Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Ассоциация рака гортани с онкогенными вирусами папилломы человека и Эпштейна-Барр

На правах рукописи

003456027

ШИЛОВА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА

АССОЦИАЦИЯ РАКА ГОРТАНИ С ОНКОГЕННЫМИ ВИРУСАМИ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА И ЭПШТЕЙНА-БАРР

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г#

г* УУГЧ'

НОВОСИБИРСК - 2008

003456027

Работа выполнена в ГУ научно-исследовательском институте онкологии Томского научного центра СО РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Уразова Людмила Николаевна

Научный консультант:

чл.-корр. РАМН, профессор, д.м.н. Чойнзонов Евгений Лхамацыренович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

Ведущая организация:

ГУ научно-исследовательский институт онкологии им. профессора Н. Н. Петрова МЗ РФ (Санкт-Петербург).

Защита состоится « {(о » _ 2008 г. в /¿/""часов на

заседании диссертационного/ совет^ Д 001.048.01 в ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН по адресу: ул. Академика Тимакова, д. 2, г. Новосибирск, 630117. Тел/факс 8 (383) 333-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НЦКЭМ СО РАМН. Автореферат разослан « -//» 2008 г.

профессор

Сидоров Сергей Васильевич

доктор биологических наук

Макарова Ольга Петровна

Ученый секретарь диссертационного совета д.б.н.

Пальчикова Н.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рак гортани (РГ) занимает лидирующие позиции среди злокачественных опухолей верхних дыхательных путей, составляя 65-70%, а в структуре общей онкологической заболеваемости -1,4%, среди которых 2,8% приходится на мужчин и 0,2% - на женщин. Так, в 2006 году в России было выявлено 6655 новых случаев заболевания раком гортани (Чиссов В.И. и др., 2008).

По данным госпитальных регистров 60-70% больных обращаются в специализированные учреждения с уже распространенным опухолевым процессом (Пачес А.И., 2000; Хабибулаев Ш.З. и др., 2005; Чойнзонов Е.Л. и др., 2006). К числу факторов, которые приводят к поздней диагностике, относится и бессимптомное течение, которое наблюдается у 35% больных.

Все вышеперечисленное свидетельствует о необходимости поиска новых методов ранней диагностики и скрининга лиц с предопухолевыми заболеваниями гортани, которые составляют группу риска.

Многочисленные эпидемиологические исследования, проводимые в различных странах мира, показали, что основными этиологическими факторами развития РГ являются курение, алкоголь, воздействие на слизистую оболочку верхнего респираторного тракта канцерогенов, состояние хронического стресса, а также хронические процессы различного генеза, такие как хронический гиперпластический ларингит (ХГЛ) и папилломатоз гортани (ПГ). Согласно классификации ВОЗ (2003) ХГЛ и ПГ отнесены к облигатному предраку. Так, частота встречаемости ХГЛ в популяции варьирует в пределах 30-65%, а вероятность малигнизации данного заболевания составляет от 3% до 35%, достигая в отдельных случаях 60% в сроки от 6 мес. до 7 лет (Чумаков Ф.И. и др., 2002; Осипов В.Д., 2006).

Однако, в последнее время, все большее число исследователей приоритетное значение в вопросе канцерогенеза гортани придают вирусной составляющей. Это обусловлено частым выявлением генетической информации онкогенных вирусов папилломы человека (ВПЧ) в слизистой оболочке гортани, как при доброкачественных, так и при злокачественных процессах, а также детекцией повышенного уровня антител к антигенам литической инфекции вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) у больных с данной патологией. Так, частота выявления ВПЧ в доброкачественных и предопухолевых новообразованиях области головы и шеи варьирует от 18,5% до 35,9% (МсКа^ Я. й а1., 1998). На долю же ВПЧ-ассоциированного папилломатоза гортани, по оценкам ряда авторов, приходится 40-100%, с последующей малигнизацией в 8-20% случаев в сроки до 10 лет (Пачес А.И., 2000,2004; БгуШои^И 1. а а1., 1999).

Поскольку в литературе, практически, не встречается работ по комплексной оценке частоты синтеза антигенов литической и латентной инфекции вируса Эпштейна-Барр и выявления вирусов папилломы у больных раком и предопухолевыми заболеваниями гортани, в сопоставлении с клинико-морфологическими особенностями опухолевого процесса,

представляется актуальным осветить данную проблему в рамках представленной работы.

Цель исследования. Изучить ассоциацию вирусов папилломы человека и Эпштейна-Барр с клинико-морфологическими показателями у больных раком и предраковой патологией гортани, определить диагностическую и прогностическую значимость изученных показателей. Задачи исследования:

1. Изучить частоту ассоциации рака и предопухолевых заболеваний (хронический гиперпластический ларингит, папилломатоз) гортани с онкогенными вирусами папилломы человека и Эпштейна-Барр.

2. Изучить взаимосвязь уровня антител к белкам литической инфекции ВЭБ с частотой синтеза латентного мембранного протеина (ЪМР-1) в опухолевых клетках больных раком гортани.

3. Оценить частоту делеции генов глутатион-Б-трансфераз СБТП и ОБТШ у больных раком и предопухолевыми заболеваниями гортани.

4. Изучить взаимосвязь вирусной инфекции с клинико-морфологическими особенностями рака гортани.

5. Определить факторы риска развития рака гортани.

Научная новизна. Проведено комплексное исследование частоты ассоциации онкогенных вирусов со злокачественными и предопухолевыми заболеваниями гортани. Показан 8,5-кратный риск развития рака гортани, ассоциирующий с инфицированностью эпителия гортани вирусом папилломы человека 6 типа.

Показано значимое увеличение частоты встречаемости высокого уровня к вирусному капсидному антигену ВЭБ у больных РГ с ТЗ объемом опухоли.

Проведен сравнительный анализ результатов определения латентного мембранного протеина (ЬМР-1) в опухолевых клетках больных РГ и иммунного ответа к антигенам литической инфекции ВЭБ. Показано, что в 87,5% случаев синтез ЬМР-1 сопровождается повышением уровня антител к антигенам литической инфекции ВЭБ.

Определена частота встречаемости делеции генов глутатион-8-трансфераз С8ТТ1 и С8ТМ1 у больных раком и предопухолевыми заболеваниями гортани. Установлен ассоциирующий с носительством делеции гена С8ТТ1 3-х и 4-кратный риск развития РГ у больных предопухолевыми заболеваниями и РГ.

Выделены критерии формирования группы повышенного онкологического риска развития рака гортани.

Теоретическая и практическая значимость. Выявление опухолей гортани, ассоциированных с онкогенными вирусами папилломы человека и Эпштейна-Барр, может служить важной предпосылкой для углубленного изучения их этиопатогенеза, разработки новых подходов к ранней диагностике и прогнозированию клинического течения заболевания. Установленная ассоциация инфицированности эпителия гортани ВПЧ 6 типа

и носительства делении гена GSTT1 с РГ, свидетельствует о возможности использования изученных показателей в качестве дополнительных критериев формирования групп повышенного риска развития рака гортани.

Определение в опухолевых клетках больных раком гортани синтеза латентного мембранного протеина (LMP-1), сопровождающегося повышением уровня антител к антигенам логической инфекции ВЭБ может свидетельствовать о вкладе вирусной составляющей в процесс канцерогенеза гортани.

Выявленные факторы риска могут быть использованы в качестве дополнительного критерия при скрининге лиц с предопухолевыми заболеваниями. Результаты, полученные на модели одной из наиболее распространенных эпителиальных опухолей человека, будут способствовать более глубокому пониманию механизмов вирусного канцерогенеза. Внедрение результатов исследования. Метод ПЦР для определения вирусов папилломы человека и Эпштейна-Барр, а также полиморфизма генов ферментов детоксикации ксенобиотиков адаптирован и внедрен в практику работы лаборатории онковирусологии ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН. Полученные результаты используются в учебном процессе на кафедрах онкологии, биологии и генетики Сибирского государственного медицинского университета.

Положения, выносимые на защиту:

1. Частота выявления и спектр папилломавирусной инфекции в группе больных раком гортани превышают данные показатели у пациентов предопухолевыми заболеваниями гортани и здоровых лиц.

2. Наличие в опухолевых клетках больных раком гортани маркера латентной инфекции вируса Эпштейна-Барр, мембранного протеина (LMP-1), сопряжено с повышением уровня антител к антигенам литической инфекции ВЭБ.

3. Носительство делеции GSTT1 гена повышает риск развития РГ. Апробация работы: Основные положения диссертационной работы были представлены и обсуждены на региональной конференции молодых ученых имени академика РАМН Н.В.Васильева "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии", Томск (2005-2007); III Российской научной конференции с международным участием "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Новосибирск (2006); Российской научной-практической конференции с международным участием "Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи", Барнаул (2006, 2007); IV съезде онкологов и радиологов СНГ, Баку (2006); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Опухоли головы и шеи", Анапа (2006);VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней -2007» Москва (2007).

Публикации. Основные результаты исследования опубликованы в 18 печатных работах, из них три - в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 34 рисунками и 32 таблицами. Библиографический список включает 171 источник: 81 отечественных и 90 зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование было включено 126 пациентов с патологией гортани, из них 103 - с диагнозом рак гортани, 23 - с предопухолевыми заболеваниями гортани (хронический гиперпластический ларингит и папилломатоз) (табл.1). Больные раком гортани находились на стационарном и амбулаторном лечении в отделении опухолей головы и шеи ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (зав. отделением - чл.-корр. РАМН, профессор, д.м.н., Е.Л. Чойнзонов).

Таблица 1

Характеристика групп обследованных

Группы обследованных N Пол Возраст (год)

Муж Жен

Рак гортани 103 100 3 57,6±1,05

Предопухолевые заболевания гортани 23 16 7 51,3±1,93

Контрольная группа 56 34 22 45,9± 1,94

Образцы опухолей гортани и прилежащей к опухоли морфологически неизмененной ткани были получены в результате диагностических биопсий и/или после оперативного вмешательства по поводу рака. Гистологическое и иммуногистохимическое исследование проводилось в отделении патологической анатомии и цитологии ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (зав. отделением - профессор, д.м.н. В.М. Перельмутер). Диагноз подтверждался результатами клинического, эндоскопического, рентгенологического и морфологического обследований.

Для анализа сравниваемых групп по гистологическому типу использовалась рекомендуемая ВОЗ (1999) «Гистологическая классификацией опухолей гортани». Гистологическое и иммуногистохимическое исследования проводились в отделении патологической анатомии и цитологии ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (зав. отделением - профессор, д.м.н. В.М. Перельмутер). У всех

обследованных больных РГ верифицирован плоскоклеточный тип разной степени дифферендировки. При этом у 24,3% больных отмечена высокая, у 63,1% - умеренная и у 8,7% - низкая степень дифференцировки опухоли. Распространенность опухолевого процесса оценивалась по международной классификации ТОМ (табл.2). Наблюдение за больными, проходившими стационарное лечение в клинике ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, проводилось в течение 2-х лет. Рецидив отмечен у 12 (11,65%) больных в сроки от 6 месяцев до 2-х лет от момента проведения оперативного вмешательства, при этом, у 9,7% зарегистрирован летальный исход. Контрольная группа представлена лицами, не имеющими морфологических изменений эпителия гортани (п=56).

