Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Модуляция активности онкогенов v-src и N-ras в трансформированных клетках хомячка

российская академия медицинских наук онкологический научный центр им. H.H. Блохина

На правах рукописи удк 618.14-006-092.9

чевкина елена максимовна

МОДУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ОНКОГЕНОВ v-src И N-ras В ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ ХОМЯЧКА

(Специальность 14.00.14 - Онкология)

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

§ §

.eis

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии вирусов (руководитель - доктор биологических наук, профессор Ф.Л. Киселев) Онкологического научного центра РАМН им. H.H. Блохина (директор -академик РАМН H.H. Трапезников).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ф.Л. Киселев Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук К.В. Ильин

доктор биологических наук, профессор Д-М. Спитковский

Ведущее учреждение: НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского,

РАМН

Защита состоится "М." _ 1996 г.

на заседании специализированного Ученого совета ( ) Онкологического научного центра РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОНЦ РАМН. Автореферат разослан "_ " * /Г^Ев^ 1996 г.

Ученый секретарь специализированного Ученого совета

доктор мед. наук, профессор B.C. Турусов

работы

1. Актуальность проблемы

В настоящее время достигнут большой прогресс в понимании механизмов опухолевой трансформации клеток. Обнаружено значительное количество генов, регулирующих этот процесс (онкогенов и антионкогенов). Показано, что многие из продуктов этих генов участвуют в путях пг-редачи сигналов, регулирующих пролиферацию клеток и соответовенно ответственных за рост опухоли. Однако конкретные молекулярно-биологические механизмы процессов передачи сигналов в нормальной клетке и при злокачественной трансформации остаются до конца не выясненными. Данная работа посвящена изучению некоторых аспектов этой проблемы, касающихся взаимодействия двух онкогенов, относящихся к различным классам: N-ras и v-src. Оба этих онкогена известны своей способностью к трансформации in vivo и in vitro, а также экспрессией в опухолях различного происхождения. В этой связи кажутся особенно актуальными подходы к поиску путей регуляции активности данных онкогенов, а также создание новых экспериментальных модельных систем, позволяющих исследовать различные аспекты их взаимодействия в качестве отдельных звеньев в цепи передачи сигналов в трансформированной клетке. В данной работе разработана новая экспериментальная модель, на основе полученных ранее в институте клеточных линий эмбриональных фибробластов хомяка, трансформированных in vitro вирусом саркомы Рауса. В результате проведенных исследований была доказана возможность подавления экспрессии онкогена v-src под действием онкогена N-ras и достижения обратного эффекта, то есть восстановления экспрессии v-src в результате введения в геном клетки N-ras-специфической последовательности в антисмысловой ориентации. Полученные данные и разработанная экспериментельная модель могут быть использованы в дальнейших исследованиях, касающихся различных аспектов функционирования онкогенов в клетке.

2. Цели и задачи работы

Целью настоящей работы является изучение феномена модуляции экспрессии онкогена v-src под влиянием активности онкогена N-ras и возможности его обратимости, а также создание экспериментальной

з

модельной системы для изучения взаимодействия онкогенов различных классов на примере N-ras и v-src.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

а. Подавление активности экзогенного N-ras в RSV-трансформированных клетках с помощью введения в геном генетических "агентов - антагонистов" гена N-ras;

б. Получение клеточных линий, позволяющей исследовать взаимодействие различных классов онкогенов на примере v-src и N-ras;

в. Получение генно-инженерной конструкции, экспрессирующей N-ras-специфическую последовательность в антисмысловой ориентации;

г. Доказательство функциональной роли активированного экзогенного N-ras в модуляции экспрессии генома провируса RSV и, в частности, онкогена v-src;

д. Определение возможной корреляции между модуляцией экспрессии провируса RSV и уровнем каталазной активности в данной экспериментальной системе.

3. Научная новизна

В данной работе впервые была показана возможность обратимого регулирования экспрессии продукта онкогена v-src под влиянием экспрессии онкогена N-ras в экспериментальной модели хомячковых эмбриональных фибробластов, трансформированных вирусом саркомы Рауса. Данная работа продолжает исследования, ранее проводимые в НИИ Канцерогенеза в лабораториях противоопухолевого иммунитета и регуляции вирусных и клеточных онкогенов. Впервые получена панель клеточных линий, производных RSV-трансформированных фибробластов хомяка, несущих и экспрессирующих экзогенные последовательности N-ras и его антагонистов: генов K-rev1 и последовательности N-ras в антисмысловой ориентации. Сконструирован плазмидный вектор, экспрессирующий N-ras-специфическую последовательность в антисмысловой ориентации. В данной экспериментальной системе впервые показано, что ген-супрессор K-rev1, продукт которого известен в качестве функционального антагониста генов семейства ras, не подавляет биологическую активность онкогена N-ras и не изменяет морфологический фенотип клеток. В то же время экспрессия антисмысловой N-ras мРНК в той же экспериментальной системе приводит к восстановлению экспрессии онкогена v-src, подавление

