Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Биологическая активность регуляторных пептидов, выделенных из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю

0046'' На правах рукописи

Л

Доржаева Дыжнтма Доржиевна

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ЛЕГКИХ И ПЛАЗМЫ КРОВИ ЖИВОТНЫХ, ПЕРЕНЕСШИХ ОСТРУЮ КРОВОПОТЕРЮ

14.03.03. - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 1 ОКТ 2010

Чита-2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Читинская государственная медицинская академия Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию".

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор ЦыбиковНамжнлНаюатович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Степанов Александр Валентинович

кандидат медицинских наук Колесниченко Лариса Романовна

Ведущая организация: ГОУ ВПО "Новосибирский государственный

медицинский университет Росздрава" (г. Новосибирск)

Защита диссертации состоится" пКСФ^ 2010 года в часов на заседании диссертационного совета Д 208.118.01 при ГОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия Росздрава" (672090, г. Чита, ул. Горького, 39а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия Росздрава" (672090, г. Чита, ул. Горького, 39а).

Автореферат разослан

года.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.118.01. доктор медицинских наук, профессор

И.Н. Гаймоленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Конец двадцатого и начало двадцать первого столетия ознаменовались многочисленными техногенными катастрофами и локальными военными конфликтами. Острая массивная кровопотеря стала одной из актуальных проблем современной медицины ( Клигуненко E.H., Краковец О.В., 2005). Значение кроао-плазмопотери при ранениях и травмах чрезвычайно велико, успешная борьба с ней во многих случаях определяет исход лечебных мероприятий. Поэтому основное внимание исследователей традиционно сконцентрировано на двух патогенетических механизмах -снижении объема циркулирующего кислородоносителя и уменьшении объема крови. Именно на этих двух положениях и строится вся тактика терапии острой массивной кровопотери. Активацию свертывающей системы крови и процесса тромбообразования, реакции сердечнососудистой системы, восстановление белкового состава крови, устранение дефицита форменных элементов относят к адаптивным механизмам компенсации кровопотери. При подобном подходе изучение данных разделов патогенеза острой кровопотери отодвигается на второй план, а механизмы коррекции остаются малоизученными (Воробьев А.И., Городецкий В.М., Васильев С.А., 2001; ВалетоваВ.В. 2008).

В последние годы появилось немало сообщений, свидетельствующих о том, что при гнойной хирургической инфекции, а также при термической и механической травме возникают выраженные сдвиги в состоянии основных защитных систем организма - врожденного и адаптивного иммунитета (Цыбиков H.H. и др., 1991; Кузник Б.И. и др., 1999,2002,2004, 2008; Fedi S., 1999; Витковский Ю.А. и др., 2000; Хавинсон В.Х. и др., 2001; Гаин Ю.М., 2001; Булава Г.В. и др., 2002; Козлов В.К., 2002; Лиханов И.Д., 2002; Степанов A.B. и др., 2002; Завада Н.В. и др., 2003; Цепелев В.Л. и др., 2003; Абакумов М. М. и др., 2007; Гординская H.A., 2007; МарченкоВ.И. и др., 2007). Изучение изменений иммунной системы при острой кровопотере остается темой менее исследованной.

Одним из перспективных направлений исследования адаптационных реакций организма в ответ на острую кровопотерю является изучение свойств эндогенных регуляторных пептидов (цитомединов). Эти соединения способны переносить от клетки к клетке специфическую информацию, закодированную в последовательном расположении аминокислот. Цитомедины влияют на течение репаративных процессов, являются модуляторами клеточного и гуморального иммунитета, обладают антиоксидантным действием и нормализуют свертываемость крови и фибринолиз (Ашмарин И.П., 1984; Кузник Б.И. и др., 1981, 1998, 2001;

Цыбиков H.H. и др., 1991; Морозов В.Г. и др., 1996,2000; Степанов A.B. и др., 2002; Патеюк A.B. и др., 2003; Цепелев B.JI. и др., 2003).

В связи с вышесказанным представляется интересным изучить биологические эффекты пептидов, выделенных из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю, оценить меру их влияния на основные защитные системы организма: иммунитет и гемостаз.

Цель и задачи исследования. Целью исследования явилось изучение биологических свойств цитомединов, выделенных из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю. В связи с этим решались следующие задачи:

1. Изучить влияние цитомединов на экспрессию CD-маркеров лимфоцитов крови здоровых людей и больных с вторичными иммунодефицитными состояниями.

2. Исследовал, коагулирующие, фибринолигаческие свойства регупэторных пептидов.

3. Оценить действие цитомединов на агрегацию тромбоцитов.

4. Определить влияние цитомединов на лимфоцитарно-тромбоцитарную, эритроцитарно-тромбоцитарную и лейкоцитарно-эритроцитарную адгезию.

Научная новизна. Показано, что биологическая активность цитомединов, полученных из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю, отлична от свойств регуляторных пептидов, полученных от интактных животных.

Показано, что пептиды, полученные из легких животных, перенесших кровопотерю, увеличиваютэкспрессиюС08+,С016+-маркеров лимфоцитов, взятых от больных с вторичными иммунодефицитными состояниями, а пептиды из плазмы крови - CD4+. Пептиды из легких и плазмы крови интактных животных в аналогичных опытах увеяичиваютэкспрессию CD4+, CD8+, CD16+, атакже СОЗ+-маркеров лимфоцитов. Пептиды, выделенные из легких и плазмы крови интактных и перенесших кровопотерю животных, не влияют на экспрессию CD-маркеров лимфоцитов крови доноров.

Установлено, что цитомедины, выделенные из легких и плазмы крови интактных и перенесших кровопотерю животных, проявляют антикоагулянтный эффект. Этим свойством в большей степени обладают пептиды, выделенные из легких животных, перенесших кровопотерю. Цитомедины плазмы крови активируют эуглобулиновый и ингибируют каолиновый фибринолиз, что в большей степен и характерно для пептидов интактных животных. Цитомедины, выделенные из легких интактных и перенесших кровопотерю животных, не меняютэуглобулиновый и каолиновый фибринолиз.

Доказано, что "постгеморрагические" пептиды увеличивают скорость и степень агрегации кровяных пластинок, а также лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию в большей степени по сравнению с "интактными".

Пептиды из легких животных, подвергшихся кровоизвлечению, увеличивают число лейкоцитарно-эритроцитарных агрегатов.

Теоретическая и практическая значимость. В работе получены новые сведения о биологических свойствах цитомединов, полученных из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю. Показано, что опытные пептиды изменяют экспрессию CD-маркеров лимфоцитов, обладают антикоагулянтным и фибринолитическим потенциалом, способны увеличивать скорость и степень агрегации тромбоцитов, а также усиливать адгезивные свойства форменных элементов. Результаты проведенного исследования показывают, что больные, перенесшие острую кровопотерю, вне зависимости от причины, могут нуждаться в реабилитационных мероприятиях, заключающихся в назначении препаратов обладающих иммуномодулирующим и антиагрегантным действием.

Положения, выносимые на защиту:

1. Цитомедины, выделенные из легких и плазмы крови интактных животных, обладают свойством стимулировать экспрессию CD-маркеров на лимфоцитах крови больных с вторичными иммунодефицитными состояниями. Пептиды, выделенные из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю, в значительной степени теряют эту способность. Все исследуемые пептиды не влияют на экспрессию CD-маркеров лимфоцитов крови доноров.

2. Пептиды, выделенные из легких и плазмы крови интактных и перенесших кровопотерю животных, изменяют фибринолитический потенциал крови, проявляют антикоагулянтный эффект, который в большей степени выражен у "постгеморрагических" пептидов.

3. Под действием "интактных" и, в большей степени, пептидов, выделенных из животных перенесших острую кровопотерю, усиливаются адгезивные свойства клеток крови, увеличивается агрегабельность тромбоцитов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 1 в ведущем рецензируемом журнале, определенном ВАК Министерства образования и науки РФ, методическая рекомендация, монография.

