Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Роль гипофиза в регуляции иммунитета и гемостаза

министерство здравоохранения и медицинской промышленности российской федерации читинский государственный медицинский

Р Г 5 С Л институт

1 п

На правах рукописи

УДК: 612.432/.434:612.017.1:616-005.1-08

ПАТЕЮК Андрей Владимирович

РОЛЬ ГИПОФИЗА В РЕГУЛЯЦИИ ИММУНИТЕТА И ГЕМОСТАЗА

(14.00.17- нормальная физиология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ЧИТА - 1995

Работа выполнена на кафедре нормальной физиологии Читинского государственного медицинского института.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки Российской Федерации, Лауреат премии Совмина СССР, доктор медицинских наук, профессор Б.И.Кузник.

Лауреат премии Совмина

СССР, доктор медицинских

наук, профессор

Н.Н.Цыбиков,

доктор медицинских наук

А.В.Степанов.

Ведущая организация: Институт физиологии СОРАМН

(г.Новосибирск)

Защита состоится " /У " ¿г.1995 года в /¿У в^часов на заседании Специализированного совета К 084.74.01 при Читинском медицинском институте по адресу 672000, г. Чита, ул. Горького - 39 "А".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Читинского медицинского института.

Автореферат разослан "/V " 1995 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

А.Н.Ложкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы все большее внимание уделяется изучению центральных механизмов регуляции иммуни-тета и системы свертывания крови. В аспекте данной проблемы, исследование механизмов участия гипофиза в поддержании иммуно-логического и коагуляционного гомеостаза .приобретает важное значение. Это объясняется анатомическими, гистологическими и функциональными особенностями гипофиза (Девойно Л.В., 1977; Альперина Е.Л., 1985; Абрамов В.В., 1991).

Известно, что удаление гипофиза приводит к инволютивным изменениям в тимусе (Корнева Е.А., 1993). В то же время информации о взаимосвязи гипофиза и сумки Фабрициуса,'являющейся органом дифференцировки B-лимфоцитов у птиц, нам в доступной литературе найти не удалось.

Вместе с тем, эти взаимосвязи представляются нам наиболее важными для понимания роли гипофиза в реакциях гуморального иммунитета, так как именно в фолликулах бурсы В-клетками приобретается гетерогенность по их антигенной специфичности, что и обеспечивает разнообразие образующихся антител (Болотников И.А., Соловьев Ю.В., 1980; Болотников И.А., 1982). Бурсэктомия не сопровождается значительными нарушениями клеточного иммунитета. Вот почему куры служат идеальной моделью для изучения защитных реакций, связанных с гуморальным иммунным ответом. Необходимо также напомнить, что сумка Фабрициуса является эндокринным органом. Клетками бурсы выделяются гуморальные факторы, оказывающие влияние на созревание B-лимфоцитов и приобретение ими специфических свойств (Степанов A.B., 1988).

Если рассматривать бурсу как железу внутренней секреции, то можно с определенной долей вероятности предполагать наличие взаимосвязей между сумкой Фабрициуса и гипофизом. Системы иммунитета и гемостаза находятся в тесных взаимоотношениях, поэтому проводимая нами работа по выявлению новых механизмов регуляции иммунологических процессов и реакций гемостаза весьма актуальна в плане разработки новых методов лечения заболеваний,i сопровождающихся иммунодефицитами и явлениями гиперкойгуляции.

Цели и задачи исследования. Основной целью наших исследований явилось выяснение взаимосвязи между гипофизом, тимусом и бурсой в регуляции иммунитета и гемостаза.

Перед нами стояли следующие задачи:

1.Изучить, какие изменения в иммунитете и системе сверты-зания крови возникают у гипофиз-, тим - и бурсэюгомированных дыплят.

2.Выделить из перёдней'и задней долей гипофиза полипептидные фракции и изучить их влияние на системы иммунитета и гемостаза.

3.Выяснить, возможна ли коррекция иммунологических и коа-гуологических сдвигов у кур с удаленным гипофизом, тимусом и бурсой под влиянием полипептидов, выделенных из гипофиза.

4.Определить, как изменяется состав и биологическая активность полипептидов, выделенных из тимуса и бурсы гипофизэктомированных цыплят.

Научная новизна. Установлено, что существует связь между гипофизом, тимусом и сумкой Фабрициуса. В результате удаления гипофиза, тимуса и бурсы или совместной тим- и бурсэктомии ликвидируется одно или оба звена этой связи, что, в конечном итоге, приводит к развитию иммунодефицита и гиперкоагуляции. '

После удаления гипофиза склерозируется строма, наблюдается гиперплазия лимфоидной части и массивные скопления малых лимфоцитов в паренхиме и в строме сумки Фабрициуса.

Установлено, что пептиды передней и задней долей гипофиза, тимуса и бурсы обладают различными биологическими эффектами. Наиболее значительное действие на состояние гуморального иммунитета оказывают пептиды задней доли гипофиза и бурсилин, а на клеточный иммунитет - пептиды передней доли гипофиза и тимуса. В то же время действие пептидов гипофиза выражено сильнее, чем тимуса и бурсы. При совместном применении пептидов передней и задней долей гипофиза отмечается полная нормализация как со стороны клеточного, так и гуморального иммунитета у гипофизэктомированных цыплят.

