Автореферат и диссертация по медицине (14.00.53) на тему:Особенности старения и карцерогенеза у трансгенных мышей HER-2/neu: механизмы и модифицирующие воздействия

На правах рукописи

АЛИМОВА Ирина Николаевна

ОСОБЕННОСТИ СТАРЕНИЯ И КАНЦЕРОГЕНЕЗА , У ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ НЕК-2/пеи: МЕХАНИЗМЫ И МОДИФИЦИРУЮЩИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ

14.00.53. - геронтология и гериатрия 14.00.14. - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2002

Работа выполнена в отделе канцерогенеза и онкогеронтологии Научно-исследовательского института онкологии им. проф. Н.Н. Петрова Министерства здравоохранения РФ.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Анисимов Владимир Николаевич Официальные оппоненты;

доктор медицинских наук Малинин Владимир Викторович доктор биологических наук Швембергер Ирина Николаевна

Ведущее научное учреждение:

Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт Минздрава РФ

Защита диссертации состоится " с? 2002 г. в Л асов

на заседании диссертационного совета Д601.001.01 при Санкт-Петербургском Институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу 197110, Санкт-Петербург, просп.Динамо, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО

РАМН

Автореферат разослан " /3 " ииСьсЛ^З 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Л.С. Козина

и ¿1/7, 1/ 0.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

За последние десятилетия в развитых странах мира наблюдается значительное постарение населения. Эта проблема приобретает глобальный характер. Об актуальности проблемы старения для всего человечества свидетельствует разработанная по инициативе ООН Программа по исследованиям старения в XXI веке (Andrews G.R. et al., 2001). Отдельный раздел этой программы посвящен изучению механизмов старения и связанных с ним заболеваний. Среди этих заболеваний одно из важнейших мест занимают злокачественные опухоли.

Исследованию механизмов старения и развития рака посвящено большое количество экспериментальных и клинических исследований. Существует много теорий происхождения рака и развития возрастных изменений в организме (Дильман В.М., 1987; Anisimov V.N., 1987; Hayflick L., 1998). В то же время до сих пор недостаточно изучены конкретные механизмы старения и канцерогенеза, особенно, механизмы взаимосвязи этих процессов.

Важнейшее значение в динамике старения и возрастной патологии, включая злокачественные опухоли, имеют изменения тканей-мишеней на молекулярно-генетическом уровне. Исследования в этом направлении стали возможными, в значительной степени благодаря разработке новых методов получения линий генетически модифицированных животных, в частности, трансгенных и нокаутных мышей (Hogan В. et al., 1994). В экспериментах на таких мышах удалось установить роль отдельных генов в механизмах старения и рака, включая гены, ответственные за продукцию некоторых гормонов, иммунитет, пролиферацию и дифференцировку клеток, уровень свободно-радикальных процессов, репарацию ДНК. Однако, длительные наблюдения за трансгенными мышами, их продолжительностью жизни, динамикой возникновения, локализацией и морфологией опухолей весьма немногочисленны (Anisimov V.N., 2001).

Перспективной моделью для изучения механизмов старения и рака являются трансгенные мыши с высокой частотой рака молочной железы (РМЖ). Исследования на таких животных актуальны, поскольку, как известно, рак молочной железы - самое частое онкологическое заболевание у женщин, а методы его профилактики не достаточно разработаны (Семиглазов В.Ф. и др., 1992; Моисеенко В.М. и др., 1997; Parkin D.M. et al., 2001). В то же время, доказана зависимость возникновения и развития этих опухолей от генетической предрасположенности и возрастных изменений (Napalkov N.P. et al., 1983; Cuzick J., 1985; Имянитов Е.Н и др., 1997).

Важным этапом в изучении роли генетических факторов в развитии РМЖ явилось получение линий трансгенных мышей с инкорпорированным онкогеном HER-2/neu (Muller W. J. et al., 1988). Показана амплификация и избыточная экспрессия этого онкогена в РМЖ человека и ее связь с клиническими признаками опухолевой прогрессии (Имянитов

E.H., Князев П.Г., 1991; Slamon D.J. et al., 1987; Andrechek E.R. et al., 2000).

У трансгенных мышей HER-2/neu отмечено раннее возникновение РМЖ с высокой частотой, причем развивающиеся опухоли дают метастазы в легкие (Guy С.Т. et al., 1992). Таким образом, эти мыши представляют собой удобную экспериментальную модель для изучения механизмов и разработки мер профилактики рака этой локализации. Однако данные о связи уровня экспрессии HER-2/neu у этих мышей с развитием РМЖ отсутствуют. Не исследованы особенности старения этой линии мышей. Не изученным также является вопрос об особенностях возрастных изменений эндокринного статуса этих животных, влияющих на развитие РМЖ. К ним относятся, в частности, изменения эстрального цикла и уровня рецепторов эстрогенов (Russo J., Russo I.H., 1987).

В последние десятилетия активно развиваются представления о значительной роли свободных радикалов в молекулярных механизмах старения и канцерогенеза, поскольку свободные радикалы кислорода и азота способны повреждать макромолекулы клетки (ДНК, белки, липи-ды), что, в конечном счете, может приводить к развитию возрастной патологии, в том числе, к возникновению новообразований (Harman D., 1994). Однако роль этих процессов в генезе РМЖ изучена недостаточно. Поэтому представляет интерес изучение уровня свободнорадикальных процессов и состояния антиокислителыюй системы организма на модели РМЖ у трансгенных мышей.

Важный вклад в изучение механизмов развития рака внесли работы по модифицирующим факторам канцерогенеза, в том числе, антиканцерогенным. Исследование механизмов их действия перспективно и в плане разработки профилактических мероприятий.

В последние годы накапливается все больше убедительных данных об ингибирующем влиянии индольного гормона эпифиза мелатонина на развитие спонтанных и индуцированных химическими канцерогенами опухолей молочной железы у лабораторных грызунов (Cos S., Sanchez-Barcelo E.J, 2000; Bartsch С., et al., 2001).

Новой группой антиканцерогенных факторов являются пептидные биорегуляторы (Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1983, 1996; Хавинсон В.Х., 2002). Показано, что пептидные факторы, выделенные из тимуса и эпифиза, так же как гормон эпифиза мелатонин, ингибируют развитие РМЖ на различных экспериментальных моделях в том числе, на часто используемых в онкологических исследованиях мышах линии SHR (Анисимов В.Н., Хавинсон В.Х., 1991; Anisimov V.N. et al., 1994; Аниси-мов В.Н., 1997).

