Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Биофармацевтический анализ метаболических систем ацетилирования, окисления и регуляция их ферментативной активности ксимедоном

На правах рукописи

ЖАРЕХИНА АЛЛА ВАЛЕРИАИОВНА

БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ СИСТЕМ АЦЕТИЛИРОВАНИЯ, ОКИСЛЕНИЯ И РЕГУЛЯЦИЯ ИХ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ КСИМЕДОНОМ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Казань-2008

003454341

Работа выполнена на кафедре аналитической химии, стандартизации и менеджмента качества в ГОУ ВПО «Казанский государственный технологический университет»

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Гармонов Сергей Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Плетенева Татьяна Вадимовна

доктор фармацевтических наук, профессор Егорова Светлана Николаевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Нижегородская государственная

медицинская академия Росздрава»

Защита состоится «19» декабря 2008 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212. 080.07 при Казанском государственном технологическом университете по адресу: 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, 68, А-330,

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственного технологического университета.

Электронный вариант автореферата размещен на сайте Казанского государственного технологического университета htpp://www.kstu.ru.

Автореферат разослан « if » ноября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук, доцент

В.М. Захаров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ*

Актуальность исследования. Биофармацевтический анализ играет важную роль в оценке эффективности, обеспечении безопасности и индивидуальной переносимости организмом человека лекарственных веществ (JIB). При этом современные методы анализа JIB в биологических объектах представляют собой в своей совокупности своеобразный инструмент для проведения биофармацевтических исследований на различных этапах создания и клинического применения лекарственных средств. Они включают определение фармако- и токсикокинетических параметров ЛВ, оценку и контроль состояния метаболических систем организма и целенаправленную регуляцию их ферментативной активности для достижения оптимального фармакологического эффекта.

. Системы ацетилирования и окисления, находящиеся под контролем ферментов N-ацетилтрансферазы (NAT) и микросомальных окси-даз (МО), осуществляют биотрансформацию большого количества JIB. Активность этих генетически детерминированных систем является главным фактором, определяющим колебания концентрации лекарств в организме пациентов, и, в конечном итоге, их ответ на лекарства, применяемые при наиболее частых и социально значимых заболеваниях (инфекционных, сердечно-сосудистой системы, органов дыхания, печени).

Все это обуславливает необходимость разработки более совершенных методов биофармацевтического анализа для установления фарма-кокинетических параметров тест-препаратов этих процессов метаболизма в биологических жидкостях. Последнее служит основой индивидуализации дозирования JIB, учета биохимических фенотипов при терапии различных патологических состояний и проведения мониторинга лекарственных препаратов. При этом сложный многокомпонентный состав биологических жидкостей особенно при низких содержаниях анализируемых веществ требует использования избирательных и чувствительных методов определения ЛВ. В то же время не менее значимым является требование высокой производительности, надежности и возможности получения большого объема аналитической информации при проведении биофармацевтического анализа в клинических условиях.

*В руководстве диссертационной работой принимала участие кандидат химических наук Шитова Наталья Сергеевна

\

Таким требованиям удовлетворяют хроматографические и оптические методы, которые все более интенсивно используются в контроле генетически детерминированных биохимических процессов метаболизма JIB в организме человека.

В связи с этим биофармацевтические исследования активности ферментов метаболизма и влияния на нее лекарственных препаратов позволяют разработать алгоритмы персонализации лекарственной терапии, совершенствовать требования к экспертизе новых препаратов, а также снизить проявление нежелательных лекарственных реакций и расходы на медицинскую помощь.

Диссертационная работа выполнялась при поддержке Грантов Президента Российской Федерации (МД-2824.2005.3 и ЩЦ-2523.2008.3) и Академии наук Республики Татарстан (проект 09-9.2-275/2006 (Г)).

Цель работы состояла в разработке комплекса хроматографиче-ских методов биофармацевтического анализа для установления активности метаболических систем ацетилирования и окисления организма человека, а также оценке влияния лекарственного препарата ксимедона на фармакокинетику тест-препаратов этих ферментных систем.

Материалы и методы исследования. В работе использована система жидкостной хроматографии SHIMADZU (Япония) с программным обеспечением LC Solutin, состоящая из насоса высокого давления LC-20АВ для создания бинарного градиента, диодно-матричного детектора SPD-M20A, флуориметрического детектора RF-10AXL, вакуум - дегазатора DGU-20 A3, термостата колонок СТО-20А. Для хроматографи-ческого разделения использованы колонки Summetry С18 (4,6 мм х 250мм х 5 мкм) с предколонкой Summetiy С18 (3,9 мм х 20мм х 5 мкм), Pecosphere С-8 ( 8,3 см х 4,6 мм) и Pecosphere С18 5 мкм ( 8,3мм х 4,6 мм). Для контроля рН мобильной фазы использовали рН-метр фирмы Наппа (Румыния). В предварительных испытаниях для определения спектров анализируемых веществ использовался сканирующий спектрофотометр SPECORD 40 фирмы AnalitykJena (Германия). Для приготовления элюентов, а также растворения стандартных испытуемых препаратов использовали ацетонитрил ос.ч, метанол марки для хроматографии и сверхчистую воду, полученную на установке MilliporWaters (США) из бидисти-лированной воды. Спектрофотометрические измерения также проводили на спектрофотометре СФ-26 и фотоколориметре КФК-3. Для предварительной пробоподготовки биологических образцов использована центрифуга К-32 (Janetszki).

При разработке методов биофармацевтического анализа ферментативной активности систем ацетилирования и окисления обследованы с использованием тест-препарата изониазида 68 чел. (здоровые добровольцы от 18 до 26 лет); с использованием тест-препарата сульфадимезина - 99 чел. (здоровые добровольцы от 18 до 28 лет); с использованием тест-препарата антипирина - 39 чел. (здоровые добровольцы от 18 до 28 лет). Исследование индукционного влияния ксимедона на систему микросомальных оксидаз проводилось в группе из 215 чел. (здоровые добровольцы в возрасте от 20 до 37 лет). Биофармацевтический анализ ферментной активности при патологических состояниях и ее регуляция проведены в группах больных стрептококковой ангиной - 85 чел., рожей - 45 чел. (набор материала для исследований осуществлялся в Республиканской инфекционной клинической больнице под руководством к.м.н., доцента кафедры инфекционных болезней КГМУ Кравченко И.Э.), хроническим вирусным гепатитом С - 50 чел. (набор материала для исследований осуществлялся в Центре по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями РТ под руководством зам. главного врача по лечебной работе, к.м.н. Макаровой М.В.), гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области - 35 чел. (набор материала для исследований осуществлялся в больнице скорой медицинской помощи № 1 под руководством главного врача поликлиники КНЦ РАН, к.м.н., доцента Погорельцева В.И.).

Фармакокинетическая и статистическая обработка результатов проводилась при использовании компьютерных программ Statistika 6, Excel, M-IND и Mathcad 11.