Введение тималина приводит к более выраженным сдвигам показателей гемостаза у неонатально тимэктомированных цыплят, чем при использовании пептидов передней доли гипофиза, хотя полной нормализации системы гемостаза и фибринолиза при этом не отмечается. Последнее наблюдается лишь при совместном применении пептидов передней и задней долей гипофиза.

Установлено, что пептиды задней доли гипофиза, также как и бурсы , в большей степени,' чем передней, нормализуют состояние иммунитета и гемокоагуляции у неонатально бурсэктомированных цыплят. Совместное применение пептидов передней и задней долей гипофиза полностью коррегирует нарушения иммунитета и гемостаза, возникающие при бурсэктомии.

Применение пептидов гипофиза при каловом перитоните оказывает положительный эффект, на систему иммунитета,

гемостаза и фибринолиза. По механизму действия пептиды передней доли гипофиза напоминают пептиды тимуса, а задней - бурсы.

Удаление гипофиза также приводит к изменению свойств цито-мединов, полученных из тимуса и бурсы. Наряду с этим происходят качественные и количественные сдвиги в пептидном составе, что выражается в потере ими иммуностимулирующего эффекта как в опы-как in vivo, так и in vitro. Приведенные факты являются доказательством наличия прямой или опосредованной связи между гипофизом, тимусом и сумкой Фабрициуса ( или ее аналогом у млекопитающих).

Практическая ценность работы. Нами выявлен один из механизмов центральной регуляции иммунитета и гемостаза. Это позволяет расширить представления о регуляции иммуногенеза и системы свертывания крови, а также о механизме коагулопатий и иммунодефицитных состояний, связанных с дисфункциями гипофиза и других эндокринных желез. Получены новые полипептидные вещества из передней и задней долей гипофиза, применение которых возможно в клинике с целью коррекции нарушений иммунитета и гемостаза, возникающих при большинстве заболеваний.

Полученные факты внедрены в учебный процесс кафедр нормальной и патологической физиологии Читинского медицинского института.

Положения, выносимые на защиту.

1. Гипофизэктомия сопровождается значительными сдвигами в системах клеточного и гуморального иммунитета, а также развитием гиперкоагуляции. Удаление гипофиза приводит к атрофии тимуса и склерозированию бурсы и, следовательно, к нарушению их функции.

2. Полипептиды гипофиза при введении гипофизэк-томированным животным полностью нивелируют отрицательные последствия, возникающие в результате удаления гипофиза.

3. Полипептиды гипофиза способствуют нормализации показателей иммунитета и гемостаза у тим- и бурсэктомированных птиц, и при каловом перитоните у крыс.

4. Экстирпация гипофиза приводит к значительному снижению способности полипептидов из тимуса и бурсы коррегировать иммунодефицитные и гиперкоа'гуляционные нарушения у животных с экспериментальным иммунодефицитом и стимулировать экспрессию рецепторов, свойственных Т- и В-лимфоцитам.

5. Хроматографический анализ полипептидов из тимуса и бурсы гипофизэктомированных птиц свидетельствует о структурных и количественных изменениях в их составе.

Апробация работы. Материалы исследований были доложены на X, XI межвузовских конференциях молодых ученых по проблеме "Физиология и патология иммуногенеза и гемостаза" (Чита, 1988), на регионарной научной конференции "Экспериментальная и клиническая иммунология на Востоке страны" (Красноярск, 1988), на Всесоюзной конференции "Стресс и иммунитет" (Ростов н/Д, 1989), на межвузовской конференции "Регуляторные пептиды в норме и патологии /цитомедины/" (Чита, 1991), на симпозиуме "Пептидные биорегуляторы-цитомедины" (Санкт-Петербург, 1992).

Основные данные работы отражены в 6 публикациях.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 174 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, четырех глав собственных результатов, обсуждения полученных данных, выводов, указателя литературы. Работа иллюстрирована' таблицами'и рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Хронические эксперименты поставлены на 450 цыплятах породы Леггорн КРОСС-288 и на 260 лабораторных неимбредных крысах самцах. Птицы подвергались неонатальной . гипофизэктомии, бурсэктомии и тимэктомии. У 140 крыс вызывали каловый перитонит. Кроме того, исследована кровь 32 здоровых людей и 8 больных ожоговой болезнью (ожог На - III степени - 15-30% поверхности тела). Объектами исследования служили кровь, плазма, сыворотка, форменные элементы крови, ткани экспериментальных животных (тимус, сумка Фабрициуса, селезенка), а также гипофиз , полученный от 240 свиней в возрасте 1 года.

Биологически активные вещества из гипофиза, вилочковой железы и сумки Фабрициуса получали модифицированным способом В.Г.Морозова и В.Х.Хавинсона (1974).

Хроматографический анализ полипептидов, выделенных из гипофиза, бурсы и тимуса проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе "Irica" (Япония) методом обращенных фаз. Анализ хроматограмм осуществлялся автоматически с использованием хроматографического процессора "Chromatocorder 12". Стандартная обработка хроматограмм проводилась в режиме регистрации времени выхода пика, обсчета его площади и удельной доли.

