Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Иммуногистохимия макроглобулинов в паренхиме и строме рака молочной железы до и после лучевой терапии

РГ8 ОД

] 9 .'пр На правах рукописи

КОЗЛОВ ДМИТРИЙ ВАСИЛЬЕВИЧ

ИММУНОГИСТОХИМИЯ МАКРОГЛОБУЛИНОВ В ПАРЕНХИМЕ И СТРОМЕРАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ДО И ПОСЛЕ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ

14.00.15 — патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Челябинск —1996

Работа выполнена в Новокузнецком государственном институте усовершенствования врачей.

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Доросевич А. Е., доктор биологических наук, чл.-корр. АЕН РФ Зорин Н. А.

Официальные оппоненты:

член Международной Академии Патологии, заслуженный деятель науки Удмуртской Республики, зав. кафедрой патологической анатомии Ижевской медицинской академии, доктор медицинских наук, профессор Глумов В. Я.,

доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической' анатомии Омской медицинской академии Кононов А. В., член Международной Академии Патологии, лауреат Государственной премии СССР, зав. кафедрой патологической анатомии Тверской медицинской академии, доктор медицинских наук, профессор А. М. Шабанов.

Ведущая организация:

медицинский университет им. акад. И. П. Павлова (г. Санкт-Петербург).

Защита диссертации состоится "__"_1996 г.

в______часов на заседании диссертационного совета

Д 084,04.03 в Челябинской государственной медицинской академии.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии (454092, г. Челябинск, улица Воровского, дом 64).

Автореферат разослан"_"_1996 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор Бордуновский В. Н.

-.з -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ * * *

Актуальность исследования.Более половины так называемого естественного роста рака молочной железы /РМЖ/ происходит скрытно,вне досягаемости диагностических возможностей маммологического скрининга CLundgren В,1977]. Основные надежды,в связи с этим, возлагаются на разработку новых методов ранней диагностики рака,в том числе с использованием опухолевых маркеров [Аничков Н.М..Зиновьев А.С,,1993;Волченко H.H.и со-

авт.,1996].Среди последних особое место принадлежит альфа -о

макроглобулинам /АМ/ [Zorin N. А. е. а. 1992].

Несмотря на информативность использования AM в диагностике РМЖ, морфологическое изучение протеинов лишь намечается. Отсутствуют сведения о роли AM в морфогенезе РМЖ,о распределении AM в паренхиме и строме рака,в том числе об особенностях иммунодетекции /ИД/ AM в тканях РМЖ в связи с постлучевым патоморфозом,Отсутствуют сведения об участии AM в морфогенезе PMS,особенно его ранних стадий.Не прослежена иммуногистохимическая эволюция белков в тканях интактной молочной железы /МЖ/,доброкачественных и злокачественных опухолей МЖ.Недостаточно освещена морфогенетическая роль кровеносного сосудистого русла /КСР/ и его клеточного микроокру-кения в раке,а также их роль в динамике AM в тканях Ш,фиброаденомы /ФА/ И РМЖ.

Таким образом,иммуногистохимия /ИГХ/ AM в тканях до и после лучевой терапии /ЛТ/ не изучена,что определяет актуальность нашего исследования.

Объект исследования - депарафинированные гистологичес-

кие срезы операцкошо-биолсийного материала 131 .наблюдения РМЖ до и после ЛТ,21 наблюдения ФА и тканей 21 интактной от опухолей МЖ.

Предмет исследования - ИГХ АМ.

Цель исследования - изучить ИГХ АМ в паренхиме и строме ГШ до и после ЛТ,выявить их роль в морфогенезе и прогнозе еаболевания.

Задачи исследования: 1.Разработать методики забора,фик-

о

сации и ИГХ исследования АМ в операционно-биопсийном и архивном' (парафиновые блоки) материале ФА и РМЖ, а также тканях интактной МЖ. 2.Изучить характер распределения АМ в сравнении с плазминогеном /ПГ/. и фибриногеном /ФГ/ в тканях нормальной Щ, ФА, РМЖ до и после ЛТ,в том числе в наблюдениях с большей и меньшей чем пять лет выживаемостью больных после предоперационной ЛТ. З.Морфомотрически изучить площадь паренхимы и стромы,а также площадь и удельную плотность гис-тоструктур стромы РМЖ до и после ЛТ в сравнении с ФА и интактной МК. 4.Провести гистометрическое изучение клеточного периваскулярного микроокружения вокруг артериол,венул и капилляров в ткани РШ до и после ЛТ в сравнении с ФА и интактной Ш. 5. Оценить роль КСР и его клеточного микроокружения в морфогенезе РМЖ и динамике АМ. 6.На основании анализа выявленных особенностей исследуемых структур в тканях РМЖ до и после ЛТ в сравнении с ФА и интактной МЖ оценить результаты и разработать критерии,способствующие более полному пони» N

манию вопросов морфогенева и повышайте точность морфологической диагностики рака,дифференциальной диагностики ФА и РМЖ, оценки адекватности ЛТ и прогнозирования рака.

Научная гипотеза - АМ'являются неспецифическими марке-

рами опухолей МЖ при ИГХ исследовании гистологических срезов операционно-Сиопсийного материала онкообразований железы.

Методологические основы диссертационного исследования базируются на последовательном определении уровней ИГХ детекции АМ в паренхиматозных и стромальных компонентах тканей1, начиная с интактной от опухолей МЖ,далее ФА,а затем ШЖ до и после ЛТ с целью изучения динамики и особенностей распределения АМ в этих тканях,определения их роли в морфогенезе рака,выявления критериев,повышающих точность морфологической диагностики РМЖ,дифференциальной диагностики ФА и РМЖ,оценки эффективности ЛТ^ составления прогноза заболевания.

Методы исследования - гистология,гистохимия,ИГХ и гис-тометрия исследумого материала.

Организация исследования.Исследование проведено в морфологическом отделе центральной научно-исследовательской лаборатории Новокузнецкого ордена Трудового Красного Знамени института усовершенствования врачей и Смоленском областном институте патологии.Диссертационная работа выполнена по научному плану ЦНИЛ Новокузнецкого ГИДУВа и связана с проблемой "Ингибиторы протеиназ/роль в норме и при патологических процессах".Номер государственной регистрации 01.9.40 004214,УДК 577,15.Номер комплексной темы в плане института -100/к.

Научная новизна.Представленные в диссертации данные и

о

их теоретическое обобщение можно рассматривать как новое научное направление: ИГХ АМ в раке в сравнении с доброкачественной опухолью (ФА) и интактной тканью органа (МЖ) - одна из основных частей материального субстрата критериев морфологической диагностики рака и дифференциальной диагностики

ФА и РМЖ,оценки эффективности предоперационной ЛТ рака и прогнозирования заболевания.

Выявлено,что альфаг-гликопротеин /АБГ/ в интактной МЖ присутствует в минимальных количествах и ингибирование про-теиназ выполняет альфаг-макроглобулин /МГ/,локализуясь в основном в стромальном компоненте железы. Впервые показано, что в ФА наблюдается резкое повышение ИД МГ в гиперплазиро-

ванном эпителии. В РМ& наблюдается падение ИД МГ в раковом о

эпителии в сочетании с резким усилением присутствия в паренхиме 'АБГ,который в раке начинает выполнять основные функции по ограничению активности протеиназ. В РМЖ после ЛТ Наблюдается снижение ИД АБГ и повышение № опухолевой тканью.Заинтересованность АМ в опухолевом росте позволяет квалифицировать их как неспецифические маркеры онкообразований МЖ,

Качественно новым является проведение ряда морфометри-ческих исследований гистоструктур РМН до и после ЛТ,а тааде оценка уровней ИД искомых белков в паренхиме и различных структурах стромы МЖ,ФА,РМЖ до и после ЛТ. При этом показаны статистически достоверные различия площади паренхимы и стромы в Ш, ФА, РМН до и после ЛТ,площади и удельной плотности КСР,лимфоцитов /ЛФ/,фибробластов /ФБ/,макрофагов /Ш/,плазматических клеток /ПК/ и полишрфноядерных лейкоцитов /ПЯЛ/ в исследуемых тканях Ш и се онкообразований.Обнаружены отличительные особенности ИД ФГ и ПГ в тканях MB,ФА,РМЖ до и

нссле ЛТ.Выявлено,что ИД АМ в кровеносных сосудах,в отличие * v

от особенностей динамики Ш в паренхиме и некоторых гистост-руктурач стремы рака;ФА и интактной ME, имеют большее посто--янство в разных нозологиях.. Это подтверждает важную роль КСР в морфогенезе PME,в. частности в динамике. АМ.

- г -

Впервые гистометрически изучено клеточное периваскуляр-ное микроокружение,представленное ФБ,ФЦ,ЛФ,ПК,МФ и ПЯЛ.Обнаружены статистически достоверные различия количества ФЦ и ФБ,расположенных вокруг артериол в тканях ФА и РМК.Показаны отличия КСР интактной МЖ.ФА и РМЖ до и после ЛТ,а также характерные особенности ангиогенеза и неойаскулогенеза в раке. Основными отличительными особенностями КСР РШ от доброкачественных опухолей и интактной МЖ являются наличие нео-васкулогенеза и гетерогенности сосудов МЦР,включая сосуды незрелого типа.

Морфологически подтверждено участие меток лимфо-плаз-моклеточного инфильтрата /ЛПКИ/ стромы опухоли в динамике АМ.ИГХ выявлены различия ИД ДМ в ЛФ, ПК и Ш стромы ФА и РШС до и после ЛТ.Полученные результаты позволяют полагать,что клетки ЛПКИ стромы опухолей участвуют в биосинтезе, а сосуды в транспорте АМ от КСР к регионам опухоли и обратно.