Таблица 2

Распространенность опухолевого процесса в гортани

Стадия T N M

0 Tis N0 МО

I Tl N0 МО

II T2 NO МО

III Tl, T2, T3 N1, N0, N1 МО МО

IVA Tl, T2, T3, T4 N2, N0, N1, N2 МО МО

IVB T4b Любая T Любая N N3 МО МО

IVC Любая T Любая N Ml

Методы исследования

Геномная ДНК, полученная из лимфоцитов периферической крови и биопсийного материала, была выделена с использованием протеиназы К с последующей фенол-хлороформной экстракцией (Дейвис К., 1990). Генетическую информацию вируса папилломы человека в ДНК, выделенную из биопсийного и операционного материала, выявляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Амплификация фрагментов ДНК папилломавирусов 6, 11, 31, 33, 16 и 18 типов проводилась по стандартной программе на амплификаторе «Термоцик МС2», с регулированием температуры по матрице (скорость нагрева-охлаждения не менее 1°С/сек). Для визуализации продуктов амплификации применяли 2,5% агарозный гель. Для определения ДНК ВПЧ использовали коммерческие наборы фирмы «Амплисенс» (ФГУН ЦНИИЭ, Москва).

Определение латентного мембранного протеина (LMP-1) вируса Эпштейна-Барр проводили иммуногистохимически, авидин-биотиновым методом с использованием моноклональных антител Epstein-Barr Virus (latent

membrane protein) - NCL-EBV-CS1-4 (Novocastra Laboratories Ltd) на серийных парафиновых срезах, сделанных из биопсийного и операционного материала лиц со злокачественной патологией гортани, проходивших лечение в клинике ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН г. Томска в период с 2005 по 2007 гг.

Уровни специфических антител к антигенам литической инфекции ВЭБ (lgG и IgA к вирусному капсидному антигену, IgG к комплексу ранних антигенов) в сыворотке периферической крови обследуемых лиц определяли методом непрямой иммунофлюоресценции (Henle W., 1979).

Оценку полиморфизма генов ферментов детоксикации ксенобиотиков GSTT1 и GSTM1 (кодируют соответственно глутатион S-трансферазы 91 и ц1) проводили с помощью мультиплексной ПЦР с использованием трех пар олигонуклеотидных праймеров, специфичных к участку гена рецептора эстрогенов, ER (F: 5'-caa-gtc-tcc-cct-cac-tcc-cc; R: 5'-gtg-cga-gtg-gct-cag-tgt-gt) и генов GSTT1 (F: 5'-ggt-cat-tct-gaa-ggc-caa-gg; R: 5'-ttt-gtg-gac-tgc-tga-gga-cg), и GSTM1 (F: 5'-tgc-ttc-acg-tgt-tat-gga-ggt-tc; R: 5'-gtt-ggg-ctc-aaa-tat-acg-gtg-g) (Spurdle A.B. et al., 2001). Продукты амплификации фракционировали в 3%-ом агарозном геле с добавлением бромистого этидия в течение 30 мин при напряжении 130 В и визуализировали в УФ-свете (рис.1).

ER

GSTT1 GSTM1

Рис. 1. Примеры идентификации 0/0 и + генотипов по генам GSTTI и GSTMI: ER -контроль амплификации (183 п.н.); 1 - генотип GSTT1 0/0 GSTM1 0/0; 2, 5, 7 - GSTT1 + GSTM1 + (131 и 114 п.н. соответственно); 3. 4, 6 - GSTT1 0/0 GSTMI +; 8 - GSTTI + GSTM1 0/0.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows 6.0». При сравнении частот генотипов применяли стандартный критерий Пирсона (х2). В случае малого объема выборки (< 5 человек) использовали критерий Пирсона с поправкой Йетса и критерий Фишера. Для оценки ассоциации между генотипами и риском развития заболевания рассчитывали отношение шансов

(OR-odd ration). OR указывался с 95% доверительным интервалом (Confidence interval - CI). Прогностическая значимость признаков в отношении общей и безрецидивной выживаемости у больных РГ оценена с использованием программы Survival Analysis, STAT1ST1CA 6.0. Кривые кумулятивной выживаемости строились по методу Каплана-Майера. Значимость различий в выживаемости между группами оценена по критерию Гехана-Вилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН на протяжении ряда лет проводились исследования по изучению распространенности вируса Эпштейна-Барр среди населения Сибири и Дальнего Востока, кроме того, изучалась его роль как фактора прогноза и формирования групп повышенного риска развития опухолей различных локализаций, в том числе, области головы и шеи (Исаева Т.М., 1992; Чойнзонов ЕЛ., 1997). Литературные данные относительно вклада вируса папилломы человека в патогенез рака гортани разноречивы и, зачастую, диаметрально противоположны. Кроме того, практически, не встречается работ, посвященных изучению частоты встречаемости ВПЧ у лиц, страдающих хроническим гиперпластическим ларингитом и папилломатозом гортани, которые официально признаны факторами риска развития РГ и рассматриваются как заболевания с высокой частотой малигнизации. На первом этапе нашей работы была изучена частота ассоциации рака и предопухолевых заболеваний гортани с вирусом папилломы человека и проведено сопоставление изученного показателя с клинико-морфологическими особенностями опухолевого процесса.

Максимальный уровень инфицирования вирусом папилломы человека был зарегистрирован у больных РГ (20,0%), значимо различаясь с таковым в контрольной группе (5,4%), в то время как у пациентов с ПЗГ значение данного показателя составило 8,7% (рис.2).

Следует отметить, что у больных раком гортани ВПЧ инфицирована как опухолевая (16%), так и прилежащая к ней, нормальная (5,0%) ткань, тогда как у больных предопухолевыми заболеваниями и лиц контрольной группы ВПЧ был детектирован только в нормальной ткани в 8,7% и 5,4% случаях, соответственно. Изучение частоты инфицированности как нормальной, так и опухолевой ткани гортани одним или несколькими типами ВПЧ, показало преобладание в нормальной ткани больных РГ моно-инфекции (13,0%), а в опухолевой ткани - микст (6,0%). У больных предопухолевыми заболевания гортани оба типа инфицирования были обнаружены с одинаковой частотой -в 4,0% случаев. При этом в контрольной группе обнаружено только микст-инфицирование (5,4%).

Исследование спектра инфицирования ВПЧ эпителиальной ткани гортани среди больных и лиц контрольной группы показало, что наиболее

часто во всех трех группах выявляются 6 и 11 типы вируса. Так, у больных РГ данные типы обнаружены в 10 и 7,0% случаев, соответственно, тогда как среди больных предопухолевыми заболеваниями гортани и в контрольной группе ВПЧ 6 и 11 были обнаружены с одинаковой частотой - в 4,0% случаев. ВПЧ 31 и 33 были определены у больных РГ и в контрольной группе в равном проценте случаев - 2,0% .

Рис. 2. Частота встречаемости вируса папилломы человека в изученных группах больных и контрольной. Примечание: * - статистически значимые различия с контрольной группой (р < 0,05).

Следует отметить, что в группе больных РГ спектр инфицированности опухолевой ткани был шире по сравнению с нормальной тканью. Так, кроме ВПЧ 6, 11, 31 и 33, представленных в нормальной ткани, в опухолевой дополнительно были выявлены ВПЧ 16 и 18 в 1,0% и 2,0% случаев, соответственно.

При сопоставлении частоты детекции и спектра инфицированности ВПЧ с таким клинически значимым параметром, как стадия заболевания, были получены следующие результаты. При одинаковом уровне инфицированности нормальной ткани больных со II и III стадией опухолевого процесса, у пациентов с III стадией заболевания частота выявления ВПЧ в опухолевой ткани в два раза превышала значение этого показателя у больных со II стадией (рис.3,4). Однако при детальном рассмотрении зависимости спектра типов ВПЧ от стадии опухолевого процесса было установлено, что у больных с Ш стадией диапазон вирусов папилломы человека, инфицирующих нормальную ткань, более широк.

Кроме 6 и 11 типов вируса, присутствие которых было отмечено также и в нормальной ткани больных со II стадией, у больных с III стадией были определены с одинаковой частотой 31 и 33 типы. Аналогичная тенденция отмечена при сравнении спектра ВПЧ в опухолевой ткани больных РГ. Максимальный спектр типов ВПЧ был зафиксирован в опухолевой ткани больных с Ш стадией опухолевого процесса. Помимо 6, II и 31 типов ВПЧ, обнаруженных в опухолевой ткани больных со II стадией процесса, у больных с III стадией дополнительно и с одинаковой частотой (13,0%) были определены 33, 16 и 18 типы.

II стадия III стадия

Рис. 3. Частота детекции вируса папилломы человека в норм&чьной ткани больных раком гортани со II и III стадией опухолевого процесса.

Аналогичная тенденция наблюдалась при изучении спектра инфицированности и частоты детекции ВПЧ в ткани больных РГ во взаимосвязи со степенью дифференцировки опухоли. Так, у больных с высокой степенью дифференцировки частота детекции вируса в нормальной и опухолевой ткани была, примерно, равнозначна. Однако, в опухолевой ткани, помимо ВПЧ 11, выявленного и в нормальной ткани, присутствовал ВПЧ 6 (7,0%). Спектр инфицированности как опухолевой, так и нормальной ткани больных РГ с умеренной степенью дифференцировки опухоли был более широким. Кроме ВПЧ, выявленных у больных с высокой степенью дифференцировки, у больных с умеренно-дифференцированной опухолью обнаружены ВПЧ 16 и 18 (в 2,0 и 3,0% случаев, соответственно). Причем, с максимальной частотой и в опухолевой (в 9,0 и 5,0% случаях, соответственно), и в нормальной ткани (в 11,0 и 8,0% случаях, соответственно) были обнаружены 6 и 11 типы ВПЧ. С одинаковой частотой (2,0%) в обеих типах эпителиальной ткани гортани больных РГ выявлены ВПЧ 31 и 33.

Ит''

■ 6

12

¡0

8

%

6

4

2

0

II стадия

III стадия

Рис, 4. Частота детекции вируса папилломы человека в опухолевой ткани больных раком гортани со II и 111 стадией опухолевого процесса.

Поскольку, от момента инфицирования до возникновения опухоли проходит продолжительный латентный период, длящийся годами, а иногда и десятилетиями, мы сочли целесообразным изучить частоту встречаемости и спектр ВПЧ во взаимосвязи с длительностью течения заболевания, для чего больные РГ были разделены на соответствующие подгруппы (длительность заболевания менее 0,5 лет; 0,5-2 и 2-4 года). Показано 2,4- и 1,2-кратное увеличение частоты встречаемости ВПЧ в опухолевой ткани больных РГ, заболевание которых длилось 0,5-2 и 2-4 года, соответственно, по сравнению с больными с минимальным сроком развития патологического процесса. Тенденция инфицирования нормальной ткани больных была подобна предыдущей, однако, у больных с максимальным сроком развития заболевания частота детекции вируса была в 1,5 раза ниже, чем у лиц с 0,5-2-летним и составила 9,0%. Следует отметить, что нормальная ткань больных именно с минимальным периодом развития опухолевого процесса была инфицирована, помимо ВПЧ 6, 11, вирусами папилломы 31 и 33 типа, чего не наблюдалось ни в одной другой подгруппе больных. Тогда как, в опухолевой ткани присутствовал только 6 тип вируса. В подгруппе больных с продолжительным течением заболевания частота и спектр инфекции, напротив, были наиболее широко представлены в опухолевой ткани (ВПЧ 6, 11,16 и 18), тогда как в нормальной были выявлены только 6 и 11 типы.