В последнее время получены синтетические пептиды, регулирующие функцию тимуса и эпифиза - вилон и эпиталон (Хавинсон В.Х. и др., 1997; Хавинсон В.Х., 1999). Однако исследования их эффекта на трансгенных мышах ранее не проводились. Комплексное изучение связи между экспрессией генома, эндокринным статусом, уровнем свободнорадикальных процессов, биомаркерами старения и продолжительно-

стью жизни у трансгенных мышей в условиях воздействия модифицирующих факторов, прежде всего, пептидных биорегуляторов и мелатонина, позволит углубить представления о механизмах старения и канцерогенеза, а также возможных направлениях профилактики возрастной патологии и преждевременного старения.

Цель исследования

Изучение возрастных изменений показателей гомеостаза и маркеров старения, а также продолжительности жизни, развития опухолей и экспрессии онкогена НЕЯ-2/пеи у трансгенных мышей, несущих данный онкоген, и влияния на эти показатели модифицирующих факторов (пептидных биорегуляторов, мелатонина и кастрации), в сопоставлении с влиянием этих же факторов на мышей низкораковой линии БНР..

Задачи исследования

1. Представить онкологическую характеристику трансгенных мышей НЕ11-2/пеи, включающую:

- динамику развития опухолей молочной железы (ОМЖ) у мышей НЕЯ-2/пеи;

- морфологию опухолей молочной железы у мышей НЕЯ-2/пеи;

- экспрессию онкогена НЕК-2/пеи в опухолях молочной железы у трансгенных мышей;

- содержание рецепторов эстрогенов в опухолях.

2. Изучить показатели гомеостаза и биологического возраста у трансгенных мышей в сравнении с мышами низкораковой линии 8НИ :

- потребление корма;

- динамику массы тела;

- температуру тела;

- эстральный цикл;

- продолжительность жизни;

- уровень свободнорадикальных процессов в тканях мышей.

3. Изучить влияние кастрации на развитие опухолей молочной железы у трансгенных мышей НЕЯ-2/пеи.

4. Изучить влияние мелатонина и пептидных биорегуляторов вилона и эпиталона на экспрессию гена НЕК-2/пеи, показатели гомеостаза и биологического возраста, а также развитие опухолей у трансгенных мышей и мышей линии 5НЛ.

Научная новизна исследования

Впервые представлена онкологическая характеристика трансгенных мышей НЕК-2/пеи.

Впервые изучены показатели гомеостаза и биологического возраста (эндокринный статус, свободнорадикальные процессы, температура тела, динамика массы тела), а также продолжительность жизни у мышей НЕГ1-2/пеи в сравнении с мышами БЫЛ.

В работе впервые изучено влияние кастрации, мелатонина и пептидов, регулирующих функцию тимуса и эпифиза, на экспрессию гена

НЕЯ-2/пеи, биомаркеры старения, продолжительность жизни и возникновение опухолей у трансгенных мышей НЕЯ-2/пеи.

Научно-практическая ценность работы

Результаты работы имеют теоретическое и практическое значение. Показано, что у трансгенных мышей - самок НЕЯ-2/пеи наблюдаются, наряду' с повышенной экспрессией онкогена НЕ11-2/пеи, высокой частотой и ранним появлением рака молочной железы, возрастные изменения показателей гомеостаза и неопухолевые патологические изменения внутренних органов, свидетельствующие об ускоренном старении. Эти данные подтверждают предположения о возможном участии онкогенов, в том числе гена НЕЯ-2/пеи, в механизмах старения.

Торможение канцерогенеза молочной железы у кастрированных мышей-самок и интактных самцов НЕЯ-2/пеи является показателем роли гормонального баланса в реализации действия онкогена НЕЯ-2/пеи.

Введение мелатонина, эпиталона и вилона снижает экспрессию онкогена НЕЯ-2/пеи в опухолях молочной железы и тормозит возрастные изменения некоторых показателей биологического возраста у трансгенных мышей, что свидетельствует о связи механизмов старения и рака.

Мелатонин тормозит развитие РМЖ у трансгенных мышей и ОМЖ и новообразований других локализаций у мышей БНЯ. При этом отмечается увеличение продолжительности жизни животных.

Эпиталон и вилон угнетают канцерогенез молочной железы у мышей НЕК-2/пеи. При введении эпиталона отмечено увеличение продолжительности жизни мышей НЕЯ-2/пеи и БНЯ.

Полученные данные расширяют представления о механизмах канцерогенеза, связи старения и рака. Обнаружение антиканцерогенного и геропротекторного эффекта пептидных биорегуляторов эпиталона и вилона важно для разработки новых методов предупреждения рака и преждевременного старения.

Положения, выносимые на защиту

1. Кастрация мышей НЕК-2/пеи в раннем возрасте тормозит развитие рака молочной железы, снижает частоту поликистоза почек и увеличивает продолжительность жизни животных.

2. Мелатонин тормозит развитие рака молочной железы у мышей НЕК-2/пеи и БНК, снижает уровень экспрессии онкогена НЕЯ-2/пец в опухолях молочной железы, увеличивает продолжительности жизни животных, тормозит старение репродуктивной системы.

3. Эпиталон угнетает канцерогенез молочной железы, что проявляется в увеличении латентного периода обнаружения рака молочной железы, снижении частоты и множественности опухолей и их метастазирования; увеличивает продолжительность жизни и замедляет старение репродуктивной функции организма мышей НЕЯ-2/пеи и БНЯ. У мышей БНЯ эпиталон тормозит возникновение лейкозов. Эпиталон и вилон снижают уровень экспрессии гена

HER-2/neu в аденокарциномах молочной железы трансгенных мышей.

