Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Молекулярная природа повреждений онкогена HRASI в карциномах молочной железы и легких человека

Министерство здравоохранения РФ

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОНКОЛОГИИ им. проф. Н. Н. ПЕТРОВА

На правах рукбписи

БАБЕНКО Виктор Иванович

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ПРИРОДА ПОВРЕЖДЕНИЙ ОНКОГЕНА НИАБ! В КАРЦИНОМАХ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ЛЕГКИХ ЧЕЛОВЕКА

Специальность: 14.00.14 — Онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1992

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте онкологии им. проф. Н. Н. Петрова Минздрава РФ.

Научные руководители:

доктор медицинских наук П. Г. Князев, доктор медицинских наук Е. И. Шварц

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук М. Л. Забежинский, доктор медицинских наук, профессор В. С. Гайцхоки

Ведущее научное учреждение: Институт проблем онкологии им. Р. Е. Кавецкого АН Украины.

Защита диссертации состоится « . . , ».......... 1992 г.

и «... » часов на заседании Специализированного совета НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова (189646, Санкт-Петербург, Пе-сочный-2, Ленинградская ул., 68).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « . . . »......... 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор медицинских наук

Е. В. Демин

¡Актуальность проблемы. Новейшие данные теоретической и эк. спе^ментальной онкологии свидетельствуют о том, что рак у че-^ тдэДОвека и жиютных является молекулярно-генетическим заболева-Sál'iBgl^Cairns ¿et al. ,1981.1983; Князев П.Г. и др. ,1986;). Глубинные патогенетические процессы при онкогенезе прежде всего развертываются на уровне геномной ДНК и сводятся в основном к точковым мутациям. (Сгосе С.M et al., 1985.1987;, Сейц И.Ф., Князев Е Г. ,1986). Это генетическое событие (при недостаточности систем естественной репарации, регуляции экспрессии генов и межклеточных взаимодействий) необратимо, что и обуславливает необратишй характер явления малигниэации на уровне генома клетки.

Наиболее убедительные экспериментальные данные о роли специфичных точковых мутаций в активации лротоонкогенов были получены при сравнительном анализе генов семейства RAS, выявленных при трансфекции опухолевой ДНК нормальных клеток. У представителей этой группы генов во всех типах опухолей с разной частотой мутации затрагивают 12 или 61 кодоны (Santos E.et al.

. ,1983; Yuasa Y. et al. ,1984). Цутацня в 13, соседнем с 12, ко-доне протоонкогена HRAS1 (замена глицина аспарагином или сери-ном) так» приводит к трансформирующая активности этого гена (Fasano Q.et al. ,1984).

Исходя из вышеизложенного, в дисг ртационной работе планировалось изучить частоту присутствия точковых мутаций в "горячих" кодовая онкогена HRAS1 в карциномах молочной железы и легких, как в. наиболее распрострайенных неоплазмах у человека Необходимость проведения такого исследования подкрепляется и тем обстоятельством,-что по данным литературы этот вопрос оставался малоизученным, поскольку методы выявления точковых мутаций в генах чрезвычайно сложны технически и дороги.

Анализ работ показывает, что между генетическими повредде-ииями, в нашем случае между делениями аллелей и точковыми му. тациями в оставшемся адлеле онкогена HRAS1» возможна взаимосвязь (Князев II Г. и др. ,1990,1991). С учетом этого, в данной работе также планировалось проверить ранее сформулированную гипотезу ó,неслучайной (направленной) элиминации дикого аллеля • онкогена HRAS1 в процессе прогрессии опухолевых признаков у человека. Подобные генетические события в клетке могут быть "раэнесеньГ. во времени: точкс.вая мутация в одном из аллелей -раннее событие,-возможно связанное с инициацией канцерогенеза, а делеция дикого аллеля - позднее, ассоциированное с злокачес-

твенной трансформацией, что блестяще подтверждено в экспериментах на животных, а именно раках кожи у мышей, индуцированных метилхолантреном (ВаЬшп А. е1 а1.,1989).

Кроме того, обнаруженные мутации в онкогене НКА21 с помощью рестрикнионного картирования с последующим секьенирова-нием могли определить варианты замен нуклеотидов в горячих кодонах и расширить наши представления о механизмах активации этого протоонкогена.

