Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Биофармацевтический анализ генетически детерминированной ферментативной активности метаболических систем организма человека

На правах рукописи

ШИТОВА Наталья Сергеевна

БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИ ДЕТЕРМИНИРОВАННОЙ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ СИСТЕМ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА

15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Казань - 2005

Работа выполнена в Казанском государственном технологическом университете

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор Евгеньев Михаил Иванович

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук,

профессор Егорова Светлана Николаевна

доктор химических наук,

профессор Будников Герман Константинович

Ведущая организация: Всероссийский научный центр молекулярной

диагностики и лечения (г. Москва)

Защита состоится 23 декабря 2005 года в КЗ часов на заседании диссертационного совета Д 212.080.07 в Казанском государственном технологическом университете по адресу: 420029, Казань, ул. Сибирский тракт, 12, аудитория Д-414.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного технологического университета.

Автореферат разослан " 24 " НО^Л 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент -- Захаров В.М.

же-Г 2 16'357 б

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Для осуществления эффективного и безопасного применения лекарственных средств (ЛС) необходимо всестороннее изучение механизма качественных и количественных изменений лекарственных веществ (JIB) в биологических жидкостях организма человека, а также оценка влияния различных факторов на фармакокинетику JTIB при использовании современных методов биофармацевтического анализа.

Генетически детерминированные особенности организма могут существенно влиять на все этапы фармакокинетики и метаболизма лекарственного препарата. В связи с этим совершенствование применения лекарственных препаратов включает индивидуальную оптимизацию режимов их дозирования на основе комплексной оценки фармакокинетических параметров и особенностей биотрансформации, а также проведение терапевтического мониторинга лекарств. При этом для решения комплекса проблем^ связанных с разработкой новых методов биофармацевтического анализа JIB, весьма перспективным является использование фармакокинетических подходов для оценки генетически детерминированных процессов метаболизма лекарственных препаратов в организме человека.

Большинство J1C подвергается биотрансформации путем протекания окислительных процессов с участием генетически детерминированной ферментативной системы цитохромов Р450, а процессы метаболизма амино-содержащих ЛВ в организме катализируются ферментом N-ацетилтранс-феразой (NAT). В связи с этим особую значимость для биофармацевтических исследований приобретает изучение фармакокинетики ЛВ, являющихся тест-препаратами этих генетически детерминированных процессов. В тоже время биосуостраты являются сложными по составу матрицами, представляющими собой совокупность соединений различной природы.

Ряд факторов приводит к вариабельности фармакокинетических параметров ЛС. К ним можно отнести индукцию и репрессию ферментов биотрансформации, а также формирование определенных фенотипов под действием ряда патологических факторов. Эти факторы позволяют прогнозировать пути регулирования фенотипов ацетилирования и окисления для оптимизации дозирования ЛС на основе оценки индивидуальных фармакокинетических профилей, что существенно повысит эффективность и безопасность фармакотерапии различных заболеваний.

Цель работы состояла в разработке комплекса методов биофармацевтического анализа тест-препаратов генетически детерминированных ферментативных процессов ацетилирования и окисления в организме человека, а также оценке влияния различных факторов на фармакокинетику этих лекарственных веществ.

Диссертационная работа выполнялась при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 03-03-96241) и Академии наук Республики Татарстан (проекты 09-9.2-112/2003, -2004, 09-9.2-275/2005).

*В руководстве диссертационной работой принимал участие доктор химических наук, профессор Гармонов Сергей Юрьевич

РОС. НАЦИОНАЛ! 7я

библиотека

C.Qerepj

Научная новизна:

- на основании систематического исследования аналитических реакций тест-препаратов ацетилирования и окисления выявлены факторы повышения избирательности и чувствительности биофармацевтического анализа этих лекарственных веществ в биологических жидкостях организма человека;

- обоснованы и установлены условия аналитических определений в биофармацевтическом анализе гидразида изоникотиновой кислоты и антипирина, выработаны критерии выбора аналитических реагентов при дериватизации этих соединений;

- разработаны методы косвенного определения активности N-ацетилтран-сферазы и цитохромов Р450 путем изучения фармакокинетики гидразида изоникотиновой кислоты и антипирина в слюне и моче при использовании спек-трофотометрического детектирования их производных с аналитическими реагентами различных классов, также обосновано их использование для оптимизации фармакотерапии и в предиктивной медицине;

- впервые изучена фармакокинетика гидразида изоникотиновой кислоты при совместном приеме с иммуномодулятором ксимедоном, при этом выявлено индукционное влияние ксимедона на активность фермента N-ацетилтрансферазы;

- впервые установлены доза-зависимые и временные схемы введения ксимедона человеку с целью получения максимального эффекта индукции процессов ацетилирования;

- изучена фармакокинетика тест-препаратов ацетилирования и окисления при сахарном диабете 2 типа, у больных с хирургической инфекцией и ангинами, при этом установлены пути целенаправленного регулирования активности ферментов при этих патологических состояниях для оптимизации терапии;

- изучены закономерности соотношения фенотипов ацетилирования и окисления у здоровых людей, а также установлено достоверное повышение активности сывороточной холинэстеразы у сверхмедленных ацетиляторов по сравнению с другими типами ацетилирования.

Практическая значимость. Разработан комплекс методик установления фенотипов ацетилирования и окисления. Методы рекомендованы и апробированы в клинических условиях при оптимизации безопасной дозировки JIB, оценки риска интоксикации, побочных явлений при фармакотерапии.

Предложен новый индуктор NAT - отечественный иммуномодулятор ксимедон. Доза-зависимые и временные схемы введения ксимедона использованы в лечении сахарного диабета 2 типа (СД 2 типа), у больных с хирургической инфекцией и ангинами с целью получения оптимального лечебного эффекта.

Результаты работы используются для обеспечения медицинской защиты личного состава (Министерство обороны РФ) и внедрены в лечебную практику Республиканской клинической больницы Татарстана (Казань), Казанской городской инфекционной клинической больницы, поликлиники Казанского Научного Центра РАН. Экспериментальные результаты использованы в учебном процессе КГТУ в дисциплине "Контроль качества лекарственных препаратов".

На защиту выносится:

• Результаты исследования и подбор оптимальных условий спектрофото-метрического определения тест-маркеров ацетилирования и окисления с аналитическими реагентами различных классов.

• Методики биофармацевтического анализа гидразида изоникотиновой кислоты и антипирина в биологических жидкостях организма человека.

• Данные по фармакокинетике гидразида изоникотиновой кислоты и антипирина при их экскреции слюной и мочой в организме человека.