Положения выносимые на защиту. 1.ИГХ исследование АМ возможно в депарафинированных гистологических срезах как свежефиксированной ткани, так и архивных парафиновых блоков операционно-биопсийного материала многолетней давности,фиксированного 157.-ним нейтральным водным раствором формалина. 2.В тканях МЖ,ФА,РШ до и после ЛТ имеются существенные различия уровней содержания АМ.В ФА,по сравнению с МЖ,отмечается повышение ИД МГ в паренхиме.В развитом раке наблюда-

о

ется падение детекции МГ и увеличение ИД АБГ в паренхиматозном компоненте.Эффективная ЛТ тормозит биосинтез раковым эпителием АБГ. З.КСР выполняет транспортную роль в динамике АМ начиная с интактной МЖ,что проявляется большей стабильностью уровней ИД белков в стенках и содержимом кровеносных

- 8 - ■

сосудов,чем в других структурах тканей Ш,ФА,РМН до и после ЛТ. 4.Периваскулярное клеточное микроокружение является динамичным отражением паренхиматозно - стромальных отношений, участвует в трансформациях АМ,имеет отличия в МЖ и ее опухолях. 5.Различия паренхиматозно - стромальных отношений в PME до и после ЛТ.ФА и интактной МЖ (статистически достоверные различия величин площадей паренхимы,стромы,некроза;количества паренхиматозных клеток,фиброцитов и фибробластов,расположенных вокруг артериол в ФА и РШ; уровней ИД АМ в ФА.РМЖ до и после ЛТ) могут выступать в качестве критериев, повышающих точность морфологической диагностики,оценки эффективности ЛТ и индивидуального прогнозирования опухолей МЖ.а АМ являются неспецифическими маркерами опухолей МЖ в гистологических-срезах.

Теоретическая значимость заключается в том,что результаты работы обосновывают необходимость изучения морфогенеза рака,адекватности ЛТ и оценки прогноза РМЖ с позиций особенностей ИД АМ в паренхиме и строме опухоли.

Научно-практическое значение определяется тем,что проведенные исследования подтвердили иммунологические данные о том,что АМ являются неспецифическими маркерами опухолевого роста и показали возможность использования их с з- --:": целью в патомсрфологической практике.

Выявленные особенности иммунопероксидазного окрашивания . АМ в паренхиме и строме ФА и РШ до и после ЛГ способствуют повышению точности морфологической диагностики рака.диффе- ' ренциальной диагностики ФА и РМЖ,составления прогнозам его. индивидуализации на основе ИГХ оценки эффективности ЛТ.

Разработка .методик вабора,фиксации . и ИГХ исследования

операционно-биопсийного материала и архивных блоков ФА и РМЖ до и после ЛТ для ИД АМ адресована непосредственно патологоанатомам. Показано,что фиксацию операционо-биопсийного материала можно проводить в обычном для практики клинических патологов 15%-ном нейтральном водном растворе формалина; гис-то^репараты после, иммуннопероксидазного окрашивания могут быть докрашены гематоксилином и эозином,заключены в бальзам и храниться в таком виде длительное время без снижения качества окраски.

■ Наши исследования [Козлов Д.В.и соавт.,1995] ИД АМ в опухолях различцрй•локализации позволяют утверждать,что основные сведения об особенностях распределения АМ в паренхиме и строме РМЖ можно экстраполировать па опухоли разной локализации.

Апробация работы.Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:1.Заседании проблемной комиссии "Морфология опухолей" Научного Совета по комплексной программе "Злокачественные новообразования" при Президиуме Российской Академии Медицинских наук (Москва,1995),заседаниях Ученого Совета Новокузнецкого института усовершенствования врачей (1993-1995 гг.).2.28-й научно-практической конференции врачей Ульяновской области "Новое,прогрессивное в практику здр&воохранеия",(1993). 3. Заседании Ученого Совета Смоленского областного института патологии (1995).4.Заседании Кеме-

о

ровской областной ассоциации патологоанатомов (1995). 5.Результаты работы доложены на заседании кафедры патологической анатомии Челябинской медицинской академии (1996).6.3-й Межрегиональной научно-практической конференции патологоанатомов Урала и.Западной Сибири,Челябинск,1996. 7.Всероссийской

конференции "Организация паллиативной помощи и методы лечения больных с распространенными формами злокачественных новообразований" ,Москва,1995.8.Всероссийской конференции "Иммунологический мониторинг патологических состояний и иммуно-реабилитация",Москва,1995.9.Всероссийской конференции "Опухоли висцеральных локализаций.Ранняя диагностика,лечение" .Томск, 1995. 10. Всероссийской конференции "Совершенствование методов профилактики и диагностики злокачественных новообразований", Москва, 1995. 11.Конференции с международным участием "Экология и общественное здоровье населения".Новокузнецк, 1994.12. 1-ом Международном конгрессе "Иммунодиагностика и ' иммунотерапия",Витебск,1995.13.1-st International Congress Immunorehabilitation",Sochi. Russia, 1994. 14.XXll-nd Meeting "Basic Research and Clinical Application in Human Tumor Immunology and Molecular Biology", September 18-22,1994,Groningen,The Netherlands.15.International symposium "Immunology of reproduction",Kiev,Ukraina,19-23 October ,1993.16.IX-th International Congress of Immunology, San Francisco,1995. 17. Работа апробирована на заседании Ученого Совета института усовершенствования врачей (Новокузнецк, 26 марта,1996). ' ,

Публикации.По основным материалам диссертации поданы, шесть заявок на изобретения,опубликованы 30 научных работ и издано учебно-методическое пособие.

Внедрение результатов исследования. Частично материалы диссертации отражены в учебно-методическом пособии "йммуно-гистохимическая диагностика и дифференциальная диагностика, опухолей . молочной железы",Новокузнецк,1994.-12 С. ■ '

Гистологические,гистометрические и ИГХ критерии диаг-.

- и -

ностики и дифференциальной диагностики ФА и РМЖ до и после ЛТ, оценки эффекта ЛТ и прогноза РМЖ внедрены в практику Кемеровского и Новокузнецкого патологоанатомических бюро,материалы диссертации излагаются при чтении лекций на кафедрах патологической анатомии МАЛО (г.Санкт-Петербург),медицинских акЛДемий Смоленска и Кемерова,что документируется соответствующими актами о внедрении.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, глав "Альфа - макроглобулины при раке молочной дерезы и некоторые аспекты морфогенеза заболевания (об8ор литературы)", "Онконозолс^ическая характеристика больных с поражением молочной железы и методы исследования", пяти глав результатов собственных исследований,заключения.выводов,практических рекомендаций,указателя литературы и приложения. Работа изложена на 320 (в том. числе приложение 72) страницах машинописи. Из них 175 страниц представлены рисунками,таблицами и указателем литературы. Текст диссертации иллюстрирован 41 рисунком и 43 таблицами,5 из которых находятся в тексте и 38 в приложении. Указатель литературы содержит 294 отечественных и 221.иностранных источника.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ * л *

Материал и методы исследования *'

Для решения поставленных задач исследованы ткани молочных желез 173 женщин.Основную часть материала составили архивные парафиновые блоки и анатомические препараты мастэкто-мий,осуществленных по поводу РМЖ.Опухолевую ткань изучали

как до,так и после ЛТ.Всего исследован материал от 131 больной РМЖ. Возраст больных колебался от 28 до 90 лет и в среднем составил 52,96 лет.

Материал РМЖ без предоперационной ЛТ был представлен 60 наблюдениями и разделен на три группы.Средний возраст больных- 54, 08 лет,а размах индивидуальных колебаний возраста отмечался от 28 до 90 лет.Первую группу составили 20 наблюдений, которые гистологически квалифицированы как дольковый ин-о

фильтрирующий рак (РМЖ ДМ).Во вторую группу отнесен операционный Материал 20 наблюдений протокового инфильтрирующего рака (FMI ПИ).Третью группу составили 20 наблюдений РМЖ других гистологических форм (РМЖ ДФ) - слизистого,медуллярного, папиллярного рака, FM с метаплазией плоскоклеточного и веретеноклеточного типа и болезни Педжета соска.

В наблюдениях РМЖ с предоперационной ЛТ гистогенез опухоли установить было невозможно из-за лучевого повреждения опухолевой ткани. Преобладали наблюдения со второй и третьей степенями лучевых повреждений.ЛТ проводилась крупными- фракциями, курсами. Средняя суммарная доза облучения для всей группы наблюдений составила 27,33 Гр.при колебании индивидуальных суммарных доз облучения от. 18,3 до 6С гр.Возраст ' больных данной группы колебался от 32 до , 80 лет (средний возраст-51,83 года).

Наблюдения РМЖ с комбинированной терапией, включающей предоперационную ЛТ,разделены на три группы в зависимости от пятилетней выживаемости больных.Суммарный срок выживания 33 больных,проживших более .. пяти лет,составил. 9,24 года,а сум-, марная доза облучения-от 19,7 до 60 (средняя суммарная доза облучения-25,09) Гр.В 20 наблюдениях больные прожили.менее

пяти лет и погибли от генерализации процесса.Суммарный срок выживания составил 2,02 года,при индивидуальных колебаниях от полугода до 4,9 лет.Средняя суммарная доза облучения для этой группы больных оказалась равной 26,61 Гр.В третьей группе у больных оставшихся 18 наблюдений отсутствовали све-декия о сроке выживания. Средняя суммарная доза облучения для данной группы равна 32,21 Гр.

Для сравнительного анализа изучали ткань МК с наличием ФА.Возраст 21 больной колебался от 16 до 48 лет и в среднем составил 31,05 лет.В 7 наблюдениях опухоль имела характер интраканаликулярной ФА,в 9 периканаликулярной ФА и в 5-сме-шанной ФА.В одном наблюдении имелось билатеральное поражение желез.

Бее изучаемые в работе параметры исследованы,также, в ткани интактной от опухолевых процессов МЖ. Средний возраст 21,женщины на момент забора материала составил 45,48 лет. Все женщины погибли от травм, или от острых сердечно-сосудистых заболеваний (Табл.1).