Дель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение молекулярной природы повреждений онкогена НЯА51 в карциномах молочной железы и легких человека

В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи:

- осуществить широкий скрининг присутствия точковых мутаций в горячих кодонах онкогена НЯА51 в карциномах молочной же-леэы и легких человека, а также для сравнения с другими опухолями - в раках, толстой кишки, щитовидной железы и яичника;

- провести анализ наличия мутаций в 12 и 61 кодонах онкогена Н!?А51 для проверки гипотезы направленной утраты дикого аллеля в некоторых образцах ДНК карцином легкого и молочной железы, содержащих один аллель этого гена, и установить взаимосвязь мелщу указанными генетическими событиями; . .

- определить первичную структуру фрагментов онкогена ША31, имеющих точковые мутации, для выяснения характерных вариантов замены нуклеотидов в кодонах, ассоциированных с превращением протоонкогена в онкоген;

.- оценить прогностическую значимость делеций и точковых мутаций в аллелях онкогена НКА31 при развитии карцином молочной железы и легких у человека

Научная новизна и практическая значимость полученных результатов. В результате, выполнения диссертационной работы впервые решены следующие важные в теоретическом и практическом плане вопросы:

- получены новые плазмиды рВБ-1 и рВБ-2, несущие 1" и 61-ый кодоны онкогена НГ?А31, позволяющие проанализировать у1са-занные последовательности;

- определена частота точковых мутаций в горячих кодонах онкогена НРА51 в карциномах молочной железы (3 гетероэигсты по мутации в 12 кодоне из 57 образцов ДНК) и яичника (1 гетерози-гота по мутации в 12 кодоне из 3 образцов ДНК) (табл.);

- отмечено, что делеция одногс из аллелей онкогена №А51 в

исследуемых карциномах не сопровождается демаскированием мутаций в 12, 33 и 61 кодонах протоонкогена Н(?А31, следовательно утрата короткого плеча 11 хромосомы в отношении этого онкогена не является случайным событием;

- установлен вариант замены нуклеотидов в 12 кодоне, ответственных за активацию онкогена ИЯА31, сопровождающейся трансверсией Г - Т (ГГЦ -ГТЦ) в ДНК опухолевых клеток карцином молочной железы и яичника, что, в свою очередь, приводит к замене в белке р21-Н1?А31 в 12 положении амитнокислоты глицина на валин.

Диссертационная работа в целом представляет собой теоретическое исследование. Полученные результаты имеют важное значение для понимания роли точковых мутаций в канцерогенезе у человека, с одной стороны, другой - способствуют разработке мо-лекулярно-биологических методов определения прогноза развития неоплазм. Несомненно в будущем такие подходы будут также использоваться в диагностике злокачественных новообразований у людей.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав: материалы и методы, результаты и обсуждение, заключения и выводов. Работа' иллюстрирована 8 таблицами и 26 рисунками. Библиографический ук; ¡атель включает публикации на русском и английском языках.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на симпозиумах: советско-американском - ''Ретровирусы, онкогены, регуляция экспрессии белков", США, г. Сиэттл, 1989, сентябрь; советско-французском "Ретровирусы и молекулярная онкология", г. Рига, 1991, октябрь и всесоюзном - по биохимии опухолевой клетки, г. Минск, 1990, ноябрь, а также на заседании совместной научной конференции лабораторий: молекулярной генетики, биохимии, экспериментальных опухолей, эндокринологии, онкоиммунологии, химических канцерогенных агентов, предклини-ческих испытаний, органического синтеза и фармакологии, пато-логоанатомии с прозектурой, научно-технического отдела НИИ онкологии им,, проф. Н.Е Петрова МЗ РФ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Биопсийный материал карцином-молочной и щитовидной желез, легких и яичника человека для генетического анализа были любе-

- б -

вно предоставлены научными сотрудниками из хирургических отделений Института онкологии имени проф. Я Н. Петрова: Д.М.Н. Гуляевым А.В. ,. к. м. н. Васильевым Б.R . к.м.н. Матвеевым ЕЕ. н к.м. н. МоисеенкоЕМ. Препаративная ДНК перечисленных неопла-зий, а также рака толстой кишки получены от руководителя настоящей работы д. м. н. Князева IL Г.

Ферменты рестрикции: Bain HI, EcoRl, Ifepl, Mval, Pstl, Alul поставлены НПО "Фгрменг" г. Вильнюс и ИЮ "В?ктор" г. Бердск.

