Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Белковые продукты онкогенов в трансформированных клетках и опухолях человека

^ с| v 9 - I

V • *

. . АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК' СССР

^всесоюзный онкологический научный центр

На правах рукописи УДК 616. 04: 577. 29:611. 018. 54

МАЗУРЕНКО Наталья Николаевна

БЕЛКОВЫЕ ПРОДУКТЫ ОНКОГЕНОВ В ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ И ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА

14. 00.14. - Онкология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва 1991г.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии вирусов НИИ канцерогенеза Всесоюзного онкологического научного центра АМН СССР

Официальные оппоненты:

академик АМН СССР, доктор медицинских наук,

профессор Б. А. Лапин

член- корреспондент ВАСХНИЛ, доктор биологических наук,

профессор . Т. И. Тихоненко

доктор медицинских наук,

профессор 3. Г. Кадагидзе

Ведущее учреждение - ордена Трудового Красного Знамени НИИ онкологии имени проф. К Е Петрова МЗ СССР

Защита состоится часов

на заседании специализированного совета по защите- докторских диссертаций (Л.001. 17.01) при Всесоюзном онкологическом научном центре АМН СССР ( Москва 115478, Каширское., шоссе 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного онкологического научного центра АМН СССР

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

Ю. К Шишкин

■'"-'' \ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОБЛЕМЫ

::■<*. • Актуальность проблемы. В последние 10-15 лет достигнуты -/.значительные успехи в исследовании молекулярных механизмов ^'¿Нйцфогенеза. Решающим событием в этой области явилось открытие клеточных генов . - протоонкогенов, генетические изменения и нарушения нормальной регуляции- которых, ответственны за неопластическую трансформацию клеток. Это открытие стало возможным благодаря целенаправленным и кооперативным усилиям молекулярных биологов и онковирусологов, первоначально открывших онкогены в составе РНК - содержащих ретровирусов, вызывающих опухоли у животных и . трансформацию клеток в культуре ткани. Установлено, что клеточные онкогены, являющиеся прародителями вирусных, присутствуют в геноме всех эукариотических организмов, включая человека, и играют ключевую роль в важнейших процессах нормальной жизнедеятельности клетки, таких как пролиферация и дифференцировка. Для возникновения опухолевой клетки, поддержания малигнизированного состояния, прогрессии опухоли, ее инвазии и метастазирования, по-видимому, необходима активация различных онкогенов, которые включаются на разных этапах многоступенчатого процесса канцерогенеза и взаимодействуют между собой. В настоящее время, интенсивно изучается структура промоторов и энхансеров клеточных онкогенов, исследуются изменения активности онкогенов в результате амплификации и транслокаций,делеций и точечных мутаций. Однако все эти нарушения структуры генома в конечном итоге приводят либо к изменению уровня синтеза нормального белкового продукта, либо к продукции аномальных измененных белков. Регуляция экспрессии и функционирования онкобелка может осуществляться и на пострансляционном уровне, путем белок белкового взаимодействия. Таким образом, 'исследования структуры и свойств белковых продуктов клеточных и вирусных онкогенов и их экспрессии в нормальных, трансформированных и опухолевых клетках важны для понимания . механизмов функционирования онкогенов. Одна из проблем, затрудняющих исследование онкобелков, связана со сложностями получения специфических антител. Причем для структурно-функционального анализа онкобелков особенно актуально создание наборов антител к различным фрагментам молекулы. Наконец, одним из наименее изученных вопросов остается экспрессия белковых продуктов

онкогенов в нормальных тканях и опухолях человека. Совершенно не исследованы возможные корреляции в изменении экспрессии онкобелков с гистологическим типом и дифференцировкой опухоли, ее прогрессией и метастазированием. Практически не разработаны методы иммуногистохимичъсдазго определения активности онкогенов в тканях человека. Исследования, направленные на выяснение различных аспектов . указаннах - проблем, представляются актуальными для современной молекулярной онкологии.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение молекулярно-биологических свойств белковых продуктов онкогенов и анализ их экспрессии в культурах трансформированных и опухолевых клеток,., а также в опухолях человека различного гистогенеза для выяснения их роли в процессах канцерогенеза.

В проведении работы можно различить три основных этапа-а) получение и -характеристика новых антител к продуктам онкогенов для применения их в молекулярно-биологических и _ иммуноморфологических исследованиях; б) исследование особенностей структуры онкобелков и уровня их экспрессии в клеточных системах, ' трансформированных различными агентами, а также культивируемых in vitro опухолевых клетках животных и человека; в) исследование белковых продуктов клеточных онкогенов в биоптатах опухолей человека различного гистогенеза с " целью выявления возможных корреляций с различными характеристиками опухолевого процесса.

.В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Отработать метод получения антител к синтетическим пептидам и создать набор антител к онкобелкам.

2. Исследовать молекулярно-биологичские характеристики и экспрессию "продуктов клеточных и вирусных онкогенов в нормальных, трансформированных и опухолевых клетках различного происхождения.

3. Изучить активность ряда клеточных онкогенов в первичных опухолях человека и метастазах путем скрининга их на экспрессию онкобелков молекулярно-биологическими методами.

4. Выяснить, имеется ли взаимосвязь между экспрессией онкогенов и гистогенезом и дифференцировкой опухолевой ткани, прогрессией и метастазированием.

5. Определить возможности использования полученных антител в иммуноморфологических исследованиях для изучения особенностей распределения онкобелков в опухолевых тканях и разработки методов иммуно^'истохимического определения-активности онкогенов

- 3 -

для клинических исследований.

Научная новизна работы. В ходе выполнения работы впервые получены следующие результаты:

1. получен и охарактеризован набор антител к отдельным, ранее не использовавшимся фрагментам онкобелков;- -. ■ показана иммуногенноеть этих участков молекулы';

2. установлен ряд новых фактов, касающихся структуры белковых продуктов онкогенов:

- установлено существование fos-родственных белков, гомологичных продукту гена c-fos по. С-концевой последовательности, но отличающихся от него по N- концу;

- показана независимая экспрессия белковых продуктов семейства F0S в культурах трансформированных и опухолевых клеток, обнаружены различия в экспрессии генов F0S в клонах и сублиниях одной и той же культуры клеток,

- обнаружены fos-родственные антигены в тканях и опухолях человека,

- показано, что структурные белки,_и продукт гена src вируса саркомы кур Д6, полученного из .опухоли, индуцированной ДМБА (Дядькова и др. 1966), отличаются от белков вируса саркомы кур Рауса,

- показано существование клеточных протеинкиназ, гомологичных src белку по домену аутофосфорилирования;

3. При исследовании экспрессии белковых продуктов онкогенов myc, fos, src, ras и sis в препаратах опухолей человека различного гистогенеза установлено, что :

- экспрессия продуктов генов глус и fos не зависит, а экспрессия онкобелка src зависит от гистологического типа опухоли и уровня дифференцировки ткани;

- продукт гена src экспрессируется в опухолях легких и шейки матки;

- ras белки дифференцировано экспрессируются в первичных опухолях и метастазах некоторых форм рака.

Научно-практическая значимость работы. Работа имеет теоретическое значение для понимания молекулярных механизмов функционирования онкогенов и их роли в канцерогенезе. Основным итогом работы является обоснование перспективного научного направления в исследовании- молекулярных механизмов канцерогенеза посредством изучения экспрессии и особенностей

структуры белковых продуктов онкогенов в культурах трансформированных и опухолевых клеток и опухолевых тканях человека ,

Практическое значение имеет создание набора антисывороток к белковым продуктам онкогенов тус, fos, src, sis, позволяющих исследовать их молекулярно- биологическими и иммунологическими методами, выявление полной корреляции в результатах иммуноблоттинга и иммуногИ&тохимического анализа экспрессии онкобелков в • опухолях, что открывает возможности для исследования активности онкогенов в иммуноморфологических исследованиях , в условиях клиники для целей прогноза и диагностики.

Апробация работы. Диссертационная работа апробирована на совместной конференции лабораторий молекулярной биологии вирусов, вирусных канцерогенов, цитогенетики, иммунологии онкогенных вирусов и регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ канцерогенеза ВЭНЦ АМН CCÖP 5 июня 1991года.

Материалы работы докладывались и представлялись на : симпозиумах етран СЭВ по вирусному канцерогенезу (Москва, 1981, Рига 1985), на советско-французских симпозиумах по вирусологии опухолей (Москва 1981,1985, Рига 1990), на Мевдународных симпозиумах "Ревертазаонкоген" ( Киев 1980, Рига 1982,), на 19 Европейском симпозиуме по пептидам (Афины 1986), на XYII Европейском симпозиуме по опухолеродным вирусам (Дрезден 1987), на 1,11 и III Мевдународных симпозиумах по молекулярной и клеточной онкобиологии (Тарту 1986, Таллинн 1988,. Львов 1990), на I Всесоюзном совещании по биохимии опухолевой клетки (Минск 1990), на 7 Международной конференции по маркерам опухолей человека (Киев 1990), на XYIII конференции международного общества онкоэмбриональной 'биологии и медицины (Москва 1990).-

Структура и объем работы. Диссертация в форме ' научного • доклада изложена на 54 стр. машинописного текста, содержит 6 таблиц и состоит из общей характеристики работы,, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения и выводов. В тексте содержатся ссылки на 168 отечественных и зарубежных источников. По теме диссертации опубликовано 36 печатных работ. •'

- 5 -

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Клеточные линии и их культивирование. В работе использованы культуры нормальных, иммортализованных, трансформированных вирусами и химическими канцерогенами культур клеток, а также культуры клеток опухолей животных и человека

а) нормальные клетки: первичные эмбриональные фибробласты курицы, мыши, крысы, сирийских хомячков получали трипсинизацией и использовали на первых пассажах.

б) иммортализованные клеточные линии: крысиные фибробласты Rat-2 (получены от И. Деннера, Германия), клетки почки нормальной крысы NRK-49 (получены от Ф. Дейнхардта Германия), крысиные фибробласты REF( LT), иммортализованные геном большого Т-антигена вируса полиомы (Комиссарова и др. 1989), мышиные фибробласты NIH ЗТЗ, культуры эмбриональных фибробластов человека HEF 12 и HEF 22 (получены от А. Лизоньовой ЧСФР).

в) линии клеток, трансформированных вирусами: куриные фибробласты, трансформированные ВСР штамм Прага С получали по общепринятой методике (Vogt 1969), клетки, трансформированные ВСР штаммами Шмидт-Руппин и ts NY 68 и вирусом саркомы кур Д6 (получены от С. Н. Федорова, Институт онкологии МЗ СССР, Ленинград), клетки крыс ХС, трансформированные ВСР in vivo (J.Svoboda, 1961), сублиния ХС^ поддерживалась в лаборатории вирусного канцерогенеза, а сублиния XCy¡ в лаборатории молекулярной биологии вирусов ВОНЦ АМН СССР, клетки крыс TVERC,трансформированные ВСР in vitro (Simcovich et al., 1972), клетки хомяков Н-9, Н-12 и Н-14, трансформированные ВСР,спасенным из клеток ХС (Svoboda 1981), клетки мышей RVP^ > трансформированные ВСР in vitro (Bubenick et ál. ,1967), клетки мармозеток HF-4/SSV, трансформированные вирусом саркомы шерстистых обезьян (получены от Ф. Дейнхардта ФРГ), клетки крыс NRk/SSV получены нами (Мазуренко и др. 1987), клетки PR-2 гепатомы курицы , индуцированной вирусом МС-29 (получены от Ч. Альтанера ).

г) линии клеток, ■ трансформированных химическими канцерогенами: фибробласты крысы Rat-2 МС-3 и Rat-2 КС-5, трансформированные метилхолантреном ( получены от И. Деннера, Германия),

д) линии опухолевых клеток животных : феохромоцитомы крысы РС-12 (получены от М. Саарма, Таллинн), клетки карциномы мышей Эрлиха МАС-3 и ее клоны ВЗ, С7, Е4, F5, G10, НИ и клетки^ карциномы мышей Льюиса (Кудрявец и др. 1987), клетки

тератокарциноыы мыши (получены от Р. Равье), клетки карциномы яичника китайского хомячка СНО (получены от Б. Вестермарка, Швеция).

е) линии опухолевых клеток человека: клетки опухоли щитовидной железы человека.С 643 (Heldin et al. ,1988 ) .клетки злокачественной глиомы B-5GT и ее клоны N4 и N6 ( Grofova et al., 1987), клетки., тератокарцином/ Тега I, Тега II и PAI и клетки промиелоцитарного лейкоза человека HL-60 ( получены от Р.Равье, франция), клетки эритролейкоза человека К-562, меланом человека Dorier, НМВ-2, Dau, Bowes, Beu ( получены от А. Лизоньовой, 'ЧСФР).

Всего в работе использовали 50 линий и пггаммов культур клеток. Клетки культивировали в стеклянных или пластмассовых флаконах в присутствии двуокиси углерода или без нее. Состав сред. различался в зависимости от линии. В среду добавляли антибиотики и 10% сыворотки крупного рогатого скота (СССР) или новорожденных телят или эмбрионов коров ( ЧСФР или Flow, Gibco, Великобритания) ■ ■ -

2. Опухоли человека. Образцы опухолей человека и макроскопически неизмененных нормальных тканей получали непосредственно после операции и хранили в жидком азоте. Первоначальный клинический диагноз опухолей контролировался на основании результатов гистологических исследований, проведенных сотрудниками отдела патологическрй анатомии ВОНЦ АМН СССР на основании классификации ВОЗ (1984). Препараты опухолей легкого т^кже- были предоставлены и гистологически охарактеризованы д. м. н. Е. А. Коган , кафедра патологической анатомии ММА им. И. М. Сеченова. Было исследовано 212 образцов опухолей, метастазов в лимфоузлы и препаратов условно-нормальной ткани, представляющей собой макроскопически неизмененные участки ткани пораженного органа. В некоторых случаях исследовали гистологически нормальную ткань различных органов человека.

3. Антитела коммерческие или полученные из других лабораторий. В работе использовали следующие антисыворотки и

.моноклональные антитела : антисыворотки к р27 AMV и gp.85 Rav-0 и к препарату разрушенного ВСР, производство NIH США,- сыворотка TBR от кроликов с опухолями,'' индуцированными ВСР предоставлена X. Ханафуза, США, сыворотка ТВМ от мармозеток, инфицированных ВСР получена. от Ф. Дейнхардта .ФРГ, сыворотка к. препарату разрушенного ВСК Дб предоставлена П. Князевым, сыворотка к v-myc белку предоставлена К.Меллинг, ФРГ, моноклональные антитела Mab

- 7 - "

327 предоставлены С. Полманом, Швеция, сыворотка Rat 18 от крыс, которым вводили клетки ХС, получена от М. Грофовой, моноклональные антитела Pan-Ras фирмы Cetus США, моноклональные антитела Mab SCRF 35.1 к пептиду 96-118 c-Ha-ras производство ВСВ NIH, США. ■ .

4. Синтетические пептиды. Пептиды размером от. 6 до 15 аминокислот, соотвествующие определенным фрагментам последовательностей онкобелков (см. схему), были синтезированы сотрудниками Института биоорганической химии имени М. М. Шемякина АН СССР к. X. н. И. И. Михалевой и В. В. Антоненко ( пептиды к продуктам генов fos и sis), сотрудниками Института органической химии АН Латв.ССР (пептид к src белку) й Всесоюзного кардиологического центра АМН СССР (пептид к фрагменту 212-224 v-sis белка).Всего в работе использованы 9 пептидов к продуктам 4 онкогенов : myc, src, fos, sis.