Научная новизна:

- установлены рабочие условия хроматографического разделения антипирина, изониазида и сульфадимезина в условиях обращено-фазной ВЭЖХ и выявлены факторы повышения избирательности и чувствительности биофармацевтического анализа этих лекарственных веществ в биологических жидкостях организма человека;

- найдены и обоснованы рабочие условия высокочувствительного и избирательного определения антипирина в слюне, изониазида и сульфадимезина в моче методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детек-трированием, оптимизированы способы их пробоподготовки при высокопроизводительных аналитических определениях тест-препаратов метаболизма;

- разработаны способы косвенного определения активности микро-сомальных оксидаз и И-ацетилтрансферазы гепатоцитов на основе фар-макокинетических параметров антипирина в слюне, изониазида и сульфадимезина при их экскреции с мочой с применением ВЭЖХ и спек-трофотометрии и обосновано их использование для персонализации лекарственной терапии;

- по данным фармакокинетики антипирина при совместном приеме с иммуномодулятором ксимедоном выявлено индукционное влияние ксимедона на активность микросомальных оксидаз печени человека;

- найдены дозозависимые и временные схемы введения ксимедона человеку с целью получения максимального эффекта индукции процессов окисления и достижения при этом оптимальных фармакокинетиче-ских параметров индуктора;

- комплексом методов биофармацевтического анализа изучена фарма-кокинетика тест-препаратов ацетилирования и окисления при стрептококковых ангинах, хроническом вирусном гепатите Сиу больных рожей, при этом установлены пути химико-фармацевтической регуляции активности ферментов систем ацетилирования и окисления при этих заболеваниях лекарственным препаратом ксимедоном;

- найдено соотношение активности И-ацетилтрансферазы и показателей неспецифической резистентности организма при гнойно-воспалительных заболеваниях челюстно-лицевой области, а также установлена прогностическая значимость сочетания медленного фенотипа ацетилирования и низкой резистентности организма в течении гнойно-воспалительных процессов.

Практическая значимость. Разработан комплекс способов оценки активности ферментных систем окисления и ацетилирования, основанных на косвенном изучении их индивидуальной активности при биотрансформации. Предложенные методические подходы могут быть использованы для экспертизы новых лекарственных средств и рекомендованы для применения в качестве аналитических технологий персонализированной медицины для повышения качества применения лекарственных средств.

Предложен новый индуктор микросомальных оксидаз - отечественный иммуномодулятор ксимедон. Дозазависимые и временные схемы введения ксимедона использованы при лечении стрептококковых ангин с целью получения оптимального лечебного эффекта.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследования хроматографического разделения антипирина, изониазвда и сульфадимезина в условиях обращено-фазной ВЭЖХ.

2. Обоснование и подбор оптимальных условий высокочувствительного и избирательного определения антипирина в слюне, изониази-да и сульфадимезина в моче методом ВЭЖХ со спектрофотометриче-ским детектрированием, способов пробоподготовки этих биологических субстратов при высокопроизводительных аналитических определениях тест-препаратов метаболизма.

3. Результаты расчета и анализа фармакокинетических данных тест-препаратов метаболизма в биологических жидкостях организма человека и оптимизации критериев фенотипирования для экспрессной и точной оценки индивидуальной активности ферментных систем.

4. Способы определения индивидуальной активности ферментных систем окисления и ацетилирования, основанных на биофармацевтическом анализе фармакокинетических параметров тест-препаратов метаболизма.

5. Данные по фармакокинетике тест-препарата окисления антипирина при совместном приеме с иммуномодулятором ксимедоном и до-зозависимые и временные параметры индуцирующего эффекта ксиме-дона на активность микросомальных оксидаз гепатоцитов.

6. Данные по фармакокинетике тест-препаратов ацетилирования и окисления при стрептококковых ангинах, хроническом вирусном гепатите Сиу больных рожей, а также способы химико-фармацевтической индукции активности этих метаболических систем ксимедоном.

7. Закономерности соотношения активности М-ацетилтрансферазы и показателей неспецифической резистентности организма при гнойно-воспалительных заболеваниях.

Личный вклад автора в опубликованных в соавторстве работах состоит в выборе и обосновании методик эксперимента, непосредственном его проведении, в участии во всей процедуре анализа и обобщении полученных экспериментальных результатов, расчете фармакокинетических параметров, установлении закономерностей и формулировке выводов.

Апробация работы. Результаты работы и основные положения диссертации были доложены и обсуждены на XIV и XV Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2007, 2008), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), II Всероссийской конференции с международным участием

«Аналитика России» (Краснодар, 2007), V и VI Международных конференциях «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2005, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины» (С.-Петербург, 2006), VII Российском съезде «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней» (Нижний Новгород, 2006), XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), II Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008).

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в клиническую практику Центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями Министерства здравоохранения РТ и Республиканской инфекционной клинической больницы Татарстана, а также в учебный процесс ГОУ ВПО «Казанский государственный технологический университет» в дисциплинах «Контроль качества лекарственных препаратов» и «Основы токсикологии».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 статей, 12 тезисов докладов и получен патент РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, заключения, указателя литературы, включающего 225 источников. Работа изложена на 171 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 рисунками, 43 таблицами, 3 схемами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении раскрыта актуальность диссертационной работы, определена цель и намечены задачи для ее достижения, показана научная новизна и практическая значимость полученных результатов, дана структура диссертации.

В первой главе описаны метаболические процессы окисления и ацетилирования; ферментные системы, участвующие в биотрансформации ксенобиотиков, способы регуляции их активности, а также современные методы биофармацевтического анализа генетически детерминированных систем окисления и ацетилирования.

Во второй главе дано описание объектов, методов и средств исследования JIB в биологических жидкостях и методик проведения экс-

периментов. В качестве объектов исследования использовали тест-препараты антипирин, изониазид и сульфадимезин, а индукторов метаболических систем - ксимедон и фенобарбитал фармакопейной чистоты. Фенотип ацетилирования определяли по модифицированной методике с использованием системы ВЭЖХ, а при спектрофотометрических определениях в качестве реагента использовали метаванадат аммония. Фенотип ацетилирования оценивали по соотношению количества выведенного с мочой непревращенного тест-препарата к количеству введенной дозы (фракция дозы). Фенотип окисления оценивали по модифицированному антипириновому тесту. Для изучения индукционного влияния ксимедона на активность ферментов МО оценивалась фармакоки-нетика антипирина до и после курсового приема по различным временным схемам и в зависимости от дозы исследуемого индуктора.

В третьей главе приведены результаты разработки методов определения тест-препаратов окисления в слюне и тест-препаратов ацетилирования в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для выделения антипирина из слюны более целесообразен метод осаждения балластных компонентов с последующим центрифугированием и хроматографированием супернатанта. При аналитических длинах волн в условиях ВЭЖХ наблюдалось поглощение биогенных компонентов слюны неустановленной природы в УФ-области спектра (рис. 1). Длина аналитической длины волны соответствует максимуму поглощения лекарственного вещества в УФ-области. Спектр поглощения антипирина в подвижной фазе приведен на рисунке 2.

А

300

100

О

о

200 250 300 350 }.,им

( 3 ТПШ1

Рисунок 1 Хроматограмма слюны человека в условиях ВЭЖХ

Рисунок 2 Спектр поглощения антипирина (10 мкг/мл) в смеси ОД % уксусная кислота с 0,1 % диэтиламина-ацетонитрил (15:85 об. %), 1 = 1 см

4О0]шА1)

I

3 г иип

Рисунок 3 Хромато-грамма антипирина (5* 10"5 моль/л) в слюне человека в условиях ВЭЖХ

43%

Рисунок 4 Соотношение фенотипов окисления (здоровые добровольцы), п =39:быстрые - 21%, средние - 43%, медленные - 36%; р<0,05

Идентификацию пика антипирина проводили, используя элюентную систему с рН 6,7 по времени удерживания препарата и спектральному отношению при длинах волн 230 и 260 нм (А2зо/254~0,795). В указанных условиях наблюдается хорошее разрешение пика определяемого вещества и пиков соэкстрактивных веществ (рис. 3).

