Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Влияние изменений активности р53 и генов семейства ras на стабильность кариотипа иммортализованных и опухолевых клеток человека и грызунов

КБ ОД

о, t № ^ i ■

На правах рукописи

АГАПОВА Лариса Степановна

ВЛИЯНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ АКТИВНОСТИ р53 И ГЕНОВ СЕМЕЙСТВА ras НА СТАБИЛЬНОСТЬ КАРИОТИПА ИММОРТАЛИЗОВАННЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И ГРЫЗУНОВ

(Специальность 14.00.14)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1998

Работа выполнена в НИИ канцерогенеза ОНЦ РАМН, директор НИИ канцерогенеза - академик РАЕН Д.Г. Заридзе, директор ОНЦ РАМН - академик H.H. Трапезников.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Б.П. Копнин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.Г. Татосян доктор биологических наук Д.А.Крамеров

Ведущая организация:

Медико-генетический центр РАМН

Защита диссертации состоится ^^ 99g г

на заседании специализированного Ученого Совета (К.001.17.01) при ОНЦ РАМН (Москва, 115478, Каширское ш., 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОНЦ РАМН.

Автореферат разослан it^t-O-iSL- ] 99g r

Ученый секретарь специализированного Ученого Совета доктор медицинских наук, профессор B.C. Турусов.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность проблемы

Опухолевый супрессор р53 играет ключевую роль в регуляции клеточного цикла, апоптоза, репарации ДНК и некоторых других фундаментальных процессов жизнедеятельности клетки. В связи с этим неудивительно, что нарушения его функции являются наиболее универсальным изменением в различных новообразованиях человека. Согласно общепринятым представлениям, повреждения р53 ведут к инактивации охранных механизмов, предотвращающих размножение клеток, в которых уже произошли или могут произойти различные генетические изменения, в том числе и онкогенные. Так, недавно было показано, что нормальное функционирование р53 препятствует пролиферации клеток, содержащих активированные онкогены семейства ras [Serrano et al., 1997]. Вызываемая аномалиями р53 генетическая нестабильность является движущей силой неуклонной опухолевой прогресс™, детерминирующей появление и отбор все более и более агрессивных клонов. Между тем, детальные механизмы возникновения нестабильности генома при различных нарушениях р53 во многом остаются неясными. В частности, остается невыясненной роль р53 в предотвращении изменений числа хромосом. Неясны и генетические последствия кооперативного действия аномалий р53 и экспрессии активированных онкогенов семейства ras - события, которое также довольно часто наблюдается в различных новообразованиях человека.

1.2. Цель н задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение роли различных нарушений функции р53 и активации онкогенов семейства ras в возникновении генетической нестабильности. Было запланировано решение следующих экспериментальных задач:

1. Определить влияние экспрессии экзогенных р53 с мнссенс-мутациями в кодонах 175, 248 и 273 - наиболее частыми повреждениями р53 в различных

новобразованиях человека - на частоту возникновения числовых и структурных изменений хромосом в человеческих клетках с нормальным статусом эндогенного р53.

2. Изучить генетические последствия инактивации р53 по доминантно-негативному механизму и исследовать эффекты, возникающие при подавлении функции различных доменов белка р53.

3. Проанализировать влияние экспрессии активированных онкогенов семейства ras на частоту возникновения различных генетических нарушений и функциональную активность чекпойитов клеточного цикла в клетках с нормальным и инактивированным р53.

1.3. Научная новизна и практическая значимость работы.

В настоящей работе впервые показано, что экспрессия р53 с характерными для опухолей человека мутациями (Trp248, His273, His 175) приводит к увеличению частоты хромосомных разрывов в пролиферирующих клетках и появлению клеток с дополнительными хромосомами. С помощью клонального анализа, подобного тесту Луриа-Дельбрюка, продемонстрировано, что в популяции человеческих клеток линии LIM1215 темп индуцированного мутантными р53 появления гипердиплоидных вариантов составляет примерно 10° на клетку на генерацию. Обнаружено, что подавление активности р53 дикого типа путем трансдукции в клетки генетических супрессорных элементов, также как и экспрессия мутантных р53, увеличивает вероятность появления в делящихся клетках самых разных генетических нарушений - гетероплоидии, незарепарированных разрывов хромосом и рекомбинаций ДНК, приводящих к генной амплификации. При этом впервые показано, что последствия супрессии различных частей белка или мРНК р53 неодинаковы: спектр и/или частота генетических нарушений при ингибировании функциональной активности олигомернзационного домена были выше, чем при подавлении функции трансактивационного и ДНК-связывающего доменов. Обнаружено, что экспрессия активированных онкогенов N-ra.v и Н-ra.v также может вызывать

разнообразные генетические изменения, однако вероятность их появления определяется функциональной активностью р53-зависимых сигнальных путей в ras-трансформированных клетках. Впервые продемонстрировано кооперативное действие нарушений функции р53 и экспрессии онкогенов ras, приводящее к инактивации Gl- и 02-чекпойнтов клеточного цикла и отмене запрета на вход поврежденных клеток, соответственно в S фазу и митоз.

Результаты проведенной работы способствуют лучшему пониманию механизмов опухолевой прогрессии, что является важным для создания принципиально новых методов лечения злокачественных новообразований.

1.4. Апробация работы.

Диссертация апробирована 17 марта 1998 года на совместной научной конференции лабораторий цитогенетики, генетики опухолевых клеток, механизмов канцерогенеза, регуляции клеточных и вирусных онкогенов. Материалы диссертации докладывались на 1-ом Съезде Онкологов стран СНГ, Москва, 1996; 27th Annual Meeting of the Europian Society of Human Genetics, Мюнхен, 1995; American Association of Cancer Research Conference «Inducible Genomic Responses», Портленд, 1996; Joint ISRES-AACR symposium «Cancer and Cell Cycle», Лозанна, 1996; 9,h p53 Workshop, Крит, 1998.

