Оценка информативности лабораторных показателей при хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр

Горейко, Татьяна Владимировна

Диссертации по медицине → Клиническая лабораторная диагностика

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Оценка информативности лабораторных показателей при хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Горейко, Татьяна Владимировна Санкт-Петербург 2011 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.03.10

Автореферат диссертации по медицине на тему Оценка информативности лабораторных показателей при хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр

ГОРЕЙКО Татьяна Владимировна

ОЦЕНКА ИНФОРМАТИВНОСТИ ЛАБОРАТОРНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ВИРУСОМ ЭПШТЕЙНА-БАРР

14.03.10- клиническая лабораторная диагностика 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

' 1 СЕН 2011

Санкт-Петербург -2011

4852564

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС России

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор КАЛИНИНА Наталия Михайловна доктор биологических наук ДРЫГИНА Лариса Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор РАХМАНОВА Аза Гасановна доктор медицинских наук профессор СЕРЕБРЯНАЯ Наталия Борисовна

Ведущая организация: ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации

Защита состоится «22» сентября 2011 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, Д. 4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС России.

Автореферат разослан «_» _2011г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Инфицированность вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ) регистрируется во всем мире и охватывает около 90% населения (Самарин Д.В., 2008; Carville A. et al., 2008; Sargsyan S.A. et al., 2010). Литературные данные последних лет свидетельствуют о патогенетической значимости ВЭБ не только для детей, но и для взрослых (Алексеев A.B., 2009; Бацков С.С., 2011). Наряду с известной ролью ВЭБ в качестве возбудителя инфекционного мононуклеоза (ИМ), лимфомы Беркитта и носоглоточной карциномы доказан его вклад в развитие аутоиммунной патологии и синдрома хронической усталости (Ершов Ф.И., 2006; Исаков В.А., 2006; Долгих Т.И., 2011).

Наиболее частым типичным и хорошо изученным еще в 70-е годы XX века проявлением первичной инфекции, вызванной ВЭБ (ИВЭБ), является ИМ, возникающий в 50% случаев при инфицировании в юношеском или во взрослом возрасте (Тимченко В.Н., 2001; Иванова В.В. и соавт., 2004; Самарин Д.В., 2008). В качестве единственных лабораторных критериев диагностики ИМ служили появление атипичных мононуклеаров в клиническом анализе крови и неспецифических гетерофильных антител в реакции Пауля-Буннеля (Straus S.E. et al.,1993).

Хроническая персистирующая инфекция, вызванная ВЭБ (ХИВЭБ), практически не исследована (Малашенкова И.К. и соавт., 2007; Павленко O.A. и соавт., 2009). Принято считать, что ХИВЭБ имеет выраженные клинические проявления только на фоне тяжелой депрессии иммунной системы, например, при иммуносупрессивной терапии, синдроме приобретенного иммунодефицита (Алексеев A.B., 2009). Однако в последние годы наметился рост клинических проявлений ХИВЭБ у пациентов без тяжелой иммунной патологии. Об этом свидетельствует увеличение уровня заболеваемости ХИВЭБ (Бошьян P.E., 2009). Подобная динамика определяется с одной стороны, развитием иммунодепрессии, обусловленной неблагоприятными факторами внешней и внутренней среды (Исаков В.А. и соавт., 2006; Rúan J.L. et al., 2004; Son S.W. et al., 2009), с другой стороны, появлением новых методов лабораторной диагностики ИВЭБ (Долгих Т.И., 2010; Siennicka J. et al., 2007). Несмотря на то, что настороженность врачей различного профиля в отношении ХИВЭБ повысилась, своевременная диагностика с дифференцировкой стадий вирусной инфекции проводится не всегда.

Это связано с тем, что клинические проявления ИВЭБ могут варьировать в зависимости от состояния иммунной системы, сочетанного вирусного инфицирования и других причин.

Открытым остается вопрос о том, можно ли рассматривать персистенцию ВЭБ в макроорганизме как форму своеобразного симбиоза, или она связана с индукцией иммунодефицитного состояния, механизмы которого продолжают изучать до настоящего времени. Отечественными и зарубежными учеными получены данные о ведущей роли иммунных механизмов в патогенезе ИВЭБ (Исаков В.А., 2006; Рей-оуа М. е1 а1., 2006; Но1тоу Т., 2008; виИеу. М.Ь е! а\., 2008; Bieging К.Т. е1 а1., 2009). Согласно современным представлениям, при ИВЭБ меняются параметры клеточного и гуморального иммунитета, динамика которых изучена только при острой форме инфекции. Практически отсутствуют данные по изменению показателей иммунной системы при латентной ИВЭБ, реактивации ХИВЭБ у взрослых.