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации и результаты исследований доложены и обсуждены на научно-практической конференции, посвященной 80-летию Г.Е. Мункоевой (г. Улан-Удэ, 2007г.); на Всероссийской конференции, посвященной 30-летию МУЗ "Городская клиническая больница скорой медицинской помощи им. В.В. Ангапова" (г. Улан-Удэ, 2008г.); на III Международной конференции "Традиционная медицина: состояние и перспективы дальнейшего развития" (г. Улан-Удэ, 2008г.); на межрегиональной научно-практической

конференции, посвященной 15-летию кафедры терапии №2 ГОУ ДПО "Иркутский государственный институт усовершенствования врачей" (г. Иркутск, 2008г.); на конференции, посвященной 90-летию со дня рождения академика К.Р. Седова (г. Иркутск, 2008г.); на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 55-летию ГОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" (г. Чита, 2008г.).

Структура я объем работы. Диссертационная работа изложена на 101 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 171 источник, из которых 23 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 13 таблицами, 12 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение регуляторных пептидов. Для получения регуляторных пептидов были взяты ткань легкого и плазма крови баран. Животные были разделены на две группы: опытные, которым за пять дней до забоя выводилась кровь путем пункции яремной вены в объеме 20% ОЦК и контрольные - без предварительного кровопускания. Животные содержались в стандартных условиях вивария ГОУ ВПО "Бурятская государственная сельскохозяйственная академия" на обычном рационе, при температуре (+) 21 - 22°С и естественном световом дне. Умерщвление проводилось в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" (Приложение 4 к Приказу МЗ СССР №755 от 12.08.77.). Выделение регуляторных пептидов проводилось методом уксуснокислой экстракции с последующим осаждением комплекса пептидов ацетоном.

Методы изучения иммунного статуса. Иммуиоактивные свойства цитомединов исследовали на 24 образцах крови доноров, а также 30 образцах крови больных с вторичными иммунодефицитными состояниями. Обе группы были сопоставимы по возрасту и полу. Группа больных представлена пациентами Республиканского клинического госпиталя для ветеранов войн, Республиканской клинической больницы г. Улан-Удэ. У всех больных диагностирована хроническая обструктивная болезнь легких, эмфизематозный или бронхитический тип, среднетяжелое течение, стадия обострения. ДН Н-Ш степени. Диагноз выставлен на основании жалоб, данных анамнеза, объективного осмотра, а также лабораторных и инструментальных методов исследования согласно современным стандартам обследования. Наличие вторичного иммуиодефицитного состояния выявлялось по результатам иммунологического исследования.

Перед проведением исследования цитомедины растворяли в соотношении 100,0мкгв 1,0 мл физиологического раствора. Для инкубации

с лимфоцитами бралось 0,1 мл раствора. Длительность инкубации 60 минут. Подсчет общего числа лейкоцитов крови, лейкоцитарной формулы проводили стандартным методом в камере Горяева (Рпте1 X., 1979; Меньшиков В.В., 1987). Выявление поверхностных маркеров лимфоцитов (СОЗ+, СЭ4+, С08+, С022+ и СО 16+) проводили с помощью моноклональных антител реакцией иммунофлюоресценции (РИФ). Использовались моноклоны производства "МедБиоспектр" (г. Москва). В качестве контроля проводили аналогичные опыты с введением физиологического раствора.

Методы исследования системы гемостаза. Для изучения коагуляционной активности цитомединов, последние, в конечной концентрации 10,0 мкг/мл, инкубировали с кровью доноров при температуре 37°С в течение 60 минут. Коагуляционный гемостаз оценивали по следующим тестам: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время, тромбиновое время, каолиновое время (Баркаган З.С., 1985); эуглобулиновый и хагеманзависимый фибринолиз (Ко\¥аггукН., Ви1ик К., 1954; Веремеенмэ К.Н., 1978). В качестве контроля проводили аналогичные тесты с введением физиологического раствора.

Изучите агрегациошюй активности тромбоцитов. Для изучения влияния цитомединов на агрегационную активность тромбоцитов, пептиды, в конечной концентрации 10,0 мкт/мл, инкубировали с кровью доноров при температуре 37°С в течение 60 минут. Исследование агрегации тромбоцитов крови доноров производили на модели отечественного агрегометра марки "Биола". Использовалась методика предложенная О. Вот (1962). В качестве контроля проводили аналогичные тесты с введением физиологического раствора.

Оценка лимфоцитарно-тромбоцитарной, эрнтроцнтарно-тромбоцитарной и лейкоцнтарно-эритроцнтарной адгезии. Исследуемые пептиды, в конечной концентрации 10,0 мкг/мл, инкубировали с цитратной кровью доноров 60 минут, затем центрифугировали со скоростью 3000 об/ мин в течение 10 минут. Использовалась методика предложенная Д.И. Бельченко (1993). Осадок ресуспензировали, наносили на предметное стекло и окрашивали по Романовскому-Гимза. Подсчитывали число коагрегатов на 100 клеток. В качестве контроля проводили аналогичные тесты, используя кровь доноров, инкубируемую с физиологическим раствором.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в исследовании структуры пептидов. ВЭЖХ пептидов, полученных из легких и плазмы животных, проводили по методу А. Хеншена(1988).

Статистическая обработка материала. Значения полученных данных были обработаны статистически общепринятыми методами с применением пакета прикладной программы "ВТОБТАТ" и программы статистического

анализа Microsoft Excel, версия XP. Исследуемые параметры приведены в виде средних величин со стандартным отклонением (M ± SD). Достоверность различий параметров оценивались по парному критерию Стьюдента для нормально распределенных переменных.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Влияние регуляторных пептидов, выделенных из легких н плазмы крови, иа экспрессию CD-маркеров лимфоцитов крови Известно, что введение регуляторных пептидов в организм способно существенным образом менять иммунологический потенциал. Это связано с тем, что цитомедины влияют на течение реакций как врожденного, так и адаптивного иммунитета. Мы решили оценить способность регуляторных пептидов, выделенных из легких и плазмы крови как интактных, так и перенесших кровопотерю животных, влиять на экспрессию CD-маркеров лимфоцитов. Причем, лимфоциты-индикаторы выделяли из крови, как доноров, так и пациентов с вторичными иммунодефицитными состояниями.

Таблица 1

Влияние регуляторных пептидов, полученных из легких, на экспрессию СО-маркеров лимфоцитов крови доноров (М±БО)

Изучаемый показатель (*103 кл/мкл) Лимфоциты доноров

Физиологический раствор (контроль) п-24 Пептиды интактных животных (опыт I) п=24 Пептиды животных после кровопотери (опыт П) п-24

Т лимфоциты CD3+ 0,57*0,09 0,53*0,09 pl> 0,05 0,48*0,09 pl> 0,05 р2> 0,0 S

Т хелперы CD4+ 0,45*0,02 0,55±0,04 pl<0,05 * 0,44*0,09 pl> 0,05 р2> 0,05

Цитотоксические Т-лимфоциты CD8+ 0,32*0,07 0,35*0,04 pl> 0,05 0,33*0,07 pl> 0,05 р2> 0,05

В лимфоциты CD22+- 0,30*0,09 0,30*0,04 pl> 0,05 0,27*0,07 pl> 0,05 р2> 0,05

NKCD16+ 0.36*0,12 0,35*0,04 pl> 0,05 0,31*0,12 pl> 0,05 р2> 0,05

Условные обозначения: р! - уровень значимости различий показателей между контролем и опытом I, между контролем и опытом И; р2 - уровень значимости различий показателей между опытом I и опытом II.