1.5. Публикации.

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1 Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, содержи 11 таблиц и 21 рисунок. Состоит из введения, глав: обзор литературь материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждени полученных результатов и выводов. Список литературы содержит 38 источников, в том числе 8 отечественных.

2.2. Результаты

2.2.1. Влияние мутантныхр53 на стабильность кариотипа клеток ЫМ121.

Чтобы изучить влияние экспрессии р53 с миссенс-мутациями в кодона 175, 248, и 273, которые чаще всего обнаруживаются в различны новообразованиях человека, на частоту появления клеток с различным аномалиями кариотипа, мы транедуцировали соответствующие формы кДНК р5 человека в клетки LIM 1215, характеризующиеся высокой кариотипическо стабильностью и сопоставили влияние их экспрессии на частоту митотическн клеток с числовыми и структурными изменениями хромосом.

Анализ полученных индивидуальных клонов и массовых культур клето LIM1215, конститутивно экспрессирующих р53 с миссенс-мутациями в кодона 175, 248 и 273 показал, что транедукция мутантных р53 сопровождаете увеличением частоты хромосомных разрывов в митотических клетках (Рис.1) появлением в популяциях гипердиплоидных вариантов с 47-53 хромосомам (Рис.2). Экспрессия экзогенного р53 дикого типа не вызывала таких эффекта (Рис. 1, 2).

Наряду с анеуплоидией, экспрессия некоторых мутантных р5 увеличивала в клетках LIM 1215 вероятность эндоредупликации, т.е. повторно репликации всего хромосомного набора в течение одного клеточного цикла (Рш 3). Метафазы с цитологическими признаками эндоредупликации были выявлен! в большинстве клонов, экспрессирующих мутантный p53-Hisl75, тогда как пр анализе контрольных культур такие метафазы были выявлены только в одном и клонов (Табл. 1).

| % метафаз с разрывами

35 и

пео 175 248 273

Рис. 1. Частота хромосомных разрывов в сублиниях клеток ЫМ1215, экспрессирующих различные формы экзогенного р53 1115273, Тгр248) или только селектируемый ген то. (Приведены суммарные результаты двух экспериментов, в каждом из которых анализировали не менее 75 метафаз для каждой группы опыта).

í

p53wt

(n = 1 25)

43 44 45 46 47 4в 49 БО 51 52 53 43 44 45 46 47 4в 49 50 51 52 53

Рис. 2. Распределение околоднплоидных клеток по числу хромосом i сублиниях клеток LIMI215, экспрессирующих различные формы экзогенной р53 (wt, His 175, His273, Trp248, His 194) или только селектируемый ген neo. (I каждой культуре проанализировано 150-200 метафаз).

V/' И Л5 . V- ~ <ч 1? ^ ^ ^

/г}н-".V «Г* f ^

и. « " * -

Рис. 3. Метафазы клеток клонов 1215/175-3 и 1215/175-5, демонстрирующие эпдоредупликацию всего хромосомного набора в текущем клеточном цикле.

Табл. 1.

Доля метафаз, демонстрирующих эпдоредупликацию в индивидуальных клонах, несущих мутантный р53 (р53-ЬПз175) или пустой вектор рРЯ/пео

N6 культуры Метафазы с эндоредупликацией, %

рР5/пео р53-Шз175

1. 0 (1319)' 0,1 (1121)'

2. 0 (1078)' 0,4 (1064)1

3. 0 (732)' 0 (797)1

4. 0,6 (1655)' 0 (1256)'

5. 0 (1305)' 0,2 (869)'

6. 0 (1749)' 0 (784)'

1 В скобках указано число проанализированных клеток

Полученные данные наводили на мысль о том, что, по крайней мере некоторые из мутантных р53, могут увеличивать вероятность отмены запрета на вход в следующую Б-фазу в клетках, в которых не произошла сегрегация хромосом, реплицированных в предыдущем клеточном цикле. Чтобы проверить это предположение, мы сравнили частоту индуцируемой колцемндом полиплоидии в культурах ЫМ1215, экспрессирующих или не экспрессирующих мутантные р53. При обработке колцемндом в течение 48 час. количество полиплоидных метафаз в сублиниях с экзогенными мутантными р53 возрастало в 1,5-4 раза, тогда как в сублинии ЫМ/пео оно практически не изменялось. (Рис. 4). Так как нами было показано, что экспрессия экзогенных мутантных р53 не изменяла чувствительность клеток ЫМ1215 к цитостатическому действию колцемида, можно заключить, что в клетках с мутантным р53 при воздействии колцемида действительно увеличена вероятность появления пролиферирующих полиплоидных клеток.

iJá

neo 175 248 273 Колцемид

Рис. 4. Влияние экспрессии мутантных р53 на частоту индукции полиплоидии колцемндом в популяции клеток линии LIM 1215.

Обработка колцемндом (Sigma, 0,02 мкг/мл в течение 48 час.) вызывала статистически достоверное (Р<0,01) увеличение числа полиплоидных клеток в сублиниях, экспрессирующих экзогенные мутантные p53-Hisl75, р53-Тгр248 и р53-Il¡s273, но практически не влияла (Р>0,1) на частоту полиплоидов в контрольных клетках 1215/пео. (Представлены суммарные результаты трех экспериментов).

% полиплоидных клеток

30

25 20 15 10

lili

neo 175 248 273 Контроль

Изменение реакции клеток, экспресснрующих мутантный р53, на обработку колцемидом было подтверждено при РЛСБсап-анализе сублиний 1215/пео и 1215/273. При инкубации с колцемидом в течение 48 часов в культурах, экспрессирующих мутантный р53 -11 ¡э273, обнаруживалась существенная фракция клеток с уровнем плоидностн >4п, тогда как в контрольных культурах 1215/пео, содержащих пустой вектор ШО/пео количество высокоплоидных клеток практически не изменялось (Рис.5).

