Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Пептиды сосудистой стенки в патогенезе острого экспериментального панкреатита

5 М

г ^

На правах рукописи

Медведев Владимир Леонидович

Пептнды сосудистой стенки в патогенезе острого экспериментального панкреатита

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону 1997

Работа выполнена в Читинской государственной медицинской академии и в Ростовском областном патологоанатомическом бюро.

Научные руководители:

Лауреат премии Совмина СССР доктор медицинских наук, профессор

кандидат медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Овсянников В.Г.

Заслуженный деятель науки РФ доктор медицинских наук,

профессор Леонов А.Н.

Ведущая организация: Российский гематологический центр.

Защита состоится.^:.^..^"..........1997 года в.^.^часов на заседании диссертационного Совета К 084.53.03 при Ростовском государственном медицинском университете (344022 г.Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер., 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан........Т.*................ 1997 г.

Цыбиков Н.Н. Мационис А.Э.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент

Борщев П.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Известно, что эндогенные биорегуляторы, значительная часть которых представлена цитомединами - пептидными соединениями малой молекулярной массы, способны регулировать функцию всех без исключения органов и систем (Ашмарин, 1982; Барашков, 1987; Гольдберг, 1987; Луценко, 1986 и др.).

Цитомедины, обладающие общими для всех неспецифическими свойствами, а также специфическими эффектами представляют собой функционально непрерывную совокупность регуляторных пептидов, обеспечивающих согласованную деятельность клеточных популяций организма на всех уровнях организации (Казанцева, 1987; Кузник, 1996).

В клинике и эксперименте установлено, что пептиды оказывают положительное действие при различных патологических состояниях (Бадмаева, 1996; Балаболкин, 1994; Белозерцева, 1988; Яковлев и соавт., 1991), нормализуя показатели системы гемостаза, фибринолиза, иммуногенеза и повышая неспецифическую резистентность организма. Все эти исследования свидетельствуют о важной роли пептидных регуляторов группы цитомединов в развитии любого патологического процесса и об их высокой фармакологической активности (Яковлев и соавт., 1987; Кузник и соавт., 1996).

Вместе с тем, хорошо известно, что одним из основных эфферегных регуляторов системы гемостаза является сосудистая стенка. В артериях и венах обнаружены соединения, регулирующие сосудисто-тромбоци-тарный гемостаз и влияющие как на коагуляционную, так и фибриноли-тическую активность крови (Кузник, Цыбиков, 1983; Альфонсов, 1967; Зу-баиров, 1981; Мищенко 1991). Сосудистая стенка также является регулятором иммуногенеза и неспецифической резистентности организма (Кузник, 1981; Малежик, 1985).

Соприкасаясь непосредственно с кровью, сосудистая стенка выделяет в окружающую среду соединения, влияющие не только на состав крови, но и на различные физиологические и биохимические процессы.

Таким образом, сосудистая стенка является важным звеном сопряжения иммуногенеза, гемостаза, фибринолиза и неспецифической резистентности организма.

Учитывая тот факт, что сосудистая ткань широко представлена в каждом органе, можно предполагать, как велико ее значение в регуляции различных функций и развитии патологических процессов. На наш взгляд, из всех известных в настоящее время цитомединов, именно вазолин - ци-томедин из сосудистой стенки должен оказывать наиболее эффективное воздействие как на сам пораженный орган, так и на функции других органов, изменяющихся вторично при любом патологическом процессе. Возможно, именно вазолин может выступать в качестве универсального неспецифического регулятора всех функциональных систем организма.

Однако, до сих пор недостаточно изучены механизмы влияния вазо-лина на течение патологических процессов, а также неизвестно, как изменяются структура и свойства естественных цитомединов в патологии.

В качестве патологического процесса не случайно был выбран острый панкреатит. С одной стороны, проблема острого панкреатита остается одним из сложных разделов медицины, что обусловлено относительно большой частотой поражений, летальностью и малой результативностью лечения тяжелобольных.

С другой стороны, одним из основных звеньев патогенеза острого панкреатита являются тяжелые ферментативные нарушения, приводящие к генерализованному характеру метаболических и патоморфологических расстройств. Это одно из заболеваний, при котором наблюдаются ярко выраженные изменения всех функциональных систем организма (Савельев, 1983).

В связи с приведенными факторами, на наш взгляд, представляется интересным изучение влияния вазолина на клиническое течение острого экспериментального панкреатита (ОЭП), его исходы, сроки выздоровления, показатели деятельности основных ферментативных систем и пато-морфологические изменения внутренних органов.

Кроме того, было интересно получить пептиды из тканей при патологическом процессе, поскольку неизвестны их свойства, не изучалось влияние "патологических пептидов" на функции различных систем организма.

Из сказанного вытекает, что избранная нами тема работы является актуальной и имеет важное как теоретическое, так и практическое значение.

Цели и задачи исследования

Основной целью нашего исследования явилось изучение роли пептидов из сосудистой стенки в патогенезе острого панкреатита.

Исходя из цели исследования перед нами были поставлены следующие задачи:

1. Выделить вазолнн из сосудистой стенки интактных крыс и крыс с ОЭП, леченных и нелеченных пептидами сосудов.

2. Изучить действие выделенных пептидов на гемостаз, иммунитет, комплемент, протеолитическую активность ферментов, кининовую систему.

3. Оценить терапевтический эффект вазолина при ОЭП.