4. Антиканцерогенные и геропротекторные свойства эпиталона и вило-на сопоставимы со свойствами природных полипептидных препаратов эпифиза и тимуса — эпиталамина и тималина.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на объединенной научной конференции отдела канцерогенеза и онкогеронтологии, лаборатории эндокринологии, лаборатории онкоэкологии и патологоанато-мической лаборатории НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова МЗ РФ, лаборатории онкогеронтологии и Отдела клеточной биологии и патологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН 13.06.2002 г., международном конгрессе молодых ученых "Научная молодежь на пороге XXI века" (Томск, 2000), 3-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2000), международной конференции "ВИЧ/СПИД и родственные проблемы" (Санкт-Петербург, 2001), 2-й научно-практической конференции с международным участием "Ускоренное старение и пути его профилактики" (Одесса, 2001), 17-м Всемирном геронтологическом конгрессе (Ванкувер, Канада, 2001), 1-й международной конференции по онкологии "Рак молочной железы у пожилых женщин" (Болонья, Италия, 2002), международном симпозиуме "Свет, эндокринная система и рак" (Кёльн, Германия, 2002).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, собственных результатов, обсуждения и выводов. Объем работы составляет 168 страниц. Список литературы содержит 62 отечественных и 115 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 27 таблицами и 26 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В опытах было использовано 210 трансгенных мышей-самок и 50 самцов линии F VB/N, несущих ген рака молочной железы человека HER-2/neu, первоначально полученных из Итальянского Национального исследовательского центра старения (Анкона) и поддерживаемых в виде разводки в лаборатории. Контролем в эксперименте служили 200 самок мышей линий SHR и 20 самок - мышей линии СВ А, полученных из питомника «Рапполо-во» РАМН. Животным вводили эпиталон (ЭТ) (Ala-Glu-Asp-Gly) и вилон (Lys-Glu) (в ампулах по 10 мкг в 1 мл и по 1 мкг в 1 мл раствора), выпускаемые Санкт-Петербургским институтом биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН; мелатонин (МЛТ) (Sigma, США), а также физиологический раствор (ФР) (Phoenix Pharmaceuticals Ltd, Великобритания).

Трансгенные НЕЛ-2/пеи мыши-самки были рандомизированно разделены на 10 групп:

1) интактный контроль (ИК) - для хронических опытов (30 мышей); 2) интактный контроль, используемый для оценки интенсивности сво-боднорадикальных процессов (17 мышей); 3) физиологический раствор-1 (ФР1) -. введение ФР курсами (28 мышей); 4) ФР2 - введение ФР постоянно (24 мыши); 5) кастрированные (овариоэктомированные - ОЭ) животные (25 мышей); 6) мелатонин-1 (МЛТ1) - введение МЯТ курсами (30 мышей); 7) МЛТ2 - введение МЛТ постоянно (30 мышей); 8) эпита-лон-1 (ЭТ1) - введение ЭТ курсами (28 мышей); 9) ЭТ2 - введение ЭТ постоянно (24 мыши); 10) вил он - введение вилона курсами (27 мышей).

Кроме того, за 50 интактными самцами НЕЯ-2/пеи длительно наблюдали с целью выявления у них опухолей молочных желез.

Мыши БНЯ были рандомизированно разделены на 4 группы: 1) ИК (50 мышей); 2) ФР1 - введение ФР курсами (50 мышей); 3) МЛТ1 - введение МЛТ курсами (50 мышей); 4) ЭТ1 - введение ЭТ курсами (50 мышей). 20 интактных мышей СВА служили контролем при оценке интенсивности свободнорадикальных процессов у мышей НЕЛ-2/пеи.

При курсовом введении мыши НЕЯ-2/пеи и БНЯ получали препараты один раз в месяц на протяжении 5 дней, при постоянном введении - 5 дней в неделю на протяжении всей жизни, начиная с возраста 3 мес.

Во всех опытах разовая доза эпиталона и вилона составляла 0,1 мкг в 0,1 мл раствора, ФР ~ 0,1 мл. Мелатонин в дозе 20 мг/л животные получали в ночные часы с питьевой водой. Раз в три месяца у животных в течение 2 недель ежедневно цитологически исследовали содержимое влагалищных мазков для оценки астральной функции. Одновременно производили ректальное измерение температуры тела с помощью медицинского электротермометра (ТПЭМ-1); рассчитывали среднюю температуру тела и среднюю температуру тела в фазы эструса и диэструса. За животными наблюдали до их естественной гибели. Регистрировали день гибели животных и рассчитывали среднюю и максимальную продолжительность жизни мышей. Один раз в две недели у всех мышей путем пальпации определяли появление опухолей молочной железы. Обнаруженную опухоль измеряли, локализацию отмечали на специальной схеме. Мышей ежемесячно взвешивали на электронных весах. Один раз в два месяца, в те же сроки, что и взвешивание, производили определение количества потребляемого корма.

Для изучения особенностей свободнорадикальных процессов у трансгенных и низкораковых мышей в гомогенатах мозга и печени, а также в сыворотке крови определяли генерацию активных форм кислорода методом перекисной люминолзависимой хемилюминесценции (Прокопенко В.М. и др., 1995). Об интенсивности перекисного окисления липи-дов судили по уровню содержания диеновых коньюгатов и шиффовых оснований (Стальная И.А., 1974). Для определения общей антиокислительной активности тканей использовали метод регистрации хемилюминесценции рибофлавина (Бурмистров С.О., 1997). Определяли активность

Си, Zn-супероксиддисмутазы, используя метод подавления биологическом материалом нитросинего тетразолия (Agostini А. et al., 1980).

Всех павших или забитых в состоянии крайней слабости животных вскрывали. На аутопсии осматривали кожу и все внутренние органы. Выявленные новообразования классифицировали согласно рекомендациям Международного агентства по изучению рака (МАИР) как «фатальные» (то есть, послужившие непосредственной причиной гибели животных) или как «случайные» (в случаях, когда животное погибло от других причин)

(Gart J.J. et al., 1986). Опухоли, а также ткани и органы, подозрительные на наличие опухолевого роста, фиксировали в 10% нейтральном формалине. После обычной гистологической обработки ткани заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и изучали микроскопически. Использовали гистологическую классификацию опухолей, предложенную МАИР (Turusov V.S., Mohr U., 1990).

У части мышей в опухолях молочной железы определяли рецепторы половых гормонов уголь - декстрановым методом. Рецепторы эстрадио-ла определяли по связыванию с меченным эстрадиолом (Merck, Германия), который применяли в дозах 2,9-1013 М; 7,3-1013 М; 1,4-1012 М. Для определения рецепторов прогестерона использовали синтетический аналог прогестерона R-5020 (промигестрон, фирма Amersham) в концентрациях 2,5-1013 М; 6,1 • 1013 М; 1,8-1012 М. Для определения специфического связывания в часть пробы добавляли 1000 избыток немеченого эстра-диола или прогестерона. Инкубировали пробы в течение 16-18 часов. Для определения свободного и связанного гормона их обрабатывали раствором активированного угля, покрытого декстраном. Счет импульсов проводили в жидкостном сцинтилляционном счетчике Mark-2 с эффективностью счета до 35%. Концентрацию белка определяли по модифицированному методу О.Н. Lowry и соавт. (1956).