Оперативные вмешательства на животных.

1. Неонатальная гипофизэктомия. Птиц оперировали в первые 6 часов после рождения. Цыплятам под гексеналовым наркозом,

а середине третьей небной складки, делали прокол неба сновной кости и дна турецкого седла иглой диаметром 1,2 мм. алее извлекали иглу и по образованному каналу в область грецкого седла вводили щипцы для биопсии от эндоскопа 1пония) и отсекали гипофиз. Дефект кости замещали стерильным гематологическим воском. На поврежденный участок слизистой эба наносили слой медицинского клея БФ с раствором зиллиантовой зелени.

2. Неонатальная тимэктомия птиц. Цыпленка в первые 6 часов эсле рождения погружали в гексенаповый наркоз и производили едиальный разрез по задней поверхности шеи. Вследствие того, о тимус у птиц состоит из 8-10 долек, каждую из них удаляли гдельно, отпрепаровывая от яремной вены. Рану ушивали (ловыми швами.

3. Неонатальная бурсэктомия. Птиц подвергали оперативному чешательству в первые 6 часов после рождения. Под жсеналовым наркозом цыплятам, на середине расстояния между тчиком и клоакой, разрезали кожу. Тупфером отпрепаровывали /рсу, выводили из раны и отсекали в месте прикрепления к зямой кишке. Атравматичными иглами зашивали кожу.

Птиц, составивших контрольную группу, в этом же возрасте адвергали ложной операции, для чего воспроизводили все апы оперативнного вмешательства за исключением удаления шофиза, тимуса или бурсы.

4. Экспериментальный перитонит. Перитониту крыс вызывали |утрибрюшинным введением 5 % каловой взвеси из расчета 3 1/кг массы.

Иммунный статус цыплят оценивали следующими юсобами. После однократной иммунизации экспериментальных квотных эритроцитами барана ( внутрибрюшинно вводили 7 х Рклеток на 1кг. веса тела ) определяли на 5-е сутки в реакциях магглютинации и гемолиза к ксеногенным эритроцитам. В элезенке животных регистрировали количество пителообразующих клеток (АОК) по методу А.СиптпдИат ( )65). Кроме того, в мазках периферической крови спериментальных птиц, окрашенных по Романовскому-Гимзе, »дсчитывали содержание лимфоцитов по общепринятым зтодам, определяли уровень зависимой от антител клеточной

1ТОТОКСИЧНОСТИ.

С целью изучения действия полипептидов из гипофиза, тимуса эурсы на рецепторный аппарат иммунокомпетентных клеток, суспензию лимфоидных клеток здоровых людей и ожоговых •льных, вносили исследуемые полипептидные препараты в нцентрации 0,1 мкг/мл. После двухчасовой инкубации при 37 определяли содержание Т-, Т-активных и В-лимфоцитов

методами розеткообразования с эритроцитами барана ( Е-РС ЕА-РОК, ЕАК-РОК) (Jondal М, et al,, 1972: Kerman В, et al,, 1976 Состояние свертывающей системы крови и фибринол оценивали по следующим тестам: время рекальцификац iBergerhof H.D., Roka L., 1954), каолин-кефалиновоевремя (Larri M.J.7 Weil-lard С., 1957), протромбиновое время (Quick A.J., 194: тромбиновое время (Сирмаи Э., 1957), запи тромбоэластограммы цельной крови крыс, запись агрегац тромбоцитов (Born G., 1962). Фибринолиз оценивали по скорос растворения эуглобулинового сгустка по методу H.Kowa^ K.Buluk (1954).

Классический и альтернативный путь активации системы ком лемента определяли по методу S.Tanaka et al. (1986).

Полученные данные обрабатывали методом вариационн статистики для связанных и несвязанных между соб наблюдений и вычисляли показатель достоверности различ (Венчиков А.И.. Венчиков В.А.. 1974)

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ВЛИЯНИЕ ГИПОФИЗА НА СОСТОЯНИЕ ИММУНИТЕТА И ГЕМОСТАЗА У ПТИЦ

Влияние гипофизэктомии на состояние иммунитета и гемостаза у птиц

Отмечено, что вес оперированных птиц был примерно в < раза меньше, чем контрольных.

Значительные изменения выявлены в иммунных органах. В бурсы у гипофизэктомированных цыплят увеличивался почт1 10 раз, примерно в такой же степени возрастала плотность клет в селезенке, хотя масса самой селезенки по отношению к мае тела падала примерно в 3,2 раза. Визуально отмечено снижен в этом органе количества стромальных элементов. Выявле уменьшение веса тимуса относительно тела в 1,2 раза.

При гипофизэктомии у птиц отмечены значительн изменения в реактивности иммунной системы: в селезенке в I раза уменьшалось количество АОК и практически не выявил1/ агглютинины и гемолизины . При этом резко снижала неспецифическая антителозависимая цитотоксичность клеток

При гистологическом исследовании бурсы у таких птиц обе ружены слабо выраженные признаки склерозирован стромальных элементов, гиперплазия лимфоидной части массивные скопления малых лимфоцитов в паренхиме .частично, в строме сумки Фабрициуса.