Научай я новизна:

Установлено, что лечение вазолином животных с острым экспериментальным панкреатитом приводит к нормализации иммунитета, гемостаза, ферментативной активности крови, а также снижает летальность и укорачивает сроки выздоровления животных.

Впервые выделены пептиды из ткани пораженного патологическим процессом организма и проведен хроматографический анализ полученных пептидов.

Впервые дана сравнительная характеристика пептидов выделенных, из сосудистой стенки ложнооперированных крыс, а также крыс с ОЭП, леченных и нелеченных вазолином.

Впервые обнаружено, что при ОЭП происходит изменение структуры и биологической активности полипептидов из сосудистой стенки.

Изучено действие выделенных пептидов на гемостаз, иммунитет, комплемент, протеолитическую активность ферментов.

Установлено, что полипептиды из сосудов ложнооперированных крыс и животных с ОЭП, леченных вазолином повышают дезагрегацион-ную активность сосудистой стенки, в то время как пептиды больных панкреатитом крыс, неполучавших ваэолин, не обладают подобным эф--фектом.

При электронномикроскопическом исследовании поджелудочной железы у животных с ОЭП обнаружены признаки нарушения белкового синтеза. У другой группы животных с ОЭП, но принимавших вазолин, ацинарные клетки имеют сохранную ультраструктуру белоксинтезирую-щего аппарата.

Впервые установлено, что использование вазолина как лекарственного препарата в терапии ОЭП сопровождается восстановлением структуры, собственных, измененных при патологическом процессе пептидов сосудистой стенки.

Практическая значимость работы

Установленные факты позволяют считать, что цитомедины из сосудистой стенки оказывают выраженное регуляторное действие в условиях патологии и проявляют положительный терапевтический эффект при ОЭП, что является перспективным для разработки лекарственного препарата.

Положения, выносимые на защиту

1. Лечение вазолином приводит к быстрой нормализации иммунитета, гемостаза, ферментативной активности крови у крыс с острым экспериментальным панкреатитом, а также улучшает течение заболевания и снижает летальность животных.

2. Полипептиды, выделенные из патологических тканей, имеют измененную структуру, биологическую активность и регуляторные свойства.

3. "Патологические полипептиды" восстанавливают свои структуру и активность при лечении острого экспериментального панкреатита вазолином.

Апробация работы

Основные положения работы были доложены на межрегиональных конференциях молодых ученых по проблеме "Физиология и фармакология полипептидов" (Чита 1985, 1988, 1996).

Работа прошла апробацию на совместном заседании отдела Физиологии и биохимии пептидов Ростовского Научно-исследовательского института нейрокибернетики и отдела экспериментальной патологии и электронной микроскопии Ростовского областного патологоанато-мического бюро.

Публикации

По результатам исследований оформлено 2 рационализаторских предложения, опубликовано 7 печатных работ, 2 работы опубликованы в центральной печати.

Внедрения

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс на кафедрах нормальной и патологической физиологии Читинской государственной медицинской академии и на кафедрах патологической физиологии и факультетской хирургии Ростовского государственного медицинского университета.

Структура диссертации:

Диссертация изложена на 159 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 2 глав собственных результатов, обсуждения полученных данных, выводов, указателя литературы, включающего 219 отечественных и 93 зарубежных литературных источника.

Работа иллюстрирована 24 таблицами и 17 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исследования проведены на 950 белых беспородных крысах, крови 20 здоровых доноров и крови 14 больных с иммунодефицитом. Для иммунизации использовали 5 кроликов весом 3,5-4 кг.

Лабораторные животные содержались согласно "Санитарных правил по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)", утвержденных приказами МЗ СССР № 775 от 12.08.77, "О суточных нормах кормления лабораторных животных и цен продуктов".

Эксперименты проводились на интактных, тимэктомированных животных, а также на крысах с острым экспериментальным панкреатитом. В качестве контроля использовали ложнооперированных животных.

Объектами исследования служили плазма, сыворотка, форменные элементы крови и ткани экспериментальных животных.

Тимэктомия производилась у крыс весом 65-80 г в возрасте 1,5-2 месяца.

Забор крови осуществлялся различными способами в зависимости от вида животного и целей эксперимента.

Вазолин получали из крупных сосудов крыс методом уксуснокислой экстракции по методу В.Г. Морозова и В.Х. Хавинсона (1974).

Хроматографический анализ полипептидов проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе Irica (Япония) методом обращенных фаз на колонке 4:250 с сорбентом Lichosorb RP 18 Т (Япония), а также на жидкостном хроматографе "LKB" (Швеция) методом гель-фильтрации ira колонке с сорбентом Superóse 12 FPLC (Швеция).

Операция тимэктомии у крыс проводилась по методике, разработанной на кафедре нормальной физиологии Читинского медицинского института (Цыбиков H.H., Медведев В.Л., 1978).

Острый панкреатит вызывали у животных по методу Лавровой З.С. (1971).

Опытной группе животных с ОЭП вводили вазолин в экспериментально подобранной дозе 2,5 мг/кг массы (Т.Н. Степанова, 1986), разведенный в физиологическом растворе, внутримышечно в течение 7 дней. Контрольная группа крыс с ОЭП получала в том же объеме инъекции физиологического раствора хлорида натрия.

Состояние сосудисто-тромбоцитарного гемостаза оценивали по количеству тромбоцитов, адгезивной и агрегационной активности тромбоцитов.