которой было вызвано активностью экзогенного онкогена N-ms. Выявлена корреляция между экспрессией продуктов онкогена v-sre. и уровнем каталазной активности в полученной экспериментальной модели.

4. Научно-практическая ценность работы

Теоретическое значение работы заключается в обнаружении новых данных, касающихся вопросов функционирования в опухолевых клетках онкогенов v-src, N-ras и K-rev1, в получении новых клеточных линий, экспрессирующих экзогенные последовательности v-src, N-ras и его генетических антагонистов, а также в создании генно-инженерных конструкций, которые могут быть использованы в дальнейших исследованиях в области экспериментальной онкологии.

5. Апробация работы

Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместной конференции лабораторий молекулярной биологии вирусов, регуляции вирусных и клеточных онкогенов, вирусного канцерогенеза, иммунологии онкогенных вирусов и противоопухолевого иммунитета НИИ канцерогенеза ОНЦ РАМН.

Материалы работы опубликованы в журнале Int.J. Oncology, v.7, p.453-459,1995

6. Объем и структура работы

Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов исследования, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и библиографии. Материалы диссертации изложены на 123 страницах машинописного текста и включают 12 рисунков, 7 схем и 1 таблицу. Библиография включает 272 литературных источника.

Содержание работы

1 Обзор литературы

Обзор литературы состоит из двух основных частей. Первая часть посвящена рассмотрению онкогенов семейства ras, влючпя юнетическую и белковую структуру данной группы онкогенов, их экспрессию в нормальных тканях и в опухолях, функционирование белкоиых продуктов

в клетке и их участие в канцерогенезе. Во второй части рассматриваются фармацевтические, ииологические и генетические экспериментальные подходы к подавлению трансформирующих свойств онкогенов семейства ras.

2 Материалы и методы

В работе были использованы следующие методы исследования: культивирование и анализ культур клеток млекопитающих' трансфекция клеток млекопитающих, определение каталазной активности in vitro, растровая электронная микроскопия, трансформация бактериальных клеток, выделение плазмидной ДНК, выделение и очистка нуклеиновых кислот из клеток млекопитающих, рестрикция, электрофорез нуклеиновых кислот, блот-гибридизация нуклеиновых кислот (Саузерн и Норзерн блотинг), молекулярное клонирование в плазмидных векторах, выделение и анализ белковой фракции клеток (иммуноблоптинг).

В работе были использованы клеточные линии сирийских хомячков, трансформированные RSV [Deichman G.I. et al.,1989], и их производные, несущие и экспрессирующие экзогенную последовательность N-ras [Tatosyan A.G. et al.,1993], полученные в лабораториях противоопухолевого иммунитета и регуляции вирусных и клеточных онкогенов ОНЦ РАМН. Для трансфекции клеток, получения новых векторов и в качестве молекулярных зондов использовались плазмиды, содержащие последовательности K-rev1, N-ras, RSV, MMTV и др.

3 Результаты

3.1 Предпосылки проводимого исследования

В качестве экспериментальной модели для данного исследования была выбрана клеточная линия HET-SR эмбриональных фибробластов хомячка, трансформированных in vitro вирусом саркомы Рауса (RSV), характеризовавшаяся стабильно высоким уровнем экспрессии онкогена v-src, а также отличавшаяся высокими показателями ряда параметров антиоксидантной защиты (АОЗ) клеток, в том числе активностью фермента каталазы [Deichman G.I. et al.,1996]. После трансфекции клеток данной линии активированным (замена глицина на аспарагин в 12 положении) онкогеном N-ras в большинстве отобранных клонов, экспрессирующих экзогенный N-ras, наблюдалось заметное снижение уровня продуктов экспрессии RSV, и в частности, v-src-специфичной

мРНК и pp60vs,c [To^ol L.Z. ot al.,1993]. При этом никаких изменений в структуре интегрированного провируса не наблюдалось. Подавление экспрессии v-src в полученных линиях сопровождалось значительным снижением параметров АОЗ, и в особенности - резким падением уровня каталазной активности [Deichman G.I. et al., 1996]. Один из клонов, отличавшийся наиболее выраженным эффетом подавления активное!и v-src, HET-SR-N-ras клон 6 (HET-SR-N-ras/6), был использован для дальнейшей работы.

