Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Ранние этапы взаимодействия онкогенного аденовируса обезьян SA7(C8) с первичными непермиссивными клетками

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ИМЕНИ П. Д. ГЕРЦЕНА

На правах рукописи УД 4 616-006.04-022 : 578.826 : 578.233.083.13

КОТЕЛЬНИКОВА Ирина Николаевна

РАННИЕ ЭТАПЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОНКОГЕННОГО АДЕНОВИРУСА ОБЕЗЬЯН 5А7(С8) С ПЕРВИЧНЫМИ НЕПЕРМИССИВНЫМИ КЛЕТКАМИ

(14.00.14 — онкология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена в Московском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском онкологическом институте имени П. А. Герцена (директор—доктор медицинских паук, профессор В. И. Чнссов).

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор Агеенко А. И.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Хесин Я. Е., доктор биологических наук Илюхин А. В.

Ведущее учреждение — Институт проблем онкологии и радиобиологии им. Р. Е. Кавецкого АН УССР.

Защита диссертации состоится « . . . » . . . . 1991 г. в «... » час. на заседании специалнзнрованого совета Д 084.17.01 в Московском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском онкологическом институте имени П. А. Герцена но адресу. 125284, Москва, 2-й Боткин-скин пр., 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского онкологического института имени П. А. Герцена.

Автореферат разослан « . . . ».....1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

профессор Максимов И. А.

; . ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

- Актуальность проблемы. Участив ДНК-содержащих онкогенных ви-

;£хЕрус0В в образовании опухолей у животных и ^ трансформации первичных культур убедительно доказано на разных экспериментальных иоде лях. Также имеется достаточно данных в пользу того, что некоторые из них, такие как вирус герпеса П типа, вирус папилломы, вирус гепатита В, являются кофакторами в этиологии злокачественных новообразований человека м.А.,19871 ОвЪгош н.э., 1987)•

Исследования в современной молекулярной биологии и генной инженерии дали возможность идентифицировать вирусные гены и их продукты, ответственные за трансформации и туморогенез. На модели вирусного онкогенеза о использованием как РНК-содержащих, так и ДНК-содержащих вирусов, благодаря возможности манипулировать отдельными вирусными генами, были изучены функции белков - продуктов этих генов, что внесло некоторую ясность во взаимоотношениях вирусов и клеток-шшеней.

Б настоящее время механизм трансформации и опухолеобразова-ния рассматривается как многоступенчатый процесс, в котором участвуют и клеточные, и вирусные гены. На различных экспериментальных вирусных моделях показано, что для приобретения клетками трансформированного фенотипа в культуре требуется как минимум два этапа: I этап - приобретение клетками свойств иммортализации (способности к бессмертии, что обеспечивает им неограниченное число делений),,0 этап - приобретение клетками свойств трансформированных. .В трансформированных клетках появляются н^ые фено-типические признаки: независимость от сывороточных ростовых фак— тороз, морфологические изменения, способность делиться без °ри-крепдения к подложке, экспрессия эмбриональных антигенов и опу-холеоцецифических трансплантационных антигенов, низкую организацию цитоскелета, опухолеродность для животных и другие, все выые перечисленные признаки трансформированных в культуре клеток свойственны и опухолевым клеткам, образующимся в организме.

Были идентифицированы группы клеточных генов, называемое протоонкогенами, экспрессирущиеся при онкогенезе и экспериментально продемонстрировано их участие в иммортализации и трансфор-

нации стабильных клеточных линий. Грущш клеточных протооккоге-нов является аналогами регровирусных генов, участвующих в трансформации. К группе имморталиэукщих клеточных генов относятся про-тоонкогены туе и шуъ и их аналоги ретровирусные шус и шуъ. Например, клеточный онкоген шус наиболеэ сильно эксяреосирован во. многих В-клеточных лимфомах человека, в том числе и в лимфоме Беркита (Klein g. at al., 1985). К группе трансформирующих генов относятся клеточные онкогены группы гае. Гены ехой грущш были выделены из многих опухолей человека, в том числе из легких, поджелудочной железы, из карциномы мочевого пузыря (Biebop J.M., 1983).

Подобное разделение функций стало известно и для ДНК-содер-кащих вирусов. Так для аденовирусов четко показана способность раннего гена Е1А иммортализовахь первичные клетки, Установлена большая степень гомологии структуры гена Е1А аденовирусов и ге-•. нов ретровирусов туе и myb (Ralston Е. et al.,4983). Функция трансформации кодируется у аденовирусов геном Е1В, его продукты определяют и опухолеродность трансформированных клеток для грызунов (Van den Elsen P. et al., 1982$ Bernards R. et al., 1983),

Применяя различные сочетание иммортализующих и трансформирующих генов, полученных как из ДКК-содержащих, так и из РНК-оодер-жащих вирусов, а таюае из опухолей человека, исследователи получили доказательства необходимости участия обеих групп генов в получении эффективной трансформации первичной культуры.

Аденовирусы - перспективная модель для изучения особенностей трансформирующего действ д днк-содер£гш,их вирусов» Достаточно подробно изучен лишь один онкогенный аденовирус - Ad 12. Что ка-гчется обезьяньего аденовируса SA7, данные о механизмах его трансформирующего действия скудны, Неаду тем, этот вирус представляет, пожалуй, особый интерес, так как является единственным известным в настоящее время вирусом эг'сго семейства, индуцирухщии опухоли у природного вида хозяев.