Операционный материал и архивные блоки для исследований брали в клиническом онкологическом диспансере (г.Новокузнецк) .Часть архивных блоков наблюдений с предоперационной ЛТ получены в Смоленском областном институте патологии (директор - доктор медицинских наук,профессор А.Е.Доросевич). * Ткань интактной от онкопроцессов МЖ забрана в танатоло-

о

гических отделениях судебно-медицинского бюро и провектур /г.Новокузнецк/. *

После окончания операций для гистологического,гистохимического и ИГХ исследований вырезали необходимое количество кусочков.Материал фг ;сировали 15Х-ным водным нейтральным

раствором формалина и заливали в парафин,Гистологические срезы толщиной 5-8 мкм готовили с помощью микротома.Депара-финирование гистологических срезов проводили обработкой их в

Таблица 1.РАСПРЕДЕЛЕНИЕ МАТЕРИАЛА ИССЛЕДОВАНИЙ ПО НОЗОЛОГИЧЕСКИМ ГРУППАМ

N5* 1 Вовраст К о Л и ч е с т В 0 н а б л ю д е н и й

пп 1 от-до ММ ФА ■ РМЖ без ЛТ РМЖ после ЛТ

(лет) ЛИ ПИ ДФ Всего >5 лет <5 лет Не-изв. Всего

1. ¡15-90 21 21 20 20 20 60 33 20 18 71

Пояснения.ММ-ткань интактной от онкопроцессов молочной железы;ФА-фиброаденома;РМЖ-рак молочной железы;ДИ-доль-кобый инфильтрирующий; ПИ - протоковый инфильтрирующий;

.ДФ-другие гистологические формы РМЖ;> 5 лет-наблюдения с выживаемостью больных более пяти лет; < 5 лет-наблюдения с выживаемостью больных менее пяти лет;Неизв.-наблюдения с неизвестными сроками выживания больных после комбинированной терапии.

трех порциях о~ксилола по 5 минут в каждой с последующим содержанием срезов в термостате при 58° С. в течении 10 ми-

* Приносим нашу искреннюю признательность за. предоставленный м.зтериал профессору А.Е.Доросевичу, ■ патологоанатомам. Л.П.Николаевой и В. А. Захарову, судебно- медицинскому- эксперту' ■ М. П. Ивацину.

нут.Обезвоживание срезов достигали обработкой их в четырех порциях этанола (абсолютный,96°,70° и 56°) по три минуты в каждой.

Окраски гистологических срезов осуществляли по. описанным прописям [Волкова 0.В.,Елецкий Ю.К.,1992;Меркулов Г.А.,1969; Рокейс Б.,1954].Кроме микроскопии срезов,окрашенных гематоксилином и эозином, во всех наблюдениях соединительную ткань выявляли по методу ван Гизона.Эластические волокна исследовали по методу Вейгерта.а аргирофильный каркас изучали по Футу. Гликозаминогликаны исследовали реакцией ШИК и по методу Хейла. ДНК определяли по Фельгену, а РНК по методу Браше.

Велки-МГ,АБГ,ПГ и ФГ исследовали путем иммунопероксидаз-ного окрашивания СНго Т..Ленхофф Г.,1988]. Все необходимые для проведения иммуногистохимических /ИГХ/ реакций реактивы получены в иммунологическом отделе ЦНИЛ.**

В начале ИГХ реакции гистологические срезы переводили на пять минут в 0,05 М забуференный физиологический растБор рН 7,6 /ЗФР/.Блокирование эндогенной пероксидазы (этот и последующие этапы проводили в чашках Петри) осуществляли свежим ЗХ-ным раствором перекиси водорода.Длительность этапа 10 минут. ЗФР пять минут.Далее выдерживали срезы под каплей 5%-но-го раствора лошадиного сывороточного альбумина (50 мг альбумина в 1 мл ЗФР). После этого избыток альбумина стряхивали и

** Искренне благодарим заведующего центральной научно-исследовательской лабораторией Новокузнецкого института усовершенствования врачей, доктора биологических наук, чл. -корр.АЕН РФ Н.Л.Зорина за предоставленные реактивы для ИГХ детекции альфа-макроглобулинов, плазминогена и фибриногена.

аккуратно обтирали предметные стекла вокруг среза.На последний наносили каплю афинно очищенных кроличьих биотинилиро-ванних антител против МГ (или других исследуемых протеинов) в концентрации 8 мкг/мл ЗФР.Раствор антител содержал в себе 3% альбумина и 0,01% азида натрия.

С целью увеличения вязкости раствора добавляли полиэти-ленгликоль-6000 (Sigma,U.S.А.) до конечной концентрации его

в растворе 5Z (заявка на изобретение 94003431 /002884/,прио-с

ритет от 28.01.1994 года).Инкубацию срезов проводили в течение 30'минут при 37° С в чашках Петри с созданием условий влажной камеры,для чего на дно чашки Петри укладывали фильтровальную бумагу смоченную ЗФР.Две порции ЗФР по 5 минут в каждой,после чего раствор ЗФР меняли на свежий.

Обрабатывали срезы комплексом авидин-пероксидаза или стрептовидин - пероксидаза (Jlenmoc .Россия) в течение 30 минут. Непосредственно перед применением комплекс разводили в 200 раз в ЗФР.ЗФР 5 минут.Иммунологическое проявление осуществляли в 0,03Х-ном растворе субстрата в течение 10 минут. Раствор получали смешивая непосредственно перед применением 1 мг 3,3-5,5-диампнобензидина тетрахлсрида /ДАБ/ фирмы Sigma (U.S.A.) с 2 мл ЗФР и 0,2 мл 0,3%-ной перекиси водорода. Реакцию останавливали ополаскиванием срезов в двух порциях дистиллированной воды.

Учитывая,что полученные темно-коричневые преципитаты ДАБ нерастворимы в воде,спирте и ксилоле осуществляли окраску ядер клеток гематоксилином Майера в течение 3 минут.Далее срезы проводили через свежие спирты восходящей концентрации .. (56°,70°,96° и абсолютный этанолы) и три порции о-ксилола путем тщательного ополаскивания в каждой жидкости,затем зак-

лючали в бальзам.

При осуществлении ИГХ реакции всякий раз использовал:: "положительный" и "отрицательный" контроли.Все микроскопические исследования и микрофотографирование проводили с помощью биологического исследовательского универсального микроскопа - МВИ-15 (ЛОМО,Санкт-Петербург). Результаты ИГХ реакций оценивали по наличию желто-коричневого окрашивания изучаемого протеина в опытных микропрепаратах и "положительном" контроле, при отсутствии окраски в "отрицательном" контроле.

Оценивали де-уекцию исследуемых протеинов по степени их окрашиваемости,применяя балльную систему,а именно:! балл-отсутствие окраски; 2 балла- отсутствие окраски одних и окра-шиваемость других клеток паренхимы и зон стромы в желто-коричневый цвета;3 балла- окрашиваемость различных структур от светло-желтого до желтого цвета; 4 балла- окрашиваемость всех структур в желтый цвет;5 баллов- окрашиваемость разных зон стромы и клеток паренхимы от желтого до коричневого цветов; 6 баллов- окрашиваемость в коричневый . цвет различных структур тканей.

Площади паренхимы,стромы,некроза,сосудов опухолей,а также удельную плотность клеток: ЛФ,ПК,1®,ФЦ,ФБ и ПЯЛ опухолевой ткани изучали ммкронорфомотричееккм методой в 40 полях зрения при увеличении микроскопа в 400 раз с помощью окуляр-

о

ной измерительной сетки ГАвтандилов Г.Г.,1984].

Площадь паренхимы,стромы и некроза вычисляли в процентном отношении ко всей просчитанной площади среза,а удельную плотность ЛФ и други подсчитываемых клеток стромы вычисляли на 1000 точек в абсолютных цифрах [Доросевич А.Е.,19883.

- 18 -

Исследовали периваскулярное клеточное минроокружение.Для

этого определяли количество ФЦ,ФВ,ЛФ,ПК,МФ и ПЯЛ вокруг ар-териол.венул и капилляров опухоли.Подсчет клеток проводили в 10 полях зрения при увеличении микроскопа в 900 раз под масляной иммерсией.Протоколировали общее количество клеток в 10 полях зрения,совпавших с тест-точками большого квадрата окулярной измерительной сетки.Важно отметить,что идентификация'

и подсчет клеточного окружения вокруг микрососудов проводи-

0

лись б непосредственной близости от них, располагая сосуд в центр йоля зрения [Доросевич А.Е.,1987].

Гистологическую картину опухолей Ш! оценивали в соответствии с рекомендациями второго издания Международной гистологической классификации опухолей МЖ.Степень злокачественности РМЖ определяли по рекомендациям Р.Скарфф и Г.Торло-ни,1969.Степень лучевого повреждения РМЖ оценивали по В.П.Модяеву и соавт. ,1991.Изменение структуры региональных лимфатических узлов устанавливали согласно предложениям А.Котье и соавт.,1978.Степень синусового гистиоцитоза ЛУ определяли по №.Шеро1ои5ка, 1973.

Ретроспективно гистологические, гистохимическ'-»", ИГХ и морфометрические попозателл исслэдомишй сопоставлял)! с клиническими результатами лечения - пятилетней выживаемостью больных.Отправной точкой последней являлась дата мастэкто-мии,которую проводили по завершении курса радиотерапии.

Статистическая обработка полученных цифровых данных гис-тометрии проводилась с помощью критерия Фишера-Стьюдента,величину которого сравнивали с табличными значениями согласно • числу степеней сиободы [Кактурский Л.В., 1980; Лакин Г.Ф., . 1980; ойвин. И. А., 1950; Тавкз К., 19803.

- 19 -

Используемые в работе единицы измерений приведены в соответствии с Международной системой единиц СЛипперт Г.,1980].

Иммуногистохимия альфа - макроглобулинов, их роль в морфогенезе рака¡возможности использования белков в качестве неспецифических маркеров опухолей молочной железы,а также критериев,повышающих точность оценки эффективности предоперационной лучевой терапии рака и прогнозирования заболевания

*

Данные наших исследований подтверждают иммунологические сведения о заинтересованности альфа-макроглобулинов /АМ/ в опухолевом росте [Веремеенко К.Н.и соавт.,1988;Bohn Н.е.а., 19813 и основаны на следующих результатах работы.