Олигонуклеотидные праймеры для 12 (Б'-GGCAGGAGACCCTGTAGGAG - sense,5' -GTATTCGTCCACAAAATGGTTCT-antisense) И 61 (б'-ACCGGA-AGCAGGTGGTCATT-sense, 5'-CTGTAGTGGTQGATGTCCTC-anti sense) кодо-нов онкогена HRAS1 синтезированы в Институте биоорганической химии имени M. М. Шемякина АН РФ и предоставлены д.х.н. Бердяным Kl А.

Термостабильная ДНК-полимераза выделена из некоторых штаммов микроорганизмов Thermos : thernophilus, охарактеризована и частично дана для проведения экспериментов О. К. "Кабоевым. Клонирование, праймер-эависимая амплификация, рестрикционное картирование и прямое секвенирование проведены на базе Ленинградского института ядерной физики имени R П. Константинова АН РФ в группе в. н. с. Е. И. Шварца ( лаборатория молекулярной генетики ОМРБ). _

Иолимеразная цепная реакция (ГОР) - амплификация ДНК, pec- : трикционный анализ и электрофорез. АмплиФикаШш ДНК проводилась в 100 мкл смеси, содержащей 67мЫ трис-HCL рН 8,8; 16,6мМ сульфат аммония; б,7мЛ хлорид магния; 10мМ 2-меркаптоэтанол; 170.мкг/ мл EGA; 4 dNTP (по 1мМ каждого); два лраймера (каждого в количестве 0,1-0,3 мкг) и 0,1-1 мкг ДИК. Денатурация нитей ДНК производилась 7 мин. при 97 С, отжиг - 2 мин. при 55 О, затем добавлялось S единицы полимерами из Thernos thernophilus. Синтез ДНК осуществляли при 72 С в течении 4 мин. Последующие циклы выполнялись автоматически со следующими параметрами: 1 мин. - 92 С (денатурация), 1 мин. - 55 С (отжиг) и 2 мин.- 72 С (синтез)/ После 30 циклов амплифицированная ДНК проверялась электрсфоретически в 6Z ПААГ, соотношение акрила-мида к бис-акриламиду соответствовало 29:1. В дальнейшем амп-лификаты подвергались рестрикционноиу анализу. Для этого в смесь полимеразной цепной реакции добавляли 1-3 единицы активности соответствующего фермента, например, Ktepl, Mvalmw Pstl и производили гидролиз при температуре 37 С от 2 до 3 час. Рестрикционные фрагменты разделяли электрофоретически в 82 ПА-

AT.

Радиоактивное мечение олигонукяеотидов (праймеров). Синтетические олигоьуклеотиды фосфорилировали по 5'-концу в реакции переноса -фосфата с ( -32Р) АТР на свободный 5'-ОН конец оли-гонуклеотида. Реакции проводили в 30 мкл смеси, содержащей 50мМ трис-HCL, рН 8,0; ЮмМ хлорида магния; 15мМ ДТТ; 25-50 мкКи ( -32Р) АТР с удельной активностью 37 Пбк/моль (Институт ядерной физики, г.Ташкент); 0,1-0,3 мкг соответствующего олигонук-леотида и 5-10 единиц полинуклеотидкиназы фага Т4 (Яермент, г. Вильнюс). Реакционная смесь инкубировалась 30 мин. при температуре 37 С, Для оценки включения 1 мкл смеси наносили на фильтр ДЕ-81 ( SERVA,Германия), а затем промывали 50 мл раствора О.йМ хлорида н-.трия. Среднюю удельную радиоактивность зонда и продуктов его расщепления для секвенирования определяли на счетчике "Delta 300" (Searle,Австрия).

Определение первичной нуклеотидной последовательности амп-лифицированной ДНК методом Максама-Гилберта. В случае использования химического метода секвенирования ДНК, производят мечение одного из ее рангов, частично расщепляют по каждому из четырех оснований в четырех(пяти) различных реакциях, продукты разделяют по размеру с помощью электрофореза в плоском полиак-риламиднсм геле и последовательность определяют с радиоавтографа, отмечая при этом, какой из специфичных к основанию агентов расцепил цепь по очередному нукл зтиду.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выявление точковых мутаций в онкогене HRAS1 в ДНК клеток рака молочной железы (РМИр. Для анализа первичной нуклеотидной последовательности протоонкогена HRAS1 и возможного обнаружения мутаций в 12, 13 и 61 кодонах, приводящих к превращению его в онкоген, были амплифицированы соответствующие фрагменты клеточных ДНК, изолированных из 57 РМЖ (табл.). Среди указанных ДНК опухолей присутствовали 8 образцов с делеция-ми одного из аллелей этого гена.