Эмбриональные фибробласты хомяка HEF

HET-SR-1

+• RSV

HET-SR-8 HET-SR-10

+ N-ras

HET-SR-/V-ras

клон 6

Клоны-К-reyJ-трансфектанты NN 1, 2, 3

Клоны-"анти-га-s-трансфектанты" NN1,4, 11

Рис. 1 Предпосылки и общая схема исследования

С целью изучения роли экзогенного активированного онкогена N-ras в описанном феномене модуляции экспрессии онкогена v-src, мы использовали два экспериментальных подхода, направленных на подавление биологической активности онкогена N-ras, и, таким образом, на потенциальное восстановление экспрессии онкогена v-src в данной системе. В соответствии с этим мы выбрали два типа генетических агентов, потенциально способных подавить биологическую активность онкогена N-ras. В первом случае мы использовали ген K-rev1 (rap 1А, smg р21), продукт которого известен в качестве функционального антагониста онкогенов семейства ras [Nocla М.,1993]. Во втором случае - нами был сконструирован вектор, экспрессирующий N-ras-специфическую последовательность в антисмысловой ориентации. Указанные векторы вводились в геном клеток линии HET-SR-N-ras/6 методом стабильной трансфекции. Полученные клоны подвергались анализу интеграции и экспрессии экзогенных генетических агентов. Схема исследования представлена на рис 1.

3.2 Ген K-rev1 в качестве потенциального супрессора биологической активности онкогена N-ras в системе RSV-трансформированных фиброблястов

В нашей работе для введения экзогенной последовательности К-revl в геном исследуемых клеток мы использовали ретровирусный вектор p-K-rev1 (рис. 2), полученный на основе плазмиды pBW1631, и содержащий последовательность кДНК гена K-rev1 под контролем промотора MuLV.

LTR K-rev1 pBR322 SV40ori neo LTR

Рис 2. Строение плазмиды рК-геу-1

Этот вектор был котрансфицирован вместе с плазмидой рБ\/2 Ьудго, несущей ген устойчивости к селективному маркеру гигромицину, в линию НЕТ-БР-Ы-газ/б методом кальциево-фосфатной преципитации в соотношении 10 мкг рК-гоу1 : I мкг рБ\/2 Иудго. После двух-трех

недельной селективной инкубации на среде йМЕМ, содержащей гигромицин в концентрации 300 мкг/мл, было отобрано 7 клонов.

Для анализа интеграции плазмиды ДНК из отобранных клонов подвергали рестрикции эндонуклеазой ВатН1, разделяли в 1% агарозном геле с последующей блот-гибридизацией с К-геу1-специфической пробой, полученной из плазмиды рК-геу1.

По крайней мере 3 из анализированных клонов выявили четкую положительную реакцию при гибридизации, соответствующую интеграции полноразмерной 1,8 т.п.н. последовательности К-геу1 (рис. 3), отсутствующую в ДНК родительской линии НЕТ-БР-М-гаэ/б. Несколько дополнительных фрагментов, выявленные в клонах-трансфектантах, могут отражать поликлональную интеграцию последовательностей К-геу, а также возможную утерю одного из сайтов Ват Н1 в отдельных копиях гена.

- 2.3 т.п.п.

<4- 2.0 т.п.н.

12 3 4

Рис 3.

Анализ интеграции вектора рК-геу1 в геном клеток НЕТ-ЭР-Г^-газ/б.

1 - ДНК линии НЕТ-ЭР-Ы-газ/б.

2-4 - ДНК клонов К-геу1-трансфектантов.

Для изучения экспрессии трансфицированной последовательности К-геу1, РНК из анализируемых линий подвергалась Норзерн-блот гибридизации с К-геу1-специфической пробой. Все клоны, выявившие интеграцию плазмидной ДНК, обнаружили экспрессию К-геу1-

специфичной мРНК размером 1,9 т;н. и приблизительно сходный уровень транскрипции экзогенного К-гоу1.

3.3 Анализ экспрессии экзогенных последовательностей N-ras и v-src в клонах K-revl-трансфектантах

Потенциальноо влияние экспрессируемой последовательности К-revl на активность генов N-ras и v-src определялось на белковом уровне методом иммуноблоттинга. Образцы, содержащие 100 мкг тотального клеточного белка, разделялись в 15% или 8% полиакриламидном геле с SDS для определения p21N",HS и pp60v"src соответственно, после чего подвергались иммуноблоттингу с использованием соответствующих моноклональных антител. Иммунореактивность определялась методом ECL.