• Способы определения фенотипа ацетилирования и окисления при изучении фармакокинетики тест-препаратов гидразида изоникотиновой кислоты и антипирина в слюне и моче пациентов и результаты их применения в клинических условиях.

• Данные по фармакокинетике гидразида изоникотиновой кислоты при совместном приеме с иммуномодулятором ксимедоном и доза-зависимые и временные параметры индуцирующего эффекта ксимедона на активность Ы-ацетилтрансферазы.

• Данные по фармакокинетике тест-препаратов ацетилирования и окисления при сахарном диабете 2 типа, у больных с хирургической инфекцией и ангинами.

• Закономерности соотношения фенотипов ацетилирования и окисления у здоровых людей, а также активности сывороточной холинэстеразы у быстрых и медленных ацетиляторов.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), IV Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2004), II Всероссийском симпозиуме «Тест-методы химического анализа» (Саратов, 2004), II Международной научно-практической конференции «Экология: образование, наука, промышленность и здоровье» (Белгород, 2004), XII Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005), IV Терапевтическом форуме «Актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики наиболее распространенных заболеваний внутренних органов» (Тюмень, 2005), XIII Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005), VI Республиканской научной конференции «Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан» (Казань, 2005).

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 6 статей, 8 тезисов докладов и подана заявка на патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; литературного обзора; четырех глав экспериментальной части; выводов; заключения; списка используемой литературы. В приложении представлены акты использования результатов диссертационной работы.

Диссертация изложена на 154 страницах, содержит 27 рисунков, 35 таблиц, 6 схем, список использованной литературы включает 276 источников.

Выражаю благодарность к.м.н., доценту Погорельцеву В.И. за консультации по клинико-фармакологическим вопросам.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ,

Спектрофотометрические измерения проведены на спектрофотометре СФ-26. Кислотность растворов контролировали рН-милливольтметром MV-87S. В работе использована центрифуга К-23 (Janetszki).

В работе применялись субстанции и лекарственные формы фармакопейной чистоты.

Биологические жидкости получены у пациентов, клинических баз Казанского государственного медицинского университета и медсанчасти Казанского высшего артиллерийского командного училища. Фармакоки-нетические исследования проведены в группах контроля (120 вариабельно отобранных здоровых добровольцев при оценке активности NAT и 100 чел. в случае цитохромов Р450) и опытных группах (30 чел. с применением индукторов и репрессоров, 62 чел. с хирургической инфекцией гнойно-септического профиля, а также больные сахарным диабетом 2 типа в количестве 61 чел. и 85 больных с инфекционными ангинами).

Статистическая обработка проводилась с помощью компьютерных программ Origin 4.0 и Excel. Фармакокинетические параметры рассчитывались с помощью программ M-IND и Mathcad 11. Расчеты мольных долей и констант устойчивости проведены посредством программ EQ-V(V) и Stinger.

2. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕСТ-ПРЕПАРАТОВ ПРОЦЕССОВ АЦЕТИЛИРОВАНИЯ И ОКИСЛЕНИЯ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ

Для биофармацевтического анализа тест-препарата процессов ацетили-рования - ГИНК в моче была использована селективная хромогенная реакция получения производного этого ЛВ с метаванадатом аммония в качестве аналитического реагента.

При взаимодействии ГИНК с метаванадатом аммония в кислой среде образуется комплексное соединение красно-коричневого цвета. В зависимости от рН среды ванадаты в водных растворах могут существовать в виде различных ионов. В связи с этим изменение рН существенно влияет на устойчивость образованного комплекса. На рисунке 1 показаны спектры поглощения комплекса ГИНК с метаванадатом аммония при различных рН. Были установлены условия образования комплекса путем проведения реакции комплексообразования в различных интервалах рН. При смещении условий проведения реакции в более кислую область интенсивность поглощения увеличивается. При создании более щелочных значений рН среды, начиная от рН 6,86 максимум поглощения смещается в коротковолновую область. В связи с этим можно предположить, что состав комплекса в слабокислой, нейтральной и щелочной среде имеет различный состав. Методом изомолярных серий было установлено, что комплекс образуется в соотношении 1:1. По рассчитанным мольным долям присутствующих ионов в растворе можно заключить,

что при рН среды 2,2, создающейся в условиях проведения аналитической реакции, в растворе преимущественно существуют ионы У02+.

Возможность определения в ГИНК моче была оценена методом «введено - найдено» (табл. I) Полученные данные показывают, что при выбранных условиях детектирования комплекса ГИНК с метаванадатом аммония компоненты мочи не оказывают мешающего влияния на спектрофотометрические определения ЛВ.

Хорошо воспроизводимые зависимости оптической плотности от концентрации ГИНК в моче линейны для области концентраций 2-10"6 - 2-Ю"3 М:

А = 0,0533СХ (мкг/мл)+0,0007 (И2 = 0,9999) (1)

Предел обнаружения ГИНК при указанных условиях спектрофотометрического определения достигает 0,28 мкг/мл, что значительно ниже интервала фармакокинетических концентраций ЛВ.

Рис. 1 Устойчивость комплекса гидразида изоникотиновой кислоты с метаванадатом аммония при различных рН: 1 - 2,2; 2 - 4,5; 3 -6,86; 4-7,5

300

400

500

Л,нм 600

Таблица 1 Результаты спектрофотометрического определения изониазида в моче (п=4, р=0,95) __

Введено ГИНК, мкг/мл Найдено ГИНК, мкг/мл sr

1,37 1,3б±0,02 0,01

2,74 2,75±0,20 0,07

5,48 5,41±0,27 0,05

8,22 8,02±0,25 0,03

10,96 10,83±0,26 0,02

Реакция взаимодействия антипирина, применяемого в качестве тест-маркера процессов микросомального окисления ЛВ, с нитритом натрия в кислой среде широко используется при проведении антипиринового теста. Нами была оценена возможность определения антипирина и модернизирован ранее применяемый метод оценки активности окислительных ферментов.

Изучено, что максимум поглощения 4-нитрозоантипирина наблюдается при длине волны 350 нм, также была уменьшена доза тест-препарата до 0,6 г и сокращено время сбора образцов слюны до 12 часов.

А

'СН,

антипирин

ЫаЫ02

н2во,

о—

>-Сн,

I

С.н,

4-нитрозоантипирин

При выбранных условиях детектирования нитрозоантипирина компоненты слюны не оказывают мешающего влияния на спектрофотометрическое определение ЛВ. Возможность избирательного определения антипирина в слюне оценивали методом «введено - найдено» (табл. 2).