Площадь паренхимы в интактной МЯС составляет 5,69+1,19% и в ней находится малое количество исследуемых белков: МГ-1,43+0,11 и АБГ-1,24+0,01 балла. В строме железы белков больше и преобладает уровень МГ-3,81+0,01 над АБГ-3,10+0,01 балла.Это указывает на значительную роль его в метаболизме соединительной ткани,где показано [Веремеенко К.Н. и соавт., 1988],что МГ регулирует процессы синтеза и расщепления основных ее компонентов - коллагена,эластина,протеогликанов и структурных гликопротеинов,зависящих от активности соответствующих протеинаэ.Роль АБГ в регулировании протеиназ стро-мы,возможно,близка МГ.но концентрация его меньше.Таким обра-

о

зом.в ткани нормальной Ш регулирование активности протеиназ осуществляет преимущественно МГ.

Считается,что в нормальных условиях основным источником биосинтеза МГ являются гепатоциты [Веремеенко К.Н.и соавт., 1988;Petersen С.М.е.а.,1988],хотя показана секреция его ЛФ

[Горлина H.K.и соавт. ,1992; Miyanaga O.e.а. ,1988 ), ФБ Шо-sher D.F.,Wing D.A.,1976]. АБГ синтезируется В-лимфоцитами Шогпе C.H.W.е.а. ,1976;Thomson A.W.e.a. ,1980 ].Имеются доказательства возможности их биосинтеза и другими мононуклеар-ными клетками крови [Зорин H.A.и соавт.,1991; Chowdhury R.S. е.а.,1987], а также некоторыми линиями злокачественно трансформированных клеток tLundgrem Е.е.а. ,1979],в том числе экс--

плантатами РМЖ различных гистологических типов USarclo-о

ne E.J.e.a. ,1883].

В'SA железы, при близкой МЖ площади паренхимы, наблюдается значительное увеличение ИД МГ в паренхиме (5,43+0,13) и снижение в строме (2,86+0,10).При этом количественное, увеличение МГ. в паренхиме и редукция белка в строме более выраже-

Баллы

Ы Г

АБГ

М Г

АБГ

ДЕТЕКЦИЯ БЕЛКОВ В ПАРЕНХИМЕ

ДЕТЕКЦИЯ .лсЛКОВ В СТРОМЕ

Рис Л. Сравнительная оценка уровней иммунодетекции МГ и АВГ в паренхиматозно - стромальном компонентах Ш /1/, ФА /2/, РШ до /3/ и после /4/ лучевой терапии

ны.чем АБГ (3,10+0,09"и 2,29+0,10 балла,соответственно). Результаты наших исследований позволяют предположить, что .уже

гиперплазирующийся эпителий ФА увеличивает концентрацию AM за счет локального их биосинтеза.Подобных данных в литературе мы не обнаружили.

В раковом эпителии,по сравнению с ФА,наблюдается еще большее увеличение АБГ (4,67+0,21 балла)«тогда как ИД МГ падает (2,86+0,16 балла).В строме рака,в сравнении с ФА,также, отмечается уменьшение уровня ИД МГ (2,14+0,08 балла),при некотором увеличении АБГ (2,86+0,21 балла).Можно полагать,что накопление AM в опухолевол паренхиме происходит не только за счет локального биосинтеза ИП эпителиальными клеисами, но и

путем поглощения ими белков из окружающей стромы.В таком о

случае становится понятным отсутствие ИД МГ в строме,прилежащей к раковой паренхиме. ь

В наблюдениях РНЯ после ЛТ ИД МГ в строме несколько лозрастает (до 3,00+0,15 балла),а в паренхиме- снижается (до 2,75+0,12 балла).ИД АВГ в строме остается на том же,что и в РМЖ без ЛТ уровне,а в паренхиме резко снижается (до 2,89+0,12 балла).В РМЖ площадь паренхимы,по сравнению с МЖ и ФА,увеличивается более чем в пять раз,а после ЛТ показатель уменьшается в два раза,по сравнению с раком до ЛТ,и эти различия имеют статистическую достоверность.Подобные данные получены в предшествующих исследованиях [Доросевич А.Е.,19883, показавших статистически достоверное уменьшение площади паренхимы РШ "после JIT с 29,56+2,88 до 17,98+1.42% (Р < 0,001).Следует.подчеркнуть,что'эти данные,как и наши, полу-° чены при исследовании гистологических срезов операционного материала мастзктомий,осуществленных по завершении курса ЛТ.Для других ситуац..Д результаты .вероятно, будут иными.

В секрете железы и очагах слизистой дистрофии опухолей

ИД МГ самой высокой оказалась в наблюдениях РМЖ лосле ЛТ с выживаемостью более пяти лет после комбинированной терапии,а самой нивкой в РЖ без ЛТ. Подобная динамика уровня МГ отмечена и в очагах некроза рака, что можно объяснить тем, что в РМЖ после радиотерапии,в частности в наблюдениях с пятилетней выживаемостью больных, возникают более обширные зоны лу- ' чевых повреждений.В связи с этим создаются более высокие

уровни содержания АМ.При этом можно видеть, что МГ выполняет о '

основную задачу по регулированию активности протеиназ в очагах диЬтрофии и некроза.

В РМЖ площадь стромы.по сравнению с МЖ и ФА,уменьшается до 73,61+1,19%, а после ЛТ возрастает до 87,63±1,34% (Р < 0,001).Площадь некроза в РМЖ составила 2,07+0,29%,а после ЛТ. она увеличилась до 16,78+3,38%.В наблюдениях.других исследователей [Доросевич А.Е.,19881 средняя величина площади стро-мы РМЖ до ЛТ равнялась 68,45+3,27%,а после ЛТ - 73,18+11,86% (Р < 0,05). Площади некроза в РМЖ до и после ЛТ были.соот-вественно, следующими:1,98+0,87 и 8,83+1,49%.Указанные факты показывают, что после ЛТ РМЖ дистрофические и некробиотичес-. кие процессы в паренхиме преобладают над таковыми в строме. Более интенсивно происходит изменение и уровней детекции АМ в паренхиме.. ,

В очагах некроза наиболее высоким уровень ИД АМ был в наблюдениях РМЖ после ЛТ с выживаемостью больных после ком-, бинированного лечения более пяти лет,а самым низким,в наблюдениях рака, после ЛТ с выживаемостью больных менее- пяти лет. , Различия уровней ИД МГ оказались статистически - достоверными.-, между РМЖ до и после.ЛТ и наблюдениями РМЖ после ЛТ с, раз-! личными сроками ЕЫжиЕания больных после комбинированной -.те- ,

рапии.

ИД ЛБГ в очагах некроза тканей РМЖ после ЛТ оказалась более высокой,чем в РМЖ без ЛТ.ИД белка ниже оказалась в наблюдениях с выживаемостью больных менее пяти лет.Выявленные различия имели статистическую достоверность между РШ до и"после ЛТ,а также наблюдениями с различными (более и менее пяти лет) сроками выживания больных после комбинированного лечения.Достоверны различия уровней ИД АВГ в зонах кровоизлияний в ФА и- РМЖ без ЛТ,а также в ФА и РМЖ после ЛТ.

Важная роль КСР,как связующего звена в системе "парен-хима-строма" МЖ и ее опухолевых процессов,а также в двусто-

Q

ронней связи опухоли и организма [Ушморов А.Г., Александров В.А.,1989], полностью подтверждаются результатами наших исследований,в том числе участием в динамике AM.

Согласно данным проведенных исследований,КСР интактной МЖ.ФА.а также РМЖ до и после ЛТ имело качественного н количественные отличия. Отличительной особенностью рака от предшествующих процессов и ткани интактной МЖ было наличие нео-ьаскулогенеаа с формированием атипичных форм сосудов.Мы согласны, что новообразование сосудов.сопутствующее опухолевое росту,является одним из важных факторов,регулирующих процессы пролиферации и'влияющие на прогрессию и спонтанную регрессию ЗН [Denecamp J.,1984].Подтверждением этого являются

результаты исследований площади и удельной плотности КСР в

о

тканях разных исследуемых объектов.В интактной МЖ.по данным наших исследований,удельная плотность КСР составила 6,36±0,?1,в РМЖ до ЛТ 7,57+0,86,а после ЛТ-5,46*3,53 промилле. Меньше всего сосудов обнаружено в ткани ФА,а больше всего в РМЖ . ДИ.Статистически достоверными оказались различия

- 24-- ■

величин показателей площади и удельной плотности КСР между ФА и РМЖ без JIT, между дольковыы и протоковым вариантами рака.

Регудьтаты проведенных исследований показали определенную роль КСР в морфогенезе рака,Система 1фовоснабжения РМЖ характеризуется неполной зрелостью,атипией , и полиморфизмом. Она включает в себя внесосудистое звено,представленное> псе^ососудами-примитивными тканевыми каналами и щелями,ограниченными клетками опухоли, и сосудистое звено,в котором выделейы микрососуды типа протокапилляров,каналов,синусоидов и венул,различающихся по структурным характеристикам и степени зрелости.

Процессы ангиогенеза . сопровождались усилением протеаз-ной активности-эндотелия,ядра которого в области капиллярных "почек" были богаты ДНК. На начальных этапах почкования,как в наших исследованиях,так и по результатам других работ [Ка-lebic Т.е.а.,19833,наблюдалось ослабление межклеточных контактов, увеличение проницаемости СС и локальное разрушение базальной мембраны.В ряде наблюдений процесс, неоваскулогене-за протекал на фоне "свободного кровотока",когда опухолевые клетки располагались непосредственно в имбибирующей опухолевую строму крови."Почкование" и рост группы нов!™: сосудов на ранних этапах ангиогенеза,нередко имели единое направление ,что косвенно может указывать на - ориентацию в сторону ан-гиогенного f стимула. Это. наблюдение подтверждается; .литератур- ' ними данными о наличии многочисленных-эффекторов v. IKlagsbrun, М. -,-Л Shing Y. ,19853 и ингибиторов [Peterson1Н,х I.:, 19831 ■ нео-.. васкулогенеза. .о

; В станках кровеносных сосудов ИД АБГ. и МГ = была, наиболь-

шей при РМЖ без ЛТ; Это,вероятно,отражает интенсивный процесс транссудации протеинов черев сосудистую стенку в связи с создающейся в раке высокой потребностью в AM для регулирования активности протеиназ,доставки факторов роста клеток опухоли и др.КСР в этой ситуации выполняет транспортную роль по доставке белков из депо их биосинтеза до регионов ЗН. Таким же высоким присутствие МГ в стенках КСР было в наблюдениях FMÄ после ЛТ с выживаемостью больных менее пяти дет после комбинированной терапии.АВГ менее всего зафиксировано в ФА и стенках КСР интактной МЖ.а МГ - в наблюдениях PMS после ЛТ с

выживаемостью больных . после комбинированного лечения более о

пяти лет.Ш это объясняем падением биосинтеза AM в печени и других депо,а также уходом белков из кровеносного русла в зоны деструкции ткали рака.