Все клоны K-revl-трансфектанты экспрессировали стабильно высокий уровень p21N ,HS (рис. 4А , антитела Oncogene Science), ни один из них не выявил крких-либо изменений в экспрессии по сравнению с родительской линией HET-SR-N-ras/6.

Ни в одном из клонов не обнаружилось восстановления экспрессии pp60vsrc(pnc. 4Б, антитела UBI#05-185), сравнимого с контролем -исходной линией HET-SR.

При этом все клоны экспрессировали стабильный уровень рр660с" s,c (рис. 4В, антитела UBI#05-184), соответствующий уровню исходных клеток HET-SR.

Сравнение морфологических особенностей клонов К-revl-трансфектантов с таковыми родительских клеток N-ras-трансфектантов, HET-SR-N-ras/б, а также с клетками исходной линии HET-SR визуально методом растровой (сканирующей) электронной микроскопии, проведенное совместно с д.б.н. Ю. А. Ровенским, показало, что все культуры представляли собой морфологически типичные трансформированные фибробласты. Клоны несколько отличались между собой по микрорельефу поверхности, однако все характеризовались многослойным ростом и общим трансформированным фенотипом.

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии регистрируемого влияния экзогенной последовательсти K-rev1 на экспрессию продуктов онкогенов N-ras и v-src и c-src, а также на морфологический фенотип клеток в данной экспериментальной системе.

А

60 кД

12 3 4

Рис 4.

Анализ экспрессии продуктов р21(\1-газ (А), ррбОу-эгс (Б) и ррбОс-эгс (В). А: 1 - клетки родительской линии НЕТ-БР-М-газ/б.

2-4 - клетки клонов К-геу1- трансфектантов. Б-В: 1 - клетки исходной линии НЕТ-БР

2-4 - клетки клонов К-геу1-трансфектантов.

3.4 Получение генно-инженерной конструкции, несущей М-гаэ-специфическую последовательность в антисмысловой ориентации!''

В целях получения стабильно экспрессируемой антисмысловой N1-гаэ мРНК мы сконструировали плазмидный вектор, несущий Ы-гэб-специфическую последовательность в антисмысловой ориентации, под

регулируемым дексаметазоном промотором вируса опухолей молочной железы мышей (MMTV).

Для этого из плазмиды pSVcN-ras был вырезан фрагмент "pre-ras" размером - 650 п.н., содержащий интересующую нас лидерную область гена N-ras, соответствующую участку начала транскрипции (рис. 5.1). Данный фрагмент в ангисмысловой ориентации был клонирован в плазмиду рМАМ-пео(-) (рис.5.6), производную плазмиды рМАМ-пео, из которой был удален ген neo, в участок, примыкающий к промотору.

В целях приобретения необходимых сайтов рестрикции (в частности, Sali) с обеих фланкирующих сторон фрагмента "pre-ras", потребовалось два промежуточных этапа клонирования. На первом этапе фрагмент "pre-ras" был клонирован в полилинкерную область плазмиды pBluescript (рис.5.2-3), после чего вырезанный из промежуточной конструкции фрагмент, включающий "pre-ras" с приобретенным сайтом Sail, клонировали в полилинкерную область плазмиды pTZ19R (рис.5.3-4) Из полученной конструкции участок Sall/Sal! был вырезан и клонирован по данному сайту в плазмиду pMam-neo(-) (рис.5.6).

Ориентация вставки (прямая и обратная) проверялась с помощью рестрикгного анализа эндонуклеазами BamHI и Sali. Вектор рМАМ-рге-ras-as (рис.5.7), содержащий последовательность "pre-ras" в обратной (антисмысловой) ориентации был использован в дальнейшей работе.

(*) - фрагмент работы выполнен совместно с к.б.н. М.С. Штутманом

3.5 Восстановление экспрессии v-src в RSV-трансформированных клонах N-ras-трнсфектантах после введения в геном клеток антисмысловой последовательности к онкогену N-ras

Полученный вектор pMAM-pre-ras-as был котрансфицирован совместно с плазмидой pSV2hygro, несущей ген устойчивости к гигромицину, в ту же самую клеточную линию HET-SR-N-ras/6 (рис.1), что и в эксперименте с геном K-rev-1, и по той же схеме. После селекции часть отобранных клонов подвергались дальнейшему анализу.