Состояние свертывающей системы крови оценивали по следующим методам, опубликованным в современных руководствах по исследованию системы гемостаза: время свертывания крови (Lee R.J., White P.D., 1913); время рекальцификации плазмы (Bergerhof H.D., Roka L., 1954); каолиновое время (Hatterslay P.G., 1966); протромбиновое время (Quick A.J., 1966); тромбииовое время (Biggs R.M., Macfariane R.G., 1962); этано-ловый тест (Godai H., Abildgaard V., 1966); содержание фибриногена (Рутберг P.A., 1961); протаминсульфатный тест (Marber R., Winterstein А., 1955); активность антитромбина-111 (Kaula, 1971).

Фибринолитическую активность крови определяли по скорости растворения фибринового сгустка эуглобулиновым методом (Kowarzyk H., Buluk L., 1954), a также по площади зон лизиса на фибриновых пластинах (Astrup T., Mullertz S., 1952).

Антипротеазное действие вазолина оценивали по способности блокировать прогеолитический эффект фибринолизина, трипсина и урокина-зы.

Иммунную реактивность организма оценивали по общему количеству лимфоцитов, а также по содержанию различных популяций -числу Т- и Та-лимфоцитов. (Jonda I.M., е.а. 1972; Kerman В.Н. е.а. 1976). Количество B-лимфоцитов оценивали по методу ЕАК-РОК (Biamo С. е.а. 1973).

О состоянии неспецифической резистентности организма судили по следующим показателям:

1. Определение БАСК (бактерицидная активность сыворотки крови) проводили по методу О.В. Смирновой и Т.А. Кузьминой (1966) в модификации О.В. Бухарина и А.П. Луда (1972).

2. Определение лизоцима в сыворотке крови осуществляли по методике К.А. Каграмановой и соавт. (1978).

3. Определение уровня гемагглютининов проводили при помощи гемагглютинации объемным методом (И. Лефковитс, 1981).

4. Определение активности комплемента.

Действие вазолина на общую гемолитическую активность комплемента оценивали по степени лизиса сенсибилизированных антителами эритроцитов барана (классический путь) и эритроцитов кролика (альтернативный путь) сывороткой человека (S. Tanaka et al., 1986).

О состоянии калликреин-кининовой системы судили по активности калликреина (Суровикина М.С., 1975), содержанию кининогена (Пасхина Т.С. и соавт., 1968; Dinis C.R., Carvalho I.F., 1963) и активности кинино-разрушающих ферментов плазмы крови (Kaplan А.Р., 1975).

Для оценки ферментативной и антиферментативной активности крови определяли амилазу, липазу, трипсин, ингибитор трипсина (М.М. Бо-гер, 1982), щелочную фосфатазу, ACT, АНТ, уГТТ (Е.А. Кост, 1975).

Гистологические и электронно-микроскопические исследования проводили с целью выявления морфологических особенностей в поджелудочной железе, легких, почках, печени у крыс с острым экспериментальным панкреатитом при лечении вазолином.

Математическая машинная обработка полученных результатов выполнена на компьютере "Amstrad" PC 1640 с использованием вариационно-статистического анализа (А.И. Венчиков, В.А. Венчиков, 1974) для связанных и несвязанных между собой наблюдений с вычислением показателя достоверности различий (Р) по Стыоденту.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что острый панкреатит протекает с резкими сдвигами в ферментативном гомеостазе организма (B.C. Савельев, 1983). Активированный трипсин в кровотоке способствует повышению активности ряда каскадных систем, что приводит к нарушениям микро- и макроциркуляции.

Тесная функциональная связь между иммунными и гемоста-тическими реакциями в настоящее время не вызывает сомнений. Показано, что иммунные реакции в значительной степени определяют интенсивность элиминации из кровотока ферментов гемостаза (Л.Д. Петрушко-ва, 1984). Более того, ферментативный потенциал в системе свертывания крови определяется иммунными механизмами (B.C. Савельев, 1983; H.H. Цыбиков, 1984).

Вместе с тем, щелочные полипептиды - цнтомедины обладают выраженной антиферментативной активностью (Del Favero G.etal., 1983). Исходя из сказанного, мы решили оценить действие пептида из сосудистой стенки - вазолина на иммунитет, гемостаз и ферментативную активность крови у крыс с острым экспериментальным панкреатитом.

Эксперименты проведены на трех группах белых крыс:

1. ложнооперированные крысы, подвергшиеся лапаротомии;

2. крысы с острым экспериментальным панкреатитом;

3. крысы с острым экспериментальным панкреатитом, леченные ва-золином.

В первой серии данного фрагмента работы исследовали влияние вазолина на некоторые биохимические показатели крови, характеризующие уровень метаболических сдвигов при ОЭП. В крови определяли активность амилазы, липазы, трипсина и ингибитора трипсина, щелочной фос-фотазы, а также ACT, АЛТ и уГТП.

Мы наблюдали резкое увеличение ферментативной активности в сыворотке крови, что свидетельствует о глубоких изменениях в метаболических процессах при ОЭП.

Вместе с тем, у другой группы животных с ОЭП, но леченных вазо-лином мы наблюдали менее выраженные изменения ферментативной активности. Так, уровень трипсина повышался максимально на 3 сутки в 4 раза по сравнению с ложнооперированными крысами, а к 14 суткам практически достигали контрольных величин все исследуемые показатели.

Полученные данные свидетельствуют о том, что вазолин способствует нормализации показателей ферментативной активности у крыс с ОЭП.