Использование аденовирусов для изучения механизмов онкогене-за, с одной стороны, является удобным, так как для них генетически идентифицированы участки ДНК, транскрибируемые с них мШ и белки, осуществляющие и иымортализацию, и трансформацию, кроме того, вирусные гены не имеют аналогов с клеточными генами, как у ретровирусов. -.

С другой стороны, использование аденовирусов для изучения механизмов онкогенеза мгдруднено из-за множества функциональных активности каждого продукта трансформирующих генов вируса.

Для достижения эффективной трансформации, помимо вирусных генов требуется, по-видимому, определенны,1:1 набор функциональных изменений клетки-мишени. Исследования последних лет показали, что ДКК-содер«адие вирусы актиЕйруют те же клеточные гены, что и рет-ровирусы и химические канцерогены, а также индуцируют появление новых МРНК (Schutztoank I. et al., 1982* Scott li.RJ). et al-, 1933).

Используя ДНК-синтезирующуа систему клетки-мишени, аденовирусы после интеграции в геном клетки индуцируют начальные этапы генетических изменений, которые сопрозоадавт конверсию нормальной клетки з трансформированную. Экспрессия вирусных генов на ранних этапах лнфекции приводит к активации генетического аппарата клетки, что, по-видимому, является важнейшим условием для обеспечения возможности дальнейших эпигеношых изменений, позволяющих клетке проходить все ступени трансформации и поддерживать трансформированной фенотип.

Изменения функций генетического аппарата трансформированных клеток являются объектом исследования как в эксперименте, так и в опухолях человека. В настоящее время получено много данных, указыьающих на большое сходство начальных этапов развития опухоли в организме и при трансформации клеток in vitro, что наводит на мысль об универсальности механизма'онкогенеза.

Большинство работ данного направления в эксперименте выполнены на стабильно трансформированных клеточных линиях и не дают представления о ранних событиях взаимодействия вируса с непер-миссивной клеткой.

Цель работы: изучение экспрессии аденовирусных ДНК, соответствующих областям Е1А и EtВ, на ранних сроках после инфекции червячных культур эмбриональных клеток мыши аденовирусом обезьян SA7(C8) и сопутствующих изменений пролиферативного статуса и макромолекулярных синтезов в клетках-мишенях.

Для реализации- этой цели были поставлены следующие задачи:

'1, Изучить возможности оценки реакции клеток на вирусное заражение в условиях культивирования в среде без сывороточных фак-' торов.

2. Оценить спектр мРНК, соответствуищсх ранним генам Е1А и Е1Б. . .

3. Получить данные о параметрах клеточной пролиферации в . культурах при лишении их сыворотки и после заражения вирусом

SA7CC8).

4. Исследовать реакцию хроматина клеток на заражение опухо-леродныц вирусом s&7(C8).

5. изучить реакцию нуклеолярного аппарата клетки и активность рибосомных генов в ответ на вирусиое воздействие.

Научная новизна.

1. В работе представлена новая научная информация об экспрессии на уровне МРНК аденовирусных ДНК, соответствующих областях Е1А и'Е1В аденовируса SA7 в первичных недермиссивыых клетках. Показано, что экспрессия этих мРНК резко нарастает на протяжении первых 48 часов после адсорбции вируса»

2. Показано митогенное действие вируса в культурах, содержащихся в условиях полного отсутствия сыворотки в течение нескольких суток.

3. Установлено, что вступление клеток из состояния покоя в митотнчеокий цикл под действием вируса сопровождается необычной реакцией хроматина - повышением степевв его компактности*

4. Получены доказательства активации рибосомных генов клетки непосредственно после заражения культуры вирусом»

5. Выявлены количественные .морфологические изменения нувлео-дярного аппарата клеток шшеней в ответ на вирусную инфекцию.

Т(?рр<?тиче$н;ая и цракгичесщ PftfaW'

Установлены закономерности ранних ¿«гадов аденовирусного онкогенеза, хроиолог^л зкспрессии матричных РНК вируса, ответственных за опухолевую трансформацию влеток-миаеней. Подучены уникальные факты о функционировавши генома кхе*ок на уровне синтеза макромолекул вусдовиях воздействия ояухолеродного аденовируса, позволяющие лучше понять механизмы феномена опухолевой трансформации.- .'•■

Разработана зксперимзнтальнаяшдел* для изучения взаимодействия вкрус-клетка в уоловиях отсутствия воздействия сывороточных факторов. Адаптированы методы современной кошшиеризоваяной цитологии для изучения пролиферазавпого иазгуса, структуры хромати-

— э -

на и активности рибооотк генов на уровне отдельных клеток. Эти методы могут быть использованы как в эксперименте, так и в клинической практике для оцзнкй эффективности различных воздействий на опухолевые клетки.

Апробация диссертации. Диссертация апробирована на объединенной научной конференции экспериментального отдела МНИОИ имени П.А.Герцена. Основные материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых 1981 г., на Всесоюзной научной конференции "Структура и функция хроматина", г.Ленинград, 1985} на 3-й Республиканской конференции "Автоматизация цитологических исследований", г.Киев, 1988. , ...

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6.научных работ, включая 4 отатьи в центральных журналах.