Выбор последовательностей осуществляли на основе анализа особенностей вторичной структуры белка и профилей ее гидрофильности, путем расчетов, выполненных по методам Чоу -Фасмана (Chou, Fasman 1987), Кайта - Дуллитла (Kyte, Doolittle 1982 ) и Хоппа - Цудса ( Hoppi Vpods 1981 ). Пептиды синтезировали классическими методами в растворе, либо с помощью пептидного синтезатора фирмы LKB и очищали гельфйльтрацией и обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией. Индивидуальность пептидов доказывали с помощью аминокислотного анализа, тонкослойной хроматографии, аналитической обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и анализа спектров Н-ЯМР веществ (БОмгц).

5. Получение антител к онкобелкам. Синтетические пептиды к онкобелкам коньюгировали с гемоцианином моллюска Keyhole limpet (KLH) и сывороточным альбумином быка (BSA) с помощью водорастворимого карбодиимида или глютаральдегида . Кроликов иммунизировали коньюгатами . с KLH внутрикожно множественно с полным адьювандтом Фройнда и повторно несколько раз с неполным адьювандтом Фройнда. Титр' антител в сыворотках' определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) по отношению к пептидным коньюгатам с BSА.

6. Биохимические методы. Радиоиммунопреципитацию проводили по общепринятой методике. Культуры клеток, достигшие монослоя, растили на среде без метионина в течение 40мин. с 2-4% фетальной сыворотки и затем метили 35 - S- метионином в концентрации 200мкКи/мл в течение 1-3 час. Клетки лизировали в

буфере RIPA (lOmM Трие-HCL pH 7,4, 150мМ NaCl, 0,1%SDS, 1% додецидхолат натрия, 1 % тритон X-lOO, 1мМ EDTA, 0,1% апротинин) при 4°С. Лизаты осветляли центрифугированием и хранили при -70° С. Концентрацию белка в лизатах клеток и опухолей определяли по модифицированному методу Лоури (Lowry 1957). Меченые лизаты инкубировали с антмт.едамй' и иммунные комплексы осаждали суспензией Staphylococcus aureus, либо белком А,' связанным с сефарозой (Sigma, США). Преципитаты отмывали и подвергали электрофорезу в. SDS - полиакриламидном геле ( Laemml i 1970), окрашивали амидочерным или кумасси, флюорографировали, сушили и экспонировали с рентгеновской пленкой.

Протеинкиназный тест in vitro проводили в модификации (Richert et al., 1979)! Антитела к src белку связывали с белком А на сефарозе и затем инкубировали с немеченным■лизатом клеток, трансформированных вирусом саркомы кур. Иммунные комплексы отмывали и к ним добавляли по 5-10мкКи АТФ в присутствии

ионов №i++ или Mg++. После .Юмин. инкубации при 30°С белки подвергали электрофорезу в 10% полиакриламидном геле с 0,1% SDS с последующей флуорографией. Белки, содержавшие фосфотирозин, выявляли по устойчивости к действию щелочи (Cheng, Chen 1981).

Иммуноблоттинг . Немеченные клетки лизировали в буфере RIPA, белковые лизаты (ЮОмкг) разделяли электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле и , белки переносили на нитроцеллюлозные фильтры в буфере Трис - глицин pH 8,3 с 20% метанола, либо в О,04М фосфатном буфере pH 6,5 в аппарате Transphor (LKB). Оцухолевые и нормальные /ткани хранили в жидком азоте и замороженными измельчали в микродисмембраторе (Braun) до порошкообразного состояния, после чего их лизировали в буфере RIPA. и исследовали как клеточные лизаты. Иммунопроявление проводили с антителами к онкобе&сам, разведенными в . 100-500 раз. > Для забивки мест неспецифической посадки антител использовали овальбумин или обезжиренное молоко. Антивидовые антитела (Sigma, Bio-Rad США, Dacopatts Дания) были коньюгированы с пероксидазой. Проявление вели с диэтил-аминобензидином или с орто-хлорнафтолом.

РНК выделяли из замороженных клеток гуанидин-изотиацианатным методом с последующим центрифугированием в CsCl с плотностью 1,8г/мл, либо с помощью 6М мочевины - ЗМ LiCl (Bantle et al'. ■ 1976) с последгющей обработкой горячим фенчлом. Электрофоретическое разделение РНК в 0,8%-ном агарозном геле, перенос на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизацию РНК с

р] днк клонированных онкогенов (50% формамид, 42°, 48ч.) проводили по общепринятой методике ( Маниатйс и др. 1984). Для 'дот-гибридизации поли-А РНК получали после двух циклов фракционирования на олиго-дТ целлюлозе (White et al. , 1982). Удельная радиоактивность ДНК клонированных проб онкогенов v-fos, с-шус-h, v-abl и v-Ki-ras была 2-4х Ю^имп/мин. на 1мкг.

РЕЗУЛЬТАТЫ.И ЮС ОБСУЖДЕНИЕ L_ Сравнительный анализ структурных и трансформирующих белков вирусов сарком птиц s различных культурах

пермиссивных и непермиссивных клеток Исследование структуры • и функций онкогенов и их белковых продуктов возникло из направления онковирусологии, изучавшего РНК - содержащие ретровирусы, вызывающие опухоли у животных и ответственные за трансформацию. клеток в культуре ткани. Онкоген, как специфический генетический материал, содержащий информацию об определенном белковом продукте, ответственном за трансформацию, впервые был идентифицирован в составе вируса саркомы кур Рауса - ВСР (Staehelin et al., 1975). Вскоре были открыты клеточные гомологи как вирусных онкогенов, так и их продуктов, однако на первом этапе вирусные онкогены и онкобелки были основными объектами исследований в этой области и наиболее интенсивно изучался v-src ген ВСР.

С изучением вируса саркомы кур Рауса связаны многие открытия и, в частности, показана возможность преодоления ретровирусами межвидовых барьеров (Зильбер, Крюкова 1957). Клетки млекопитающих, трансформированные ВСР, - непермиссивная система для репродукции ретровирусов птиц, однако, они оказались удобной моделью для изучения различных факторов, контролирующих трансформированный фенотип клеток. Уникальный набор клеточных линий грызунов, трансформированных ВСР, с различными биологическими свойствами был получен Я. Свободой и его коллегами (Svoboda 1968, Svoboda et al., 1971, Popovich et al., 1978, Svoboda 1981). Характер взаимодействия ретровирусов С-типа птиц с клетками млекопитающих весьма вариабелен. Клетки делятся на продуцирующие вирус в очень низких титрах и на не продуцирующие его. Последние в свою очередь разделяются на вирогенные,продуцирующие вирус после слияния с чувствительным! клетками птиц и индуцирующие опухоли ' у кур, и на хелпер-зависимые вирогенные, продуцирующие вирус только при слиянии с чувствительными Клетками, суперинфицированными

вирусом-помощником. Существуют также криптовирогенные, из которых вирус активировать не удается, так как они содержат неполный вирусный геном, и, наконец, невирогенные клетки, утратившие вирусный геном в процессе пассирования.

1.1 Экспрессия структурных белков ВСР в клетках млекопитающих

К началу 80-х годов Рыли достаточно полно изучены биологические характеристики различных типов вирогенных клеток, однако молекулярно-биологическое изучение структуры интегрировавшего,' в них провируса и его продуктов только начиналось . Анализ экспрессии структурных и трансформирующих белков ВСР в различных типах вирогенных клеток был необходим для понимания феномена вирогении. Используя специфические антитела, мы сравнили методом радиоиммунопреципитации экспрессию продуктов структурных генов gag и env и онкогена src в пермиссивных и • различных типах непермиссивных клеток (табл.1). Были исследованы: клетки крыс ХС (Svoboda, 1961) и T.WERC, (Simcovic, 1977), клетки хомяков Н-9, Н-12 и Н-14 (Svoboda, 1981), полученные из опухоли хомяков, вызванной ВСР, спасаемым из клеток ХС, а также криптовирогенные мышиные клетки RVP (Svoboda,1977). Клетки ХС и Н-9 - классические вирогенные, а Н-12~ Н-14 и TWERC - вирогенные хелперзависимые. Для сравнения использовали первичные куриные фибробласты нормальные и зараженные ВСР,а также первичные эмбриональные фибробласты крыс, мышей и хомяков.

Антисыворотка к ,р27 AMV выявляет в трансформированных куриных фибробластах основной внутренний белок ВСР р27 и его предшественник Рг76 , а такжб предшественник полимеразы Рг 180. При исследовании меченных ^-метионином трансформированных клеток млекопитающих антисыворотка к р27 преципитировала белки с молекулярными массами 76кДа ( клетки ХС, TWERC , н-9),• либо 70-72кДа ( клетки Н-12 и Н-14), которые являются предшественниками gag белков. В клетках ХС выявлен также предшественник Рг180. Однако ни в одной линии трансформированных ВСР клеток млекопитающих не обнаружена продукция собственно р27 Таким образом, как в вирогенных клетках ХС и Н-9, так и в вирогенных хелперзависимых -TWERC; Н-12 и ' Н-14 продуцируется предшественник gag белков, который не подвергается процессингу до структурных белков вириона. По-видимому, это связано с отсутствием в клетках млекопитающих протеазы р15 ( Von der Helm et al. , 1980),

Таблица 1.

Экспрессия белков вируса саркомы кур Рауса (ВСР) в различных типах вирогенных клеток

Клетки

Вид животного

Тип

вирогенности

ga.fi

Белки ВСР env

CEF-RSV

куры

вирус -продуцирующие

р27

gag

gp85

Рг76

Яав

Рг180

gag+pol

ррбО

ХС Н-9

крысы хомяки

вирогенные

Рг76еав,

Рг180

gag+pol

gp85

. ррбО

TWKRC H-12 H-14

крысы

хомяки

хомяки

вирогенные

хелпер-

эависимые

Рг76 Рг72'

зав

Мае

Рг72'

вай

gp85 gp85e

ррбО

pp60V

pp60v

крипто-вирогенные

ррбО

Нами было установлено, что предшественник gag белков в вирогенных хелперзависимых клетках Н-12 и Н-14 короче (70-72кДа), чем Рг76 в вирогенных клетках Н-9 и ХС и вирус продуцирующих куриных фибробластах. В клетках Н-12 и Н-14 также отсутствует предшественник полимеразы Рг180 , что свидетельствует о нарушениях в структуре этих генов провируса ВСР. Действительно, картирование генома провирусов в этих клетах обнаружило делецию, захватывающую 3'- конец гена gag и ген pol провируса ВСР (Татосян и др. 1986).

Исследуя Экспрессию гена env методом радиоиммуно-преципитации -с антителами к gp85 Rav-O. , мы обнаружили этот белок в клетках ХС. Продукт гена' env нами обнаружен также в клетках ' Н-9, Н-12 и- Н-14, хотя и в значительно меньших количествах, чем в куриных фибробластах. Это согласуется с данными по спасению генома провируса из клеток Н-12 и Н-14 и образованию инфекционнного трансформирующего вируса с помощью ВСР штамм Брайан, который является дефектным по гену env, однако содержит ген pol,который отсутствует в провирусах ВСР в клетках Н-12 и.Н-14 (Svoboda 1981). Таким образом, в вирогенных клетках Н-12 и Н-14 имеется дефект генома ВСР, затрагивакшяй гены gag и pol, в связи с чем в них продуцируется укороченный gag предшественник и отсутствует предшественник белков комплекса обратной транскриптазы Рг 180 .

Вирогенные клетки TWERC , напротив, содержат интактные гены gag и pol, но антисыворотка к env белку не обнаруживает в них gp85 что обусловлено, делецией гена env (Татосян и др. 1986).

Суммируя полученные -данные, можно утверждать , что: 1) в отличии от пермиссивных' куриных клеток, в различных типах вирогенных клеток млекопитающих, даже при наличии полного генома провируса и экспрессии генов gag, pol и env, продукция вирионов отсутствует из-за нарушения процессинга предшественника gag белков. Слияние с куриными клетками или. введение их курам обеспечивает продукцию вирионов в клетках типа ХС и Н-9; 2) в вирогенных хелперзависимых клетках имеются дополнительные дефекты в структуре провирусов, затрагивающие разные гены, в связи с чем в них либо вовсе не зкдпрессируются продукты этих генов , например gp85 в клетках TWERC, либо экспрессируются дефектные белки- gag в Н-12 и Н-14 . Для спасения провирусов в этих клетках поэтому необходимы лишь куриные клетки, сулеринфицированные вирусом помощником.

- 13 -

1,2 Экспрессия и протеинкиназная активность продукта гека src в клетках млекопитающих, трансформированных ВОР . Общим свойством всех трансформированных ВСР клеток кур и млекопитающих является присутствие и экспрессия онкогена v-src. Мы исследовали продукцию src белка с помощью антисывороток TBR и ТВМ , полученных соответственно от кроликов и мармозеток с опухолями, индуцироваными ВСР. Эти сыворотки содержат антитела ко всем вирусиндуцированным белкам и в опытах по радио-иммунопреципитации осаждали из трансформированных клеток кур и млекопитающих белок с молекулярной массой бОкДа - продукт гена src, а также р27 в куриных клетках и предшественники gag белков Рг7б и Рг72 соответственно в крысиных и хомячковых клетках.

Основным свойством src белка является тирозин специфическая протеинкиназная активность (Hunter, Cubran 1980). Мы также показали, что продукт гена src из трансформированых клеток кур и млекопитающих обладают тирозин специфической протеинкиназной активностью, которая выявляется в протеинкиназном тесте in vitro с сывороткой TBR. В присутствии jl_[32p] атф и ионов Мг++йли Ш++ ррбО фосфорилировал тяжелую цепь иммуноглобулинов р55 IgG сыворотки TBR, преципитировавшей его из клеточных лизатов. Фосфорилирование имело место по тирозину, который в отличии от фосфосерина и фосфотреонина сохраняется в условиях щелочной обработки. Таким образом, основное свойство трансформированных клеток млекопитающих обусловлено интактным src геном, кодирующим полноценный ферментативно активный белок.

Небольшой.уровень ферментативной активности,

соответствующей эндогенной c-src протеинкиназе выявлен в эмбриональных фибробластах мышей, крыс и хомяков и не обнаружен в,клетках кур. Протеинкиназная активность src белка обнаружена нами и в криптовирогенных клетках RVP , практически утративших провирусный геном (Tatosyan et al. 1982). Не исключена активация гена c-src в этих клетках, так как уровень src белка в них выше, чем в мышиных эмбриональных фибробластах.

С целью выявления субклеточной локализации src протеинкиназы и ее возможных мишеней, мы исследовали активность src белка в экстрактах клеток TWERC , полученных двумя способами. В первом случае лизаты клеток осветляли как обычно для радиоиммунопреципитации, при этом они освобождались от мембран, а во втором варианте клеточные лизаты не осветляли. Если в первом случае в протеинкиназном тесте с сывороткой TBR

фоефоршшрован был только р55 IgG, то во втором случае в неосветленных ' лигатах насчитывалось до 43 полос, соответствующих белкам, копреципитировавшим с ррбО при добавлении сыворотки TBR. Эти белки - возможные мишени src белка, среди них наиболее выражены полосы 34, 85 и 130кДа, соотвествующие по моле.к}ущ>'ной массе вероятным мишеням - лактат дегидрогеназе 34кДа(Cooper, Hunter; 1984), калпактину I (Radke et al. , 1983), '. винкулину 130кДа (Sefton et al., 1981), белку 120кДа (Comoglio et al., 1984, Lau 1986 ). До сих пор вопрос об истинных мишенях src белка остается открытым.

