Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Биофармацевтический анализ месалазина и сульфаниламидов для оценки фенотипа ацетилирования организма человека

На правах рукописи

00504^'"

НГУЕН Чунг Зунг

Биофармацевтический анализ месалазина и сульфаниламидов для оценки фенотипа ацетилировании организма человека

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

' 9 т'0/7 ¿С12

Казань-2012

005046470

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский национальный исследовательский технологический университет»

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Гармонов Сергей Юрьевич

Официальные оппоненты: Плетенева Татьяна Вадимовна

доктор химических наук, профессор, ГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов», г. Москва, зав. кафедрой фармацевтической и токсикологической химии

Егорова Светлана Николаевна

доктор фармацевтических наук, профессор, ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», зав. кафедрой фармации ФПК и ППС

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная

медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «14» сентября 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.080.07 при ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» по адресу: 420015. г. Казань, ул. К. Маркса, д.68, зал заседаний Ученого совета, А-330.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет».

Автореферат разослан « 0& 2012 г.

Нугуманова Гульнара Наиловна

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Разработки методов анализа лекарственных пешести (ЛВ) в биологических объектах для фармакокипетических исследований играет важную роль в оценке биоэквнвалентпости, обеспечении безопасности, эффективности и нерсонализации применения лекарственных средств (ЛС).

Для ЛВ, содержащих амипные функциональные группы, биотрансформация осуществляется главным образом путем реакций N-ацегнлировамия, и у человека сформированы фенотипы быстрого и медленного метаболизма, различающиеся генетически детерминированной активностью N-ацстилтрансфе-разы (NAT) генатоцитов. При этом активность NAT является одним из важных факторов, определяющим индивидуальные колебания концентрации J1B в организме пациентов, и, » конечном итоге, их ответ на многие ЛС, применяемые при ряде социально значимых заболеваний (инфекционных, сердечнососудистой системы, органов дыхания, печени).

Наиболее часто фенотипировамис МАТ производится с помощью фармакокипетических исследований выведения с мочой изониазида и сульфаниламидов спектрофотомстрическим методом с применением хромогепных реагентов (карбонильные соединения, диазотирование с последующим азосочетанием !i др.). однако существенными недостатками этих методик являются низкая чувствительность определений, малоизбиратглыюсгь из-за сложного состава анализируемой матрицы, многостадийиость и длительность. В тоже время оценка активности NAT методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЗЖХ) при определении кофеина в моче, гидрэзидов кислот и сульфаниламидов в крови имеет ограничения по клиническому применению этого теста у некоторых категорий больных.

Перспективным направлением развития фармацевтической химии является разработка псинвазивных подходов по биофармацевтическому анализу для установления фармакокипетических параметров новых тест-препаратов апеллирования в моче и слюне. Это обуславливает необходимость создания избирательных, чувствительных, высокопроизводительных и доступных для клинической практики методов количественного определения ЛВ в биологических жидкостях. Этим требованиям удовлетворяют методы ВЭЖХ и сиектрофото-метрии при использовании высокоизбирательных аналитических реагентов. Применение комплекса этих методов позволяет решать сложные задачи, возникающие при проведении фармакокипетических исследований, а также разрабатывать алгоритмы персонализации фармакотерапии и оценивать влияние ЛВ на активность ферментативных систем метаболизма.

Цель работы состояла в разработке методов хромагографического и спектрофотометр и ч ее ко го определения месалазина и сульфаниламидов в биологических жидкостях, оценке фармакокипетических параметров при их выведении

из организма человека для косвенною установления фенотипа ацетил пронация.

Для достижения поставленых целей решались следующие задачи:

- изучение условий хроматографического разделения и режимов элюиро-вания, расчет и оценка параметров пригодности хроматографнческой системы при разработке методик определения месалазина, сульфаметаксазола и суль-фадиметоксина в моче и слюне;

- выявление факторов, обеспечивающих чувствительность и избирательность спектрофотометрических определений месалазина, сульфаметаксазола и сульфадиметоксина в моче и слюне в виде окрашенных производных с 7-хлор-4,6-динитробензофуроксаном (ХБФО);

- оценка влияния компонентов анализируемой матрицы на регистрируемый в условиях ВЭЖХ и спектрофотометрни аналитический сигнал, определение метрологических характеристик разработанных способов для подтверждения их соответствия требованиям, принятым для фармацевтического анализа;

- проведение расчета и оценки фармакокинетических параметров тест-препаратов ацетилирования у здоровых добровольцев, разработка способов установления активности NAT при экскреции месалазина, сульфаметаксазола и сульфадиметоксина с мочой и слюной;

- установление фармакокинетических параметров тест-препаратов окисления и ацетилирования у больных хроническим вирусным гепатитом В.

Научная новизна работы:

- установлены условия хроматографического разделения месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в условиях обращено-фазной ВЭЖХ, а также выявлены факторы повышения избирательности и чувствительности биофармацевтического анализа этих лекарственных веществ в биологических жидкостях организма человека;

- найдены и обоснованы рабочие условия высокочувствительного и избирательного определения месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в моче и слюне методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим дстектрировани-ем, оптимизированы способы их пробоподготовки при высокопроизводительных аналитических определениях тест-препаратов процессов ацетилирования;

- впервые показана возможность количественного определения месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в моче и слюне спектрофотометрическим методом на основе реакции с 7-хлор- 4,6-дииитробензофураксаном:

разработаны способы косвенного определения активности N-ацетилтрансферазы на основе оценки фармакокинетических параметров месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина при их экскреции с мочой, сульфадиметоксина в слюне с применением ВЭЖХ и спектрофотометрни и обосновано их использование для иерсонализации фармакотерапии;

- комплексом методов биофармацевтического а нал та изучена фармакоки-нетика тест-препаратов ацетилироваипя и окисления при хроническом вирусном гепатите В.

Практическая значимость. Разработан комплекс методик снекгрофото-мстрнческого и хроматографического определения содержания месалазина, сульфаметоксазола и сульфадимстоксииа в моче и слюне. На их основе предложены диагностические подходы для оценки индивидуальной активности метаболической системы ацетилирования организма человека, которые могут быть рекомендованы как лабораторные тесты при персонализированном применении лекарственных средств.

Внедрение результатов. Результаты исследования внедрены во Всероссийском Центре молекулярной диагностики и лечения Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Москва) и в учебный процесс ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» в дисциплинах «Контроль качества лекарственных препаратов» и «Основы токсикологии».