Обьен и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глава "Материал и методы", главы "Результаты собственных исследований и их обсуждение", заключения, выводов л указателя литературы. Диссертация изложена на 86 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами, 15 рисунками. Список литературы содержат 192 истопника, иа которых'8 отечественных и 184, иностранных.

Диссертация выполнена в лаборатории вирусологии ИНИИОИ имени П.А.Герцена (руководитель - доктор медицинских наук, профессор А.Й.Агоенко) в соответствии о планом НИР, является фрагментом темы "Опухолевый рост - как механизм иммунологического распознавания своих соботвешшх поверхностных эмбриональных антигенов". Фрагмент А. "Исследование механизмов онкогенеза". Oui лыше фрагменты работы выполнялись в лабораториях гемоцатологии (руководителе - проф.Г.И.Козинец) и генных диагностикумов (руководитель -к.б.н^Г.Я.Соловьев) Всесоюзного гематологического научного центра МЗ СССР,.

/

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЕ Материал и методы исследования

Биологический материал: первичные трипсинизироганные культуры клеток эмбрионов мышей СВА 12-16.дня.беременности, непер-миссивные для аденовируса обезьян si.7(c8), аденовирус обезьян sa.7(G8) с исходным инфекционным титром - 10^'4 ЦЩЦ0 в 1 мл.

Цитохимические методы: 1) реакция Фипьгена в модификации Ко-зинца Г.И. и соавг, (1986), 2) импрегнацш ядрышкообрааующих районов 50$ раствором аеНО^ в модификации Погорелова (1937)» 3) авторадиография с 3Н-тимидином (Епифанова 0--И-., Терских ВсВ»р 1969).

ЦитоФогометрию клеточных ядер проводили на сканирующем цито-фотометре штн фирш Не1сЬвг^;1 Австрия, соединенной о настольной ЭВМ НР9845 фирмы Неяг1вП"Рас1сагйг, США. При анализе гистограмм распределения клеток по содержанию ДНК пользовались методом Беаа (1980).

Компьютерную морйометрию осуществляли на анализаторе И0Р-У1<1еор1аг1 фирмы копЪгоп, ФРГ, с использованием телевизионной проекции изображения клетки, Структуры нуклеолярного аппарата обводили по контуру на дигитайзере.

Выделение и анализ РНК. РНК выделяли из клеток с 611 гуани-•динизотиоцианатом с последующей очисткой центрифугированием в СеС1 и электрофорезом в агарозе (Мапиасио и соавт., 1975). В блот-гибридиэации (Бои-Ышгпо 1985) в качестве зондов использовали нативную ДНК БА7 и фрагменты вставки ранней области, соответствующие генам Е1А и Е1В. Источником получения клонированного материала была плазиида рАЕР„

Денситометрам радиоавтографов проведали на денситометре фирмы 1ЕВ;, Швеция, путем линейного сканирования вдоль полосы электрофореза» Количественную оценку полученных'кривых осуществляли с помощью планиметрии на дигитайзере.

Статистическую обрабегчу проводили с помощью стандартного пакета програш на ЭВМ Кохгьгоп, достоверность различий мезду группами определяли по методу Вилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕД0БА1..ИЙ И ИХ ОШУВДЕНЫЕ 1 • Параметры пролиферации в'культурах в различных экспериментальных условиях. Культуры,выращиваемые на среде 199 о добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТО), достигали монослоя на 3 сутки. В это время доля клеток в Б-фазе по данным цитофотометрш ДНК и импульсной (1 час) метки Н3-тимидинон варьировала в разных опытах.от 10 до 34% и в среднем составляла около 16&. По данным суточной метки за сутки 8-фазу происходило от 29

до 67% реви популяции (и среднем 44,2%). В g2 в среднем находилось 22,8% (от 13 до 34% в различных опытах).

Dpa лишении культур сыворотки параметры пролиферации резко менялись. Через сутки культивирование <5ез ЭТО индекс метки (Ш) снввался в среднем с 14,6 до 3,9%, через г суток - до 2,14%, через 3 суток - до 1Р67%, через 4 суток - до 1,38% и через 5 суток - до 1,32%о Иными словами в бессывороточных культурах пролифера-тивные процесса снижены до минимума. Это подтверждается данными цшгофотоиетриио Через сутки после лишения культур сыворотки про-центров содержание клеток в s-фазе в среднем падает втрое ( с 16,0 до 5,1%)о В последующие дни, однако, доля клеток в s-фазе несколько возрастает и варьирует в пределах 7,8-9,5%. Количество клеток в g2 хотя и колеблется в отдельных наблюдениях от 4% до 27&, однако в среднем на протяжении 5 суток культивирования без сыворотки достоверно не меняется, При инкубации в течение суток с На--тшшдинои ИМ варьировал от нескольких десятых до 4,1% (рис.1).

Таким образом, при лишении культур эмбриональных фибробла-стов сыворотки на стадии монослоя происходит резкое замедление пролдф<зратшвных процессов. Это выражается, прежде всего в падении доли клеток, включающих Н3-тиыидин. То, что доля клеток в s-фазе по данным цитофотометрии в несколько раз больше, чем Ш, указывает на возможную остановку клеток в прохождении s -фазы до завершения синтеза ДНК - еще одно свидетельство глубоких нарушений прохождения клеточного цикла.