: В содержимом КСР наивысший уровень МГ определялся в сосудах МЖ и ФА,а минимальный - в наблюдениях РМЖ после ЛТ с выживаемостью больных менее пяти лет. АБГ больше всего присутствовало в наблюдениях ЯШ после ЛТ с выживаемостью больных более пяти лет.Меньше всего протеина было в просвете КСР ткани МЖ.Эги данные высвечивают транспортную роль сосудов в динамике AM.При этом очевидно,что КСР проявляют большую стабильность детекции AM,чем другие компоненты тканей МЯ и е. опухолей.Так,колебания уровней ИД МГ в сгешах КСР тканей МК и ее опухолей отмечается от 3,94±0,08 балла (в РМй после Ж) до 4,05+0,04 балла (в раке без ЛТ).В содержимом КСР колеба-° ' ния уровней ИД белка также невелики - от 5,51*0,13 балла в РМЖ после ЛТ до 6.00+0,22 балла в ФА.

Проведенные иссл. давания доказали участие AM в различных звеньях, морфогенеза РМЖ.На какие же цели столь интенсив-

- 20 - -

но расходуются АМ при раке? С одной стороны-по прямому назначению, то есть для удаления продуктов распада тканей,разрушаемых опухолью.С другой стороны, АМ доставляют к опухоли значительное количество цитокинов,которые могут регулировать темпы ее роста.При разных стадиях туморогенева эти стороны расходования АМ различны. ..

У опухолевых клеток механизм контактного торможения

клеток отсутствует,вследствие чего некоторые цитокины могут о

создавать дополнительные стимулы для их пролиферации.Экспоненциальный рост опухоли в определенной 'мере уравновешивается другими цитокинами,уничтожающими ее клетки,то есть ФИО и интерферонами. - .

Возможность локального биосинтеза АМ опухолевыми клетками позволяет защищать опухоль как от атаки ее. цитокинами, так и иммунокомпетентными клетками,которые могут быть "выключены" комплексами АМ,обладающими иммуносупрессивными свойствами. В пользу этого свидетельствует более интенсивный биосинтез АМ пролкферирующими линиями раковых клеток-[Багс1о-пе Е.Л.е.а.,19831,а также активными клетками зон роста опу-. холи и инвазии ею подлежащей ткаки в, наших наблюдениях.

К настоящему времени сложились четкие представления о зависимости иммуиного инфильтрата опухоли от сосудистого. русла [Лобанов С.Л.,1992].Имеются работы,в которых показана '. определенная значимость пернваскулярного клеточного минроок-ружения в ФА [Голубев 0.А. ,1993],а также, между клетками мик-' роокружения и нервными структурами в морфогенезе стромально-- го компонента предрака и рака Ш [Абросимов. С. ¡0. ,1992]. .

К сосудистому микроокружению, в, РШ1 мы 'относили различу',-: ше ; шгетки перквзскулярного,; инфильтрата.-и собствашо. каетк^:

стромы.Паренхиматозные клетки мы подсчитывали,хотя к пери-васкулярному микроокружению не относили.Оказалось,что в ФА число паренхиматозных клеток (18,67+1,66),фиброцитов (14,00±1,07) и фибробластов (32,86+2,40),статистически достоверно отличается от числа паренхиматозных клеток (44,62±6,56),фиброцитов (8,56+0,72) и фибробластов (24,00±2,37),расположенных вокруг артериол.в РМЖ.

Непременными компонентами периваскулярного микроокружения были такие клетки как ЛФ,ПК и МФ.Количество всех клеток в paiie.no сравнению с интактной МЖ,возрастало.После ЛТ число ЛФ оставалось на прежнем уровне,а количество ПК и MS увеличивалось , однако выявленные различия не имели статистической достоверности.

Результаты гистометрии клеточного микроокружения вокруг артериол.венул и капилляров в РМЖ до и после ЛТ в сравнении с интактной МЖ,свидетельствуют в.пользу усиления синтетических процессов в строме МЖ при развитии в ней ЗН.После ЛТ в строме рака основные изменения- сводятся к коллагенизации и замещению возникших лучевых повреждений,в том числе утраты численности раковой паренхимы.Эти данные отражают суть складывающихся в РМЖ" до ЛТ и создающихся после лучевых повреждений. взаимоотношений звена "паренхима - сосуды - строма".

В каждом случае возникновения ЗН имеет место нарушение иммунного статуса, то есть возникновения иммунодефицитного состояния различного характера и сФепени [Серов В.В.,1994; Соловьев Ю.Н.,1990¡Хмельницкий O.K.,1990¡Шабанов A.M.и со-авт.,19883.одним из морфологических проявлений которого является .степень .и характер лимфоидно плазмоклоточной инфильтрации /ЛПКИ/ стромы опухоли.до и после ЛТ,

г ' - 28 -

> В наших наблюдениях плошдць и удельная плотность ЛФ в • РШ до ЛТ выше,чем в РМЖ после ЛТ.Выявлены и другие различия показателей площади и удельной плотности ЛФ,ПК,МФ и ПЯЛ в л MR,ФА и раке до и после ЛТ. Однако статистически достоверным : оказалось лишь преобладание удельной плотности ЛФ в протоко-вом варианте рака по сравнению с ФА; ПК над ПЯЛ в тканях ФА и РШ после ЛТ. .

Считается,что после предоперационной крупнофракционной ЛТ увеличивается ЛПКИ ткани РМЖ, СДоросевич А.Е., Абросимов ? А.Ю.,1987J.В наших наблюдениях площади ЛФ и ПЯЛ в РМЖ после ЛТ остались без изменений,а площади ПК и МФ хотя и увеличи лись по сравнению с PMJK без ЛТ.но выявленные различия, величин показателя не имели статистической достоверности.

Исследование детекции AM в Л П К И стромы выявило большие, в сравнении с этим,изменения.Максимальным уровень ИД МГ s J№ был в ФА,а АБГ - в M бе? ЛТ. Это подтверждает иммунологические данные о том,что биосинтез МГ возможен в ЛФ tMi-yanaga O.e.а.,1982],а основным источником биосинтеза АБГ яв-■ ляются ЛФ CHorne C.H.W.e.a. ,19783.Пик уровней ИД МГ в ЛФ ФА,а АБГ в ЛФ РМЖ отражает наиболее высокие потребности данных тканей в соответствующих AM.Менее всего АБГ и МГ -в ЛФ обнаружено при РМЖ после ЛТ.Это можно объяснить как снижением потребностей в AM,так и радиоповреждениями клеток.Показанные различия имели статистическую достоверность высокой (при р < 0,001) степени.

В ПК среди выявленных различий достоверны следующие: наибольшее количество МГ обнаружено в ФА,а наименьшее в наблюдениях РШ после ЛТ с выживаемостью . больных менее пяти лет.В tfö статистически достоверно преобладание уровней; ИД

АБГ в PMHt без ЛТ,в сравнении с ФА,а также в раке,в сравнении : .с PME после ЛТ.Выявленные различия уровней ИД протеина могут > указывать на МФ как возможный источник биосинтеза белка, ..

Роль иммунной системы в модификации особенностей тече- * нии ЗН в настоящее время практически не оспаривается. Поэтому иммунорегуляторные свойства АМ заслуживают особого внимания. ' i Антипротеазные свойства АМ позволяют регулировать реак- | ции,зависящие от активности ферментов,например,управлять , системой комплемента Шеремеенко К.Н.и соавт.,10883.Ранее ; предполагалось,что АМ,особенно АБГ,наделены исключительно иммуносупрессивными. свойствами - они дозозависимо блокируют спонтанную и митогениндуцированную пролиферацию иммунокомпе-тентных клеток,разрушают штокины [Зорин Н.А.и соавт. ,19933. Однако действие комплексов ЛМ с яффинантями ня клеточное звено иммунитета не столь однозначно. Комплексы этих АМ с достаточно крупными иротеиназаыи,такими как ПН.обладают выраженными комитогенными свойствами [Shabln S.G: е.а.,19923. Следовательно, ишунорегуляторныз свойства данных комплексов . определяются характеристиками соединения, захваченного "ловушками" макроглобулина. Небольшие аффиванты, вызывайте максимальное •'захлопывание" створок "ловушки" (то есть максимально е конформационное уплотнение комплекса), обладают наи; большим , супресеорным действием. Высокомолекулярные же соединения, прёпятствующие существенному сжатию створок "ловуяки", ; : имеют прямо противоположные свойства. Однако в последнем случае возрастает вероятность разрушения пептидов - цитокияов ■ про^еиназами, захваченными "ловуикой". Это кажущееся противо-* % речие фгумто/^/'свд/^^^рткст- Ш с крупными аффиная-' :>\ там»становятся понятным, " если' коснуться, механизма реакций

- 30 -

взаимодействия макроглобулинов с цитокинами.

В последнее время установлено,что практически все известные цитокины (интерлейкины.интерфероны,факторы роста клеток и ФНО) образуют с AM стабильные комплексы CSto-naris I.J.e. а. ,1992]. Первоначально предполагалось, что AM являются единственными белками плазмы крови,способными связывать и транспортировать цитокины [Borth W.,Luger T.А.,. 1989].Сейчас установлено [Близнюк Б.Ф.,1982],что сходными,но существенно менее выражеными свойствами обладают и другие ИП - серпины.Показано,также,что цитокины могут фиксироваться нативными AM,не вызывая при этом "захлопывания ловушек",что позволяет этим комплексам достаточно долго находиться в системе крово- и лимфообращения.При конформационном уплотнении, вызванном захлопыванием "ловушек",AM,несущие цитокины, присоединяются к клеткам и реализуют реакции,управляемые цитокинами [Shabin S.S.е. а. ,1992]. Избыток же цитокинов.попа-. дая в "ловушки" с протеиназами,разрушается.Кроме того,до 40% ЛФ всех субпопуляций несут на поверхности AM [Зорин H.A.и соавт.,1993].Возможно, AM,захватывая цитокины,осуществляют короткодистантную регуляцию кооперации иммуноксмпетентных клеток.Все вышеизложенное дает основание для гипотеза,согласно которой AM являются одними кз главкойзва универсальная регуляторов функций иммунной (Л'.СТОИЦ.