У больных с предоггухолевыми заболеваниями гортани различий в частоте инфицированности ВПЧ между подгруппами показано не было. Однако нормальная ткань пациентов с минимальным сроком развития заболевания была инфицирована 6 и 11 типами, тогда как у больных с 2-4-летним процессом - ВПЧ 31. Таким образом, присутствие ВПЧ 31 типа в нормальной

слизистой гортани больных раком и нредопухолевой патологией неоднозначно влияет на длительность течения патологического процесса.

Существуют разные точки зрения на причинно-следственные аспекты вирусного канцерогенеза. Так, связь между инфицированностью эпителия у больных с предопухолевой патологией гортани и тяжестью течения заболевания объясняется наличием латентной инфекции в морфологически здоровой ткани, прилегающей к патологическому очагу (Плужников МС. и др., 2006). Согласно гипотезе, предложенной Г.Ф. Иванченко и др. (2001), ведущая роль в поддержание и прогрессирование патологического процесса, не исключая вклада вирусной составляющей, отводится особенностям макроорганизма, в частности, дефициту системы интерферона и показателей Т-клеточного звена иммунитета, регистрируемому у 98% больных рецидивирующим респираторным папилломатозом. О важности CD4+ и/или CD8+ - Т-клеточных реакций в контроле ВПЧ-инфекции, в том числе, частоты ее рецидивирования у больных с Т-клеточной иммуносупрессией, свидетельствует и большое число заболеваний, ассоциированных с ВПЧ различных типов (Benton С. et al., 1992). Вышесказанное подтверждается, также, гистологическими исследованиями, выявляющими, в случаях самопроизвольной регрессии папиллом, наличие Т-клеточной инфильтрации в биоптатах кожи и слизистых оболочек (Berman A. et al., 1980; Iwatsuki К. et al., 1986; Delius H. et al., 1998). Имеются данные, согласно которым, развитию и прогрессированию вирусной инфекции у 48% больных папилломатозом гортани способствует дибаланс Thl/Th2 (Clerici М. et al., 1998; Snowden T.R. et al., 2001).

Оценив риск развития рака гортани у лиц, инфицированных папилломавирусами, нами установлено, что инфицирование эпителия гортани больных РГ ВПЧ 6 ассоциировало с 8,5-кратным риском развития злокачественной опухоли по сравнению с контрольной группой. При этом только у больных РГ и исключительно в опухолевой ткани были обнаружены 16 и 18 типы вируса папилломы, отсутствующие в других исследуемых группах. Отмечено, что только у больных с III стадией злокачественного процесса и умеренной степенью дифференцировки в опухолевой ткани обнаружено присутствие всех 6 изученных типов ВПЧ. Несмотря на получение определенных результатов относительно ассоциации ВПЧ с патологией гортани, их неоднозначность оставляет вопрос о вкладе вируса папилломы человека в этиопатогенез рака гортани открытым и требующим дальнейшего изучения и уточнения.

Несмотря на практически 95-100% инфицирование населения планеты вирусом Эпштейна-Барр, механизм канцерогенеза, ассоциированный с этим вирусом, достаточно сложен и мало изучен. До настоящего времени нет четких данных о роли вируса Эпштейна-Барр в патогенезе РГ, не выявлен вклад факторов, которые могут способствовать онкогенезу, в частности, ВЭБ-ассоциированных хронических воспалительных процессов эпителия слизистой, его иммунодепрессивное влияние при инфицировании организма хозяина. Учитывая вышеизложенное, вторым этапом нашего исследования

явилось определение гуморального иммунного ответа к антигенам литической инфекции вируса Эпштейна-Барр в изучаемых группах и сопоставление полученных данных с клиническими параметрами, такими как размер первичного опухолевого очага, регионарное и отдаленное метастазирование, общая и безрецидивная выживаемость.

Изучение зависимости уровня антител к антигенам ВЭБ от размера опухоли показало, что максимальная частота повышенного уровня антител класса в к вирусному капсидному и комплексу ранних антигенов ВЭБ (40,0% и 48,0%, соответственно) характерна для больных, размер опухоли которых соответствовал ТЗ, значимо различаясь с аналогичным показателем у больных с Т1, Т2 и Т4 объемом опухоли. При этом между уровнем антител класса в к антигенам ВЭБ и регионарным метастазированием была показана обратная пропорциональная зависимость. Так, высокие уровни антител класса в к вирусному капсидному и комплексу ранних антигенов ВЭБ с большей частотой (44,0% и 56,0%, соответственно) были определены у больных РГ с отсутствием метастазов, значимо различаясь с данным параметром у больных с одним или несколькими регионарными метастазами.

У больных РГ с отдаленными метастазами в распределении уровней антител к антигенам ВЭБ наблюдалась тенденция, аналогичная предыдущей. Высокие уровни антител были зафиксированы только у больных без метастазов. Однако в единичном случае в группе больных с одним отдаленным метастазом мы наблюдали повышенные уровни антител класса в к комплексу ранних антигенов. При этом значимые различия были показаны между низким значением антител и отсутствием, либо наличием одного отдаленного метастаза.

При изучении такого клинически важного прогностического критерия, как безрецидивная выживаемость, в сопоставлении с уровнем антител класса в к вирусному капсидному антигену ВЭБ, статистически значимых различий между кривыми выживаемости показано не было (р>0,05). Однако тенденция к наличию различий наметилась между кривыми выживаемости при изучении уровня антител класса О к комплексу ранних антигенов ВЭБ (рис.5). Следует подчеркнуть, что в данном случае максимальное количество рецидивов (п=9) было отмечено в группе больных с низкими значениями антител.

Таким образом, полученные данные по состоянию специфического гуморального иммунного ответа у больных РГ в сопоставлении с клиническими параметрами носят, как и в случае инфицирования пациентов вирусами папилломы, несколько противоречивый характер: с одной стороны, вполне обоснованно наблюдается повышение уровня антител к антигенам ВЭБ у больных с ТЗ размером опухоли, с другой - снижение, практически, до нулевых значений - при регионарном или отдаленном метастазировании.

о Нецензурированные : Цензурирование

Время, месяцы

Рис 5, Безрецидивная выживаемость больных РГ в зависимости от уровня антител класса G к комплексу ранних антигенов ВЭБ. Примечание: нецензурированные данные -завершенные наблюдения, в которых зафиксирован случай рецидивирования; цензурированные данные - незавершенные наблюдения, в которых исследуемый исход не наступил, или объект выбыл и больше не наблюдался. Группа 1 - уровень антител класса G к РА в значении < 1:20, группа 2 - уровень антител класса G к РА в значении > 1:40. Статистически значимых различий между кривыми выживаемости не выявлено (р=0,6172).

Одновременно с синтезом антигенов литической инфекции ВЭБ, сопровождающимся повышением уровней специфических антител, в организме может наблюдаться и экспрессия генов, индуцирующих синтез антигенов латентной инфекции. Одним из представителей этой группы является мембранный протеин (LMP-I), обладающий онкогенной потенцией и инициирующий злокачественный фенотип клеток эпителия. Согласно литературным данным, в опухолевых клетках больных со злокачественной патологией верхнего отдела респираторного тракта отмечается синтез именно этого протеина (Baumforth К. R. N, 1999; Prince S., 2003; Bar-Sela G, 2003). Однако время начала его синтеза в клетке и пусковой механизм, который приводит к малигнизации, остаются неясными. При сопоставлении частоты синтеза LMP-1 с уровнем антител к антигенам литической инфекции ВЭБ, нами показано, что в большинстве случаев (87,5%) повышение уровня антител к антигенам ВЭБ сопровождается присутствием в опухолевых клетках генетического материала ВЭБ - мембранного протеина LMP-1, что не исключает возможности использования специфических антител ВЭБ на этапе ранней диагностики ВЭБ-позитивного рака гортани.

В последнее время в литературе все чаще обсуждается вопрос о влиянии полиморфизма генов ферментов детоксикации ксенобиотков - С8ТТ1 и С5ТМ1 на предрасположенность к развитию онкологических заболеваний, в том числе и рака гортани (.(оигепкоуа 1998; ИбсЬ А,, е1 а1., 2003). Получены данные о модифицирующем влиянии канцерогенных факторов внешней среды на чувствительность эпителиальных клеток к инфицированию вирусами (№ес1оЬкек в., 2000). В этой связи мы сочли целесообразным изучить частоту встречаемости делеции данных генов в группах больных раком и предопухолевыми заболеваниями гортани, а также рассчитать риск развития РГ в изученных группах (табл.4).

Частота детекции гомозигот по нулевому аллелю (0/0) гена С8ТТ1 в группе здоровых лиц оказалась несколько ниже популяционной для СевероЗападного региона Сибири (23,3%) (Попова С.Н., 2002), в том числе и для г.г. Томска и Новосибирска (23,7%) (Ляхович В.В. и др., 2000; Вавилин И.О. и др., 2002; Брагина Е.Ю., 2005), составив 15,0% (табл.3). Максимальная частота нулевого генотипа СЭТП среди изученных групп была отмечена у больных раком гортани (58,2%). Это значение в 3,8 раза превышало соответствующий показатель в контрольной группе и в 1,3 раза - в группе больных предопухолевыми заболеваниями гортани. При этом различия по данному показателю между группами онкологических больных и контрольной оказались значимыми (х2=40,75; р=0,0001), что может свидетельствовать об ассоциации риска развития заболевания с данным генотипом (011=3,88; С19$%2,37-6,37). Различия по нулевому генотипу С8ТП между группами пациентов с предопухолевыми заболеваниями гортани и контрольной также оказались значимыми (р <0,05) и риск развития злокачественной патологии был повышен у больных предопухолевыми заболеваниями гортани по сравнению с группой контроля (011=2,90; С195%1,50-5,60) (табл.3).

При сравнении частоты распределения нулевого генотипа С8ТТ1 среди больных раком и предопухолевыми заболеваниями гортани значимых различий выявлено не было. Частота гомозигот по нулевому аллелю глутатион-Б-трансферазы М1 в контрольной группе составила 43,0%, соответствуя таковой в популяции Северо-Западного региона России (42,2%) и практически совпадая с аналогичным показателем (54,8%) для жителей г. Томска (Попова С.Н., 2002, Брагина Е.Ю., 2005). У больных раком гортани частота гомозигот С8ТМ1 0/0 составила 29,1% (что в 1,4 раза ниже популяционного уровня). В группе больных с ПЗГ частота нулевого генотипа С8ТМ1 (26,1%) практически соответствовала таковой (29,1%) в группе больных раком гортани, в 1,6 раз превышая аналогичный показатель в контрольной группе. Указанные различия в сравниваемых группах больных оказались незначимыми (р >0,05).