При заражении культур через одни сутки после лишения ЭТС ИМ увеличивается в 14 раз, а в последующем в 6-8 раз. Оч. .ь близкие значения получаются и при цитофотометрической оценке содержания клеток в s-фазе (табдЛ)., Доля клеток в &2 в среднем несколько снижается при заражении через 2/3 и 4 суток культивирования без сыворотки^ однако статистически достоверное снижение наблюдается лишь через 4 суток-, При заражении через одни сутки без сыворотки процентное содержание клеток в g2 практически не меняется.

При заражении культур, растущих в присутствии 10% сыворотки наблюдается увеличение доли клеток в s -фазе по данным автобиографии и цитофотометрии примерно на 40%, доля клеток в фазе s-при этом не меняется. После добавления 10% сыворотки к культурам, находившимся перед этим без сыворотки в течение 1-х и 3-х суток,

ни в одной, ни в другом случае выраженной стимуляции пролиферации выявлено не было.

•Таблица 1

Влияние заражения бессывороточных культур вирусом в различные сроки культивирования без сыворотки

Параметр Условие п М т. Разброс Медиана р

1 сутки контр. 6 3,8 0,9 2-7 2,7 <0,001

ИМ вирус 6 52,7 5,2 39-70 50,2

8 контр. 7 5,1 0,59 3-7 5,2 < 0,001

вирус 7 49,7 5,6 29-68 45,0

2 сутки . контр. 5 2,2 0,6 0,8-4,3 1,7 ^ 0,001

ИМ вирус 5 15,3 6,3 6,2-40,8 9,6

г контр. 4 2,5 0,64 1-4 2,5 < и,оа1

вирус 4 17,7 5,7 7-34 15,0

3 сутки контр. 4 1,5 0,87 0.2-4,0 0,95 < 0,001

Ш вирус 4 9,4 1,6 6,1-13,0 9,2

Б контр. 4 2,05 0,4 1-3 2,1 < 0,001

вирус 4 10,7 '1,7 8-15 10,0

4 сутки ' контр. 4 2,1 0,6 (¡,2-3,1 2,5 < 0,001

Ш вирус . 4 17,8 4,5 7-25,3 19,0

з контр. 4 7,75 0,62 6-9 8,0 < 0,001

вирус 4 14,5" 3,4 8-24 13,0

Нами были такке поставлены несколько дошшшгедьшх контрольных экспериментов. В одной серии опытов яшшеите сиворота культуры добавляли супернатант от кульэур, инфицированных вирусом и культивировавшиеся без ЭТС в течение 2 и 24 часов после инфекции,

В другой серии экспериментов йесси&оро?ачше к/амуры заражали вирусом в разведениях 1/100 и 1/1000. Вй в шрзюи, ш во втором экспериментах не выявлено ечтулвтя пролиферации,;

Нами была предпринята попытка оцениеь доли клеток, находящихся в фазе покоя о0 на основании даншх цзао^отокетрических исследований. На 3-й день, культивярозаяия в б0 шхоштея от 1%

до 17$ клеточной попул.щии, в среднем - 4,7%. Через сутки посла лишения культур сыворотки это количество возрастает в среднем до 14,и в дальнейшее возрастает (до 22,856 на 5 сутки). При заражении вирусом этих культур наблюдается «екоторое снижение доли клеток, находящихся в а^, статистически достоверное во всех наблюдениях (рис.2).

Таким образом, лишение культур сыворотки резко тормозит про-лиферативные процессы ухе в первые оутка, что выражается в значительном уменьшении доли клеток, находящихся в в -фазе и возрастании количества клеток в фазе В последующие несколько суток пролиферация в культура^ находится на минимальном уровне, однако до 3& клеток в среднем продолжает включать Н8-тимцдин. В это не вреип наблюдаются нарушения в прохождении клетками цикла, что выражается в остановке части клеток в з -фазе до ее завершения. Некоторое увеличение доли клеток в в0 (с 5 до 1в первые сутки и до 2,1% в последующие 4 суток) свидетельствует о том, что в этих услозиях наблюдается незначительный переход из в ао.

Нам представляются справедливыми представления В.Вааегеа о том, что клеткам в оо не хватает для прохождения цикла не питательных веществ в среде, а факторов роста. Действительно, в отсутствии ростовых факторов многие кулыуральные линии впадают в физиологическое состояние покоя (й0), в котором они могут пребывать очень долго.

Глубина погружения клеток в состояние покоя меняется по мере культивирования: если инфекция вирусом производится через одни сутки после лишения культур сыворотки, когда "глуо'-аа погружения1, клеток в состояние покоя еще незначительна, то ИМ вырастает примерно в 14 раз, а на 3-4 сутки - лишь.в 6-8 раз. Еще бо-;е наглядны эти различия в абсолютных цифрах: при инфекции через одни сутаи после лишения сыворотки ИМ в среднем составил 52$, а через 2 и 4 суток - 9,4& и М,8% соответственно.

Лишение культур сыворотки нарушает прохождение клетками Б-фазы: если ИМ на 2-5 сутки бессывороточного культивирования варьирует в пределах 1,3-3,9%, то доля клеток в Б -фазе по данном ци-тофои'оыетрии ДНК существенно выше - 5,1-9,4%. Следовательно, часть клеток с содержанием ДНК соответственно Б-фазе, не включает Н3-тимидин. Это свидетельствует, либо об остановке, либо о резком замедлении прохождения б-фазы этими клетками.