В следующей серии экспериментов изучалось влияние вазолина на некоторые показатели системы гемостаза и фибринолиза у крыс с ОЭП.

Установлено, что индукция острого панкреатита вызывает развитие гипокоагуляции, о чем свидетельствует увеличение времени свертывания крови.

При анализе коагуолограммы обращает на себя внимание явление так называемого "десинхроноза", свидетельствующее о ДВС крови.

Кроме того, в 1-3 сутки у таких животных снижается активность антитромбина-111 и несколько нарастает в последующие сроки.

У крыс с ОЭП, получавших вазолин, по сравнению с нелеченными животными резко возрастает содержание антитромбина-111, хотя общая антитромбиновая активность практически не изменяется.

Известно, что в присутствии гепарина антитромбин-Ш легко и быстро проявляет свою антитромбиновую активность, а в тех случаях, когда уровень гепарина понижен, антитромбин-111 способен связывать трипсин (Danielsson, Bjork, 1982).

Таким образом можно предположить, что у животных, леченых ва-золином, появляются условия, благоприятствующие инактивации трипсина антитромбином-111.

У животных этой группы начинают регистрироваться с 3-х суток отрицательные протаминсульфатный и этаноловый тесты. Кроме того, у

леченных животных, по сравнению с нелеченными резко увеличивается время лизиса эутлобулинов. Вероятно, под влиянием вазолина не только происходит угнетение фибринолитической активности, но и тормозится общая протеазная активность крови.

В следующей серии экспериментов представлялось интересным определить титр аугоантител к трипсину и Ха-фактору при остром панкреатите.

Мы установили, что через сутки от начала опыта снижается титр аутоантител к трипсину. Однако на 3 сутки и, особенно, на 7 сутки со-ддюкание антитрипсиновых антител у животных с ОЭП резко нарастает, а в последующие сроки возвращается к норме. Аналогичным образом меняется в динамике титр аутоантител и к Ха-фактору. Следовательно, титр антител как к трипсину, так и Ха-фактору меняется однотипно.

Обращает на себя внимание следующий факт. Как у крыс с ОЭП, так и у ложнооперированных животных динамика аутоантител к трипсину и Ха-фактору идентична. Выявленная закономерность, вероятно, определяется тем, что наркоз и оперативная травма (ложная операция) также сопровождаются трипсинемией и генерацией Ха-фактора, что находит отражение в схожей динамике титра аутоантител у сравниваемых групп животных (B.C. Савельев, 1983; H.H. Цыбиков, 1985).

Таким образом, представленные данные еще раз свидетельствуют о тесной взаимосвязи иммунных и гемостатических реакций.

Дальнейшая серия экспериментов также была проведена с целью изучения влияния вазолина на состояние иммунологической реактивности организма у крыс с ОЭП.

Для достижения поставленной задачи крысам на фоне иммунизации эритроцитами барана индуцировали острый панкреатит. Десять из них лечили вазолином, а десять других получали инъекции физиологического раствора хлорида натрия.

Наши исследования показали, что на протяжении 7 суток от начала эксперимента у животных с ОЭП достоверно снижается содержание ге-магтлютининов, антителообразующих клеток, уменьшается бактерицидная активность сыворотки крови, снижается концентрация лизоцима и развивается лейкоцитоз.

Таким образом, данные свидетельствуют о снижении иммунной реактивности у крыс с ОЭП. Вместе с тем, у животных, леченных вазолином, не снижается, по сравнению с контролем, бактерицидная активность сыворотки крови, достоверно увеличивается количество антителообразующих клеток, а также несколько увеличивается титр гемолизинов и ге-магтпютининов и снижается лейкоцитоз. Следовательно, вазолин способствует нормализации факторов неспецифической резистентности организма.

Известно, что система свертывания крови и фибринолиза теснейшим образом связана с калликреин-кнниновой системой (ККС) (З.С. Бар-каган, 1981; 1988; А.М. Чернух и соавт., 1983; Sandamo J., Pair D., 1983).

Учитывая выше сказанное, в следующей серии данного фрагмента работы мы исследовали влияние вазолина на состояние ККС у крыс с ОЭП.

Оказалось, что развитие ОЭП уже в 1-3 сутки приводит к резким изменениям в состоянии ККС. В частности, активность калликреина резко возрастает, тогда как уровень кининогена уменьшается приблизительно в 2 раза. Кроме того, резко и достоверно повышается активность кининаз плазмы. Только к 14 суткам появляется некоторая тенденция к восстановлению уровня калликреина и кининогена, хотя активность кининаз остается по-прежнему высокой.

Известно, что снижение содержания субстрата (кининогена) для образования активных кининов, является характерным признаком активации кининообразования. Полученные данные полностью совпадают с результатами исследований, проведенных Савельевым B.C. и соавт. (1983) и свидетельствуют о том, что ОЭП приводит к существенному повышению кининообразования и сопровождается продукцией активных кининов. Нет сомнения, что ДВС крови, развивающийся при ОЭП, в определенной степени зависит от активности ККС.

Следующая группа животных с ОЭП получала вазолин по обычной схеме. Обнаружено, что под действием пептида у животных менее выражено повышается активность калликреина, а через 7-14 суток уже соответствует контрольной величине. Уровень кининогена в 1-3 сутки снижается так же, как и у нелеченных животных, но к 7-14 суткам наступает нормализация, в отличие от животных, не получавших вазолин. Кининазная активность проявляет тенденцию к падению, а к 14 суткам достоверно снижается.