Значительные сдвиги после гипофизэктомии наблюдалис! в системе гемостаза. У таких цыплят развивала

перкоагуляция: сокращалось время свертывания крови и кальцификации плазмы (в 1,4-1,5 раза), уменьшалось □линовое, протромбиновое и тромби-новое время (в 1,4-1,6 за), повышалось содержание фибриногена (в 1,6 раза) и гибировался фибринолиз (в 1,3 раза).

Следовательно, при гипофизэктомии нарушаются такие 13ненно важные системы, как иммунитета (угнетается развитие функционирование иммунокомпетентных органов: тимуса, рсы. селезенки, падает реактивность иммунной системы, рушается клеточный и. особенно, гуморальный иммунитет), звивается выраженная гиперкоагуляция и угнетается юринолиз.

Влияние полипептидов гипофиза на иммунитет и гемостаз у интактных птиц

Пептиды, полученные из гипофиза свиней, подвергались ионо-менной хроматографии на высокоэффективном жидкостном эматографе "1пса" методом обращенных фаз. Полипептиды передней и задней долей гипофиза разделялись тодом высокоэффективной жидкостной хроматографии на 8 Э фракций, различающихся по молекулярной массе и степени дрофобности. Полипептиды передней доли отличаются от липептидов задней доли гипофиза меньшей степенью дрофобности и большим содержанием низкомолекулярных эдинений ( рис. 1, 2).

Установлено, что у птиц, получавших пептиды, увеличивалось держание лейкоцитов в крови, повышался вес селезенки и :ло в ней кариоцитов, а также незначительно возрастало число итроцитов. АОК, повышался титр гемагглютининов и иолизинов. Наибольшие изменения происходили при зместном применении пептидов передней и задней долей юфиза, наименьшие - при введении пептидов передней доли.

Таким образом, пептиды гипофиза оказывают 1мулирующее влияние на иммунитет птиц. Кроме того, введение чтидов передней доли гипофиза приводит к незначительной [еокоагуляции. а задней - к гипокоагуляции. При совместном вменении пептидов передней и задней долей гипофиза ленений со стороны гемостаза не наблюдалось. Сравнительное влияние пептидов гипофиза, тимуса

и бурсы на состояние иммунитета и гемостаза

у неонатально гипофизэктомированных цыплят Неонатальная гипофизэктомия приводит к значительному угне-1ию всех изучаемых показателей иммунитета, а также к ¡витию гиперкоагуляции.

Наши эксперименты свидетельствуют о том, что пептиды пе-1ней и задней долей гипофиза, тималин и бурсилин обладают

0««110> <41* К« и * «

<Ч<Ч ♦ Г» « ®

< * вГ) »«ГР Т М

«-»о«*©-и

ПГ <в МП в Л П И N

К в) * « р К

«> Ю ф - Л) N

••(чптптм

Рис.1. Хроматограмма полипептидов передней доли гипофиза

Г. П « Л ГК <4 № * « «

« т п * п ь. к. и

С С С С С С

-ч Л

II « 14« <4 <4 Г> N 9 П МГ»« ШЧ> « N ПЛ.»» * N

-♦.«»кмыл«

ЧМ -

о» в юм к » N ь <ч

К Г> 'Л - Г> ® N ® г> 1> •< N Г V О

ШОПТ^ТЧМГ

о о с

(ГИМН

• I —¡г,;

Рис.2. Хроматограмма полипептидов задней доли гипофиза

х

различными биологическими эффектами. Наиболее значительное действие на состояние гуморального иммунитета оказывали пептиды задней доли гипофиза и бурсилин, а на клеточный иммунитет -пептиды передней доли гипофиза и тималин. В то же время влияние пептидов гипофиза было выражено сильнее, чем тимуса и бурсы. При совместном применении пептидов передней и задней долей гипофиза отмечалась полная нормализация как со стороны клеточного, так и гуморального иммунитета.

Наконец, пептиды задней доли гипофиза и особенно комплекс пептидов передней и задней долей гипофиза в большей степени, чем тималин и бурсилин, восстанавливали состояние гемокоагуля-ции у гипофизэктомированных птиц. Сказанное в значительной степени связано с нормализацией физиологического иммунного механизма регуляции свертывания крови, и фибринолиза.

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОВ ГИПОФИЗА И ТИМУСА НА СОСТОЯНИЕ ИММУНИТЕТА И ГЕМОСТАЗА У

НЕОНАТАЛЬНО

ТИМЭКТОМИРОВАННЫХ И БУРСЭКТОМИРОВАННЫХ

цыцлят

И НА ТЕЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ПЕРИТОНИТА У

КРЫС

Влияние пептидов гипофиза и тимуса на состояние иммунитета и гемостаза у тимэктомированных цыплят.

Установлено, что у неонатально тимэктомированных цыплят падал вес тела, селезенки и сумки Фабрициуса, уменьшалось количество лейкоцитов, эритроцитов и АОК в селезенке, снижался титр гемолизинов и гемагглютининов.