Рис. I, Влияние лишения оыворотки на параметры щкмшферации в культуре.

Ось абсицисс - продолжительность культивирования бее сыворотки (аут.) Ось ординат - процентное содержание клеток в ра-влкчных фазах митотичес-кого цикла.

Рис. 2. Процентное содержание клеток в фазе ц в культурах после лишения оыворотки (белые столбили) и заражения вирусом (темные столбики)

Ось абсцисс - процент клеток в д. Ось ординат - срок культивирования без сыворотки (сут.)

Прз всех экспериментальных условиях значительная доля клеток находилась в фазе а2. При культивировании с 10% сыворотки в g2 находилось около 23$ популяции, в культурах, лишенных сыворотка - ож 10 до 20?, после инфекции вирусом - 12-17%. Достоверных различий в содержании клеток в g2 'между различными экспериментальными условиями нами не выявлено.

По данным Hurray и соавт. (1982), при заражении эмбриональных фибробластов аденовирусом человека 5 типа (культивировали в среде с 0,2$ ЭТО) в а2 находилось прн различных экспериментальных условиях от 11 до 3156 клеток. Они наблюдали нарастание доли клеток в &2 через 3 суток после инфекции. Кроме того, до 20% клеток в это время содержали ДНК выше тетраплоидных значений, то есть были полиплоидными. В контроле таких клеток (>g2) авторы не наблюдали.

Мы также наблюдали до 9% полиплоидных клеток в культурах, однако, в отличие от работы Murray и соавт. они встречались при всех экспериментальных условиях и не могут быть, следовательно, отнесены за счет вирусного воздействия.

2. Изучение структур^ зромауива клеточных ядер. Сканирующая цитофотоиетрия клеточных ядер, окрашенных по Фельгену, была проведена в трех независимых экспериментах. При сканировании мы измеряли оптические плотности во всех участках ядра зондом площадью 0,25 мкм . Сумма этих площадей соответствует площади ядра, сумма зарегистрированных оптических плотностей,то есть интегральная оптическая плотность (ИОП) - общему содержанию ДНК в условных единицах, а следовательно и положению клетки в митотическом цикле, а отношение ИОП к площади ядра, средняя оптическая плотность (СОП) отражает степень компактности хроматина.

После вирусного воздействия СОП ядер увеличивается в среднем для клеток, находящихся в фазах клеточного цикла, на 16,1%, для члеток, находящихся в s-фазе, - на 11,3%, в е2-фазе - на 13,1:4 (средние данные по результатам трех экспериментов). Одновременно наблюдается уменьшение средней площади ядер на 11,*, 11,8 и 12,1% для клеток, находящихся соответственно в g^-, s-и о? -фазах. Воздействие вируса приводит к появлению более высоких оптических плотностей, то есть более конденсированных участков хроматина (рис.3).

Изиеренне толщины клеток не выявило статистически достоверной разницы иехду контрольными и инфицированный« культурами. Следовательно, наблюдаемое увеличение СОП не является результатом простого утолщения ядер.

Таким образом, действие опухолероднзго аденовируса приводит к увеличению степени конденсации хроматина, сопровождающемуся возрастанием СОП, уменьшением средних значений площадей клеточных ядер и сдвигом оптических плотностей в сторону более высоких значений. Эти изменения характерны для клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла.

Возрастание степени конденсации хроматина в ответ на вирусную инфекцию было обнаружено и на других системах с использованием РНК и ДНК-содержащих опухолеродных вирусов: в эмбриональных фибробластах легкого человека, инфицированных вирусом герпеса I и П типов (Truaal ь., 1975) и цитомегаловирусом человека (mug.i-•. ani н,, 1981) и в лимфоцитах мыши, инфицированных вирусом эрит-ролейкоза френда (Bartels Р., 1980). В приведенных работах клетки исследовали без учета положения их в штотическом цикле. Наши данные указывают на то, что возрастание конденсации хроматина происходит вне связи с фазой клеточного ци1:ла, хотя оно более выражено для клеток, находящихся в Gq/1 -фа:*:.

Учитывая, что вирусная инфекция сопровождается стимуляцией пролиферации (что наблюдается и в наших экспериментах) реакция хроматина клетки на воздействие вируса является уникальиой: на вйех известных нам моделях любая стимуляция матричной активности ведет к деконденсации хроматина и к увеличению размеров ядра: при стимуляции щитовидной железы метилтиоура/даом (Kiefer в. et ai., 1974), в культурах диплоидных фибробласмв человека wi-зв, стимулированных к пролиферации сменой среда (Hicoiinl к. et ai., 1977).

Клетки, инфицированные вирусом, ведут себя противоположным образом, ¿{еханизмы такой парадоксальной реакции и ее биологический смысл остаются неясными. В работе r.Kemata и соавт. (1979) было показано, что в первые 3 -часа после инфекции цитомегаловирусом клеток культур эмбрионального легкого человека появляются два белковых фактора, вырабатываемых в цикле репликации вируса и ассоциированных с хроматином клеток с мол.массой 70 и 30 кД. Один из них стимулирует матричную активность хроматина клетки, а дру-

гой ведет к изменению структуры хроматина. Так, что не исключено, что изменение структуры хроматина вызывается ранними белками вируса (Кадила Т., 1979).