При трансформации клеток млекопитающих ВСР в них фосфорилируется по тирозину много белков и не только те, которые копреципитирукгг с продуктом гена src при использовании сыворотки TBR. В частности, в клетках ХС образуются новые белки с молекулярными массами 105кД?1 и 98кДа, которые удалось выявить с помощью сыворотки Ratl8 от крыс с регрессирующими опухолями, возникшими после введения им клеток ХС (Grofova et al. 1982). Эти '.белки .не имеют обпщ детерминант со структурными белками ВСР и не обнаружены в нормальных клетках кур и крыс и в крысиных клетках,трансформированных химическими канцерогенами. Следовательно, они индуцируются в клетках млекопитающих только под влиянием генома ВСР. Удалось показать, что белок с молекулярной массой 98 кда обладает протеинкиназной активностью и аутофосфорилируется в присутствии АТФ, однако функции его до сих пор неизвестны.

J.3 Сравнительный анализ белковых продуктов вирусов саркомы кур 'Л б и саркомы кур Рауса Одним из фрагментов работы по изучению белковых продуктов онкогенов ретровирусов птиц явилось исследование белков вируса саркомы кур Д 6 (ВСК Д 6), выделенного из опухоли курицы, индуцированной 9,10-диметил 1,2-бензатраценом (Дядькова и др. 1'966). Этот вирус представлял интерес именно потому, что фактически был активирован химическим канцерогеном. Характер формирования очагов трансформации и морфология куриных фибробластов, трансформированных ВСК Д6 отличалась от очагов трансформации, индуцируемых другими вирусами сарком птиц.

Изучение генома ВСК ЛД6 показало, что он содержит все 4 гена, характерных для недефектных вирусов саркомы кур, при этом репликативныё - гены и 5' - конец гена src гомологичны соотвествующим генам ВСР Прага С. В то же время выявлены существенные . отличия в' рестриктных • картах ВСК Д6 и ВСР при

действии ферментов Eco RI, Hind III и Bgl II, что свидетельствует о принципиальных отличиях в первичной структуре этих вирусов (Федоров и др. 1984). Данные картирования указывали на . возможность существования особенностей в структуре белков ВСК Дб и, в частности, продукта гена sre, что и послужило основанием для нашей работы.

Сравнительный анализ белков ВСК'Дб и ВСР был проведен с помощью антител к продуктам генов gag и env ( антисыворотки к р27 AMV , gp 85 Rav-0 и разрушенным ВСР и ВСК Дб) и сыворотки TBR, узнающей как структурные, так и трансформирующие белки.

Установлено, что ВСК Дб существенно отличается от ВСР штаммы Шмидт -Руппин и ts NY 68 по продуктам нескольких генов. Во-первых, различаются подвижности 5'-концевых gag белков р19 в полиакриламидном геле: р19 ВСК Дб идет гораздо быстрее, чем р19 ВСР. Причем это различие в подвижности велико и не может объясняться возможным несоответствием в уровнях фосфорилирования этих белков. Следовательно, р19 ВСК Дб значительно короче, чем р19 ВСР. Более короткая форма белка р19 была обнаружена в рекомбинантных вирусах сарком, содержащих информацию об эндогенных провирусах. кур ( Shaikh R. et al 1979). Можно полагать, что присутствие укороченного р19 в ВСК Дб обусловлено эндогенным происхождением этого вируса, выделенного из опухоли, индуцированной химическим канцерогеном.

Обнаружены также отличия в антигенных детерминантах продуктов генов env ВСК Дб и ВСР штамм 1Шидт-Руппин. При использованию! специфических антисывороток к gp85 и к разрушенным вирусам ВСР и ВСК Дб установлено существование индивидуальных антигенных детерминант при наличии значительного антигенного родства мажорных гликопротеидов этих вирусов. i Однако, наибольшие отличия выявлены в продуктах онкогенов: sre белок ВСК Дб значительно крупнее и имеет молекулярную массу 65кДа. Этот белок, также как и ррбО ВСР_ Шдвдт-Руппин и ts NY 68, обладает протеинкиназной активностью и в тесте in vitro фосфорилирует р55 IgG сыворотки TBR-D по тирозину. ' Однако, в отличии от sre белка ВСР, он фосфорилирует также белок с молекулярной массой 45кДа, присутствующий в иммунных комплексах с сывороткой TBR-D. Природа последнего остается неясной: либо это клеточные белки - актин (Ito et al. 1982) или энолаза (Gould et al. 1984 ), которые являются акцепторами фосфата в протеинкиназном тесте in vitro ,. либо продукт мутантного гена sre. Подобные укороченные sre белки описаны в литературе,

например, продукт онкогена src мутанта РAd 1105 ВОР Шмидт-Руппин имеет молекулярную массу 45кДа и сохраняет протеинкиназную активность (Lousier et al. 1984), также как и другие мутанты с молекулярной массой 45 кДа с делецированным N-концевым фрагментом (Parsons et al., 1986). Кроме того, в крысиных фибробластах, трансформдай'анных ВСР штамм В77 обнаружены два продукта src гена с. молекулярными массами 68 и 43кДа, которые транслируются с разных инициирующих кодонов (Mardon, Varmus 1983). . • ■

Продукт гена src ВСК Дб . имеет необычный размер - 65кДа. Этот ген, по-йидимому, включил в себя фрагмент клеточной ДНК (в середину или в 3'-конец гена), что обусловило различия в рестриктных картах BÖK Д6 и ВСР и увеличение размера белкового продукта. Подобные формы src белка были обнаружены и в других вирусах сарком кур S1 и S2 (Hirara et al. 1984) и PR 2257 (Geryk et al. 1989). Они' являются результатом трансдукции части клеточной ДНК- в геном вируса и рекомбинации с эндогенным вирусным геномом.

Таким•образом, полученные результаты свидетельствуют о различиях в белках вирусов сарком кур Д6 и Рауса, обусловленных особенностями структуры геномов этих вирусов, и подтверждают данные рестриктного анализа. Скорее всего, ВСК Д6 образовался из ' последовательностей эндогенных провирусов кур и клеточной ДНК под влиянием ДМБА. Тем не мерее, оба вируса сарком содержат ферментативно активный src белок, ответственный за основную биологическую характеристику этих вирусов - способность трансформировать чувствительные клетки кур и млекопитающих.

II. ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА АНТИСЫВОРОТОК К ОНКОБЕЛКАМ.

При исследовании белковых продуктов вирусных и клеточных онкогенов основные проблемы связаны со способом их детекции. Из всех методов наиболее чувствите ным является иммунологический. Однако, в виду того, что онксбелки находятся в клетках в исключительно малых количествах, обычные методы выделения белков и иммунизации непригодны. Первый онкобелок - продукт гена src ВСР был обнаружен с. помощью сыворотки TBR от .«роликов с опухолями, индуцироваными ВСР, которая в отличии от сыворотки к разрушенному вирусу преципитировала кроме структурных белков новый белок - продукт онкогена (Brugge, Erikson 19?7). Аналогичным образом был обнаружен продукт гена fos вируса остеосаркомы мышей FBJ M3V (Curran, Teich 1982).

В начале 80-х годов наибольшее распространение приобрел

- 17 - '

метод . получения антител к онкобелкам, нарабатываемым в бактериях с помощью экспрессируемых векторов, содержащих онкоген под сильным промотором, что стало возможным вследствии развития техники генной инженерии. Несмотря на несомненные достоинства, он имеет и недостатки, связанные со сложностями получения экспрессируемых векторов и выделением онкобелков, не подвергшихся расщеплению бактериальными протеазами. Кроме того, белки, продуцируемые в бактериях, бывают лишены специфических модификаций, например, гликозилирования, характерного .для продуктов эукариотических онкогенов.

Наряду с этим методом, тогда же был разработан способ получения антител к , синтетическим фрагментам ' онкобелков . Основой для него явилось совершенствование техники секвенирования ДНК, что позволило в 1982-1984гг определить последовательности большинства известных вирусных и клеточных онкогенов и расчитать аминокислотные последовательности, кодируемых ими продуктов. Наиболее ответственный момент заключается в правильном выборе иммуногенного фрагмента на основании аминокислотной последовательности. Анализ имеющиеся работ показывает, что при выборе пептида необходимо учитывать профили гидрофильности белка, длину пептида, его локализацию в белке и другие свойства ( Lerner 1982, Niman et al. , 1983, Tanaka et al., 1985 ). При этом успех достигается по разным данным в 25 - 100% случаев , причем различие в одну аминокислоту может быть достаточно для получения сыворотки с совершенно другими свойствами. Несмотря на определенные сложности с выбором пептида, этот метод имеет несомненные преимущества перед предыдущими. Он позволяет не только выявлять белки и антигенно родственные соединения, но и дает возможность исследовать особенности структуры и функции отдельных фрагментов молекулы и всего онкобелка. Этот метод наряду с сайт-направленным мутагенезом является наиболее эффективным для детального изучения" роли отдельных участков молекулы в трансформации и мы воспользовались им для получения антител к ряду онкобелков (табл.2).

Основным методом исследования онкобелков мы избрали иммуноблоттинг с антисыворотками к синтетическим пептидам, который имеет ряд преимуществ перед другими методами, а именно: 1) позволяет работать с немечеными клеточными лизатами и препаратами тканей человека;

СХЕМА ФРАГМЕНТОВ ОНКОБЕЛКОВ, К КОТОРЫМ ПОЛУЧЕНЫ АНТИСЫВОРОТКИ

SRC N---------------------------------___«5П421------„с533

FOS №[]—-

N-N-

380 380

375[]с 380 371 с ]С 380

SIS N-N-

226

201^210__с 226

N_____________200[:j206__c 226

МУС N----§Zn§§.

439

Таблица 2

Свойства некоторых полученных антисывороток к онкобелкам

^Название Онкобелок сыворотки фрагмент последовательности онкобелка Титр антител в ELISA Выявление белков Возможности примениения антител в РИП ИБл. ИГХ

TBR(TBR-D) v-erc (c-src) неизвестен H.O.. РР60егс + +

анти вгс с-вгс (v-вгс) 415-421 5х103 рр60вгс, PP45,рр85, рр120 + + н. о.

анти N-fos c-fos V-foa 6-15 1х103 p55f°S(p62fOB ) + + +

анти C-fos c-fos fos В fra 1 371-380 БхЮ P62foB р46 р36 р75,р90 + + +

анти v-sis v-sls c-sis 201-210 1х103 р64 в1в + + +

анти с-шус c-myc 58-67 5х104- -, Р64-66ШУС Р58-60 ' + + +

2) этот метод предпочтительнее при работе с антипептидными сыворотками, так как они лучше узнают пептид в денатурированном . белке;

3) позволяет выявить лишь белки, содержащие определенный структурный фрагмент, либо гомологичную последовательность ;

4) обладает высокой чувствительностью, характерной для . иммунологических методов.

II. 1 Получение сыворотки TBR-D и использование ее для исследования sre. белка Трансформирующий белок вируса саркомы кур Рауса является продуктом независимого онкогена, экспрессию и ферментативную активность которого мы тестировали с помощью сыворотки TBR. Совместно с Б. П. Боговским была получена новая сыворс-ка TBR-D от кроликов, которым вводили смесь штаммов ВСР Шмидт-Руппин и Прага С и вирус саркомы кур Дб. Поэтому обозначение TBR-D мы ввели для того , чтобы отличить ее от сыворотки TBR, которую обычно получают введением ВСР.

При сравнении свойств сывороток TBR и TBR-D было установлено, что обе сыворотки осаждают sre белок из различных культур клеток кур и млекопитающих, 'трансформированных ВСР. В протеинкиназном тесте ррбО фосфорилирует иммуноглобулины сыворотки TBR-D также, как и сыворотки TBR. Кроме того, сыворотка TBR-D имеет некоторое преимущество перед сывороткой TBR, так как плохо узнает вирусные структурные белки и, таким образом, фактически реагирует только с sre белком, что в значительной степени упрошает картину преципитации. Эту особенность, видимо, можно объяснить использованием смеси трех вирусов сарком птиц для иммунизации кроликов. Однако все сыворотки TBR плохо реагируют с денатурированным sre белком и их не используют в иммуноблоттинге.

Сыворотка TBR-D была использована во всех экспериментах по выявлению продукта гена sre методом радиоиммунопреципитации и определению его ферментативной активности в культурах клеток, трансформированных ВСР и ВСК Дб. 4 Она позволила также изучить экспрессию sre белка в опухолях человека в иммуно-морфологических исследованиях, проведенных совместно с Е. А. Коган, где моноклональные антитела и антипептидная сыворотка к sre белку оказались неэффективны.

Сыворотка TBR-D нашла применение в исследованиях по получению бактериальных продуцентов sre белка (Амбарцумян и др. 1987, 1990). При тестировании бактериальных штаммов Е. coli,

инфицированных различными конструкциями плазмид, содержащими

ген src ВСР, нами с помощью сывсротки TBR-D была показана

возможность экспрессии белкового продукта гена src плазмиды

pBRCil в Е. coli и были отобраны клоны с наибольшей

ферментативной активностью. .Src белок, продуцируемый в Е.coli,

имел стандартный размер &0йДа и фосфорилировал иммуноглобулины

сыворотки TBR-D по тирозину.

IJ. Z. Получение и свойства антител к фрагменту 415-421 ррбО

Для детального изучения особенностей структуры src белка,

нами, помимо сыворотки TBR, были получены антитела к

синтетическому пептиду, соответстующему последовательности

415-421,. включающей тирозин 416. Этот остаток является основным

сайтом фосфорилирования в продукте вирусного онкогена и в

продукте клеточного протоонкогена in vitro, но не in vivo

(Smart et al. 1981,Purchio çt al. 1982).. Роль этого сайта в

трансформации не была ясна: в то время как онкогенность ts

мутантов ■ ВСР коррелировала со степенью фосфорилирования

тирозина 416. (Peirier et al. 1984), его утрата или замещение не

лишали вирус • трансформирующей способности, хотя и сншали ее

(Cross, Hanafusa 1983, Snyder et al. 1983).

Для получения, антител был выбран участок последовательности

415-421 ррбО Qlu-Tyr-Thr-Ala-Arg-Glu-Gly, который синтезировали

классическими методами в растворе. Кроликов иммунизировали

коньюгатом пептида с гемоцианином и полученные сыворотки

тестировали твердофазным иимуноферментным методом с пептидом,

юрньюгированным с BSA. Несмотря на некоторые индивидуальные

различия в ответе животных, антисыворотки по отношению к

пептиду имели титр 1-5x10^. За титр принимали 1/2 разведения,

при . котором достигается максимальное связывание антител с

пептидом, хотя антитела реагировали с пептидом и в разведении

5x1 (А •

Свойства антисывороток к пептиду 415-421 изучали в

сравнении с сывороткой TBR-D. Поскольку до сих пор нет данных о

структуре антигенных детерминанат, узнаваемых TBR, мы проверили

методом ELISA, реагирует ли сыворотка TBR с пептидом- 415-421.

Ответ был отрицательный, следовательно эти сыворотки узнают

разные эпитопы. ■ ■ /

Антисыворотки к пептвду 415-421. в реакции 'радиоиммуно-

преципитации' осаждали ррбО , а также белки с- молекулярной

массой 85 и 120кДа из лизатов куриных фибробластов и клеток

млекопитающих, хрансформированныъх ВСР. Полученные антитела

- 21 - ' узнавали эти же белки не только в нативных условиях, но и после денатурации при использовании иммуноблоттинга Это свидетельствует о том, что фрагмент 415-421 достаточно консервативен и присутствует не только в ррбО , но и в указанных белках.