Количественное определение препарата проводилось методом абсолютной калибровки по площади пика антипирина. В интервале концентраций 10"б-10"4 моль/л градуировочная зависимость аналитического сигнала от содержания антипирина является линейной:

Б (тАи*5)=999213 Сх (мкг/мл) + 3195 (г = 0,9999) (п=16).

Правильность хроматографических определений антипирина в слюне была оценена с использованием метода «введено-найдено». Результаты этой оценки демонст рируют отсутствие мешающего влияния различных компонентов слюны (неорганических и органических) на результаты ВЭЖХ определений антипирина (табл. 1).

На основе ВЭЖХ определений антипирина в слюне разработан метод косвенного определения активности микросомальных оксидаз. При этом распределение добровольцев контрольной группы по активности цитохромов Р450 при определении фенотипа окисления (ФО) по антипирину показало наличие трех групп: быстрого (21%), среднего (43%) и медленного типа (36%), что показано на гистограмме (рис. 4).

|

Таблица 1 Результаты определения антипирина в слюне методом ВЭЖХ

(п=6, р=0,95)

Введено антипирина в слюну, м кг/мл Найдено антипирина, мкг/мл 8Г

3,0 2,9 ± 0,3 0,06

4,0 4,1 ±0,3 0,05

5,6 5,5 ± 0,4 0,05

7,5 7,3 ± 0,6 0,05

10,8 11,0 ± 1,0 0,04

12,0 12,0 ± 1,0 0,05

15,5 16,0 ± 1,0 0,04

20,6 21,0 ± 1,0 0,04

25,0 26,0 ± 2,0 0,04

30,0 31,0 ±2,0 0,04

35,0 34,0 ± 2,0 0,04

Разработанные критерии разделения обследуемых на «быстрых», «средних» и «медленных» окислителей и степень достоверности разработанного метода представлены в таблице 2.

Для унификации разрабатываемого метода были определены длины волн, при которых все исследуемые вещества имели достаточно высокий коэффициент молярного поглощения. Наибольшие значения коэффициенты молярного светопоглощения водно-этанольные растворы сульфадимезина и изониазида имеют при 270 и 260 им, соответственно.

Таблица 2 Фармакокинетические параметры экскреции антипирина слюной (п=39)

Параметр Фенотип окисления (М±ш)

Быстрый Средний Медленный

Содержание антипирина, экскретируемого со слюной за 12 часов, мкг/мл 2,8±1,9 10,7+0,7 24,4+3,3

Статистический уровень значимости различий, р р<0,001

р<0,001

Примечание (далее везде): р - статистический уровень значимости различий между показателями фенотипов метаболизма; М - средняя величина; ш -среднеквадратичное отклонение.

При использовании подвижной фазы состава 0,05 % водный раствор трифторуксусной кислоты и ацетонитрил (85:15 % об.) на колонке

Pecosphere CI8 пик сульфадимезина хорошо разделялся с компонентами мочи. Изониазид удалось хорошо отделить от соэкстрактивных веществ также на колонке Pecosphere С18 с использованием в качестве подвижной фазы смеси 0,02 М фосфатного буферного раствора и аце-тонитрила (95:5 % об.). Скорость подачи подвижной фазы, при которой наблюдалось оптимальное достижение параметров хроматографическо-го разделения, была на уровне 1 мл/мин.

При экстракции тест-препаратов из мочи для полного извлечения компонентов биологической матрицы эффективным оказалось использование ацетонитрила в течение 10 минут с последующей обработкой ультразвуком. Причем процедура вакуум-отгонки растворителя досуха, необходимая при использовании многокомпонентных ограниченно смешивающихся с водой элюирующих смесей, может быть исключена. Это значительно упрощает проведение анализа и обеспечивает достаточную экспрессность единичного определения.

При анализе сульфадимезина в моче человека пик определяемого вещества и неидентифицированные компоненты мочи полностью разделяются при использовании следующего состава подвижной фазы: 0,05 % водный раствор трифторуксусной кислоты-ацетонитрил (90:10, % об.) (рис. 5 и 6).

mAU

175

mAU 175

125 75

25 0 -25

0,0

2,5 5,0

125

75

25 0 -25

J

J

Рисунок 5 Хроматограмма мочи человека в условиях ВЭЖХ. Элюент 0,02 М фосфатный буферный раствор - ацетонитрил (95:5 % об.): 1 - неразделенная смесь, 2 - изониазид (25 мкг/мл)

0,0 шш

Рисунок 6 Хроматограмма мочи человека в условиях ВЭЖХ. Элюент 0,05 % водный раствор трифторуксусной кислоты ацетонитрил (90:10, % об.): 1 -неразделенная смесь, 2 - сульфадиме-

гл г- I ^

При этих условиях линейные, хорошо воспроизводимые градуиро-вочные зависимости интенсивности сигнала (площадь пика) - содержа-

2,5 5,0

ние определяемого вещества могут быть представлены в виде уравнений:

дая изониазида БОпАи-э) = 47679Сх(мкг/мл) - 2390 (г = 0,9989, п = 15); для сульфадимезина 8(тАи-Б) = 69016Сх(мкг/мл) - 1059 (г = 0,9996, п = 14) при интервале определяемых содержаний веществ 3 мкг/мл - 100 мкг/мл.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о значительных преимуществах разработанной методики хроматографического определения тест-препаратов в биожидкостях перед другими, уже известными из литературы. Это связано, прежде всего, с быстротой, точностью, прецезионностъю данного анализа и возможностью автоматизации процесса.

С помощью комплекса разработанных методик обследовано 100 здоровых добровольцев и оценено распределение их на медленный и быстрый фенотипы. По нашим данным соотношение ацетиляторных фенотипов у здоровых добровольцев составляет 55% медленных и 45% быстрых ацетиляторов, что согласуется со сведениями из литературы. По этим результатам рассчитаны фармакокинетические параметры (табл. 4). Полученные данные позволяют использовать в качестве критерия для фенотипирования ацетилирования указанные параметры, из которых наиболее удобным является оценка фракции дозы изониазида.

Таблица 4 Фармакокинетические параметры экскреции изониазида с мочой (доза 0,45 г) у здоровых добровольцев (М±ш)

Фармакокинетические параметры Фенотип ацетилирования Р

Быстрый Медленный

Площадь подфармакокинети-ческой кривой (А1ГС), мкг-ч/мл 21630±2300 77590±14220 р<0,001

Константа элиминации лекарственного вещества (Ке]), ч"1 0,554610,058 0,229810,1000 р<0,001

Время полувыведения лекарственного вещества (^д), ч 1,35±0,18 3,9710,25 р<0,001

Объем распределения (Уа), мл 41,Ш,5 32,2+3,4 р<0,001

Фракция дозы за 6 часов, % 3,12±0,25 9,4011,37 р<0,001

Избирательное и чувствительное хроматографическое определение сульфадимезина в моче позволило использовать эту методику для изучения фармакокинетики генетически детерминированных процессов его биотрансформации в организме человека и уменьшить дозы его приема. Были рассчитаны фармакокинетические параметры кумулятивного выведения сульфадимезина с мочой (табл. 5).