Выраженность иммунорегуляторных свойств различных AM неодинакова.Так,АБГ по этому показателю в 10-20 pas превосходит МГ [Мальцева Н.В.и соавт.,1991].С другой стороны,АБГ обеспечивает до 70% иммуносупрессорного потенциала сыворотки крови беременных женщин,тогда как раково1эмбриональные маркеры (альфах- фетопротеин.хорионический гонздотропин.трофоб-;

ластический бетах- гликопротеин и РЭА) не участвуют в формировании этого потенциала [Stlmson W.Н.,1980).

Вышеизложенные свойства AM позволяют представить возможную роль этих белков во взаимоотношениях злокачественного новообразования и организма человека.При росте опухоли AM необходимы для связывания продуктов,выделяющихся из погибших клеток.Следовательно,рост опухоли способствует интенсивному росту тканевого,а затем гематоликворного пулов AM.Однако, концентрация АБГ на этом фоне возрастает,что свидетельствует 'об активации биосинтеза этого белка не только в опухоли,но и в иных тканях.По видимому,механизмы активации биосинтеза АБГ при раке идентичны таковым при беременности. В обоих случаях максимальный (но недостаточный для компенсации системы мать-плацента-плод или хозяин-опухоль) биосинтез МГ компенсируется активацией биосинтеза других AM,прежде всего АБГ tZorin N. А. е. а.-, 19923. Подобный же параллелизм характерен и для раково-эмбриональных маркеров или белков беременности ГОугрорл Т.М.и сояр/г. ,10891. Однако именно АБГ обладает наиболее мощным иммунорэгуляторным потенциалом,способным в наибольшей, степени обеспечить вынашивание плода или неотторжение опухоли [Зорин H.A.и соавт.,19933.

AM при раке тесно связаны с белками систем гемостаза и фибринолиза,поэтому детекцию АБГ и МГ мы сравнивали с присутствием в гистоструктурах тканей ПГ и 4Г. Известно,что , болм""- РМЖ повышение фибринолитической активности связано i. присутствием в тканях проактиватора и активатора ПГ [Gobi farb R.H.g. а. ,1986]. В.крови,при этом,отмечается увеличен¡< содержания ПН,который обладает высокой специфичностью к <№ ■ 4>Г.Активность ПН.ограничена действием ингибиторов,в том '

ле МГ.В норме избыток ПН в крови удаляется,а при РМЖ возникает его избыток при недостатке ингибиторов.В такой ситуации фибринолиз,целесообразный до определенного уровня,при продолжающейся активации,превращается в патологию.Деградация ФГ достигает уровня Д и Е фрагментов [Бышевский А.Ш.и со-авт.,1987].вследствие чего кровь полностью теряет способность к свертыванию СТалака К. е.а.,1978].Близкую к этой ситуацию мы наблюдали в наших исследованиях РМЖ после ЛТ,когда возрастала еще больше,в сравнении с РМЖ без ЛТ,детекция ПГ,на фоне продолжающей снижаться ИД ФГ.Эго может объяснятся еще и тем,что предоперационная ЛТ в режиме крупного фракционирования приводит к снижению прокоагулянтной активности [Марусов A.A.,1987].

Известно,что ФГ.ПГ и их метаболиты способны образовывать комплексы между собой и с другими биологически активными веществами крови,в том числе AM.Метаболиты ФГ и ПГ,а также их комплексы обладают широким спектром биологической активности, влияют на самосборку ФН,активируют или угнетают процессы коагуляции или фибринолиза СБалуда В.П. и со-авт.,1992]. В наших наблюдениях окрасками на ФН по Вейгерту и Шуенинову.а также путем ИД ФГ и ИГ показана заинтересованность белков в канцерогенезе при РМЖ.

ФН в PME до и после ЛТ определяли в паренхиме,строме и ее компонентах - стенках и содержимом кровеносных сосудов, очагах слизистой дистрофии,некроза и зонах кровоизлияний. Наши результаты подтверждают сведения о том,что неопластические клетки нуждаются в ФН и способны поглощать его [Воронцова Г.В., 1967].Мы наблюдали как раковые клетки находились в межуточном веществе,содержащем ФН.В паренхиматозных.

клетках ФА ИД ФГ и ПГ увеличивается.соответственно,с 1,00+0,22 и 1,48+0,11 в ткани интактной МЖ до 3,62+0,11 и 3,52+0,17 баллов.В раковой паренхиме ИД ПГ несколько снижается, по сравнению с ФА,а ФГ остается на прежнем уровне.

Считается,что высокий тромбогенный потенциал крови и повышенная активация белков системы гемостаза в тканях необходимы и благоприятны для развития опухоли [Кудряшов Б.А. ,1975].Таким образом,наши данные совпадают с литератур-

Валлм 6

5 •

4 .

3 • 2 • 1 •

Рис.2. Сравнительная оценка уровней иммунодетекцин ПГ и ФГ в паренхиматозно - стромальном компонентах МЖ /1/, ФА /2/, РЙН до /3/ и после /4/ лучевой терапии

ными сведениями [Мкртчян Л.Н.и соавт.,1984] о способности ФН ограничивать опухолевые клетки РМЖ от здоровых тканей.

■ В раке после ЛТ детекция ПГ и ФГ в паренхиме еще больше уменьшается, достигая 2,ЗСН0,14 , и 3,04+0,13 баллов,соот-

П Г ФГ I_I I_1

ДЕТЕКЦИЯ БЕЛКОВ В ПАРЕНХКМЕ

3 4

П Г Ф г

I.......... I I_I

II "

ДЕТЕКЦИЯ БЕЛКОВ В СТРОМЕ

ветственно. Однако во всех других структурах тканей РМЖ после ЛТ уровни детекции ПГ возрастают.На этом основании можно предполагать,что радиоповреждения сопровождаются активацией фибринолитической системы.

Таким образом,результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о том, что белки систем гемостаза и фибринолиза задействованы в процессах туморогенеза в МЖ.

Анализируя результаты проведенных исследований можно видеть,что такие факторы прогноза как скорость роста и репо-пуляции.пролиферативная активность,количество гипоксических клеток и другие параметы опухоли могут быть дополнены результатами ИГХ исследований,так как несомненно важное значение в процессах рецидивирования РМЖ имеют АМ.Современные методы лечения рака (хирургическое лечение,химиотерапия и ЛТ) однозначно увеличивают расход МГ и дополнительно стимулируют биосинтез АБГ [Веремеенко К.Н.,1977].В этом случае уцелевшие или резистентные опухолевые клетки получают благоприятные возможности для роста.Поэтому можно предполагать,что ситуации когда после проведения комбинированной терапии РМЖ не наблюдается падения ИД МГ и увеличения АБГ, являются более благоприятными в прогностическом плане.

• Наши исследования показали,что для . целей диагностики, дифференциальной диагностики опухолей,оценки лучевого эффекта, а также прогнозирования ЗН, более информативно определение уровней ИД в гистоструктурах тканей обоих АМ, а не одного какого-либо протеина.Кроме того,в гистологическом материале имеются отличия ИД белков в РМЖ различных гистологических типов и с различными сроками выживания больных после предоперационной ЛТ.

- 35 -

В ДИ ИИ наблюдается достоверное преобладание ЛМ в ПК (3,60t0,15 и 4,25±0,19 балла,соответственно) и М1> (4,05+0,22 и 4,95+0,26 балла,соответственно) по сравнению с НИ ГШ в ПК (3,25+0,22 и 4,10+0,19 балла,соответственно! и МГ (4,20+0.24 и 4,55+0,21 балла, соответственно),а тшс.е ЛГ FMJ4 в ПК (2,95+0,15 и 3,15+0,11 балла,соответственно') и Ш Í3.TO+0.E5 и 3,85+0,21 балла,соответственно). В ПН РИМ .достоверно преобладание № в строме (2,85+0,15 балла) опухоли по сравнению с ДИ РМЖ (2,15+0,06 балла) и АБГ в М (3,701.0,18 баяла) и ПК (4,10+0,19 балла),а также МГ в ПК (З.ЕБЮ.гя балла) и Ш (4,20+0,24 балла) по сравнению с Дф РМЖ (2,95i0.15 и 3,50±0,25 балла,соответственно).наблюдается достоверное преобладание МГ в паренхиме (3,55+0,14 балла) и строме (3,00+0,15 балла) опухоли,по сравнению с ДИ FMH (2,85+0,18 и*2,15+0,05 балла,соответственно),а также АБГ в просвете КСР (6,00+0,00 балла),по сравнению с ДИ РШ (5,20±0,19 балла) и ПИ'РМЖ (4.85+0,25 балла): . преобладание АБГ в секрете (3,75+0,12 балла) и зонах кровоизлияний (6,00+0,00 балла), по . сравнению с ПИ FMJR (2.85+0,18 и 5,05±0,21 балла,соответственно).

Уровень детекции МГ в наблвденкяя с пятилетней выживаемость» больных выше в паренхиме (3,18+0,08 и 3,10+0,16 балла),стенках (3,94+0,08 и 3,50+0,15 балла, соответственно) и просветах кровеносных сосудов (5,51+0,13 и 5,40+0,21 балла, соответственно), ЛФ (3,12+0,08 и .2,45±0,18 балла), ПК (3,21±0,09 и 2,90±0,19 балла), Ь® (4,06±0,16 и 3,25±0,24 балла),секрете (4,27í0,13 и 3,75*0,12 балла), очагах некройа (4,97+0,13 и 4,10*0,16 балла) и .зонах кровоизлияний (5,52+0,13 -и 5,40+0,21 балла,соответственно). Таким обра-

аом.лишь в строме рака,в наблюдениях с выживаемостью больных менее пяти лет,уровень ИД МГ был выше,чем в наблюдениях с пятилетней выживаемостью больных.Однако,достоверными различия оказались между уровнями детекции МГ в ЛФ,в секрете и в очагах некроза опухоли.