На защиту выносится:

- результаты исследования хроматографнчеекого разделения месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в условиях обращено-фазной ВЭЖХ;

- результаты изучения влияния состава и рН подвижной фазы, условий элюирования, данных по оценке пригодности предложенных хроматографиче-ских систем и свойств ЛВ иа выбор условий избирательного и чувствительного детектирования месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина при их анализе в моче и слюне;

- обоснование и подбор оптимальных условий чувствительного и избирательного спектрофотометрического определения месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в виде производных с 7-хлор-4,б-динитробензофуроксаном в слюне и моче, способов пробоподгоговки при количественных определениях этих тест-препаратов;

- результаты исследования метрологических характеристик разработанных способов определения, полученные путем обработки экспериментального материала, подтверждающие их соответствие требованиям, принятым для био-фармацсвгических методов анализа;

- результаты расчета и анализа фармакокинетичсских данных месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в биологических жидкостях и оптимизации критериев фенотинирования для экспрессной и точной оценки индивидуальной активности ферментных систем;

- способы определения индивидуальной активности Ы-ацетилтрансферазы, основанных на биофармацевтичсском анализе фармакокннетических параметров месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина;

- данные по фармакокинетике тест-препаратов ацетилирования и окисления при хроническом вирусном гепатите В.

Апробация работы. Результаты работы и основные положения диссертации были доложены и обсуждены на XVII, XVIII Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2010, 2011), 65 и 66-ой Всероссийской конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2010, 2011), III Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, 2009), XV Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2010), VII Съезде медицинских генетиков (Ростов на Дону, 2010), Всероссийской конференции "Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез" (Краснодар, 2010), III региональной научно-практической конференции с международным участием «Синтез и перспективы использования биологически активных соединений» (Казань, 2011), XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волю-град, 2011), III Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2011).

Публикации: Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 17 печатных изданиях, включая 5 статей в рецензируемых изданиях, рекомендуемых для размещения материалов диссертаций, 1 статью в международном журнале и 11 тезисов докладов.

Объем и струюура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, заключения, списка литературы, включающего 261 источник. Работа изложена на 183 страницах машинописного текста, иллюстрирована 38 рисунками и 30 таблицами.

Личный вклад автора в опубликованных в соавторстве работах состоит в выборе и обосновании методик эксперимента, непосредственном его проведении, в участии во всей процедуре анализа и обобщении полученных экспериментальных результатов, расчете фармакокинетических параметров, установлении закономерностей и формулировке выводов.

Благодарности. Автор работы выражает глубокую благодарность к.х.н. Шитовой Н.С. за научные консультации и помощь в фармакокинетических исследованиях и статистической обработке их результатов; д.х.н., профессору Юсуповой JI.M. за синтез 7-хлор-4,6-динитробензофурексана, использованного в работе; к.х.н. Салахову И.А и провизору-аналитику Хуснугдпновой А.Р. за помощь в проведении хроматографических исследований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе описан химизм метаболических процессов ацетилиропа-ния; ферментные системы, участвующие в биотрапсформации ксенобиотиков и биофармацевтические подходы по оценки их активности; современные методы количественного определения JIB в биологических жидкостях человека, а также связь скорости апетилирования с различными заболеваниями.

Во второй г лаве дано описание объектов, методов и средств исследования JIB в биологических жидкостях, схем и методик проведения экспериментов и расчета фармакокипетических параметров, способов статистической обработки результатов.

При выполнении работы были использованы следующие лекарственные средства: субстанция 5-аминосалициловой кислоты («Alfa Aesar», Germany), месалазин (таблетки по 0,4 г, «Сап Фармасыотикал Индастриз Лтд», Индия), субстанция сульфаметоксазола («Sigma-AIdrich», Switzerland), субстанция сульфадимеюксина («Sigma-Aldrich», Switzerland), сульфадиметоксин (таблетки по 0,.*> г, ОАО «Биосинтез», Россия), изоииазид (таблетки по 0,3 г, «Акрихин», Россия.)), субстанция антипирина («Sigma-Aldrich», Germany).

В работе использована система жидкостной хроматографии SHIMADZU (Япония) с программным обеспечением l.C Solutin. Для котроля рН мобильной фазы использовали рН-метр фирмы Наппа (Румыния). В предварительных испытаниях для определения спектров анализируемых веществ использовался сканирующий спектрофотометр SPIXORD 40 фирмы AnalitykJena (Германия). Спек-трофотометрические измерения также проводили на спектрофотометре СФ-26.

Биофармацевтический анализ мочи и слюны здоровых добровольцев и больных проводился при участии зав. каф. инфекционных болезней КГМУ, д.м.н., профессора Фазылова В.Х. и д.м.н., доцента Кравченко Н.Э.

Фармакокинетическая и статистическая обработка результатов проводилась при использовании компьютерных программ Statistika 6, Excel, M-IND и Mathcad 11.

В третей главе приведены результаты разработки методов определения тест-препаратов ацетилирования: сульфаметоксазола и месалазина в моче, сульфадимеюксина в моче и слюне методом ВЭЖХ и спекгрофотометрии.

Месалазин (5-аминосалициловая кислота) и сульфаниламиды (сульфаме-таксазол и сульфадиметоксин) были использованы в качестве тест-препаратов ацетилирования в связи с их широким применением как антибактериальных средств, обладающих оптимальной фармакокинетикой (быстрая всасываемость в желудочно-кишечном тракте, создание широкого диапазона концентраций в биологических жидкостях), а также потенциальной возможностью оценки генетической детерминированности процессов их метаболизма в моче и слюне. Месалазин является активным метаболитом при биотрансформации ряда ЛС (сульфасалазин, олсалазин, балсалазид) (рис. 1). что определяет необходимость персонализации их применения пу тем оценки фенотипа ацетилирования.

В качестве универсального метода определения тест-препаратов в биологических жидкостях использована ВЭЖХ. Выбранные длины волн позволили определить каждое из исследуемых соединений на длине волны максимально-то поглощения или близкой к ней (рис. 2-4). При аналитических длинах волн в условиях ВЭЖХ также наблюдалось поглощение биогенных компонентов слюны и мочи неустановленной природы в УФ-области спектра (рис. 5-7).

btücx Олсалагш* ВО / V-H-N.... Суль ф ас ал «пин (xyai

w/ В W

Суль ф аш ip идин (метаболит)

о-

с»

Na» гйюхсвьсяьич

Балсалашд

4-0-

иода, игу-

"Ч

Месшташи

/=л

NATI, NAT2

г л,

4 íürtSifíoétííí гшйная кислота (метаболит)

К-ацетил-5-аминосалицшшвая кислота

Рис. 1. Схема метаболизма мейалазина и его пролекарств в организме человека

Рис. 2. Спектр поглощения сульфади-метоксина (5 мкг/мл) в смеси ацего-нитрил - 0,5 % раствор ортофосфор-ной кислоты ( 15:85 об. %).

А

Ч

\

/ \

к. им

ж ?.. нм

Рис. 3. Спектр поглощения суль-фаметоксазола (10 мкг/мл) з смеси ацетонитрил - 0,02 M раствор гидрофосфата натрия pli 6,2 (3;97 об. %).