Таблица 2 Результаты спектрофотометрического определения

Введено, мкг/мл Найдено, мкг/мл

0,82 0,80±0,15 0,19

1,37 1,34±0,21 0,16

2,74 2,72±0,23 0,08

5,48 5,43±0,31 0,06

8,22 8,1510,25 0,03

10,96 10,87±0,40 0,04

Зависимости оптической плотности от концентрации антипирина в слюне линейны для области концентраций 5-10'5 -10'3 М:

А = 0,0187СХ (мкг/мл)+0,0052 (Я2 = 0,9991) (2)

Предел обнаружения антипирина при указанных условиях спектрофотометрического определения достигает 1,88 мкг/мл.

3. МЕТОДЫ БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА В ОЦЕНКЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ ДЕТЕРМИНИРОВАННОЙ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ

Процесс ацетилирования заключается в присоединении ацетильной группы к молекуле субстрата и катализируется ферментом ЫАТ при участии ко-фермента А. У разных категорий обследуемых наблюдались различные значения фармакокинетиических параметров экскреции тест-препаратов. Следовательно, оценка фармакокинетических параметров тест-препаратов может лежать в основе фенотипирования индивидов на группы «быстрых» и «медленных» метаболизаторов.

+ СНг-С— Б -КоА >Ы. /У-С-ЫН—ЫН + КоАвН

II ^сн3

^ 3 и

О о

При определении фенотипа ацетилирования изониазид однократно перо-рально принимался пациентом в дозе 0,45 г. Мочу собирали каждые два часа в течение 6 часов после приема тест-маркера. В почасовых пробах мочи определяли содержание ГИНК фотоколориметрическим или спектрофотометри-ческим методами. По полученным данным рассчитывали фармакокинети-ческие параметры (табл. 3), строли кинетические кривые (рис. 2), определяли фракцию дозы ГИНК и оценивали фенотип ацетилирования пациента. Как видно, фенотипировать обследуемых людей можно, пользуясь любым из представленных фармакокинетических параметров. Для быстрых ацетиля-торов характерны более низкие значения площади под фармакокинетической кривой, времени полувыведения ЛВ и более высокие значения константы элиминации, объема распределения, чем для медленных ацетиляторов. Кумулятивное количество экскретируемого с мочой ГИНК (фракция дозы), характерное для быстрых и медленных ацетиляторов, с учетом вероятности распределения представлено в таблице 4. Фармакокинетическая модель распределения ЛВ у пациентов после его перорального введения приведена на рисунке 3.

т, мг200

150 100 50

Рис. 2 Кривые кумулятивной экскреции ГИНК с мочой: 1 -быстрые ацетиляторы; 2 - медленные ацетиляторы

| I I I I 1 I I

0 1 2 3 4 5 6 7Т, час

Для системы ферментов цитохрома Р450 также характерен полиморфизм процессов метаболизма:

ПН (субстрат)+02 НАДФН+Н+->ЯОН(продукт)+Н20+НАДФ+

Распределение добровольцев контрольной группы по активности цитохромов Р450 при определении фенотипа окисления с помощью антипиринового теста показало наличие трех групп: быстрого (20%), среднего (44%) и медленного типа (36%) (табл. 5). Рассчитаны фар-макокинетические параметры экскреции антипирина со слюной (табл. 6).

Рис. 3 Фармакокинетическая модель распределения ЛВ у пациентов после его перорального введения. Камера «О» - область введения JIB в ЖКТ; камера «1» - тест-ткань; Dp0- доза препарата; к,- константа скорости накопления препарата в тест-ткани; к<.| - константа элиминации препарата; т - задержка по времени

Таблица 3 Кинетические параметры выведения изониазида с мочой при пероральном приеме 0,45 г лекарственного вещества (достоверность различия между показателями быстрого и медленного ацетилирования Р < 0,001)_

Фенотип ацетилирования Площадь под фармакокине-тической кривой (AUC), мкг ч/мл Константа элиминации (К.0.Ч1 Время полувыведения (Т1в),ч Объем распределения (Vd), мл

Быстрый 21630±2300 0,554610,0580 1,35±0,18 41,7±4,5

Медленный 77590±14220 0,2298±0,Ю00 3,97±0,25 32,2±3,4

Таблица 4 Критерии для определения индивидуальной активности N-ацетилтрансферазы (п=120)__

Тип ацетилирования Активность N-ацетил-трансферазы (фракция дозы ГИНК, %) Вероятность распределения

Быстрый 3,1210,25 Р<0,001

Медленный 9,4011,37

Таблица 5 Критерии для определения индивидуальной активности ферментов системы цитохрома Р450 (п=39)

Фенотип окисления Количество антипирина, выведенного со слюной за 12 часов, мкг Вероятность распределения

Быстрый 2,8411,80 PcO.OOl

Средний 10,6910,83

Медленный 24,2513,19 Р<0,001

Область введения

Таблица 6 Фармакокинетические параметры антипирина по результатам измерения его концентрации в слюне при введении per os в дозе 0,6 г_

Параметр, размерность Фармакокинетические параметры

Здоровые (п = 39) Больные с СД 2 типа (п=27)

Быстрые Средние Медленные Средние Медленные

Константа скорости элиминации препарата, к^, час'1 0,3460 0,1140 0,1610 0,3280 0,1050

Константа скорости накопления препарата в крови, ка, час"1 0,6220 1,4220 0,9510 0,5340 0,5540

Объем распределения, Ул. л 179,9 101,1 44,9 58,4 45,1

Максимальная концентрации антипирина в слюне, Си„, мкг/мл 1,60 4,77 9,31 4,73 9,03

Время достижения максимума концентрации антипирина в слюне, Ти„„ час 4,72 4,18 4,75 3,72 4,76

Период полуэлиминации препарата, Т\п, час 2,00 6,11 4,32 2,12 6,62

Клиренс, СЬ, мл/час мл/мин 62294 1038 11468 191 7208 120 19129 319 4723 79

Среднее время пребывания, МЯТ, час 7,10 11,77 9,78 6,27 12,40

Среднее время накопления препарата, МАТ, час 4,20 2,96 3,55 3,22 2,85

Среднее время прохождения препарата, МТТ, час 2,90 8,81 6,23 3,05 9,55

Площадь под кривой «кон-центрация-время»,А11С, мкг-час/мл 9,63 52,32 83,24 31,37 127,05

4. БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННОЙ

РЕГУЛЯЦИИ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ И ЕЕ ОЦЕНКА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ

Было обнаружено, что иммуномодулятор ксимедон, проявляющий иммуностимулирующий или иммунодепрессантный эффект в зависимости от дозы препарата, является активатором NAT. Экспериментальные данные свидетельствуют, что в отношении эффекта индукции возможны два механизма действия: субстратзависимый и субстратнезависимый (тригтерный). Так, например, у быстрых ацетиляторов значения индукции при дозировании препарата по 1 и 2 г в сутки практически одинаковы. Это связано с тем, что регистрация индукции при суточной дозе 2 г осуществлялась через 1 сутки после приема препарата. По всей видимости, суточная доза ксимедона, равная 1 г, является «пороговой» для проявления ксимедоном субстратзависимого

механизма действия (чем больше доза, тем выше эффект). Однако при дальнейшем уменьшении дозы наблюдается увеличение показателей индукционного процесса, которое невозможно объяснить с позиций субст-ратзависимого механизма, что позволяет предположить пусковой (субстрат-независимый) механизм действия. Ведь известно, что высокие концентрации субстрата начинают тормозить вызываемую этим же субстратом биохимическую реакцию. Подобные изменения интервала доз были зафиксированы и в случае медленных ацетиляторов с той лишь разницей, что «порог» пусковой дозы сдвинут в сторону уменьшения ее значений. Это связано с тем, что в случае медленной активности NAT дольше сохраняется высокая концентрация препарата (табл. 7). Фармакокинетические параметры для быстрых и медленных ацетиляторов были рассчитаны по концентрации ГИНК, экскретируемого с мочой как при приеме индуктора в различных дозах, так и без него (табл. 8). Найден максимальный интервал сохранения индукции ксимедоном и по полученным результатам рассчитаны фармакокинетические параметры ГИНК при индукции ацетилирования (табл. 9,10). Кроме того, в рамках данной работы было установлена возможность возникновения индукции при приеме иммуномодулятора ксимедона одновременно с тест-маркером ГИНК и через 30 мин после введения последнего. Данное наблюдение подтверждает предположение о триггерном характере воздействия ксимедона на ферментный комплекс и дает возможность использовать это свойство не только для профилактики различных интоксикаций (в том числе и эндогенного происхождения), но и для лечения отравлений, когда с момента принятия токсиканта прошло значительное время.

Для сравнения активаторов N-ацетилирования проверялось влияние на фармакокинетику ГИНК известных индукторов пантотената кальция и пири-доксина гидрохлорида (табл. 11). Индуцирующий эффект этих активаторов сопоставим с индукцией ксимедоном на процессы ацетилирования. Следует отметить, что при приеме пантетената кальция и пиридоксина гидрохлорида величина индукции пропорциональна дозе индуктора.

Таблица 7 Индукция N-ацетилтрансферазы в зависимости от дозы и частоты приему ксимедона_

Фенотип ацетилирования Индукция N-ацетилтрансферазы в зависимости от дозы и частоты приема ксимедона, %

0,5г 4 раза вдень 0,5г 4 раза в день, 3 дня 0,5г 4 раза в день, исследование через сутки 0,25г 4 раза в день 0,25г 2 раза в день 0,125г 2 раза в день 0,0625г 2 раза в день

Быстрый 33±8 39±12 13±5 12±3 32±9 30±10 23±8

Медленный 13±2 15±6 48±15 25±4 53±10 51±16 83 ±9

Таблица 8 Фармакокинетические параметры изониазида при индукции

процесса ацетилирования ксимедоном

Доза ксимедона Фенотип ацетилирования Площадь под фармако-кинетической кривой (AUC), мкг-ч/мл Константа элиминации Время полувыве-цения (Т|/2), ч Объем распределения (Vd), мл

Без приема ксимедона Быстрый 2163012300 0,554610,0580 1,3510,18 41,714,5

Медленный 77590±14220 0,229810,0740 3,9710,25 32,213,4

0,5г четыре раза в день Быстрый 21960±4470 0,338010,1350 2,5010,98 78,8136,9

Медленный 122220±16940 0,307810,0803 5,0411,20 29,219,0

0,5г 4 раза в день, Здня Быстрый 18090±3250 0,569810,0702 2,5210,25 404,0142,0

Медленный 62290±9670 0,255910,0190 4,0910,95 53,8111,2

0,5г 4 раза в день, исследование через сутки Быстрый 11770±2130 0,221710,0150 2,2210,47 102,0126,0

Медленный 32480±2450 0,343410,0580 16,1012,30 214,0128,0

0,25г 2 раза вдень Быстрый 18100±1360 0,502110,0260 1,5210,68 117,0132,0

Медленный 44670±5360 0,159410,0304 4,3511,23 63,3120,3

0,125г 2 раза в день Быстрый 29960±2150 0,150510,0580 1,6410,94 149,0136,0

Медленный 59720±6230 0,288010,0250 3,8711,07 38,419,6

0,0625г 2 раза в день Быстрый 32410±1150 0,329710,0501 3,1211,46 93,5115,3

Медленный 36600±1250 0,646110,0240 1,0711,32 19,018,2

Таблица 9 Динамика индукции в зависимости от времени приема разовой дозы ксимедона 1 г и типа ацетилирования_

Тип ацетилирования Индукция ^ацетилтрансферазы в зависимости от интервала времени от принятия индуктора до начала регистрации индукции, %

20 ч 16ч 12 ч 8ч 4ч

Быстрый Нет индукции 1513 19±1 20±2 33+5

Медленный Нет индукции 2312 30±5 34±7 49±6

Обнаружена также способность лекарственного препарата димефосфона увеличивать активность NAT (индукция при суточной дозе 4,5 - 6 г составила 34±10 % - для быстрых ацетиляторов, 32±9 % - для медленных). Ранитидин является известным репрессором фермента NAT. Была рассмотрена его способность снижать активность данного фермента, а также анализировалась активность ХЭ на фоне приема ранитидина. По полученным

экспериментальным данным лицам с низкой активностью NAT характерна повышенная активность ХЭ (табл. 12, 13, рис. 4).

Целенаправленно уменьшая активность NAT с помощью приема рани-тидина, была установлена обратная связь между процессом ацетилирования и холинэстеразной активностью. Активность ХЭ определялась до и после приема ранитидина. Достоверных результатов не наблюдалось, но ясно видна тенденция к увеличению активности ХЭ в группе обследуемых, принимающих ранитидин.