Результаты наблюдений свидетельствуют о том, что вазолин, не изменяя состояния ККС у интактных животных, способствует ее нормализации у животных с ОЭП.

Интересны, на наш взгляд, и некоторые клинические наблюдения. Животные с ОЭП, получавшие вазолин, вели себя значительно активнее, уже на 2-3 сутки начинали принимать пищу, в то время как нелеченные -только на 4-5 сутки. У нелеченных животных до 12 суток наблюдался частый жидкий стул; у животных, леченных вазолином, стул нормализовался на 6-8 сутки.

При вскрытии у нелеченных крыс обнаружены геморрагический выпот в брюшной полости, отек и гиперемия поджелудочной железы с кровоизлияниями в ее паренхиму. На поверхности поджелудочной железы, брюшины появлялись "стеариновые" пятна. Все эти изменения наблюдались и на 18 сутки. У леченных вазолином крыс признаки воспаления поджелудочной железы практически исчезали к 14 суткам.

У нелеченных животных на 3 - 14 сутки наблюдения на микропрепаратах поджелудочной железы при окраске по Шуенинову были обнаружены внутрисосудистые сгустки фибрина, множественные абсцессы. Некротическим и воспалительным процессом поражена вся поджелудочная железа. В группе животных, подвергнутых лечению вазолином к 14 дню в

поджелудочной железе появляются очаги фиброза, среди которых сохранились протоки; структура долек в периферических отделах различима.

При электронно-микроскопическом исследовании экзокринной части поджелудочной железы обнаружены признаки вакуольной дистрофии большинства ацинарных клеток, в таких участках на мембранах отсутствуют рибосомы, что свидетельствует о нарушении белкового синтеза в ацинусах.

У леченных вазолином животных ацинарные клетки на третьи сутки имеют сохранную ультраструктуру белоксинтезирующего аппарата. Наличие двуядерных ацинарных клеток свидетельствует о восстановлении регенераторных способностей ткани.

По нашим данным, уже через три дня после начала процесса наблюдается существенная разница между серией с введением пептида и без: пептид способствует сохранению ультраструктуры как ацинарных клеток, так и ацинарных протоков в целом. Имеются достоверные признаки положительного влияния пептида на экзокринную функцию поджелудочной железы.

Выполненные морфологические исследования показали, что помимо местных изменений в поджелудочной железе имели место генерализованные изменения, проявляющиеся в нарушении проходимости сосудистой сети за счет тромбирования сосудов микроциркуляторного русла фибрином. Анализ динамики изменений в экспериментальных группах выявил, что у группы животных с ОЭП нарастали дистрофические изменения паренхиматозных органов вследствие гипоксии, обусловленной ДВС-синд-ромом и присоединением гнойных осложнений. В группе животных, подвергнутых лечению вазолином, проходимость сосудов микроциркуляторного русла начинала восстанавливаться к третьим суткам, что улучшало трофику тканей и препятствовало развитию гнойных осложнений. В очаге повреждения подавлялась воспалительная реакция, а организация очагов некроза в месте инъекции желчи происходила за счет фиброза с минимальной воспалительной инфильтрацией. Патологические изменения в поджелудочной железе у леченных животных были более локализованы и менее выражены.

Смертность в группе животных, не получавших вазолин, составляла 31%, а в группе леченных -15%.

Таким образом, экспериментальный острый панкреатит у крыс вызывает выраженные сдвиги в системе гемостаза (гипокоагуляцию, ускорение фибринолиза с накоплением в кровотоке продуктов паракоагуляции и т.д.). Указанные изменения расценены нами как проявления синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови в стадии коа-гулопатии потребления. Кроме того, у крыс с ОЭП происходят глубокие нарушения иммунитета, снижается содержание гемагглютининов, гемолизинов, антителообразующих клеток, уменьшается бактерицидная активность сыворотки крови и концентрация лизоцима. У таких животных повышается содержание амилазы, липазы, трипсина, щелочной фосфотазы,

ACT, AJTT, уГТП, повышается концентрация ингибитора трипсина и активируется калликреин-кининовая система.

Лечение таких животных вазолином способствует нормализации показателей коагулограммы. Более того, происходит снижение активности протеаз и резкое увеличение активности антитромбина-111, что приводит к более быстрой инактивации трипсина.

Под влиянием вазолина увеличивается титр гемолизинов, гемагглю-тининов, снижается лейкоцитоз, но повышается бактерицидная активность сыворотки крови и увеличивается содержание антителообразующих клеток.

Лечение вазолином приводит к более раннему исчезновению многих клинических и патоморфологических проявлений заболевания, восстановлению микроциркуляции в пораженном органе, снижению летальности в 2 раза и укорочению сроков выздоровления животных.

Полученные данные свидетельствуют о том, что вазолин способствует нормализации иммунитета, гемостаза и ферментативного потенциала у крыс с острым экспериментальным панкреатитом.

Все это позволяет считать, что цитомедины из сосудистой стенки оказывают выраженное регуляторное действие в условиях патологии и положительный терапевтический эффект при ОЭП. Возможно, их следует отнести к числу наиболее эффективных средств коррекции при различных патологических состояниях, характеризующихся каскадом функциональных и морфологических изменений со стороны большинства систем организма и рекомендовать применение вазолина в комплексном лечении острого панкреатита.