* - значимые отличия.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, пептиды, выделенные из легких, практически не оказывают эффекта на экспрессию СО-маркеров лимфоцитов крови здоровых людей. Следует лишь указать, что цитомедины из легких интакгных животных усиливают экспрессию С04+ (р<0,05). Несколько иная картина обнаруживается при анализе результатов исследований, представленных в таблице 2. Оказалось, что пептиды, выделенные из легких животных, перенесших острую кровопотерю, усиливают экспрессию маркеров С08+ (р<0,02) и СО 16+ (р<0,002). Вместе стем, цитомедины, выделенные из легких животных без предварительного кровопускания, усилнваютэкспрессию СЭЗ+ (р<0,05), СБ4+ (р<0,02), С08+ (р<0,02), а также Сй 16+ (р<0,05).

Таблица 2

Влияние регуляторных пептидов, полученных из легких, на экспрессию СБ-маркеров лимфоцитов крови больных (М±50)

Изучаемый показатель (*103 кл/мкл) Лимфоциты больных

Физиологический раствор (контроль) п=30 Пептиды интаетных животных (опыт I) п=30 Пептиды животных . после кровопотсри (опыт II) п=30

Т лимфоциты СОЗ+ 0,63*0,09 1,02*0,17 р1 <0,05 * 0,86*0,14 р1 > 0,05 р2> 0,05

Т хслперы С04+ 0,40*0,05 0,79*0,15 р1<0,02 * 0,57*0,07 р1> 0,05 р2>0,05

Цнтотоксическис Т-лимфоциты СП^• 0,24*0,02 0,45*0,08 р1<0,02 * 0,4*0,06 р1 <0,02 * р2>0,05

В лимфоциты С022+ 0,26*0,05 0,42*0,18 р!> 0,05 0,25*0,09 р1> 0,05 р2> 0,05

ЫКСШ6+ 0,23*0,02 0,47*0,10 р]<0,05 * 0,45*0,06 р10,002 * р2> 0,05

Условные обозначения: р1 - уровень значимости различий показателей между контролем и опытом I, между контролем и опытом II; р2 - уровень значимости различий показателей между опытом I и опытом II. * - значимые отличия.

Цитомедины, полученные из плазмы крови животных, не изменяют экспрессию СО-маркеров лимфоцитов крови здоровых людей. Вместе с тем, если лимфоциты выделялись из крови больных с вторичными

иммунодефицитными состояниями, а затем инкубировались с цитомединами из плазмы крови, то мы регистрировали резкие изменения в экспрессии СБ-маркеров лимфоцитов. Это в полной мере относится к цитомединам, полученным из плазмы крови интактных животных, где отмечена динамика показателей СБЗ+ (р<0,05), СБ4+ (р<0,002), СБ8+ (р<0,001), СБ16+ (р<0,01). Цитомедины, полученные из плазмы крови животных, перенесших кровопотерю, достоверно изменяли показатели С04+ относительно контрольных данных (р<0,05) и результатов опыта I (р<0,05), а также СЭ8+ - относительно результатов опыта I (р<0,001).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что регуляторные пептиды, выделенные из легких и плазмы крови животных, способны менять экспрессию СБ-маркеров в большей степени на лимфоцитах, выделенных из крови людей с вторичными иммунодефицитными состояниями. Пептиды, выделенные из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю, в значительной степени теряют эту способность.

Влияние регуляторных пептидов, полученных из легких и плазмы

крови, на коагуляционный гемостаз, фибрииолиз Известно, что цитомедины способны менять течение ферментативных реакций в организме, в том числе протеазных систем, активирующихся по типу "каскада". Это в полной мере относится к системе свертывания крови.

Цитомедины, полученные из легких интактных животных (табл. 3), удлиняют АЧТВ (р<0,001) и каолиновое время (р<0,002) относительно контрольных данных. Вместе с тем пептиды, выделенные из легких животных, перенесших кровопотерю, еще в большей степени удлиняют АЧТВ (р<0,001), каолиновое (р<0,001), а также тромбиновое время (р<0,05). Отмечено достоверное отличие между результатами опыта I и опыта II. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что цитомедины, полученные из легких животных, перенесших острую кровопотерю, определенным образом модифицируются, что усиливает их антипротеазный потенциал, а, следовательно, и антикоагулянтные свойства.

Несколько иные результаты были получены при исследовании пептидов, полученных из плазмы крови животных (табл. 4). Оказалось, что "интактные" цитомедины удлиняют АЧТВ (р<0,01) и каолиновое время (р<0,02), а "постгеморрагические" пептиды оказывают аналогичный эффект только по отношению к контрольным данным.

Таблица 3

Влияние регуляторных пептидов, полученных из легких, на коагуляционный гемостаз доноров (М±БО)

Изучаемый показатель (сек.) Плазма доноров

Физиологически и раствор (контроль) п=7 Пептиды интактных животных (опыт I) п-7 Пептиды животных после кровопотери (опыт II) п=7

АЧТВ 40,71±|,13 72,064:2,34 р1 <0,001 • 81,14±2,04 р1 <0,001 * р2<0,05 *

Каолиновое время 53,57±2,07 66,43*1,71 р1 <0,002 * 72,06±2,08 рКО.ОО! * р2<0,05 *

Тромбиновое время 15,43±0,97 16,86±1,34 р1> 0,05 21,42±2,10 р!<0,05 * р2> 0,05

Протромбиновос время 12,00±1,20 12,10±1,44 р1> 0,05 14,20±1,20 р1> 0,05 р2> 0,05

Условные обозначения: р1 - уровень значимости различий показателей между контролем и опытом I, между контролем и опытом II; р2 - уровень значимости различий показателей между опытом I и опытом II; *-значимые отличия. Таблица 4 Влияние регуляторных пептидов, полученных из плазмы крови, на коагуляционный гемостаз доноров (М±50)

Изучаемый показатель (сек.) Плазма доноров

Физиологический раствор (контроль) п=7 Пептиды интактиых животных (опыт I) п=7 Пептиды животных после кровопотери (опыт 11) п-7

АЧТВ 40,71±1,13 53,43*2,20 р1<0,01 ♦ 55,00±2,16 р1 <0,002 * р2> 0,05

Каолиновое время 53,57±2,07 62,0б±1,57 р1 <0,02 ♦ 64,0б±2,90 р1<0,05 * р2> 0,05

Тромбиновое время 15,43±0,97 16,00±2,44 р 1 > 0,05 16,71-1:3,57 р1> 0,05 р2> 0,05

Протромбиновос время 12,00±1,20 12,00^:1,68 р1> 0,05 12,30±0,96 р1> 0,05 р2> 0,05

Условные обозначения: как к табл. 3.

Таблица 5

Влияние регуляторных пептидов, полученных из плазмы крови, на фибринолиз доноров (М±8Б)

Изучаемый показатель (мин.) ' Плазма доноров

Физиологический раствор (контроль) п=7 Пептиды интактных ЖИВОТНЫХ (опыт I) п=7 Пептиды животных после кровопотери (опыт II) п=7

Фибринолиз эуглобулиновый 190,0*14,13 91,0*11,92 р1 <0,001 * • 106,4*12,15 р1<0,01 * р2> 0,05

Фибринолиз 8,0*1,41 22,43*3,51 14,57*1,71

каолиновый pl<0,01 * pl<0,05 *

р2<0,05 »

Условные обозначения: pi - уровень значимости различий показателей между контролем и опытом I, между контролем и опытом II; р2 - уровень значимости различий показателей между опытом I и опытом II; * - значимые отличия.

Цитомедины, выделенные из легких не меняют время эуглобулинового и каолинового фибринолиза. Вместе с тем, цитомедины, выделенные из плазмы крови (табл. 5), в значительной степени активируют эуглобулиновый фибринолиз и тормозят каолиновый. Последнее, вероятно, объясняется тем, что пептиды, обладая антипротеазным эффектом, интенсивно ингибируют активный фактор Хагемана, другая часть проявляет эффект активаторов плазминогена.