Первоначально был исследован фрагмент онкогена HRAS1, содержащий .1 зкзон. С помощью полимеразной цепной реакции, используя праймврн на 12 кодон (ем. "Материалы и методы исследования") и ДНК-полимеразу из T. thernx>phi lus, получили фрагменты длиной 145 п, и. (рис.1, дорожка 1). Как известно (Capon D. J. et al. 19831. в этих участках ДНК имеются 2 М*р1-сайта

рестрикции (С С03), из которых первый от 5'-конца (нуклеотиды 1645-1648 интрона 1) постоянный, а второй (нуклеотиды 32-35 экзона 1) -.при мутации изменяется. Поэтому в данной ситуации возможны следующие варианты. В первом - в случае отсутствия точковой мутации во 2 Мзр1-сайте рестрикции при гидролизе амп-лифицированного участка онкогена Н1?А51 образуются 3 Фрагмента: 64, 56 и 25 п. н. (см. рис. 1, дорожки 2-4).

X ч» — » ч м ч о-

Рис. 1. Гидролиз рестриктаэой амплифицмрованньа последовательностей онкогена №ЛБ1 ДНК РШ, содержащих 12- ый кодоны, без точковых мутаций.

Сверху показаны маркер (М) - р5Рб4/Мзр1 и обаацы ДНК -РМЖ: 2б(амплификат), 26, 27, 41 - соответствующие амплифи-каты после расщепления реетриктазсй Шр1; слева - размеры фрагментов маркера; справа - размеры амллификата (145 п. о.) и продуктов его расщепления эндонуклеазой М5р1 (64, 56 и 25 п. п. ); внизу - порядковые номера маркера и проб.

Во втором

при наличии мутации во ? №ь-р1 -сайте рестрикции в

двух нитях ДНК выявляются 2 фрагмента: 120 и 2Б п. н. (данные не приводятся). В третьем - присутствие мутации во 2 Ktepl-сайте лишь только в одной нити ДНК образуются 4 фрагмента: 120, 64, 56 и 25 п..н. - гетерозиготы по мутации в 12 кодоне (рис. 2, дорожки 1-4).

Рис.2. Гидролиз амплифицированных фрагментов онкогена Н(?А31 ДНК РМЖ реетриктаэой Мзр1, имеющих в одной нити му-тантный 12-ый кодон.

Сверху показаны номера образцов ДНК РМЖ; справа - размеры продуктов расщепления амплификатов эндонуклеазой М*р1: 1?0,64,5б и Яб п. о.; внизу - порядковые номера проб: 1-РШ 101, 2-РЯ, 3-РМЖ 179, 4-ГШ 352. Размеры фрагментов маркера соответствовали рис. 1 и здесь не приводятся.

Рестрикционный анализ имеющихся образцов ДНК показал, что в случае точковой мутации в горячем кодоне протоонкогена НЯА31 Г например, замена в 12 кодоне ГГЦ(йСС) на ГЩСТС)] изменяется его первоначальна Функция. РбеРпечиваюдая, как свидетельству-.

1 2 3 4 П. В.

ют литературные дачные, трансформацию мышиных клеток Н1Н ЗТЗ (Тарагоюзку Е. еЬ а1. ,1982).

Образцы ДНК РМЖ (101, 179 и 352) с выявленными мутациями в 12 кодоне онкогена НЯА31 при рестрикционном анализе были про-секвенированы по методу Максама-Гилберта [рис. 3(РМЖ 101)].

\ 12 № соЛ>п

\

3'

Рис. 3. Первичная нуклеотидная последовательность участка онкогена карциномы молочной железы человека (препа-

рат N101), включающего 12 кодон.

Слева 2 стрелками показан 12 кодон в диком аллеле -93С( ГГЩ, а справа одной - позиция убыли гуанина и появления тимина (в процентах; дорожаТ/С) при мутации в другом аллеле Ггетерозигота по 12 кодону - С5ТС(ГТШ). Сверху указаны ориентация фрагмента (3', 5') и варианты химического растепления ДНК ча основания^, в/А, Т/С,С).