Связано ли увеличение конденсации хроматина о оп/холевой * трансформацией клеток? До некоторой степени, да. Об э'^ом свидетельствуют данные В.К1е£ег, С.Запйгтег (1976), исследовавших ядра клеток щитовидной яелезы в норме, при гиперплазии и в опухолях, а такае сравнивавших размеры и содержание ДНК в ядрах протоков молочной нелезы и клеток из карциномы. В частности, в раковых клетках конденсация хроматина была, почти вдвое выше, чей в клетках нормальных протоков.

Р.КепйаН и соавт. (1979) сравнивали ядра диплоидных фибро-бластов 7П—58 и ядра линии клеток подвергшихся трансфор-

мации под влиянием вируса эт-ад. Оказалось, что в трансформированных клетках конденсация хроматина достоверно выше, чем в контроле. Иными словами злокачественным клеткам присущ повышенный уровень конденсации хроматина.

Однако, насколько конденсация хроматина, наблюдаемая, нами на ранних этапах контакта клетки с вирусом, кояет бить связана о последующей трансформацией остается неясным. Тем более, что подобная реакция наолюдаетсп и в пермиссивной системе (Тгива1 ъ.,

19751 Миз1ап1 а., 1981).

3. Изучение состояния нуклеодярного аппарата и активности ркбосомных генов. Известно, что при стимуляции покоящихся клеток к пролиферации одним из первых ответов -является нарастание синтеза РНК и в частности, рибосомной РНК (рРНК)СВаае^а в., 1985). Это сопровождается активацией иуклеолярного аппарата, что выраиа-ется в постепенном преобразовании структура ядрызек, увеличениеи их размера, формированием нуклеонемы, Ядрышко является "фабрикой рибосом", причем сегменты ДНК, кодирующие рРНК, то есть цксхраны рРНК, локализуются.на коротких плечах акроцептрических хромосом (у человека, например, это 13,14,15,21 и 22 хромосомы) и носят, название ядрышкообразующих районов (ЯОР). На хромосомах, окрашенных красителем Гимзы, ЯОР представляют в виде слабоокрашенных участков, а электронная микроскопия выявляет в этих участках необычную структурную организацию комплекса ДНК - белок (Негаапаег-Уегйип, 1980). В интерфазном ядре ЯОР находятся в конденсированном состоянии и образуют''фибриллярные центры ядрышка. Здесь про-

£>~

2) -15 -

ю Н

2) -I

15

ю ^ 5

А

й-

п

о од .од 03 вд 05

Рас. 3. Распределение оптических плотностей в клеточных ядрах в контроле (верхняя гастограы ыа) и после вирусного заражения (нижняя гистограмма) .

Ось абсцисс - величины оптической плотности (ед. опт. плотности). Ось ординат - процент клеток.

Рис. 4. Общая площадь нуклеол (1), средняя площадь нуклеол (2) в ..суммарная площадь гранул серебра на клет-' ку (3; х 0,1).

Ось ординат — площадь в мкм2.

I - вдльтуры с этд П - культуры без ЭТО Ш - культуры, лишенные оыворотки после вирусног заражения.

исходит сборка рибосомной РНК.

В 70-х годах был предложен цитохшшчеокий метод выявления ЯОР, заключающийся в их окраске солями серебра (Goodpasturg, Bloom, 1975)s в результате этой реакции на препаратах хромосом или', интерфаэных ядер над ЯОР располагаются зерна серебра.

Важным аспектом этой реакции является то, что она выявляет активные рибосоыные гены (Hubbell, 1985) и отличается стехиоиет-ричностью. Это было доказано с помощью положительной корреляции между интенсивностью окраска Ag-fiOP и включением Н3-урадина в 18S и 28S рРНК в культуре диплоидных фибробластов человека (Morton, 1983) н с использованием кмнуноцитохиынческой локализации транскрипционных комплексов РИК-полкмеразн I и генов рРНК в регенерирующей печени на ультраструктурном уровне ' (сьеег, Вове, 1984).

Доведение нуклеолярного агпарата клетки в условиях воздействия вируса практически пе исследовалось. Что касается синтеза клеточной РНК в этих условиях, до недавнего времени считалось, что он стимулируется ДНК-содерзащикп вирусами по тому же механизму, что и при стимуляции сывороткой. Однако в дальнейшем были выявлены некоторые различия. Так оказалось, что при стимуляции культур 10% ЭТС синтез РНК монет быть полностью заблокирован 0,03 нкг/ил актиношцина Д, но эта концентрация не влияет на симуляцию культур аденовирусом 12 типа (Laughlin, Stroh!, 1976),- то есть, для запуска синтеза ДНК при инфекции аденовирусом 12 типа синтез РНК оказался необязательным. Это было подтверждено и в работе Pochron и соавт. (1980) для аденовируса 2 типа, воздействие которого на культуру клеток хомячка стимулировало пролиферацию без активации синтеза РНК и, в частности, рРНК. Эти данные отличаются от результатов, полученных при изучении других типов ДНК-содержащих вирусов (SY-40 а яолиош), которые стимулируют синтез и накопление РШ в покоящихся клетках. В частности, очищенный большой Т-анти-ген вируса sv-ад стимулирует синтез рБКК в изолированных нукле'о-лах печени крысы (Wfaeliy, 1978). На основании этих данных било ^сказано предположение, что геном аденовирусов 2 и 12 типов содержит ген(ы), ответственные за индукцию синтеза ДНК, что. в даль-взйвеи а подтвердилось.