Очевидно, в клетках с нормальным статусом р53 существует жесткий запрет на вход в Б-фазу клеток, в которых разрушены микротрубочки и/или произошло нерасхождение хромосом во время митоза. Экспрессия мутантного р53, по-видимому, уменьшает эффективность работы такого защитного механизма, вследствие чего часть клеток, не завершив митоз, тем не менее входит в новый раунд репликации ДНК, который в следующем митозе может быть зафиксирован в виде типичной цитологической картины т.н. эндоредупликации хромосом (Рис. 3). Следует, однако, подчеркнуть, что большинство клеток в культурах, экспрессирующих мутантный р53, даже после довольно длительного культивирования в присутствии колцемида имело тетраплоидный геном, т.е., не завершив митоз, не вступали в Б-фазу (Рис. 5) Вероятно, экспрессия мутантного р53, хотя и ослабляет, но полностью не отменяет работу защитных механизмов, т.н. чекпойнтов клеточного цикла, ингибирующих переход из 00/01 в Б при разрушении микротрубочек и нерасхождении хромосом во время митоза.

Суммируя результаты всех вышеизложенных экспериментов можно было заключить, что экспрессия мутантных р53 увеличивает вероятность появления в делящихся клетках линии ЫМ1215 числовых и структурных изменений хромосом.

1215/пео

1215/273

Контроль

Колцемид, 24 часа

Колцемид, 48 часов

2п 4п

2 и 4п

Рис. 5. Распределение клеток по количеству ДНК в обработанных колцемид культурах 1215/273, экспрсссирующих экзогенный мутантный р53-1П5273 1215/пео, несущих пустой ретровирусный вектор.

После обработки колцемндом число клеток с уровнем плоидности >4п культурах 1215/273 увеличивалось значительно сильнее, чем в в культу] контрольных клеток 1215/пео. Данная картина воспроизводилась во всех т( поставленных экспериментах.

2.2.2. Влияниер53-СЯЕ на стабильность генома крысиных эмбриональных фибробластов

Чтобы расчленить эффекты, вызываемые доминантно-негативными и вновь приобретенными активностями мутантных р53, мы исследовали клетки, в которые трансдуцированы генетические супрессорные элементы, которые представляют собой короткие фрагменты кДНК крысиного р53 (до 300 пар нуклеотидов). Они кодируют короткие пептиды, соответствующие разным доменам р53, и инактивируют, по крайней мере некоторые, функции р53. Были исследованы эффекты, вызываемые экспрессией генетических супрессорных элементов, соответствующих 4 разным участкам молекулы р53 и отличающихся по способности вызывать нммортализацию крысиных эмбриональных фибробластов, кооперировать с онкогеном га.? в тесте на морфологическую трансформацию и/или придавать устойчивость к действию ДНК-повреждающих агентов, в частности этопозида [Оххогхкауа с1 а!., 1996]. Три нч использованных генетических супрессорных элементов (05Е22, 05ЕЮ5, ОБЕ 123) кодируют короткие пептиды, которые мо1ут блокировать олигомернзацию молекул р53 (05Е22) или конкурировать с функцией определенных доменов р53 (05ЕЮ5, С8Е123). Еще один элемент, С5Е108, соответствует З'-нетранслируемой области крысиного гена р53; его функция не ясна [Охьогхкауа с! а!., 1996]. Помимо более определенного ответа на вопрос о роли инактивации функции р53 дикого типа в контроле разных генетических нарушений, использование данного подхода позволяло изучить возможную функциональную роль отдельных участков молекулы р53.

Используя культуры крысиных эмбриональных фибробластов (11ЕЕ) и их дериваты, несущие р53-05Е/22, р53-С5Е/105, р53-05Е/Ю8, рбЗ-ОЯЕ/Ш \Ossovskaya е1 о/., 1996] мы, в первую очередь, определили, сопровождается ли супрессия функции различных доменов р53 накоплением п популяциях клеток с микроядрами. Как известно, микроядра образуются как в результате неправильной сегрегации целых хромосом во время митоза, так и в результате отставания во время митоза хромосомных фрагментов, возникших при

двунитевых разрывах ДНК. Таким образом, микроядра являются показателем хромосомной нестабильности, который может свидетельствовать о повышенной частоте и числовых, и структурных хромосомных аномалий.

Мы обнаружили, что в культурах REF, экспрессирующих различные р53-GSE, частота клеток с микроядрами выше, чем в контрольных крысиных эмбриональных фибробластах на 6-8 пассажах in vilro (Рис. 6). При этом экспрессия разных генетических супрессорных элементов сопровождалась неодинаковыми изменениями в частоте микроядерных клеток. Больше всегс клеток с микроядрами обнаруживалось в культуре, несущей генетический супрессорный элемент, соответствующий олигомеризационному домену, а наименьшее количество микроядерных клеток было в культуре, в которую была трансдуцирована кДНК, гомологичная З'-нетранслируемой области гена р53. Супрессорные элементы, соответствующие участкам трансактивационного или ДНК-связывающего доменов р53 оказывали рромежуточное действие (Рис. 6).

Получив эти результаты, мы решили подробнее исследовать действие различных генетических супрессорных элементов на частоту появления гетероплоидии и хромосомных разрывов. На Рис.7 представлены данные с распределении делящихся клеток по числу хромосом в культурах REF, несущи* разные p53-GSE и в контрольной культуре крысиных эмбриональных фибробластов на 6-ом пассаже in vitro. Оказалось, что культуры, экспрессирующие 3 из 4 исследованных p53-GSE (GSE/22, GSE/105 i GSE123) содержат довольно значительное число гипердиплоидных > околотетраплоидных клеток. При этом, наибольшее количество гетероплоидны> клеток обнаруживалось в культуре с GSE/22, блокирующил олигомеризационный домен р53. В то же время, в культуре с GSE/108 соответствующим З'-нетранслируемой области гена р53, число полиплоидо! практически не отличалось от наблюдаемого в контрольной культуре. Такт образом, в культурах с разными p53-GSE наблюдалась корреляция межд) частотой клеток с микроядрами и числом клеток с изменениями числа хромосом.