При рассмотрении частоты встречаемости делеции С8ТТ1 и С8ТМ1 у больных РГ, инфицированных ВПЧ, установлено, что у данной категории лиц выявлялась делеция только одного из двух изучаемых генов. При этом больные, инфицированные ВПЧ 11, являлись носителями только делеции

С8ТМ1 гена. При сопоставлении носительства делении СБТИ и 08ТМ1 генов с высоким уровнем антител к антигенам ВЭБ какой-либо зависимости установлено не было.

Таблица 3

Частоты нулевого (0/0) генотипа С8ТТ1 и вБТМ! в обследованных группах

Ген Генотип Здоровые (п=100) Больные

ПЗГ (п=23) РГ (п=103)

Абс. % Абс. % Абс. %

GSTT1 0/0 15 15,0 10 43,5' OR=2,90; С195%(1,50-5,60) 60 58,2' OR=3,88; С195% (2,37-6,73)

GSTM1 0/0 43 43,0 6 26,1 30 29,1

Примечания: * - уровень статистической значимости различий параметров в сравнении с контрольной группой; OR - относительный риск развития заболевания в сравнении с контрольной группой. OR указывался с 95% доверительным интервалом (Confidence interval - CI).

Для установления связи между изучаемыми клинико-морфологическими и вирусо-генетическими параметрами был проведен корреляционный анализ (рис.6). На схеме представлены корреляционные связи с уровнем статистической значимости р < 0,05. Наличие прямых связей показано как внутри, так и между клинико-серологическим и вирусо-генетическим блоками. Тогда как обратная зависимость была выявлена только между вирусологическим и вирусо-генетическим параметрами. Так, синтез антител класса G и А к антигенам литической инфекции ВЭБ связан между собой, а также с гистологическим диагнозом, что является закономерным с патофизиологической точки зрения, указывая значимость и возможность применения данного параметра при диагностике заболеваний гортани. Наличие корреляционной связи между инфицированностью опухолевой ткани ВПЧ 6 и 11, также как наличием в опухолевой ткани ВПЧ 16 и 18, можно интерпретировать с позиции как принадлежности к одной группе онкогенности, так и их широкой распространенности. Наличие связи между носительством делеции генов ферментов детоксикации ксенобиотиков -GSTT1 и GSTM1 объяснимо, возможно, высокой частотой встречаемости делеции гена GSTM1 в популяции Томской области и повышенной частоты -гена GSTT1, выявленной среди больных РГ. Обратные корреляционные связи были показаны лишь в двух случаях: между наличием в опухолевой ткани ВПЧ И и 18, что может быть объяснено как принадлежностью к

разным группам онкогенности, так и взаимоисключающими или конкурирующими взаимоотношениями со стороны обоих типов; а также между инфицированной ВПЧ 11 опухолевой тканью и делецией СвТЛ гена, создающей, возможно, неблагоприятные условия для интеграции данного типа вируса в эпителиальные клетки гортани. Однако наиболее значимыми, с точки зрения патофизиологии, мы считаем наличие корреляции, установленной между инфицированностью нормальной и опухолевой ткани ВПЧ 6, что может свидетельствовать о частичной моноклональности опухолевого пула клеток и тем самым подтверждать вклад вирусной составляющий в процесс канцерогенеза гортани. На основании анализа корреляционных связей можно сделать вывод о причастности вирусов папилломы человека и Эпштейна-Барр к опухолевому процессу в гортани. Однако, на наш взгляд, полученные данные недостаточны для установления прямой причинно-следственной связи между изученными клиническими показателями и вирусной компонентой. Вероятно, попав в организм, вирус может реализовать свой онкогенный потенциал через цепь последовательных звеньев, приводящих, в совокупности, к злокачественной трансформации клеток и, в конечном итоге, инициирующих канцерогенез.

Для выявления факторов риска развития рака гортани был проведен первый этап регрессионного анализа с включением всех клинико-морфологических и вирусо-генетических параметров, в результате которого были отобраны наиболее информативные (с коэффициентом значимости р < 0,05). В результате было показано, что основополагающими в процессе злокачественной трансформации являются: вирусная составляющая, включающая повышенный уровень иммуноглобулинов класса в к вирусному капсидному антигену вируса Эпштейна-Барр, свидетельствующая о наличии в организме литической инфекции; инфицирование эпителия гортани вирусом папилломы человека 6 типа, который был выявлен во всех трех изученных группах, с максимальной частотой определен как в нормальной, так и в опухолевой ткани больных раком и предопухолевыми заболеваниями гортани, и носительство которого ассоциировало с 8,5-кратным риском развития рака; генетическая компонента, заключающаяся в делеции гена С8ТТ1, носительство которой ассоциировало с 3-х и 4-кратным риском развития злокачественного процесса у больных с предопухолевыми заболеваниями и раком гортани, соответственно; анамнестический показатель - возраст, являющийся универсальным фактором риска для многих заболеваний, в том числе онкологических.

Возраст

IgG к РА

Делеция гена Делеция гена

GSTT1 GSTM1

Рис 6. Корреляционные связи между вирусо-генетическими и клшшческими параметрами в группе больных раком гортани. Примечание: —► - прямые связи, --*■-обратные связи. На схеме представлены связи с уровнем статистической значимости р < 0,05 и коэффициентом корреляции Спирмана > 0,5.

ВЫВОДЫ

1. Частота выявления вируса папилломы человека у больных раком гортани составила 20,4%, в 2,3 раза превышая таковую в группе больных предопухолевыми заболеваниями гортани, и значимо различаясь от данного показателя у лиц контрольной группы.

2. Диапазон типов вируса папилломы человека в опухолевой ткани зависел от стадии заболевания: на III стадии развития рака гортани зарегистрирован более широкий спектр типов вируса папилломы человека по сравнению с данным параметром у больных со II стадией.

3. В опухолевых клетках 42,4% больных раком гортани выявлен латентный мембранный протеин (LMP-1) вируса Эпштейна-Барр, синтез которого в 87,5% случаев сопровождался высокой активностью гуморального иммунного ответа на антигены литической инфекции вируса Эпштейна-Барр.

4. Показано значимое увеличение частоты встречаемости высокого уровня иммуноглобулина G к вирусному капсидному антигену вируса Эпштейна-Барр у больных раком гортани с ТЗ объемом опухоли по сравнению с величиной данного параметра у больных с Т1 и Т2 объемами.

5. К факторам риска развития рака гортани отнесены инфицирование эпителия гортани вирусом папилломы человека 6 типа, высокие уровни иммуноглобулина G к капсидному антигену вируса Эпштейна-Барр, носительство делеции GSTT1 гена, возраст больного.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шилова О.Ю. Роль вирусов в этиологии и патогенезе злокачественных опухолей: протоколы общества онкологов / О.Ю. Шилова, JI.H. Уразова // Сибирский онкологический журнал. - Томск. - 2005. - №2. - С.61 - 62.

2. Шилова О.Ю. Исследование частоты ассоциации предопухолевых заболеваний и рак гортани с онкогенными вирусами / О.Ю. Шилова, JI.H. Уразова // Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи. Материалы Российской научно - практической конференции с международным участием. - Барнаул. - 2006. - С. 247.

3. Частота выявляемое™ вируса папилломы человека при патологических процессах гортани / О.Ю. Шилова, JI.H. Уразова, E.JI. Чойнзонов, М.Р. Мухаммедов, О.В. Черемисина, В.А. Евтушенко // Сибирский онкологический журнал. - Томск. - 2006. - Прил.№.1. - С. 130 -131.

4. Шилова О.Ю. Патологические процессы гортани, ассоциированные с онкогенными вирусами / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова // IV съезд онкологов и радиологов СНГ. Материалы съезда. - Баку. - 2006. - С.400.

5. Частота выявления вируса папилломы человека у больных хроническими заболеваниями и раком верхних дыхательных путей / О.Ю. Шилова, JI.H. Уразова, E.JI. Чойнзонов, М.Р. Мухаммедов, О.В. Черемисина,

B.А. Евтушенко // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: третья российская конференция с международным участием. Тезисы докладов. - Новосибирск. - 2006. - С.263-265.

6. Выявление вирусов папилломы человека у больных хроническими заболеваниями и раком верхних дыхательных путей / / О.Ю. Шилова, JI.H. Уразова, Е.Л. Чойнзонов, М.Р. Мухаммедов, О.В. Черемисина // 10 Российский онкологический конгресс. Материалы конгресса. - М. - 2006. -

C.200.

7. Шилова О.Ю. Выявление HPV-ассоциированных форм хронических заболеваний и рака гортани / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии: региональная конференция молодых ученых. Сборник материалов. - Томск. - 2006. - С.68-69.

8. Ассоциация рака гортани с вирусами папилломы человека и Эпштейна-Барр: проспективные исследования / О.Ю. Шилова, М.Р. Мухамедов, О.В. Черемисина, Л.Н. Уразова // Профилактика и лечение злокачественных новообразований в современных условиях: Российская научно-практическая конференция с международным участием. Материалы конференции. -Новосибирск. - 2007. - С.374-375.

9. Онкогенные вирусы в патогенезе хронических заболеваний и рака гортани / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова, М.Р. Мухамедов, Е.Л. Чойнзонов // Buletinul academiei de stiinte a Moldovei stiinte medícale: revista stiintifico-practica. - Chísinau. - 2007. - №4. - C.341-342.

10. Шилова О.Ю. Ассоциация рака гортани с вирусами папилломы человека и Эпштейна-Барр / О.Ю. Шилова // Сибирский онкологический журнал. - Томск. - 2007. - Прил. № 2. - С.126-127.

И. Шилова О.Ю. Исследование частоты ассоциации предопухолевых заболеваний и рака гортани с онкогенными вирусами папилломы человека и Эпштейна-Барр / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова // Проблемы фундаментальной и прикладной медицины: четвертая Всероссийская конференция молодых ученых в рамках 13 международного конгресса по приполярной медицине. -Новосибирск. - 2006. - С.53-54.

12. Вирус папилломы человека у больных хроническими заболеваниями и раком верхних дыхательных путей / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова, Е.Л. Чойнзонов, М.Р. Мухаммедов, О.В. Черемисина // Молекулярная диагностика: VI всероссийская научно-практическая конференция с международным участием. Сборник тезисов. - М. - 2007. - Т. III. - С.168-169.

13. Полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков: взаимосвязь с риском развития рака гортани / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова, П.А. Гервас, М.Р. Мухамедов, О.В .Черемисина, В.А.Евтушенко, Е.Л.

Чойнзонов // Сибирский онкологический журнал. - Томск. - 2007. - №2. -С.62-65.

14. Вирусы папилломы человека и Эпштейна-Барр в патогенезе предопухолевых заболеваний и рака гортани / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова, М.Р. Мухамедов, О.В. Черемисина II XII межрегиональная конференция онкологов. Материалы конференции. - Якутск. - 2007. - С. 108-110.

15. Синтез латентного мембранного протеина (LMP-1) вируса Эпштейна-Барр в опухолевых клетках больных раком гортани / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова, Н.Г. Крицкая, Е.Л. Чойнзонов, О.В. Черемисина // Совершенствование онкологической помощи в современных условиях: Российская научно-практическая конференция с международным участием. Материалы конференции. - Барнаул. - 2008. - С. 151-152.