Анализ интеграции вектора проводился методом Саузерн блоттинга (рис.6). Образцы ДНК подвергались рестрикции эндонуклеазой Hindlll, разделялись в 1% агарозном геле и гибридизовались с фрагментом вектора pMam-neo (областью промотора MMTV).

Xbal KPnI „. „„ Pvi.II

U Hindll! |

I____4.

LTR 1

MuLV

N-ras

pre-ras

Kpnl 1

I lintl 111 1

NEO

pSVcN-ras

svo

F'BO

Kpnl Konen 3aTynjien T4 JJHK nomtMepamii

pBlucscript

Kpnl Xhol Clal EcoRV Pst! BamHI Xbal F.agl Sacll

1111

1 1

1 1 1

T T t t

Apal Sali Hindlll EcoRI

Smal

t

Spei

T

Notl

BstXI Sacl

Kpnl Xhol Clal

pBS-pre-ras

+

I

1

T

Apal

t

Sali

} pre-ras Hindlll

BamHI 1

Xbal Lagl Sacll 1 1 1

t

Spcl

t

Noll

t t BstXI Sacl

Hindlll

Psll 1

Xbal 1

Smal 1

Sacl 1

pTZ19R

t

SpliI

t Sali

r

BanilU

t

Kpnl

t

FcoRI

pTZ-pre-ras

Hindlll PStl xbal 1 1 1

t T t

Sphl Sali BamHI

Hindlll Sali Apal Sic!

, I 1 I 'i

pre-ras

T t i !

Clal Xhol Kpnl FcoRI

11Mt.1l I [ ГЧ1 5а1! В.ппШ

I 4 I

рТ7-рге-га5

МпнШ! ЯлИ Лрл1 5„с|

I

I I I_г III

7 ! I |

ХЬо| Крп! ЕсиШ

RSV

ЕсоШ I

Шг)«ЛII С1а1 91 417

старт транскрипции 1277

I

ВатН1 2413

рМАМ-пео (-)

ТШП—. рп i |

ЕсоЯ! 3164

ЕсоШ 5716

7

8

старт транскрипции 1277

рМАМ-рге-гаэ

старт транскрипции 1277

Рис 5. Схема конструирования вектора рМАМ-рге-газ-аэ.

И

Все три представленные дочерние клоны выявили характерный специфический фрагмент 1,3 т.п.н., соответствующий участку вектора, включающему промоторную область 1ЛТ? ИЭУ и часть клонированной последовательности Ы-гаэ в антисмысловой ориентации. Дополнительные полосы размером 2,1 т.п.н. отражают, вероятно, присутствие ММТУ-родственных последовательностей в хомячковом геноме, а наличие сигналов в нескольких низкомолекулярных фрагментах могут свидетельствовать об интеграции неполноразмерных форм вектора.

Рис.6 Анализ интеграции вектора рМАМ-рге-гаБ-аэ в геном клеток НЕТ-ЭО-М-газ/б по Саузерну.

1- ДНК исходной линии НЕТ-БЯ

2-4-ДНК клонов анти-гаэ-трансфектантов: 2, 3, 4 - субклоны №11,4, 1

При анализе экспрессии антисмысловой Ы-гаэ мРНК, а также РНК и белковых продуктов интересующих нас генов Ы-гаэ и у-бгс в клонах, несущих антисмысловую М-гаэ конструкцию, часть клеток каждого клона и контрольных родительских клеток подвергалась обработке дексаметазоном для стимуляции работы промотора ММТ\/. Контрольная популяция клеток каждой линии культивировалась параллельно в стандартных условиях и одновременно отбиралась для анализа.

РНК из клонов-трансфектантов и родительских линий выделялась гуанидин-изотиоционатным методом с последующим

центрифугированием через "подушку" СэС!. Образцы РНК разделялись

12 3 4

по электрофоретической подвижности в 1% агарозо-формальдегидном геле и переносились на мембрану Hybond С extra. Для подтверждения транскрипции антисмысловой N-ras последовательности, мембраны с образцами РНК гибридизовались с фрагментом транскрибируемой части промотора MMTV, полученном при последовательной рестрикции плазмиды pMam-neo двумя эндонуклеазами Sac I и Sma I. Все клоны-трансфектанты обнаружили специфическую экспрессию мРНК размером 1,6 т.н., что соответствует транскрипции полноразмерного фрагмента вектора от промотора до сайта полиаденилирования SV-40, включая, соответственно, и антисмысловую N-ras последовательность. Сравнение уровней экспрессии антисмысловой мРНК в различных клонах, а также в клетках, стимулированных дексаметазоном, и не проходивших обработку, не выявило существенных различий.