Экспрессию онкогена HER-2/neu в опухолях оценивали молекуляр-но-генетическим и иммуногистохимическим методами. При молекуляр-но-генетическом исследовании оценивали уровень мРНК HER-2/neu цепной реакцией полимеризации в реальном времени (РТ-ПЦР). На первом этапе из экстрагированной из ткани ОМЖ РНК синтезировали кДНК, инкубируя РНК с dNTP, Oligo dT, First Strand буфером, обратной транскриптазой M-MLV, ингибитором РНКазы и DTT. На втором этапе проводили ПЦР, инкубируя кДНК с реакционной смесью, содержащей Г1ЦР буфер, MgCl2, dNTP, специфические прямые и обратные праймеры, Taq ДНК полимеразу. Образцы инкубировали в амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 (Perkin Elmer) до 35 циклов для HER-2/neu и 30 циклов для -актина, использовавшегося в качестве контроля. Праймеры для HER-2/neu и -актина были получены от Roche Diagnostics GmbH, Германия. Продукты ПЦР и стандарты визуализировали после электрофореза в 1,5% агарозном геле, содержащем 1 мкг/мкл этидиума бромида (EtBr). Денситометрический анализ производили на приборе GelDoc 2000 (Biorad Laboratories, Италия).

Иммуногистохимический анализ образцов ткани РМЖ проводили стандартным методом с использованием антител для HER-2/tieu А0485 (DAKO, Дания). После инкубации и реакции с диаминобензидином срезы докрашивали гематоксилином.

При статистической обработке результатов опытов использовали методы вариационной статистики с использованием пакетов статистических программ STATGRAPH и STADIA. Достоверность различий оценивали по критериям 1Стьюдента,х2 и точному методу Фишера (ГублерЕ.В., 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности канцерогенеза у трансгенных мышей HER-2/neu

Первой задачей работы явилась онкологическая характеристика трансгенных мышей HER-2/neu. Для сравнения была изучена низкораковая линия мышей SHR. Данные по динамике развития опухолей и продолжительности жизни мышей групп ИК представлены в табл. 1,2 и на рис. 1,2.

Проведенные исследования показали, что у трансгенных мышей ОМЖ возникают в более раннем возрасте и их число нарастает гораздо быстрее, чем у мышей SHR. Так, первые опухоли у трансгенных и низкораковых мышей обнаружены, соответственно, в возрасте 135 и 390 дней; средний латентный период их выявления составил 2365,9 и 48414,9 (р<0,001) дня; частота опухолей - 77% и 22% соответственно (р<0,001). Таким образом, наши исследования подтвердили литературные данные, полученные на мышах с инкорпорированным геном HER-2/neu (Muller W.J. et al., 1998; Andrechek E.R., 2000).

Таблица 1.

Сведения о продолжительности жизни и возникновении опухолей

люлочной железы у мышей HER-2/neu, подвергшихся овариоэктомии, курсовому и постоянному введению мелатонина

Показатели ИК оэ МЛТ 1 МЛТ2

Количество мышей J30____ 281±8,1 25 , 27 22

Средняя продолжительность жизни мышей, сут. 373*20,5"* 271±7,94 244±С,37****

Количество мышей с ОМЖ 23 (76,7%) 15(60%) 18(66,7%) 13 (59,1%)

Общее количество ОМЖ 75 39 9S 45

Среднее количество ОМЖ на 1 мышь-опухоленосителя 3,3 ±0,2 2,6±0,3 5,3±0,12*** 3,5±0,13***"

Количество мышей с метастазами ОМЖ в легких 10(33,3%) 3 (12%)* 6(22,2%) 3(13,6%)*

Минимальный диаметр метастазов, см. 0,29±0,05 0,2б±0,03 *** 0,58±0Д9*** 0,20±0,06**

Различие с показателем в интактном контроле статистически достоверно: *р<0,05; ** р <0,01; *** р < 0,001.

Достоверное отличие поданному показателю между группами МЛТ 1 и МЛТ 2: р<0,05

Таблица 2.

Сведения о продолжительности жизни и возникновении опухолей молочной железы у мышей 57/Д, подвергшихся курсовому введению мелатонина и эпиталона

Показатели ИК ФР1 МЛТ1 ЭТ1

Количество мышей 50 50 50 50

Средняя продолжит, жизни мышей, сут. 480±18,3 454±29,3 556±25,4* 587±22,5**

Количество мышей с ОМЖ 1Ц22%) 9(18%) 12 (24%) 13 (26%)

Обшее количество ОМЖ 11 11 17 16

Количество ОМЖ на одну 1 1,2±0.09 1,42±0,07 1 1,23±0,07

мышь-опухоленосителя

Количество мышей с метастазами ОМЖ в легких 3 (6%) 8(16%) 5 (10%) 5(10%)

Минимальный диаметр метастазов, см 0Д±0,13 0,1±0,03 0,1 ±0,07 0,1±0,07

Различие с соответствующим показателем в контроле статистически достоверно: *р<0,02; ** р<0,001

100 80 60 40 20 0

I/

-1-и"зйи"> Jh АI Ас

' HER-2/ncu 'SHR

А А'ААА

s*

V

V

<р

'Ss

# Л*

а

ьс Возраст, сут.

Рис. 1. Динамика возникновения аденокарцином молочной железы у интактных самок мышей HER-2/neu и SHR

Морфологическое строение опухолей трансгенных мышей в наших опытах также отличалось от структуры новообразований молочной железы у мышей SHR. Если для трансгенных мышей характерным было полиморфное строение ОМЖ, состоящих из очагов солидного рака, камедокарциномы, криброзных структур и кровоизлияний с образованием геморрогических полостей, что соответствовало аденокарциномам типа В, то у мышей SHR развивались не содержавшие крупных кист опухоли мелкотубулярного строения, соответствующие аденокарциномам типа А (Turusov V.S., Mohr U„ 1994).

Что касается метастазирования опухолей, то их частота и метастатический потенциал РМЖ у трансгенных мышей были выше, чем у мышей SHR.

Рис. 2. Динамика выживаемости интактных самок мышей HER-2/neu и SHR.

У трансгенных мышей-самок опухали других локализаций обнаружить не удалось, тогда как у низкораковых мышей SHR отмечалось развитие лейкозов (5 случаев) и опухолей легких (1), и также новообразований яичника (2). Возможно, это связано с тем, что из-за развития РМЖ трансгенные мыши погибали рано и не доживали до обнаружения опухолей других локализаций, которые у мышей SHR отмечали в возрасте 518-697 дней. Однако у трансгенных мышей часто отмечали неопухолевую патологию: поражение почек с кистозными изменениями канапьцев, сморщиванием клубочков и интерсти-циальной мелкоклеточной инфильтрацией, а также атрофию фолликулов селезенки и атрофию печеночных балок. При этом в печени и селезенке отмечали скопление мелкозернистого содержимого. Отмеченные изменения напоминали нарушения обмена веществ, наблюдаемые при амилоидозе. Поскольку скопления амилоида характерны для стареющих животных, а также отмечаются при процессах старения у человека, можно предположить, что инкорпорация онкогенов может ускорять старение. У исходной линии мышей FVB/N, на основе которой была получена использованная нами линия HER-2/neu, патология почек не описана (Mahler J.F. et al., 1996).