Как видно ка рис. 3 результаты прямого секненирования подтвердили молекулярный деффект протоонкогена HRAS1, заключающийся в замене в одной нити последовательности 12 кодона ГГЦ(СОС) на ТТЦ(СТС) С трансверсия T(G) - Т(см. габл. ), гетерозигота!, которая проявилась на авторадиограмме уменьшением количества гуанина (до 6.5Х), дорожки G, G/A. Одновременно, на дорожке Т/С наблюдалось появление сигнала, свидетельствующего о присутствий тимина (до 35%) в 12 кодоне.

Кроме того, секвенирование других препаратов ДНК; РМЖ179 и 352 с мутацией в 12 кодоне онкогена HRAS1 показало аналогичные варианты замен нуклеотидов (см. табл. ), что, теоретически, приводит к изменению в 12 позиции белка р21 аминокислоты глицина на валин.

Таким образом, из 57 препаратов ДНК РШ нами обнаружено 3 образца (101,179 и 352), содержащих мутации в 12 кодоне онкогена HRA31 в одном аллеле - гетерозиготы (см. рис. 2, дорожи 1-4).

В дальнейшем, в 50 образцах ДКК РМЖ той же выборки больных, был изучен статус 61 кодона онкогена HRA51 (табл.). С помощью ЩР (последовательности праймеров приведены в "Материалах и методах исследования") синтезировали Фрагменты размером 172 п. н. , содержащие 2 экзон онкогена (рис. 4, дорожки 3,4). Ш-лученные фрагменты, как известно из литературных данных, содержали по 2 Mval-сайта рестрикции ССС( )GG] с номерами нуклеотидов 54-58 и 69-73, из которых первый от 5'-конца онкогена постоянный, а второй, в случае мутации изменяется (Capon D.J. et al. ,1983). Поэтому при рестрикционном анализе амплифициро-ванной последовательности возможны следующие варианты: в первом - в случае наличия обоих Mval-сайтов рестрикции образуются 3 фрагмента: 109, 48 и 15 п. н. ; во втором - присутствие только одного Mval-сайта (первого) выявляет 2 фрагмента: 124 и 48 п. н. ; в третьем - если первый Mval-сайт был в обоих, а второй - лишь в одной нити ДНК, наблюдаются 4 Фрагмента- 124,К®, 48 и 15 п. н. (гетерозиготы по указанному кодону). В нашем исследовании наблюдались 3 фрагмента: 109,48 и 15 п. и. (см. рис. 4, дорожки 1,2), т.е. л анализируемой пос.п»повательностн онкогенп точковой мутяини ле обнчруж'но.

о. «л

^ Ш 1X1 ш

Ю 10 Л <11

____ * *

Г?> х: £: £ зс.

и.о. а а о.

15

>ч1

Ч* 1 » Иг,; т

/ 1 \ >

'•«Г» " .

ЙЛ

Г'" ( . АЗЙ!

. ■ •

Ч Л,«,

М 12 3 4

- 48

■15

ПО

Рис.4. Рестрикционный анализ амплифицированных фрагментов, содержащих 61-ый кодон онкогена Ш?А31 ДНК рака молочной железы, эндонуклеазой Муа1.

Сверху показаны маркер и образцы исследуемых ДНК; слева - размеры фрагментов маркера; справа - размеры амплифи-катов (172 п.о.) и продуктов их гидролиза (109,48 и 15 п. о. ); внизу - порядковые номера маркера (М - р5Р64/Мзр1) и проб: 1-РМЖ 65/Муа1, 2-РМЖ бб/Ша1, 3- РМК65, 4-РМЖ 66.

Таким образом, определение точковых мутаций в горячих ко-донах онкогена Н(?А31 позволило установить следующее: во-первых, мутации обнаружены только в 12 кодоне в образцах ДНК с наличием обоих аллелей онкогена; во-вторых, в случае мутации в 12 кодоне, в другом (61) таковой не отмечено; в-третьих, все установленные точковые мутации характеризуется одним типом замен, а именно: трансвереи^ й Г( Я! - Т.

2. Поиск точковых мутаций в онкогене . Ш?А31 в ДНК клеток рака легкого (РЛ), рака толстой кишки (РТК), рака щитовидной железы (РЩЖ) и рака яичника (РЯ). Поиск точковых мутаций в 12 кодоне онкогена Н1?А51 осуществлен в 39 образцах ДНК РЛ, в 13 кодоне - в 1 и в 61 кодоне - в 42 (см. табл.). Кроме того, в их числе былч 2 образца ДНК с делениями одного из аллелей этого гена. Для этого анализа использована тактика, описанная выше в 1 разделе. С помощью ПЦР получили амплифицированные фрагменты, содержащие 12 кодон, размером 145 п. н. При рестрикционном ана-.шзе этих участков ДНК посредством эндонуклеазы Мзр1 мутации не обнаружены.