Рис. 4. Спектр поглощения меса-лазина (!0 мкг/мл) в смеси ацетонитрил - 0,05 % водный раствор трифторуксуспой кислоты (10:90 % об).

/(ля определения месалазина использовали бинарную ПФ, состоящую из смеси ацетонитрила и раствора трифторуксуспой кислоты. Этот элюент позволяет хроматографировать 5-аминосалицилоиую и 4-аминосалициловую (внутренний стандарт) кислоты в виде симметричных пиков на обращено-фазном сорбенте С16, что объясняется, по видимому, более резким изменением селек-

тивности колонки вследствие модификации силанольных активных центров поверхности. При этом использовали изократическое элюирование, которое является более экономичным и полому более предпочтительным при определения одного соединения.

I

Рис. 5. Хроматограммы: месалазмн (1) и 4-аминосалициловая кислота (2). I -стандартные растворы. II - в моче человека. ПФ: ацетонитрил - 0,05 % раствор трифторуксусной кислоты (10:90, об. %), скорость потока 1 мл/мин. Discovery RP Amide С16 150 х 4,6 мм, 40°С, //=300 им. Содержание аналитов 10 мкг/мл.

V

к 2 Ь 5.0 7.5 ioö

Рис, 6. Хроматограммы сульфадиметоксина: I - стандартный раствор, П-в моче человека. ПФ: ацегонитрпл - 0,5 % раствор фосфорной кислоты (15:85, об. %). Discovery RP Amide С16 150 * 4,6 мм, 40 °С, ^=270 им, скорость потока 1 мл/мин. Концентрация 5 мкг/мл.

Была исследована возможность использования фосфорной кислоты и буферных растворов на ее основе в качестве эдюентов при определении сульфаниламидов в биологических жидкостях. В эгом случае отсутствует поглощение компонентов ПФ в области коротких длин воли, что позволяет повысить чувствительность определений. При использовании ПФ ацетонитрнл - 0,5 % фосфорная кислота (15:85, об. %), ацетоннтрил - 0,02 М гидрофосфат натрия рН~6,2. (3:97, об. %) на колонке Discovery RP Amide С16 пики J1B хорошо разделяются с компонентами мочи. На других обращенно-фазных колонках

(Pecosphere C-8 и CI8, XTerra RP-18, CYANO) с использованием той же Г1Ф разделения достичь не удалось.

Правильность ВЭЖХ определений ЛВ в моче и слюнс была оценена с использованием метода «введено-найдено», что демонстрирует отсутствие мешающего влияния компонентов мочи на результаты определений (табл. !).

_J

Рис. 7. Хромагограммы: с у л ьф а м сто к с аз о.ч а (1) и внутреннего стандарта антипирина (2). I - стандартные растворы, 11 - в моче человека. ПФ: ацетонит-рил - 0,02 М гидрофосфат натрия, рН=6,2 (3:97, об.%), 1 мл/мин. Discovery RP Amide СЛ6 150 х 4,6 мм, 40 °С, Х^269 нм. Концентрация всех акалитов 10 м кг/мл

Таблица 1. Результаты определения сульфадиметоксина, сульфаметоксазола и месалазииа в биологических жидкостях методом ВЭЖХ (п-6). р=0,95

Лекарственные вещества Объект анализа Введено, мкг/мл Найдено, м кг/мл RSD

0,50 0,49.10,02 0,04

Моча 2,00 2,0 i ±0,06 0,03

5,00 5,02±0,07 Г 0,01 1

Сульфадиметоксин 10,00 9,98±0,07 0,01 .

0,25 0,25±0,01 0,04

Слюна 0,50 0,50Ш,01 0,02

2.00 1.98±0.09 0.05

5,00 5,03±0,11 0,02

1,00 0,98:1.0,06 0,06

Сульфаметоксазол Моча 5,00 4.96±0,07 0,01

10,00 10,10^0,08 0,01

15,00 14,96*0,09 0,01

1,00 1,1 ±0,06 0,06

Месалазин Моча 5,00 4,92±0,12 0,04

10,00 10,10.4:0,11 0,01

15,00 !4.92±0.10 0,01

Количественное определение ЛВ проводилось методом внешнего стандарта по площади пика для сульфадиметоксина и внутреннего стандарта для сульфаметоксазола и месалазина. В интервале 0,! мкг/мл - 20 мкг/мл линейные градуировочные зависимости аналитического сигнала от содержания исследуемых ЛВ записываются следующим образом:

для сульфадиметоксина 8 (тАи*5)=1,504Сх (мкг/мл) (II2 = 0,9999, п = 15, % 1180=0,68);

для сульфаметоксазола 8(тАи*з) = 0,775СХ (мкг/мл) (Я2 = 0,9999, п = 15, % К81)= 1,63);

для месалазина 8(тАи*з) = 2,119СХ (мкг/мл) - 5,285 (К2 = 0,9999, п = 15, % 1*80=1,54).

Оценка ключевых показателей валидационных параметров предложенных условий разделения выявила перспективу их использования для определения сульфадиметоксина, сульфаметоксазола и месалазина в биологических жидкостях (табл. 2).

Таблица 2. Результаты валидации методик определения лекарственных веществ в моче и слюне методом ВЭЖХ

Параметры Критерии Сульфа-диметокеин Сульфа-метоксазол Месалазин

яг 1,5 Я5=2,0 ^=1,8

Пригодность N не менее

хромато графи- 2000 г.т. N=3000 т.т. N=2842 т.т. N=2780 т.т.

ческой системы Симметрия

пика: 0,8 - 2,0 1,39 1,34 1,36

Специфичность Полное разделение пиков

Линейность калибровки Я2 не менее 0,999 Я2=0,9999 Я2=0,9999 Я2=0,9999

Интервал

определяемых содержаний, мкг/мл - 0,1-20 0,1-20 0,1-20

Метод «введе-

Правильность но-найдено» %Я80<Ю %Я80=2,25 %Я80=2,25 %Я8 0=3,1

Предел обнаружения, „ 0,03 0,03 0,03

мкг/ мл

Метод Метод Метод

Воспроизводи- %Я80<Ю внешнего внутреннего внутреннего

мость стандарта, %Я8Э=0,68 стандарта, %Я50=1,63 стандарта, %Я80=Ч,54

В фармацевтическом анализе одним из подходов улучшения аналитических свойств J1B при спектрофотометрических определениях является получение их производных. Сравнительное сопоставление существующих подходов позволило выявить перспективу использования реакций ЛВ, содержащих аминные функциональные группы с хлординитрозамещенпыми беиз-2,1,3-оксадиазола. Среди них - 7-хлор-4,6-динитробепзофуроксан (ХБФО), обладающий высокой реакционной способностью и контрастностью полос поглощения с ариламинами. ХБФО был использован в работе для определения месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в моче и слюне. Было установлено, что исследованные JIB образуют азот-углерод связанные, интенсивно окрашенные продукты аналитических реакций

VS VS

о^х^ о _ и ^ч- Р О

W к А \-/ S-J ' *» W в 5 W \J "

CKjO' C-N" CH-Ci' w op

о О. о

\J ,, о )J

о

w к \ 3

о

ян

0<--Ч

\.....