При введении пептидов передней доли гипофиза у тимэктомированных птиц увеличивался вес тела и количество лейкоцитов в периферической крови. Остальные показатели иммунитета изменялись незначительно. Пептиды задней доли гипофиза приводили к выраженному увеличению числа АОК, титра гемолизинов и гемагглютининов, веса бурсы и селезенки. Совместное введение пептидов передней и задней долей гипофиза сопровождалось полной нормализацией иммунитета птиц, а вес бурсы и селезенки даже несколько превышал вес этих органов у ложнооперированных цыплят.

Введение тималина незначительно повышало вес бурсы и селезенки, количество АОК и лейкоцитов при этом приближалось к норме, резко возрастал титр гемолизинов и гемагглютининов.

После неонатальной тимэктомии у цыплят развивалась гиперкоагуляция.

При введении полипептидов передней доли гипофиза тимэкто-

мированным цыплятам отмечались лишь незначительные изменения показателей гемостаза в сторону нормализации. Введение полипептидов задней доли гипофиза тимэктомированным цыплятам приводило к большей нормализации показателей коагуляционного гемостаза, а совместная инъекция пептидов передней и задней долей гипофиза вызывала практически полную нормализацию изучаемых показателей.

Введение тималина неонатально тимэктомированным цыплятам сопровождалось более выраженными изменениями гемостаза, чем пептидов передней доли гипофиза, хотя полной их нормализации при этом не отмечалось. Последнее наблюдалось лишь при совместном применении пептидов передней и задней долей гипофиза.

Таким образом, пептиды гипофиза, одновременно с восстановлением иммунитета, нормализуют процессы свертывания крови у неонатально тимэктомированных цыплят.

Влияние пептидов гипофиза и сумки Фабрициуса на систему иммунитета и гемостаза у неонатально

бурсэктомированных цыплят Нами установлено, что бурсэктомированные птицы отставали в весе, у них существенно снижалась масса селезенки, а также количество в ней кариоцитов. При иммунизации эритроцитами барана у бурсэктомированных птиц отмечалось резкое уменьшение титра гемагглютининов, гемолизинов и числа АОК в селезенке.

Введение пептидов передней доли гипофиза неонатально бурсэктомированным цыплятам приводило к некоторому увеличению веса селезенки, числа кариоцитов и АОК, титра гемолизинов и гемагглютининов. Введение пептидов задней доли гипофиза практически полностью коррегировало нарушения гуморального иммунитета, возникающие при бурсэктомии. Совместное применение пептидов передней и задней долей гипофиза, кроме полного восстановления иммунитета, вызывало незначительное превышение веса селезенки и числа кариоцитов в ней по сравнению с ложнооперированными цыплятами.

Пептиды из бурсы вызывали наибольшие изменения со стороны селезенки, ее вес и число клеток в ней увеличивалось, возрастало количество АОК, повышался титр гемолизинов и гемагглютининов.

В нашем эксперименте неонатальная бурсэктомия также приводила к развитию гиперкоагуляции. При введении таким цыплятам полипептидных факюров из передней доли гипофиза у них отмечалась частичная нормализация гемокоагуляции. При введении неонатально бурсэктомированным цыплятам пептидов

задней доли гипофиза наблюдалась полная нормализация гемостаза, хотя и отмечалось некоторое торможение фибринолиза. При совместном применении пептидов передней и задней долей гипофиза у бурсэктомированных цыплят выявлена незначительная гипокоагуляция. Однако, при совместном введении пептидов передней и задней долей гипофиза на фоне гипокоагуляции наблюдалось невыраженное угнетение фибринолиза. Введение пептидов бурсы приводило к практически полной нормализации показателей системы гемостаза и фибринолиза у бурсэктомированных птиц.

Влияние пептидов гипофиза, тимуса и бурсы на

состояние иммунитета и гемостаза у цыплят с одновременно удаленными тимусом и бурсой

Установлено, что у птиц без бурсы и тимуса резко снижен иммунный ответ на ксеногенные эритроциты. При этом у цыплят антитела практически не выявлялись, уменьшалось количество лейкоцитов и АОК, понижался вес тела и селезенки.

Введение пептидов передней доли гипофиза практически полностью восстанавливало вес тела и число лейкоцитов и в меньшей степени влияло на вес селезенки, количество АОК, титр гемолизинов и гемагглютининов.

При введении пептидов задней доли гипофиза отмечалось более значительное, чем при иъекции пептидов передней доли, увеличение веса селезенки. АОК. титра антител на ксеногенные эритроциты. Вес тела и количество лейкоцитов при этом практически не изменялись.

Совместное введение пептидов передней и задней долей гипофиза приближало изучаемые показатели системы иммунитетах норме.

Инъекции тималина незначительно повышали вес тела и селезенки, увеличивали количество клеток в селезенке и АОК , титр гемолизинов и гемагглютининов. Под влиянием тималина резко возрастало количество лейкоцитов.

Пептиды бурсы вызывали меньшее увеличение веса тела, селезенки и количества лейкоцитов, чем пептиды гипофиза и тималин. но значительно повышали количество АОК. титр гемолизинов и гемагглютининов.

У птиц с удаленными центральными органами иммунитета наблюдалась выраженная гиперкоагуляция.