Основное свойство ррбО - ферментативная активность, фосфорилирующая по тирозину ряд клеточных белков, а также аутофосфорилирование по " тирозину 416. Как известно,в протеинкиназном тесте in vi-tro ррбО фосфорилирует иммуноглобулины сыворотки TBR. Однако при замене сыворотки .TBR на антитела к пептиду 415-421, вместо фосфорилированных иммуноглобулинов антипептидной сыворотки, мы обнаружили фосфорилированые белки 45 кДа, 85кДа и 120кДа В крысиных клетках ХС и TWERC были фосфорилированы белки 45кДа и 85кДа, а в клетках Н-12 - 45кДа, 85кда и 120кДа, причем наиболее интенсивно фосфорилирован белок 85кДа. Природа этих белков неизвестна, однако наиболее вероятно, что эти белки были копреципитированы с ррбО и являются естественными мишенями действия src протеинкиназы. В частности, белок 120 кДа рассматривался и другими авторами в .качестве предполагаемой мишени действия ррбО (Comoglio 1984, Linder, Burr 1987). Было показано, что его может фосфорилировать ррбО (Lau 1989). Интерес представляет также белок 85кДа, который по размеру и способности акцептировать фосфат схож с ферментом фосфатидил инозитол киназой; имеющей по одним данным молекулярную массу 85кДа (Kaplan et al., 1987 ), а по другим 81кДа (Coutneidge, Heber 1987). Установлено, что он может быть мишенью src белка, однако ген фосфатидилинозитолкиназы не клонирован, структура его белкового продукта не изучена и неизвестно, содержит ли он грмологичный сайт аутофосфорилирования.

Антитела к пептиду 415-421 закрывают сайт аутофосфорилирования и оно происходить не может, однако это не мешает фосфорилированию белков-мишеней. Оставалось непонятным , почему ррбО в протеинкиназном тесте in vitro фосфорилирует р55 IgG сыворотки при использовании сыворотки TBR, но не сыворотки к пептиду 415-421. Однако, оказалось, что при добавлении к иммунному комплексу ррбО с антипептидной сывороткой избытка (1мкл) сыворотки TBR и $[32р]- атф происходит фосфорилирование иммуноглобулинов сыворотки TBR. Следовательно, различный результат ¡ реакции обусловлен особенностями конформации комплексов ррбО с • двумя типами антител к нему и

пространственным расположением иммуноглобулинов и киназного домена ррбО . Хотя антипептидная сыворотка к 415-421 закрывает основной сайт аутофосфорилирования, это не препятствует проявлению протеиникиназной активности по отношению к р55 IgG TBR. Следовательно, этот фрагмент не входит в протеинкиназный домен src белка. , Полученные результаты согласуются с современными представлениями"^ том, что киназный домен включает участок 498-512. В то же время фрагмент 415-421 чрезвычайно важен для проявления трансформирующих свойств v-src и c-src белков, а именно, необходимо гиперфосфорилирование тирозина 416, причем для •■ c-src белка это должно сочетаться с гипофосфорилированием тирозина 527 (Hunter, 1987, Kmeicik et. al 1987, Piwnica-Warms et-al. 1987 ).

Таким образом, нами получены антитела к функционально важному участку молекулы ррбО, которые узнают как нативный, так и денатурированный -белок. Показано, что закрытие сайта аутофосфорилирования в молекуле src белка (остатки 415-421) не мешает проявлению протеинкиназной активности фермента • и, следовательно, этот пептид не входит в протеинкиназный домен. Полученные антитела и сыворотка TBR узнают разные эпигопы в молекуле онкобелка. . Последовательность 415-421 достаточно консервативна и поэтому антипептидная сыворотка узнает этот фрагмент в антигенно родственных белках с м. м. 45, 85 и 120кДа.

Необходимо отметить, что в данном' случае антитела к короткому пептиду, содержащему всего 7 аминокислот,, узнавали не только пептид , но и нативный белок. Это указывает на его большую иммуногенность и. доступность для взаимодействия с молекулами других белков -и согласуется с высокой активностью тирозина 416 в ферментативных реакциях. По литературным данным, пептиды размером менее 12 , аминокислот дают не очень удовлетворительные результаты: лишь 1 из 7 таких пептидов генерируют сыворотку с хорошим ответом. Характерно также, что антитела к длинному 17-ти членному пептиду 409-425, включающему пептид 415-421 , не узнают src белок (Tanaka et al. 1985), в то же время другие авторы использовали этот же пептид для получения антител к рецептору эпидермального фактора содержащего гомологичную последовательность (Lax et al., 1984). Сопоставление этих результатов с нашими данными подтверждает,, что небольшие различия в последовательности пептидов и технике эксперимента генерируют антитела с другими свойствами.

- 23 -

■ ¡1.3. Получение антител к продукту гена v-sis.

Онкобелок р28 - продукт гена v-sis вируса саркомы шерстистых обезьян (SSV), единственного дефектного по репликации трансформирующего вируса приматов ( Deinhardt et al. ,1980 ). Клонирование его ДНК привело к определению нуклеотидной и аминокислотной последовательности, продукта онкогена v-sis (De vare et al. 1983), который оказался гомологичен В цепи тромбоцитарного фактора роста - PDGF-2 (Doolittle et al., 1983, Waterfiel'd et al. 1983). Установлено, что продуктом трансляции клеточного гена c-sis является белок с м. м. 26 кДа, который в результате процессинга превращается в более короткий (13кДа) PDGF-2. Продукт вирусного онкогена - р28 кроме последовательности, гомологичной продукту c-sis гена, содержит 19 N-концевых аминокислот, кодируемых геном env вируса саркомы шерстистых обезьян (Igarashi et al., 1987). Как и PDGF-2, белок р28 секретируется в виде димера р56, и его трансформирующая активность проявляется во взаимодействии со специфическим рецептором. . Это единственный пока пример антигенного и функционального родства факторов роста и онкобелков (Chiu et al. , 1984). Сходства вирусного и клеточного генов sis , дает основания для предположения , что нарушение регуляции гена c-sis может привести к образованию более крупного , чем PDGF -2, бежового продукта, участвующего в трансформации, тем более, что в клетках обнаружена c-sis специфическая РНК размером 4,2 т.п. н.

В связи с изучением роли гена c-sis в канцерогенезе у человека возникла необходимость в получении антител к онкобелку. При выборе пептида мы руководствовались тем, чтобы получить антитела, которые позволят дифференцировать экспрессию RDGF-2 и р28 . Для этого был выбран С-концевой фрагмент белка р28, присутствующий в продуктах генов v-sis и c-sis, но не в PDGF-2. К С- концевому фрагменту последовательности 200-226 р28 были синтезированы . три пептида, соответствующих последовательностям 201-210 (пептид I), 200-206 (пептид II) (Антоненко и др. 1987, Mikchaleva et al. 1987) и 212-224 (пептид III). '

Arg -Arg-Pro-Pro-Lys-Gly-Lys-His-Arg-Lys ( I) Val - Arg- Arg- Pro- Pro- Lys- G1 у (II)

Lys-His-Thr-His-Asp-Lys-Thr-Ala-Leu-Leu-Lys-Glu-Thr-Leu (III) Для иммунизации кроликов были использованы конь'югаты пептидов I и III с KLH и пептида II с BSA, полученные как с

водорастворимого карбодиимида, так и с помощью глутаральдегида. Существенным оказался способ конъюгации пептида с гемоцианином антисыворотки к коньюгату пептида I с KLH с карбодиимидом узнавали пептид в разведении 1x10^ , тогда как сыворотки к тому же пептиду, коньюгированному с помощью глутаральдегида были совсем не активны в'ELISA.

Полученные.антисыворотки исследовали в реакциях радиоиммунопреципитации и иммуноблоттинга с лизатами клеток, трансформированных вирусом саркомы шерстистых обезьян клетками мармоееток HF-4/SSV и крысиными клетками NRK-SSV. Последние клетки мы получили сами, инфицируя клеткм почки крысы NRK-49 вирусом, находящимся в ' культуральной жидкости клеток HF-4/SSV. В крысиных"клетках вирус размножался с образованием фокусов трансформированных клеток, которые обозначили NRK-SSV.

Антисыворотки к пептиду_ I приципитировали белок с

молекулярной массо'й 28кДа из клеток NRK-SSV и HF-4/SSV, ос,

меченных . S- метионином в присутствии восстанавливающего агента - р. - меркаптоэтанола и не выявляли этот ' белок в контрольных клетках NRK-49. : В отсутствии восстановителя антитела осаждали белок с молекулярной массой 56кДа, который является димером, образующимся из молекул р28, имеющих' по 8 цистекновых остатков, в основном, в N-концевой и центральной частях молекулы (Sauer,Dohoghue 1988). Этим объясняется тот факт, что антитела к С- концу выявляли как мономер, так и димер. Неиммунная сыворотка эти белки не выявляет. Кроме р56 артисыворотка к пептиду 201-210 выявила в трансформированных, клетках HF-4/SSV белок 46кДа, который является продуктом процессинга димера р5б при отщеплении N-концевого фрагмента (Robbins et al., 1982, Antoniades et al. 1985).

' Полученная антисыворотка нашла применение при анализе белкового продукта гена v-sis, экспрессируемого в Е.coli после трансфекции плазмидой pLM sisl-2, содержащей ген v-sis под промотором MMTV (Колобков , 1987), а также была использована для выявления экспрессии продукта гена v-sis в трансгенных мышах (Вайсман и др. 1987).

Таким образом, полученные антитела позволяют выявлять продукт гена v-sis в трансформированных клетках и его клеточный гомолог', содержащий пептид 201-210. Эти данные свидетельствуют о доступности, и мобильности этого участка молекулы р28 . Полученные результаты согласуются с данными об иммуногенности N- и С-концевых фрагментов и недоступности центральных участков

■ - 25 -

онкобелка (Robbins et al. , 1982, Devare et al. , 1983).

Кроме указанных sis-специфических белков, антисыворотка к пептиду 201-210 р28 выявляет также белок с молекулярной массой 54кДа как в sis-трансформированных, так и в' неияфицированных клетках NRK-49, ХС, Rat-2 и других. Этот белок является мономером и природа его остается неизвестной, хотя размеры белка позволяют думать, что он может быть полным продуктом гена c-sis, который кодирует РНК, достигающую 4,2 т. п. н. Белок такого же размера, был обнаружен в ядрах клетках NRK и NRK-SSY. (Shawer et al. , 1988). Показано, что он фосфорилирован по сериновым и треониновым остаткам, а в SSV-трансформированных клетках этот белок фосфорилирован также и по тирозину. Предполагает- , что он участвует в механизме аутокринной регуляции, причем для транспортировки в ядро необходима сигнальная последовательность, соответствующая остаткам 198-210 белка р28. Белки, утратившие ее или содержащие мутацию в этом фрагменте, аккумулируются в ядрышке, не переносятся е ядро и не трансформируют клетки аутокринным путем (Mäher et al., 1988). Характерно, что антитела к пептиду 201-210 выявляли белковый продукт гена c-sis в опухолях чёловека при использовании ишуногистохимического метода исследования. Антитела к синтетическому пептиду выявили присутствие c-sis белка также- в эндотелии сосудов (Коган и др. 1990).

11. 4. Получение антител к продукту гена c-niyc Онкоген с-тус является наиболее часто экспрессируемьм в опухолях человека (Eva et -al., 1982, Slamon et al. , 1984, Tatosyan et al. ,1985). Для изучения его .экспрессии на уровне белка мы получили антитела к синтетическому пептиду. соотЕествующему последовательности 57-68 с-тус белка: , ' Pro -Thr-Pro-Pro-Leu-Ser-Pro-Ser-Arg-Arg-Ser-Gly

Выбор пептида ■ был сделан на основании расчета гидрофильности молекулы онкобелка и пептид бьш синтезирован на приборе фирмы LKB . Кроликов иммунизировали коньюгатом с KLH и' титр полученных антисывороток составил 1-5 х ltf* , хотя в ELISA сыворотка узнавала пептид в разведении 1х10& . Специфичность антител анализировали методом иммуноблоттинга и для сравнения использовали поликлональные овечьи антитела к бактериально полученному V-myc белку (Bunte et al. , 1984). Обе антисыворотки выявляли продукт вирусного онкогена v-myc - белок Pr HOgag-raj^ метках PR-2, трансформированных вирусом 143-29.

Для тестирования экспрессии с-шус белка использовали клоны БЗ и F5 мышиной карциномы МАС-3 , положительные по экспрессии с-шус мРНК. Антитела к пептиду 57-68 с-туе- белка выявляли дублет белков с молекулярной массой 64-66кДа , также как и овечьи антитела к v-myq белку: Кроме того обе антисыворотки реагировали также да<м»том белков с молекулярной массой бОкДа, природа которых остается неизвестной. Причем сильнее с этими белками реагировали антипептидные антитела.

При исследовании культур опухолевых клеток человека антитела выявили с-шус белок с молекулярной массой 64кДа в клетках эритролейкоза человека- К 562 , причем белок с молекулярной массой бркДа не обнаружен. В этом же эксперименте не выявлена экспрессия продукта гена с-шус в клетках эмбриональных* фибробластов человека, а также в пяти различных культурах'клеток метаном человека, при этом в- параллельном опыте в них обнаружена экспрессия продукта гена c-fos.

Полученные антитела использовали для анализа экспрессии онкобелков • в опухолях человека методом иммуноблоттинга и иммуногистохимии. . фи иммзшоморфологиче с ком исследовании специфическое окрашивание с антителами к фрагменту с-шус белка наблюдалось в ядрах клеток опухолей легких, рака шейки матки, рака желудка, лимфом.

Описано несколько попыток получения антител к синтетическим пептидам белка v-niyc, в основном к 3 экзону (Bunte et al. 1984, Evan et al. , Tanaka et al., 1985), однако не все они были успешными.. Так, из 7 пептидов размером от 7 до 15 аминокислот к С- концевой части онкобелка, лишь один 15 -членный реагировал с туе белком (Tanaka et al., 1985). Таким образом, выбор относительно короткого пептида 57-68 оказался удачным , так как этот пептид достаточно иммуногенен. Необходимо отметить, что он содержит несколько остатков пролина и присутствует с заменой 2-3 других аминокислот также в продуктах других генов семейства mye: v-myc и N-myc (Kohl et al. ,1986). 50% гомологии с этим же фрагментом имеют соответствующие участки продуктов генов L-myc ( Nau ' et al., 1985) и Ibmyc (Ingvarsson et al. ,., 1989), причем все они богаты пролином. Этот пептид консервативен и присутствует в продуктах генов с-шус птиц, мыши, крысы и человека, однако конкретная функциональная' роль этого участка молекулы с-шус белка пока неизвестна

III. Исследование структуры и экспрессии продукта гена c-fos.

III. i:Получение и свойства антител к различным фрагментам

c-fos белка.

Продукт онкогена v-fos вируса остеосаркомы мышей впервые был.обнаружен в 1982 году с помощью сыворотки TBRS от крыс с опухолями, индуцированными FBJ-MSV (Curran, Teich 1982 ). Его клеточный аналог, продукт гена c-fos, отличается'or вирусного онкобелка составом последних 48 С-концевых аминокислот (Van Beveren et al., 1983, Van Straaten et al. , 1983) и является регулятором транскрипции генов, участвующих в пролиферации, дифференцировке и трансформации (Setoyoma et ah, 1986, Distel et al., 1987, Lucibe¿lo et al. , 1988) . Как вирусный, так и клеточный гены fos кодируют белки, аккумулирующиеся в л."зе и взаимодействующие с ' продуктами семейства генов jun с образованием комплекса, который реагирует с последовательностью АР I промоторной зоны ДНК различных генов (Chiu et al. , 1988, Sassone-Corsi et al. , 1988, Zerial et al., 1989, Cohen et al. , 1989 ) .