о

°ч .О, О ,0..

N;' 'N о=«< n' и

но—^ V-nhj о......4 ¿>--fiOf —-»-но—^ V-wh.......•( }.....

02M OjN

Максимумы поглощения производных JIB находятся в интервале 480-510 им, при этом их положение и интенсивность определяются природой растворителя и рН среды (рис. 8,9). Было установлено, что добавки органических растворителей при проведении реакции влияют на устойчивость продуктов и интенсивность их полос поглощения, что может быть связано с обеспечением оптимальной растворимости продуктов реакции и степени ее завершения.

Была изучена возможность определения тест-препаратов в биологических жидкостях. Как пример, на рис. 10 представлены спектры поглощения растворов реагента, его смеси с образцом мочи и продукта аналитическом реакции с сульфадиметоксином. Из представленных спектрально-аналитических данных видно, что в условиях анализа при Х~ 490-500 пм влияние реагента и мочи на полосы поглощения продукта реакции весьма незначительно. Его молено полностью исключить, включив эти компоненты в состав раствора сравнения при спектрофогометрическом детектировании, а также возможно использование трихлоруксусной кислоты для удаления мешающих компонентов в моче.

Таким образом, такое изменение пробоподготовки позволяет проводить избирательные и чувствительные спектрофотометрические определения сульфаниламидов и месалазина в биологических жидкостях.

Рис. 8. Спектры поглощения 4,6-динитробензофуроксановых производных сульфадиметоксина (4.10"5 М): 1 -этанол-вода (50:50, об.%); 2 - то же (30:70, об. %), 3 - ацетонитрил-вода (30:70, об.%); 4 - димстилсульфоксид-вода (5:95, об.%); 5 - этанол-вода (5:95, об.%); 6 -в воде, рН 6,8, 1=1 см

Рис. 10. Спектры поглощения: 1 -Х1зФО (1,5-10"4 М) в ацетонитриле, 2 -компоненты мочи и ХБФО (1,5-10" 4М) в присутствии грихлоруксусной кислоты (10"2М), 3 - дишггробензо-фуроксаповое производное сульфа-метоксазола (3-10"5 М) в воде, рН"-6, 8,1=1 см

Рис. 9. Спектры поглощения 4,6-динитробензофуроксановых производных месалазина (ЗЛО"5 М): 1 - в воде; 2 - этанол-вода (30:70, об. %), 3 - ацетонитрил-вода (30:70, об,%), 4 - диметилсульфоксид-вода (30:70, об. %), 5 - то же (5:95, об. %), рН=6,8,1=1 см

Рис. 11. Зависимость оптической плотности от рН при проведении реакции 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана (1,5-10'4М) и сульфаметоксазола (3-Ю"5 М) в воде, Х490 им, 1=1 см

Для выбора оптимальных условий определений изучено влияние кислотности реакционной среды, концентрации реагента и устойчивости производных во времени. Как видно, наиболее полное образование производного и максимальная интенсивность светопоглощения наблюдается в интервале рН 6-8 при двух и более кратном избытке реагента (рис. 11-13). Светопоглощение аналитической смеси повышается первые 3 мин. В течение дальнейших трех часов величина оптической плотности сохраняется на одном уровне, что демонстрирует устойчивость производных во времени.

.Г

А 0.В

05

0.4 02 О

, 5

Рис. 12. Устойчивость продукта 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана (1,5-10"4М) с месалазином в смеси ДМСО-вода (5:95 об.) во времени, ?1^500 нм, рН=6,8,1=1 см

Рис. 13. Влияние концентрации реагента на аналитический сигнал при проведении реакции с месалазином (3-10'5М) п смеси диметил-сульфоксид-вода (5:95 об. %), А-500 нм, рН=6,8, 1=1 см

Правильность спектрофотомегрических определений сульфадиметоксина, сульфаметоксазола и масалазина в биологических жидкостях была оценена методом «введено - найдено». Полученные данные показывают, что при выбранных условиях детектирования компоненты мочи и слюны не оказывают мешающего влияния на спсктрофотометрические определения анадитов (табл.

3).

Оценка ключевых показателей валидацнониых параметров предложенных условий спектрофотометрического анализа выявила перспективу их использования для определения сульфадиметоксина, сульфаметоксазола и месалазипа в биологических жидкостях (табл. 4).

Таблица 3 Результаты определения лекарственных веществ в биологических жидкостях методом «введено-найдено» (п=5, р=0,95)

Лекарственные вещества Объект анализа Введено, мкг/мл Найдено, мкг/мл 1180

3,12 3,04±0,10 г 0,03 1

Моча 6,24 6,12:1-0,19 0,03

Сул ьфадиметокс ин 9,36 9,27±0,17 ' 0,02

4,68 4,64*0,15 0,03

Слюна 7.80 7,82±0,10 0,01

10,92 10,95±0,10 0,01

1,28 1,271-0,07 0,06

Сульфаметоксазол Моча 2,56 2,36±0,09 0,04

5.12 5,10±0,12 0,02

7,68 7,72±0,07 0,01

0,32 0,35±0,02 0,06

Месалазии Моча 0,77 0,81 ±0,03 6,04 "1

1,53 4,6 1,50±0,04 " '1,62±0,07 "" 0,03 0.1:2

Таблица 4. Результаты валидации методик спсктрофотометрического определения лекарственных веществ в моче и слюне

Параметры

Контрастность полос поглоще-

___пня, нм__ _

Стабильность,час

Правильность

Линейность и калибровочная кривая

Интервал определяемых содер-жапий, мкг/мл Предел обнаружения, мкг/мл

е, л мол 1 см"1

Критерии

Не менее 70

И3 не менее 0,990

Ю5

Месалазин

90

%1«П = 3,04

о/с^ЯО - 2,84

Г = 0,999 А- 0,1594СХ (мкг/мл) ь 0,0012

0,32 - 4,6

0,1

2,4.10"

Сульфади-метоксин

80

Г-0,995 А - 0,08Сх (мкг/мл) -!-0,034

0,312-9,36

0,09

2,5. КГ

Сульфаме-токсазол

80

%И8Р - 2,7 Я7- 0,996 А = 0,147Сх (мкг/мл) + 0,0071

0,512-5,12 0,16

3,8.10

Полученные результаты позволяют сделать вывод о значительных преимуществах разработанных методик определения тест-препаратов в биожидкостях перед другими, уже известными из литературы. Это связано, прежде всего, с быстротой, точностью, прецезиопностью анализа и возможностью его широкого клинического использования.