При оценке экспрессии онкогена HER-2/neu в ОМЖ иммуногисто-химическим методом высокое содержание онкобелка HER-2/neu выявлено во всех исследованных опухолевых тканях, а также в предопухолевых очаговых пролифератах молочных желез. Высокий уровень экспрессии онкогенов в опухолях молочной железы был выявлен также с помощью цепной реакции полимеризации. Наши данные согласуются с работами других авторов, которые выявили амплификацию и повышенную экспрессию онкогенов у мышей с высокой частотой РМЖ (Guy С.Т. et al., 1992; Andrechek E.R. et al., 2000).

При изучении показателей гомеостаза и биологического возраста у трансгенных мышей по сравнению с мышами SHR отмечено следующее: более низкая температура тела, несмотря на большее потребление корма, что, по-видимому, связано с особенностями обменных процессов у трансгенных животных; нарушение эндокринного баланса, что отразилось в увеличении числа иррегулярных циклов (в 2,5 раза). Подобное нарушение характерно для раннего старения.

Изучение содержания рецепторов эстрогенов показало наличие рецепторов эстрадиола -17 во всех исследованных образцах тканей опухолей у трансгенных мышей (2-9 Фмоль/мг белка), в то время как рецепторы прогестерона обнаружены в одном из четырех образцов ткани (5 Фмоль/мг белка). Сопоставление наших данных с литературными свидетельствует о том, что содержание стероидных рецепторов в ОМЖ у мышей НЕЯ-2/пеи является сравнительно невысоким и близко к уровню, отмеченному в спонтанных ОМЖ мышей ВАЬВ/с (Ьапап С. е1 а!., 1989).

Таблица 3.

Показатели свободнорадикальных процессов в различных органах самок мышей НЕЯ-2/пеи и мышей СВА

Параметры Молодые мыши (3 мес.) НЕЯ-2/пеи (п = 7) Зрелые мыши (6 мес.)НЕЯ-2/пеи _1о=10)__ Зрелые мыши (6 мес.)СВА(п=10) )

Сыворотка крови

Л-ХЛ (104 УЕ/мг.б.) 78,30±25,60 154,30±20,20 224,0±29.80

ОАА (УЕ/мг.б.) 1,35±0,14 0.95±0,20 1.40*0.15

ДК (нмоль/мл) 3,89±0,12 4,87±0,28 С 4,36±0.43

ОШ (УЕ/мл) 24>30±0_140 33.50il.8g 29.20±3.20

СОД (УЕ/мг.б) 1,05±0,11 0,75±0,09 ;

Головной мозг

! Л-ХЛ (104 УЕ/мг.б.) 130,40*18.70 147,90±15,20 ** 94.10±7.90 I

! ОАА (УЕ/мг.б.) 7,33±0,18 Ь 7,28±0Д7 Ь *** 3.10±0.19 1

ДК (нмоль/г) 23.50±0.90 Ь 28,00±0.80 Ь *** 22.29±0.87 1

ОШ (УЕ/г) 340.70±18,20 Ь 345,70±7,80 Ь «** 388,00±25 1

1 СОД (УЕ/мг.б) 21,70±1,40 Ь 19,50±1,30 Ь 23^0±1,801 1

ГП (мМ ГБН/мг.б.мин) 83,60±6,80 1 115.60i8.40f |

Печень 1

Л-ХЛ (104 УЕ/мг.б.) _305,50.ь59,50 а 138.80±23,9*Г 78.40± 10,4 1 !

! ОАА (УЕ/мг.б.) 11.00±0.60Ь 12.30±0.б *'* 4,72±0,45 1 1

ДК (нмоль/г) 75.90±3.50 Ь 96.10i3.80g*** 66.37±2,17 1

ОШ (УЕ/г) 581.50±22,80 Ь 628.50Ы6.70 *** 543,00±14.0 1 ]

ГЗПмМ/мг.б.мин)_ 167,30±9.40 176.50±5.90

ГП (мМ Г5Н/мг.б.мин. 206,60±40,70 с 175,00±Х5.20 ;

а Ь

р<0,01, р<0,001 - достоверное различие у молодых мышей НЕЯ-2/пеи по данному параметру с показателями в сыворотке крови;

р<0,02; < р,0,01 - достоверное различие по параметру ГП с показателями свободнорадикальных процесов а головном мозгу;

р<0,05; р<0,01 - достоверное различие по данному параметру молодых и зрелых мышей

р<0,001 - достоверное различие у зрелых мышей СВА по данному параметру с показателями свободнорадикальных процессов в сыворотке крови; *р<0,05; **р<0,01, *** р<0,001 - достоверное различие уровня свободнорадикальных процесов по данному параметру зрелых мышей НЕГ?-2/пеи со зрелыми мышами СВА.

Л-ХЛ - люминолзависимая хемилюминесценция; ОАА - общая антиокислительная активность; ДК - диеновые конъюганты; ОШ - основания Шиффа; ГП -глутатионпероксидаза; Г5Т-Глутатион-5-трансфераза.

Поскольку известно, что интенсивность старешм и канцерогенеза зависит от уровня свободно-радикальных процессов, изучались различные параметры генерации свободных радикалов и состояния антиоксидантной системы защиты у трансгенных мышей, в сопоставлении с мышами низкораковой линии СВА. Было установлено, что содержание некоторых пролуктов перекисного окисления (диеновых конъюгатов) у трансгенных мышей было значительно больше, чем у низкораковых мышей (таблЗ). Это может свидетельствовать о более высоком уровне генерации свободных радикалов у трансгенных животных, способствующих раннему старению и развиппо рака

Одной из причин ранней гибели трансгенных мышей было развитие опухолей молочных желез. Другой причиной явились нарушения обмена веществ, связанные с поражением почек и других органов. Их частота была сравнима с частотой РМЖ, соответственно, 63% и 77%. Сравнимы были и средние сроки их обнаружения - 236 и 282 сут. В то же время, у низкораковых мышей SHR частота поражения почек составила 2% (р<0,001), а частота опухолей - 48,7% (18/39). Средняя продолжительность жизни низкораковых мышей была в 1,7 раза больше, чем у трансгенных животных (р<0,001) (табл.1,2, рис.2.).