При введении таким цыплятам пептидов передней доли гипофиза отмечалась частичная нормализация показателей гемостаза.

Введение пептидов задней доли гипофиза вызывало более выраженные позитивные изменения в гемокоагуляции. Однако, нормализации процессов свертывания крови введением пептидов

задней доли гипофиза у одновременно тим- и бурсэктомированных цыплят достичь не удалось.

Совместное применение пептидов передней и задней долей гипофиза приводило к полной нормализации показателей гемокоагуляции. Введение тималина и пептидов бурсы сопровождалось менее выраженными изменениями исследуемых показателей.

Полученные данные свидетельствуют о том, что при одновременном удалении тимуса и бурсы у цыплят развивается выраженная иммунодепрессия и гиперкоагуляция. Пептидные факторы гипофиза способны полностью нормализовать иммунный статус и гемостаз у таких цыплят. Тималин и пептиды бурсы оказывают менее выраженное действие на изучаемые показатели.

Сравнительное влияние пептидов гипофиза, тимуса и бурсы на течение экспериментального калового перитонита у крыс

При развитии перитонита в наших опытах отмечалось резкое угнетение иммунитета: уровень гемолизинов и гемагглютининов снижался на 40%, количество АОК уменьшалось в 1,8 раза, число лейкоцитов возрастало в 2 раза. Одновременно у таких крыс отмечалась выраженная гиперкоагуляция.

При лечении больных животных полипептидами гипофиза, тимуса и бурсы выявлены нормализующие сдвиги в иммунной системе:приближалось к норме количество 'лейкоцитов, повышался уровень гемолизинов и гемагглютининов, а также количество АОК. При этом пептиды задней доли гипофиза и бурсы оказывали более выраженное действие на показатели гуморального иммунитета. При совместном введении пептидов передней и задней долей гипофиза показатели иммунитета даже несколько превосходили аналогичные у интактных животных.

При лечении больных животных пептидами передней и задней долей гипофиза, тимуса и бурсы отмечалась тенденция к нормализации свертывания крови. Пептиды передней доли гипофиза и тималин оказывали менее выраженное действие на систему гемокоагуляции, чем задней доли и бурсы. При совместном применении пептидов передней и задней долей гипофиза наблюдалась незначительная гипокоагуляция.

Таким образом, применение пептидов гипофиза при каловом перитоните оказывает положительный эффект на систему иммунитета и гемостаза. По механизму действия пептиды передней доли гипофиза близки к тималину, а задней - к пептидам бурсы.

ВЛИЯНИЕ ГИП0ФИЗЭКТ0МИИ НА БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЛИПЕПТИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ТИМУСА И БУРСЫ Влияние гипофизэктомии на биологическую активность полипептидов, выделенных из тимуса в опытах in vivo Инъекции полипептидов из вилочковой железы ложнооперированных птиц больным крысам приводили к снижению абсолютного числа лимфоцитов. Вместе с тем, после введения цитомединов из тимуса ложнооперированных цыплят отмечалось повышение количества АОК селезенки, возрастание индекса цитотоксичности, титров гемолизинов и гемагглютининов к эритроцитам барана. Усиление иммунитета у таких крыс сопровождалось ликвидацией гиперкоагуляционных сдвигов, наблюдавшихся после развития калового перитонита.

Эффект от применения препаратов из вилочковой железы гипофизэктомированных цыплят оказался слабо выраженным. Показатели иммунитета и гемостаза при введении этих полипептидов не имели тенденции к нормализации. Влияние гипофизэктомии на биологическую активность полипептидов, выделенных из тимуса в опытах in vitro Наши наблюдения свидетельствуют о том, что цитомедины из вилочковой железы ложнооперированных птиц обладали способностью стимулировать экспрессию рецепторов на Т-лимфоцитах и практически не влияли на В-лимфоциты.

Полипептиды из вилочковой железы гипофизэктомированных птиц практически не обладали биологической активностью. Добавление этих препаратов в суспензию лимфоцитов не приводило к увеличению экспрессии рецепторов на Т- и В-лимфоцитах

При* инкубировании исследуемой плазмы с полипептидами из тимуса интактных птиц отмечалось значительное ингибирование классического и слабое угнетение альтернативного пути активации системы комплемента. Инкубирование плазмы крови с пептидами тимуса гипофизэктомированных птиц не вызывало значительных изменений активации как классического, так и альтернативного пути системы комплемента.

Далее мы решили проверить, будут ли полипептиды из вилочковой железы интактных и гипофизэктомированных цыплят отличаться по своему составу друг от друга. Для этого мы провели хроматографический анализ указанных препаратов. Полипептиды тимуса ложнооперированных и гипофизэктомированных птиц разделялись методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на 11 и 10 фракций соответственно. Полипептиды из тимуса гипофизэктомированных птиц отличались от

Рис. 3. Хроматограмма полипептидов тимуса ложнооперированных цыплят

* rrcrrzc

NK-KISNOISfi

« Г1 S 'А Л N - ® в ■ »tUriNe«»»

ft Í4 ti N

ff.lilflAINMtefilC O M I" O t Г П S M

Рис. 4. Хроматограмма полипептидов тимуса гипофизэктомированных цыплят

полипептидов тимуса ложнооперированных снижением содержания низкомолекулярных и гидрофобных соединений. Причем после гипофизэктомии полностью отсутствовала одиннадцатая фракция ( рис. 3, 4).