Таблица 5 Фармакокинетические параметры экскреции сульфадимезина

с мочой (доза 0,25 г)

Фармакокинетические параметры Быстрые ацетиляторы (а=47) Медленные ацетиляторы (п=52)

Период полувыведения (^д), ч 6,0 + 0,7 13,0 ±1,2

Фракция дозы за 6 часов, % 5,5 + 0,6 10,1 ±1,1

Константа скорости выведения (Кс1), час"1 0,13 + 0,01 0,30 ±0,04

Как видно, в группе обследуемых пациентов они распределяются бимодально, что позволяет проводить их выявление как быстрых и медленных ацетиляторов. Оказалось, что удобным параметром для этого является количество выводимого сульфадимезина в процентах от вводимой дозы. Как было установлено, надежное установление фенотипа возможно путем анализа почасовых проб мочи в течение 6 часов после приема лекарства (менее 7 % выведения свободного лекарства -быстрый тип, более 7 % - медленный тип), что позволяет проводить достаточно экспрессное обследование пациентов.

В главе 4 представлены результаты изучения индукционного влияния лекарственного препарата ксимедона на активность микросомаль-ных оксидаз печени человека. Критерием увеличения активности ферментов системы цитохрома Р450 служили кинетические параметры ФО, которые оценивались по кумулятивному количеству антипирина, выведенному со слюной. Вначале определяли фармакокинетические параметры, определяющие ФО здоровых добровольцев, затем после приема ксимедона в различных суточных дозах вновь определяли ФО (табл. 6). Для этого предложена фармакокинетическая модель распределения антипирина, описываемая процессами псевдопервого порядка, которая позволила провести расчет фармакокинетических параметров тест-препарата.

Таблица 6 Фармакокинетические параметры антипирина до и после приема ксимедона

Группа 1 Фенотип окисления Фармакокинетические параметры антипирина

Ко, 1/час л ^тах, мкг/мл С1, мл/мин часы АиС, мкгчас/мл

Здоровые (п=205) Б 0,37±0,04 175,2±1,7 2,23±0,17 1065±14 2,23±0,03 11,02±1,05

С 0,17±0,02 90,8±6,9 6,14±0,36 188±9 4,39±0,15 66,22±6,46

М 0,14±0,00 49,5±2,11 11,27±0,66 112±3 7,95±0,98 83,33±2,42

1 (п=48) Б 0,39±0,03 179,9±5,6 1,83±0,01 1427±24 1,59±0,09 7,92±1,02

С 0,18±0,01 106,3±6,9 5,30±0,38 218±12 2,53±0,03 43,55±4,53

М 0,16±0,01 48,9±1,1 7,68±0,15 129±1 5,15±1,08 7б,79±0,98

с7 Б 0,39±0,00 179,0±5,б 1,69±0,38 1443±19 1,48±0,11 8,70±0,13

С 0,20±0,01 108,9±14,2 5,70±0,55 259±22 2,14±0,01 39,95±4,41

М 0,16±0,01 53,6±1,0 7,96±0,48 132±5 5,07±0,05 77,бЗ±1,18

3 (п=55) Б 0,36±0,01 177,8±1,0 1,73±0,00 1156±8 1,86±0,05 9,10±0,03

С 0,18±0,03 99,34±1,5 5,81±0,02 219±8 3,36*0,01 42,87±0,80

м 0,16*0,01 52,0±0,9 8,59±0,02 121±5 7,15±0,08 78,11±1 Л

4 (п=50) Б 0,32±0,01 171,3±1,9 2,10±0,08 1098±7 2,01±0,1б 10,4±1,5

С 0,17±0,01 96,2±3,0 5,94±0,42 172±б 4,86±0,18 43,59±1,23

м 0,16±0,00 47,8±3,7 10,01±0,01 12б±6 8,01±1,16 86,60±0,21

Примечание: Б - быстрый, С - средний, М - медленный фенотипы

Добровольцы случайным образом были разделены на 5 групп: первые четыре группы принимали ксимедон в различных суточных дозах, а в 5 группе принимался известный индуктор окислительных ферментов фенобарбитал. Установлены дозозависимые эффекты влияния ксимедона на активность ферментов окисления, которые достоверно отличаются при установленных дозах. Процент индукции растет с увеличением дозы индуктора ксимедона и является максимальным при суточной дозе в 1,5 г (табл. 7).

При снижении дозы индуктора у лиц с быстрым фенотипом окисления индукция практически не наблюдалась. Это может объясняться высокой активностью окислительных ферментов, на которые небольшие дозы индуктора просто не оказывают влияния, а также ускоренным метаболизмом самого индуктора. В подгруппе среднего фенотипа окисления наблюдается дозозависимый характер изменения величины индукции. При этом фармакокинетические параметры антипирина оценивали до и после приема ксимедона. Наибольшая вариация параметров наблюдалась у пациентов 1 и 2 групп, принимавших одинаковую суточную до-

зу ксимедона 1,5 г в течение семи и трех дней соответственно, причем их величина достоверно не отличается между собой, что говорит о наличии только дозозависимого эффекта, в то время как длительность приема индуктора не влияет на величину индукционного эффекта.

Таблица 7 Величина индукции (в %) в зависимости от фенотипа окисления (ФО) дозы ксимедона и срока его приема

Суточная

доза, г 1.5 г; 1,5 г; 0,375г; 0,1875 г; 0,09 г;

срок приема, 7 дней 3 дня 3 дня 3 дня 3 дня

дни

Быстрый ФО 25,78±9,12 20,85±14,74 1,01±0,09 0,93± 0,17

(п=8) (п=10) (п=б) (п=5)

Средний ФО 44,39±8,24 51,64±3,31 27,83±6,09 7,94± 3,81

(п=29) (п=24) (п=28) (п=30)

Медленный ФО 49,48±4,40 45,57±6,70 34,41±16,59 37,50± 8,19

(п=15) (п=14) (п=21) (п=15)

Общая ин- 45,85±5,80 43,66±4,23 27,68±4,25 16,01± 4,54 52,77±6,33

дукция (п=52) (п=48) (п=55) (п=50) . (п=10)

Выявление наличия дозозависимых и временных эффектов позволяет сделать вывод о механизме воздействия индуктора на систему цито-хромов Р450. Учитывая химическое строение и изоформы окислительных ферментов, участвующих в биотрансформации антипирина можно сделать вывод, что наиболее вероятным типом механизма индукции ци-тохромов Р450 ксимедоном является фенобарбиталовый тип.

Для сопоставления разработанного способа увеличения активности окислительных ферментов с уже имеющимся, проверялось влияние на фармакокинетику антипирина известного индуктора процесса окисления фенобарбитала (табл. 8).

Таблица 8 Фармакокинетические параметры антипирина у добровольцев, принимавших фенобарбитал (п=10)

Фармакокинетические параметры Фенотип окисления

Быстрый (п=4) Средний(п=6)

Kei.l/час 0,360±0,004 0,27б±0,119

173,90±6,49 92,04±1,18

Cimax, мкг/мл 1,89±0,57 4,76±1,11

ti/гДасы 1,58±0,01 2,51±0,08

CL, мл/мин 1542±50 285±29

AUC, мкг-час/мл 8,4б±3,90 41,46±2,15

Установлено, что величина индукции при приеме ксимедона достоверно не отличается от индукции фенобарбиталом. В связи с этим применение ксимедона в качестве индуктора ферментов системы цитохро-мов Р450 является более целесообразным вследствие его малой токсичности и возможности универсальности применения в качестве иммуно-модулятора и регенеранта.