16. Ассоциация с риском развития рака гортани делеции генов биотрансформации ксенобиотиков (GSTT1 и GSTM1) / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова, О.В. Черемисина, Е.Л. Чойнзонов, М.Р. Мухамедов // Совершенствование онкологической помощи в современных условиях: Российская научно-практической конференция с международным участием. Материалы конференции. - Барнаул. - 2008. - С.321-322.

17. Синтез латентного мембранного протеина вируса Эпштейна-Барр в опухолевых клетках больных раком гортани / Л.Н. Уразова О.Ю., Шилова, Е.Л. Чойнзонов, Н.Г. Крицкая // 100 лет Российской оториноларингологии: достижения и перспективы: Всероссийская научно-практическая конференция. Материалы конференции,- С.-Петербург. - 2008. - Прил. №2,-С.424-427.

18. Изучение полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков GSTT1 и GSTM1 у больных хроническими заболеваниями и раком гортани / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова, ЕЛ.Чойнзонов, О.В.Черемисина, В.А. Евтушенко, М.Р. Мухамедов // V съезд онкологов и радиологов СНГ. Материалы съезда. - Ташкент. - 2008. - С.65.

Список сокращений:

РГ - рак гортани

ПЗГ - предопухолевые заболевания гортани ХГЛ - хронический гиперпластический ларингит ПГ - папилломатоз гортани ВПЧ - вирус папилломы человека ВЭБ - вирус Эпштейна-Барр

BKA - вирусный капсидный антиген вируса Эпштейна-Барр РА - комплекс ранних антигенов вируса Эпштейна-Барр LMP-1 - latent membrane protein-1 Ig - иммуноглобулины

Автор выражает глубокую признательность за ценные теоретические и методические рекомендации, а также практическую помощь, оказанную при проведении исследований и обсуждении результатов профессору, зав. лаборатории иммунологии НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН Чердынцевой Н.В., доктору медицинских наук, ведущему научному сотруднику отделения опухолей головы и шеи Мухамедову М.Р., доктору медицинских наук, ведущему научному сотруднику отделения эндоскопии Черемисиной О.В., доктору медицинских наук, профессору, заведующему отделением патологической анатомии и цитологии Перельмутеру В.М., кандидату биологических наук, старшему научному сотруднику отделения патологической анатомии и цитологии Крицкой Н.Г., доктору медицинских наук, старшему научному сотруднику лаборатории биохимии Бочкаревой Н.В. и коллективу лаборатории онковирусологии.

Тираж 100. Заказ 1064. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники. 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40.

Рак гортани (РГ) занимает лидирующие позиции среди злокачественных опухолей верхних дыхательных путей, составляя 65-70%, а в структуре общей онкологической заболеваемости - 1,4%, среди которых 2,8% - приходится на мужчин и 0,2% - женщин. Так, в 2006 году в России было выявлено 6655 новых случаев заболевания раком гортани (В .И. Чиссов и др., 2008). К сожалению, бессимптомное течение, которое отмечается у 35% больных РГ, приводит к тому, что более 60-70% пациентов обращаются в специализированные учреждения с уже распространенным опухолевым процессом, а показатель запущенности, отражающий состояние диагностики злокачественных новообразований в России, составил в 1996 г. 24,9% (Ольшанский В.О., 1995; Кицманюк З.Д. и др., 1998; Пачес А.И., 2000, Чиссов В.И. и др., 2000; Виноградов В.В. и др., 2007; Черемисина О.В., 2007).

Мощными индукторами опухолевых поражений слизистой оболочки верхних дыхательных путей являются курение и алкоголь (Olsen J., 1985; Franceschi S., 1990; Заридзе Д.Г., 2001; Заридзе Д.Г. и др., 2002; Shafey О., 2003; Левшин В.Ф. и др., 2003; Макушкина О.В., 2004; IARC, 2004; Осипов В.Д., 2005а; Ragin C.C.R., 2007; Шаньгина О.В., 2007). Сформулирована гипотеза, согласно которой алкоголь является активатором канцерогенного действия табачного дыма на слизистую оболочку верхнего респираторного тракта. Однако важная роль в этиопатогенезе рака гортани принадлежит воспалительным процессам, в частности, гиперпластическим заболеваниям верхних дыхательных путей (папилломатоз, хронический гиперпластический ларингит). В общей структуре воспалительных заболеваний JIOP-органов на долю хронического гиперпластического ларингита (ХГЛ) приходится от 8,4% до 10% с последующей малигнизацией эпителия гортани в 8-20% случаев (Чумаков Ф.В. и др., 2002; Осипов В.Д., 2005 б),

Согласно современным представлениям, 10 - 25% случаев рака в мире могут быть этиологически связаны с хроническими вирусными инфекциями

Фирсова Г.А. и др., 1991; Butenco Z.A. et al., 2000; Wong M., 2002; Лялина Л.В., 2003; Гурцевич В.Э. и др., 2002; Киселев Ф.Л., 2000; zur Hausen Н., 2000; Wong М. et al., 2004; Заридзе Д.Г., 2005). Все большее внимание исследователей привлекает вирусная теория канцерогенеза верхних дыхательных путей (Parkin D.M. et al., 1999; Лялина Л.В. и др., 2003). При этом .по оценкам разных авторов, от 25% до 35% опухолей головы и шеи ассоциировано с ВПЧ-инфекцией (McKaig, RG., et al., 1998; Киселев Ф.Л., 2000; Gillison М, 2000).

Трансформирующие свойства папилломавирусов обеспечиваются функционированием генов Е6 и Е7 (zur Hausen Н., 1999; Киселев Ф.Л., 2000;). Белок Е6 взаимодействует с р53, вызывая его деградацию по убиквитин-зависимому типу. Это приводит к предотвращению апоптоза и нарушению защитных регуляторных механизмов, обеспечивающих репарацию ДНК, что способствует дестабилизации генома. Кроме того, Е6 подавляет выработку интерферона, активирует теломеразу, усиливая таким образом пролиферацию (zur Hausen Н., 2002). Основным свойством белка Е7 является взаимодействие с продуктом гена Rb, с убиквитинизацией последнего и высвобождением из комплекса pRb-E2F транскрипционного фактора E2F, регулирующего клеточную пролиферацию, высокая активность которого может привести к апоптозу (Киселев Ф.Л., 2000; zur Hauzen Н., 2002; Киселев В.И. и др., 2003; Мазуренко H.H., 2003). Белок Е7 также усиливает мутагенное действие химических канцерогенов, может индуцировать анеоплоидию. Каждый из генов Е6 и Е7 способен иммортализовать культуру клеток. Совместная экспрессия этих генов значительно усиливает прогрессию, благодаря уникальному кооперативному эффекту (zur Hausen Н., 1996).

Говоря о вирусном канцерогенезе верхних дыхательных путей, не следует забывать о вирусе Эпштейна-Барр (ВЭБ), представителе семейства у-герпесвирусов человека, который связан с возникновением ряда лимфопролиферативных заболеваний, некоторых гистологических вариантов рака желудка, легких, слюнных, околоушных, молочных желез (Sixbey J.W. et al, 1984; Исаева Т.М. 1990; Shibata D. et al., 1991; Чойнзонов Е.Л., 1995; Takada К. et al., 2000; Гончарова E.B., 2001; Гурцевич В.Э. и др., 2002; Севастьянова Н.В., 2004). При этом показана трансформирующая активность ряда протеинов ВЭБ, одним из проявлений которой является способность инактивировать ген р53 (Niedobitek G. et al., 1993; Fries K.L. et al., 1996). Значительная роль в процессе малигнизации эпителиальных клеток отводится латентному мембранному протеину вируса Эпштейна-Барр (LMP-I). В доступных нам литературных источниках, практически, не освещается вирусный канцерогенез рака гортани: нет четких данных о роли вируса Эпштейна-Барр в патогенезе РГ, не выявлены механизмы опухолевой трансформации клеток, а также вклад факторов, которые могут способствовать онкогенезу, в частности, ВЭБ-ассоциированных хронических воспалительных процессов в эпителии слизистой, его иммунодепрессивное влияние при инфицировании организма хозяина. Однако получены данные о модифицирующем влиянии канцерогенных факторов внешней среды на чувствительность эпителиальных клеток к инфицированию ВЭБ (Niedobitek G. et al., 1994; Thomas J.A. et al., 1991).

Известно, что в патогенезе онкологических заболеваний участвуют гены-модификаторы, в частности, гены «внешней среды», ответственные за биотрансформацию поступающих в организм чужеродных веществ и определяющие реакцию организма на неблагоприятные внешние воздействия (Саприн А.Н., 1991; Hirvonen A. et al., 1997; Белицкий Г.А. и др., 1998; Е.В. Белогубова и др., 2000; Hong Y.J. et al., 2000; Вавилин B.A. и др., 2002; Жолдакова З.И. и др., 2002; Баранов B.C. и др., 2003; Habdous M. et al., 2004; Gajecka M. et al., 2005). Делеция этих генов приводит к синтезу функционально неполноценных белков, влияющих на способность гена-онкосупрессора р53 останавливать клеточный цикл для совершения репарационных процессов, что в дальнейшем вызывает повреждение генетического аппарата клетки и злокачественную трансформацию

Нурмухаметова Е.В., 1996; Rebbeck T.R., 1997; Баранов B.C. и др., 2003; Loeb L. et al., 2003; Scian M.J., 2004).

Вышесказанное определяет актуальность изучения, в сопоставлении с клинико-морфологическими особенностями опухолевого процесса, частоты выявления онкогенных вирусов папилломы человека и комплексной оценки уровня антител к антигенам Эпштейна-Барр для установления их статуса при раке гортани.

Цель исследования. Изучить ассоциацию вирусов папилломы человека и Эпштейна-Барр с клинико-морфологическими показателями у больных раком и предопухолевыми заболеваниями гортани, определить диагностическую и прогностическую значимость изученных показателей.

Задачи исследования.

1. Изучить частоту ассоциации рака и предопухолевых заболеваний хронический гиперпластический ларингит, папилломатоз) гортани с онкогенными вирусами папилломы человека и Эпштейна-Барр.

2. Изучить взаимосвязь уровня антител к белкам литической инфекции ВЭБ с частотой синтеза латентного мембранного протеина (LMP-1) в опухолевых клетках больных раком гортани.

3. Оценить частоту делеции генов глутатион-Б-трансфераз GSTT1 и GSTM1 у больных раком и предопухолевыми заболеваниями гортани.

4. Изучить взаимосвязь вирусной инфекции с клинико-морфологическими особенностями рака гортани.

5. Определить факторы риска развития рака гортани.

Научная новизна. Проведено комплексное исследование частоты ассоциации онкогенных вирусов со злокачественными и предопухолевыми заболеваниями гортани. Показан 8,5-кратный риск развития рака гортани, ассоциирующий с инфицированностью эпителия гортани вирусом папилломы человека 6 типа.