Для получения антител к* продукту гена c-fos нам необходимо было выяснить особенности вторичной структуры продуктов генов c-fos и v-fos и синтезировать наиболее им^уногенные и мобильные фрагменты молекулы. Произведенные расчеты . профилей гидрофильности и образующего потенциала этих белков, показали, что в молекуле много гидрофильных участков и структур и поэтому при выборе пептидов остановились на N и С- концевых фрагментах, поскольку у продуктов вирусного и клеточного c-fos генов С-концы разные, a N- концы одинаковые, то антисыворотки к С-концу должны были узнавать только клеточный c-fos белок, а к N-концу - как клеточный, так и вирусный белки.

Классическими методами синтеза белков в растворе были поручены пептиды N1(6-15),-N2(1-15), 01(371-380) и 02(375-380), соответствующие N- и С- концевым фрагментам гена c-fos (Антоненко и др. 1987, Mikhaleva et al. ,-1987, 1988):

Phe- Asn--Al a- Asp- Туг- Gl u- Al a- Ser- Ser- Phe N1 Met-Met-Phe-Ser-Gly-Phe-Asn-Ala-Asp-Tyr-Glu-Ala-Ser-Ser-Phe N2 Ser-Leu-Ser-Ser-Pro-Thr-Leu-Leu-Ala-Leu C1 Pro-Thr-Leu-Leu-Ala-Leu C2 Пептиды CI, C2, N2 коньюгировали с гемоцианином с помощью водорастворимого карбодиимида за N конец, а пептид N1 - за С конец. В целом, титры антител к С- концевым пептидам были выше (1-104 ), чем к N- концевым (1x10^ ). Пептиды С1 и С2 частично гомологичны, однако при постановке перекрестной твердофазной

иммуноферментной реакции с обоими пептидами, было установлено, что полученные антитела реагируют с разными эпитопами этих пептидов, причем более специфичны антитела к пептиду 371-380._

Полученные антисыворотки тестировали в реакции иммунопреципитации с клетками опухоли щитовидной железы человека С 643 (Mark et al.'',19®* в которых показана экспрессия c-fos мРНК. Обе полученные, антисыворотки осаждали белок р55 , однако лучше реагировали антитела к N-концевому фрагменту, чем антитела к С концу, несмотря на то, что титр последних выше. В литературе описаны антитела к срединному 127-152 (Curran et al. , 1985) и N-концевым фрагментам ( Ramsey et al. , 1984, Adamson etal. , 1985) fos белков. Однако попытка получения моноклональных антител к короткому С- концевому фрагменту c-fos белка оказалась неудачной, при этом специфичность антител тестировали только методом иммунопреципитации (Bplonchini ' et al., 1988 ). Это согласуется с нашими данными о том, что поликлональные антитела к С- концевому фрагменту слабо преципитируют нативный c-fos белок: Скорее всего, причина этого кроется в недостаточной доступности и мобильности С- концевого участка в нативном белке, потому что эти же антитела к пептиду 371-380 хорошо узнают пептид в составе денатурированной молекулы белка при иммуноблоттинге. В пользу этого предположения свидетельствуют данные расчета гидрофильности, по которым 5 С-концевых аминокислот гидрофобны (Антоненко и др. 1988). Метод иммуноблоттинга с применением антипептидных сывороток имеет ряд преимуществ перед. реакцией радиоиммунопреципитации, так как позволяет выявлять только _ белки, содержащие определенную аминокислотную последовательность, тогда как при иммунопреципитации возможно соосаждение белков, находящихся в комплексе с искомым белком, в частности, возможно соосаждение fos-ассоциированных белков ( Franza et al. , 1987).

Одной из наиболее детально изученных моделей, являются клетки феохромоцитомы крысы РС-12, в которых при дифференцировке под действием фактора роста нервов происходит транзиторная активация гена c-fos (Kruifer et al.1985). Экспрессию • продукта гена c-fos. в клетках РС-12 мы тестировали методом иммуноблоттинга. Антитела к С- концевому участку не обнаружили c-fos белок в клетках РС-12, растущих, в бессывороточной среде в отсутствии факторов роста нервов. Однако при добавлении фактора роста нервов из слюнных желез мыши в них уже через 15 мин. начинается синтез .белка с молекулярными массами 36,- 46, 62 и

- 29 - . •

ЭОкДа. Необходимо отметить, что белки с молекулярными массами 62, 36 и 46, 'кДа были обнаружены также в клетках РС-12, обработанных фактором роста нервов и бензодиазепином с помощью антител к срединному фрагменту 127-152 c-fos продукта (Franza et al. ,1987) Белок 62 кДа является, продуктом гена c-fos, а остальные белки гомологичны ему и получили название fos-родственных антигенов - FRA. Эти же белш синтезируются в крысиных фибробластах 208F в присутствии фетальной сыворотки.

Следовательно, антитела к С- концевому декапептиду 371-380 c-fos белка выявляют в клетках РС-12 белки с таким же молекулярным весом, что и антитела к срединному фрагменту 127-152 : c-fos продукт 62 кДа и fos-родственные белки 36 кДа и 46 кДа, содержаще гомологичные последовательности. Кроме того, антитела к С- концевому пептиду выявили также в клетках РС-12 fos-родственный белок 90 кДа, который -ранее в них не был обнаружен. Однако ЭОкДа белок, гомологичный c-fos продукту, обнаружен также в крысиных фибробластах 208F, культивируемых с фетальной сывороткой (Franza-et al , 1987).

Таким образом, впервые было показано, что антитела к С-концевому фрагменту продукта гена c-fos выявляют как сам c-fos белок, так и fos-родственные антигены и значит эти белки гомологичны не только в срединной части, но и в С-концевой последовательности. Впоследствии было показано, что fos-родственные антигены 36 кДа и 46 кДа являются продуктами c-fos родственных генов fra 1 (Cohen, Curran 1988) и fos В (Zerial et al. ,1989 ). Эти гены составляют с геном c-fos семейство генов F0S факторов транскрипции. Анализ структуры их ДНК выявил 70% гомологии, причем к районам высокой гомологии белков относится именно ДНК-связываюший домен (134-207 остатки c-fos белка) и С-концевой район (368-380 остатки). Тагам, образом, С-концевые антитела могут быть использованы для выявления также продуктов генов f'ral (36 кДа) и fos В (46 кДа). Природа белка 90. кДа неизвестно, предполагают, что это модифицированный гликопротеид, гомолс1гичный продукту гена c-fos (Franza et al. 1987).

III. 2. Анализ экспрессии продуктов генов семейства F0S в культурах трансформированных я опухолевых клеток.

В нормальных клетках протоонкоген c-fos активируется, как правило, транзиторно в ответ на действие митогенов и факторов роста (GreenDerg, Ziff 19¿4, Muller et al., 1984, Kruijer et al. , 1984). В частности, экспрессия белка начиналаеь при

переводе крысиных фибробластов 208F из бессывороточной среды в условия культивирования с 20% фетальной сывороткой (Franza et al. 1987). Во многих опухолях, напротив, экспрессия этого гена носит конститутивный характер (Muller 1986). Экспрессию гена fos обычно тестируют по уровню fos мРНК , а работ, в которых исследовали экспрессию белка в культурах клеток очень мало. Спектр fos-родственных белков, которые могут синтезироваться во всех этих • случаях , может быть различен и практически неизвестен. В связи с этим представлялось важным- исследовать экспрессию продуктов генов семейства fos в различных культурах нормальных, " трансформированных и опухолевых клеток в обычных для них условиях культивирования in vitro в присутствии 10% фетальной сыворотки( табл. 3).

Исследования лизатов клеток методом иммуноблоттинга с антителами к С- концевому фрагменту продукта гена с-fos показало, что спектр белков семейства fos различалсяв культурах иммортализованных и опухолевых клеток. Экспрессия гена c-fos не обнаружена в длительно пассируемых in vitro иммортализованных клетках нормальной почки крысы NRK-49 и в иммортализованных крысиных фибробластах Rat-2, что подтверждает сообщения об отсутствии экспросии гена c-fos в клетках нормальных тканей, а также данные о том, что статус иммортализации не связан с активацией гена c-fos (Jenuwein, Muller 1987).

Хотя экспрессия гена c-fos отсутствует в иммортализованных крысиных фибробластах Rat-2, в них выявлена слабая экспрессия белка с молекулярной массой 46кДа. Экспрессия этого fos-родственного антигена значительно • выше в культурах трансформированных клеток Rat-2 МО-3 и Rat-2 МС-5, полученных из клеток Rat-2 при обработке метилхолантреном, однако c-fos белок в • них не появился. Таким образом, синтез fos-родственного антигена может происходить в отсутствии экспрессии гена c-fos и следовательно, эти гены экспрессируются независимо.

Этот вывод подтвердился при исследовании других клеточных систем. В частности, антитела к С- концевому фрагменту выявили fos-родственный антиген 46 кДа также в трансформированных вирусом саркомы Рауса крысиных фибробластах ХС^., тогда как c-fos белок р62 в них отсутствовал. Мы исследовали две сублинии клеток ХС, впервые полученные Я. Свободой в 1961 году, которые поддерживали в разных лабораториях. Обе сублинии клеток ХС^. и

- ZV-

Таблица 3.

Экспрессия продуктов генов семейства FOS в культурах и клонах трансформированных и опухолевых клеток.

Название Происхождение Экспрессия культуры клеток -------------:-----------

клеток c-fos foe-родств. foe

белок белки мРНК

NRK-49 Rat-2 Rat-2 МС-3 Rat-2 МС-5

хск хсм

РС-12

PC-12+NGF LL-

МАС-3

КЛОН Вд

С7 Е.

норм.почка крысы норм.фибробл.крысы крыс.фибр.трансФ. МХ

крыс.фибр.трансФ.ВСР

феохромоцитома мыши

карцин.легкого мыши асцитн.карцин.мыши

Н

HEF-12

HEF-22 .

\С 643 B-5GT " клон 4 " клон 6 " клон 8

10 11

эмбрион.фибр.челов.

эмбрион.фибр.челов.

тиролдн.карцин:чел. остеосаркома чело^.

- - Н.(

- Р46± -

- р46 +

- р46 . +

- р46 +

- - н.<

р62 р46,рЗв,р90 H.I

р62 р46,р36,р75 +

р62 р46,рЗб,р75 +

р62 . р46,р75 +

р62 . р90

р62 р46,р75 ±

р62 р46,р75 +

р62 р46,р75 + 1

р62 р46,р75 -

р55 р46 +

р55) р46 +

р5б' - +

Рб2± р36+ -

н.о. н.о. +

XC.jj . имели трансформированный фенотип и содержали интегрированный провирус саркомы Рауса. Однако оказалось, что fos-родственный антиген 46 кДа продуцировался только клетками сублинии ХС^. и не был выявлен в клетках XC.f^ . Именно в сублинии клеток ХС^. была обнаружена fos-специфическая мРНК методом дот-гибридизации с пробой к вирусному гену fos . Хотя .это не позволяет определить точно, какой из генов семейства fos транскрибируется в этом случае, можно с уверенностью утверздать, что в сублинии клеток XCj{. экспрессируется fos'-родственный белок. Эти данные позволяют сделать вывод, что экспрессия fos-родственного белка 46 кДа возможна в отсутствие экспрессии продукта гена c-fos и может варьировать в сублиниях одной и той же культуры клеток. Следовательно, она непосредственно не связана с индукцией и поддержанием состояния трансформации под действием онкогенных вирусов или химических канцерогенов.

• Экспрессия продукта гена fos с молекулярной массой 55 кДа и fos-родствеНного антигена 46 кДа наблюдалась в культурах клеток HEF 12 и. HEF 22, ■ полученных из 12 и 22 недельных эмбриональных фибробластов человека. Это подтверэдает литературные данные об экспрессии гена c-fos в эмбриональных тканях животных (Muller 1986).

Особое значение имело исследование экспрессии продуктов, кодируемых генами семейства fos в культурах опухолевых клеток и их клонах. При исследовании культуры клеток B-5GT, полученной из опухоли гигантоклеточной остеосаркомы человека и ее клонов было установлено, что в исходных клетках B-5GT и клоне N6, культивируемых как в бессывороточной среде, так и в присутствии фетальной сыворотки экспрессию c-fos белка выявить не удается. В то же время в клоне N4 этих клеток, растущих в бессывороточной среде, имеется слабая экспрессия этого белка, которая усиливается при добавлении сыворотки. Полученные данные свидетельствуют о том, что разные клоны одной и той же культуры опухолевых клеток различаются по экспрессии гена c-fos. Зто подтверждают и результаты исследования fos мРНК: было показано, что другой клон - N8 содержит fos-специфическую РНК в отличие от исходных клеток B-5GT (Grofova et al. , 1987).

Наиболее подробно мы исследовали продукцию c-fos белка и fos-родственных антигенов в культурах опухолевых клеток мышей, полученных Ю. И. Кудрявцом из асцитной карциномы Эрлиха - клетки МАС-3 и карциномы Льюиса - клетки LL. В лизатах клеток из этих

культур антитела к С- концевому фрагменту 371-380 выявляли в иммуноблоттингё^с-fos белок 62 кДа, fos - родственный антиген 46 кДа и белок с молекулярной массой 75 кДа, который содержал гомологичный пептид. Уровень экспрессии этих белков в клетках МАС-3 был одинаково высоким, тогда как в клетках LL экспрессия c-fos продукта превалировала.

Для проверки ранее полученных нами данных о том, что сублинии и клоны клеток могут отличаться по экспрессии продуктов генов семейства fos, мы исследовали такж лизаты клонов клеток МАС-3 (ВЗ, С7, Е6, F5, G10 , НИ ), которые отличались гю ряду биологических свойств: скорости роста, образованию колоний в агаре, туморогенности, метастазированию и т.д. (Кудрявец и др., 1988). При анализе экспрессии мРНК онкогенов обнаружено,что c-fos специфическая мРНК выявляется, хотя и в различном количестве, но во всех клонах клеток МАС-3, тогда как количество с-шус специфической РНК практически одинаково в различных клонах . •

Анализ этих клеток методом иммуноблоттинга с антителами к С-концевому фрагменту показал ,что исходные клетки МАС-3 и все полученные из них клоны синтезируют продукт гена c-fos с молекулярной массой 62кДа. Большинство клонов содержит также fos-родственный антиген 46кДа и, кроме того наблюдается слабая экспрессия белка 75кДа. Исключение составляют клон С7, в котором отсутствует fos-родственный белок 4бкДа, ' но экспрессируется антиген с молекулярной массой ЭОкДа. Таким образом, и в этом случае клоны одной и той же линии клеток, культивируемые в идентичных условиях, ' отличаются по экспресрии fos-¡родственных антигенов. Обращает на себя внимание тот факт, что заметные различия между клонами в экспрессии c-fos мРНК не находят своего количественного ■ выражения в содержании fos-белков. Так в клоне G10 при минимальном содержании c-fos мРНК количество fos - белков не отличается от таковых в других клонах. _

Поскольку нам впервые удалось| получить антитела к С-концевому пептиду, мы сравнили свойства антител к С- и N-концевым фрагментам продукта гена c-fos методом иммуноблоттинга. Установлено,что в клетках МАС-3 антитела к N-концу выявляют только белок с молекулярной массой 55кДа, и не реагируют с белками 62, 46, 75 и ЭОкДа. Аналогичная ситуация наблюдалась с субклоном клеток- ХС{л , в которых С-концевые антитела выявляют fos-родственный антиген 4бкДа и не еыявляют

собственно продукт c-fos гена. Антитела к N-концу c-fos белка вообще не реагируют с белками клеток ХС^. Полученные результаты свидетельствуют о том, что во-первых, нет гомологии в N-концевых районах c-fos белка и fos-родственных антигенов, а во-вторых, в клетках МАС-3 антитела к С-и N-концам реагируют с разными модифицированными формами c-fos белка - 55кДа и 62кДа ( Kruijer et al. ,1984, Muller et al. , 1984), либо с разными белками, гомологичными продукту этого гена по тестируемым последовательностям. Интересно, что в клетках С 643 и HEF 12 и HEF 22 обе антисыворотки выявляли продукт c-fos гена с молекулярной массой 55кДа.