Влияние регуляторных пептидов, выделенных из легких и плазмы крови, на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз Одним из параметров характеризующих гомеостаз и резистентность организма является нормальное функционирование тромбоцитов и состояние микрососудов. Этим и определяется наше желание оценить влияние регуляторных пептидов, полученных из легких и плазмы крови, на агрегацию тромбоцитов.

При проведении опытов с пептидами из легких максимальные значения CPA остались практически одинаковыми, правда, при явном увеличении скорости агрегации CPA относительно контрольных данных (0,42±0,01 ед/ мин) более чем в 2 раза: 1,07±0,14 ед/мин. в опыте I и 1,0±0,16 ед/мин. в опыте И. Оказалось, что "интактные" пептиды увеличивают степень приращения СП по сравнению с контрольными данными (1,19±0,08%) в 2 раза (2,41 ±0,3 9%), а пептиды, полученные из легких животных перенесших

кровопотерю, более чем в 13 раз (15,99±0,20%), при возрастании скорости СП в 5 раз (в опыте I) и в 2 раза (в опыте II).

Введение регуляторных пептидов из плазмы крови (табл. 6) увеличивало степень CPA и скорость их образования, а также приращение СП (степень и скорость) по сравнению с контрольными данными. Результаты данной серии опытов вновь свидетельствуют о влиянии регуляторных пептидов на агрегацию тромбоцитов, в данном случае с четкой закономерностью более выраженного эффекта у цитомединов, выделенных из плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю.

Таблица 6

Влияние пептидов, выделенных из плазмы крови, на спонтанную агрегацию тромбоцитов доноров (М±БО)

Изучаемый Показатель Плазма доноров

Физиологический раствор (контроль) п=7 Пептиды интактных животных (опыт I) п=7 Пептиды животных после кровопотери (опыт И) п=7

CPA. Степень агрегации (ед) 1,28±0,15 7,92±0,23 pi <0,001 * 2.52±0,37 pl<0,001 * р2<0,02 *

CPA. Скорость агрегации (ед/мин) 0,42*0,01 1,62±0,11 pi <0,001 * 1,98±0,42 р1<0,001 * р2> 0,05

СП. Степень агрегации (%) 1,19±0,08 4,2i0,22 pi <0,001 * 9,06±0,3 pi <0,001 • р2<0,001 *

СП. Скорость агрегации (%/мин) 2,59±0,30 10,05±0,37 pi <0,001 * 27,66^2,14 pi <0,001 • р2<0,001 »

Условные обозначения: р 1 - уровень значимости различий показателей между контролем и опытом I, между контролем и опытом II; р2 - уровень значимости различий показателей между опытом I и опытом II; * - значимые отличия.

Таким образом, параметры агрегации по кривой CPA на введение пептидов реагируют противоречиво, но с явной тенденцией нарастания показателей по сравнению с контрольными данными. Приращение СП изменяется более закономерно: во всех опытах отмечается статистически достоверное изменение значений по сравнению с контрольными данными, между результатами опыта I и опыта II с явной тенденцией увеличения показателей в опытах с "постгеморрагическими" пептидами.

Влияние регуляторных пептидов, выделенных из легких и плазмы крови, на лимфоцитарно-тромбоцнтарную, эритрощггарно-тромбоцитарную и лейкоцитарно-эритроцитарную адгезию

В последние годы установлено, что в физиологических условиях в кровотоке происходит формирование разнообразных агрегатов клеток крови (ЛТА, ЭТА, ЛЭА). Поскольку предпочтительным местом образования этих агрегатов является венозное русло, то основным "органом-мишенью" являются легкие. Поэтому, понятен наш интерес к изучению влияния пептидов из легких, плазмы крови на формирование ЛТА, ЭТА и ЛЭА.

Таблица 7

Исследование активности пептидов, выделенных из легких, на ЛТА, ЭТА и ЛЭА (\fcfcSD)

Изучаемый показатель (число агрегатов на 100 кл.) Кровь доноров

Физиологический раствор (контроль) п=7 Пептиды интактных животных (опыт I) п-7 Пептиды животных после кроаопотери (опыт II) п=7

Лимфоцитарио- тромбоцитарные розетки 10,57*1,9 23,43*2,64 р1<0,01 * 26,43*2,07 р1 <0,001 * р2Х),05

Эритроцитарно-тромбоцитарные розетки 2,71 ±0,76 2,29*0,49 р1>0,05 2,29*0,49 р!>0,05 р2>0,05

Лейкоцитарно- эритроцитарные розетки 3,57*0,53 5,57*0,97 р1>0,05 7,57*0,9« р 1 <0.01 * р2>0,05

Условные обозначения: р1 - уровень значимости различий показателей между контролем и опытом I, между контролем и опытом II; р2 - уровень значимости различий показателей между опытом I и опытом II; *- значимые отличия.

Нами установлено (табл. 7), что пептиды, выделенные из легких интактных животных, увеличивают ЛТА (р<0,01). Вместе с тем цитомедины, выделенные из животных перенесших кровопотерю, имеют тенденцию к еще более выраженной стимуляции ЛТА (р<0,001), а также влияют на ЛЭА (р<0,01). Пептиды, выделенные из плазмы крови интактных животных (табл. 8), увеличивают ЛТА в крови доноров (р<0,01) и этот эффект имеет тенденцию к нарастанию при добавлении пептидов, выделенных из плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю.

Таблица 8

Исследование активности пептидов, выделенных из плазмы крови, на ЛТА, ЭТА и ЛЭА (\liSD)

Изучаемый показатель (число агрегатов на 100 кл.) Кровь доноров

Физиологический раствор (контроль) п=7 Пептиды интактных животных (опыт I) п—7 Пептиды животных после кровопотери (опьгт II) п=7

Лимфоцитарно-тромбоцитарные розетки 10,57*1,9 24,43*3,31 р1<0,01* 34,29*1,26 рКО.ОГ р2>0,05

Эритроцитарно-тромбоцитарные розетки 2,71*0,76 2,57*0,79 р1Х),05 2,86*0,9 р!>0,05 р2>О,05

Лейкоцитарно- эритроцитарные розетки 3,57*0,53 5,29*1,11 р1>0,05 4,43*1,27 р1Х),05 р2>0,05

Условные обозначения: р1 - уровень значимости различий показателей между контролем и опытом I, между контролем и опытом II; р2 - уровень значимости различий показателей между опытом I и опытом II;

* - значимые отличия

Полученные результаты не должны вызывать удивление. Увеличение в проводимых опытах ЛТА, ЛЭА под влиянием регуляторных пептидов из легких и плазмы крови интактных и перенесших кровопотерю животных, отражает с одной стороны активацию системы гемостаза, а с другой - иммунитета.

Определение структуры пептидов методом ВЭЖХ

При анализе пептидограмм полученных методом ВЭЖХ установлено, что после острой кровопотери в пептидах, полученных их ткани легкого, отчетливо контурируется дополнительный пик, обозначенный на пептидограмме под номером три, а также исчезает пик номер восемь, визуализированный на контрольной пептидограмме.

Рнс.2. Пептидограмма цитомединов, выделенных из легких животных, перенесших острую кровопотерю.

Таким образом, получены доказательства изменения не только функциональной активности опытных пептидов, но и обнаружены структурные отличия. Последнее может быть связано с изменением гомеостаза, интенсификации метаболизма, модификацией протеолитических реакций в клетках и, в частности, катепсиновой активности. Это находит отражение в изменении структуры пептидов и их биологической активности.

выводы

1. Цитомедины, полученные из легких интактных животных, увеличивают экспрессию С04+-маркеров лимфоцитов крови здоровых людей и повышают экспрессию СЭЗ+, СБ4+, СБ8+ и СБ 16+-маркеров лимфоцитов полученных от больных с вторичными иммунодефицитными состояниями. Пептиды, выделенные из легких животных, перенесших кровопотерю, увеличивают экспрессию СБ8+ и С016+-маркеров лимфоцитов крови больных.