Определена частота встречаемости делеции генов глутатион-S-трансфераз GSTT1 и GSTM1 у больных раком и предопухолевыми заболеваниями гортани. Установлен ассоциирующий с носительством делеции гена ОБТЫ 3- и 4-кратный риск развития РГ у больных предопухолевыми заболеваниями и РГ.

Проведен сравнительный анализ результатов определения латентного мембранного протеина (ЬМР-1) в опухолевых клетках больных РГ и иммунного ответа к антигенам литической инфекции ВЭБ. Показано, что в 87,5% случаев синтез ЬМР-1 сопровождается повышением уровня антител к антигенам литической инфекции ВЭБ.

Показано значимое увеличение частоты встречаемости высокого уровня ^О к вирусному капсидному антигену ВЭБ у больных РГ с ТЗ объемом опухоли. Выделены критерии формирования группы повышенного онкологического риска развития рака гортани.

Теоретическая и практическая значимость. Выявление опухолей гортани, ассоциированных с онкогенными вирусами папилломы человека и Эпштейна-Барр, может служить важной предпосылкой для углубленного изучения их этиопатогенеза, разработки новых подходов к ранней диагностике и прогнозированию клинического течения заболевания. Установленная ассоциация инфицированности эпителия гортани ВПЧ 6 типа и носительства делеции гена 08ТТ1 с РГ, свидетельствует о возможности использования изученных показателей в качестве дополнительных критериев формирования групп повышенного риска развития рака гортани.

Определение в опухолевых клетках больных раком гортани синтеза латентного мембранного протеина (ЬМР-1), сопровождающегося повышением уровня антител к антигенам литической инфекции ВЭБ может свидетельствовать о вкладе вирусной составляющей в процесс канцерогенеза гортани.

Выявленные факторы риска могут быть использованы в качестве дополнительного критерия при скрининге лиц с предопухолевыми заболеваниями. Результаты, полученные на модели одной из наиболее распространенных эпителиальных опухолей человека, будут способствовать более глубокому пониманию механизмов вирусного канцерогенеза.

Положения, выносимые на защиту:

1. Частота выявления и спектр папилломавирусной инфекции в группе больных раком гортани превышает данные показатели у пациентов предопухолевыми заболеваниями гортани и здоровых лиц.

2. Наличие в опухолевых клетках больных раком гортани маркера латентной инфекции вируса Эпштейна-Барр, мембранного протеина (LMP-1), сопряжено с повышением уровня антител к антигенам литической инфекции ВЭБ.

3. Носительство делеции GSTT1 гена повышает риск развития РГ. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на региональной конференции молодых ученых имени академика РАМН Н.В.Васильева "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии", Томск (2005, 2006, 2007); III Российской научной конференции с международным участием "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Новосибирск (2006); Российской научно-практической конференции с международным участием "Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи", Барнаул (2006, 2007); IV съезде онкологов и радиологов СНГ, Баку (2006); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Опухоли головы и шеи", Анапа (2006); VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней — 2007» Москва (2007).

Публикации. Основные результаты исследования опубликованы в 17 печатных работах, из них три - в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, выводов, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 34 рисунками и 15 таблицами. Библиографический указатель включает 262 источник, из них 74 отечественных и 188 зарубежных.

134 ВЫВОДЫ

1. Частота выявления вируса папилломы человека у больных раком гортани составила 20,4%, в 2,3 раза превышая таковой в группе больных предопухолевыми заболеваниями гортани и значимо различаясь с данным показателем в контрольной группе.

2. Диапазон типов вируса папилломы человека в опухолевой ткани зависел от стадии заболевания: на III стадии развития рака гортани зарегистрирован более широкий спектр типов вируса папилломы человека по сравнению с данным параметром у больных со II стадией.

3. В опухолевых клетках 42,4% больных раком гортани выявлен латентный мембранный протеин (ЬМР-1) вируса Эпштейна-Барр, синтез которого в 87,5% случаев сопровождается высокой активностью гуморального иммунного ответа на антигены литической инфекции вируса Эпштейна-Барр.

4. Показано значимое увеличение частоты встречаемости высокого уровня иммуноглобулина О к вирусному капсидному антигену вируса Эпштейна-Барр у больных раком гортани с ТЗ объемом опухоли по сравнению с величиной данного параметра у больных с Т1 и Т2 объемом.

5. К факторам риска развития рака гортани отнесены инфицирование эпителия гортани вирусом папилломы человека 6 типа, высокие уровни иммуноглобулина в к капсидному антигену вируса Эпштейна-Барр, носительство делеции С8ТТ1 гена, возраст больного.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рак гортани (РГ) составляет 65-70% среди злокачественных опухолей верхних дыхательных путей. В структуре общей заболеваемости злокачественными новообразованиями эта патология занимает 9-е место, что составляет 1,8-2%, а в структуре заболеваемости мужского населения — 4-е место (Пачес А.И., 2000; Мухамедов М.Р., 2005). При этом рак гортани наиболее часто, в 50-60% случаев поражает лиц трудоспособного возраста (40-59 лет), реже - лиц в возрасте старше 60 лет (20-30%) и наименее часто, в 15-28% случаев - до 40 лет (Бойков В.П., 1989; Morra В., 1987). Все вышеперечисленное указывает на необходимость тщательного изучения и серьезного переосмысления подходов к ранней диагностике данной патологии и скринингу лиц с предопухолевыми заболеваниями, которые составляют группу риска.

Многочисленные эпидемиологические исследования, проводимые в различных странах мира, убедительно показали, что основными этиологическими факторами риска развития РГ являются курение, употребление алкоголя, воздействие на слизистую оболочку респираторного тракта экзо- и эндогенных факторов и хронические заболевания (хронический гиперпластический ларингит - XTJI и папилломатоз - ПГ), частота которых составляет 9,7% и 0,4-90,0%, соответственно (Дайняк Л.Б., 1986; Чумаков Ф.И., 2002). Эти заболевания принято рассматривать в качестве облигатного предрака (IARC, 1988, 2002). Так, у лиц с ХГЛ, чья работа связана с воздействием на верхний респираторный тракт производственных канцерогенов, риск развития РГ в 3,5 раза превышает таковой у практически здоровых лиц, работающих в аналогичных условиях (Журба А.Н., 1988).

В последние годы в литературе все чаще встречаются сообщения о выявлении в опухолевой ткани больных предраком и раком гортани генетической информации онкогенных вирусов папилломы человека и Эпштейна-Барр (8.К. Е1-Мойу е! а1., 2003, Балукова О.В. и др., 2004). Однако, мы не встретили работ, в которых бы уделялось достаточно внимания роли вирусной составляющей в этиопатогенезе рака гортани, поэтому мы сочли целесообразным провести комплексную оценку вирусо-генетических параметров и изучить их ассоциацию с клинико-морфологическими характеристиками опухоли, а также диагностическую и прогностическую значимость изученных показателей.

В соответствие с поставленной целью было проведено комплексное обследование больных, проходивших в 2004-2007 гг. стационарное и амбулаторное лечение в ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН. В исследование включено 182 человека, из которых были сформированы группы больных раком и предопухолевыми заболеваниями гортани. Контрольную группу составили здоровые лица без морфологических изменений эпителия гортани, не предъявляющие жалоб по данной локализации в течение двух лет. Всем обследуемым методом ПЦР было проведено тестирование на наличие вирусов папилломы человека в эпителии гортани. Методом непрямой иммунофлюоресценции в сыворотке крови определены уровни антител к антигенам литической инфекции вируса Эпштейна-Барр. Кроме того, методом иммуногистохимии в опухолевой ткани больных РГ выявлялся латентного мембранного протеина (ЬМР-1) вируса Эпштейна-Барр.

Показано, что частота встречаемости вирусов папилломы человека в изученной популяции здоровых лиц составила 5,4%. Однако отмечено, что частота выявления низкоонкогенных ВПЧ 6 и 11 у здоровых лиц, приведенная в представленной работе (3,6%), оказалась ниже цитируемой в литературе, согласно которой, изученный показатель колеблется среди здоровых лиц от 23% до 36%. Среди них 19-25% оказываются носителями низкоонкогенных типов - ВПЧ 6 и 11 (ТЧипеэ Б.А., 1994), а 9% -высокоонкогенных ВПЧ 16 и 18 (1а1а1 Н. е1 а1., 1992; БгусПохузкл 1. е! а1., 1999). McKaiq Я. е1 а1. (1998) приводят еще более высокую частоту детекции вируса папилломы человека в слизистой оболочке гортани (60%), без уточнения типа выявленных вирусов.

Следует отметить, что все случаи инфицирования ВПЧ слизистой оболочки гортани здоровых лиц были отмечены нами лишь в возрастной группе 40-59 лет. Возможно, приводимые в литературе данные по высокому уровню инфицированности больных вирусом папилломы объясняются региональными особенностями данного показателя у здорового населения. Низкая частота инфицирования ВПЧ, показанная нами для больных ПЗГ, может быть обусловлена как низкой частотой инфицированности здорового населения региона, так и присутствием в обследуемой группе подавляющего большинства лиц с хроническим гиперпластическим ларингитом, среди которых случаи ВПЧ-ассоциированной формы данного заболевания, согласно литературным данным - достаточно редкое событие (R. McKaig, 1998; Пачес, 2004). Следует принять во внимание результаты корреляционного анализа, согласно которому между присутствием в мофологически неизмененной ткани гортани здоровых индивидуумов ВПЧ6 и 11 и эндоскопическим диагнозом выявлена средняя по силе связь (г=0,485; р=0,05), что позволяет предположить, что для здоровой популяции г. Томска уровень инфицированности слизистой оболочки гортани папилломавирусами, показанный в нашей работе, является нормой.

Учитывая, что почти 100% населения планеты инфицировано вирусом Эпштейна-Барр, но, тем не менее, механизм возникновения заболеваний, ассоциированных с этим вирусом, в том числе и онкологических, остается открытым, представляется целесообразным изучить особенности гуморального ответа к антигенам литической инфекции вируса Эпштейна-Барр у больных РГ и взаимосвязь изученных показателей с клинико-морфологическими параметрами и синтезом маркера латентной инфекции ВЭБ - мембранным антигеном LMP-I.

Показано, что у здоровых лиц, инфицированных вирусом папилломы человека, в 94,5% случаев были выявлены антитела класса G к к BKA вируса

Эпштейна-Барр, в то время, как антитела класса А к комплексу ранних антигенов в сыворотке крови у обследуемых лиц обнаружены не были. МогеЬес! К. (2003) при изучении сывороток, полученных от здоровых доноров, вообще не обнаружил антител к антигенам литической инфекции ВЭБ. Однако годом раньше этот же автором, изучая иммунный ответ организма на антигены литической инфекции ВЭБ в другой популяции здоровых лиц, у 88,8% обследованных выявил высокий уровень антител класса ^О к ВКА, сравнимый с таковым у 89,3% больных раком гортани, что может быть свидетельством реинфекции ВЭБ на момент забора крови Могшее! К., 2002).