Таким образом, удаление гипофиза приводит к изменению структуры и свойств полипептидов, полученных из тимуса оперированных цыплят, что выражается в почти полной потере этими цитомединами способности оказывать иммуностимулирующий эффект в опытах in vivo и in vitro.

Влияние гипофизэктомии на биологическую активность полипептидов ,выделенных из бурсы в опытах in vivo Инъекции полипептидов из бурсы ложнооперированных птиц больным крысам приводили к некоторому снижению абсолютного количества лимфоцитов в периферической крови. Кроме того, наблюдалась выраженная коррекция гуморального иммунного ответа. У таких крыс значительно увеличивалось число АОК селезенки, отмечалось возрастание индекса цитотоксичности, титров гемолизинов, гемагглютининов к эритроцитам барана. Одновременно уменьшалась гиперкоагуляция, развившаяся вследствие перитонита.

Назначение крысам с каловым перитонитом препарата из сумки Фабрициуса гипофизэктомированных птиц вызывало гораздо менее выраженный иммуномодулирующий эффект. Столь же незначительными в этой экспериментальной группе были и изменения со стороны свертывающей системы.

Влияние гипофизэктомии на биологическую активность полипептидов, выделенных из бурсы в опытах in vitro Полученные результаты свидетельствуют о том, что полипептиды, выделенные из бурсы ложнооперированных животных, обладали большей способностью стимулировать экспрессию рецепторов, свойственных В-лимфоцитам, чем Т-лимфоцитам. Подобного эффекта не отмечалось под действием полипептидов, выделенных из сумки Фабрициуса цыплят с удаленным гипофизом.

При инкубировании исследуемой плазмы с полипептидами из сумки Фабрициуса интактных птиц наблюдалось ингибирование классического и альтернативного пути активации системы комплемента. Инкубирование плазмы крови с пептидами бурсы гипофизэктомированных птиц не вызывало значительных изменений активации системы комплемента.

Известно, что биологическая активность пептидных гормонов, определяется их структурой. Полипептиды из бурсы ложнооперированных и гипофизэктомированных птиц разделялись методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на 9 и 8 фракций соответственно, различающихся по молекулярной

О NN«8« »*вми

о м •

»«ивПКМЙГ «ППИбВЙЙв ® » Л Л ® « ® N «вПОПШяКК

ППЧ«^1)«^ («П^ФПАШчО

N0 «

8 К ¡8 и

Рис. 5. Хроматограмма полипептидов бурсы ложнооперированных цыплят

Рис. 5. Хроматограмма полипептидов бурсы гипофизэктомированных цыплят

массе и степени гидрофобности. Полипептиды бурсы гипофизэктомированны* птиц отличались от таковых у ложнооперированных снижением содержания как гидрофобных, так и низкомолекулярных соединений. Кроме того, гипофизэктомия сопровождалась полным отсутствием девятой фракции (рис. 5, 6).

Таким образом, удаление гипофиза приводит к изменению структуры и свойств цитомединов, полученных как из тимуса, так и из бурсы. Наряду с этим происходят качественные и количественные сдвиги в пептидном составе соединений, что выражается в потере иммуностимулирующего эффекта как в опытах in vivo, так и in vitro. Приведенные факты являются доказательством прямой или опосредованной связи между гипофизом, тимусом и сумкой Фабрициуса (или ее аналогом у млекопитающих). Гипофиз, участвуя в регуляции образования физиологически активных полипептидов тимуса и бурсы, влияет, таким образом, на процессы пролиферации и дифференцировки Т- и В-лимфоцитов.

ВЛИЯНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ ГИПОФИЗА НА РЕЦЕПТОРЫ

Т- и В-ЛИМФОЦИТОВ, АНТИТЕП00БРА30ВАНИЕ И

СИСТЕМУ КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА

Влияние пептидов гипофиза на рецепторный аппарат Т- и В-лимфоцитов здоровых и больных ожогами людей

Установлено, что после 6 часов инкубации лимфоцитов от здоровых доноров с пептидами задней доли гипофиза (0,1 мг/ мл) практически никаких достоверных изменений не происходило. Вместе с тем, под влиянием пептидов передней доли гипофиза отмечалось увеличение экспрессии рецепторов на Т- и Т-"активных" лимфоцитах.

При инкубации лимфоцитов ожоговых больных с пептидами передней доли гипофиза выявлено значительное увеличение числа Т-"активных" лимфоцитов (в 1,8 раза) и общего количества Т-лимфоцитов (в 1,3 раза). Число В-лимфоцитов при этом не изменялось. При инкубации лимфоцитов с пептидами задней доли гипофиза возрастало количество В-лимфоцитов (в 1,3 раза) и "активных" Т-лимфоцитов (в 1,5 раза), тогда как общее количество Т-лимфоцитов практически не изменялось.