Уровни ИД АВГ в паренхима рака вше в наблюдениях с выживаемостью менее пяти лет (4,55±0,18 балла) по сравнению с наблюдениями пятилетней выживаемости больных (3,9?±.0,13 балла) после комбинированной терапии.В строме преобладание уровней ИД белка было противоположным:в наблюдениях с пятилетней выживаемостью больных - 3,70+0,03 балла, а в наблюдениях с менее чем пятилетней выживаемостью - 3,30+0,13 балла. В различных других исследованных гистоструктурах стромы отличия уровней детекции АБГ в сравниваемых группах наблюдений минимальны.Исключение составляет преобладание уровня-АБГ в содержимом К.СР наблюдений с пятилетней выживаемостью больных (5,64+0,12 балла,против 5,00+0,23 балла),а также в очагах некроза (4,73±0,12 и 3,05±0,12 балла, соответственно) и зонах кровоизлияний (5,52+0,14 и 5,00±0,23 балда,соответственно). Итак, преобладание уровня детекции АБГ в просвете КСР в наблюдениях с пятилетней выживаемостью больных можно объяснить более интенсивной эвакуацией белка из опухоли,а в очагах некроза и зонах кровоизлияний - более активно протекающими процессами рестрикции активности протеиназ,происходящих в данных наблюдениях.

По результатам наших исследований обнаружены статистически достоверные различия между уровнями ИД всех исследованных белков (АВГ,МГ,ПГ и ФГ) в ФА и РМЖ без ЛТ.а также РМЖ до и после ЛТ (табл.2).

- 37 -

Эти различия касаются уровней ИД протеинов в паренхиме вне опухоли,а также опухолевой паренхимы; стромы вне опухоли и внутри ее,стенок и просветов КСР,клеток инфильтрата -ЛФ.ПК и Ш; секрета паренхиматозных структур, а также очагов некроза и зон кровоизлияний.Все выявленные статистически достоверные различия можно использовать в качестве диагнос-

Таблица 2. СРАВШГГЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ДОСТОВЕРНОСТИ РАЗЛИЧИЙ Юй 5УН0ДЕТЕКЦИИ НССЛЕДУЕИК БЕЛКОВ В ПАРЕНХИМЕ И РАЗЛЛ'ОШ СТРУКТУРАХ СТРОНЬ) г,И, ФА, РО ДО II ПОСЛЕ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ

NN Объек- Степень достоверности различия

пп ты МГ- -АБГ МГ-ПГ МГ-ФГ АВГ-Пт| ДБГ-ФГ ПГ-ФГ

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4|1 2 3 41 1 2 3 4

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Пар. Стр. Стен. Проев. ЛФ ПК МФ Секр. Некр. Кров. - • • - ; - ■ - - - - 1 т • : - -Л

Пояснения. р< 0,05; р< 0,001. 1-Ш,2-ФА,3-РМЖ бер

и 4-РМЖ после лучевой терапии. Кар.-паренхима. Стр.-строма. Стен.-стенки и Проев.-просветы кровеносных сосудов.ЛЗ-лимфоцит .¡14-плазматическая клетка.!"3-макрофаг.Сзкр.-секрет.Наир.-очаги некроза.Кроз.-зоны кровоизлияний.

- 3b -

'шчиских, дифференциально-диагностических и прогностических критериев в работе патоморфологов при исследовании гистологических препаратов операционно-Сиопсийного материала доброкачественных опухолей и РМЖ.

ВЫВОДЫ

* * *

1.Иммуногистохимическое выявление АМ возможно в депара-фшшрованных гистологических срезах операционно - биопсий-ного материала опухолей Ш, в том числе в архивном, фиксированном 15Х-ным нейтральным водным раствором формалина.

2.В ткани нормальной МЖ АМ присутствуют в малом количестве , Исключением является более убедительная ИД МГ в строме желеуц (3,81*0,01 балла).В ФА,по сравнению с интактной железой,наблюдается статистически достоверное увеличение ИД МГ в паренхиме (с 1,43+0,11 до 5,43+0,13 балла).Присутствие МГ в строме.а также АБГ в паренхиме и строме ФА,по сравнению с МЖ.ивменяется мало.

3.В паренхиме РМЖ на инфильтрирующей стадии процесса,по сравнению с ФА,ИД МГ падает ниже 2,8б±0,1б балла,а уровень АБГ возрастает выше 4,67±0,21 балла.В РМЖ после предоперационной ЛТ уровни детекции АМ.по сравнению с раком без ЛТ,изменяются в сторону снижения детекции АБГ в паренхиме (2,89i0,12 балла) и повышения ИД МГ в строме (3,00±0,15 балла) ,при сохраняющихся уровнях детекции МГ в паренхиме и АБГ в строме.

4.Дольковый РМЖ отличается достоверным преобладанием АМ и ПК и Ш> от нротокового РМЖ,а также других гистологических вариантов РМЖ. В протоколом ШЖ достоверно преобладание МГ в строме опухоли,по сравнению с дольковым раком,АБГ в ЛФ и

ПК,а также МГ в ПК и МФ,по сравнению с другими гистологическими вариантами РМЖ. В последних наблюдается достоверное преобладание МГ в паренхиме и строме опухоли,по сравнению с дольковым раком,а также АБГ в содержимом KCP.no сравнению с дольковым и протоковым РМЖ;преобладанием АБГ в секрете,® и зонах кровоизлияний,по сравнению с протоковым инфильтрирующим РМЖ.

5.Клеточное периваскулярное микроокружение является динамичным отражением паренхиматозно-стромальных отношений, имеющих отличительные особенности в интактной МЖ,ФА,РМЖ до и после ЛТ,зависящим от этих взаимоотношений.В РШ.по сравнению с раком без ЛТ,ФА и интактной МЖ,достоверно увеличение площади паренхимы,а в РМЖ после ЛТ - уменьшение площади паренхимы и стромы при увеличении площади некроза.

6. В ФА число паренхиматозных клеток (18,67±1,96),фиброцитов (14,00+1,07) и фибробластов (32,86+2,40),статистически достоиорно отличается от числа паренхиматозных клеток (44,6216,56),фиброцитов (8,5610,72) и фибробластов (24,00+2,37),расположенных вокруг артериод.в РМЖ.

7. Кровеносные сосуды и клетки их микроокружения активно участвуют в процессах транспорта и биосинтеза АМ,соответственно. Присутствие -АМ в стенках и содержимом кровеносных сосудов, по сравнению с паренхимой и различными гистоструктура-ми стромы МЖ и ее опухолей,имеет большую стабильность.

8. Для ФА характерны следующие уровни ИД ЛМ в строме (МГ-ниже 2,86+0,И,а АБГ ниже 2,29+0,10 балла) и в паренхиме (МГ-выие 5,43+0,13,а. АБГ выше 3,10Ю,09 балла).В отличие .от

¡этого для больных 'РМЖ. свойственны уровни детекции ЛМ в строме . (МГ-ниже 2; 14:10,'08,а АБГ выше 2,86^0,16) и в паренхиме

- 40 -

(МГ ниже 2,86+0,16 балла и АБГ выше 4,67±0,21 балла).

9.Прогностически благоприятнее (выживаемость больных более пяти лет) уровни ИД АМ при РМЖ после предоперационной ЛТ в паренхиме (МГ-выше 3,18±0,08,а АБГ-ниже 3,97±0,13 балла) и в строме (МГ-выше 3,36*0,09,а АБГ-выше 3,70±0,03 балла), чем уровни ИД АМ (выживаемость больных менее пяти лет после комбинированного лечения) в паренхиме (МГ-ниже 3,10*0,16,а АБГ-выше 4,55*0,18 балла) и в строме (МГ-ниже 3,50±0,15,а АБГ-ниже 3,10±0,13 балла).

10.Обнаруженные при исследованиях особенности ИД АМ в паренхиматозном и стромальном компонентах,включая КОР и клетки ЛПКИ ФА и РМЖ до и после ЛТ,позволяют квалифицировать АМ как универсальные регуляторы иммунной системы организма человека.

И.АМ.в отличие от ПГ и ФГ, задействованы в различных звеньях морфогенеза рака и являются неспецифическими маркерами опухолей МЕ при ИГХ исследовании гистологических срезов операционно - биопсийного материала опухолей железы.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРКШШШ

А * А

, 1.В качестве диагностического и дифференциально-диагностического критериев используют различия клеток периваску-лярного микроокружения в ФА и РШ.Так в ФА число паренхиматозных клеток (18,67±1,96).фиброцитов (14,00±1,07) и фиброб-ластов (32,86±2,40),статистически достоверно отличается от числа паренхиматозных клеток (44,62+6,56)«фиброцитов (8,56*0,72) и фибробластов (24,00+2,37).расположенных вокруг артериол.в РМЖ.

- 41 -

2.ИГХ исследованию с целью выявления ДМ подвергают опе-рационно-биопсийный материал различной давности фиксированный 15%-ным нейтральным водным раствором формалина.В качеств ве "положительного" и "отрицательного" контролей при постановке ИГХ реакции используют срезы зрелой плаценты.

3.Уровни ИД AM оценивают в Оаллах: 1 балл- отсутствие окраски; 2 балла- отсутствие окраски одних и окрашиваемость других клеток паренхимы и зон стромы в желто-коричневый цвета^ балла- окрашиваемость различных структур от светло-желтого до желтого цвета; 4 балла- окрашиваемость всех структур в желтый цвет;5 баллов- окрашиваемость разных зон стромы и клеток паренхимы от желтого до коричневого цветов;б баллов-.окрашиваемость в коричневый цвет различных структур тканей.