С помощью комплекса разработанных методик обследованы здоровые добровольцы и оценено их распределение на медленный и быстрый фенотипы. По нашим данным соотношение ацетиляторных фенотипов у здоровых добровольцев составляет 55% медленных и 45% быстрых ацетилягоров, что согласуется со сведениями из литературы. По этим результатам рассчитаны фармако-кииетические параметры (табл. 5-7). Контрольное определение фенотипа аце-тилирования у здоровых добровольцев проводилось с номошыо тесг-препарата изониазида.

Полученные данные позволяют использовать в качестве критерия для фе-нотипирования ацетилирования указанные параметры, из которых наиболее удобным является оценка фракции дозы тест-препарата.

Фармакокннетичсские кривые кумулятивной экскреции ЛВ с мочой приведены на рис. 14-16, Как видно, установление количества Л В позволяет судить о фенотипе ацетилирования обследуемых. При лом уровень выводимого ЛВ для быстрых и медленных ацетиляторов различается более чем в два раза.

12 16 20 24 '

Рис. 14. Фармакокииетические кривые кумулятивной экскреции сульфадиме-токсина с мочой после перорального однократного приема в дозе 0,5 г: 1-быстрый фенотип; 2- медленный фенотип ацетилирования

Рис. 15. Фармакокииетические кривые кумулятивной экскреции сульфаметоксазола с мочой после перорального приема в дозе 0,4 г: 1 -быстрый фенотип; 2- медленный фенотип ацетилирования

Были рассчитаны фармакокииетические параметры кумулятивного выведения сульфадиметоксина, сульфаметоксазола и месалазина с мочой. Для быстрых ацетиляторов характерны более низкие значения площади под фармако-кинетической кривой, времени полувыведения ЛВ и более высокие значения константы элиминации, объема распределения, чем .для медленных ацетиляторов (табл. 5-7). Разница в периоде полувыведения и количестве выводимого препарата для пациентов одной и той же группы объясняется, по-видимому, вариациями функционального состояния желудочно-кишечного тракта и другими факторами среды.

На рис. 17 представлено содержание сульфадиметоксина в слюне. Установление фенотипа ацетилирования возможно путем анализа почасовых проб слюны через 24 час после приема тест-препарата. Полученные кинетические данные по моче и слюне коррелируют между собой.

С. №Т/Ш

I, час

0 2 4 6 8 1С

Рис. 16. Фармакокииетические кривые кумулятивной экскреции месалазина с мочой в разовой дозе 800 мг в виде лекарственной формы месакола: 1 -быстрый фенотип; 2-медленный фенотип ацетилирования

а, час

Рис. 1"). Уровень содержания сульфадиметоксина в слюне после перорального однократного приема в дозе 500 мг. 1 - быстрый фенотип, 2-. медленный фенотип ацетилирования

Таблица 5. Фармакокинетическне параметры экскреции сульфадиметокси-на с мочой (доза 0,5 г) у здоровых добровольцев (Mean±SD)

Параметр Фенотип ацетилирования Р*

Быстрый Медленный

Число добровольцев 20 24

Активность NAT (фракция дозы изоииазида, %} 4,2+0,7 9,9±1,8 Р<0,001

AUC, мкт ч/мл 24250±5060 54376±7230 Р<0,01

К(1, ч"1 0,130+0,014 0,070+ 0,004 Р<0,01

Vd, МЛ 205 ± 66 146+32 Р>0,05

Фракция дозы сульфадиме-токсина за 24 часа, % 6,4±0,7 13,3+1,4 Р<0,005

Таблица 6. Фармакокинетическне параметры экскреции сульфаметоксазола с мочой (доза 0,4г) у здоровых добровольцев (MeaniSD)

Параметр Фенотип ацетилирования Р*

Быстрый Медленный

Число добровольцев 20 25

Активность NAT (фракция дозы изоииазида, %) 3,9±0,4 9,1 ±0,8 Р<0,001

AUC, мкг ч/мл 13104±1772 42217±7329 Р<0,05

Ксь ч'1 0,36+0,03 0,19± 0,04 Р<0,05

т ,, ' \!Ъ 2,01+0,21 5,00+0,81 Р<0,05

Vd, мл 84 ±24 94+31 Р>0,05

Фракция дозы сульфаметоксазола за 8 часов, % 4,4+0,7 9,4±2,4 Г'<0,05

Таблица 7. Фармакокинетическне параметры экскреции месалазина с мочой (доза 0,8т) у здоровых добровольцев (Mean±SD)

Параметр Фенотип ацетилирования Р Р<0,001

Быстрый Медленный

Число добровольцев 18 22

Активность NAT (фракция дозы изоииазида, %) 3,1 ±0,2 9,4±1,4

AUC, мкг-ч/мл Ко1, ч' !2123±3941 29477±7734 Р<0,005

0,550±0,063 0,401 ±0,020 Р<0,005

Т| ■->, ч 1,30+0,10 1,73±0,090 Р<0,001

Vti, мл 129 ±42 71±15 Р<0,05 Р<0,005

Фракция дозы месалазина за 10 часов, % 1.6±0,5 3,7±0,9

В четвертой главе описаны взаимосвязи скорости окисления и ацетилиро-вания тест-препаратов метаболизма при хроническом вирусном гепатите В (ХВГВ). 11о имеющимся литературным данным соотношение фенотипов и разных этнических группах отличается, поэтому при формировании группы придавалось значение ее однородности, которую составляли лица европейской популяции, проживающие в Республике Татарстан. При этом быстрое ацети-лирование является преобладающим (67 %), что свидетельствует об предрасположенности лиц с быстрым фенотипом к ХВГВ и согласуется с литературными данными (рис. 18, табл. 8).

М Быстрый и Мед/юимый

Рис. 18. Соотношение фенотипов ацети-лирования: ! - больные ХВГВ (п=24), 2 -здоровые добровольцы (п-110)

20

Быстрый ИСредний Ш Медленный

Рис. 19. Соотношение фенотипов окисления: 1 - больные ХВГВ (¡1=24), 2- здоровые добровольцы (п=40)

Больные ХВГВ по активности цитохромов Р450 распределяются на две фенотипические группы (рис. 19): средний (37%) и медленный фенотип окисления (63%) в сравнении со здоровыми, которые распределяются тримодально: быстрый (21%), средний (43%) и медленный фенотип (36%). У больных ХВГВ с увеличением длительности и прогрессирования заболевания замедляется элиминация тест-препарата окисления антипирина. Активность МАТ у боль-пых ХВГВ в группах медленных и средних фенотипов окисления не имеет статистически значимых различий.