Рассчитаны данные по фармакокинетике тест-препаратов ацетилирования и окисления при СД 2 типа (табл. 3), у больных с хирургической инфекцией и ангинами. По полученным экспериментальным данным быстрый тип ацетилирования является преобладающим при СД 2 типа (рис. 5,6). При определении активности цитохромов Р450 в этой группе больных наблюдалось распределение лишь на две статистически значимо различающиеся группы: средний и медленный фенотип окисления (рис. 7,8).

Таблица Ю Фармакокинетические параметры изониазида при приеме 1г ксимедона per os за промежуток времени от 20 до 4 часов до введения тест-маркера_____

Промежуток времени от принятия индуктора до начала анализа Фенотип ацетилирования Площадь под фарма-кокинетичес-кой кривой (AUC), мкгч/мл Константа элиминации (М. ч"' Время полувыведения (Т1/2),ч Объем распределения (Vd), мл

Без ксимедона Быстрый 19380±3060 0,664910,2505 0,9610,81 28,4119,9

Медленный 61190±9740 0,424810,0853 1,71Ю,35 19,416,7

20 ч Быстрый 24700±470 0,239510,0490 1,3210,47 80,3116,9

Медленный 83950±9420 0,391610,250 3,3312,12 24,1112,7

16 ч Быстрый 174501700 0,547310,100 1,3210,05 50,1112,8

Медленный 67890+5710 0,241010,0740 3,7811,73 38,1119,5

12 ч Быстрый 1720011970 0,4132Ю,0055 1,6810,01 64,216,4

Медленный 119830120100 0,096710,0015 7,1710,07 47,513,8

8ч Быстрый 1846014450 0,289110,0133 2,4010,07 91,6124,4

Медленный 4593017670 0,253110,2105 17,6911,50 38,0118,4

4ч Быстрый 114501350 0,475910,0041 1,4610,01 82,713,2

Медленный 2603016620 0,261910,005 2,6510,07 5,112,7

Таблица 11 Индукция М-ацетилтрансферазы в зависимости от дозы

индукторов ацетилирования

Фенотип ацетилирования Индукция М-ацетилтрансферазы в зависимости от дозы активатора, %

Пантотенат кальция Пиридоксина гидрохлорид

Доза 0,75 г Доза 0,5 г Доза 0,04 г Доза 0,02 Доза 0,01 г

Быстрый 44±9 21±6 20±6 13+3 Нет индукцш

Медленный 16±2 Нет индукции 43±6 37±3 34±2

Активность ХЭ, Мкмоль АХТБ' ^^ин. мл. сыворотки

2000

1000

О I

о

в>

СО (М

быстрый медленный сверхмедленный

Рис. 4 Зависимость активности холинэс-теразы от фенотипа ацетилирования * АХТБ - ацетип-холинтиобромид

тип ацетилирования

Рис. 5 Полиморфизм ацетилирования у здоровых добровольцев (п= 110): 1 -быстрые 50%, 2 - медленные 50%

Рис. 6 Полиморфизм ацетилирования при сахарном диабете 2 типа (п = о1): 1 - быстрые 63%, 2 - медленные 38%

Рис. 7 Полиморфизм окисления у Рис. 8 Полиморфизм окисления у

здоровых лиц (п = 39): 1 - быстрые больных при сахарном диабете 2

21 %, 2 - средние 44%, 3 - типа (п = 27): 1 - средние 22%, 2 -

медленные 36% медленные 78%

Таблица 12 Активность холинэстеразы в группах быстрых, медленных и сверхмедленных ацетиляторов (п=120)_

Тип ацетилирования Активность фермента

N-ацетилт-рансфераза (фракция дозы ГИНК, %) Вероятность распределения, Р Холинэстераза, мкмоль АТХБ*/мл. мин. сыворотки Вероятность распределения, Р

Быстрый 3,12±0,25 Р<0,001 Р<0,01 > 1618±68 Р<0,05 Р<0,05

Медленный 9,40±1,37 1701±114

Сверхмедленный 15,95±1,34 2043±69

*АХТБ - ацетилхолинтиобромид

У хирургических больных гнойно-септического профиля представляет интерес применение ксимедона, который вызывает сокращение сроков заживления ран и ожогов, при этом выявлено его эффективное модулирующее действие на иммунную систему и индуцирующий эффект на систему ацетилирования. После первичного приема ксимедона исследовалась индукция, которая проявилась у медленных ацетиляторов и фактически отсутствовала у быстрых ацетиляторов. Отсутствие индукции сохранялось у всех быстрых ацетиляторов к концу лечения (табл. 14). У медленных ацетиляторов индукция к концу лечения сохранялась, что привело к типизации многих медленных ацетиляторов в быстрые. Рассчитаны фар-макокинетические параметры экскреции изониазида с мочой для медленных и быстрых ацетиляторов до приема ксимедона при однодневном приеме ксимедона в дозе 125 мг 2 раза в день и при курсовом приеме ксимедона в аналогичной дозе (табл. 15,16). Это позволяет достигать оптимального эффекта при проведения фармакотерапии.

Таблица 13 Фармакокинетические параметры ГИНК и активность холинэстеразы при курсовом приеме ранитидина (суточная доза 510 мг) в течение 5 дней (п = 13)_* __

№ Фармакокинетический параметр До приема ранитидина После приема ранитидина

1 Фракция дозы ГИНК, % 3,52±1,88 11,41±7,92

2 Площадь под фармакокинетической кривой (AUC), мкгч/мл 17570±10940 29180±13430

3 Константа элиминации (Kei), ч"1 0,4290±0,3780 0,5580±0,2520

4 Время полувыведения (Тщ), ч 2,047±0,570 2,209±0,240

5 Среднее время пребывания (MRT), ч 4,37±1,27 4,19±0,72

6 Активность ХЭ 1756±539 1993±595

Таблица 14 Индукция N-ацетилтрансферазы при применении ксимедона

Тип ацетили-рования Фракция дозы ГИНК до приема ксимедона, % Прием ксимедона по 125мг 2раза в день в течение 1 дня Курс лечения ксимедоном

Фракция дозы ГИНК, % Индукция, % Фракция дозы ГИНК, % Индукция, %

Быстрый 4,8±0,8 5,5±0,7 нет 5,3±0,1 нет

Медленный 13,5±1,5 8,6±1,3 37,7±6,1 9,2±0,9 27,4±9,8

Таблица 15 Фармакокинетические параметры для медленных ацетиляторов____

Прием ксимедона Площадь под фармакокинетической кривой (AUC), мкг-ч/мл Константа элиминации (Ке,)^ Время полувыве-цения (Т,/2), ч Объем распределения (Vd), мл