ОБЕ 105 вБЕ 123 СБЕ 22 ОЯЕ 108 -> -> -> ->

1-50 123-171 312-391

трансактивационный ДНК-связывающий С-концевой З'-нетранслируемая домен домен домен область

Рис. 6. Влияние экспрессии различных р53-С8Е, гомологичных разным участкам молекулы р53, на встречаемость клеток с микроядрами.

Вверху - гистограммы, показывающие долю клеток с микроядрами в культурах РЕР с транедуцированными р53-СБЕ; внизу - соответствие исследованных вЭЕ функциональным доменам белка р53. (Приведены результаты одного из трех типичных экспериментов; в каждой культуре проанализировано 1000-1200 клеток).

ЯЕР

ИЕР/ОЗЕ-Юб

НЕР/бвЕ-Юв

Р1ЕР/63Е-123

«О ОС

Рис. 7. Влияние экспрессии различных р53-ОБЕ на распределение клеп по числу хромосом в культурах крысиных эмбриональных фибробластов. каждой культуре проанализировано 150-200 метафаз).

В следующей серии экспериментов мы попытались оценить влияние различных p53-GSE на частоту хромосомных разрывов в делящихся крысиных эмбриональных фибробластах и на вероятность возникновения в них рекомбинаций ДНК, ведущих к амплификации гена cad.

Мы обнаружили, что экспрессия всех исследованных p53-GSE сопровождалась повышением частоты в митотическнх клетках спонтанных и индуцированных этопозидом разрывов хромосом. При этом частота индукции различными супрессорными элементами хромосомных разрывов не совпадала с их способностью увеличивать частоту образования клеток с микроядрами и/или изменениями числа хромосом. Так, в культурах с GSE108, характеризовавшихся самым низким повышением частоты клеток с микроядрами (Рис. 6) и изменениями числа хромосом (Рис. 7), доля метафаз с хромосомными разрывами (Рис. 8) и число разрывов на клетку были примерно такими же как и в культурах, экспрессирующих другие p53-GSE. Следует подчеркнуть, что в обработанных этопозидом культурах экспрессия всех исследованных p53-GSE сопровождалась не только увеличением доли метафаз с хромосомными разрывами, но и значительно менее выраженным снижением митотического индекса. Так, если в культуре контрольных эмбриональных фибробластов он снижался более, чем в 3 раза, в обработанных этопозидом клетках с GSE/105, GSE/108 и GSE/123 наблюдалось 1,5-2-кратное снижение доли делящихся клеток, а в культурах с GSE/22 митотический индекс вообще практически не менялся (Рис. 8). При учете этого обстоятельства оказывается, что в обработанных мутагеном культурах экспрессия p53-GSE в 10-17 раз увеличивает частоту делящихся клеток, в которых имеются разрывы хромосом, причем, как и в других случаях, наибольший эффект наблюдается при действии GSE/22, соответствующего олигомеризационному домену р53 (Рис. 8).

17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

ЕЗдоля метафаз с разрывами, %

ЕЗ митотический индекс, %

■частота делящихся клеток с разрывами, %

Контроль

£ * ю О о СМ

до СО о

РЕР СБЕ22 СБЕЮб С8Е108 С8Е123

Э топ озид (200нг/мл, 48час.)

РЕР 6БЕ22 СБЕЮб СвЕЮв С8Е123

Рис. 8. Влияние различных р53-05Е на частоту делящихся клеток со спонтанными и индуцированными этопозидом разрывами хромосом в культурах крысиных эмбриональных фибробластов. (Представлены результаты одного из трех типичных экспериментов).

Кроме влияния p53-GSE на частоту незарепарированных разрывов хромосом в делящихся клетках, мы исследовали, может ли их экспрессия изменить вероятность возникновения клонов клеток с рекомбинациями ДНК, приводящими к генной амплификации. С этой целью мы решили сравнить в культурах REF с разными p53-GSE частоту появления колоний клеток, устойчивых к М-фосфоацетил-Ь-аспартату (PALA). Ранее было установлено, что резистентность крысиных клеток к этому препарату, как правило, возникает в результате внутрихромосомной амплификации гена cad [Stark, 1993; Ishizaka et ai, 1995]. Также было показано, что в ответ на действие PALA в клетках, сохранивших функцию р53 дикого типа, в частности, в крысиных фибробластах линии REF52, наблюдается остановка клеточного цикла в Gl и/или S фазах клеточного цикла, в результате чего клетки в среде с цнтостатиком хотя и не погибают, но и не могут сформировать резистентные клоны с амплификацией гена cad [Livingstone el al, 1992; Yin et al., 1992; Ishizaka et а!., 1995; Chernova et al., 1995] - явление т.н. «непермиссивности для генной амплификации» [Wright et al., 1990; Perry et al, 1992; Stark, 1993].