Таким образом, используя антитела к С- концевому участку продукта гена c-fos, нам впервые удалось показать, что существует семейство белков, родственных продукту гена c-fos в С- концевом участке. Судя по молекулярной массе и гомологии С-концевых фрагментов они являются продуктами генов, составляющих семейство генов F0S. В этих fos- родственных белках отсутсвует N-концевая последовательность продукта гена c-fos. Используя два вида полученных нами антител, можно анализировать продукцию собственно c-fos белка. и fos-родственных антигенов.

Экспрессия белкоЕых продуктов генов семейства FOS не характерна для нормальных и иммортализованных клеток (NRK-49, Rat-2) или происходит на очень низком уровне. Высокий уровень экспрессии имеет место в культурах эмбриональных фибробластов (HEF12, HEF22). Активация синтеза FOS белков наблюдается при дифференцировке-клеток под действием ростовых факторов (РС-12), при трансформации клеток опухолеродными вирусами (клетки ХС) и химическими канцерогенами (клетки Rat-2 МС-3, Rat-2 МС-5). Экспрессия FOS белков обнаруживается в клетках опухолей животных (МАС-3, LL) и человека (С 643, B-5GT клон 4). Впервые показано, что может быть дифференцированная экспрессия генов семейства F0S не только в различных линиях нормальных и опухолевых клеток, но и в сублиниях и клонах одной и той же линий клеток.

В результате проведенных исследований был апробирован и отработан метод получения антител, к синтетическим пептидам онкобелков. Критическим является правильный выбор иммуногенного фрагмента на основании аминокислотной последовательности белка.

Наши результаты и анализ публикаций показывает, что при выборе пептида необходимо учитывать профили гидрофильности и вторичную структуру белка, длину пептида, его локализацию в белке и другие свойства (Lerner et al., 1982, Walter, Doolittle 1982, (Niman et al., 1983, Tanaka et al., 1985). Сопосталение данных по . получению антипептидных 'антител и данных рентгеноструктурного анализа показало, что строго специфично с нативным белком реагируют антитела к высоко мобильным участкам молекулы, а антитела к хорошо упорядоченным фрагментам - не узнают белок (Tainer et al., 1984). Сопоставление сывороток к гомологичным пептидам показывает, что различие в одну аминокислоту может быть достаточно, для получения сыворотки с совершенно другими свойствами.

Мы использовали для иммунизации 9 синтетических пептидов к четырем онкобелкам. Антисыворотки к 8 пептидам реагировали с пептидом в твердофазном иммуноферментном тесте, из них 7 узнавали пептид в составе нативной или денатурированной молекулы онкобелка при использовании иммунопреципитации или иммуноблоттинга . Для работы были отобраны 5 наиболее удачных антисывороток к продуктам генов src, myc, fos и sis. Для получения антител существенным является гидрофильность фрагмента, практически все пептиды, за исключением С-концевого к с-fos белку являются гидрофильными. Все пептиды относительно коротки - от 7 до 15 аминокислот, причем 15-ти членный к участку 1-15 c-fos белка менее удачен, чем 10-ти членный к пептиду 6-15. При использовании гомологичных пептидов 371-380 и 375-380 более специфичными оказались антитела к более длинному фрагменту. При прочих равных условиях важным является также способ коньгации (водорастворимый карбодиимид или глутаральдегид), а также то, за какой конец (С или N) пептид коньюгирован с белком носителем. Несомненно важен, но не предсказуем, индивидуальный ответ кроликов. По своей специфичности поликлональные антитела к достаточно коротким пептидам' - 7-12 аминокислот приближаются к моноклональным антителам.

Полученные антисыворотки дают возможность не только тестировать онкобелки биохимическими и иммуноморфологическими методами, но также позволили выявить родственные антигены, содержащие гомологичные пептиды. Особенно важным это оказалось при исследовании fos-родственных антигенов и при изучении белков, содержащих последовательность, характерную для сайта аутофосфорилирования тирозиновых протеинкиназ.

IY. ИССЛЕДОВАНИЕ ОНКОБЕЛКОВ В ОПУХОЛЕВЫХ ТКАНЯХ ЧЕЛОВЕКА Открытие протоонкогенов в геноме человека поставило вопрос об их ' роли в возникновении злокачественных новообразований. Уже в первых работах по экспрессии онкогенов в культурах опухолей человека, культивируемых in vitro (Eva et al. , 1982),' и в препаратах опухолевых тканей ( Татосян и др. 1984, Спитковский и др. 1985, Slamn-et al. ,1984, Tatosyan et al., 1985) было показано усиление экспрессии ряда онкогенов на уровне РНК. Тогда же возникло предположение, что онкогены различаются по уровням их экспрессии в опухолях человека на часто (myc, ras, fos), умеренно (myb, sis, erb В) и редко экспрессируемые или "молчащие" ( ntos, sre) (Tatosyan et al. 1985)

Анализ экспрессии онкогенов в опухолях чаще проводят на уровне' РНК, а исследования онкобелков ограничиваются, г. в основном, продуктами генов туе и ras (Hand et al. , 1984, Jack ''et al., 1986, Lee et al., 1987). Причем, подавляющее большинство работ по анализу активности онкогенов в опухолях сделано на культурах опухолевых клеток, а не на препаратах опухолей, тогда как свойства опухолевых тканей и полученных из них культур клеток, как известно, могут существенно различаться по экспрессии онкогенов (Albino et al. ,1984). Наряду с этим исследования онкобелков в опухолях были . предприняты с целью выявления возможных корреляций между активностью онкогенов и гистогенезом и уровнем дифференцироЕки ткани, прогрессией опухоли, метастазированием и другими характеристиками опухолевого процесса., В частности, было показано, что ' высокий 'уровень экспрессии некоторых онкогенов оказался характерным для незрелых низкодифференциррванных клеток (Miller et al. ,1982, Reitsma 1983), тогда как дифференцировка опухолевых клеток мышей in vitro сопровождается подавлением экспрессии онкогенов (Sejersen et al., 1985). Нам, совместно с Р. Равье, удалось это показать на культурах клеток ■ опухолей человека : в пролиферирующих низкодифференцированных клетках тератокарцином человека Тега I и Тега II выявлена экспрессия большего числа онкогеноЕ ( туе, Ki-ras, fos, abl) и отмечен более еысокий уровень их экспрессии, чем в клетках PAI, имеющих некоторую ограниченную способность к дифференцировке..

Важнейшей предпосылкой ■ для исследований экспрессии онкобелков в . опухолях явились также указания на возможную прогностическую .- роль некоторых онкогенов в опухолях определенного гистогенеза: myc (Yokota et al. 1986,Zborovskaya et al. 1987, Johnson et al. 1987 ), N-myc (Brodeur et al. 1986), erb В (Cline et al. 1987, Fontain et al.1988, Garcia et al. 1989).

Исследование экспрессии онкобелков проводили методом иммуноблоттинга в тканях операционных" биопсий больных раком жедудка (46 образцов), раком легкого (66), раком шейки матки (25), меланомами (29). В ряде случаев помимо препаратов самой опухоли, удавалось . получить макроскопически неизмененные участки ткани того же органа (условно-нормальные ткани), а также метастазы в лимфоузлы (табл.4). Кроме того мы исследовали некоторые другие опухоли (лимфосаркому легкого, злокачественную шванному), а также ткань метастазов от больных различными формами сарком (синовиальной саркомой, фиброзной гистиоцитомой, хемодектомой)- и рака ( пищевода, шейки матки, яичников , кожи, гортани и языка). Наряду с этим были исследованы препараты доброкачественных опухолей - фибромы легкого, узловатого зоба, .экринной поромы, полипов толстого кишечника и неопухолевых заболеванийтуберкуломы лёгкого, псевдоопухоли желудка и хронического воспаления. Всего исследовано 212 препаратов.

IY. 1 Экспрессия белкового продукта гена с-тус.

Синтез белкового продукта гена с-шус в препаратах тканей исследовали с поликлональными антителами к

бактериально-полученному фрагменту 3 экзона • (аминокислоты 228-425 ) вирусного онкобелка v-myc (Bunte et al. , 1984) и с полученными нами антителами к фрагменту 58-67 белка с-шус. И те и другие антитела практически во всех тестированных опухолевых препаратах и метастазах выявляли мощчую экспрессию белков с "молекулярной массой 64-66 кДа, а тккже более слабую двойную полосу белка бОкДа В трех случаях- в препаратах нормальной и опухолевой ткани от больного аденокарциномой желудка, а также в препарате мелкоклеточного рака легкого антитела к белку v-myc выявляли белок с молекулярной массой 37кДа. Мы предполагаем, что в данном случае удалось выявить короткую форму онкобелка -продукта гена L-myc, обнаруженную при- трансляции in vitro

Таблица 4.

Экспрессия онкобелков в тканях различных опухолей

Опухоль Ткань Экспрессия онкобелков

, МУС .РОБ ИАБ БКС БГБ

Карциномы

желудка Перв. 26/26 22/22 11/19 3/23 3/4

Мет. 5/5 3/3 2/4 0/5 н.и.

Усл.норм .15/15 11/14 12/15 1/13 0/1

легкого Перв. 34/37 12/12 17/17 20/33 8/16

Мет. 4/5 н.и. 2/2 2/3 . 1/1

-Усл.норм. .21/24 3/6 6/9 5/24 1/2

шейки Перв. 22/23 6/10 14/17 25/25 1/4

матки

карциномы Мет. 7/9 . 6/6 3/9 0/8 3/4

прочие

Меланомы Перв. 8/8 5/6 1/5 1/6 1/3

Мет. 21/21 18/18 17/19 2/19 9/;2

Саркомы Перв. 2/2. 2/2 2/2 0/2 н.и.

Мет. 5/5 3/4 3/4 1/4 1/3

Доброкачеств. 2/3 3/3 2/3 0/3 н.и.

Полипы толстой 2/2 11/13 13/13 8/13 н.и.

кишки

Неопухолевые 1/3 0/3 , 1/3 0/3 н.и.

заболевания

короткой (2,2кв) мРНК Ь-тус (Бе бгеуе еЬ а1. ' 1988). Ранее этот бедок наблюдали лишь в культуре клеток мелкоклэточного рака легкого (1кедако et а1.1989).

Кроме того,- продукция онкобелка с-туе наблюдалась в большинстве исследованных условно-нормальных тканей жедудка и легких (табл.4 ). Экспрессия с-туе белка обнаружена также в препаратах некоторых доброкачественных опухолей - узловатого зоба, псевдокарциномы желудка, однако не найдена при фиброме и туберкуломе легких.

Полученные результаты подтверждают сообщения, что экспрессия, гена туе ассоциирована с делением клеток и характеризует высокую степень пролиферации клеток в опухолевой ткани (Сатр1з1 еЬ а1. ,1984). Постоянная суперэкспрессия гена с-туе может вызывать клеточное деление и подавлять дифференцировку, таким образом увеличивая пропорцию клеток менее зрелых, . с более высокой способностью к пролиферации (МоеШпд еЪ а1. , 1988).

Таблица .5.

Экспрессия онкобелков при патологии легких по данным иммуноблоттинга и иммуногистохимии

Количество наблюдений

Онкобелки

Рак легкого Регенераторные и

предраковые изменения (имм'уноблоттинг) (иммуногистохимия) (иммуногистохимия )

МУС 34/37 (91,9%) 18/19 (94,7%) 11/37 (29,7%)

КОБ 12/12 (100%) 33/33 (100%) 26/43 (60,5%)

НАБ 17/17 (100%) 25/33 (75,8%) 17/42 (40,5%)

ЭИС 20/33 ( 60, 6%) 19/30 (63,3%) 14/42 (33,3%)

В то же время экспрессию онкобелка с-шус мы наблюдали в большом проценте условно-нормальных тканей, то есть визуально морфологически нормальных участков органов,пораженных опухолью. Это, с одной стороны,' может иметь место за счет присутствия в этих тканях опухолевых клеток с высокой пролиферативной активностью, а с другой стороны указывать на то, что и для нормальной ткани, окружающей опухоль, также характерна высокая степень пролиферации. Более определенный ответ мог быть получен только в иммуноморфологических исследованиях, так как взятый для- молекулярно-биологического анализа препарат не всегда гистологически однороден. В частности, высокий уровень экспрессии гена с-тус был обнаружен в строме опухолей .желудка при иммуногистохимических исследованиях ( УашйюЬо еЬ а1. ,1987) С целью выяснения истинной картины активации онкогенов на уровне опухолевой клетки и сопоставления результатов молекулярно-биологических исследований с морфологической характеристикой опухоли, были! проведены параллельные иммуногистохимические исследования рака легких. При иммуногистохимическом исследовании рака легкого белковый продукт с-тус обнаружен в виде гранул и. аморфного материала в ядрах и цитоплазме опухолевых клеток в препаратах различных гистологических типов . Экспрессия наблюдалась в 95% опухолей

и не выявлена в нормальных эпителиальных клетках . Небольшая экспрессия выявлена в строме рака легкого в очагах десмопластической реакции - в пралиферирующих фибробластах, миофибробластах. В очагах регенерации эпителия .метаплазии и аденоматоза экспрессия выявлена в 29,7% случаев, в основном, в очагах пролиферации с атипией клеток, а уровень экспрессии в среднем был значительно ниже, чем при раке легкого (табл.5).

Таким образом, высокий уровень экспрессии продукта гена с-шус в опухолях человека отражает вырокий уровень пролиферации клеток и может быть связан с прогрессией опухоли.

1У. В. Экспрессия белкового продукта гена с-Гоз.

Данных об экспрессии ■ гена с-Гоэ в опухолях человека на уровне РНК исключительно мало (Спитковский и др. 1985, ТаЬоБуап et а1.-, 1985), а экспрессию белка практически никто ? не исследовал. Экспрессию с-Гоэ белка мы тестировали с антителами ■к И- и С- концевым фрагментам. Лучшие результаты получены с антителами к синтетическому пептиду, соответствующему аминокислотам 6-15. Присутствие продукта с молекулярной массой 55-62кДа выявлено.в подавляющем большинстве опухолей, причем иногда обнаруживалось сразу несколько белков этого размера, по-видимому, различающихся по степени фосфорилирования. Антитела к С- концу выявляли белки с молекулярной массой 62кДа, а также изредка ( примерно в 10% случаев) Гоз -родственный белок 4бкДа.