2. Цитомедины из плазмы крови интактных и перенесших кровопотерю животных не изменяют экспрессию СО-маркеров отдельных клонов лимфоцитов здоровых людей. "Интактные" регуляторные пептиды увеличивают экспрессию СРЗ+, СБ4+, С08+ и С016+-маркеров лимфоцитов больных с вторичными иммунодефицитными состояниями. Пептиды животных, перенесших кровопотерю, увеличивают экспрессию С04+-маркеров лимфоцитов больных.

3. Пептиды, выделенные из легких и плазмы крови интактных и перенесших кровопотерю животных, проявляют антикоагулянтный эффект. Этим свойством в большей степени обладают пептиды, выделенные из легких животных, перенесших кровопотерю. Цитомедины, выделенные из легких интактных и перенесших кровопотерю животных, не меняют время эуглобулинового и каолинового фибринолиза. Цитомедины, выделенные из плазмы крови, активируют эуглобулиновый и ингибируют каолиновый фибринолиз, данные свойства проявлены меньше у пептидов, выделенных из плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю.

4. Исследуемые пептиды увеличивают скорость и степень агрегации кровяных пластинок. Этот эффект в большей степени выражен у пептидов из плазмы крови животных, перенесших кровопотерю.

5. Цитомедины, полученные из легких и плазмы крови интактных и, в большей степени, перенесших кровопотерю животных, увеличивают лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию. Пептиды из легких животных, подвергшихся кровоизвлечению, увеличивают число лейкоцитарно-эритроцитарных агрегатов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Исследование влияния щелочных полипептидов, выделенных из внутренних органов животных, перенесших кровопускание на динамику СД-рецепторов / В.А. Тарнуев, О.Ж. Гармаева, Д.Д. Доржаева, И.Н. Есаулова // Развитие специализированной терапевтической помощи населению Республики Бурятия: материалы науч.-практической конф., посвящ. 80-летию Г.Е. Мункоевой (г. Улан-Удэ, 20 декабря 2007 г.). - Улан-Удэ, 2007. - С. 233 - 236.

2. Динамика CD-рецепторов лимфоцитов под влиянием щелочных пептидов, полученных из внутренних органов кроликов, подвергшихся кровопусканию /H.H. Цыбиков, В.А. Тарнуев, Д.Д. Доржаева, О.Ж. Гармаева, И.Н. Есаулова //Бюл.ВСНЦ СО РАМН.-Иркутск, 2007.-№5(57).-С. 180-181.

3. Влияние щелочных полипептидов (цитомединов), полученных из легких и плазмы животных, перенесших кровотечение, на динамику СД-рецепторов лимфоцитов /H.H. Цыбиков, В.А. Тарнуев, Д.Д. Доржаева, О.Ж. Гармаева, И.Н. Есаулова // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - Улан-Удэ, 2008. -№3 (61). - С. 186.

4. Влияние щелочных полипептидов (цитомединов), полученных из легких и плазмы животных перенесших кровопускание на динамику СД-рецепторов / H.H. Цыбиков, В.А. Тарнуев, Д.Д. Доржаева, О.Ж. Гармаева, И.Н. Есаулова // III Международная конф. "Традиционная медицина: состояние и перспективы дальнейшего развития" (18-22 августа 2008 Россия, Улан-Удэ).-Улан-Удэ, 2008. - С. 82.

5. Биологическая активность веществ, выделенных из внутренних органов животных, перенесших кровопускание на динамику лимфоцитов / H.H. Цыбиков, В.А. Тарнуев, О.Ж. Гармаева, И.Н. Есаулова, Д.Д. Доржаева // III Международная конф. "Традиционная медицина: состояние и перспективы дальнейшего развития" (18-22 августа 2008 Россия, Улан-Удэ). - Улан-Удэ, 2008. - С. 81 - 82.

6ч Иммунологические аспекты формирования специфической резистентности организма при дробном кровопускании в условиях эксперимента / В.А. Тарнуев, О.Ж. Гармаева, Д.Д. Доржаева, И.Н. Есаулова / / Актуальные вопр. терапии: материалы межрегиональной науч.-практической конф., посвящ. 15-летию кафедры терапии №2.23 октября 2008 г. Улан-Удэ-Иркутск: Иркутский государственный институт усовершенствования врачей. - Улан-Удэ, 2008. - С. 130 - 132.

7. Анализ биологической активности цитомединов, выделенных из внутренних органов животных, перенесших кровопускание / В.А. Тарнуев,Д.Д. Доржаева, О.Ж. Гармаева, И.Н. Есаулова // Традиции и современность: материалы конф., посвящ. 90-летию со дня рождения академика K.P. Седова. - Иркутск, 2008.-С. 194-196.

8. Динамика СД-рецепторов лимфоцитов в ответ на влияние цитомединов из

легких и плазмы животных перенесших кровопотерю / НН. Цыбиков, В.А. Тарнуев, Д.Д. Доржаева, О.Ж. Гармаева, И.Н. Есаулова // Актуальные проблемы клинической и экспериментальной мед.: материалы всероссийской науч.-практической конф., посвящ. 55-летию Читинской государственной медицинской академии. Чита, 1-2 октября 2008 г. - Чита, 2008. - С. 226,

9. Влияние цитомединов из легких и плазмы животных, перенесших кровопотерю, на динамику CD-рецепторов лимфоцитов / Д.Д. Доржаева, H.H. Цыбиков, В .А. Тарнуев, О.Ж. Гармаева, И.Н. Есаулова // Сибирский мед. журн, - Иркутск, 2009. - Т.84, №1. - С.37 - 39.

10. Современное представление о кровопускании в традиционной медицине / В.А. Тарнуев, И.Н. Есаулова, Д.Д. Доржаева - Улан-Удэ: Республиканская типография, 2009. - 168 с.

11. Лечение кровопусканием: метод, рекомендации / И.Н. Есаулова [и др.]. - Иркутск: РИО ИГИУВа, 2009. -19 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЧТВ ВЭЖХ

дн

ЛТА

ЛЭА

ОЦК

CPA

СП

РИФ

ЭТА

CD

pH

- активированное частичное тромбопластиновое время

- высокоэффективная жидкостная хроматография

- дыхательная недостаточность

- лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия

- лейкоцитарно-эритроцитарная адгезия

- объем циркулирующей крови

- средний размер агрегатов тромбоцитов -светопропускание

- реакция иммунофлюоресценции

- эритроцитарно-тромбоцитарная адгезия

- cell differentiation antigens или cluster definition - антигены кластеров дифференцировки клеток.

- potential hydrogeni - водородный показатель

Лицензия ИД №03077 от 23.10.00. Подписано в печать 24.09.2010. Бумага офсетная. Гарнитура Times NewRoman Формат 60x84 '/,,.. Усл. печ. л. 1,3 Тираж 100. Заказ № 133/2010.

Отпечатано в информационно-издательском центре ЧГМА 672090, Чита, ул. Горького, 39а.

Конец двадцатого и начало двадцать первого столетия ознаменовались многочисленными техногенными катастрофами и локальными военными конфликтами. Острая массивная кровопотеря стала одной из актуальных проблем современной медицины [47].

Значение крово-плазмопотери при ранениях и травмах чрезвычайно велико, успешная борьба с ней во многих случаях определяет исход лечебных мероприятий. Поэтому основное внимание исследователей традиционно сконцентрировано на двух патогенетических механизмах -снижении объема циркулирующего кислородоносителя и уменьшении объема крови. Именно на этих двух положениях и строится вся тактика терапии острой массивной кровопотери [16, 23].

Активацию свертывающей системы крови и процесса тромбообразования, реакции сердечно-сосудистой системы, восстановление белкового состава крови, устранение дефицита форменных элементов относят к адаптивным механизмам компенсации кровопотери [23, 63]. При подобном подходе изучение данных разделов патогенеза острой кровопотери отодвигается на второй план, а механизмы коррекции остаются малоизученными.