В пятой главе изложены результаты биофармацевтического анализа метаболических систем при различных патологических состояниях й изучение возможностей их химико-фармацевтической коррекции ксиме-доном.

Больные ангиной были разделены на две группы - контрольную, получавшую только базовое лечение и основную, получающие дополнительно к базовой терапии ксимедон (табл. 9). Как было установлено, при ангине в острый период преобладает медленный фенотип окисления (рис. 7). У пациентов на фоне приема ксимедона происходит перераспределение фенотипов окисления, соотношение которых приближается к группе здоровых людей, а также наблюдается более выздоровление, чем у больных с базовым лечением.

Рисунок 7 Соотношение фенотипов окисления обследуемых групп: 1 - здоровые добровольцы (п=30), 2 - больные ангиной в острый период (п= 32), 3 - больные ангиной в период ранней реконвалесценции (базовая терапия, п=15), 4 - больные ангиной в период 1 2 3 4 ранней реконвалесценции (базовая терапия и

а быстрый а средний и медленный прием ксимедона, п=17)

Таблица 9 Данные о содержании антипирина в слюне пациентов после его перорального введения в дозе 0,6 г

Фенотип окисления Концентрация, мкг/мл

Базовое лечение Лечение на фоне ксимедона

до лечения после лечения до лечения после лечения

Быстрый 3,74±0,19 (п=2) 1,20±0,19 (п=2) 4,14±0,94 (п=2) 3,03±0,13 (п=3)

Р р<0,001 р<0,001 р<0,01 р<0,001

Средний 10,53±1,26 (п=5) 11,26±0,76 (п=8) 12,83±0,89 (п=6) 10,96±1,05 (п=7)

Р р<0,001 р<0,001 р<0,001 р<0,001

Медленный 27,98±1,46 (п=8) 23,21±1,75 (п=5) 22,94±1,43 (п=9) 28,65±1,93 (п=7)

При исследовании активности ферментов системы ацетилирования у данной категории больных установлено, что быстрый фенотип ацетилирования является преобладающим. По полученным данным рассчитаны фармакокинетические параметры для быстрых и медленных аце-тиляторов (табл.10).

После курсового применения ксимедона не выявлена индукция в группе быстрых ацетиляторов, в то время как у медленных ацетилято-ров индукция к концу лечения привела к переходу многих испытуемых из группы медленных ацетиляторов в группу быстрых (табл. 11).

При сопоставлении результатов ацетиляторного статуса и процессов микросомального окисления у больных стрептококковой ангиной прослеживается следующая взаимосвязь. В острый период заболевания у больных ангиной преобладает быстрый фенотип ацетилирования и медленный фенотип окисления.

Таблица 10 Фармакокинетические параметры выведения изониазида с мочой при пероральном приеме (доза 0,45 г) у больных ангиной до лечения в группах быстрых и медленных фенотипов ацетилирования (п=85)

Фенотип ацетилирования Площадь под фармакоки-нетической кривой, мкг-ч/мл (AUC) Время полувыведения, ч (Тю) Константа элиминации, ч'1 (Ке1) Объем распределения, мл (Vd) Фракция дозы, %

Быстрый (п=48) 21567±4523 1,05±0,35 0,4956±0,067 8 50,1±6,89 4,07±0,34

Медленный (п=35) 78908±11356 3,78±1,91 0,3001±0,0045 32,46± 11,21 10,92±0,74

Р* р< 0,001 р < 0,05 р > 0,05 р > 0,05 р < 0,001

Таблица 11 Индукция 'Ы-ацетилтрансферазы при применении ксимедона в основной группе больных

Фенотип ацетилирования Фракция дозы ГИНК до начала лечения, % Курс лечения ксимедоном

Фракция дозы ГИНК по окончанию лечения, % Индукция, %

Быстрый 4,25 ± 0,28 5,18 ±0,6 Нет

Медленный 10,27 ±0,75 6,59 ± 1,01 62,5± 9,08

Другим примером, ярко характеризующим роль разработанных методов биофармацевтического анализа в обеспечении безопасности лечения, являются пациенты хроническим вирусным гепатитом С. Обследованные 50 человек были представлены двумя группами больных: в группе 1 определяли фенотип окисления, а в группе 2 - фенотип аце-тилирования.

Фенотипирование группы 1 показало, что преобладающим является средний фенотип окисления (рис. 8). При этом быстрый фенотип окисления не наблюдался, в то время как у здоровых людей регистрировался еще и быстрый фенотип окисления (табл. 12). По полученным экспериментальным данным были рассчитаны фармакокинетические параметры антипирина при его экскреции со слюной пациентов (табл. 13).

Таблица 12 Данные о содержании антипирина в слюне, выведенного за 12 часов у больных ХВГС и здоровых людей

Фенотип окисления Больные ХВГС (п=20) Здоровые добровольцы (п=39)

Количество антипирина, выведенного за 12 часов (Со5щ), мкг/мл

Быстрый * 2,84±1,80

Р - р<0,001

Средний 12,99±3,21 10,69±0,83

Р р<0,001 р<0,001

Медленный 26,06±5,45 24,25±3,19

в исследуемой выборке данного фенотипа окисления не наблюдалось

При определении фенотипа ацетилирования было выявлено, что

преобладающим является медленный фенотип ацетилирования (рис.9).

%

8<У» 60 40 20 0

100 50 0

п быстрые □ средние я медленные

в Быстрые

□ Медленные

Рисунок 8 Фенотип окисления: 1- больные ХВГС (п=20), 2- здоровые добровольцы (п=39)

Рисунок 9 Фенотип ацетилирования: 1 - Больные ХВГС (п=20), 2 - здоровые добровольцы (п=110)

Таблица 13 Фармакокинетические параметры антипирина при его экскреции со слюной у больных ХВГС

Фармакокинетические Фенотип окисления ;

параметры Средний(п=14) Медленный (п=6)

kjbl/час 0,2000±0,0621 0,1300±0,0700

Vd, л 71,26±8,96 49,48±7,41

т, час 2,73±0,18 2,33±0,14

С1тах, мкг/мл 6,79±0,59 9,80±1,16

t, п;часы 4,42±1,22 4,25±1,13

CL/f, мл/час 12091±3148 4542±1880

мл/мин 201±52 75,77±31,41

MRTB, часы 8,63±2,28 13,00±6,88

МАТ, часы 3,29±0,20 2,95±0,2б

МТТВ, часы 6,38±1,76 6,13±1,64

AUC мкг-час/мл 55,76±8,72 82,03±28,48

Полученные экспериментальные данные показывают, что при гепатите С наблюдается резкое торможение метаболизма лекарств в печени.

Интересным приложением разработанных методов явилась оценка активности ацетилирования у больных с острыми гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области (рис. 10), где преобладающим фенотипом ацетилирования явился медленный тип.

Рисунок 10 Соотношение фенотипов ацетилирования: 1- больные гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области, 2-здоровые добровольцы.

Было проведено сопоставление неспецифической резистентности организма со скоростью метаболизма. У здоровых людей наблюдается более высокие значения коэффициента резистентности, что говорит об оптимальном уровне возбудимости ЦНС. Неспецифическая резистентность организма больных в группах медленных и быстрых ацетилято-ров при всех видах воспалений челюстно-лицевой области имела низкие значения непосредственно после проведенной операции и значительно повышалась после проведенного лечения (табл. 14).