Литературные данные, а также наши эксперименты свидетельствуют о том, что применение цитомединов и, в частности, вазолина, при лечении самых различных патологических процессов сопровождается выраженным положительным терапевтическим эффектом. (И.И. Балаболкин, 1994; Э.Д. Загородняя, 1992; Б.И. Кузник, 1996) Перспектива их широкого клинического применения не вызывает сомнений. Однако, все применяемые в эксперименте и клинике пептиды были выделены из нормальных тканей здоровых животных. Изученные к настоящему времени свойства, активность, биологические эффекты касаются только "здоровых" цитомединов и позволяют отнести эти соединения к классу биорегуляторов.

Вместе с тем, до сих пор не ясно, существуют ли эти биорегуляторы в естественных условиях и, в частности, в условиях патологии, или они являются продуктом протеолиза клеточных структур при уксусно-кислой экстракции тканей. Никогда ранее не выделялись пептиды из тканей больного органа; не изучалось, как при патологическом процессе в организме изменяется структура и функциональная активность пептидов данного органа и других органов и тканей. Каковы свойства цитомединов, выделенных из патологически измененных органов и сохраняют ли они свои регуляторные способности в условиях патологии? Не изучено и влияние "патологических" пептидов как на функцию пораженного органа, так и на функции различных систем организма.

В связи с изложенным, дальнейшие исследования были направлены на изучение свойств вазолина, выделенного из сосудистой стенки животных с острым экспериментальным панкреатитом.

Были поставлены следующие задачи:

1. Выделить вазолин из сосудистой стенки ложнооперированных крыс, крыс с ОЭП и крыс с ОЭП, леченных вазолином.

2. Провести хроматографический анализ полученных пептидов.

3. Изучить действие выделенных пептидов на гемостаз, иммунитет, комплемент и протеолитическую активность ферментов.

В экспериментах использовали 3 группы крыс:

1. Ложнооперированные крысы;

2. Крысы с острым экспериментальным панкреатитом;

3. Крысы с острым экспериментальным панкреатитом, леченные вазолином.

Сравнительный анализ (рис. 1, 2) показал, что хроматографическая картина полипептидов, полученных из сосудов ложнооперированных животных и крыс с ОЭП неоднородна. Она значительно отличается по количеству пиков, по времени их выхода, площади и концентрации. Эти данные свидетельствуют о том, что структура вазолина, выделенного из сосудов 2 группы животных резко отличается от таковой здоровых (ложнооперированных) крыс. Следовательно, в условиях развития тяжелого патологического процесса происходит изменение структуры и, вероятно, регуляторных свойств цитомединов.

Вместе с тем, хроматографическая картина полипептида, выделенного из сосудистой стенки крыс с ОЭП, но леченных вазолином (рис. 3) приближается по своим характеристикам к 1 (контрольной) группе животных.

Таким образом, использование вазолина, как лекарственного препарата в терапии ОЭП сопровождается восстановлением структуры собственных, "патологически" измененных пептидов сосудистой стенки.

Эти данные позволяют предполагать, что наряду со структурными изменениями происходит и изменение биологической активности цитомединов при развитии патологического процесса. В связи с этим были проведены дальнейшие эксперименты.

Биологическую активность регуляторных полипептидов из сосудистой стенки оценивали по их общебиохимическим свойствам: действию на системы гемостаза, иммунитета, комплемента, агрегацию тромбоцитов и антиагрегационную активность сосудистой стенки, протеолитическую активность ферментов.

В экспериментах in vitro оказалось, что вазолин ложнооперированных крыс достоверно удлиняет время рекальцификации плазмы, про-тромбиновое и каолиновое время, а также значительно удлиняет время лизиса эуглобулинового сгустка. Вазолин, полученный из сосудистой стенки крыс с ОЭП, наоборот, сокращает время рекальцификации плазмы, про-тромбиновое и каолиновое время, одновременно резко активируя фибри-нолиз. Это, несомненно, способствует тромбообразованию и нарушеншо микроциркуляции. Пептид, полученный из сосудов третьей труппы живот

(

i mm

:: i

ib......'

i

» ! ! i ¡ i

\1

1

i i i

...

, M1

S t ------

4-r

1

s шш

КС .te I гс

í? S

¡i- "

S i i.........s

pNC I. Хро

hic.3. Xpo>uTorp«MHsae(muta>eaa]rw»aKjroioct>cyeM крыссОЭП,

ных удлиняет время рекальцификации плазмы, протромбиновое и тром-биновое время и удлиняет время лизиса эуглобулинового сгустка.

Таким образом, вазолин, выделенный из сосудистой стенки крыс с ОЭП вызывает достоверные изменения коагулограммы в сторону гиперкоагуляции in vitro. Вместе с тем, полипептид, выделенный из сосудистой стенки крыс с ОЭП, но получивших курс лечения вазолином, восстанавливает до нормы изучаемые показатели свертывания крови и фибринолиза.

Сосудистая стенка находится в тесной взаимосвязи с компонентами крови и форменными элементами. Эндотелиоциты способны в значительной степени влиять на агрегатное состояние крови. Полипептиды сосудистой стенки нормализуют функцию эндотелиальных клеток, те, в свою очередь, способны вмешиваться в механизмы сосудисто-тромбоцигарного гемостаза. Учитывая эти обстоятельства нам казалось интересным проследить действие полипептидов из сосудистой стенки крыс на специфические функции кровяных пластинок.