В последние годы появилось немало сообщений, свидетельствующих о том, что при гнойной хирургической инфекции, а также при термической и механической травме возникают выраженные сдвиги в состоянии основных защитных систем организма - врожденного и адаптивного иммунитета [1, 15, 20, 21, 31, 52, 58, 65, 66, 67, 73, 90, 114, 120, 135, 140, 164, 169]. Изучение изменений иммунной системы при острой кровопотере остается темой менее исследованной.

Одним из перспективных направлений исследования адаптационных реакций организма в ответ на острую кровопотерю является изучение свойств эндогенных регуляторных пептидов (цитомединов). Эти соединения способны переносить от клетки к клетке специфическую информацию, закодированную в последовательном расположении аминокислот. Цитомедины влияют на течение репаративных процессов, являются модуляторами клеточного и гуморального иммунитета, обладают антиоксидантным действием и нормализуют свертываемость крови и фибринолиз [4, 57, 62, 78, 79, 88, 96, 114, 135, 140].

В связи с вышесказанным представляется интересным изучить биологические эффекты пептидов, выделенных из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю, оценить меру их влияния на основные защитные системы организма: иммунитет и гемостаз.

Цель и задачи исследования. Целью исследования явилось изучение биологических свойств цитомединов, выделенных из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю. В связи с этим решались следующие задачи:

1. Изучить влияние цитомединов на экспрессию СБ-маркеров лимфоцитов крови здоровых людей и больных с вторичными иммунодефицитными состояниями.

2. Исследовать коагулирующие, фибринолитические свойства регуляторных пептидов.

3. Оценить действие цитомединов на агрегацию тромбоцитов.

4. Определить влияние цитомединов на лимфоцитарно-тромбоцитарную, эритроцитарно-тромбоцитарную и лейкоцитарно-эритроцитарную адгезию.

Научная новизна. Показано, что биологическая активность цитомединов, полученных из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю, отлична от свойств регуляторных пептидов, полученных от интактных животных.

Показано, что пептиды, полученные из легких животных, перенесших кровопотерю, увеличивают экспрессию СБ8+, С016+-маркеров лимфоцитов, взятых от больных с вторичными иммунодефицитными состояниями, а пептиды из плазмы крови - СБ4+. Пептиды из легких и плазмы крови интактных животных в аналогичных опытах увеличивают экспрессию СБ4+, СБ8+, СБ 16+, а также СБЗ+-маркеров лимфоцитов. Пептиды, выделенные из легких и плазмы крови интактных и перенесших кровопотерю животных, не влияют на экспрессию СБ-маркеров лимфоцитов крови доноров.

Установлено, что цитомедины, выделенные из легких и плазмы крови интактных и перенесших кровопотерю животных, проявляют антикоагулянтный эффект. Этим свойством в большей степени обладают пептиды, выделенные из легких животных, перенесших кровопотерю. Цитомедины плазмы крови активируют эуглобулиновый и ингибируют каолиновый фибринолиз, что в большей степени характерно для пептидов интактных животных. Цитомедины, выделенные из легких интактных и перенесших кровопотерю животных, не меняют эуглобулиновый и каолиновый фибринолиз.

Доказано, что «постгеморрагические» пептиды увеличивают скорость и степень агрегации кровяных пластинок, а также лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию в большей степени по сравнению с «интактными». Пептиды из легких животных, подвергшихся кровоизвлечению, увеличивают число лейкоцитарно-эритроцитарных агрегатов.

Теоретическая и практическая значимость. В работе получены новые сведения о биологических свойствах цитомединов, полученных из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю. Показано, что опытные пептиды изменяют экспрессию СБ-маркеров лимфоцитов, обладают антикоагулянтным и фибринолитическим ; потенциалом, способны увеличивать скорость и степень агрегации у Г тромбоцитов, а также усиливать адгезивные свойства форменных элементов. Результаты проведенного исследования показывают, что больные, перенесшие острую кровопотерю, вне зависимости от причины, могут нуждаться в реабилитационных мероприятиях, заключающихся в назначении препаратов обладающих иммуномодулирующим и антиагрегантным действием.

Внедрение. Материалы работы внедрены в учебный процесс кафедр патологической физиологии ГОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия», медицинской реабилитации ГОУ ДПО «Иркутский государственный институт усовершенствования врачей Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Положения, выносимые на защиту:

1. Цитомедины, выделенные из легких и плазмы крови интактных животных, обладают свойством стимулировать экспрессию СБ-маркеров на лимфоцитах крови больных с вторичными иммунодефицитными состояниями. Пептиды, выделенные из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю, в значительной степени теряют эту способность. Все исследуемые пептиды не влияют на экспрессию СО-маркеров лимфоцитов крови доноров.

2. Пептиды, выделенные из легких и плазмы крови интактных и перенесших кровопотерю животных, изменяют фибринолитический потенциал- крови, проявляют антикоагулянтный эффект, который в большей степени выражен у «постгеморрагических» пептидов.

3. Под действием «интактных» и, в большей степени, пептидов, выделенных из животных перенесших острую кровопотерю, усиливаются адгезивные свойства клеток крови, увеличивается агрегабельность тромбоцитов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 1 в ведущем рецензируемом журнале, определенном ВАК Министерства образования и науки РФ, методическая рекомендация, монография.

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации и результаты исследований доложены и обсуждены на научно-практической конференции, посвященной 80-летию Г.Е. Мункоевой (г. Улан-Удэ, 2007г.); на Всероссийской конференции, посвященной 30-летию МУЗ «Городская клиническая больница скорой медицинской помощи им. В.В. Ангапова» (г. Улан-Удэ, 2008г.); на III Международной конференции «Традиционная медицина: состояние и перспективы дальнейшего развития» (г. Улан-Удэ, 2008г.); на межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 15-летию кафедры терапии №2 ГОУ ДПО «Иркутский государственный институт усовершенствования врачей» (г. Иркутск, 2008г.); на конференции, посвященной 90-летию со дня рождения академика K.P. Седова (г. Иркутск, 2008г.); на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 55-летию ГОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» (г. Чита, 2008г.).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 101 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 171 источник, из которых 23 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 13 таблицами, 12 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Цитомедины, полученные из легких интактных животных, увеличивают экспрессию С04+-маркеров лимфоцитов крови здоровых людей и повышают экспрессию СОЗ+, СБ4+, СБ8+ и С016+-маркеров лимфоцитов полученных от больных с вторичными иммунодефицитными состояниями. Пептиды, выделенные из легких животных, перенесших кровопотерю, увеличивают экспрессию СБ8+ и СБ16+-маркеров лимфоцитов крови больных.

2. Цитомедины из плазмы крови интактных и перенесших кровопотерю животных не изменяют экспрессию СО-маркеров отдельных клонов лимфоцитов здоровых людей. «Интактные» регуляторные пептиды увеличивают экспрессию СОЗ+, СБ4+, СБ8+ и СБ 16+-маркеров лимфоцитов больных с вторичными иммунодефицитными состояниями. Пептиды животных, перенесших кровопотерю, увеличивают экспрессию СБ4+-маркеров лимфоцитов больных.

3. Пептиды, выделенные из легких и плазмы крови интактных и перенесших кровопотерю животных, проявляют антикоагулянтный эффект. Этим свойством в большей степени обладают пептиды, выделенные из легких животных, перенесших кровопотерю. Цитомедины, выделенные из легких интактных и перенесших кровопотерю животных, не меняют время эуглобулинового и каолинового фибринолиза. Цитомедины, выделенные из плазмы крови, активируют эуглобулиновый и ингибируют каолиновый фибринолиз, данные свойства проявлены меньше у пептидов, выделенных из плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю.

4. Исследуемые пептиды увеличивают скорость и степень агрегации кровяных пластинок. Этот эффект в большей степени выражен у пептидов из плазмы крови животных, перенесших кровопотерю.