%

1 2

В Быстрые □ Медленные

»

У больных с медленным фенотипом ацетилирования в сочетании с пониженной резистентностью сроки выздоровления были существенно больше, чем у лиц с быстрым фенотипом ацетилирования (12,0±1,5 и 19,0±2,0 суток соответственно, р<0,001).

Таблица 14 Неспецифическая резистентность организма у больных с воспалительными заболеваниями в челюстно-лицевой области в зависимости от фенотипа ацетилирования

Фенотип ацетилирования Коэффициент резистентности при поступлении Коэффициент резистентности при выписке Статистический уровень значимости коэффициента резистентности

Быстрый 0,31 ±0,06 0,45 ± 0,09 р<0,001

Медленный 0,30 ±0,09 0,44 ±0,16 р<0,01

Таким образом, результаты диссертационной работы демонстрируют высокую эффективность разработанных методов биофармацевтического анализа генетически детерминированной ферментативной активности систем ацетилирования и окисления на основе оценки индивидуальных фармакокинетических профилей тест-препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Обоснованы и установлены рабочие условия высокочувствительного и избирательного анализа антипирина в слюне, изониазида и сульфадимезина в моче методом обращено-фазной ВЭЖХ со спектро-фотометрическим детектрированием, оптимизированы способы пробо-подготовки этих биологических субстратов при высокопроизводительных аналитических определениях тест-препаратов метаболизма.

2. Разработаны методики биофармацевтического анализа активности микросомальных оксидаз и М-ацетилтрансферазы на основе оценки фармакокинетических параметров антипирина в слюне за 12 часов, экскреции изониазида и сульфадимезина в моче за 6 часов методами ВЭЖХ и спектрофотометрии, обосновано их использование для персо-нализации лекарственной терапии.

3. Впервые выявлено индукционное влияние ксимедона на активность микросомальных оксидаз печени человека по фармакокинетике антипирина при совместном приеме с иммуномодулятором ксимедо-ном. Установлены доза-зависимые схемы введения ксимедона человеку

с целью получения максимального эффекта индукции процессов мик-росомального окисления.

4. Методами биофармацевтического анализа изучена фармакокине-тика тест-препаратов ацетилирования и окисления при хроническим вирусном гепатите С, стрептококковых ангинах и у больных рожей. Выявлены пути химико-фармацевтической регуляции активности ферментов систем ацетилирования и окисления при этих заболеваниях лекарственным препаратом ксимедоном.

5. Проведена оценка соотношения активности N-ацетилтрансферазы и показателей неспецифической резистентности организма при гнойно-воспалительных заболеваниях челюстно-лицевой области и установлена прогностическая значимость сочетания медленного фенотипа ацетилирования и низкой резистентности организма в течении этих процессов и коррекции применения лекарственных средств.

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, для размещения материалов диссертации:

1. Гармонов, С.Ю. Фармакокинетические подходы к оценке активности микросомальных оксидаз печени человека / С.Ю. Гармонов, Н.С. Шитова, A.B. Яковлева (Жарехина), Т.А. Киселева, В.И. Погорельцев, М.В. Макарова // Вестник Казанского технолог, ун-та. - 2006. - №5. - С. 41-51.

2. Гармонов, С.Ю. Метод определения фенотипа ацетилирования при использовании в качестве реагента метаванадата аммония и оценка активности N-ацетилтрансферазы у больных вирусным гепатитом С / С.Ю. Гармонов, Н.С. Шитова, A.B. Яковлева (Жарехина), P.A. Юсупов, В.И. Погорельцев, М.В. Макарова // Вестник Казанского технолог, ун-та. - 2006. - №5. - С. 32-41.

3. Погорельцев, В.И. Фармакокинетические исследования лекарственного препарата ксимедона / В.И. Погорельцев, С.Ю. Гармонов, B.C. Резник, A.B. Яковлева (Жарехина) // Вестник Казанского технолог, ун-та. - 2006. - №4. - С. 19-25.

4. Погорельцев, В.И. Применение иммуномодулятора ксимедона в качестве индуктора фермента N-ацетилтрансферазы / В. И. Погорельцев, С.Ю. Гармонов, Н.С. Шитова, Т.А. Киселева, A.B. Яковлева (Жарехина), М.И. Евгеньев // Клиническая фармакология и фармакотерапия. - 2006. - Т. 15, № 2. - С. 8285.

5. Гармонов, С.Ю. Метод косвенного определения активности N-ацетилтрансферазы при использовании в качестве реагента метаванадата аммония для оценки экскреции изониазида с мочой человека / С.Ю.Гармонов, Н.С. Шитова, А.В.Яковлева (Жарехина), P.A. Юсупов // Химико-фармацевтический журнал. - 2008. - Т. 42, № 8. - С. 49-53.

6. Гармонов, С.Ю Метаболические процессы ацетилирования у больных гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области / С.Ю. Гармонов, В.И. Погорельцев Н.С. Шитова, A.B. Яковлева (Жарехина), Е.В. Шарапова, И.Е. Зыкова // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2008. - №4. - С. 43-46.

7. Кравченко, И.Э. Оценка метаболических систем ацетилирования и окис-ения у больных стрептококковыми ангинами и их терапевтическая коррекция

ксимедоном / И.Э. Кравченко, С.Ю. Гармонов, Р.Г. Зарипова, A.B. Яковлева (Жарехина), В.Х. Фазылов // Казанский медицинский журнал. - 2008. - №4. - С. 452-457.

Основное содержание диссертации изложено в публикациях:

1. Ксимедон в качестве индуктора активности микросомальных оксидаз печени человека: пат. 2316327 / Рос. Федерация: МПК8 А 61 К 31/505, С 12 N 9/00 / Погорельцев В.И., Гармонов С.Ю., Резник B.C., Шитова Н.С., Яковлева (Жарехина) A.B. -№ 2006135296/15 ; заявл. 05.10.06 ; опубл. 10.02.08, Бюл№

2. Гармонов, С.Ю. Индивидуальная химическая чувствительность человека: обеспечение экологической безопасности и оценка риска / С.Ю. Гармонов, A.B. > ковлева (Жарехина) // Регионы России: управление социально-экономическими процессами и безопасность: сб. науч. ст. / КГТУ. - Казань, 2007. - Ч. 1. - С. 304307.

3. Макарова, М.В. Фармакогенетическое тестирование у больных вирусными гепатитами./ М.В. Макарова, A.B. Яковлева (Жарехина), С.Ю. Гармонов / Тезисы докладов V Междун. конф. «Клинические исследования лекарственных средств». - М., 2005. - С. 96-97.

4. Кравченко, И.Э. Исследование фенотипов ацетилирования у больных ангиной / И.Э. Кравченко, С.Ю. Гармонов, Р.Г. Зарипова, В.Х. Фазылов, A.B.

ковлева (Жарехина) // Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной едицины». - С.-Петербург, 2006. - С. 169-170.

5. Кравченко, И.Э. Оценка фенотипов окисления у больных стрептококко-- ой ангиной на фоне базисной терапии и лечения ксимедоном / И.Э. Кравчен-

о, С.Ю. Гармонов, Р.Г. Зарипова, В.Х. Фазылов, A.B. Яковлева (Жарехина) // 1езисы докладов VII Российского съезда «Новые технологии в диагностике и, ечении инфекционных болезней». - Нижний Новгород, 2006. - С. 89.