Таблица 8. Фармакокинетические параметры тест-препарата ацетилирования изониазида у больных ХВГВ (р<0,001)

Фармакокинетические параметры Быстрое апеллирование (¡1=16) 24490+2300 Медленное аце-тилирование(п=8)

Площадь под фармакокинегиче-ской кривой (АиС), мкг-ч/мл 91500+¡32.00

Константа элиминации, ч"' 0,4538+0,0140 0,2361 ±0,016

Время полувыведения (Т|/2), ч 1,37+0,68 4,88+0,95

Объем распределения, мл 90,7+26,2 33,7+3.4

У больных ХВГВ не наблюдается быстрый фенотип окисления (табл. 9), что возможно, обусловлено уменьшением количества соответствующих субстратов и нарушением баланса между способностью медленных окислителей быстро ацетилировать вещества, а быстрых окислителей медленно их ацетили-ровать. Для оптимизации эффективности применения противовирусных и ге-патопротекторных ЛС, подвергающихся ацетилированию и окислению, рекомендуется определение фенотипов ацетилирования и окисления у больных ХВГВ.

Таблица 9. Фармакокинетические параметры антипирина у больных ХВГВ по оценке его содержания в слюне (per os и дозе 0,6 г) (MeaniSD) (р<0,05)

Фармакокинетический параметр, размерность Средний фенотип окисления (п~9) Медленный фенот ип окисления (п-~ 15)

Константа скорости элиминации, час/1 0,332*0,021 0,154*0,06

Константа скорости накопления препарата в крови, час"1 0,556*0,036 0,542*0,037

Объем распределения, л 68,3*2,8 45,0*1,7

Максимальная концентрация препарата в слюне, мкг/мл 4,74*0,6 :и5±бГзз 9,04*0,88 7,23:1 (У,99

Период полуэлимипации препарата, час

Клиренс, мл/час 20128*2100 ■ 4522*754

Площадь под кривой «концентрация-время» (АУС), мкг час/мл 36*3 109*15

Примечание: Р - статистический уровень значимости различий между показателями быстрого и медленного фенотипов ацетилирования; Mean — средняя величина; SD - среднеквадратичное отклонение.

ВЫВОДЫ

!.. Обоснованы и установлены условия чувствительного и избирательного определения месалазина и сульфаметоксазола в моче, сульфадимегоксина в моче и слюне методом обращенпо-фазпой ВЭЖХ со спектрофотометричсским детектрироваиием. Выявлено влияние состава подвижных фаз, их рН, содержания в них неводного компонента, режимов элюирования на разделение лекарственных веществ.

2. Валидационные параметры при определении месалазина и сульфаметоксазола в моче, сульфадимегоксина в моче и слюне соответствует современным требованиям к пригодности хромат«графической системы. Определение характеризуются высокой селективностью (более 1,2), разрешением (более 1,5) и симметрией пиков (менее 1,5). Пределы детектирования исследуемых веществ

достигают 0,03 мкг/мл при диапазоне определяемых содержаний от 0,1 до 20 м кг/мл.

3. Установлены рабочие условия спектрофотометрического определения месалазина и сульфаниламидов в моче и слюне в виде окрашенных производных с 7-хлор-4,6-динитробензофуроксапом (к 490-500 им) с пределами обнаружения 0,09; 0,1; 0,16; мкг/мл для сульфадиметоксина, месалазина и сульфа-метоксазола соответственно. Выявлены факторы регулирования избирательности, чувствительности и экономичности определений лекарственных веществ в биологических жидкотях подбором состава среды, устойчивости во времени, а также направленным изменением спектральных характеристик производных определяемых веществ.

4. Разработаны методики биофармацевтического анализа активности N-ацетилтрансферазы на основе оценки фармакокннетическпх параметров месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина при их экскреции с мочой и сульфадиметоксина в слюне методами ВЭЖХ и спектрофотометрии, обосновано их использование для персонализации фармакотерапии.

5. Методами биофармацевтического анализа изучена фармакокинетика тест-препаратов ацетилирования и окисления при хроническом вирусном гепатите В. При этом преобладает быстрый фенотип ацетилирования (67%) и по фенотипу окисления происходит перераспределение на средний (37%) и медленный (63%) типы. Установлена прогностическая значимость этих биофармацевтических тестов для коррекции применения лекарственных средств при вирусном гепатите В.

Публикации в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных для размещения материалов диссертаций:

1. Гармонов, С.Ю. Спеюрофотометрическое определение 5-аминосалициловой кислоты в моче для оценки ее экскреции из организма человека / С.Ю. Гармонов, Нгуен Чунг Зунг, И.Ф. Мингазетдинов, Л.М. Юсупова, Н.С. Шитова, Р.Н. Исмаилова, В.Ф. Сопин// Вестник Казанского технологического университета.-2010. - №10. - С. 57- 63.

2. Гармонов, С.Ю. Индукционное влияние ксимедона на активность мик-росомальных оксидаз печени человека / С.Ю. Гармонов, Н С. Шитова, A.B. Жарехина, В.И. Погорельцев, Hrj-ен Чунг Зунг, Т.А. Киселева, И.Е. Зыкова, Н.Э. Кравченко // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2010. - №4. - С. 34-38.

3. Гармонов, С.Ю. Методы оценки и регуляция активности генетически детерминированных метаболических ферментных систем организма человека / С.Ю. Гармонов, Н.Э. Кравченко, Нгуен Чунг Зунг, И.Ф. Мингазетдинов, В.Х. Фазылов // Биомедицина. - 2010. - №3. - С. 39-41.

4. Гармонов, С.Ю. Установление фенотипа анетилирования на основе спектрофотометрического определения сульфадиметоксина в моче / С.Ю. Гар-монов, Нгуен Чунг Зунг, Л.М. Юсупова, Р.Н. Исмаилова, В.Ф. Сопин // Вестник Казанского технологического университета.-2011.- №19. С.18-24.

5. Гармонов, С.Ю. Спектрофотометрическое определение месалазипа в моче как тест для оценки фенотипа анетилирования организма человека / С.Ю. Гармоноп, Нгуеп Чунг Зунг, И.Ф. Мингазетдииов, Л.М. Юсупова, Н.С. Шитова, Р.Н. Исмаилова, В.Ф. Сопин // Химико-фармацевтический журнал. - 2011. -Т. 45,-№ 12.-С. 48-51.

Статьи н материалы конференций:

1. Nguyen Trung Dung. Determination of mesalazine in human urine by HPLC / Nguyen Trung Dung, S.Yu. Garmonov // Viet Nam Journal of Science and Technology.-2011 -V.49.-№ .3A.-P.259-265.

2. Гармонов, С.Ю. Методы биофармацевтического анализа метаболических ферментных систем организма человека / С.Ю. Гармонов, Н.С. Шитова, A.B. Жарехина, Нгуен Чунг Зуиг, Т.А. Киселева // Материалы III Всероссийской конференции с межд. участием "Аналитика России".- Краснодар, 2009,-С.384.