5. Цитомедины, полученные из легких и плазмы крови интактных и, в большей степени, перенесших кровопотерю животных, увеличивают лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию. Пептиды из легких животных, подвергшихся кровоизвлечению, увеличивают число лейкоцитарно-эритроцитарных агрегатов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Хорошо известно, что все цитомедины обладают выраженной иммуномодулирующей активностью, что проявляется в усилении иммунного ответа в иммунодефицитных организмах и ослаблением иммунной агрессии при аутоиммунных заболеваниях. Кроме того, практически все цитомедины влияют на течение репаративных процессов, ускоряют заживление ран, нормализуют свертываемость крови и фибринолиз [54, 62, 79, 96, 108, 138].

Есть мнение, что синтез регуляторных пептидов не является жестко генодетерминированным. Это, скорее всего, следствие случайного процесса, где с одной стороны выступает в качестве субстрата любой белок цитоплазмы, а с другой - лизосомальные ферменты - катепсины. Последние имеют оптимум активности в кислых значениях рН. Поэтому о генной детерминации этого процесса можно говорить только в отношении синтеза белка (субстрата) и катепсинов (ферментов). Об этом свидетельствует и необычайно широкий диапазон цитомединов по молекулярной массе: от 1000 до 20000 Д. [62, 140].

В физиологических условиях цитомедины являются медиаторами межклеточной регуляции, позволяющим клеткам «переговаривать друг с другом» и входят, наряду с нервной и гуморальной системами, в основные механизмы регуляции гомеостаза. Однако при развитии патологических процессов меняется как количественный, так и качественный состав, в результате чего начинают проявляться их новые биологические свойства. Количество цитомединов в патологии увеличивается вследствие возрастания активности катепсинов. Последняя реакция является следствием относительной или абсолютной гипоксии и закисления внутренней среды организма, а, следовательно, перевода катепсинов в оптимальный режим функционирования. Более того, в результате описанного процесса меняется качество цитомединов - появляются пептиды с более низкой молекулярной массой. Последнее находит отражение в изменении хроматографического профиля пептидов при гель-фильтрации (Цыбиков H.H., 1981; Калашников С.Г., 1989), ионообменной хроматографии (Ложкина А.Н., 1992), высокоэффективной жидкостной хроматографии (Цепелев B.JL, 2003). Последующий секвенс и аминокислотный анализ создал реальные предпосылки для синтеза пептидов. Все это удачно продемонстрировано B.JI. Цепелевым и H.H. Цыбиковым в 1999 году в Институте биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (г. Москва). Полученные ими синтетические пептиды (бурсопептиды-1, -2, -3, -4) проявляли высокую биологическую активность и создали основу для производства новых лекарственных препаратов.

Нами в целой серии опытов было показано, что цитомедины, полученные из легких и плазмы крови животных, обладают выраженной биологической активностью. Последнее проявляется в усилении экспрессии CD-маркеров лимфоцитов крови, особенно у больных с иммунодефицитным состоянием, коагулогической и фибринолитической активностью, а также способностью усиливать адгезию клеток крови. Все эти свойства в нашей работе мы увидели у «интактных» цитомединов, то есть пептидов, выделенных из легких и плазмы крови животных без предварительного кровопускания. :

В следующей серии экспериментов мы постарались проследить изменения свойств регуляторных пептидов, полученных из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю. Известно, что при развитии различных заболеваний, остром и хроническом стрессе содержание и активность цитомединов в разных органах и тканях резко изменяется. Проводились детальные исследования состояния врожденного и адаптивного иммунитета, свертывания крови, фибринолиза у больных с ожогами и отморожениями, механической травмой органов грудной и брюшной полости, гнойной хирургической инфекции, деструктивных заболеваниях легких, переломах длинных трубчатых костей [1, 13, 15, 20, 21, 29, 31, 52, 66, 69, 73, 93, 103, 107, 108]. В наших экспериментах объем потерянной крови у животных составлял 20% ОЦК. Мы воспроизводили острую кровопотерю II класса (согласно классификации Американской коллегии хирургов, 1998 г), при которой выход крови из сосудистого русла не приводил к летальному исходу или возникновению гиповолемического шока. При этом, исходя из существующих способов оценки адаптационных возможностей организма, происходили значительные сдвиги адаптационно-дезадаптационных механизмов. При потере 20% ОЦК даже на седьмые сутки постгеморрагического периода показатели, характеризующие интенсивность процессов перекисного окисления липидов, неспецифической стрессовой реакции не достигают нормальных величин [50].

Но любая кровопотеря сопровождается развитием гипоксии. Здесь, на наш взгляд, включаются многочисленные механизмы компенсации кровопотери, усиливающие степень гипоксии. Активируются симпатоадреналовая система, что не может не сопровождаться вазоконстрикцией. Однако катехоламиновое влияние носит кратковременный характер, несколько позже включаются долговременные механизмы. Так, в результате изменения напряжения сдвига усиливается синтез эндотелинов — мощных вазоконстрикторов. Эндотелиновая вазоконстрикция касается и ренальных сосудов. Гипоксия почки сопровождается выбросом ренина и неминуемой генерацией ангиотензина-Н - мощнейшего из известных вазоконстрикторов. Такая реакция сопровождается обязательным выбросом альдостерона и последующей реабсорбцией натрия из первичной мочи в канальцах почки. Гипернатриемия приводит к ряду параллельных реакций, например, гиперсекреции АДГ (антидиуретического гормона) и, следовательно, увеличению ОЦК. Более того, натрий проникает в эндотелиальные клетки, привлекает за собой воду, что приводит к их отеку и пассивной» вазоконстрикции. Также, натрий проникает в гладкомышечные клетки сосудов, вызывает их деполяризацию, а, следовательно, способствует увеличению базального тонуса сосудов. В конечном итоге описанная реакция приводит к длительной вазоконстрикции, усугубляющей гипоксию.

Однако дело не ограничивается только этим. В процесс формирования гипоксии включаются мощные гемические механизмы. С одной стороны, безусловно, происходит активация тромбоцитов и формирование агрегатов кровяных пластинок. Более того, кровяные пластинки, как показано нами, активно формируют конгломераты с лимфоцитами. Параллельно идет процесс формирования «розеток» между эритроцитами и лейкоцитами, между лейкоцитами, эритроцитами и тромбоцитами, что также сопровождается нарушением микроциркуляции и углублением гипоксии. Образование агрегатов между лейкоцитами и тромбоцитами, сопровождается высвобождением из кровяных пластинок факторов агрегации, вазоконстрикции и свертывания крови (РЗ, Р4, серотонина, норадреналина, ТхА2, у1^, фибриназы и др.), что еще сильнее усугубляет создавшееся положение. Между тем, при блокаде микроциркуляторного русла агрегатами, образуемыми лейкоцитами и эритроцитами, а также тромбоцитами и эритроцитами, происходит лизис эритроцитов с выделением факторов свертывания крови и появления активной (анионной) фосфолипидной поверхности, что усиливает внутрисосудистую коагуляцию. Вряд ли при этом остаются безучастными и лейкоциты. Известно, что моноциты способны синтезировать и экспрессировать тканевой фактор, а нейтрофилам он доставляется тромбоцитами. По всей видимости, тканевой фактор белых кровяных телец также принимает участие в процессе свертывания крови и блокаде микроциркуляторного русла.

На мембране эндотелия начинают экспрессироваться молекулы адгезии класса УСАМ и 1САМ, что не может не сопровождаться адгезией клеток крови к эндотелию. Уже это обстоятельство сопровождается уменьшением % просвета микрососудов и дополнительным блоком микроциркуляции. Однако, в этот момент, на наш взгляд, включаются самые мощные патофизиологические механизмы гипоксии. Контакт лейкоцитов и эндотелиоцитов сопровождается взаимной активацией и продукцией из эндотелиальных клеток и моноцитов тканевого фактора. Последний инициирует внешний путь свертывания крови, что сопровождается фибринообразованием и последующим фибрин-эмболизмом. Возникают участки деэндотелизации, обнажается коллаген, что приводит к активации фактора Хагемана и запуску внутреннего пути активации протромбиназы. Последняя усиливает фибринообразование.