В дальнейшем оказалось, что аденовирусы 2, 12 и 5 типов ин-гибируют продукцию 18S и- 28S рРНК в клетках - мишенях, а адено-

вирус 12 типа, по крайней мере, в период первых 8 часов после инфекции тормозит образование 28S н 5.8S рРНК из их предшественника 32S рРНК (Lawler, 1989).

В свете .этих данных закономерно поставить вопрос: является ли .тнеанный феномен универсальным для всех аденовирусов и, в частности, 'для SA7? Для ответа на этот вопрос нами было предприня-' то исследование нуклеолярного аппарата н активности рибосомкых генов в культурах, инфицированных ал? с использованием компьютерной морфометрии (см. главу "Материал и методы").

При корреляционном анализе данных морфометрии нуклеол в ар-гентофильного материала выявлены оледующие закономерности: общая площадь гранул серебра пропорциональна суммарной площади и количеству нуклеол (Рс 0,0001), то есть величина и количество нуклеол связаны с активностью рибосомкых генов» средняя площадь нуклеол обратно пропорциональна их количеству в клетке (Р < 0,0001). До-видимому, эта зависимость отражает обратное соотношение между количеством акроцеитрических хромосом, прикипающих участие в образовании отдельной нуклеолы и ее площадью. Удаление из культуры ЭТС способствовало значительным изменениям в показателях состояния нуклеолярного аппарата. Суммарная площадь нуклеол уменьшилась с 8,98 до 5,92 'мкм2 (на 34%, Р < 0,0001), количество нуклеол на клетку - с 2,87 до 1,89(на 35%, Р< 0,001), количество гранул серебра на клетку - с 26,9 до 8,7 (на 67%, Р< 0,0001). Иными словами, удаление из культур ЭТС приводило к резкому снижению активности рибоссшных генов в клетке. . '

При заражении культур без ЭТС увеличивались практически все параметры нуклеолярного аппарата: общая площадь нуклеол увеличивалась с 5,92 до 8,56 мкм2 (на 45%), средняя плокадь нуклеол - с 3,7 до 5,1 мкм2 (на"38%), количество гранул серебра на клетку -е среднем с 8,98 до 12,2 (на 35%), а их суммарная площадь - с 0,26 до 0,-9 мкм2 (на 57%) (рис.4).

Эти данные подтверждаются результатами полуколичественных исследованйй (табл.2).

Таким образом, при инфекции культур эмбриональных фибробла-стов мышей вирусом SA7 увеличивалась определяемая количеством связанного серебра активность рибосомных генов. Эффект выражен г.ьк при неличии ЭТС, так и без нее. Однако в системе без ЭТС действе вируса выражено сильнее: количество гранул серебра увеличи-

яось на 752 по сравнению с 36£ л культурах о ЭТС. По-видимому, это связано с исходно более высокой активностью рибосомных генов при наличии в среде ЭТО. Стимуляция генов рРНК, очевидно, непосредственно связана с действием вируса: в инфицированных вирусом ', инактивированных культурах увеличения аргентофильности нуклеол не обнаружено.

Таблица 2

Влияние заражения вирусом зА7(С8) на состояние нуклеолярного аппарата, % к контролю

Изучаемые параметры Культуры Культуры без ЭТО „ '

интактный вирус инактивированшгй ! вирус

К1 +27,5 +32 -10х

К2 +1х' +27 +16,7

НК +5,5х ■ +21 -9,6х

ИК +36,5 +75 -4 ¡,8х

х) различия статистически недостоверны (Р > 0,05). К1 - среднее количество зерен серебра на ядро, К2 - средний размер гранул (усл.единица), НК - нуклеолярный коэффициент - среднее количество пуклеол, ИК - интегральный коэффициент (K1 х К2 х НК).

Таким образом, если допустить, что активность рибосоиных генов отражает интенсивность синтеза рРНК, исследуемый нами обезьяний аденовирус sa? отличается от аденовирусов человека 2,5 и 12 типов по воздействию на синтез клеточной рРНК, то есть не тормозит его, а стимулирует.

4. Экспрессия онкогена SA7. Результаты блот-гибридизации мРНК, выделенных из первичных культур эмбриональных фибробластов мышей СБА на различных срокзх после инфекции и контрольных мРНК из линии sh2 представлены на рис.5. По всей видимости блот-гиб-ридизация с выбранными ДНК-зондами является специфической, так . как нет заметного сигнала в области 18S и 2SS рРНК, положение которых определялось в геле после электрофореза окраской бромистым этидием. Из данных, представленных на рис.б А,В,С совериен-но очевидно различие в картинах блох-гибридизации с использованием различных ДНК-зондов

Зоид ¡A? Зонд g Зонд t

1 2 3 1 Z 3 1 Z 3

Рио. 5 А,В,С..Экспрессия мЕНК SA7, выявляемая блот-гиоридиза-дней на разных сроках после инфекции непермиосивных клею« ц в стабильно трансформированных клетках SE2»

A. Блот-гибридизацня с ДНК-зондом, соответствующим полной копии вируса SA7 (зонд SA7)„

B. Блот-гибридизация с ДНК-зоидоы, соответствующим ранней области Е1А. (зонд G),

C. Блот-гибридизация с ДНК-зондом, соответствующий ранней области Е1В (зонд I).

:• В дорожках: * ..