Фрагмент онкогена НЯА31 РЛ57, содержащий делению одного из аллелей, размером 145 п. н. просеквенирован по Максаму-Гилбер-ту, что показало отсутствие мутации в 13 кодоне этого гена.

При анализе 61 кодона, входящего во 2 экзон протоонкогеиа НГ?А51, посредством рестрикционного картирования точковые мутации не выявлены. Секвенирсеание указанных последовательностей подтвердило отсутствие в нем нуклеотидных замен (рис.5).

5'

Н/Ы/61 РЛ 57/ 61

с с- =г =г

— © 1 © 1 «а :: № ©

«и. •о г С9 С®

о» 65% ш ! «и» «а* ш Ш

* - » \ ш баз 11 ФЙВР щ Ш

1 2 3 Ч 5 6 7 8

Рис. 5. Определение первичной последовательности нуклеоти-дов амллиФтшропанннх фрагментов, втслючантих 61-ый кодок

- 14 -

онкогена НЯА51 ДНК рака легкого.

Справа стрелкой показаны кодоны-ЦАТ (в 5'-3' ориентации); вверху - номера образцов ДНК; НЛ34/61 (норма), РЛ57/61 (рак легкого) и их варианты химического расщепления по основаниям (Г,Г+А,Ц+Т,Ц); Б'-З' - ориентация концов фрагментов гена слева внизу и оправа вверху; внизу - порядковые номера доролвк.

Кроме того, ряд образцов ДНК [3-РТК,3-Р1ЩК и 3-РЯ (табл.)], в которых имелась деления одного из аллелей онкогена НЯА31 (Никифорова И. Ф. , 1991), были ив учены на присутствие мутаций в 12 и 61 кодонах. Мутации в указанных кодонах не выявлеяы. Лишь в единственном случае РЯ обнаружена мутация в 12 позиции этого гена в одной из нитей ДНК - гетерозигота (см. рис. 2,дорожка 2; табл.), все остальные - не содержали изменений в нуклеотидных последовательностях горячих кодинов.

Таким образом, анализ мутаций в горячих кодонах онкогена Ш?А51 РЛ, РТК, РЩ и РЯ показал, что делеции его аллелей не сопровождаются точковыми мутациями в оставшихся аллелях. Обнаруженная мутация в 12 кодоне указанного гена лишь в одном случае РЯ свидетельствовала о том, что активация этого онкогена в указанных опухолях является исключительно редким событием.

пжя течяоаи иплшя в -горячит каквах гиогеяа №51 в дан маличных зтаичкггвгиж автлм г чисвгад

КОЛЙЧЕСТ- 1ЮЛГВ- ОНВСГЁН НЧЛ51 ЗАИР~ 11Ш ОПЛЫВ ВО ОБРАЗ- С7В0 »ГДЕ- ЗАШЯА АШГГ-пов днк »таим дата осжм- гасд>

Таблица

юлов вот дак тн

РАН лпвго эд

и 13

е!

ш ихючяя шеы

67

Ю

3

глицин

1« эг - яте «а и.ти 01

рак оповга-НЖ ЖЕЛЕЗЫ 3

3

11

61

РАР. толггого яизрчняка

з

3

II

В1

ГЛ1 ЯГШ1 э 3

и

в1

пяс - зтс г.иая чл

' -15 -

Как видно из таблицы в результате рестрикционного анализа онкогена HRAS1 в ДНК РЛ, РШ, РЩй, РТК и РЯ точковые мутации обнаружены только в 12 кодоне в 3 образцах PMS и 1 - РЯ (все случаи - гетёрозиготы по указанному кодону с одинаковым типом замен последовательностей ГГЦ( GQC) наГТЦ(бГС), приводящие теоретически к изменению аминокислотного состава в белке р21, глицина на валин). Учитывая небольшое количество изученных образцов ДНК РЯ (3 случая), заключение о частоте и вариантах точковых мутаций в этой позиции онкогена JiRASl сделать невозможно.. Из этих данных также следует, что повреждение 12 кодона при PMS встречается с частотой около 5,3%, следовательно - моют1 быть расценено как редкое событие.