В литературе также отмечена короткая продолжительность жизни трансгенных животных с инкорпорированными онкогенами РМЖ и частое поражение почек (Muller W.J. et al., 1988; Ward J.M. et al., 2000).

В целом, проведенный анализ показал, что мыши FVB/N с инкорпорированным геном HER-2 представляют собой удобную модель для изучения механизмов РМЖ и его связи со старением. Наши эксперименты показали роль онкогена HER-2/neu в развитии рака молочной железы, выявили особенности динамики появления опухолей, их морфологии, метастазирования, а также неопухолевой патологии, связанной с инкорпорированным онкогеном. Отмечены изменения некоторых показателей гомеостаза и биологического возраста, свидетельствующие об ускорении процессов старения в организме трансгенных мышей.

Влияние овариоэктомни на продолжительность жизни и канцерогенез у трансгенных мышей HER-2/neu

Опыты с кастрацией были поставлены с целью выявить роль эндокринных факторов в реализации действия онкогенов, вовлеченных в канцерогенез молочной железы. У большинства кастрированных животных снижение уровня половых гормонов, вызванное овариоэктомией, тормозило развитие рака. Темп нарастания числа опухолей в группе кастрированных мышей был значительно ниже, чем в интактном контроле, что отразилось, в конечном счете, и на суммарной частоте опухолей, их множественности (табл. 1), а также удлинении латентного периода (с 236±5,9 до 251115,8 сут.) (рис.3, 4). Кастрация приводила к снижению частоты метастазирования и уменьшению метастатического потенциала опухолей (табл.1). Наши данные свидетельствуют о гормонозависимо-сти ОМЖ у трансгенных мышей, что связано с наличием рецепторов эстрогенов на мембранах опухолевых клеток. О значении гормонов в развитии РМЖ у трансгенных мышей свидетельствуют половые разли-

чия в развитии новообразований. Так, в наших опытах среди 50 интакт-ных самцов НЕЯ-2/пеи на протяжении всего периода наблюдения (21 мес.) ОМЖ не были отмечены.

Кастрированные самки мышей отличались достоверно большей массой тела (на 13%) и потреблением корма (на 20%) по сравнению с интакт-ными животными. Кастрированные животные погибали значительно позже контрольных, что отразилось на показателях средней продолжительности жизни-соответственно373±20,5и2.81±8,1 сут. (р<0,01) (табл. 1). Увеличение продолжительности жизни кастрированных животных можно объяснить торможением возникновения ОМЖ, а также снижением частоты поражения почек с 63,3% до 32% (р<0,02). Снижение частоты поликистоза почек у кастрированных животных, возможно, связано с торможением реализации повреждающего влияния онкогена на почечную ткань.

£ 100

Рис. 3. Влияние овариоэктомии на возникновение аденокарцином молочной железы у самок мышей HER-2/neu

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 Время жизни, сут.

Рис. 4. Влияние овариоэктомии на выживаемость самок мышей

HER-2/neu

Влияние мелатошша на продолжительность жизни и канцерогенез у трансгенных мышей HER-2/neu и мышей SHR

Выбор гормона эпифиза мелатонина для исследования был обусловлен тем обстоятельством, что, как известно, нарушения функции эпифиза играют большую роль в возникновении рака, в том числе, РМЖ (Bartsch C.et al., 2001). Вместе с тем, данные об ингибирующем влиянии мелатонина на возникновение спонтанных и индуцированных новообразований довольно противоречивы (Anisimov V.N. et al., 2001).

В наших опытах было изучено влияние мелатонина как на трансгенных, так и на низкораковых мышах. В опытах на мышах HER-2/neu использовали два режима введения мелатонина - курсовой и постоянный, а в опытах на мышах SHR - курсовой.

В опытах на мышах HER-2/neu установлено, что даже курсовое введение мелатонина может приводить к торможению развития ОМЖ (табл.1). При постоянном введении снижение частоты новообразований было более выражено, при этом наблюдалось также снижение частоты метасгазирования и размеров метастазов.

Динамическое наблюдение не выявило существенных различий между получавшими мелатонин и ингактными мышами в потреблении корма и массе тела. Однако изучение эстральной функции показало, что курсовое и постоянное введение мелатонина тормозит ее возрастные нарушения. Так, нарастание с возрастом числа длинных циклов и, соответственно, увеличение средней продолжительности цикла, при введении мелатонина значительно замедлялось. В возрасте 9 мес. средняя продолжительность цикла у мышей, получавших мелатонин, была значительно (на 20%) меньше, чем в контроле.

Опыты на низкораковых мышах SHR подтвердили результаты, полученные на трансгенных животных. Отмечено тормозящее влияние мелатонина на развитие новообразований, выразившееся, прежде всего в увеличении среднего латентного периода обнаружения ОМЖ (с 484±14,9 до 558±44,2 дней) и среднего срока обнаружения метастазов (с 539 до 569 дней). Отмечалась также тенденция к снижению частоты лейкозов (с 16% до 6% случаев) и опухолей матки (с 6% до 0).

При оценке параметров биологического возраста у мышей SHR, получавших мелатонин, отмечены признаки замедления старения (тенденция к уменьшению массы и температуры тела, статистически достоверное укорочение эстрального цикла - на 20%). Одновременно наблюдалось увеличение продолжительности жизни под влиянием мелатонина (р<0,02) (табл. 2,4).

Таблица 4.

Динамика выживаемости самок мышей SHR

Возраст. cvT.

Группа 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850

Число мышей, доживших до указанного □ока

ИК ^50 50 38 38_ 36_ 35 33 j 26 /22_ 14 12 10 0 0 0

MJIT1 50 50 50 50—i 49 40 39 32 28 18 14 7 7 1 1

ФР1 so 50 35 35 35 33 32 Г27 18 16 9 1 0 0 0

!ЭТ1 50 48 36 36 34 33 33 25 17 _ 12 10 7* 2 0 0

Различие с контролем статистически достоверно: *- р<0,05.

Ранее в опытах на мышах СВ А было показано, что мелатонин замед ляет процесс старения, увеличивает продолжительность жизни животных и частоту развития лейкозов и аденокарцином легких (Апштоу й а1., 2001) В то же время, при введении мелатонина трансгенным мышам ММТУ/газ отмечено торможение развития ОМЖ (МесУауШа М.О. е1 а!., 1997).