Исследование активности экзогенных онкогенов N-ras и v-src в клонах, экспрессирующих антисмысловую-N-ras мРНК, проводилось как на уровне транскрипции, так и на уровне синтеза белковых продуктов. Результаты Норсерн-блот анализа исследуемых образцов РНК (гибридизацию проводили с фрагментом плазмиды pSVcN-ras, включающим полноразмерную последовательность N-ras) свидетельствуют о том, чго уровень N-ras мРНК (транскрипт размером 5,2-5,4 т.н.) в клонах-трансфектантах относительно стабилен и соответствует таковому родительских клеток HET-SR-N-ras/6, то есть остается достаточно высоким по сравнению с контрольным уровнем в исходной нетрансфицированной геном N-ras линии HET-SR. Сравнение уровней экспрессии мРНК проводилось с учетом результатов гибридизации тех же образцов с GAPDH- специфичной пробой. Таким образом, на уровне транскрипции нами не было выявлено существенных различий в экспрессии онкогена N-ras в клонах, экспрессирующих антисмысловую N-ras мРНК, по сравнению с родительской линией клеток.

Результаты Вестерн-блот анализа(15% SDS-полиакриламидный гель, антитела Oncogene Science) обнаружили некоторые различия в уровне экспрессии p21N"ras среди клонов (рис. 7). Так, частичная супрессия p21N ras наблюдалась в клоне № 1 (рис. 7 дорожка 1 (7.1)). В остальных двух клонах № 4 и № 11 (7.2 и 7.3 ) уровень экспрессии приблизительно соответствовал уровню p21N"ras в родительских клетках HET-SR-N-ras/6 (7.4). Полученные данные свидетельствуют о том, что экспрессия антисмысловой N-ras последовательности не привела к изменению уровня транскрипции N-ras, однако повлияла на уровень

iñ

трансляции, что согласуется с представлением о том, что ангисмысловые мРНК влияют на экспрессию определенных генов на уровне трансляции. При этом лишь в одном клоне (клон № 1) мы обнаружили существенное снижение уровня р21Мга*.

21 кД

12 3 4

Рисунок 7. Анализ экспрессии онкогена Ы-гаэ в клонах анти-гаэ-трансфектан^ах методом Вестерн блотинга.

1-3 - клоны анти-гаБ-трансфектанты: 1, 2, 3 - субклоны №1,4, 11. 4 - родительская линия НЕТ-8Г! М-гаэ/б.

Влияние экспрессируемой антисмысловой-Ы-гаэ мРНК на экспрессию продуктов онкогена у-бгс определяяли также методами Норэерн и Вестерн Слот анализа. При анализе уровня мРНК (гибридизацию проводили с згс-специфическим фрагментом плазмиды рЮЮэгсЬМ [Та^уап А.в. е! а1.,1996] все культуры выявили два специфических транскрипта: 9,3 т.н., соответствующий полноразмерной мРНК РБУ, и 2,7 т.н., соответствующий у-бгс мРНК. При этом в двух из трех клонов анти-газ-трэнсфектантов, N"1 и № 11, мы обнаружили восстановление экспрессии продуктов ЯБУ до уровня исходной линии клеток НЕТ-БР, не трансфицированой онкогеном Ы-таэ. В одном клоне, N0 4, уровень экспрессии у-бгс не изменился и соответствовал таковому родительской линии НЕТ-ЗР-Ы-гаэ/б.

Результаты анализа экспрессии белкового продукта ррбОу-эгс в клонах анти-газ-транофектантах и родительских культурах методом Вестерн блоттинга представлены на рисунке 8. При этом мы ещо раз сравнили лизпты из обработанных и не обработанных дексаметазоном клеток каждого клона. Результаты Вестерн блот анализа рр60у*""' дают

п

приблизительно ту же картину, что и при анализе мРНК: восстановление экспрессии ррбО"5510 до уровня исходной линии НЕТ-БР (8.7) наблюдалось в клонах № 1 и № 11 (8.1, 8.2 до стимуляции и 8.5, 8. 6 после стимуляции) вне зависимости от стимуляции дексаметазоном. В клоне № 4 (8.3, 8.4 до и после стимуляции дексаметазоном) экспрессия рр60у"5гс не изменилась, то есть осталась на уровне родительских клеток НЕТ-БР-Ы-гаэ/б (8.8) и почти не регистрировалась.