Мы обнаружили, что в культурах REF и REF52 через 3-5 суток после начала культивирования в среде с PALA (ЗОдМ) наступает остановка клеточной пролиферации, не сопровождающаяся гибелью клеток. Как и другие исследователи [Livingstone, 1992; Yin et al., 1992], мы наблюдали, что в таких условиях основная масса клеток не погибает в течение по меньшей мере 1,5 месяцев. По истечении этого времени в культурах REF и REF52 не возникло ни одного клона PALA-устойчивых клеток (Табл. 2). Экспрессия всех исследованных p53-GSE изменила поведение клеток в среде с PALA: в отличие от родительских клеток REF и REF52, они стали погибать в среде с PALA. Чувствительность к цитотоксическому действию PALA возникла, вероятно, в результате отмены работы защитного контрольного механизма - остановки клеточного цикла, предотвращающего размножение клеток при недостатке пула нуклеотидов. Действительно, FACScan-анализ показал, что, в отличие от исходных клеток, в клетках с p53-GSE, в частности REF52/GSE22, при

культивировании в среде с PALA не наблюдается блока клеточного цикла в S-фазе (Рис. 9). Таким образом, все исследуемые нами культуры, несущие р53-GSE, утратили «непермиссивность для генной амплификации». Однако частота возникновений PALA-устойчивых колоний клеток сильно отличалась в культурах с разными p53-GSE. Так, если при экспрессии GSE22 и GSE105 она колебалась в пределах от 4х10"5 до 12х10"5, то в культурах REF с GSE108 и GSE123 она была значительно ниже: 0,1х10"5-0,5х10"5(Табл. 2).

Чтобы убедиться в том, что возникновение PALA-устойчивости в исследуемых нами моделях действительно обусловлено генной амплификацией, мы размножили клетки нескольких выросших индивидуальных колоний и исследовали копийность в них гена cad методом гибридизации по Саузерну со специфическим ДНК-зондом. Во всех исследованных PALA-устойчивых клонах клеток была выявлена увеличенная копийность гена cad (Рис. 10).

i

Табл. 2. Влияние экспрессии различных p53-GSE на поведение крысиных эмбриональных фибробластов в среде с PALA и частоту возникновения колоний,

устойчивых к цитостатику

Частота (хЮ'5)

Клетки Поведение клеток в PALA-устойчивых

среде с ЗОцМ PALA колоний*

REF Остановка в S;

клетки не гибнут <0,05

REF/GSE22 Гибель клеток 8,0+4,0

REF/GSE105 Гибель клеток 9,0+2,0

REF/GSE108 Замедленная гибель

клеток 0,3+0,2

REF/GSE123 Гибель клеток 0,1+0,05

REF52 Остановка в S;

клетки не гибнут <0,01

REF52/GSE22 Гибель клеток 6,3+2,8

* Для каждой культуры приведены средние значения, полученные в 2-'. экспериментах.

Рис. 9. Влияние p53-GSE22 на распределение клеток REF52 по клеточному циклу в культурах, обработанных PALA. (Опыт воспроизведен два раза с идентичными результатами).

1 2 3 4 5 6

:::

!:47=* П

î

Рис. 10. Результаты гибридизации по Саузерпу, свидетельствующие оС амплификации гена cad в PALA-устойчИвых клонах клеток REF/GSE22 н REF/GSE105.

10 мкг ДНК клеток REFXGSE22 REF\GSE105 (дорожки 1 и 6, соответственно) н полученных из них PALA-устойчнвых клонов (дорожки 2, 3 - клоны REF\GSE22; дорожки 4, 5 ■ клоны RERGSE105) гидролизовали EcoRl, полученные фрагменты разделяли в 1% агарозс. переносили на нейлоновую мембрану и гибрвдизовалн с "Р-ДНК пробой pCAD142 (см. Главу 1 «Материалы и методы). Во всех PALA-устойчивых клонах (дорожки 2,3,4,5) наблюдаете» усиление сигналов, соответствующих рсстрикционным фрагментам крысиного гена CAD Слева указано положение маркерных фрагментов.

Таким образом, мы обнаружили, что транедукция генетически? супрессорных элементов, инактивирующих функцию р53 дикого типа, не толькс индуцирует т.н. «пермиссивность для генной амплификации», но и увеличивает по-видимому, вероятность рекомбинаций ДНК, приводящих к увеличении копийности отдельных хромосомных участков. При этом, разные рбЗ-ОБЕ вероятно, отличаются по способности стимулировать амплификацию генов Наиболее сильный эффект наблюдался при экспрессии С5Е22 соответствующего олигомеризацнонному домену р53 и вБЕШб, гомологичноп трансактивационному домену р53.

2.2.3. Действие онкогена ras на генетическую стабильность и чекпойнты клеточного цикла в зависимости от активности р53

Чтобы получить дополнительную информацию о возможных механизмах кооперации онкогена ras и аномалий р53 в опухолевой трансформации, мы решили проанализировать эффекты их совместного действия на генетическую стабильность и чекпойнты клеточного цикла. С этой целью мы получили и использовали клеточные линии, отличающиеся по статусу р53, и их сублинии с конститутивной или регулируемой экспрессией трансдуцированного онкогена ras.

В первую очередь, мы провели хромосомный анализ р53-негативных клеток MDAH041/tet-ras, экспрессирующих N-ra.?asp'2 под контролем промотора, репрессируемого тетрациклином. Контрольные культуры этих клеток, постоянно поддерживающиеся в среде с 1мкг/мл тетрациклина, как и все другие исследованные к настоящему времени клетки с дефектным р53 [Harper et al., 1993; Tsukada et al., 1993; Cross et al., 1995; Agapova et al., 1996; Fukasawa et al„ 1997], характеризуются крайне нестабильным кариотипом. Число хромосом в них варьировало от 60 до 180, при этом четкого модального класса не обнаруживалось. Разрывы хромосом наблюдались в 50-60% клеток (среднее число разрывов на анализируемую клетку составляло 2,5+0,2). Перевод в среду без тетрациклина, сопровождавшийся типичными для rav-трансформации изменениями клеточной морфологии, вызывал дальнейшее увеличение числа хромосомных разрывов (Табл. 3). Однако наиболее ярким кариотипическим эффектом экспрессии онкогена ras в клетках MDAH041 была индукция хромосомной эндоредупликицин. В 1-2% метафаз rav-трансформированных культур выявлялась типичная картина, характерная для повторной репликации всех хромосом, не сегрегировавших в митозе после предыдущей репликации. В контрольных культурах частота таких метафаз была менее 0.08% (Табл. 4).