6. Макарова, М.В Фармакогенетические тесты у больных вирусным гепа-итом С / М.В. Макарова, A.B. Яковлева (Жарехина), С.Ю. Гармонов // Тезисы окладов VII Российского съезда «Новые технологии в диагностике и лечении нфекционных болезней». - Нижний Новгород, 2006. - С. 163-164.

7. Гармонов, С.Ю. Аналитические методы в биофармацевтических иссле-ованиях и контроле перекрестного загрязнения химико-фармацевтических

производств / С.Ю. Гармонов, Г.Р. Нурисламова, A.B. Яковлева (Жарехина), И.А. Салахов, Н.С. Шитова II Тезисы докладов XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. - М., 2007. - С. 115.

8. Гармонов, С.Ю. Аналитические методы оценки ферментативной активности генетически детерминированных метаболических систем организма человека. / С.Ю. Гармонов, A.B. Яковлева (Жарехина), Н.С. Шитова, В.И. Погорельцев // Тезисы докладов II Всероссийской конференции с межд. участием «Аналитика России». - Краснодар, 2007. - С.417.

9. Киселева, Т.А. Оценка окислительной способности печени с помощью антипиринового теста / Т.А. Киселева, С.Ю. Гармонов, A.B. Яковлева (Жарехина), И.Г. Салихов // Тезисы докладов VI Междун. конф. «Клинические исследования лекарственных средств». - М., 2007. - С. 64-65.

10. Кравченко, И.Э. Изучение влияния препарата ксимедон на фенотипы окисления у больных стрептококковой ангиной / И.Э. Кравченко, Р.Г, Зарипова, В.Х. Фазылов, С.Ю. Гармонов, A.B. Яковлева (Жарехина) // Тезисы докл. XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2007. - С.

11. Гармонов, С.Ю. Ферментные системы ацетилирования и окисления у больных вирусных гепатитом С и их фармакологическая коррекция ксимедо-ном / С.Ю. Гармонов, A.B. Яковлева (Жарехина), В.И. Погорельцев, М.В. Макарова // Тезисы докл. XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2007. - С. 539.

12. Каюмова, JI.C. Оценка фенотипа ацетилирования у больных рожей на фоне базисной терапии и лечения ксимедоном / Л.С. Каюмова, A.B. Яковлева (Жарехина) // Тезисы докладов XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые учёные в медицине» / КГМУ. - Казань, 2007 - С. 86.

13. Кравченко, И.Э. Исследование процессов ацетилирования у больных рожей на фоне базисной терапии и лечения ксимедоном / И.Э. Кравченко , В.Х. Фазылов, Л.С. Каюмова, С.Ю. Гармонов, A.B. Яковлева (Жарехина), Т.Н. Га-лиуллина // Тезисы докладов XV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2008. - С. 180.

14. Гармонов, С.Ю. Аналитические методы в исследованиях генетического полиморфизма процессов биотрансформации организма человека / С.Ю. Гармонов, Н.С. Шитова, A.B. Яковлева (Жарехина) // Тезисы докл. II Международного форума «Аналитика и ан ~ неж, 2008. - Т.2. С. 478.

555.

Соискатель

Жарехина A.B.

Формат издания 60x84 1/16, V - 4,0 п.л, тир. 100 экз, заказ А-58. Отпечатано в типографии ИП Чермяниной А.П

Актуальность темы. Биофармацевтический анализ играет важную роль в оценке эффективности, обеспечении безопасности и индивидуальной переносимости организмом человека лекарственных веществ (JIB). При этом современные методы анализа JIB в биологических объектах представляют собой в своей совокупности своеобразный инструмент для проведения биофармацевтических исследований на различных этапах создания и клинического применения лекарственных средств. Они включают определение фар-мако - и токсикокинетических параметров ЛВ, оценку и контроль состояния метаболических систем организма и целенаправленную регуляцию их ферментативной активности для достижения оптимального фармакологического эффекта/

Системы ацетилирования и окисления, находящиеся под контролем ферментов N-ацетилтрансферазы (NAT) и микросомальных оксидаз (МО), осуществляют биотрансформацию большого количества ЛВ. Активность этих генетически детерминированных систем является главным фактором, определяющим колебания концентрации лекарств в организме пациентов, и, в конечном итоге, их ответ на лекарства, применяемые при наиболее частых и социально значимых заболеваниях (инфекционных, сердечно-сосудистой системы, органов дыхания, печени).

Все это обуславливает необходимость разработки более совершенных методов биофармацевтического анализа для установления фармакокинетиче-ских параметров тест-препаратов этих процессов метаболизма в биологических жидкостях. Последнее служит основой индивидуализации дозирования ЛВ, учета биохимических фенотипов при терапии различных патологических состояний и проведения мониторинга лекарственных препаратов. При этом сложный многокомпонентный состав биологических жидкостей особенно

В руководстве диссертационной работой принимала участие кандидат химических наук Шитова Наталья Сергеевна при низких содержаниях анализируемых веществ требует использования избирательных и чувствительных методов определения JIB. В то же время не менее значимым является требование высокой производительности, надежности и возможности получения большого объема аналитической информации при проведении биофармацевтического анализа в клинических условиях. Таким требованиям удовлетворяют хроматографические и оптические методы, которые все более интенсивно используются в контроле генетически детерминированных биохимических процессов метаболизма JIB в организме человека.

В связи с этим биофармацевтические исследования активности ферментов метаболизма и влияния на нее лекарственных препаратов позволяют разработать алгоритмы персонализации лекарственной терапии, совершенствовать требования к экспертизе новых препаратов, а также снизить проявление нежелательных лекарственных реакций и расходы на медицинскую помощь.

Диссертационная работа выполнялась при поддержке Грантов Президента Российской Федерации (МД-2824.2005.3 и МД-2523.2008.3) и Академии наук Республики Татарстан (проект 09-9.2-275/2006 (Г)).

Цель работы состояла в разработке комплекса хроматографических методов биофармацевтического анализа для установления активности метаболических систем ацетилирования и окисления организма человека, а также оценке влияния лекарственного препарата ксимедона на фармакокинетику тест-препаратов этих ферментных систем.

Научная новизна:

- установлены рабочие условия хроматографического разделения антипирина, изониазида и сульфадимезина в условиях обращено-фазной ВЭЖХ и выявлены факторы повышения избирательности и чувствительности биофармацевтического анализа этих лекарственных веществ в биологических жидкостях организма человека;

- найдены и обоснованы рабочие условия высокочувствительного и избирательного определения антипирина в слюне, изониазида и сульфадимезина в моче методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектрированием, оптимизированы способы их пробоподготовки при высокопроизводительных аналитических определениях тест-препаратов метаболизма;

- разработаны способы косвенного определения активности микросо-мальных оксидаз и N-ацетилтрансферазы гепатоцитов на основе фармакоки-нетических параметров антипирина в слюне, изониазида и сульфадимезина при их экскреции с мочой с применением ВЭЖХ и спектрофотометрии и обосновано их использование для персонализации лекарственной терапии;

- по данным фармакокинетики антипирина при совместном приеме с иммуномодулятором ксимедоном выявлено индукционное влияние ксимедо-на на активность микросомальных оксидаз печени человека;

- найдены дозозависимые и временные схемы введения ксимедона человеку с целью получения максимального эффекта индукции процессов окисления и достижения при этом оптимальных фармакокинетических параметров индуктора;

- комплексом методов биофармацевтического анализа изучена фарма-кокинетика тест-препаратов ацетилирования и окисления при стрептококковых ангинах, хроническом вирусном гепатите Сиу больных рожей, при этом установлены пути химико-фармацевтической регуляции активности ферментов систем ацетилирования и окисления при этих заболеваниях лекарственным препаратом ксимедоном;

- найдено соотношение активности N-ацетилтрансферазы и показателей неспецифической резистентности организма при гнойно-воспалительных заболеваниях челюстно-лицевой области, а также установлена прогностическая значимость сочетания медленного фенотипа ацетилирования и низкой резистентности организма в течении гнойно-воспалительных процессов.