Изучение молекулярных механизмов антиканцерогенного действия мелатонина впервые показало, что этот препарат снижает уровень экспрессии гена рака молочной железы НЕЯ-2/пеи в ОМЖ трансгенных мышей в 2,5 раза. Подобный эффект, наряду с другими эффектами мелатонина (ан-тиоксидантным действием, нормализующим влиянием на нейроэндокрин-ные и метаболические показатели), может быть основным фактором, определяющим антиканцерогенные свойства этого гормона эпифиза.

Полученные нами данные о геропротекторных свойствах мелатонина согласуются с результатами опытов по введению этого препарата на различных биологических объектах (РшграоП 1994; Анисимов В.Н., 1998).

В целом, сопоставление наших данных с литературными данными показывает, что, несмотря на наличие у мелатонина выраженных геропротекторных свойств, к его применению в гериатрической практике следует относиться с осторожностью.

Влияние пептидных биорегуляторов на продолжительность жизни и канцерогенез у трансгенных мышей НЕК-2/пеи и мышей ЯШ*

Наибольшее внимание при исследовании модифицирующих факторов канцерогенеза было уделено представителям перспективной группы синтетических пептидных биорегуляторов - эпиталону и вилону.

Оба препарата вводили животным в виде подкожных инъекций в ФР. Оказалось, что у трансгенных и низкораковых мышей этот растворитель стимулирует канцерогенез по сравнению с интактным контролем, приводя к увеличению множественности ОМЖ (табл. 1,2, 5).

Таблица 5.

Сведения о продолжительности жизни и динамике возникновения аденокарцином молочной железы у мышей НЕН-2/пеи, подвергшихся воздействию эпиталона и вилона

! Показатели ФР1 ФР2 ЭТ1 ЭТ2 Вялая

; Количество мышей 28 24 25 24 21

' Средняя продолжительность жизни мышей, сут. 312 ¿10,6 289±9,3 271±8,4" 328±6,5" 291±|Э,4

Количество мышей с ОМЖ 23 (82°/.) 21(87,3%) 18(72%) ,13(54,2%)« , 24 (89%)

Общее количество ОМЖ 115 120 85 61 114

Количество ОМЖ на 1 мышь-опухоленосителя 5,0 ±0,45 5,7±0.39 4,7±0,58 4,б9±0,44 4,840,40

Количества мышей с метастазами ОМЖ в легких 9(32,1%) 11 (45,8%) 4(16%) 7(29,2%) 11(41%)

Минимальный диаметр метастазов, см 0,24±0,07 0,23±0,04 0,21 .¿0,02 0,30±0,0б 0,2б±0,06 _

Различие с показателем в соответствующем контроле статистически достоверно:* р<0,02; **р<0,01.

У мышей БНЯ при этом отмечали сокращение продолжительности жизни (табл.2). Есть основания предполагать, что отмеченные эффекты вызваны стрессом, обусловленным инъекциями. Таким образом, впервые удалось показать, что изменения, обусловленные стрессом, стимулируют канцерогенез молочной железы у трансгенных мышей. Стимулирующий эффект стресса на опухолевый рост установлен и на других экспериментальных моделях (Балицкий К.П., Шмалько Ю.П., 1987).

Результаты экспериментов по введению эпиталона сопоставляли с данными у мышей, получавших ФР (табл.5, рис.5, б).

s- 100

S ISO 200 250 300 350 400 450

т

S

g Возраст, сут.

Рис. 5. Влияние эпиталона и вилона на динамику возникновения аденокарцином молочной железы у самок мышей HER-2/neu

Возраст, сут.

Рис. 6. Влияние эпиталона и вилона на выживаемость самок мышей НЕК-2/пеи

Отмечен ингибирующий эффект эпиталона на канцерогенез молочной железы у трансгенных мышей, коррелирующий с дозой препарата (в группе ЭТ2 эффект выше, чем в ЭТ1). В группе ЭТ2 по сравнению с группой ФР2 обнаружено статистически достоверное увеличение среднего латентного периода обнаружения ОМЖ (с 251±3,6 до 268±5,5 дней, р<0,05), снижение частоты опухолей (с 87,5% до 54,2%, р<0,02), тенденция к уменьшению множественности и частоты метастазирования ОМЖ.. Постоянное введение эпиталона приводило к увеличению сред-

ней продолжительности жизни (с 289±9,3 до 328±6,5 дней, р<0,01), а также оказывало благоприятное влияние на эстральную функцию организма (вызывало сокращение продолжительности цикла и уменьшение числа иррегулярных циклов).

Молекулярно-генетический анализ показал, что эпитапон снижал уровень экспрессии гена HER-2/aeu в ОМЖ в 3,7 раза, что, возможно, лежит в основе его угнетающего действия на развитие опухолей у трансгенных мышей.

В опытах на мышах SHR эпитапон, не оказывая заметного влияния на развитие ОМЖ (табл.2), снижал число лейкозов и лимфом (с 12% до 2%, р<0;05), а также опухолей яичника (с 8% до 0, р>0,05). Средняя продолжительность жизни животных при введении эпиталона достоверно увеличивалась (р<0.001) (табл.2). При этом характерными оказались изменения показателей гомеостаза (уменьшение к 19 мес. возрасту температуры тела по сравнению с контролем (с 37,70,11°С до 37,320,14°С, р<0,05); сокращение длительности эстрального цикла (с 6,840,26 до 5,870,33 сут., р<0,001), свидетельствующие о торможении процессов старения при введении эпиталона.

Аналогичный эффект эпиталона обнаружен в опытах на мышах СБА (Anisimov V.N. et al., 2001). Сопоставление результатов, полученных в опытах с эпиталоном иа мышах трех линий, свидетельствует о наличии у этого препарата антиканцерогенных и геропротекторных свойств, выраженность которых мало отличалась от обнаруженных ранее у его природного аналога - экстракта эпифиза эпиталамина (Аниси-мов В.Н. и др., 1973; Anisimov V.N. et al., 1982, 1989).

В опытах с другим пептидным биорегулятором - вилоном было установлено, что этот препарат также тормозил развитие РМЖ, однако, его эффект был менее выражен, чем у эпиталона, и наблюдался у мышей, начиная с 350 дня жизни (рис.5)

Геропротекторный эффект вилона у трансгенных животных выявить не удалось. В то же время, в проведенных ранее исследованиях на мышах СВА были выявлены как геропротекторные, так и антиканцерогенные свойства вилона (Анисимов В.Н. и др., 2000).

Результаты опытов с пептидными биорегуляторами —эпиталоном и вилоном свидетельствуют о перспективности их дальнейшего экспериментального и клинического изучения с целью применения в гериатрической практике для продления жизни и предупреждения возрастной патологии.