Обнаружив четкое действие онкогена ras на стабильность кариотипа р53-негативных клеток, мы решили проанализировать эффекты ras в клетках, экспрессирующих р53 дикого типа. Для этого мы использовали линии клеток,

отличающихся между собой по реакции р53 на экспрессию активированного ras: в клетках линий REF52 и LIM1215 наблюдается накопление р53, что характерно для нормальных эмбриональных клеток [Serrano et al., 1997], тогда как в клетках линий Rati и Rat2 имеется какой-то дефект в сигнальных путях, ответственных за ras-индуцированную активацию р53 (Рис. 11).

Индукция экспрессии ras в клетках Rati и Rat2 либо переводом в среду без тетрациклина (Ratl/tet-ras), либо дексаметазоном (Rat2/5 и Rat2-HT1) сопровождалась 4-5-кратным повышением числа хромосомных разрывов в делящихся клетках (Табл. 3) и значительным увеличением метафаз, демонстрирующих эндоредупликацию хромосом (Табл. 4). Таким образом, в клетках с дефектом сигнальных путей, ответственных за /ш-индуцированное накопление р53, ras вызывал такие же эффекты, как и в р53-негативных клетках MDAH9041.

С другой стороны, в клетках REF52 к LIM1215, в которых ras-трансформация вызывала накопление р53, экспрессия онкогена ras не давала столь ярких кариотипических эффектов. Так, частота эндоредупликации и полиплоидных клеток под действием онкогена ras практически не изменялась (Табл. 4), а число хромосомных разрывов увеличивалась менее чем в два раза (Табл. 3). Исходя из этих данных, можно было предположить, что активация р53 препятствует появлению в делящихся клетках ras-индуцированных изменений кариотипа.

Для проверки этого предположения мы исследовали, как влияет супрессия функции р53 на частоту /ш-индуцированных хромосомных аномалий в клетках REF52 и LIM1215. С этой целью были проанализированы их сублинии, экспрессирующие доминантно-негативные р53 (либо p53-GSE/22, либо мутантные р53). Мы обнаружили, что частота . гау-индуцированных хромосомных разрывов в таких сублиниях существенно выше, чем в контрольных сублиниях, экспрессирующих не доминантно-негативные р53, а пустой вектор pPS-neo (Рис. 12). Эти данные показывают, что способность онкогена ras вызывать нестабильность кариотипа зависит от функциональной активности р53 и эффективно реализуется в клетках либо с инактивированным р53, либо с дефектами сигнальных путей, обеспечивающих активацию р53 при экспрессии онкогена ras.

Табл. 3. Влияние экспрессии трансдуцированного онкогена ras на частоту хромосомных разрывов

в клетках с различным статусом р53

Линия клеток Статус p53 Регулятор экспрессии экзогенного ras Экспрессия трансгена ras Накопление p53 в ответ на экспрессию ras % метафаз с разрывами хромосом* Число разрывов на клетку*

MDAH041/tet-.ras - без тетрациклина 6 дн. + (N-ra5lsp12) - 56 ± 4.9 80 ±4.0 2.5 4.5

Ratl/tet-ras + (wt) без тетрациклина 3 дн. + (N-rasasp12) 1412.2 48±4.8 0.16 0.85

Rat2/5 + (wt) ДМТ**, 3 дн. + (N-ras) 18 ±4.4 40 ±5.6 0.19 0.70

Rat2-HT1 + (wt) ДМТ, 3 дн. + (Н-/ш""2) 14 ±2.3 44 ±4.2 0.14 0.58

REF52/tet-ras + (wt) без тетрациклина 5 дн. + (N-ra/sp12) + 14 ±3.7 22 ±4.9 0.24 0.40

LIM 1215/neo LIM 1215/ras + (wt) ■ N-ra/5"12 + 6± 1.6 12 ±3.2 0.08 0.12

* Каждая культура проанализирована дважды со сходными результатами; в каждом случае исследовано 100-175 метафаз.

** Дексаметазон, (Sigma, 2 шМ).

Табл. 4. Влияние экспрессии трансдуцированного онкогена ras на частоту полиплоидных метафаз и эндоредупликации в клетках с разным статусом р53

Линия клеток Статус p53 Регулятор экспрессии экзогенного ras Полиплоидные метафазы, % Метафазь эндоредуплик %

MDAH041/tet-.ras - без тетрациклина 6 дн. без тетрациклина 35 дн. 15 ± 1.0 20.2 ± 1.7 44.6 ± 1.5 <0.08 1.2 ±0.3 1.7 ±0.4

Ratl/tet-ras + (wt) без тетрациклина 3 дн. 14.8±1.4 26.8±1.8 0.3±0.0.' 1.7±о.з:

Rat2/5 + (wt) ДМТ*, 3 дн. 18 ± 1.7 28 ± 2.0 0.4 ± 0.2 1.3 ±0.3

Rat 2-HT1 + (wt) ДМТ, 3 дн. 6± 1.0 13 ± 1.5 <0.8 1.4 ±0.3

REF52/tet-ras + (wt) без тетрациклина 5 дн. 5.2 ±0.5 7.1±1.2 0.2±0.0: o.3±o.i:

LIM 1215/neo LIM 1215-ras + (wt) - 10.5±1.8 9.0±1.3 0.13 <0.2

* Дексаметазон, (Sigma, 2 mM).

Рис. 11. Влияние экспрессии ras на содержание р53 в клетках REF52, Rati, Rat2 i LIM1215.

Экспрессию р53 определяли методом Вестерн-анализа, использу) моноклональные антитела РаЬ421. Экспрессия онкогена ras вызывает увеличена содержания р53 в клетках линий REF52 и LIM 1215, но не изменяет его количеств« в клетках Rati и Rat2.