Низкие значения антител к антигенам литической инфекции ВЭБ или отсутствие таковых в сыворотке крови у обследованных нами лиц контрольной группы могут свидетельствовать об отсутствии в этого типа организме литической инфекции, что, в свою очередь, может быть объяснено малым количеством курящих среди обследованных лиц, что приводит к отсутствию в слизистой оболочке гортани воспалительного процесса, который поддерживается постоянным термическим воздействием табачного дыма, что, в свою очередь, способствует инфицированию, создавая для этого благоприятный фон, в конечном результате приводя к ослаблению защитных резервов иммунной системы, чего мы не наблюдали у здоровых лиц. А факт отсутствия у лиц контрольной группы антител к антигенам литической инфекции ВЭБ даже при условии инфицирования слизистой оболочки гортани ВПЧ, может быть объяснен автономностью существования, различной тропностью или пермессивностью каждого из изученных вирусов.

Наряду с такими известными экзогенными факторами риска развития патологических процессов в гортани, как курение, воздействие токсических веществ и т. д., в последнее время немаловажная роль отводится эндогенным факторам, к которым принадлежит наличие делеции в генах ферментов детоксикации ксенбиотиков - ОБТИ и М1 (Zhong Б. е! а1., 1991; Ют е! а1., 2000; ВепЬатои Б. е! .а1., 2002). Частота делеции ОБТИ и М1 генов у изученных нами здоровых лиц составила 15% и 43%, соответственно, что несколько ниже популяционной для Северо-Западного региона Сибири (23,3%) (Попова С.Н., Сломинский П.А., 2002), в том числе и для г.г. Томска и Новосибирска (23,7%) (Брагина Е. Ю., 2005, Ляхович и др., 2000; Вавилин и др., 2002). Относительно высокая частота делеции М1 гена является нормой для популяции, поскольку до 56% здоровых лиц, согласно литературным данным, являются носителями данного структурного нарушения генома.

Таким образом, низкий уровень инфицирования ВПЧ слизистой оболочки гортани, низкие значения антител к антигенам литической инфекции вируса Эпштейна-Барр и низкая частота обнаружения делеции 08ТТ1 гена у здоровых лиц, показанные нами, могут свидетельствовать об относительно благоприятной экологической и эпидемиологической обстановке на территории Томской области.

Согласно литературным данным, такие патологические процессы гортани, как хронический гиперпластический ларингит и папилломатоз, на долю которых приходится до 70% и 100% заболеваний ЛОР-органов, соответственно, рассматриваются, на основании высокой частоты малигнизации, как предрак (Чирешкин Д.Г. и др., 1994; Гаращенко Т.И. и др., 1996; Нурмухамедов Р.Х., 1998; Василенко Ю.С. и др., 2000; Чумаков Ф.В. и др., 2002).

При обследовании группы больных с предопухолевой патологией гортани в 82,6% случаев был диагностирован хронический гиперпластический ларингит, в 21,1% случаев - папилломатоз. Общий уровень инфицированности ВПЧ у больных предраком гортани составил 8,7%. При этом, например, у больного С. с хроническим гиперпластическим ларингитом, гистологически верифицированным как гиперплазия, в морфологически неизмененной ткани гортани был обнаружен ВПЧ 31. В морфологически неизмененной ткани пациентки 3. с папилломатозом, на фоне которого развилась дисплазии II степени, обнаружена микст-инфекция

ВПЧ 6 и 11. У лиц контрольной группы, помимо перечисленных типов вируса в эпителии гортани был определен ВПЧ 33. Нами показано, что у лиц с предраком вирусом папилломы была инфицирована только морфологически неизмененная ткань. В литературе мы встретили, к сожалению, лишь единичные работы, посвященные изучению ассоциации ВПЧ-инфекции с хроническим гиперпластическим ларингитом, автор одной из которых привел частоту детекции вируса папилломы человека, которая составила 19% (Rihkanen Н., 1994).

Так же, как и ВПЧ-позитивные здоровые индивидуумы, ВПЧ(+) больные ХГЛ принадлежали к возрастной группе 40-59 лет. Причем, вовлеченным в процесс инфицирования оказался складочный отдел гортани, что подтверждается литературными данными относительно хронической формы патологии гортани (Хрусталева Е.В., 2005; Onami К., 1979).

Сопоставляя длительность заболевания с типом ВПЧ у больного с ХГЛ, инфицированного ВПЧ 31 было показано, что патологический процесс у этого пациента развивался в течение 6 лет. У пациентки, страдающей папилломатозом гортани, инфицированной ВПЧ 6, 11 длительность заболевания составила 4 года, с возникновением 6 рецидивов, по поводу которых получено хирургическое лечение. Полученные данные свидетельствуют об агрессивности течения папилломатоза, ассоциированного с ВПЧ 6 и 11 типов и относительно вялом развитии - при инфицированности ВПЧ 31 что находит подтверждение в литературных данных, согласно которым, папилломатоз, вызванный ВПЧ И протекает более агрессивно по сравнению с ВПЧ 6, в связи с чем у больных регистрируется менее длительные безрецидивные периоды, что влечет за собой увеличение частоты хиургических вмешательств (Зайцев B.C. и др., 2005; Rabah R. et al., 2004).

Нами отмечено, что лишь в 4,3% случаев папилломатоз гортани оказался ВПЧ-ассоциированным. У пациентки 3. с верифицированным ПГ вирус был обнаружен только в участке ткани с дисплазией, тогда как клетки самой папилломы инфицированы не были. Подобный случай описан К. Lin et al. (1997), которые у 58-летней пациентки с папилломатозом, на фоне тяжелой дисплазии, выявили ВПЧ 6 и 11 только в диспластически измененных клетках. При этом ВПЧ 11 активно реплицировался, а ВПЧ 16 -находился в интегрированной форме. Следует также отметить, что в морфологически неизмененных клетках слизистой оболочки гортани этой пациентки вирусов папилломы выявлено не было. Возникновение дисплазии в инфицированной ВПЧ 11 ткани Rady P.et al. (1998) объясняют интеграцией вирусного генетического материала в геном клетки, что в свою очередь, влечет за собой мутацию гена-онкосупрессора р53. Происходит промоция генетической нестабильности в клетке, что является причиной появления пула диспластических клеток с последующей малигнизацией. Авторы подчеркивают, что в доброкачественных опухолях ВПЧ11 находится как в эписомальной, так и в интегрированной форме, тогда как при переходе к злокачественному росту происходит либо селекция пула клеток, содержащих исключительно интегрированный генотип, либо тотальная интеграция вирусного генома во всех инфицированных клетках. P. Raidy (2004) также полагает, что в случае ВПЧ 11-ассоциированного папилломатоза гортани, вирусный геном интегрируется с последующей малигнизацией ткани. Свои предположения автор подкрепляет фактом выявления в опухолевых клетках трех из семи (48,3%) обследованных больных карциномой гортани интегрированной формы вирусной ДНК. Противником данного утверждения выступает S.Watts (1991), показавший, что 60% случаев карциномы области головы и шеи ассоциируют исключительно с эписомальной формой генома ВПЧ 6, 11, 16 и 18. Фактом интеграции можно объяснить и высокую частоту малигнизации папиллом, в клетках которых находят ВПЧ 6, 11, либо оба типа одновременно. P. Draganov et al. (2006) приводят убедительные данные, согласно которым у больных, в папилломах которых были выявлены ВПЧ 11, 6, или микст-инфекция ВПЧ 6+11, произошла малигнизация клеток с распространением процесса на ткань легких.

При изучении особенностей гуморального иммунного ответа к антигенам ВЭБ у больных с предопухолевой патологией гортани в сыворотке крови пациента с ХГЛ были обнаружены IgG к BKA и РА ВЭБ в высоких значениях (1:1280 и 1:80, соответственно), что объясняется хронизацией процесса и воздействием на слизистую оболочку гортани табачного дыма, который еще более усугубляет течение заболевания и способствует периодическому обострению инфекции. В сыворотке же крови больной ПГ были обнаружены низкие значения антител класса G к BKA, тогда как антитела к РА не определялись, что является свидетельством как разных пермиссивных систем, так и подтверждением разнонаправленности действия в отношении патогенеза вирусов папилломы человека и Эпштейна-Барр.

В патогенез онкологических заболеваний, являющихся мультифакториальными, вовлекается множество разных функционально взаимосвязанных генов, включающие, наряду с главными, второстепенные, т.е. гены-модификаторы, эффект которых во многом определяется средовыми факторами (Баранов B.C. и др., 2000; Колчанов H.A. и др., 2000). Исследованные нами гены GSTTI и GSTMI, как уже упоминалось, кодирую две различных формы глутатион-8-трансфераз — TI и MI, которые участвуют в биотрансформации ксенобиотиков. Так как данные ферменты являются важными составляющими системы детоксикации, гомозиготность по нулевому аллелю одного из генов может привести к высокой восприимчивости организма к вредным воздействиям, повышением канцерогенной нагрузки, и, следовательно, увеличением риска развития рака. Как показали результаты настоящего исследования, в группе больных предраком гортани выявлены делеции в генах GSTT1 и GSTM1 в 43,5% и 26,1% случаев, соответственно, при этом риск развития патологии ассоциировал с делецией гена GSTTI (OR=2,90; С195%=1,05-7,96). Следует отметить, что в группе больных с предраком частота нулевого генотипа GSTM1 (26,1%) практически соответствовала таковой (29,1%) в группе больных раком гортани, в 1,6 раз превышая аналогичный показатель в группе здоровых лиц. Указанные различия как между группами больных, так и при сравнении с лицами контрольной группы оказались незначимыми (р >0,05). При изучении частоты встречаемости сочетанных генотипов было показано, что для больных с предраком характерно наличие либо функционально полноценного (13%), либо функционально неполноценного, т. е. делегированного по двум генам (43,5%). Данный факт, возможно, свидетельствует об отсутствии существенного влияния делеции в изученных генах на патогенез предрака.

В ходе корреляционного анализа в группе больных с предраком, было показано наличие связи между ВПЧ 6 и 11, что, возможно, объясняется равновероятным и одновременным инфицированием слизистой гортани как 6, так и 11 типами ВПЧ, что, в свою очередь, может означать наиболее широкое распространение данных типов среди других представителей семейства Рароуаутёеа, тропных к эпителию гортани.

Таким образом, низкую частоту встречаемости ВПЧ, адекватный ответ со стороны гуморального звена системы иммунитета на литическую инфекцию вируса Эпштейна-Барр, но, наряду с этим, повышенную в три раза, по сравнению со здоровыми лицами, частоту обнаружения делеции гена в8ТТ1 и, как следствие, ассоциацию данного нарушения с повышенным риском развития заболевания, у больных с предраком, можно рассматривать как показатели отнесения данного контингента пациентов к группе повышенного риска развития злокачественной патологии гортани.

До определенного момента хронический процесс в слизистой оболочке гортани, будь то гиперпластическая форма ларингита или папилломатоз, протекают относительно спокойно и доброкачественно. Но при воздействии таких дополнительных факторов, как курение, наличие делеции в генах ОБТТ, ослабление Т-клеточного звена иммунной системы, инфицирование слизистой гортани папилломавирусами человека, может произойти малигнизация.