X X

х

Результаты анализа онкогена HRAS1 по выявлению повреждений в иуклеотидных последовательностях горячих кодонов, 12, 13 и 61, свидетельствуют о присутствии точковых мутаций лишь в 3 образцах карцином молочной келезы из 57 и в 1 - яичника из 3 исследованных (гетёрозиготы по 12 кодону), сопровождавшиеся трансверсией Г - Т. Частота мутаций в случае PMS составила 5,32. При этой в число других ДНК без мутаций в онкогене HRAS1 входят 15 образцов с делецияюг одного из его аллелей изученных нами РШ, РЛ, РЩЯ и РЯ Спектр мутаций в этом гене PMS выглядит ины», если рассмотреть все семейство RAS как у человека, Так и у животных. Интересное заключение приводят на этот счет КосМЛг C.F.et al. ,(1989). Авторы установили, что на модельных системах канцерогенеза, а именно у крыс, достигших половой зрелости, химический канцероген индуцирует карциномы молочной яелезы, которые по своей гистологической характеристике весьма сходны с РНЗ у человека. 85% карцином молочной железы у крыс содержали активный в трансфекции клеток NIH ЗТЗ онкоген HRAS1, имго&ий мутацию в 12 кодоне (Barbacid Н , 1987).

Более того, многие исследователи считах®, что активные, мутантные онкогены семейства RAS* вероятно, являются патогенетической причиной ряда злокачественных заболеваний (инициации канцерогенеза) или прогрессия опухолевых признаков у человека (Pawson Т., 1987). Онкобелок P21-RAS, по-видимому, принимает участие в передаче митогенного сигнала, опосредованно через пока неидентифицированные ростовые факторы в трансформирован-

ных клетках. При этом клеточная линия РМЖ с активным онкогеном HRAS1 приобретала независимость от эстрагенов (Kasid A. et al.» 1985).

При анализе образцов рака легкого мы не выявили точковых мутаций в 12, 13 и 61 горячих кодонах онкогена HRAS1. Если говорить в целом об активации онкогенов семейства RAS в неопла-эиях легкого, то есть публикации, подтверждающее наличие мутаций в онкогене KRAS2 при этом заболевании. Bos J. L. (1989) изучил группу немелко.клеточных РЛ, среди которых были аденокарци-номы, плоскоклеточный рак и крупноклеточная карцинома. Предполагается, что данные опухоли происходят из общего предшествен^ ника - клетки Сронхиолоальвеольного эпителия (Gazdar A. F. et al. , 1983). При анализе этих опухолей мутации обнаружены в онкогене KRAS2 только в аденокарциноме (Rodenhuis S. et al. , 1988). Частота их составила 33% и почти все мутации затрагивали 12-ый кодон.

В процессе изучения ДНК карциномы яичника нами также выявлена точковая мутация в 1 случае (гетерозигота по 12 кодону онкогена HRAS1) из 3 изученных с делениями одного из диких аллелей. Изменений в нуклеотидных' последовательностях в 61 кодо-не не обнаружено, не найдены они и в обеих рассматриваемых позициях HRAS1 гена в 3 образцах ДНК рака толстой кишки и в 3 -рака щитовидной железы (табл.).

Приведенные данные свидетельствуют о том, что мутации в онкогене HRA31 являются редким событием. Однако, в целом, в онкогенах семейства RAS, их частота значительно выше и средний процент по ним колеблется от 15 до 30% (Barbacid М. ,1987; Bos J. L. ,1988,1989). В специфических опухолях преобладание изменяется от менее 5£ - при болезни Ходжкина (Steenvoorden А. С. М. et al. ,1988) до 90Х - при раках поджелудочной железы (Almoguera С. et al. ,1988).

Таким образом, как показано в нашей работе и других исследованиях, точковые мутации в онкогене HRAS1 в РМВ, РЛ, FTK. РНЩ и РЯ - встречаются редко. Вдавлено только 4 мутации в указанном онкогене (гетерозиготы по 12 кодону) из имеющегося банка ДНК указанных карцином. Это свидетельствует о том, что феномен злокачественной' трансформации клеток, опосредованный активацией онкогенов и инактивацией супрессорных генов, ассоциирован с точковыми мутациями, частота и механизм возникновения которых при многостадийном процессе канцерогенеза у человека требуют дальнейшего даучелля.