Разрывы на 100 метафаз 160 г

neo 175 273 neo 175 GSE

% полиплоидных клеток

— i — .-,.,.1,...^___i___ i ■ i i ■

neo 175 273 neo 175 GSE

LIM1215 REF52

с. 12. Влияние экспрессии доминантно-негативных р53 на частоту омосомных изменений, индуцируемых онкогеном ras.

Чтобы изучить возможные механизмы индукции генетической нестабильности в клетках, экспрессирующих онкоген ras, мы исследовали в таких клетках активность G1/S и G2/M чекпойнтов клеточного цикла при действии алкилирующего соединения этилметансульфоната (ЭМС), являющегося сильным мутагеном. Выбор именно этого агента обусловлен тем, что он, являясь алкилирующим соединением, вызывает быстрый ДНК-повреждающий эффект в любой фазе клеточного цикла, тогда как многие другие агенты, в частности этопозид и PALA, вызывают разрывы ДНК только во время S-фазы. Поэтому, использование ЭМС позволяло проанализировать вход в S-фазу и митоз клеток, в которых повреждения ДНК произошли соответственно в Gl и G2 фазах клеточного цикла.

Для анализа G1/S чекпойнта мы исследовали способность клеток, предварительно сшгхроиизированных в G0/G1, включать 5-бромдезоксиуридин (5-БДУ), т.е. входить в S-фазу после обработки мутагеном. Обработка этилметансульфонатом значительно уменьшала в культурах р53-позитивных клеток Rati и REF52 долю клеток вступающий в S-фазу. Экспрессия онкогена ras не отменяла в таких культурах остановку перехода из Gl в S-фазу. Однако, в производных клеток REF52, в которых функция р53 была супрессирована трансдукцией p53-GSE22 (сублиния REF52/GSE) и наблюдалась частичная отмена остановки в Gl, дополнительная экспрессия онкогена ras вызывала заметное увеличение числа клеток, входящих в S-фазу после обработки мутагеном (Табл. 5).

Наряду со стимуляцией перехода из G0/G1 в S-фазу, экспрессия онкогена ras вызывала в ряде клеточных линий отмену задержки перехода из G2 в митоз, наблюдавшейся в ответ на действие ЭМС. При обработке ЭМС за 4 часа до фиксации митотический индекс в культурах клеток, не экспрессирующих ras, существенно снижался. Причем это снижение наблюдалось не только в культурах р53-позитивных клеток Rati и REF52, но и в р53-дефектных клетках REF52/GSE и MDAH041 (Табл. 10). Экспрессия ras практически полностью снимала остановку перехода из G2 в митоз в культурах Rati и MDAH04I, но совершенно не увеличивала число митотических клеток в культурах REF52. Однако, в их производных с супрессированной функцией р53 (сублиния REF52/GSE) ras вызывал значительное увеличение числа клеток, входящих в митоз (Табл. 6).

г1п 1 роп^ду цпртвлпмш и инки!сна гщ на переход из ии/и1 в ъ в клетках, обработанных ЭМС*

Линия клеток Экспрессия экзогенного газ 5-БДУ-позитивные клетки, %

Несинхрони-зированные После синхронизации Синхронизиров. + сыворотка Синхронизиров. + сыворотка и ЭМС

ЯаИЛеи-аз + 55.4+3.0 49.9+ 2.7 5.1+ 0.3 6.7+ 0.4 68.9+3.7 70.1+3.8 12,8+0.7 18,7+ 1.0

ЯЕР52Ле1-га5 + 57.4+3.0 48.1+2.6 6.1+0.3 7.3+ 0.4 73.7+3.9 78.9+4.2 8,7+0.5 13,8+ 0.7

11ЕР52/05Е 60.1+3.2 6.2+ 0.3 75.4+4.0 35.7+ 1.9

ЯЕР52/05Е-газ + 58.4+3.1 7.0+ 0.4 75.1+4.0 59.4+ 3.2

* В культуры, синхронизированные в 00/01 путем инкубации в бессывороточной среде в течение 54 час., были последовательно добавлены сыворотка (10%), этилметансульфонат (ЭМС, 600 мкг/мл) и 5-бромдезоксиуридин (5-БДУ, 10"5 М). Через 12 час. клетки были зафиксированы, и в культурах было определено число клеток, реагирующих с антителами, специфичными к 5-БДУ ** Представлены суммарные результаты двух экспериментов; в каждой группе опыта анализировали 800-1000 клеток.

Табл. 6. Влияние экспрессии трансдуцированного онкогена ras на переход из G2 в митоз в клетках, обработанных ЭМС*

Линия клеток Экспрессия экзогенного ras % митоточеских клеток**

Контроль ЭМС

MDAH041/tet-ras + 48.0+ 1.5 65.0+ 3.0 23.0+ 1.1 56.0+ 2.2

Ratl/tet-ras + 47.5+2.5 40.6+3.8 33.6+2.1 42.2+3.8

REF52/tet-ras + 33.7+ 2.4 37.4+3.4 15.6+ 1.3 17.2+ 2.8

REF52/GSE REF52/GSE-ras + 33.4+2.8 44.4+3.1 13.2+ 1.1 38.4+3.2

* ЭМС (600 мкг/мл) был добавлен за 4 часа до фиксации клеточных культур, после чего в них была определена доля клеток, находящихся в митозе. ** Представлены результаты одного из трех типичных экспериментов; в каждой группе опыта просчитывали по 2000-2500 клеток.

Эти данные свидетельствуют о том, что для отмены 02-чекпойнта необходима одновременная инактивация р53 и экспрессия активированного ras. Исходя из этого, можно предположить, что С2-чекпойнт имеет сложный, по меньшей мере двух-компонентный механизм, и что р53 и ras участвуют в регуляции разных частей этого контролирующего механизма. Таким образом, мы обнаружили кооперирующее действие онкогенов ras и нарушений функции р53 в регуляции G1- и 02-чекпоннтов клеточного цикла и, следовательно, в индукции генетической нестабильности.