Практическая значимость. Разработан комплекс способов оценки активности ферментных систем окисления и ацетилирования, основанных на косвенном изучении их индивидуальной активности при биотрансформации. Предложенные методические подходы могут быть использованы для экспертизы новых лекарственных средств и рекомендованы для применения в качестве аналитических технологий персонализированной медицины для повышения качества применения лекарственных средств.

Предложен новый индуктор микросомальных оксидаз - отечественный иммуномодулятор ксимедон. Дозазависимые и временные схемы введения ксимедона использованы при лечении стрептококковых ангин с целью получения оптимального лечебного эффекта.

Результаты исследования внедрены в клиническую практику Центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями Министерства здравоохранения Республики Татарстан и Казанской городской инфекционной клинической больницы, а также в учебный процесс ГОУ ВПО «Казанский государственный технологический университет» в дисциплинах «Контроль качества лекарственных препаратов» и «Основы токсикологии».

На защиту выносится:

• Результаты исследования хроматографического разделения антипирина, изониазида и сульфадимезина в условиях обращено-фазной ВЭЖХ.

• Обоснование и подбор оптимальных условий высокочувствительного и избирательного определения антипирина в слюне, изониазида и сульфадимезина в моче методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектрировани-ем, способов пробоподготовки этих биологических субстратов при высокопроизводительных аналитических определениях тест-препаратов метаболизма.

• Результаты расчета и анализа фармакокинетических данных тест-препаратов метаболизма в биологических жидкостях организма человека и оптимизации критериев фенотипирования для экспрессной и точной оценки индивидуальной активности ферментных систем.

• Способы определения индивидуальной активности ферментных систем окисления и ацетилирования, основанных на биофармацевтическом анализе фармакокинетических параметров тест-препаратов метаболизма.

• Данные по фармакокинетике тест-препарата окисления антипирина при совместном приеме с иммуномодулятором ксимедоном и дозозависимые и временные параметры индуцирующего эффекта ксимедона на активность микросомальных оксидаз гепатоцитов.

• Данные по фармакокинетике тест-препаратов ацетилирования и окисления при стрептококковых ангинах, хроническом вирусном гепатите С и у больных рожей, а также способы химико-фармацевтической индукции активности этих метаболических систем ксимедоном.

• Закономерности соотношения активности N-ацетилтрансферазы и показателей неспецифической резистентности организма при гнойно-воспалительных заболеваниях.

Апробация работы. Результаты работы и основные положения диссертации были доложены и обсуждены на XIV и XV Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2007, 2008), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), II Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, 2007), V и VI Международных конференциях «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2005, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины» (С.-Петербург, 2006), VII Российском съезде «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней» (Нижний Новгород, 2006), XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), II Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008).

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 8 статей, 12 тезисов докладов и получен патент РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, заключения, указателя литературы, включающего 225 источников. Работа изложена на 171 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 рисунками, 36 таблицами, 3 схемами.

ВЫВОДЫ

1. Обоснованы и установлены рабочие условия высокочувствительного и избирательного анализа антипирина в слюне, изониазида и сульфадимезина в моче методом обращено-фазной ВЭЖХ со спектрофотометрическим детек-трированием, оптимизированы способы пробоподготовки этих биологических субстратов при высокопроизводительных аналитических определениях тест-препаратов метаболизма.

2. Разработаны методики биофармацевтического анализа активности микросомальных оксидаз и N-ацетилтрансферазы на основе оценки фармако-кинетических параметров антипирина в слюне за 12 часов, экскреции изониазида и сульфадимезина в моче за 6 часов методами ВЭЖХ и спектрофото-метрии, обосновано их использование для персонализации лекарственной терапии.

3. Впервые выявлено индукционное влияние ксимедона на активность микросомальных оксидаз печени человека по фармакокинетике антипирина при совместном приеме с иммуномодулятором ксимедоном. Установлены доза-зависимые схемы введения ксимедона человеку с целью получения максимального эффекта индукции процессов микросомального окисления.

4. Методами биофармацевтического анализа изучена фармакокинетика тест-препаратов ацетилирования и окисления при хроническим вирусном гепатите С, стрептококковых ангинах и у больных рожей. Выявлены пути химико-фармацевтической регуляции активности ферментов систем ацетилирования и окисления при этих заболеваниях лекарственным препаратом ксимедоном.

5. Проведена оценка соотношения активности N-ацетилтрансферазы и показателей неспецифической резистентности организма при гнойно-воспалительных заболеваниях челюстно-лицевой области и установлена прогностическая значимость сочетания медленного фенотипа ацетилирования и низкой резистентности организма в течении этих процессов и коррекции применения лекарственных средств.

146

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование разработанных методов биофармацевтического анализа позволяет значительно упростить процедуру оценки ферментативной активности метаболических систем ацетилирования и окисления, повысив чувствительность, селективность, надежность аналитических определений по сравнению с известными рутинными методами.

При этом важную практическую значимость приобретают методы биофармацевтического анализа, позволяющие с достаточной экономичностью без использования предварительной дериватизации определяемых компонентов проводить биофармацевтические исследования, снимая ряд ограничений, существовавших ранее.

Представленные результаты демонстрируют большое фармахимиче-ское значение изучения биотрансформации лекарственных средств на основе анаиза их фармакокинетических параметров.

Разработанные методики биофармацетического анализа биохимических фенотипов легко могут быть адаптированы к условиям клинических лабораторий, использованы для экспертизы новых JIC, выявления их индуцирующего или ингибирующего действия, прогнозирвания безопасности того или иного препарата, разработки индивидуальных режимов дозирования лекарств с учетом фенотипа, а также для оценки риска токсического воздействия и определения возможного фармакологическаго взаимодействия с другими препаратами на уровне биотрансформации.

Идея использования отечественного лекарственного прпарата ксимедона в качестве индуктора активности микросомальных оксидаз, получившая развитие в настоящем исследовании, оказалась перспективной. Нельзя не отметить при этом, что сочетание изученных свойств ксимедона с его способностью стимулировать иммунитет, регенеративные процессы, ацетилирова-ние делает возможным расширение показаний для клинического применения препарата в фармацевтической практике.

Таким образом, полученные результаты указывают на перспективность дальнейшего развития работы с использованием разработанных методик анализа биохимических фенотипов для исследования индивидуальных особенностей метаболизма JIC и индивидуальной коррекции проводимой фармакотерапии, что лежит в основе персонализированной медицины.

Предложенные в работе подходы и методические разработки имеют достаточно универсальный характер и с успехом могут быть использованы для проведения соответствующих аналитических определений при индивидуализации и коррекции применения лекарственных препаратов.

145