выводы

1. Получены 2 новые плаэмиды: рВБ-1, рВБ-2, несущие последовательности 1, 2 экзонов, соответственно, содержащие 12, 61-ый кодоны онкогена №А51, пригодные для анализа мутаций и метилирования указанных экзонов гена в ДНК нормальных, а такжэ опухолевых клеток человека.

2. Осуществлен поиск точковых мутаций в 12 кодоне онкогена Н1?А31 в 57 образцах ДНК клеток карцином молочной железы, 39 -легкого, 3 - толстой кишки, 3 - щитовидной железы и 3 - яичника Гетерозиготные точковые мутации з указанном кодоне онкогена выявлены в 3 случаях рака молочной железы, что соответствует 5,3%, и в 1 - рака яичника.

3. Мутация в 12 кодоне (ГГЦ) протоонкогена №А31 в 3 препаратах ДНК клеток рака молочной железы и 1 - рака яичника сопровождалась трансверсией Г - Т, что свидетельствует о его превращении в онкоген. Это, в свою очередь, приводит к изменении в онкобелке р21 аминокислоты глицина на валии.

4. По данным амплификации ДНК ¡п у^го, а также рестрикци-онного картирования и прямого секвенирования точковые мутации в 13 и 61 колонах онкогена НЯА51 в изученных карциномах (50 образцах молочной железы, в 42 - легкого, в 3 - толстой киши, в 3 - щитовидной железы и в 3 - яичника) не обнаружены.

5. Точковые мутации в 12, 13,; и 61 кодонах онкогена НЯА31 не являются обязательным событием для злокачественной трансформации клеток эпителия молочной железы и легких у человека

6. Элиминация одного из аллелей онкогена Н!?А51 в ДНК клеток карцином молочной" железы и легких у человека не сопровождается демаскированием мутаций в 12, 13 или 61 кодонах протоонкогена НПА31, следовательно указанное генетическое событие не ассоциировано с механизмом его превращения в онкоген, а также прогрессией опухолевых признаков.

7. Учитывая низкую частоту мутаций в горячих кодонах онкогена НЯА31 в ДНК опухолевых клеток карцином молочной железы у человека, оценить прогностическую и диагностическую значимость подобного генетического повреждения для развития этих неоплазм не представляется возможным.

X X

X

Выражаю сердечную признательность научным руководителям работы: д. м.н. ИГ. Князеву и д.м. н. Б.К. Шварцу, а также чл. -

кор. АМН РФ проф, К.П. Хансону за ценные советы и критические замечания при обсуждении результатов; коллегам по отделу моле. кулярной онкологии; д. б. н. Е А. Лаяцову, 0. К Кабоеву, А. Е Алексееву и А. А. Голъцову (ЛИЯФ им. ЕЕ Константинова, ОМРБ) ва методическую помощь в отдельных экспериментах; Ю. А. Берлину и 0. Е Плуталову - аа синтез праймеров для ВДР.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Князев П. Г. , Серова О. М., Бабенко Е И. и др. Молекулярная природа повреждений онкогена Н1?А31 в карциномах молочной железы: трансверсия 3 -Т в 12 кодоне одного алделя при делеции

. другого алледя. Виорганическая химия, 1990, т. 16, N3, с. 419.423. ■. У

2. Князев П. Г.Никифорова И. Ф., Серова 0. Ы. , Плухникоэа Г. Ф., Бабенко Е И., Берлин Ю. А., Шварц Е. И. Малекулярно-генетическая природа повреждений онкогена Н(?А31 в карциномах человека. Всесоюзный симпозиум по биохимии опухолевой клетки, Минск, 1990, ноябрь.

3. Князев И Г., Серова 0. Ы.Никифорова И. Ф., Плужникова , Г. Ф., Бабенко Е й, и др. Двуликая роль Н1?А31 онкогена в канцерогенезе человека Советско-французский симпозиум "Ретровирусы и молекулярная онкология", Рига, 1991. октябрь.

4. Князев П. Г., Суворов А. Н., Серова О. Ы. , Голубков ЕЙ., • Плухникова Г. Ф., Максимишина М. Г.Бабенко Е И. и др. Рекомби-

нантная плазмидная ДНК рНЙА51 Т^-З. кодирующая последовательность онкогена Ш51 карциномы щитовидной железы человека, и способ ее конструирования. Авторское свидетельство, 1991, N 4872379/ 13/069986/.

Тип. ¿/С.тър Ь<спл7"с.