Таким образом, пептиды передней доли гипофиза оказывают более выраженное влияние на дифференцировку и экспрессию рецепторов Т-"активных" и Т-лимфоцитов, а задней доли - на экспрессию рецепторов В- и Т-"активных" лимфоцитов.

По-видимому, увеличение числа лимфоцитов можно связать

с приобретением под влиянием пептидов гипофиза специфических рецепторов на "нулевых" лимфоцитах.

Влияние пептидов гипофиза на систему комплемента

Установлено, что пептиды как передней, так и задней долей гипофиза практически не влияли на классический путь активации системы комплемента, но в то же время значительно тормозили активацию системы комплемента по альтернативному пути (пептиды передней доли гипофиза - в 1,6 раза, задней - в 1,4 раза).

Влияние пептидов гипофиза на антителообразование

Пептиды задней доли гипофиза как в опытах in vitro, так и in vivo в большей степени, чем пептиды передней доли, стимулировали антителообразование. Наибольший эффект отмечался при совместном применении пептидов передней и задней долей гипофиза. Причем более выраженное действие пептидов на антителообразование во всех случаях было в опытах in vivo. По-видимому, пептиды гипофиза, кроме непосредственного стимулирующего влияния на АОК, оказывают действие и на дифференцировку клеток, способных к антителообразованию, влияя через бурсу и костный мозг.

Результаты наших исследований доказывают наличие связи между гипофизом, тимусом и сумкой Фабрициуса. По HaiueMV мнению гипофиз участвует в регуляции иммунитета и гемостаза по следующим механизмам, представленными на рис. 7:

Рис. 7. Схема влияния гипофиза на иммунитет

1) оказывая влияние на нейроэндокринную систему (периферические железы внутренней секреции);

2) воздействуя на тимус и бурсу с помощью полипептидных факторов-цитомединов;

3) непосредственно влияя на активность иммунокомпетентных клеток и систему свертывания крови посредством полипептидных факторов.

ВЫВОДЫ

1. Удаление гипофиза, тимуса или бурсы приводят к выраженной депрессии клеточного и гуморального иммунитета, а также развитию гиперкоагуляции и торможению фибринолиза. Совместная гипофиз- и бурсэктомия у птиц сопровождается острейшим иммунодефицитом и ДВС-синдромом, практически не совместимыми с жизнью.

2.Цитомедины передней и задней долей гипофиза при совместном введении гипофизэктомированным животным полностью ликвидируют иммунодефицит и ДВС-синдром, возникающие в результате удаления этой железы. Введение пептидов передней доли гипофиза преимущественно стимулирует клеточный, а задней - гуморальный иммунитет.

3.Экстирпация гипофиза сопровождается значительным снижением способности цитомединов из тимуса и бурсы коррегировать иммунодефицит и ликвидировать явления ДВС-синдрома у птиц с удаленными вилочковой железой или" сумкой Фабрициуса, а также стимулировать экспрессию рецепторов на Т- и В-лимфоцитах.

4. Полипептиды, выделенные из тимуса и бурсы гипофи-зэктомированных цыплят, оказывают слабый иммуностимулирующий эффект и практически нё обладают способностью нивелировать гиперкоагуляционные сдвиги при введении животным с экспериментальным иммунодефицитом.

5. После гипофизэктомии наблюдаются значительные структурные и количественные изменения полипептидов из тимуса и бурсы птиц, выражающиеся в снижении содержания низкомолекулярных и гидрофобных соединений и полным отсутствием отдельных фракций.

6. Гипофиз оказывает регулирующее влияние на деятельность центральных органов иммунитета (вилочковой железы и сумки Фабрициуса), а также стимулирует функцию иммунокомпетентных клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Патеюк A.B., Потопин A.B. Влияние гипофизэктомии на состояние иммунитета у птиц// Сб. научн. трудов "Цитомедины". -Чита, 1988, - С. 51-53.

2. Патеюк A.B. Влияние гипофизэктомии на состояние иммунитета у птиц// Экспериментальная и клиническая иммунология на Востоке страны: Сб.* науч. тр. - Красноярск, 1988. - Т.1. - С. 104.

3. Патеюк A.B. Роль гипофиза в регуляции иммунного ответа у птиц// Стресс и иммунитет: Тез. докл. Всес. конф. "Стресс и иммунитет (психонейроиммунол.)". - Ростов н/Д, 1989. - С. 136-137.

4 .Патеюк A.B. Опосредованное влияние полипептидов гипофиза на систему гемостаза у крыс с экспериментальным перитонитом// Сб. научн. работ Регуляторные пептиды в норме и патологии /цитомедины/. - Чита, 1991. - С. 43-45.

5. Патеюк A.B. Сравнительная оценка влияния препаратов гипофиза, тимуса и бурсы на течение экспериментального перитонита у крыс// Симпозиум Пептидные биорегуляторы-цитомедины. - Санкт-Петербург, 1992. - С. 113-114.

6. Патеюк A.B. Влияние пептидов гипофиза на состояние иммунитета у цыплят с одновременно удаленными тимусом и бурсой/ /' Успехи физиологических наук. - М., 1994. - Т.25. - N.4. - С. 10.