Однако, уровень экспрессии варьировал в различных тканях. При раке желудка высокий уровень экспрессии зарегистрирован в 60% опухолей. В ряде случаев удалось сравнить экспрессию с-Гоэ белка в препаратах опухоли, условно-нормальной ткани и метастазе рака желудка от одного больного: обычно уровень экспрессии в опухоли и метастазе выше, чем в прилегающей'к опухоли ткани. В меланомах и ее метастазах, а также в

метастазах плоскоклеточного рака уровень экспрессии был относительно низким.

Увеличение синтеза белка ррб2 обнаружено методом иммуноблоттинга также в 100% препаратов рака легких. При иммуноморфологическом исследовании опухолей легких, с-Гоэ белок обнаружен в ядрах клеток паренхимы,часто под кариолеммой в виде гранулярного или аморфного материала Высокая экспрессия отмечена в опухолях с железистой дифференцировкой - бронхиоло-альвеолярном раке, аденокарциноме и железисто- плоскоклеточном

Экспрессия белковых продуктов онкогенов туе, fos, src , ras в первичных опухоляя

( по данным иммуноблоттинга )

ши

на рак легкого

ШИКИ

меланомы

рак желудка

íívj рак шеРки матки

раке, а в мелкоклеточном раке чаще имеется относительно более слабая продукция c-fos белка. Продукт выявляется в небольших количествах и в неопухолевой ткани -чв альвеолярных макрофагах и клетках соединительной ткани. В очагах регенерации метаплазии, дисплазии и аденоматоза экспрессия обнаружена в 60,5% случаев (табл.5). Высокая экспрессия онкобелка коррелирует с высоким уровнем дифференцировки рака, а также более ранними этапами опухолевой прогрессии. По-видимому, c-fos активируется на ранних этапах канцерогенеза, об этом .также свидетельствует тот факт, что усиление экспрессии регистрируется уже на стадии предраковых изменений эпителия ( в очагах пролиферации с атипией клеток ), в то время как в очагах 'регенерации эпителия и в неизмененной легочной ткани экспрессия низкая или вовсе отсутствует .

IY. 3. Экспрессия продуктов генов семейства ras. ■ . Синтез белковых продуктов генов семейства ras исследовали с помощью мышиных моноклональных ■ антител к пептиду, соответствующему аминокислотам 96-118 белка р21 c-Ha-ras .Этот участок консервативен и антитела выявляют также продукты генов c-Ki-ras и N-ras. Продукция онкобелка с молекулярной массой 21кДа была выявлена в большинстве исследуемых опухолевых препаратов (табл. 4), что подтверждает представление о гене ras, как о часто экспрессируемом в опухолях .

Онкобелки 21-23кДа были найдены в 58% препаратов рака желудка и почти всегда в прилегающей условно-нормальной ткани. В ряде случаев онкобелок экспрессировался в условно-нормальной ткани, но при этом не обнаруживался в опухолевой ткани того же больного. Полученные данные могут указывать на то, что онкоген ras в раке желудка активируется на ранних этапах канцерогенеза и его ' постоянная экспрессия не является необходимой для поддержания трансформации. Это подтверждается сообщением о более частой транскрипции гена ras на ранних стадиях развития опухоли- в дисплазиях и метаплазиях (57-63%),чем в первичном раке желудка (38%) (Czerniak et al 1987, 1989). В то же время экспрессия ras белка значительно уменьшена в метастазах рака желудка по сравнению с первичными опухолями (Gallick et al. , 1985). Экспрессию ras белка в прилегающих к опухоли нормальных

. - 43 -

тканях тага® наблюдали ранее при анализе рака желудка(СгегШак et al., 1987, (/Síajima et al., 1989) и кишечника (Hand et al., 1987). Таким образом, наблюдается негативная корреляция между экспрессией гена ras и развитием рака желудка и, следовательно, отсутствие онкобелка ras в препаратах удаленных опухолей может свидетельствовать о запущенности процесса, поздно проведенной операции и плохом прогнозе для больного.

Однако, при исследовании меланом мы обнаружили совсем другую картину. В 17 из 19 случаев (90%) метастазов меланом обнаруживался продукт гена ras,но он выявлен лишь в 1 из 5 случаев первичных меланом. С большой осторожностью можно предположить, что регистрируемое усиление продукции ras белка характерно для метастазирующих клонов клеток меланомы, появляющихся в ходе опухолевой прогрессии. К выводу об усилении экспрессии гена ras с прогрессией 'опухоли пришли и другие исследователи, обнаружившие активацию гена ras в культурах клеток-инвазивных, но не ранних первичных меланом (Albino et al., 1989). Интересно, что в 3 из 14 случаев ( 21%) метастазов меланомы мы наблюдали онкобелок с более высокой подвижностью, . которая может соответствовать продукту гена N-ras. Характерно, . что этот ген активирован в 20% культур клеток меланом (Van't Veer et al. , 1989)

Экспрессия гена ras методом иммуноблоттинга выявлена также в большинстве препаратов рака легкого и прилегающих условно-нормальных тканей (табл.4.). При иммуногистохимическом исследовании опухолей легкого ras продукт обнаруживался на внутренней стороне цитоплазматической мембраны в 75,8% случаев"-и уровень экспрессии колебался в широких пределах! Наиболее низкий уровень экспрессии выявлен в мелкоклеточном .раке легкого, причем отмечена тенденция к усилению синтеза белка при увеличении размеров опухоли и появлении метастазов. В аденокарциномах легкого экспрессия ras белка чаще выявлялась на ранних стадиях прогрессии и не была связана с метастазированием . В очагах регенерации эпителия, метаплазии; ' дисплазии и аденоматоза экспрессия- ras обнаружена в 40,5% случаевL как правило, на более низком уровне, чем в раке легкого (табл.5). В отдельных случаях высокая экспрессия ras белка наблюдалась на стадии предрака в очагах аденоматоза.

- 44 -

IY. 4. Экспрессия продукта гена c-'src.

В отличие от генов myc, fos , ras, онкоген sre, судя по уровню мРНК, относится к числу "молчащих" в опухолях человека ( Tatosyan et al. ,1985). Показало, что экспрессия sre белка характерна для нейронов (Cotton, Brugge et al. , 1983), клеток нейроретины ( Bolen et al., 1985) и отсутствует в большинстве нормальных ' тканей человека. Обнаружено увеличение ферментативной активности sre- белка в нейробластомах (O'Shagnessy et al. , 1987), ' саркомах, карциномах молочной железы (Jacobs, Rubsamen 1983) и толстой кишки (Bolen et al. 1987,Gallick 1987), а также е некоторых культурах клеток мелкоклеточного рака легкого с нейрокринной дифференцировкой клеток (Meilstrom et al.1987).

■ Анализ синтеза продукта гена sre в различных опухолях человека проводили иммуноблоттингом с моноклональными антителами Mab 327 ( Lipsich et al. , 1983). Действительно, в 'большинстве исследованных опухолевых препаратов и в нормальных тканях sre белок. не выявлен (табл.4). При исследовании опухолей желудка очень слабая экспрессия обнаружена в 3 из 23 препаратов, из них в одном случае экспрессия наблюдалась как в препарате опухоли, так и еще в больших количествах в условно-нормальной ткани того же больного. В целом, для рака желудка активация гена sre не характерна, не исключено, что положительный результат наблюдается в опухолях, содержащих атипичные клетки, характерные для рака кишечника, который отличается высокой экспрессий гена sre (Bolen et al., 1987). Онкобелок практически не обнаружен в меланомах, как в первичных, так и в метастазах меланом в лимфоузлы, а также в других опухолях (злокачественной швапноме, синовиальной саркоме, хемодектоме и др.) и метастазах (рака горла, ' коки, гортани, аденокарциномы яичников). Экспрессия sre' белка отсутствовала в доброкачественных опухолях: фиброме легкого, эккринной пороме, узловатом зобе, а также при неопухолевых заболеваниях : туберкуломе и псевдоопухоли желудка (табл.4).

В то же время онкобелок ррбО обнаружен в 20 из 33 препаратов рака легкого и в 2 из 3 исследованных метастазов в лимфоузлы, то есть в 60% случаев(табл. 6). Сопоставление данных

Таблица 6.

Экспрессия его — белка в опухолях легкого человека

Патологический

процесс

Экспрессия с-егс белка по результатам

иммуноблоттинга иммуногистохнмии

НемелкоклеточныЯ рак

Аденокарциномы и бронхиолоальвеолярный рак

Плоскоклеточный рак-.

низкодиФФеренцированный

умеренно и высокодиффе -ренцированный

метастазы

Железистоплоскоклеточный

рак

Крупноклеточный рак

Мелкоклеточный рак

Лимфосаркома

фиброма

Туберкулома

18/31 (58.1%) 8/10 (80%)

9/18 7/9

2/9 2/3

1/2 0/1

2/2 -

0/1 0/1 0/1

(50%)

Условно—нормальная ткань 5/24 (20,8%) легкого

Морфологически неизмененная 0/11 ткань легкого

14/26 (53,8%) 6/10 (60%)

6/11 (54.5%) -3/4

3/7 н.и.

1/2 1/3

4/4

1/1 0/1 0/1

0/44

иммуноблоттинга и морфологических характеристик опухолей показало, что синтез src -белка имеет место в опухолях различных гистогенетических типов : как в мелкоклеточном раке легкого, имеющем нейроэндокринное происхождение, так и в различных формах немелкоклеточного рака легкого - в 80% аденокарци'ном и бронхиолоальвеолярного рака, в железисто-плоскоклеточном раке и в 50% плоскоклеточного рака легкого. Установлено также, что в группе плоскоклеточного рака имеется • тёнденция. к зависимости экспрессии онкобелка от уровня дифференцировки опухоли: в препаратах низкодифференцированного рака экспрессия наблюдалась чаще (7/9), чем в препаратах умеренно и высокодифференцированного рака (2/9) (р<0. 05). При определении протеинкиназной активности src белка в препаратах рака легкого было показано, что ферментативной активностью обладают онкобелки из опухолей различных гистологических типов •рака легкого.

Продукт гена src не обнаружен в фиброме легкого, а также ни в одном из 11 морфологически верифицированных препаратов нормальной ткани легкого. Остальные 13 препаратов условно-нормальных тканей не подверглись гистологическому контролю и среди них оказалось 5 положительных по экспрессии src белка. По-видимому, эти макроскопически условно-нормальные ткани содержали опухолевые клетки.

При иммуногистохимическом исследовании рака легкого с сывороткой TBR продукт гена src располагался в цитоплазме клеток вблизи наружной мембраны в 63% рака легкого и в 33,3% случаев регенерации эпителия, метаплазии, дисплазии и аденоматоза , В группе плоскоклеточного paita высокая экспрессия чаще встречалась среди низко-дифференцированных опухолей, чем среди высоко и умеренно дифференцированных'. Таким образом, наблюдается корреляция в данных иммуноблоттинга и иммуногистохимии, проведенных с разными антителами к src белку.

Помимо рака легкого высокий уровень экспрессии src белка обнаружен во всех исследованных препаратах рака шейки матки, . а также в 60% препаратов от больных с семейным полипозом толстой кишки с выраженной тенденцией к малигнизации.. Общим предшественником эпителиальных тканей этих органов является эпителий первичной кишки и, возможно, активация гена src

связана с нарушением дифференцировки эпителиальных клеток этого типа в результате развития опухоли.

IY. 5. Экспрессия продукта гена с-sis Ген c-sis человека кодирует белок 26 кда гомологичный B-цепи тромбоцитарного фактора роста PDGF (Igarashi et al., 1987). Его транскрип(г и белковый продукт обнаружены в культурах клеток и первичных препаратах меланом, глиобластом, фибро- и остеосарком (Westermark et al. .1986, Shin et al. 1987, Hermansson et al. , 1988), а также' в метастазах меланомы в лимфоузлы (Спитковский и др. 1985) и не выявляются в нормальных тканях. мРНК c-sis была выявлена в 5 из 11 культур клеток немелкоклеточного рака легких (Kiefer et al. ,1990).

Исследование белкового продукта гена c-sis проводили с помощью антител к пептиду, соответствующему аминокислотам 201-210 вирусного онкобелка р28 . Экспрессия белка с молекулярной массой 26 кДа выявлена в одном из трех случаев первичных меланом и в большом количестве метастазов меланомы и других опухолей в лимфоузлы.. Методом иммуноблоттинга■ в опухолях легких этот белок обнаружен в 50% случаев. При иммуноморфологическом исследовании опухолей легких c-sis белок обнаружен в цитоплазме клеток, а также в отдельных случаях и в ядрышках . Экспрессия наблюдалась в 84% случаев рака легкого, в небольших количествах в строме опухолей, эндотелии новообразованных сосудов и в альвеолярных макрофагах. В очагах регенерации эпителия, метаплазии, дисплазии и аденоматоза снкобелок обнаружен в 21% случаев Таким образом, продукт гена c-sis достаточно широко встречается в опухолях и, по-видимому, играет' важную роль в пролиферации опухолевых клеток определенных гистологических типов. Кроме того экспрессия c-sis белка характерна для эндотелиальнЫх клеток (Hermanäson et al. 1988) и в связи с' васкуляризацией опухолей в них усилен аутокринный синтез этого белка.

Полученные данные свидетельствуют об увеличении синтьза продуктов онкогенов в опухолях по сравнению с нормальными тканями. Экспрессия онкобелков наблюдается при иммуноморфологическом исследовании уже на стадии предрака , однако на более низком уровне и в меньшем проценте случаев, чем в опухолях. Складывется впечатление, что экспрессия некоторых онкогенов (myc, fos) не связана с гистолоческим типом ткани, хотя уровень экспрессии в опухолях различных органов варьирует. В то же время экспрессия других онкогенов (src.sis) имеет определенную зависимость от гистогенеза опухоли. В частности, экспрессия src белка характерна для нервных клеток и, по-видимому, для опухолевых тканей , происходящих из эндотелия., первичной кишки. Канцерогенез является многостадийным процессом и участие онкогенов в отдельных его этапах изучено мало. Можно думать, что одни онкобелки активны преимущественно на ранних этапах (fos, ras), а другие важны для прогрессии опухоли (myc, sis, src). Некоторые онкобелки могут синтезироваться в разных опухолях на разных этапах канцерогенеза, так ras, по-видимому, активируется на ранних стадиях в раке желудка и аденокарциноме легкого, и на более поздних-в меланомах-и мелкоклеточном раке легкого. До сих пор трудно сказать в каких случаях наблюдаемые изменения активности онкогена являются причиной процесса, а в каких - следствием его, в последнем случае экспрессия онкобелка ras, возможно, является следствием уже развивающегося процесса трансформации. Хотя механизмы возникновения и поддержания трансформированного состояния многообразны nórвидимому, все же в опухолях одного гистогенеза, находящихся на одном и том же уровне дифференцировки и стадии опухолевой прогрессии чаще всего активируются определенные онкогены. Дальнейшее изучение синтеза и распределения белковых продуктов онкогенов в различных опухолях человека представляется перспективным в плане выявления корреляций в активации онкогенов с гистогенезом и прогрессией опухоли и может найти применение в будущем при диагностике опухолей и построении прогноза.

- 49 -: ВЫВОДЫ

1. Апробировар метод получения антител к синтетическим фрагментам онКобелков. Получены и охарактеризованы антитела к различным, ранее- не использовавшимся, участкам молекул продуктов генов myc, fos, sre, sis. Полученные антитела позволяют выявлять онкобелки в культурах клеток и рпухолевых тканях методами иммунопреципитации и иммуноблоттинга .