Нами показано, что максимальная частота встречаемости ВПЧ (20,4%) зарегистрирована у больных со II и III стадией злокачественного процесса гортани. При исследовании инфицирования прилежащей морфологически неизмененной ткани больных РГ вирусом папилломы человека более высокая частота встречаемости ВПЧ (32%) была зафиксирована у пациентов со II стадией процесса, тогда как у больных с III стадией этот показатель составил 27%. Уровень инфицированности ВПЧ опухолевой ткани этой группы больных несколько ниже: установлено наличие вируса папилломы человека у 18% больных с III стадией злокачественного процесса и 16% больных со II стадией. Спектр изученных типов ВПЧ был наиболее ярко представлен как в опухолевой (ВПЧ 6, 11, 31, 33, 16 и 18), так и в прилежащей к опухоли морфологически неизмененной ткани (ВПЧ6, 11,31 и 33) больных РГ с III стадией заболевания. Однако и у больных со II стадией был выявлен достаточно широкий спектр ВПЧ, за исключением 31, 33 и 16 типов вируса. Данные, полученные нами по частоте и спектру инфицированности опухолевой ткани больных раком гортани, нашли подтверждение и в литературных источниках. В отношении инфицированности прилежащей ткани у больных раком гортани, данных, к сожалению, недостаточно (А1тас1оп в. е1 а1., 1996; Уепий А. е1 а1., 2000). Тот факт, что именно в ткани больных с III стадией наиболее широко представлены изученные типы ВПЧ, можно объяснить либо с позиции изначально высокого уровня инфицированности среди больных с данной стадией рака, либо процессом аккумуляции (накопления) дополнительных (ВПЧ 31, 33, 16 и 18), возможно, играющих важную роль в процессе малигнизации эпителия гортани ВПЧ.

При анализе ассоциации степени дифференцировки опухоли с уровнем инфицированности ткани ВПЧ было показано, что максимальная частота встречаемости и спектр изученных типов были представлены у пациентов с умеренной степенью дифференцировки. Совпадение изученных вирусных параметров (частоты встречаемости и спектра изученных типов ВПЧ) у больных с III стадией умеренной степенью дифференцировки логично, поскольку у большинства больных с III стадией отмечена умеренная степень дифференцировки опухоли.

Закономерные, на наш взгляд, результаты были получены в отношении взаимосвязи длительности течения предшествующего раку хронического заболевания и представленных типов вируса папилломы человека. Так, максимальная частота детекции ВПЧ (60,8%) была показана для больных, заболевание которых разворачивалось в течение 05,-2 лет. Причем как в прилежащей, так и в опухолевой ткани этой группы больных были обнаружены только ВПЧ 6 и 11. Вполовину реже - 27,3% и 26,5%, соответственно, вирус папилломы человека был выявлен у больных с 0,5- и 5-10-летней продолжительностью течения заболевания. Однако в ткани этих больных наряду с ВПЧ 6 и 11 были также выявлен ВПЧ 31 - для больных с 0,5-летней и ВПЧ 16 и 18 - с 5-10-летней продолжительностью. Исходя из вышесказанного, можно предположить, что одновременное присутствие в ткани ВПЧ 6, 11 и 31 ассоциирует с более агрессивным течением патологического процесса в слизистой оболочке гортани, тогда как наличие ВПЧ 33, 16 и 18 (в комплексе с ВПЧ 6 и 11) выступают сдерживающим фактором и способствуют более вялому развитию процесса.

Принимая во внимание данные корреляционного анализа, согласно которому не показано ассоциации между присутствием в прилежащей к опухоли ткани ВПЧ 6 и 11, что может свидетельствовать о равновероятном инфицировании больного, но установлена связь между наличием в прилежащей ткани только ВПЧ 6 и присутствием в опухолевой ВПЧ 6, 11 и 16, можно предположить моноклональность опухоли в отношении ВПЧ 6. В то же время, в морфологическом отношении опухоль является гетерогенной структурой, в связи с чем мы можем предполагать моноклональность лишь отдельного пула клеток, произошедшего из изначально инфицированной ВПЧ 6 клетки. Выявленная относительно сильная корреляционная связь между присутствием ВПЧ 6,11 и ВПЧ 16, 18 в опухолевой ткани, означает, возможно, не только широкое распространение и обязательно совместное инфицирование именно данными представителями папилломавирусов (умеренно- и высокоонкогенными типами), но и обязательное их присутствие, а значит, и существенный вклад в канцерогенез гортани. Средняя по силе связь между присутствием в опухолевой ткани больных ВПЧ 6 и 16, 18, также может означать обязательное присутствие данных типов для инициации злокачественного заболевания. Высокую тропность ВПЧ 6, 11 типов к эпителию гортани и их высокую распространенность еще раз подтверждает корреляционный анализ, который установил наличие связи данных типов вируса, обнаруженных в опухолевой ткани, с курением, его стажем и количеством выкуриваемых сигарет, подтверждая, что при наличии вышеперечисленных условий, эпителий инфицируют именно ВПЧ 6 и 11 типов.

Изучая состояние гуморального иммунного ответа к антигенам ВЭБ у больных раком гортани, в сыворотке крови большинства обследованных пациентов мы обнаружили повышенные уровни антител к антигенам литической инфекции вируса. Причем, для большинства больных с III стадией определены антитела класса G к BKA в значении 1:320, что может быть расценено как свидетельство в недавнем прошлом наличия литической инфекции ВЭБ, либо начальной стадии иммунного ответа на реинфекцию. Возможно, данное значение IgG к BKA может выступать в роли прогностического для больных с III стадией рака гортани.

Согласно литературным данным, в опухолевых клетках больных раком области головы и шеи, с определенной долей вероятности, может экспрессироваться латентный мембранный белок (LMP-I) ВЭБ, который является маркером латентной инфекции, обладает онкогенными свойствами и ингибирует литическую инфекцию данного вируса (Baumforth К., 1999; Stuart Prince, 2003; Bar-Sela G, 2003). В нашем исследовании LMP-I был обнаружен у 42,4% больных РГ. При этом установлено, что с максимальной частотой (32,2%) данный белок экспрессируется в опухолевых клетках больных с умеренной степенью дифференцировки опухоли. Однако, одновременно с обнаружением в опухолевых клетках подавляющего большинства больных ЬМР-1, в сыворотке крови этих пациентов были определены и высокие уровни антител к антигенам литической инфекции ВЭБ, что противоречит литературным данным относительно ингибирования литической инфекции ВЭБ латентным мембранным белком. Тем не менее, можно попытаться объяснить полученные результаты. Повышенные уровни антител у обследованного контингента могут быть расценены как остаточное явление литической инфекции, в то время как синтез ЬМР-1 еще только запускается. Следовательно, можно предположить, что на более поздних стадиях онкогенеза можно будет наблюдать сочетание низких уровней антител и высокой частоты синтеза латентного мембранного протеина. Тем не менее, в результате корреляционного анализа показана сильная обратная связь(г=-0,694) между экспрессией ЬМР-1 и наличием антител класса О к РА ВЭБ, которая подтверждает литературные данные об ингибировании данным белком литической инфекции. Подобная связь (г=-0,587) была установлена также между частотой экспрессии ЬМР-1 и длительностью заболевания, указывая на начало синтеза белка в слизистой оболочке гортани на ранних этапах канцерогенеза. Вероятно, у лиц, с предраком гортани есть предрасположенность к инфекционным заболеваниям, так как слизистая, постоянно пребывающая в воспаленном состоянии, особенно при поддержании этого процесса такими факторами, как курение, переохлаждение, воздействие мелкодисперсной взвези, инфильтрируется лимфоцитами, которые, в свою очередь, являются пермиссивной системой для ВЭБ. Постоянный контакт инфицированной ВЭБ популяции лимфоцитов с очагом воспаления может привести к диссеминации вируса (при наличии литической инфекции) на слизистую оболочку гортани с последующим инфицированием эпителиальных клеток и возникновением латентной инфекции, сопровождающейся экспрессией ЬМР-1.

Для демонстрации отношения и вклада делеции генов ферментов детоксикации ксенобиотиков ОБТИ и 08ТМ1 в патогенез рака гортани, мы изучили частоту встречаемости данного структурного нарушения в группах больных.

Частота встречаемости делеции С8ТТ1 и С8ТМ1 генов среди больных раком гортани составила 58% и 29%, соответственно, превышая таковую для больных с предраком. Причем, так же как и у больных с предраком, риск развития заболевания ассоциировал (СЖ=3,88; С]95о/о 2,37-6,37) с делецией С8ТТ1 гена. Однако, для больных РГ характерным оказались сочетанные генотипы, одним из обязательных условий которых являлось наличие делеции в одном из изученных генов. Были выявлены статистически значимые различия по частоте встречаемости делетированного С8ТМ1 (р=0,0001), в возрастных группах 40-59 лет и 60-75 лет а также в отношении ассоциации данного параметра с полом больных (р=0,001), что еще раз подтверждает литературные данные относительно преобладания среди больных РГ лиц мужского пола в возрасте с 59-79 лет и старше. Статистически значимые результаты получены и в отношении курящих и некурящих больных-носителей делеции по М1 гену, указывая на возможный вклад вредной привычки совместно со структурным нарушением генома в патогенез рака гортани. Вместе с тем, в отношении стажа курения, количества между носителями делеции по этому гену показаны достоверные различия. Однако корреляционный анализ показал наличие связи между С8ТТ1 - курением (г=0,198; р=0,04) и количеством выкуриваемых сигарет (г=0,256; р=0,0001).

У ВПЧ-позитивных больных РГ, в генах которых выявлена делеция хотя бы в одном изученном гене, не наблюдалось одновременного наличия делеции в обоих генах, при этом делеция С8ТТ1 и в8ТМ1 генов зафиксирована в группе обследованных пациентов с одинаковой частотой, что может свидетельствовать о равновероятном вкладе обоих генов в развитие рака гортани.

Таким образом, показаны: высокий уровень инфицированности и широкий спектр изученных типов вируса папилломы человека в прилежащей и опухолевой ткани больных раком гортани; инфицирование ВПЧ большинства больных раком гортани с III стадией и умеренной степенью дифференцировки опухоли; преимущественное выявление ВПЧ 6 и 11 у больных раком гортани с коротким периодом предшествующего хронического заболевания; высокие значения (с преобладанием значения 1:320) антител класса в к вирусному капсидному и комплексу ранних антигенов вируса Эпштейна-Барр у больных с III стадией заболевания; статистически значимое повышение серопозитивных к антигенам литической инфекции ВЭБ случаев у больных раком гортани с ТЗ опухолью по сравнению с Т2 и XI; синтез маркера латентной инфекции ЬМР-1 ВЭБ в опухолевых клетках больных раком гортани, сочетающийся с синтезом антигенов литической инфекции ВЭБ; максимальная частота делеции гена фермента детоксикации ксенобиотиков в8ТТ1 и ассоциированный с ним повышенный риск развития РГ.

Изученные особенности экспрессии молекулярно-биологических маркеров онкогенных вирусов важны как для формирования групп повышенного риска по развитию опухолей гортани, так и для прогнозирования клинического течения заболевания. Тем не менее, принимая во внимание полученные в работе результаты, можно заключить, что вклад и значение вирусной составляющей в этиопатогенез рака гортани неоднозначны и, порой, противоречивы, что еще раз подтверждает сложность взаимоотношений между вирусом и организмом и требует дальнейшего изучения и осмысления.