ВЫВОДЫ

1. Трансгенные мыши HER-2/neu, по сравнению с низкораковыми мышами SHR, отличаются высокой частотой более ранним появлением рака молочных желез, большей множественностью опухолей и частотой метастазирования, высоким уровнем экспрессии онкогена HER-2/neu в опухолях. В новообразованиях молочной железы трансгенных мышей выявлены рецепторы

эстрогенов. В то же время, у мышей НЕК-2/пеи не обнаружены опухоли других локализаций, встречающиеся у мышей ВНЯ. У трансгенных мышей также наблюдается неопухолевая патология, преимущественно, поликистоз почек (63,3%).

2. Средняя продолжительность жизни трансгенных мышей в 1,7 раза меньше, чем у низкораковых мышей БНЯ (р<0,001). Анализ возрастных изменений показателей гомеостаза и биологического возраста (температуры тела, потребления корма, эстрального цикла, свободно-радикальных процессов) свидетельствует об ускорении процессов старения у мышей НЕЯ-2/пеи.

3. Кастрация мышей НЕК-2/пеи в раннем возрасте тормозит развитие рака молочной железы, снижает частоту поликистоза почек и увеличивает продолжительность жизни животных.

4. Введение мелатонина (курсовое и постоянное) мышам НЕ11-2/пеи тормозит развитие рака молочной железы, что в наибольшей степени проявляется у мышей, получавших препарат постоянно. Мелато-нин снижает уровень экспрессии онкогена НЕЯ-2/пеи в опухолях молочной железы (в 2,5 раза). Постоянное введение мелатонина снижает метастатический потенциал опухолей. Мелатонин также тормозит развитие новообразований у мышей БНЯ.

5. Курсовое введение мелатонина мышам НЕ11-2/пеи и БНЯ сопровождается замедлением старения репродуктивной системы и увеличением продолжительности жизни животных.

6. При введении мышам НЕЯ-2/пеи пептида эпиталона отмечен тормозящий канцерогенез эффект, коррелирующий с дозой препарата. При этом отмечается увеличение латентного периода обнаружения рака молочной железы, снижение частоты и множественности опухолей, а также и частоты их метастазирования. У мышей 8НЯ эпита-лон тормозит возникновение лейкозов (с 12% до 2%). Антиканцерогенный эффект пептида вилона менее выражен и проявляется торможением возникновения опухолей на поздних сроках эксперимента у мышей НЕИ-2/пеи. Эпиталон и вилон снижают уровень экспрессии гена НЕЯ-2/пеи в аденокарциноме молочной железы трансгенных мышей (в 3,7 и 1,97 раза соответственно).

7. Введение эпиталона сопровождается увеличением продолжительности жизни и замедлением старения репродуктивной функции организма мышей НЕ11-2/пеи и БИЛ.

8. Антиканцерогенные и геропротекторные свойства эпиталона и вилона сопоставимы со свойствами природных полипептидных препаратов эпифиза и тимуса - эпигаламина и тималина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Алимова И.Н. Особенности эстрального цикла и динамика развития

опухоли молочной железы у мышей с инкорпорированным геном егЬВ-2/пеи

// Тез. докл. 3-й Всероссийской медико-биологической конф. мсшодых

исследователей "Человек и его здоровье",- Санкт-Петербург.- 2000. - С.6-8.

2. Алимова И.Н. Развитие опухолей молочной железы у трансгеннных мышей, несущих ген erbB-2/neu рака молочной железы человека // Тез. докл. международного конгресса молодых ученых " Научная молодежь на пороге XXI века",- Томск,- 2000. - С.26.

3. Алимова И.Н. Влияние светового режима и мелатонина на канцерогенез молочной железы у трансгенных erbB-2/neu мышей / И.Н. Алимова, Д.А. Батурин // Русский журнал "ВИЧ/СПИД и родственные проблемы", Санкт-Петербург. - 2001. - Т.5, № 1. - С. 18.

4. Анисимов В.Н. Использование мутантных и трансгенных мышей для изучения механизмов старения и возрастной патологии / В.Н. Анисимов, И.Н. Алимова // Успехи геронтол. -2001,- Вып. 7.-С.72-94.

5. Влияние светового режима и введения мелатонина на канцерогенез молочной железы и продолжительность жизни мышей, несущих ген рака молочной железы erbB-2/neu / Д.А. Батурин, И.Н. Алимова, И.Г. Попович, М.А. Забежинский, В.Н. Анисимов, М. Provinciali, С. Franceshi // Тез. докл. 2-й научно-практической конференции "Ускоренное старение и пути его профилактики" Одесса.-2001. - С. 127.

6. Влияние эпиталона и вилона на продолжительность жизни и развитие опухолей молочной железы у трансгенных erb B-2/neu мышей / И.Н. Алимова, Д.А. Батурин, И.Г. Попович, М.А Забежинский, В.Н. Анисимов, М. Provinciali., С. Franceshi // Тезисы докладов 2-й научно-практической конференции "Ускоренное старение и пути его профилактики", 0десса.-2001. - С.124.

7. Влияние эпиталона и вилона на развитие опухолей молочной железы у самок трансгенных мышей erbB-2/neu / В.Н.Анисимов, И.Н. Алимова, Д.А. Батурин, И.Г. Попович, М.А. Забежинский, М.А. Волков., М. Provinciali, С. Franceshi, В.Х. Хавинсон И Вопр. онкол,- 2002.-Т.48, №1.-С.57-60.

8. Роль мелатонина в поведенческих реакциях и механизмах старения и рака / В.Н. Анисимов, М.А. Забежинский, И.Г. Попович, И.Н. Алимова, Д.А Батурин, Н.Ю. Заварзина // Психофарм. биол. наркол.-2001.-№2,-С.108.

9. Зпиталон угнетает развитие опухолей и экспрессию онкогена HER-2/neu в опухолях молочной железы у трансгенных мышей с ускоренным старением / В.Н. Анисимов., В.Х. Хавинсон, И.Н. Алимова., М. Провинциали., Р. Манчини., К. Франчески // Бюлл. эксперим. биол.и мед.-2002.-Т.133, № 2.-С.199-202.

10. The effect of light regimen and melatonin on the development of spontaneous mammary tumors in HER-2/neu transgenic mice is related to a downregulaiion of HER-2/neu gene expression / D.A. Baturin, I.N. Alimova., V.N. Anisimov., I.G. Popovich., M.A. Zabezhinski, M. Provinciali., R. Mancini., C. Franceschi // Neuroendocrinol. Lett..-2001.- Vol.22, No.ó.-P. 441-447.