Таким образом, в двух из трех клонов (№ 1 и № 11), полученных после введения антисмысловой Ы-гаэ последовательности (анти-гаэ-трансфектантов), результаты анализа которых представлены в данной работе, мы наблюдали полное восстановление экспрессии у-бгс как на уровне мРНК, так и на уровне белковых продуктов. При этом только в одном клоне (№ I) восстановление экспрессии у-эгс коррелировало с подавлением экспрессии р21М гаг. Наконец, в клоне № 4 не произошло существенных изменений ни в экспрессии у-эгс, ни в уровне р21М га;;. Заметим, что полного подавления (Ч-гав не наблюдалось ни в одном клоне, и различия в уровне экспрессии р21м'га!! среди клонов оказались достаточно незначительными, в отличие от различий в уровне экспрессии \z-src, что, видимо, может свидетельствовать о существовании некоего критического уровня М-гаэ, модуляции которого способны влиять на экспрессию v-src.

21 кД

г ■

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 8. Анализ экспрессии онкогена у-бгс в клонах анти-гаэ-трансфектантах методом Вестерн блотинга.

1-6 - клоны анти-газ-трансфектанты: 1,2- субклон № I до и после обработки дексаметазоном; 3,4 - субклон № 4 до и после обработки дексаметазоном; 5, 6 - субклон № 11 до и после обработки дексаметазоном.

7 - исходная линия НЕТ-БЯ

8 - родительская линия НЕТ-ЗР-Ы-гаэ/б.

3.6 Определение каталазной активности в клонах энти-ras-трансфектантах

Показанный ранее необычайно высокий уровень параметров АОЗ, таких как устойчивость к воздействию Н2О2 (НгОг") и Н202-катаболизирующая активность, в хомячковых эмбриональных фибробластах HEF, трансформированных RSV, линия HET-SR, позволил предположить наличие связи антиоксидантной активности этих клеток с продукцией вирусного белка pp60src. Как уже говорилось, при введении в клетки HET-SR активированного гена N-ras наблюдалось снижение уровня экспрессии v-src (приблизительно на 40-80%) в большинстве полученных клонов, и в частности, в клоне HET-SR-N-ras/б. При сравнении уровня АОЗ таких клеток с родительскими клетками HET-SR было обнаружено, что все клоны N-ras-трансфектанты характеризовались полной утратой НгОг0, а каталазная активность клонов снижалась в 14-26 раз по сравнению с клетками HET-SR, и, более того, - в 3-6 раз по сравнению с уровнем активности нормальных клеток HEF (рис. 9). Таким образом, ранее полученные данные показали наличие прямой корреляции между экспрессией белка pp60src и АОЗ этих клеток, обусловленной рядом параметров, и в частности, уровнем активности каталазы [Deichman G.I. et al.,1996].

Как уже говорилось, в нашей работе при введении в один из клонов N-ras-трансфектантов линии HET-SR (HET-SR-N-ras/6) генно-инженерной конструкции, экспрессирующей N-ras-специфическуга

последовательность в антисмысловой ориентации, были получены клоны, в которых обнаружилось восстановление экспрессии v-src до уровня клеток HET-SR. В этой связи нам представлялось интересным определить, сохраняется ли корреляция между экспрессией pp60v stc и уровнем АОЗ в полученных клонах, то есть происходит ли восстановление биологических параметров параллельно с восстановлением активности трансформирующего агента. В качестве основного показателя мы выбрали уровень активности каталазы, так как эта характеристика в ранее проведенных исследованиях выявляла наиболее значительные различия между линиями HET-SR и HET-SR-N-ras/б. Для анализа активности каталазы мы использовали те же три клона анти-гаэ-трансфектанта (NN° 1, 4, 11), в двух из которых (№ 1 и № 11) было обнаружено восстановление экспрессии v-src. Определение активности каталазы проводилось in vitro в клеточных лизатах спектрофотометрическим методом [ Aebi Н., 1984]. Активность выражалась в единицах на 1 мг

белка, где одна единица соответствует минимальному количеству фермента, способному разложить 1,0 мМ Н2О2. Определение проводилось трижды на трех различных пассажах каждого клона, после чего высчитывалось среднее арифметическое значение.

В таблице (рис.9) приведены результаты анализа клонов анти-гаэ-трансфектантов в сравнении с клеточной линией HET-SR, RSV-трансформированных фибробластов хомяка, родительской линией N-ras-трансфектантов HET-SR-N-ras/б, исходной нетрансформированной линией эмбриональных фибробластов HEF, а также с линией спонтанно трансформированных эмбриональных фибробластов хомяка HETR.