Отсутствует 98500±14200 0,2161 ±0,0160 3,88+0,95 38,913,4

1 день 4647015380 0,446410,0260 2,0610,78 32,212,4

Курс лечения 63210±9670 0,183110,0580 4,9810,98 90,5111,2

Таблица 16 Фармакокинетические параметры для быстрых ацетиляторов

Прием ксимедона Площадь под фармакокинетической кривой (AUC), мкгч/м Константа элиминации (Ке,)^ Время полувыведения (Т1/2),ч Объем распределения (Vd), мл

Отсутствует 1849012300 0,663810,0140 1,1810,68 121,7126,2

1 день 1984013240 0,541110,0700 1,4610,56 79,619,5

Курс лечения 2272012450 0,854210,0560 0,8210,09 23,112,5

Обнаружены закономерности соотношения фенотипов ацетилирования и окисления (табл. 17) у здоровых людей. Весьма интересна с химико-фармацевтической точки зрения выявленная взаимосвязь между способностью быстрых ацетиляторов медленно окислять лекарственные препараты и, наоборот - медленных ацетиляторов быстро окислять лекарства.

Таблица 17 Активность Ы-ацетилтрансферазы в группах медленных, средних и быстрых фенотипов окисления (здоровые добровольцы, п = 39)

Фенотип окисления Количество антипирина, выведенного за 12 часов, мкг Вероятность распределения Активность N- ацетил-трансферазы (фракция дозы ГИНК, %) Вероятность распределения

Быстрый 3,59±1,49 Р<0,001 Р<0,01 8,60±1,23 Не достоверно Р<0,05

Средний 10,62±3,09 6,20±2,34

Медленный 25,47±9,75 3,50±1,21

Как видно из экспериментальных данных медленному типу окисления соответствует быстрый тип ацетилирования, а быстрому типу окисления -медленный тип ацетилирования, причем среднему типу окисления характерно распределение как в сторону высоких активностей NAT, так и в сторону низких.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены факторы повышения избирательности и чувствительности биофармацевтического анализа тест-препаратов генетически детерминированных процессов ацетилирования и окисления в биологических жидкостях организма человека. Обоснованы и установлены условия аналитических определений в биофармацевтическом анализе гидразида изоникотиновой кислоты и антипирина, выработаны критерии выбора аналитических реагентов при дериватизации этих лекарственных веществ в биологических жидкостях и использовании спектрофотометрического детектирования.

2. Разработаны методы косвенного определения активности N-ацетил-трансферазы и цитохромов Р450 путем изучения фармакокинетики гидразида изоникотиновой кислоты и антипирина в слюне и моче при использовании спектрофотометрического детектирования их производных с аналитическими реагентами различных классов. Обосновано использование методов биофармацевтического анализа для оптимизации фармакотерапии и в предик-тивной медицине.

3. Впервые изучена фармакокинетика гидразида изоникотиновой кислоты при совместном приеме с иммуномодулятором ксимедоном, при этом выявлено индукционное влияние ксимедона на активность фермента N-ацетил-трансферазы. Установлены дозазависимые и временные схемы введения

ксимедона человеку с целью получения максимального эффекта индукции процессов ацетилирования.

4. Установлены фармакокинетические параметры тест-препаратов ацетилирования и окисления при сахарном диабете 2 типа, у больных с хирургической инфекцией и ангинами. Выявлены пути целенаправленного регулирования активности ферментов при этих патологических состояниях для оптимизации применения лекарственных средств.

5. Проведена оценка соотношения фенотипов ацетилирования и окисления у здоровых людей, а также установлено достоверное повышение активности сывороточной холинэстеразы у сверхмедленных ацетиляторов по сравнению с другими типами ацетилирования.

Основное содержание диссертации изложено в публикациях:

1. Евгеньев М.И. Неинвазивные методы определения фенотипа ацетилирования / М.И. Евгеньев, С.Ю. Гармонов, Р.Г. Гисмятов, Н.С. Шитова, И.Е. Зыкова // Вопросы биол., мед. и фармацевт, химии. - 2003. - №3. - С. 34 - 39.

2. Евгеньев М.И. Биофармацевтический анализ ферментативной активности метаболических систем организма / М.И. Евгеньев, С.Ю. Гармонов, Н.С. Шитова, В.И. Погорельцев // Вестник Казанского технологического университета. - 2004. - № 1-2. - С. 74 - 81.

3. Погорельцев В.И. Влияние полиморфизма ацетилирования на течение хирургической инфекции и ее фармакологическая коррекция / В.И. Погорельцев, В.Ю. Терещенко, С.Ю. Гармонов, Т.А. Кисилева, Н.С. Шитова, М.И. Евгеньев // Практическая медицина. - 2004. - № 4 (9). - С. 28 - 30.

4. Евгеньев М.И. Оценка активности ферментных систем для обеспечения экологической безопасности при работе с токсикантами // М.И. Евгеньев, С.Ю. Гармонов, Н.С. Шитова, В.И. Погорельцев // Вестник Белгородского ГТУ им. В.Г. Шухова. - 2004. - № 8. - 4.2. - С. 53 - 55.

5. Гармонов С.Ю. Оценка активости холинэстеразы у быстрых и медленных ацетиляторов / С.Ю. Гармонов, В.И. Погорельцев, Н.С. Шитова, И.Е. Зыкова, М.И. Евгеньев // Вопросы биол., мед. и фармацевт, химии. - 2005. - № 3. - С. 27-30.

6. Гармонов С.Ю. Оценка фенотипов ацетилирования и окисления у больных сахарным диабетом 2 типа // С.Ю. Гармонов, Т.А. Киселева, И.Г. Салихов, М.И. Евгеньев, Н.С. Шитова, О.В. Полехина, В.И. Погорельцев // Нижегородский медицинский журнал. - 2005. - № 3. - С. 29 - 35.

7. Гармонов С.Ю. Аналитические методы исследования генетически детерминированных процессов биотрансформации / С.Ю. Гармонов, В.И. Погорельцев, Н.С. Шитова, И.Е. Зыкова, М.И. Евгеньев // Тез. докл. I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». -М„ 2004.-С. 51-52.

8. Евгеньев М.И. Аналитические технологии для исследования биохимических процессов организма человека на основе фармакогенетических тестов / М.И. Евгеньев, С.Ю. Гармонов, Н.С. Шитова, В.И. Погорельцев // Тез. докл. II Всерос. симп. «Тест-методы хим. анализа». -Саратов: Научная книга, 2004. - 86с.