3. Гармонов, С.Ю. Индукционное влияние ксим'едона на активность мик-росомальных оксидаз печени человека / С.Ю. Гармонов, Н.С.Шитова, A.B. Жарехина. Нгусн Чунг Зунг // Тезисы докл. 65-ой Всероссийской конференции по фармации и фармакологии. - Пятигорск, 2010.- С.443

4. Салахов, И.А. Унифицированные подходы к контролю качества лекарственных средств методом ВЭЖХ / И.А. Салахов, Г'.Р. Нурисламова, Нгуен Чунг Зунг, И.Ф. Мипгазетдинов, Э.А. Иртуганова, С.Ю. Гармонов // Материалы Всероссийской конференции "Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез". - Краснодар, 2010.-С. 159.

5. Гармонов, С.Ю. Методы диагностики групп риска пациентов при использовании маркеров ацетилироваиия и окисления / С.Ю. Гармонов, Н.С. Шитова, Нгуен Чунг Зунг, Т.А. Киселева, В.Ф. Сопин // Тезисы докладов XVII Рос. нац. конгресса "Человек и лекарство". - Москва, 20I0.-C.75.

6. Киселева, Т.А. Фармакогенетический анализ метаболических ферментных систем организма человека / Т.А.Киселепа, Нгуен Чунг Зунг // Тезисы докладов XV юбилейной Всероссийской научно-практической конференции "Молодые ученые в медицине",- Казань, 20I0.-C.234.

7. Нгуен Чунг Зунг. Оценка и регуляция активности генетически детерминированных метаболических ферментных систем организма человека /' Нгуен Чунг Зунг, Т.А. Киселева, Н.С. Шитова, A.B. Жарехина, С.Ю. Гармонов // Материалы VII Съезда медицинских генетиков.-Ростов на Дону, 20I0.-C396.

8. Нгуен Чунг Зунг. Хромат-«графическое и спектрофотометрическое определение месалазипа в моче человека / Нгуен Чунг Зунг, И.Ф. Мингазетдииов,

Jl.M. Юсупова. В.Ф. Сопин, С.Ю. Гармонов // Тезисы докладов XIX Менделеевского съезда по общей и прикладной химии,- Волгоград, 2011.- С.376.

9. Гармонов, С.Ю. Спекгрофотометрнческое определение месалазина в моче и изучение его экскреции из организма человека ! С.Ю. Гармонов, Нгуен Чуиг Зунг, И.Ф. Мингазетдинов, Г.А. Абдурахимова // Сборник научных трудов: "Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции". - Пятигорск, 2011,- Вып. 66.-С. 375.

10. Гармонов, С.Ю. Персонализированный прием ксимедона в качестве индуктора системы микросомальпых оксидаз / С.Ю. Гармонов, И.Э. Кравченко, Нгуен Чунг Зунг// Материалы XVIII Российского национального конгресса "Человек и лекарство". - Москва, 2011.-С.502.

11. Гармонов, С.Ю. Оценка активности метаболических ферментных систем у больных стрептококковыми ангинами с целью персонализации лечения / С.Ю. Гармонов, Нгуен Чуиг Зунг, A.B. Жарехина, И.Э. Кравченко /7 Материалы III Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. Москва, 2011. Том. 9 - прилож. 1.-С.188.

12. Нгуен Чунг Зунг. Лекарственный препарат месалашн как тест-маркер для оценки фенотипа ацетмлирования организма человека / Нгуен Чунг Зунг, Г.А. Абдурахимова, А.Р. Акбирова, Р.Т. Рыспасва, J1.M. Юсуповэ, С.Ю. Гармонов // Тезисы докладов III региональной научно-практической конференции с международным участием «Синтез и пс-рспектипы использования биологически активных соединений». Казань: КГМУ, 2011. С. 64-65.

Соискатель

Нгуен Чунг Зунг

Заказ

Тираж jWjg.

Офсетная лаборатория КНИ ГУ, 420015, Казань, К.Маркса, 68

Актуальность темы. Разработка методов анализа лекарственных веществ (JIB) в биологических объектах для фармакокинетических исследований играет важную роль в оценке биоэквивалентности, обеспечении безопасности, эффективности и персонализации применения лекарственных средств (JIC).

Для JIB, содержащих аминные функциональные группы, биотрансформация осуществляется главным образом путем реакций N-ацетилирования, и у человека сформированы фенотипы быстрого и медленного метаболизма, различающиеся генетически детерминированной активностью N-ацетилтрансферазы (NAT) гепатоцитов. При этом активность NAT является одним из важных факторов, определяющим индивидуальные колебания концентрации JIB в организме пациентов, и, в конечном итоге, их ответ на многие JIC, применяемые при ряде социально значимых заболеваний (инфекционных, сердечно-сосудистой системы, органов дыхания, печени).

Наиболее часто фенотипирование NAT производится с помощью фармакокинетических исследований выведения с мочой изониазида и сульфаниламидов спектрофотометрическим методом с применением хромогенных реагентов (карбонильные соединения, диазотирование с последующим азосочетанием и др.), однако существенными недостатками этих методик являются низкая чувствительность определений, малоизбирательность из-за сложного состава анализируемой матрицы, многостадийность и длительность. В тоже время оценка активности NAT методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) при определении кофеина в моче, гидразидов кислот и сульфаниламидов в крови имеет ограничения по клиническому применению этого теста у некоторых категорий больных.

Перспективным направлением развития фармацевтической химии является разработка неинвазивных подходов по биофармацевтическому анализу для установления фармакокинетических параметров новых тест-препаратов ацетилирования в моче и слюне. Это обуславливает необходимость создания избирательных, чувствительных, высокопроизводительных и доступных для клинической практики методов количественного определения J1B в биологических жидкостях. Этим требованиям удовлетворяют методы ВЭЖХ и спектрофотометрии при использовании высокоизбирательных аналитических реагентов. Применение комплекса этих методов позволяет решать сложные задачи, возникающие при проведении фармакокинетических исследований, а также разрабатывать алгоритмы персонализации фармакотерапии и оценивать влияние JIB на активность ферментативных систем метаболизма.

Цель работы состояла в разработке методов хроматографического и спектрофотометрического определения месалазина и сульфаниламидов в биологических жидкостях, оценке фармакокинетических параметров при их выведении из организма человека для косвенного установления фенотипа ацетилирования.