Как видно из представленных данных, в клонах энти-ras-трансфекантах было обнаружено значительное увеличение каталазной активности по сравнению с родительскими клетками HET-SR-N-ras/б: в 8,2 раза - для клона 1, в 6 раз - для клона 11, в 3,7 раза - для клона 4. При этом, несмотря на то, что это увеличение не достигло исходного уровня клеток HET-SR, активность каталазы в двух клонах (№1 и №11) превысила уровень активности данного фермента в линии нетрансформированных фибробластов HEF. .»

Проведенный анализ подтвердил также сохранение корреляции между экспрессией v-src и уровнем каталазной активности. Так, в клонах, для которых было показано восстановление активности v-src (№ 1 и № 11), увеличение активности каталазы было значительно выше (в среднем в 2 раза) по сравнению с клоном № 4, не выявившем восстановление экспрессии pp60v'src. Однако, даже в этом клоне уровень активности каталазы оказался в 3,7 раза выше, чем в родительских клетках HET-SR-N-ras/б, что, предположительно, может отражать влияние онкогена N-ras на показатели антиоксидантной защиты клеток.

Таким образом, в представленной работе обнаружено восстановление экспрессии онкогена v-src и одновременно 4х-8ми-кратное увеличение уровня каталазной активности в RSV-трансформированных клетках N-ras-трансфектантах после введения в них N-ras-антисмысловой последовательности, а также сохранение корреляции между увеличением каталазной активности и уровнем экспрессии продуктов онкогена v-src.

Таблица 1

Клеточная линия Трансформирующий агент Активность каталазы Экспрессия v-src

HEF* - 4,0 ± 0,3 -

HETR* спонтанная трансформация 8,6 + 0,6 -

HET-SR RSV 17,7 ± 1,1 + +

HET-SR-N-ras/6 РЭУ + актив. Ы-гаэ 0,67 ±0,13 ±

HET-SR-N-ras/6 anti-ras клон 1 RSV + актив. N-гаэ + ^газ-апКзепве 5,5 ± 0,25 ++

HET-SR-N-ras/6 anti-ras клон 11 РЭУ + актив. N-гаэ + ^газ-апКвепзе 4,35 + 0,6 h f

HET-SR-N-ras/6 anti-ras клон 4 НЭУ + актив. N-гэб + ^гаэ-апйБепэе 2,5 ±0,15 ±

' -Данные опубликованные ранее [Deichman G.I. et al., 1996].

Выводы

1. Подтверждено, что эффект подавления экспрессии онкогена v-src в RSV-трансформированных фибробластах хомяка, трансфицированных онкогеном N-ras, обусловлен активностью экзогенного онкогена N-ras и является обратимым.

2. Получена панель клеточных линий, производных RSV-трансформированных фибробластов хомяка, несущих и экспрессирующих экзогенные последовательности N-ras и его антагонистов: K-rev1 и N-ras в антисмысловой ориентации.

3. Сконструирован плазмидный вектор, экспрессирующий N-ras-специфическую последовательность в антисмысловой ориентации.

4. Показано, что экспрессия экзогенного гена K-rev1, как функционального антагониста ras, в данных клетках не влияет на биологическую активность онкогена N-ras и не компенсирует его способность к подавлению экспрессии v-src, а также не изменяет морфологический фенотип клеток.

5. Восстановление экспрессии гена v-src до уровня исходных RSV-трансформированных фибробластов было получено при введении в геном N-ras-трансфицированных клеток вектора, экспрессирующего последовательность N-ras в,антисмысловой ориентации. При этом все модуляции в экспрессии экзогенных последовательностей не сопровождались изменениями в структуре этих генов и не вызывали существенных изменений в трансформированном фенотипе клеток.

6. Обнаружено увеличение уровня каталазной активности в RSV-трансформированных N-ras-трансфектантах после введения в них N-ras-антисмысловой последовательности в 4 - 8 раз по сравнению с родительскими клетками. Выявлена корреляция между уровнем каталазной активности и экспрессией продуктов онкогена v-src в этих клетках.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Tchevkina Е.М., Klsseljova N.P., Shtutman M.S., Musatkina E.A., Mizenina O.A., Leskov K.V., Tavitian A. and Kisseljov F.L. Suppression and restoration of v-src expression in RSV transformed cells after transfection with N-ras and its antagonist. Int. J. of Oncol., 1995, v. 7, p. 453-459.

Участок множительной техники ОНЦ РЛМН

Заказ 424 Тираж 100 эг»