4.AM являются неспецифическими маркерами опухолей МЖ и ИД их в гистологических срезах опероционно-биопсийиого материала опухолей железы позволяет следующее:

а/повышает возможности морфологической диагностики и дифференциальной диагностики ФА и РМХ.Для больных ФА характерен уровень ИД МГ в строме ниже 2,86+0,11 и АБГ ниже 2,29±0,10 балла,а уровень детекции МГ в паренхиме выше 5,43+0,13 и АБГ выше 3,10+0,09 балла. Для больных PMS свойственны уровни детекции МГ в строме ниже 2,14+0,08 и в паренхиме ниже 2,86±0,1б балла,а уровни детекции АВГ в строме выше 2,8610,16 и в паренхиме выше 4,67±0,21 балла.

б/уточияет оценку эффективности предоперационной ЛГ и индивидуальный прогноз заболевания.Для больных РШ.выживае-. мость которых после комбинированной терапии составляет пять и более,лет, характерны уровни детекции АБГ в паренхиме рака ниже 3,97iO,'i3'балла и в строме выше 3,70+0,03 балла.а уров-

ни ИД № в паренхиме выше 3,18+0,08 балда и в строме выше 3,36±0,09 балла.В отличие от этого,у больных проживших менее пяти лет после предоперационной ЛТ,из-sa возникновения рецидива и последующей генерализации процесса,наблюдаются уровни детекции АВГ в паренхиме рака выше 4,55±0,18 балла и в строме ниже 3,30+0,13 балла,а уровни ИД МГ в паренхиме рака ниже 3,10±0,16 балла и в строме ниже 3,50±0,15 балла.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

* * *

1.Арефьева А.К., Козлов Д.В. Детекция макроглобулинов в тканях рака молочной железы до и после лучевой терапии:имму-ногистохимическое исследование//Экология и общественное здоровье населения:Тез.докл. конф. с международным участием. -Новокузнецк. -1994. -С. 20.

2.Жабин С.Р..Козлов Д.В..Николаева Л.П.Присутствие белков систем гемостаза и фибринолиза в тканях рака легкого: иммуногистохимическое исследование//Экология и общественное здоровье населения: Тез.докл, конф.с международным участием. -Новокузнецк. -1994. -С. 19.

З.Зорин H.A..Жабин С.Г..Козлов Д.В.Возможная роль семейства макроглобулинов при раке: обзор литературы//Вопросы онкологии.-1994.-Т.40.-N 1-2-3.-С. 18-24.

4.Зорин H.A..Вержбицкий Г.В..Мингалев Н.В.. Козлов Д.В. Сравнительный анализ распределения макроглобулинов в организме крыс при беременности, введении эстрациола и лимфосар-коме Плисса//Патологическая физиология и экспериментальная терапия.-1994.-К 2.-С.44-46.

5.Козлов Д.В.Иммуногистохимическое выявление макрогло-

булинов в раке молочной железы человека//Новое, прогрессивное в практику здравоохранения: Тез.докл.28-й научи. -лракт.конф.врачей Ульяновской обл.,20-21 мая 1993 г.Ульяновск, -1993. -С. 142- 143.

6.Козлов Д.В.,Мабин С.Г..Митрохина Л.Н. К методике им-муногистохимического исследования макроглобулинов//Ноиое, прогрессивное в практику здравоохранения:Тез.докл. 28-й на-учн.-практ. конф. врачей Ульяновской обл.,20-21 мая 1993 г.Ульяновск. -1993.-С.143-144.

7.Козлов Д.В.Иммуногистохимическая диагностика и дифференциальная диагностика опухолей молочной железы/Учебно-мётодическое пособие для врачей.-Новокузнецк.-1994.-12 С.

8.Козлов Д.В.Иммуногистохимическая (ИГХ) детекция макроглобулинов и белков систем гемостаза и фибринолиза в тканях р&ча//Экология и общественное здоровье населения: Тез. докл. конференции с международным участием,- Новокузнецк. -1994.-С,21.

Э.Козлов Д.В.Белки семейства макроглобулинов - неспецифические маркеры рака молочной железы//Маммология.~1994,-N 4.-С. 23-26.

'Ю.Козлов Д.В. .Арефьева А.К. .Зорин Н.А.и др.Сравнительное иммуногистохимическое исследование макроглобулинов в тканях .рака разной локализации до и после, лучевой тера-пии//0рг&чизация паллиативной помощи и методы лечения больных с распространенными формами злокачественных новообразований: Тез. докл. Всеросс.конф..май 1995.-Москва.- 1995.-С.138-140. '•.'„■'

'.Ц.Козлов Д.В.Диагностическая ценность макроглоОулиноь и белков систем гемостаза и фибринолиза при, раке// Опухоли

висцеральных локализаций: Tes. докл. Всеросс. конф.-Томск.-1995.-С.117-118.

12.Козлов Д.В.Иммунопероксидааная оценка эффекта лучевой терапии рака// Опухоли висцеральных локализаций: Тез. докл.Всеросс.конф.-Томск.-1995.-С.119-120.

13.Козлов Д.В.Лечебный эффект лучевой терапии рака молочной железы: иммуноферментная оценка и прогноз/УИммуноло-гический мониторинг и иммунореабилитация: Тез.докл.Всеросс .конф.-Москва.-1995.-С,47-48.

14.Козлов Д.В.Иммуногистохимическая диагностика фиброаденомы и рака молочной железы//Иммунологический мониторинг и иммунореабилитация: Тез. докл.Всеросс.конф.-Москва.-1995.-С. 49-50.

15. Козлов Д.В.Иммуногистометрия паренхиматозно-стро-мальных компонентов рака молочной желеэы//Иммунодиагиостика и иммунотерапия : Труды 1-го Международного конгресса.-Витебск.-1995.-С.74-76.

16.Козлов Д.В.Иммуноферментная оценка лечебного эффекта радиационной терапии рака молочной желеэы//Иммунодиагностика и иммунотерапия:Труды 1-го Международного конгресса.-Витебск. -1995. -С. 76-77.

17.Козлов Д.В..Николаева Л.П.Детекция макроглобулинов и белков систем гемостаза и фибринолиза в тканях рака легкого и молочной железы: иммуногистохимическое исследовалие//Имму-нодиагностика и иммунотерапия:Труды 1-го Международного конгресса.-Витебск.-1995.-С.77-79. ,

18.Козлов Д.В.Иммуиодетекция макроглобулинов в тканях фиброаденомы,рака и нормальной молочной железы//Совершенствование методов профилактики и диагностики елокачественных

новообразований:Тез.докл.Всеросс.конф.-Москва. -1995.-С.25-27.

19.Козлов Д. В.Возможности иммунодетекции макроглобулинов в диагностике и дифференциальной диагностике фиброаденомы и рака молочной железы по гистопрепаратам//Совершенство-вание методов профилактики и диагностики злокачественных новообразований :Тез.докл.Всеросс.конф.-Москва.-1995.-С.28-29.

20.Козлов Д.В.Детекция макроглобулинов в тканях рака молочной железы до и после лучевой терапии//Медицинская радиология и радиационная безопасность.'1Q96.-Т.41,-Н 1.-С.62-64.

.21.Козлов Д.В.Диагностический и прогностический тест в онкоморфологии//Актуальные вопросы патологической анатомии-. Тез.докл.3-ей межрегион.научно - практ.конф.патологоанатомов Урала и Западной Сибири.-Челябинск.-1996.-С.43-44.

22.Козлов Д.В.Иммуногистохимическое исследование мак-роглобулиноз в тканях рака молочной железы до и после лучевой тералии//Актуальные вопросы патологической анатомии:Тез.' докл.3-ей межрегион, научно-практ.конф.патологоанатомов Урала и Западной Сибири.-Челябинск.-1996.-С.44-45.

23.Козлов Д.В.Возможности иммунодетекции макроглобулинов в диаг.гостинге и дифференциальной диагностике фиброаденомы и рака молочной железы//Актуальные вопросы клинической иммунологии: Тез. докл. межрегион.научн.-практ.конф.-Кемерово. -1996.- С.14-15.

24.'Козлов Д.В. .Зорин H.A. .Голубев O.A.Вторичный неойн-гиогенез - одно из основополагающих ЗЕеньев.становления и прогрессии рака молочной железы//Архив . патол.-1996.-Т.58*-Вып.4.- С.

" 2S.Митрофанов1. Н. А., Козлов Д.В.Присутствие макроглобули-

нов в тканях гормонозависимых опухолей женщин: иммуногисто-химическое исследование//Зкология и общественное здоровье населения:Тез.докл. конф.с международным участием.-Новокузнецк. - 1994. -С.18.

26.Николаева Л.П..Козлов Д.В. Особенности распределения макроглобулинов в тканях рака легкого: иммуногистохимическое исследование//Экология и общественное здоровье населения: Тез. докл. конф.с международным участием.-Новокузнецк. -1994. -С. 16.

27.Ченченков М.Я..Козлов Д.В..Захаров В.А.Рак молочной железы (РМЖ) у женщин южнокузбасского промышленного региона: реабилитационный анализ больных//Экология и общественное . здоровье населения:Тез.докл. конф.с международным участием. -Новокузнецк.-1994.-С.22.

2S.Kozlov Р.У..Mltrofanof N. A.Immunohistochemical determination of alpha-macroglobulin and alpha-glycoprotein associated with pregnancy in sone hormone dependent organs of women//Immunology of reproduction:Abstr.International Symposium., Kiev, Ukraina, 19-23 October,1993.-Kiev.-1993.-P. 156.

29. Kozlov D.V.,Zorin M.A. .Shabin S.G.e.a. Immunohistochemical localization of pregnansy zone protein and ather plasma proteins In cancer// Basic Research and Clinical Application in Human Tumor Immunology and Molecular Biology: Abst.XXll-nd Meeting,Sept.18-22,1994, Groriingen.The Netherlands.-1994.-P. 256.

30.Kozlov D.V.,2orln N. A.,Shabin S.G.Immunohistochemical detection of alphae - macroglobulin (MQ) in tissues of breast cancer//International J.of Jmmunorehabilitati-

on.-1994.-N 1.-P.187-188.

31.Zorin N.A..Shabin S.G.,Gorin V.S.e.a.Interaction of Macroglobulins with tumor necrosis factors//lX-th International Congress of Immunology:Abst.-San Francisco.-1995.-P.783.

r. IloHony'ifiK, .'¡OT KMK. I'CWS i. i