Для достижения поставленых целей решались следующие задачи:

- изучение условий хроматографического разделения и режимов элюирования, расчет и оценка параметров пригодности хроматографической системы при разработке методик определения месалазина, сульфаметаксазола и сульфадиметоксина в моче и слюне; выявление факторов, обеспечивающих чувствительность и избирательность спектрофотометрических определений месалазина, сульфаметаксазола и сульфадиметоксина в моче и слюне в виде окрашенных производных с 7-хлор-4,6-динитробензофуроксаном (ХБФО); оценка влияния компонентов анализируемой матрицы на регистрируемый в условиях ВЭЖХ и спектрофотометрии аналитический сигнал, определение метрологических характеристик разработанных способов для подтверждения их соответствия требованиям, принятым для фармацевтического анализа;

- проведение расчета и оценки фармакокинетических параметров тест-препаратов ацетилирования у здоровых добровольцев, разработка способов установления активности NAT при экскреции месалазина, сульфаметаксазола и сульфадиметоксина с мочой и слюной;

- установление фармакокинетических параметров тест-препаратов окисления и ацетилирования у больных хроническим вирусным гепатитом В.

Научная новизна работы.

- установлены условия хроматографического разделения месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в условиях обращено-фазной ВЗЖХ, а также выявлены факторы повышения избирательности и чувствительности биофармацевтического анализа этих лекарственных веществ в биологических жидкостях организма человека;

- найдены и обоснованы рабочие условия высокочувствительного и избирательного определения месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в моче и слюне методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектрированием, оптимизированы способы их пробоподготовки при высокопроизводительных аналитических определениях тест-препаратов процессов ацетилирования;

- впервые показана возможность количественного определения месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в моче и слюне спектрофотометрическим методом на основе реакции с 7-хлор-4,6-динитробензофураксаном;

- разработаны способы косвенного определения активности N-ацетилтрансферазы на основе оценки фармакокинетических параметров месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина при их экскреции с мочой, сульфадиметоксина в слюне с применением ВЭЖХ и спектрофотометрии и обосновано их использование для персонализации фармакотерапии;

- комплексом методов биофармацевтического анализа изучена фармакокинетика тест-препаратов ацетилирования и окисления при хроническом вирусном гепатите В.

Практическая значимость. Разработан комплекс методик спектрофотометрического и хроматогра-фического определения содержания месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в моче и слюне. На их основе предложены диагностические подходы для оценки индивидуальной активности метаболической системы ацетилирования организма человека, которые могут быть рекомендованы как лабораторные тесты при персонализированном при-менении лекарственных средств.

Внедрение результатов. Результаты исследования внедрены во Всероссийском Центре молекулярной диагностики и лечения Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Москва) и в учебный процесс ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» в дисциплинах «Контроль качества лекарственных препаратов» и «Основы токсикологии».

На защиту выносится: результаты исследования хроматографического разделения месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в условиях обращено-фазной ВЭЖХ;

- результаты изучения влияния состава и рН подвижной фазы, условий элюирования, данных по оценке пригодности предложенных хроматографических систем и свойств ЛВ на выбор условий избирательного и чувствительного детектирования месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина при их анализе в моче и слюне;

- обоснование и подбор оптимальных условий чувствительного и избирательного спектрофотометрического определения месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в виде производных с 7-хлор-4,6-динитробензофуроксаном в слюне и моче, способов пробоподготовки при количественных определениях этих тест-препаратов;

- результаты исследования метрологических характеристик разработанных способов определения, полученные путем обработки экспериментального материала, подтверждающие их соответствие требованиям, принятым для биофармацевтических методов анализа;

- результаты расчета и анализа фармакокинетических данных месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина в биологических жидкостях и оптимизации критериев фенотипирования для экспрессной и точной оценки индивидуальной активности ферментных систем; способы определения индивидуальной активности N-ащтилтрансферазы, основанных на биофармацевтическом анализе фармакокинетических параметров месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина;

- данные по фармакокинетике тест-препаратов ацетилирования и окисления при хроническом вирусном гепатите В.

Апробация работы. Результаты работы и основные положения диссертации были доложены и обсуждены на XVII, XVIII Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2010, 2011), 65 и 66-ой Всероссийской конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2010, 2011), III Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, 2009), XV Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2010), VII Съезде медицинских генетиков (Ростов на Дону, 2010), Всероссийской конференции "Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез" (Краснодар, 2010), III региональной научно-практической конференции с международным участием «Синтез и перспективы использования биологически активных соединений» (Казань, 2011), XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011), III Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2011).

Публикации: Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 17 печатных изданиях, включая 5 статей в рецензируемых изданиях, рекомендуемых ВАК, 1 статью в международном журнале и 11 тезисов докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, оо^ора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, заключения, списка литературы, включающего 261 источников. Работа изложена на 183 страницах машинописного текста, иллюстрирована 38 рисунками и 30 таблицами.

150 ВЫВОДЫ

1. Обоснованы и установлены условия чувствительного и избирательного определения месалазина и сульфаметоксазола в моче, сульфадиметоксина в моче и слюне методом обращенно-фазной ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектрированием. Выявлено влияние состава подвижных фаз, их рН, содержания в них неводного компонента, режимов элюирования на разделение лекарственных веществ.

2. Валидационные параметры при определении месалазина и сульфаметоксазола в моче, сульфадиметоксина в моче и слюне соответствует современным требованиям к пригодности хроматографической системы. Достигнутая эффективность колонок составила от 2700 до 3000 т.т. Определение характеризуются высокой селективностью (более 1,2), разрешением (более 1,5) и симметрией пиков (менее 1,5). Пределы детектирования исследуемых веществ достигают 0,03 мкг/мл при диапазоне определяемых содержаний от 0,1 до 20 мкг/мл.

3. Установлены рабочие условия спектрофотометрического определения месалазина и сульфаниламидов в моче и слюне в виде окрашенных производных с 7-хлор-4,6-динитробензофуроксаном (к 490-500 нм) с пределами обнаружения 0,09; 0,1; 0,16; мкг/мл для сульфадиметоксина, месалазина и сульфаметоксазола соответственно. Выявлены факторы регулирования избирательности, чувствительности и экономичности определений лекарственных веществ в биологических жидкотях подбором состава среды, устойчивости во времени, а также направленным изменением спектральных характеристик производных определяемых веществ.

4. Разработаны методики биофармацевтического анализа активности И-ацетилтрансферазы на основе оценки фармакокинетических параметров месалазина, сульфаметоксазола и сульфадиметоксина при их экскреции с мочой и сульфадиметоксина в слюне методами ВЭЖХ и спектрофотометрии, обосновано их использование для персонализации фармакотерапии.

5. Методами биофармацевтического анализа изучена фармакокинетика тест-препаратов ацетилирования и окисления при хроническом вирусном гепатите В. При этом преобладает быстрый фенотип ацетилирования (67%) и по фенотипу окисления происходит перераспределение на средний (37%) и медленный (63%) типы. Установлена прогностическая значимость этих биофармацевтических тестов для коррекции применения лекарственных средств при вирусном гепатите В.