В опытах in vitro было исследовано влияние пептидов на адгезию и агрегацию тромбоцитов, а также дезагрегационную активность сосудистой стенки.

Под влиянием всех трех групп пептидов практически не изменялись адгезивные свойства кровяных пластинок.

В следующей серии опытов мы изучали действие исследуемых соединений на агрегационные свойства тромбоцитов.

Интактная сосудистая стенка крыс при инкубации с плазмой, содержащей тромбоциты, оказывает существенный дезагрегационный эффект. Но, в тоже время, полипептнды из сосудистой стенки, непосредственно вносимые в плазму, богатую тромбоцитами, не обладают подобными свойствами.

Далее эксперименты были продолжены in vivo. Интактным крысам внутримышечно в течение 7 суток 1 раз в день вводили полипептиды из сосудов ложнооперированных крыс, животных с ОЭП и больных крыс, получавших лечение вазолином.

В дальнейшем у животных изучались следующие показатели: количество тромбоцитов периферической крови, адгезивные и ахрегацион-ные свойства кровяных пластинок, а также дезагрегационные свойства сосудистой стенки.

При этом мы не обнаружили существенного увеличения числа тромбоцитов, достоверного изменения адгезии и агрегации кровяных пластинок. Что же касается последней серии опытов, то они позволили выявить следующее: полипептиды из сосудов ложнооперированных крыс и животных с ОЭП, леченных вазолином достоверно повышали дезагрегационную активность сосудистой стенки. В тоже время пептиды, выделенные от больных панкреатитом крыс, не обладали подобным эффектом.

В дальнейшем эксперименты были продолжены на тимэктомирован-ных крысах. Известно, что удаление вилочковой железы сопровождается выраженными изменениями со стороны сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, процессов свертывания крови и фибринолиза (Б.И. Кузник, 1985;

1987; Б.И, Кузник, H.H. Цыбиков, 1982). В частности, тимэктомия у крыс приводит к развитию гиперкоагуляции и торможению фибринолиза, увеличению числа тромбоцитов, усилению адгезии и агрегации кровяных пластинок (Б.И. Кузник, H.H. Цыбиков, 1982; Т.Н. Степанова, 1986 и т.д.).

Три группы исследуемых соединений были введены ложноопериро-ванным и тимэктомированным крысам через 2 месяца после операции.

Оказалось, что полипептиды из сосудистой стенки ложноопериро-ванных крыс и животных с панкреатитом, получавших вазолин угнетают адгезию тромбоцитов тимэктомированных крыс и не влияют на подобную активность кровяных пластинок ложнооперированных животных (перенесших стернотомию). Пептиды из сосудистой стенки крыс с ОЭП не обладают аналогичным эффектом и их действие при введении ложноопери-рованньш и тимэктомированным животным существенно не отличались.

Полученные данные свидетельствуют о том, что непосредственно пептиды из сосудов ложнооперированных крыс, крыс с острым экспериментальным панкреатитом и животных с панкреатитом, получавших лечение вазолином не оказывают влияние на основные показатели сосу-дисто-тромбоцитарного гемостаза. В тоже время применение исследуемых соединений in vivo, в частности у тимэктомированных животных позволило выявить антиадгезивный и антиагрегационный эффекты. Таким действием обладают пептиды сосудистой стенки ложнооперированных крыс, а полипептиды из сосудов животных, больных панкреатитом не угнетают адгезию и агрегацию тромбоцитов. Однако, если тимэктомированным животным вводили пептиды животных с панкреатитом, леченным вазолином, избыточная активация кровяных пластинок в значительной степени нивелировалась.

Таким образом, опыты позволяют предполагать, что полипептиды из сосудистой стенки способны ре1улировать реакции сосудисго-тромбоцитарного гемостаза. В частности, это касается тех случаев, когда имеет место гиперкоагуляция и активация кровяных пластинок. Не обладая непосредственно антитромбоцитарным действием сосудистые пептиды, по всей видимосги, нормализуют гомеостаз эндотелиальных клегок. Вполне возможно, что подавление адгезии и агрегации кровяных пластинок осущесгвляегся через нормализацию обмена арахидоновой кислоты в эндотелиоцитах и увеличение потенциала простагландина Е2 (простацик-лина).

Несомненно лишь то, что эти опыты только ставят перед нами задачу по изучению тонких механизмов нормализации гомеостаза сосудистой стенки и взаимодействия эндотелиальных клеток с форменными элементами крови и, в частности, с кровяными пластинками.

В следующей серии опытов мы изучали воздействие полученных пептидов на иммунную активность организма по влиянию их на экспрессию Т- и В- лимфоцитов.

Результаты исследования свидетельствуют о том, что и в этом случае биологическая активность цитомединов, полученных из сосудистых стенок ложнооперированных крыс и крыс с острым панкреатитом

оказалась не одинаковой. Пептиды, полученные из сосудистой стенки крыс с ОЭП, приводят к снижению экспрессии Т-лимфоцитов, снижению количества Т-активных (Та) и В-лимфоцитов. Вместе с тем, пептиды полученные из сосудистой стенки крыс, леченных вазолином, увеличивают количество Та- и В-лимфоцитов.

Роль системы комплемента в неспецифических механизмах защиты организма необычайно велика.

Интересно было проследить, какое влияние на систему комплемента оказывают полипептиды из сосудистой стенки.