выводы

1. Исследовано- влияние различных аномалий р53 на стабильность генома. Показано, что экспрессия р53 с миссенс-мутациями в кодонах, чаще всего поражаемых в различных новообразованиях человека, увеличивает вероятность появления в популяциях человеческих клеток линии LIM1215 метафаз с хромосомными разрывами и изменениями числа хромосом.

2. Подавление функций р53 в эмбриональных крысиных фибробластах с помощью трансдукции генетических супрессорных элементов, также как и экспрессия мутантных р53, увеличивает вероятность возникновения самых разных изменений генома: разрывов хромосом, анеуплоидни и полиплоидии, генной амплификации.

3. Блокирование функции разных участков молекулы р53 оказывает дифференциальный эффект на вероятность возникновения различных генетических нарушений. Наибольший спектр изменений и самая высокая их частота наблюдались при трансдукции суирсссориого элемента, ингибирующего олигомеризационный домен р53.

4. Экспрессия активированных онкогенов семейства ras может вызывать генетическую нестабильность, в частности, увеличение частоты эндоредупликации, полиплоидии, разрывов хромосом и генной амплификации. Однако эффективность действия онкогенов ras на стабильность генома определяется состоянием р53-зависимых сигнальных путей: при сохранении функции р53 экспрессия ras вызывает лишь незначительное увеличение частоты хромосомных разрывов, тогда как при инактивации р53 частота и спектр ras-индуцированных изменений резко возрастают.

5. В основе совместного влияния аномалий р53 и экспрессии онкогенов ras на стабильность генома лежит их кооперация в инактивации GI/S и G2/M чекпойнтов клеточного цикла. При сохранении функции р53, экспрессия ras не отменяет остановку поврежденных клеток в G1 и G2, тогда как в клетках с инактивированным р53 экспрессия ras приводит к дальнейшему ослаблению Gl-чекпойнта и практически полной отмене задержки поврежденных клеток в G2 фазе клеточного цикла.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Agapova L.S., llyinskaya G.V., Turovets N.A., Ivanov A.V., Chumakov P.M Kopnin B.P. Chromosome changes caused by alterations of p53 expressioi Mutation Research, 1996, v.354, p. 129-138.

2. Агапова Л.С., Туровец H.A., Иванов A.B., Ильинская Г.В., Чумаков П. к Копнин Б.П. Индукция гипердиплоидии и хромосомных разрывов в клетке LIM1215, экспрессирующих экзогенный мутантный р53. Генетика, 1996, т.З. с. 1080-1087.

3. Sablina А.А., llyinskaya G.V., Rubtsova S.N., Agapova L.S., Chumakov P.k Kopnin B.P. Activation of p53 mediated cell cycle checkpoint in response I micronuclei formation. Journal of Cell Science, 1998, v.111(7), p.977-984.

4. Agapova L.S., Ivanov A. V., Kopnin P.B., Sablina A. A., Sokova O.I., Chumakc P.M., Kopnin B.P. Effects of Ras oncogene expression on chromosome stabili' and cell cycle checkpoints in p53-negative and p53-positive cells. Oncogeni 1998, in press.

5. Agapova L.S., Chumakov P.M., Kopnin B.P. Expression of mutant p53 induce heteroploidy in human LIM1215 cells. Tes. Young scientists challenge Chernob disaster post-effects: now and tomorrow., Gomel, 1994, p.55.

6.Agapova L.S., llyinskaya G.V., Sokova O.I., Pugacheva EN., Ivanov A.I Chumakov P.M., Kopnin B.P. Tumor-derived p53 mutants induce various genet alterations in human and rodent cells. Tes. 27th ESHG. Med.Genetic., Munchei 1995, p.275.

7. llyinskaya G. V., Agapova L.S., Semenyak O.S., Meliksetian L.R., Chumakov P.K Kopnin B.P. Changes in expression of p53 tumor-supressor cause genet instability. Tes. An AACR Special Conference., Skamania Lodge, 1996, p.14.

8. Kopnin B.P., Agapova L.S., llyinskaya G.V., Semenyak O.S., Ivanov A.\ Pugacheva E.N., Chumakov P.M. Genomic alterations in human and rodent eel with modified p53 expression. Joint ISRES-AACR symposium, Lausanne, 199 p.95.

9. Агапова Л.С., Осовская B.C., Сокова О.И., Гудков А.В., Чумаков П.М., KonHi Б.П. Роль отдельных доменов опухолевого супрессора р53 в поддержан!, целостности генома. Тез. д. I Съезд Онкологов стран СНГ., 1996, 1ч., с.185

10 .Ильинская Г.В., Агапова Л.С., СеменякО.Ю., Меликсетян Л.Р., Чумаков П.М., Копнин Б.П. Роль опухолевого супрессора р53 в контроле числа хромосом и копийности отдельных генов. Тез. д. I Съезд Онккологов стран СНГ. 1996, 1ч., с.185-186.

11. Chumakov P.M., IvanovA.V., Kopnin Р.В., Agapova L.S., Sablina A.A., Sokova O.I., Evstifeev V.P., Kopnin B.P. Effects of oncogenic RAS on p53 pathway, chromosome stability and cell cycle checkpoints. Tes. 9th p53 Workshop, Elounda Beach, 1998, p.97.

^2.Kopnin B.P., Sablina A.A., Rubtsova S.N., llyinskaya G.V., Agapova L.S., Chumakov P.M. Activation of p53-dependent cell cycle checkpoints in response to destruction of microtubules and micronuclei formation. Tes. 9th p53 Workshop, Elounda Beach, 1998, p.148.