»25 4 93

9. Погорельцев В.И. Применение кс генетического полиморфизма и индр Погорельцев, С.Ю. Гармонов, Н.С. 1Ш Тез. докл. IV Международной конфе] лекарственных средств». - М., 2004. - С.

10. Киселева Т.А. Генетически детермин изониазида у больных сахарным диаб< Гармонов, Н.С. Шитова, И.Г. Сапихо Международной конференции «Клини1 средств». - М., 2004. - С. 84 - 85.

11. Киселева Т.А. Факторы, влияющие на цгсншииы ацечилиривания и окисления у больных сахарным диабетом 2 типа / Т.А. Киселева, С.Ю. Гармонов, В.И. Погорельцев, Н.С. Шитова, М.И. Евгеньев, И.Г. Салихов // Материалы IV Терапевтического форума «Актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики наиболее распространенных заболеваний внутренних органов». - Тюмень, 2005. - С. 33.

12. Гармонов С.Ю. Аналитические методы исследования генетически детерминированной ферментативной активности / С.Ю. Гармонов, В.И. Погорельцев, Т.А. Киселева, Н.С. Шитова, А.Р. Ахметова, М.И. Евгеньев // Материалы XIII международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение». - Казань, 2005. - С. 21 -22.

13. Киселева Т.А. Индивидуализация терапии сахарного диабета 2 типа на основе фенотипов ацетилирования и окисления / Т.А. Киселева, С.Ю. Гармонов, В.И. Погорельцев, Н.С. Шитова, М.И. Евгеньев, И.Г. Салихов // Тез. докл. XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». -М„ 2005. - С. 408.

14. Гармонов С.Ю. Оценка генетически детерминированных систем метаболизма организма человека для обеспечения экологической безопасности / С.Ю. Гармонов, Н.С. Шитова, JI.A. Зайнутдинов, В.И. Погорельцев, М.И. Евгеньев // Тез. докл. VI Респ. научной конф. «Актуальные экологические проблемы РТ». Казань, 2004. С. 56-57.

15. Заявка 2005124656 РФ, МПК7 С 12 N 9/10 Способ увеличения активности фермента N-ацетилтрансферазы у человека / B.C. Резник, В.И. Погорельцев, С.Ю. Гармонов, Н.С. Шитова, Т.А. Киселева - приоритет 02.08.2005. - 11 с.

Соискатель Н.С. Шитова

Заказ _Тираж 100 экз.

Офсетная лаборатория Казанского государственного технологического университета 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, 68

РНБ Русский фонд

2006-4 29863

Актуальность темы. Для осуществления эффективного и безопасного применения лекарственных средств (JIC) необходимо всестороннее изучение механизма качественных и количественных изменений лекарственных веществ (JIB) в биологических жидкостях организма человека, а также оценка влияния различных факторов на фармакокинетику JIB при использовании современных методов биофармацевтического анализа.*

Генетически детерминированные особенности организма могут существенно влиять на все этапы фармакокинетики и метаболизма лекарственного препарата. В связи с этим совершенствование применения лекарственных препаратов включает индивидуальную оптимизацию режимов их дозирования на основе комплексной оценки фармакокинетических параметров и особенностей биотрансформации, а также проведение терапевтического мониторинга лекарств. При этом для решения комплекса проблем, связанных с разработкой новых методов биофармацевтического анализа ЛВ, весьма перспективным является использование фармакокинетических подходов для оценки генетически детерминированных процессов метаболизма лекарственных препаратов в организме человека.

Большинство JIC подвергается биотрансформации путем протекания окислительных процессов с участием генетически детерминированной ферментативной системы цитохромов Р450, а процессы метаболизма аминосо-держащих ЛВ в организме катализируются ферментом N-ацетилтрансфе-разой (NAT). В связи с этим особую значимость для биофармацевтических исследований приобретает изучение фармакокинетики ЛВ, являющихся тест-препаратами этих генетически детерминированных процессов. В тоже время биосубстраты являются сложными по составу матрицами, представляющими В руководстве диссертационной работой принимал участие доктор химических наук, член-корреспондент РАЕН, профессор Гармонов Сергей Юрьевич собой совокупность соединений различной природы.

Ряд факторов приводит к вариабельности фармакокинетических параметров JIC. К ним можно отнести индукцию и репрессию ферментов биотрансформации, а также формирование определенных фенотипов под действием ряда патологических факторов. Эти факторы позволяют прогнозировать пути регулирования фенотипов ацетилирования и окисления для оптимизации дозирования JIC на основе оценки индивидуальных фармакокинетических профилей, что существенно повысит эффективность и безопасность фармакотерапии различных заболеваний.

Цель работы состояла в разработке комплекса методов биофармацевтического анализа тест-препаратов генетически детерминированных ферментативных процессов ацетилирования и окисления в организме человека, а также оценке влияния различных факторов на фармакокинетику этих лекарственных веществ.

Диссертационная работа выполнялась при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 03-03-96241) и Академии наук Республики Татарстан (проекты 09-9.2-112/2003, 09-9.2-112/2004, 099.2-275/2005).

Научная новизна:

- на основании систематического исследования аналитических реакций тест-препаратов ацетилирования и окисления выявлены факторы повышения избирательности и чувствительности биофармацевтического анализа этих лекарственных веществ в биологических жидкостях организма человека;

- обоснованы и установлены условия аналитических определений в биофармацевтическом анализе гидразида изоникотиновой кислоты и антипирина, выработаны критерии выбора аналитических реагентов при дериватизации этих соединений;

- разработаны методы косвенного определения активности N-ацетилтрансферазы и цитохромов Р450 путем изучения фармакокинетики гидразида изоникотиновой кислоты и антипирина в слюне и моче при использовании спектрофотометрического детектирования их производных с аналитическими реагентами, также обосновано их использование для оптимизации фармакотерапии и в предиктивной медицине;

- впервые изучена фармакокинетика гидразида изоникотиновой кислоты при совместном приеме с иммуномодулятором ксимедоном, при этом выявлено индукционное влияние ксимедона на активность фермента N-ацетилтрансферазы;

- впервые установлены доза-зависимые и временные схемы введения ксимедона человеку с целью получения максимального эффекта индукции процессов ацетилирования;

- изучена фармакокинетика тест-препаратов ацетилирования и окисления при сахарном диабете 2 типа, у больных с хирургической инфекцией и ангинами, при этом установлены пути целенаправленного регулирования активности ферментов при этих патологических состояниях для оптимизации терапии;

- изучены закономерности соотношения фенотипов ацетилирования и окисления у здоровых людей, а также установлено достоверное повышение активности сывороточной холинэстеразы у сверхмедленных ацетиляторов по сравнению с другими типами ацетилирования.