Результаты исследований показали, что полипептиды из сосудистой стенки значительно изменяют активность комплементарной системы по классическому пути, проявляя ингибирующий эффект. Во всех случаях мы наблюдали удлинение времени гемолиза. Изменение активности комплемента, несомненно, модулирует последующие сдвиги в микроциркуляции (сосудистой проницаемости, состоянии сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза и другие процессы), изменяет кооперацию клеток и повышает лабильность функционирования отдельных клеточных элементов.

Вместе с тем, цитомедины животных с ОЭП приводят к активации классического пути комплемента, что усугубляет течение любого патологического процесса и может приводить к развитию различного рода осложнений.

При исследовании полипептида, полученного из сосудистой стенки крыс с ОЭП, леченных вазолином, оказалось, что они нормализуют скорость классического пути активации комплемента.

Активность протеаз оценивали по величине зоны лизиса пленки фибрина на чашках Петри. Исследования показали, что пептиды, выделенные у крыс с ОЭП не ингибировали активность фибринолизина, трипсина и урокиназы, а от леченных вазолином животных, в большинстве случаев, снижали ферментативную активность.

Полученные данные убедительно свидетельствуют о том, что при тяжелом патологическом процессе, моделью которого в наших экспериментах являлся острый панкреатит, происходит изменение структуры, биологической активности и регуляторных свойств цитомединов. Ресгрук-туированные полипептиды перестают функционировать как биорегуляторы, но восстанавливают свои способности и структуру под действием ва-золина.

Таким образом при лечении животных с ОЭП вазолином наблюдается не только нормализация функций различных систем организма и более быстрое выздоровление, но и происходит нормализация структуры и функции собственных, "патологически" измененных пептидов сосудистой стенки. Полученные нами факты свидетельствуют о несомненном положительном терапевтическом эффекте вазолина при лечении ОЭП, что представляется перспективным для дальнейшей разработки нового лекарственного препарата. Нами убедительно продемонстрировано, что при ОЭП изменяются структурно-функциональные свойства "патологических"

пептидов, которые усиливают патологические звенья ОЗП. И, наконец, вазолин способствует нормализации пептидных комплексов сосудов животных с ОЭП, что наряду с другими положительными эффектами вазоли-на, оказывает положительное саногенетическое действие.

ВЫВОДЫ

1. При ОЭП у крыс регистрируются глубокие изменения в различных системах организма: ферментативном гомеостазе, системе свертывании крови, фибринолиза, калликреин-кининовой системе, специфической и неспецифической резистентности организма.

2. Вазолин - пептид, выделенный из сосудистой стенки интактных животных, увеличивает экспрессию рецепторов на Т- и В-лимфоцитах, проявляет антипротеазное действие и тормозит классический путь активации комплемента.

3. При лечении животных с ОЭП вазолин нормализует ферментативный гомеостаз, систему свертывания крови, фибрииолиз, калликреин-кининовую систему и иммунитет, снижает процент смертности животных.

4. Вазолин изменяет характер воспалительной инфильтрации и течение воспалительного процесса при ОЭП.

5. Вазолин обеспечивает сохранность функционирования белоксинте-зирующего аппарата ацинарных клеток поджелудочной железы.

6. Пептиды, полученные из сосудов животных с ОЭП имеют структурно-функциональные отличия от цитомединов, полученных от интактных крыс. Полипептиды больных животных не способны корригировать ферментативные, иммунологические и гемостатические реакции.

7. Пептиды, полученные из сосудов животных с ОЭП, леченных вазо-лином, восстанавливают структурно-функциональные свойства и приближаются по своим характеристикам к цитомединам интактных животных.

8. Вазолин, как лекарственный препарат, перспективен для лечения как острого панкреатита, так и других воспалительных заболеваний, протекающих с расстройствами иммунитета, гемостаза и неспецифической резистентности организма.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Состояние гемокоагуляции и активность тканевых ферментов свертывания крови и фибринолиза у интактных и тимэктомированных крыс. /Кузник Б.И., Цыбиков H.H./.- // В кн.: Физиология и патология системы гемостаза,-Чита, 1980.-С. 30-31.

2. Применение полипептидов из сосудистой стенки (вазонина) для терапии острого экспериментального панкреатита у крыс./ Медведева Л.А. /.- // В сб.: Физиология и фармакология полипептидов.- Чита, 1985.- С. 20-22.

З.Экспериментальные иммунодефициты как модели тромбогеморрагичес-кого синдрома. /Цыбиков H.H., Степанов A.B., Калашников С.Г.,и со-авт./.-// Противотромботическая терапия в клинической практике. Новое в теории, диагностике, лечении.-М., 1986,- С. 54.

4. Применение полипептидов сосудистой стенки для терапии острого панкреатита у крыс в эксперименте./ Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. /.- // Па-тол. физиология и эксперим. терапия,- 1987.- N 2,- С. 50-51.

5. Состояние гемостаза и уровень аутоантител к трипсину и Ха-фактору у крыс при экспериментальном панкреатите./ Цыбиков H.H./.- // Патол. физиология и эксперим. терапия.- 1987.- N 2.- С. 47-50.

6. Влияние вазолииа на иммунитет, гемостаз и ферменты при остром экспериментальном панкреатите//В сб.: Цитомедины.- Чита, 1996.- С. 20-21.

7. Сравнительная характеристика полипептидов из сосудистой стенки у крыс с острым экспериментальным панкреатитом/ Степанов A.B., Резников Ю.П. /.- // В сб.: Цитомедины.- Чита, 1996,- С. 22-23.