1. РНК из эмбриональных мышиных клеток через 24 чаое> : . после инфекции» , 2. ЫК из эмбриональных миаиных клеток через 28 часов после иифвхщт,

3; РНК из стабильно трансформированных ьирусом SA7 кле~

sok (sh2).

Стрелки слеза указывают'положение маркеров 28 и 18S рРЩС.

На каждую дороаку нанесецо 20 V РНК.'

Для количественной, оценки динамики накопления различных мРШС юответствующих онкогену Вк7 (Е1А и Е1В) был использэван метод шнейной деиситометрии сигнала гибридизации вдоль каждого трет I последующим расчетом площадей, ограниченных кривой левоитонат- ' (им. Площади рассчитывались в интервале 18-283 (Е1В) и 9-188 ;Е1А) (рис.б).

Результаты планиметрического расчета приведены в сабл»3.

Таблица 3

Динамика экспрессии аденовирусных мРНК, рассчитанная планиметрически из денситограны

Время а/а Зонд Общая РНК A. 28-18S($) В. 18-9S(%)

1. Н2 830 626 (75) ; 113 (14)

2. 24 SA7 740 464 (62) 95 (13)

3. 48 744 602 (18) 71 (9)

1. Н2 2091 724 (35) 1166 (56)

2. 24 g 88 16 (18) 74 (84)

з. 48 4-00 154 (38) 220 (55)

1. Н2 1518 852 (56) 576 (38)

2. 24 I "73 58 (80) 12 (16)

3. 48 511 ' 373 (73) 135 (26)

Д. - площадь на денситограике, соответствуем выбранному

интервалу 28-18S. В. - площадь на денситогракне, соответствует выбранноиу

интервалу 18-93« • В скобках процентное содернанзз os общей площади.

Из данных, представленных в .таблице, следует, что все 3 ДКК-онда выявляют гибридизациошшй сигнал з выбранных зонах обсчета, рячои процент распределения метки для кандого зонда существенно уличается. Наиболее интересными представляются сравнительные дан--ае по накоплению ыРНК, соответствующих генам Е1А и Е1В на разных роках после инфекции. Очевидно, что количество ыРНК, соответствует* Е1А на 48 часах увеличивается в 3 раза по сравнению с 24 ча-Ш1 после инфекции. В аналогичные сроки происходит увеличение со-врадния Е1В мРНК в 6,5 раз.

Обоукдая данные по гибридизации отдельных ДНК-зондов прежде всего надо отметить, что Вк7 -зонд, направленный на все вирусные нРНК, выявляет в клетках SH2 набор молекул, мигрирующих при электрофорезе.в агарозном геле в основном между 18S и 28S рРНК. При Золее длительной экспозиции автографа гибридизационный сигнал обнаруживается и в области 12-15Б. Это говорит о том, что относительное количество uPHK 12S и '¡5S для ранних генов в клетках БЫ2 невелико. Гибридизация этого же зонда с мРНК из зараженных клеток на 24 и 48 часах после инфекции выявляет качественно сходную картину. Можно предполагать, что в непермиссивных клетках первичной культуры эмбриона мыши к трансформированных SA7 линии меток крыс SH2 синтезируются аналогичные классы молекул РНК. Зонд на область El А на 24 часах после инфекции выявляет заметную вону гибридизации шше 18S (предположительно 12-13S). Некоторое несоответствие в подвижности (реально видна зона около 13-15S) можно объяснить недостаточной денатурацией в геле, что, как известно, замедляет подвижность молекул. На 48 часах после инфекции выявляется гибридизация в той же области, но одновременно виден сигнал в районе между 18S и 28S маркерами. При гибридизации о РНК из клеток SH2 указанный зонд выявляет несколько зон гибридизации: ниже 18S" и с той же эффективностью в зоне между 18S и 28з. При специфической гибридизации ДНК-зонда с нРНК, ориентированно считываемых с Е1А области, гибридизационный сигнал должен наблюдаться только в области ниже 18S рРНК маркера (ЫогапЕ., 1987). Появление сигнала в районе более крупнюс молекул может быть обусловлено несколькими причинами. Во-первых, проскакиванйе! терминирующего сигнала для 12S и 15S ранних вирусных мРНК, но это противоречит данным по гибридизации с ДНК-зондом, соответствующим I фрагменту (рис. 5В), так как в случае проскока оба зонда должны выявлять одинаковые классы молекул, но зтсно в эксперименте не наблюдалось (сравни данные по гибридизации с зондами G и I на рис.БА и В). Во-вторых, появление длинных молекул может быт2 связано со способом интеграции аденовирусной ДНК в хозяйскую хромосому. Здесь подразумевается, что аденовирусна*' ДНК может интегрировать фрагментами, что особенно часто наблюдается при высоко! множественности заражения клеток. Так как в клетках SH2 есть несколько интэгрированных копий генома SA7 и использованная множе-^i3JHH0CTb при заражении первичных клеток эмбриона мыши была до-