Практическая значимость. Разработан комплекс методик установления фенотипа ацетилирования на основе спектрофотометрического определения содержания свободного гидразида изоникотиновой кислоты при экскреции с мочой из организма человека. Разработаны методики чувствительного и избирательного спектрофотометрического определения антипирина в слюне человека. Методы рекомендованы и апробированы в клинических условиях при оптимизации безопасной дозировки JIB, оценки риска интоксикации, побочных явлений при фармакотерапии.

Предложен новый индуктор NAT - отечественный иммуномодулятор ксимедон. Доза-зависимые и временные схемы введения ксимедона использованы в лечении сахарного диабета 2 типа, у больных с хирургической инфекцией и ангинами с целью получения оптимального лечебного эффекта.

Результаты работы используются в фармакокинетических исследованиях (Казанский государственный медицинский университет), для обеспечения медицинской защиты личного состава (Министерство обороны РФ) и внедрены в лечебную практику Республиканской клинической больницы Татарстана (Казань), Казанской городской инфекционной клинической больницы, поликлиники Казанского Научного Центра Российской академии наук.

Экспериментальные результаты и выводы на их основе использованы в учебном процессе Казанского государственного технологического университета в дисциплине "Контроль качества лекарственных препаратов".

На защиту выносится:

• Результаты исследования и подбор оптимальных условий спектрофото-метрического определения тест-маркеров ацетилирования и окисления с аналитическими реагентами.

• Методики биофармацевтического анализа гидразида изоникотиновой кислоты и антипирина в биологических жидкостях организма человека.

• Данные по фармакокинетике гидразида изоникотиновой кислоты и антипирина при их экскреции слюной и мочой в организме человека.

• Способы определения фенотипа ацетилирования и окисления при изучении фармакокинетики тест-препаратов гидразида изоникотиновой кислоты и антипирина в слюне и моче пациентов и результаты их применения в клинических условиях.

• Данные по фармакокинетике гидразида изоникотиновой кислоты при совместном приеме с иммуномодулятором ксимедоном и доза-зависимые и временные параметры индуцирующего эффекта ксимедона на активность N-ацетилтрансферазы.

• Данные по фармакокинетике тест-препаратов ацетилирования и окисления при сахарном диабете 2 типа, у больных с хирургической инфекцией и ангинами.

• Закономерности соотношения фенотипов ацетилирования и окисления у здоровых людей, а также активности сывороточной холинэстеразы у быстрых и медленных ацетиляторов.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), IV Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2004), II Всероссийском симпозиуме «Тест-методы химического анализа» (Саратов, 2004), II Международной научно-практической конференции «Экология: образование, наука, промышленность и здоровье» (Белгород, 2004), XII Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005), IV Терапевтическом форуме «Актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики наиболее распространенных заболеваний внутренних органов» (Тюмень, 2005), XIII Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005), VI Республиканской научной конференции «Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан» (Казань, 2005).

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 6 статей, 8 тезисов докладов и подана заявка на патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; литературного обзора; четырех глав экспериментальной части, в которых описана аппаратура, объекты, техника эксперимента и изложены результаты с их обсуждением; выводов; заключения; списка используемой литературы. В приложении представлены акты использования результатов диссертационной работы.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены факторы повышения избирательности и чувствительности биофармацевтического анализа тест-препаратов генетически детерминированных процессов ацетилирования и окисления в биологических жидкостях организма человека. Обоснованы и установлены условия аналитических определений в биофармацевтическом анализе гидразида изоникотиновой кислоты и антипирина, выработаны критерии выбора аналитических реагентов при дериватизации этих лекарственных веществ в биологических жидкостях и использовании спектрофотометрического детектирования.

2. Разработаны методы косвенного определения активности N-ацетил-трансферазы и цитохромов Р450 путем изучения фармакокинетики гидразида изоникотиновой кислоты и антипирина в слюне и моче при использовании спектрофотометрического детектирования их производных с аналитическими реагентами различных классов. Обосновано использование методов биофармацевтического анализа для оптимизации фармакотерапии и в предиктивной медицине.

3. Впервые изучена фармакокинетика гидразида изоникотиновой кислоты при совместном приеме с иммуномодулятором ксимедоном, при этом выявлено индукционное влияние ксимедона на активность N-ацетилтрансферазы. Установлены доза-зависимые и временные схемы введения ксимедона человеку с целью получения максимального эффекта индукции процессов ацетилирования.

4. Устанвлены фармакокинетические параметры тест-препаратов ацетилирования и окисления при сахарном диабете 2 типа, у больных с хирургической инфекцией и ангинами. Выявлены пути целенаправленного регулирования активности ферментов при этих патологических состояниях для оптимизации применения лекарственных средств.

5. Проведена оценка соотношения фенотипов ацетилирования и окисления у здоровых людей, а также установлено достоверное повышение активности сывороточной холинэстеразы у сверхмедленных ацетиляторов по сравнению с другими типами ацетилирования.

124

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Приведенные результаты, таким образом, показывают высокую эффективность использования косвенных методов определения ферментативной активности генетически детерминированных метаболических систем в биофармацевтических исследованиях лекарственных веществ. Важную роль играют с точки зрения чувствительности и селективности биофармацевтического анализа лекарственных веществ в биологических жидкостях организма человека реакции получения производных определяемых компонентов. Они расширяют возможности использования различных реакций дериватизации в биофармацевтическом анализе за счет усиления хромофорных и других свойств аналита.

Вариации методов оценки тест-препаратов ацетилирования и окисления, а также сывороточной холинэстеразы позволяют регулировать соотношение информативности и экономичности при биофармацевтическом анализе лекарственных веществ в матрице сложного состава.

Разработанный комплекс неинвазивных, доступных для практики методов оценки фенотипа ацетилирования и окисления может быть легко адаптирован к клиническим условиям и использован для разработки индивидуальных схем дозирования лекарств, ранней досимптоматической диагностики заболеваний, оценки риска побочных эффектов. При этом предложенные методы оценки биохимического фенотипа существенно дополняют молекулярно-генетические и цитогенетические аналитические технологии, а в ряде случаев служат им реальной альтернативой, поскольку проявление токсических и патологических эффектов является следствием фенотипи-ческих особенностей организма.

Полученные результаты указывают на перспективность дальнейшего развития работы в рамках использования комплекса разработанных методов для исследования влияния различных фармацевтических факторов на фармакокинетику тест-препаратов ацетилирования и окисления.

123