2. Сравнительное изучение продукта гена sre и структурных белков вирусов сарком кур в различных типах пермиссивных и непермиссивных клеток показало,- что во всех типах трансформированных клеток имеется ферментативно-активный продукт гена sre. Во всех непермиссивных клетках млекопитающих, трансформированных , ВСР, нарушен- процессинг предшественника структурных белков вириона - Рг76 . Вирогенные хелперзависимые клетки содержат дефектные провирусы ВСР,что выражается в синтезе дефектных белков гена gag в хомячковых клетках Н-12, Н-14, либо в полном отсутствии продукта гена env в крысиных клетках TWERC.

3. Вирус саркомы кур ■ Д6, выделенный из опухоли, индуцированной диметилбензантраценом, отличается от вируса саркомы Рауса необычными размерами структурного - р19 и трансформирующего - рр65 белков, что, скорее всего, является результатом включения части клеточного генома в геном вируса

4. Получены антитела от кроликов с опухолями, индуцированными смесью вирусов сарком кур (сыворотка TBR-D). Проведено сравнительное изучение, некоторых свойств продукта гена v-src с помощью антител к домену аутофосфорилирования (415-421) и сыворотки TBR, изучена протеинкиназная активность' sre белка в разных типах клеток. Установлено, что эти два типа антител узнают разные эпитопы в молекуле онкобелка. Sre .белок фосфорилирует иммуноглобулины сыворотки TBR, но не антипептидной сыворотки к фрагменту 415-421. Показано, что закрытие сайта аутофосфорилирования не мешает проявлению протеинкиназной активности sre белка и, следовательно, этот участок не входит в - проуеинкин&зной домен . Показано существование клеточных протеинкиназ, гомологичных sre белку по домену аутофосфорилирования. Sre - белок ассоциирован с мембранной фракцией клеток и находится в комплексе с клеточными фосфобелками - наиболее вероятными мишенями его действия.

5. С помощью антител к С- и концевым фрагментам с-Гоэ белка впервые показано существование Гоз-родственных антигенов, гомологичных с-Лэг белку в С концевой части ( ЗбкДа, 46кДа, 75кДа 90кДа). Эти белки не содержат И-концевой домен с-Гоэ белка. Изучена экспрессия продуктов семейства РОБ в различных типах клеток: нормальных, иммортализованных, эмбриональных, трансформированных и опухолевых. Показана независимая экспрессия продуктов различных генов семейства РОЭ. Установлено, что экспрессия белков семейства РОБ может различаться, в сублиниях и клонах одной и той же линии клеток.

6. Проведен анализ экспрессии онкобелков в опухолевых тканях человека различного гистогенеза. Показано увеличение синтеза продуктов онкогенов в опухолях по сравнению с нормальными тканями. Установлено, что экспрессия генов туе и Гоз не зависит от гистологического типа опухоли. Высокий уровень экспрессии гена с-туе обнаружен в опухолях различной морфологии и отражает высокий уровень пролиферации клеток. Экспрессия гена с-Гоз наблюдается практически в большинстве опухолей человека различного гистогенеза, но количественный уровень экспрессии невысок.

7. Показано, что онкоген зге не является "молчащим" в опухолях человека и экспрессия его белкового продукта связана с дифференцировкой и гистогенезом опухолей. Бгс белок экспрессируется не более чем .в 10% опухолей желудка и не обнаружен в меланомах и ряде других опухолей. Впервые обнаружена экспрессия гена гге в препаратах рака легких , установлено,что эге белок экспрессируется в 60% опухолей легких различного гистогенеза и не только в - мелкоклеточном раке нейроэндокринного происхождения, но и в различных -типах немелкоклеточного рака легкого. В группе плоскоклеточного рака легкого экспрессия зге белка коррелирует с более низким уровнем дифференцировки. Впервые показана экспрессия гена эге в опухолях шейки и тела матки, высокий уровень экспрессии гге белка отмечен в 100% опухолей этой локализации. Экспрессия зге белка отмечена также в 60% полипов толстого кишечника , имеющих тенденцию - к малигнизации. Высокая экспрессия гена зге в опухолях легких, шейки матки и кишечника, по-видимому, связана с общностью гистогенеза эпителиальных тканей этих органов.

. - 51 -

8. Экспрессия' продуктов генов семейства ras отмечена в большинстве .^опухолей человека различного гистогенеза. Принципиальные различия обнаружены в экспрессии ras белков в первичных опухолях и метастазах. В метастазах карцином различных'локализаций ras белки экспр&ссируются реже .(30-50%), чем в первичных опухолях (60-100%). Напротив, в меланомах экспрессия ras белков обнаруживается лишь в небольшом числе первичных опухолей, но выявлена в 90% рецидивов и метастазов в лимфоузлы. Полученные данные позволяют - предполагать, что ген ras, в карциномах активируется на ранних этапах канцерогенеза и его постоянная. экспрессия не обязательна для прогрессии опухоли. В то же время в меланомах усиление продукции газ белка характерно, видимо, для метастазируюших клонов, появляющихся в ходе прогрессии опухоли.

9. Показано, что антитела к синтетическим пептидам и сыворотка TBR выявляют онкобелки в иммуноморфологических исследованиях. Изучена экспрессия и получена хорошая корреляция в результатах анализа продуктов генов myc,' fos, src, ras, sis в препаратах опухолей легкого различного гистогенеза методами иммуноблоттинга и иммуногистохимии. Полученные антитела могут быть применены в иммунопатологических исследованиях в условиях клиники.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мазуренко ЕЕ "Структура и свойства белков ретроЕирусов типа С" Вопр. вирусол. , 1980, N6, с. 644-654. •

2. Мазуренко Е Е , Асанова А. А. ,. Свобода Я "Gag, env и src специфические белки вируса саркомы Рауса в опухолевых клерках крыс и хомяков".. Сб. "Вирусный канцерогенез и 'его молекулярно-биологические аспекты", Москва, 1981, с. 22-23.

3. Киселев Ф. JL , Галецкий С. А. , ' Мазуренко H Е , Асанойа А. А. , Зборовская НЕ., Тополь JL 3. "Молекулярно-биологические критерии функционирования генома вируса.саркомы Рауса в трансформированных крысиных, клетках ХС" Мол. биология, 1^82,т. 16,N1,с. 66-76.

4. Grofova М. , Forch'aimier J., Мз^игепко N.N. "Two cellular proteins that are precipitated by an antitumor - RSV rat serum" . Neoplasma, 1982, v. 29, N6, p. 641-653.

5. Mazurenko N.N.., Asanova A.A. , Svoboda J. , Kissel jov F. L. "Expression of R5Y -specific proteins in RSV-transformed mammalian cells" Folia biologica, 1984, v. 30, N3, p. 259-269.

6. Мазуренко Н. Е , Федоров С. И , Боговский Б. IL , Князев IL Г., Сейц И. Ф., Киселев Ф. Л. "Исследование вирус-специфических белков в клетках, трансформированных вирусом саркомы кур Дб" Экспер. онкология, 1986, т. 8, N1, с. 18-21.

7. Татосян А. Г. , - Амбарцумян Е С., Тополь Л. 3., Мазуренко Е Е "Плазмида, содержащая фрагмент генома вируса саркомы Рауса, трансформирует клетки мышей и экспрессируется в Е. coli." Мол. генетика, микробиология,вирусология,1986,N1,с. 18-22.

8. Мазуренко К'Н. , Эмануэль-Равье Р., Киселев Ф. Л. "Экспрессия протоонкогенов в клеточных' линиях тератокарцином человека"

. Доклады АН СССР, 1986, N1. с. 231-233.

9. Мазуренко ЕЕ , Сенюга ЕВ., Мазуренко ЕЕ "Активация гена с-шус при Т-клеточном лейкозе, мышей ", Тезисы докладов IV Всесоюзного сьезда онкологов, Л-д, 1986, с.560-561. ■

10. Mikhaleva I. I., Antonenko V. V. , Prudchenko I. А. , Mazurepko N.N. Synthesis and immunogenic properties of peptides, corresponding to the 200-210 sequence of 28 sis oncoprotein. ' Comparative study of N6-protecting, groups. Abstr. European peptide Symposium. Greece, 1986, p. 121-122

11. Мазуренко H-EЭмануэль-Равье P., Киселев Ф. JL ■ "Исследование протоонкогенов в клетках тератокарцином человека" Доклады АН СССР, 1987, т.292, N4, с. 986-988,

12. Антоненко Е В., Лрудченко К А. , Михалева Е Е , Мазуренко Е Е, Киселев Ф. Л. "Синтез и иммуногенные свойства пептидов участка 200-210 последовательности онкобелка р28 sis". Биоорган, химия, 1987, т. 13, N10, с. 1301-1313.

13. Мазуренко Е Е , Гладкова Т. И., Михалева И. И. , Антоненко В. В., Прудченко И.' А., Киселев Ф. Л. "Получение и характеристика антител к синтетическим фрагментам онкобелков. 1. Антисыворотки к трансформирующему белку вируса саркомы шерстистых обезьян р28 sis". Шл." биология, 1987, т. 21, N4, с. 972-980.

14. Mikhaleva I. I. , Antonenko V. V. , Prudchenko I. A., Mazurenko N.N. "Synthesis and antigenic properties of peptides corresponding to 200 - 210 sequence of p28 sis oncoprotein. Comparative study of NG-protecting groups". "Peptides 1986", 1987, Walter de Gruyter & Co, Berlin, New York, p. 569-572.

15. Mazurenko N.N. , Gladkova Т. I. , Kissel jov F. L. "Use of antipeptide sera to sis , fos, src products for the analysis of oncoproteins in transformed cells". Abstr. XYII Meeting European Tumor Virus Group-, Dresden, 1987, p. 10.

- 53*16. Ambartsumyan N. S. , Nalbandyan N. G. , Topol L. Z. , Mazurenko N. N. , Tatosyan A. G. "Plasmids, containing' fragments from Rous sarcoma virus gijnome, transform mouse cells and are expressed in E. coli cells''^ Abstr. XII Meeting European Tumor Virus Group, Dresden, 1987, p. 98.

17. Кудрявец Ю. It .Киселева H. П. .Спитковский Д. Д. .Мазуренко R R " Экспрессия онкогенов в клональных линиях опухолевых клеток.с различным биологическим поведением" в кн: "Метастазирование злокачественных опухолей, новые подходы", Киев, 1987, с. 73-74.

18. Мазуренко R R , Сенюта R Б. , Гладкова Т. И. , Мазуренко Н. П. "Экспрессия протоонкогенов у мышей с лейкозом, вызванным вирусом Мазуренко". Бюлл. экспер, биол. мед. 1988, N1, с. 71-74.

19. Мазуренко R R , Тищенко В. А., Виноградов Е А., Киселев Ф. Л. "Получение и характеристика антител к синтетическим фрагментам онкобелков. II. Антисыворотка к трансформирующему белку вируса саркомы кур Рауса ррбО ". Мол. биология, 1988,т. 22, N3, с. 844-852.

20. Mikhaleva I. I. , Antonenko V. V. , Prudchenko I. A., Ivanov V. Т. , Mazurenko N. N. , Kissel jov F. L. "Synthesis and biological properties of antigenic fragments of p28 sis and p55 fos oncoproteins". J. Cell. Biochem. , 1988, 12B, p. 61.'

21. Mazurenko N. N. , Kissel jova N. P. , Kudryavet2 Y. I. , Zborovskaya I'. В., Kisseljov F. L. "The fos-related antigens have similarities to fos in the carboxy-terminal region". Abstracts of Fifth annual meeting on oncogenes. Frederick,Maryland, 1989,p. 74.

22. Амбарцумян R С., Налбандян R Г. .Мазуренко R R ,Татосян А. Г. "Транскрипция и экспрессия в Е. coli клонированных последовательностей гена src вируса саркомы Рауса..'; Мол. биология 1989, т. 23, N1, с. 127-134.

23. Мазуренко R R , Киселева R П. , Кудрявец Ю. и. "Экспрессия продукта гена c-fos и fos-родственных антигенов в культурах опухолевых клеток." Тезисы докладов .Всесоюзной конференции по генетике соматических .клеток в культуре, Москва, 1989, с. 23.

24. Комиссарова Е. В., Спитковский Д. Д., Мазуренко R R , Татосян А. Г. "Действие онкогена Ha-ras на клетки, иммортализованные геном большого Т-антигена вируса полиомы". Мол. генетика, микробиология, вирусология", 1990, N 2, с.19-22.

25. Mazurenko N. N. .Antonenko V. V. .Mikhaleva I. I. .Kissel jova N. P. Kudryavetz Y. I. "Detection of fos-related antigens with antibodies-to C-terminal sequence of c-fos protein." Abstracts "tolecular factors of hematopoiesis and stem cell", Moscow, 1990,p. 100.

26. Mazurenko N., Zborovskaya I., Nesterova I., Kogan E. , Kisseljov F. "Immunoblot analysis of oncoproteins in different human tumors". J. Tumor Marker Oncology, 1990, v. 5, N3,p. 248.

27. Kogan E. , Mazurenko N. , Yushkov P. "Immunochistochemistry of oncoproteins in precancer and human lung cancer" J. Tumor Marker Oncology, 1990, v. 5, N3, p. 212.

28. Мазуренко a E, Киселева E E , Кудрявец Ю. К , Михалева И. И. , Антоненко В. В. , Киселев Ф. Л. "Белки опухолевых клеток, выявляемые с помозфю антител к С и N-концевым фрагментам продукта прото -ог-гогйка fos." Мол. биология, 1990, т. 24, N5, с. 1351-1362.

Z'j. Ма-л!гепко N. .Zborovskaya I.,Kogan Е., Mikhaleva I. .Antonenko V. Kisseljov F. "Мус, fos and src oncoproteins in human lung and stomach cancer". Abstr. First Meeting Molecular Basis of human cancer, Frederick, USA, 1990, p. 84.

30. Mazurenko N. .Kogan E. , Zborovskaya I. .Koenig S. .Ephymova E. , Sukhova N. .Kisseljov F."pp60 src activation in human lung cancer". Abstr. Sixth annual meeting on oncogenes. Frederick, USA,1990, p. 368.

31. Коган E. A. , Мазуренко EE, Юшков ЕЕ, Тришкина EE, Киселев Ф. JL "Иммуногистохимия клеточных онкогенов при предраке и раке легкого". Архив патологии, 1990, т. 52,- N 8, с. 3-11.

32. Antonenko V. V. , Prudchenko I. А., Mikhaleva I. I. , Mazurenko N. N. , Kissel jov F. L. "Dotection of cellular proteins by sequence specif ic antisera " J. Cell. Biochem. 1990, 14C, p.234.

33. Mazurenko N. , Zborovskaya I. , Nesterova I. , Kogan E., Kisseljov F. "Analysis of oncoproptein activation in human tumors". Abstr. XVIII Meeting of the oncodevelopmental proteins and clinical applications. Moscow, 1990, p. 69.

34. Мазуренко E E , Зборовская И. Б., Нестерова И. В., Сухова Е М., Коган Е. А. .Киселев Ф. JL "Экспрессия белкового продукта протоонко-гена с-src'в опухолях человека". Докл. АН СССР , 1991, т. 316, N5, 1245-1249.

35. Коган Е. А., Секамова С. М., Мазуренко Е Е , Богатырев В. Е " "Периферический мелкоклеточный рак и карциноиды легких". Архив патологии, 1991, N. 7, с. 42-48.

36. Мазуренко Е Е .Коган Е. А. .Сухова Е М. .Зборовская И. Б. "Синтез и распределение онкобелков в опухолевых тканях". Вопр. мед. химии, :. Л. N. 6.