Названные механизмы усугубляют гипоксию, казалось бы, на небольшой объем теряемой :крови. Развитие гипоксии незамедлительно сопровождается сдвигом рН в кислую сторону и развитием ацидоза. Особенно ожидаем сдвиг в кислую сторону в цитоплазме клеток, что не может не сопровождаться физио-химическими изменениями белков, в том числе ферментов. Вероятно, в результате конформационных сдвигов у части ферментов ингибируются активные центры, а у катепсинов последние экспрессируются. Результатом этого процесса является усиление неспецифического протеолиза белков цитоплазмы с образованием большого количества пептидов, то есть цитомединов. Последние экспортируются из клеток, попадают в жидкие среды организма и достигают иммунокомпетентных клеток.

И в нашем случае ткань легкого ответила на стрессовую ситуацию выбросом цитомединов, которые экспортировались из органа в жидкие среды организма (в том числе кровь) и направились на коррекцию нарушений гомеостаза. К моменту начала экспериментов (через 5 дней) восстановление пула цитомединов, влияющих на адаптивный иммунитет, до первоначального уровня не произошло. Вот почему в опытах по изучению биологических свойств пептиды, выделенные из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю, давали менее выраженный эффект по сравнению с «интактными», что проявлялось в значительном снижении их влияния на экспрессию СО-маркеров лимфоцитов крови.

В нашей работе было замечено, что лимфоциты крови здоровых людей в значительно меньшей степени экспрессировали СБ-маркеры при контакте с пептидами, нежели чем лимфоциты крови больных. Этот факт не должен вызывать удивление и ранее многократно описывался [6, 78, 79, 80, 122, 125]. Дело в том, что на лимфоцитах здоровых людей экспрессия СО-маркеров всегда достигает оптимальных, максимальных значений. Последующая стимуляция таких лимфоцитов, конечно, не может приводить к росту числа СО-маркеров. Вместе с тем лимфоциты больных дефектны и на поверхности мембраны таких клеток имеется дефицит СО-маркеров. Поэтому иммуностимуляция таких лимфоцитов, в том числе и регуляторными пептидами, ожидаемо сопровождается ростом числа СО-молекул, что и было нами зарегистрировано.

В наших исследованиях не было замечено никакой ответной реакции со стороны гуморального звена адаптивного иммунитета. Динамика экспрессии маркеров С022+ не изменялась при введении ни «интактных», ни «постгеморрагических» цитомединов, ни на лимфоцитах здоровых, ни больных. Этот показатель характеризует избирательное влияние цитомединов, полученных из легких и плазмы крови животных, на отдельные звенья адаптивного иммунитета.

В то же время популяция «натуральных киллеров», несущая маркер СО 16+, очень активно реагирует на введение регуляторных пептидов. В опытах с цитомединами, выделенными из легких и плазмы крови интактных животных, а также с цитомединами из легких животных, перенесших острую кровопотерю, количество клеток несущих маркер СО 16+ возрастало в несколько раз.

Одним из грозных осложнений многих заболеваний является синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания. Следует отметить, что ДВС-синдром на начальных этапах носит защитный характер, так как ограничивает очаг деструкции или воспаления и препятствует распространению патогенной флоры, бактериальных токсинов и продуктов деструкции тканей по организму. Механизм его развития в патологии представлен многими звеньями. Происходит усиление агрегации тромбоцитов, образование сладжей из форменных элементов крови (главным образом эритроцитов), стимуляция процесса свертывания крови, в результате чего появляются сгустки фибрина в сосудистом русле [8, 77, 95, 120]. Не подлежит сомнению, что одним из основных факторов, способствующих развитию и генерализации ДВС-синдрома, являются везикуляция и появление осколков клеточных мембран, несущих тканевой фактор, а также повреждение сосудистого эндотелия с закономерной активацией циркулирующих тромбоцитов. Данные процессы носят избыточный характер, что приводит к чрезвычайно массивной и распространенной блокаде микроциркуляторного русла, расходу основных естественных антикоагулянтов, что усиливает внутрисосудистое свертывание крови и приводит в конечном итоге к «коагулопатии потребления». Нами показано, что цитомедины, выделенные из легких и плазмы животных, обладают антикоагулянтной активностью и в то же время способны усиливать эуглобулиновый фибринолиз и ингибировать каолиновый. Указанные свойства пептидов имеют важное саногенетическое значение при развитии патологического процесса в: организме, так как при этом состоянии обязательно усиливается постоянное внутрисосудистое свертывание крови, иногда вплоть до ДВС-синдрома, и ингибируется фибринолиз. В наших исследованиях установлено, что показатели системы коагуляционного гемостаза, а также лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия больше изменялась при введении пептидов, выделенных из легких и плазмы крови животных, перенесших острую кровопотерю. Исходя из этого, мы можем полагать о возникновении не только количественного, но и качественного изменения пула регуляторных пептидов после острой кровопотери. Следствием этого является изменение их свойств, что и было нами зафиксировано.

Нами установлено, что пептиды интактных и перенесших кровопотерю животных усиливают агрегабельность тромбоцитов. В принципе этот факт не нов и неоднократно отмечался в литературе [24, 27, 60, 62, 115, 117]. Однако, до настоящего времени не существует достаточно полного понимания механизма повышения агрегирующих свойств тромбоцитов под действием пептидов. Для ответа на поставленный вопрос напрашивается несколько версий. Во-первых, в случае спонтанной агрегации in vitro может происходить агглютинация тромбоцитов. В отличие от агрегации, агглютинация является пассивным процессом, протекающим независимо от метаболических реакций в кровяных пластинках. Агглютинация связана с нерецепторным механизмом действия пептидов на мембрану тромбоцитов в силу либо электростатического, либо ваандерваальсовского или ковалентного взаимодействия с гликопротеидами мембран. В последующем, тромбоциты «нагруженные» пептидами склеиваются (агглютинируют) между собой [53, 62]. Не исключен и другой вариант. Пептиды, возможно, активируют примембранную фосфолипазу А2, которая взаимодействует с фосфолипидами мембраны. Результатом такого взаимодействия являются, с одной стороны, образование фактора активации тромбоцитов (PAF), а с другой - появление арахидоновой кислоты и, как следствие, образование тромбоксана А2. То и другое соединение являются мощнейшими агрегантами тромбоцитов. Наконец, не исключен и третий вариант. Цитомедины либо рецепторным путем [57], либо неспецифически усиливают экспрессию гликопротеиновых рецепторов агрегации GpIIb/IIIa, Gplb. 79

Нами установлено, что изучаемые регуляторные пептиды наиболее заметно усиливают лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию. Почему? Следует сразу указать, что приоритет в открытии данного феномена целиком принадлежит читинским ученым: Ю.А. Витковскому и A.B. Солпову (1999 -2005). По мнению Rinder М. (1991) лейкоцитарно-тромбоцитарные взаимодействия вообще реализуются посредством молекулы GMP140 (Р-селектин). Позже на мембране тромбоцитов Diacovo T.G. (1994) обнаружил молекулу ICAM-2, выполняющую ту же функцию. Как установлено А.В.Солповым (2005), лигандом лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии выступают молекулы ICAM-1. Им же показано, что механизм ЛТА включает в себя образование интегриновых и неинтегриновых мостов, таких как allb/ß3- и ßl-связанные интегрины, Р-селектин- PSGL и CD40-CD40L. Вероятно, регуляторные пептиды либо рецепторным, либо нерецепторным путем способны усиливать экспрессию названных адгезивных молекул и тем самым усиливать ЛТА.