Несмотря на появление новых лабораторных технологий, применяемых для установления ИВЭБ, до сих пор нет определенности в отношении диагностической ценности многих из них фепшска I. ^ а1., 2007). Методы иммуноферментного анализа (ИФА) и различные варианты иммуноблоттинга (ИБ), которые в настоящее время стали использоваться при серологическом исследовании, различаются по спектру определяемых антигенных белков ВЭБ. В настоящее время не накоплен достаточный отечественный опыт по применению ИБ в диагностике ИВЭБ и определении стадий течения инфекции.

Значительный рост атипичных форм ИВЭБ среди взрослого населения, разнонаправленность мнений о причинах их возникновения, ограниченность данных о взаимосвязи показателей гуморального и клеточного звеньев иммунного ответа при ХИВЭБ, неопределенности при выборе метода выявления ВЭБ-инфекции и сложности при интерпретации результатов лабораторных исследований указывают на актуальность темы и служат основанием для проведения данного исследования.

Цель исследования: выявить особенности специфического гуморального и клеточного иммунного ответа при хронической персистирующей инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр для совершенствования алгоритма клинико-лабораторной диагностики.

Задачи исследования:

1. Определить диагностическую значимость выявления специфических антител к антигенам вируса Эпштейна-Барр у пациентов с хронической персистирующей инфекцией для установления стадии инфекционного процесса при использовании различных серологических методов.

2. Охарактеризовать особенности Т-клеточного звена иммунной системы, цитокинового статуса у пациентов с хронической инфекцией, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

3. Провести сравнительный анализ параметров гуморального и клеточного иммунного ответа при хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

4. Выявить частоту сочетанной инфицированности герпесвирусами и охарактеризовать особенности параметров клеточного иммунитета.

5. Выделить группу наиболее информативных лабораторных показателей для диагностики хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

Научная новизна. С использованием новых лабораторных технологий впервые охарактеризован специфический гуморальный иммунный ответ при хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

Проведено определение параметров иммунной системы в отдаленные сроки после первичного инфицирования вирусом Эпштейна-Барр.

Установлена взаимосвязь параметров клеточного и гуморального иммунитета при различных фазах хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

Охарактеризованы спектры специфических антител к белкам вируса Эпштейна-Барр в соответствии со стадией инфекционного процесса различными методами.

Теоретическая и практическая значимость. Уточнен иммунопатогенез хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр. Описаны на новом методическом уровне атипичные стадии инфекции, обусловленной вирусом Эпштейна-Барр. Охарактеризованы взаимоотношения вирус-хозяин при персистенции вируса Эпштейна-Барр.

На основании проведенного исследования выделена группа наиболее информативных лабораторных показателей для повышения качества диагностики ХИВЭБ и прогнозирования возможных осложнений. Даны рекомендации для практикующих врачей о возможностях использования современного серологического метода иммуноблоггинга. Предложены алгоритмы выявления атипичных стадий течения инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

Обоснована необходимость комплексного исследования параметров Т- и В-клеточного иммунитета для определения различных вариантов течения хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Хроническая инфекция, вызванная вирусом Эпштейна-Барр, характеризуется тремя фенотипическими профилями гуморального иммунного ответа: наличием антител класса G к белкам VCA+NA в 71% случаев; VCA+NA+EA - 10%; VCA - 7%.

2. Метод иммуноблоттинга имеет более высокую диагностическую значимость при выявлении маркеров активации хронической ВЭБ-инфекции по сравнению с традиционными методами клинической лабораторной диагностики.

3. Наибольшую диагностическую значимость при определении стадии иммунного ответа при хронической персистирующей ВЭБ-ассоциированной инфекции имеет определение количества клеток CD3+, клеток с киллерным потенциалом - CD3+CD8+, CD3-CD(16+56)+, клеток, экспрессирующих HLA DR, В-лимфоцитов, продукция in vivo и in vitro IFN-a и IFN-y.

Личный вклад автора. Автором составлен дизайн исследования и проведен анализ результатов клинико-лабораторного обследования 345 больных с ХИВЭБ. Совместно со специалистами автор принимал участие в клиническом обследовании пациентов. В ходе выполнения работы проведен аналитический обзор современной отечественной и зарубежной литературы. Автором самостоятельно выполнены иммунохимические исследования, проведен статистический анализ полученных результатов, сделаны научные выводы.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - практическому здравоохранению» (25-26 февраля 2010 г., Москва); Всероссийском конгрессе «Лабораторные технологии при организации медицинской помощи» (27 мая 2010 г., Москва); юбилейной 10-й научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, посвященная 125-летию основания СПбМАПО «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2010» (22 апреля 2010 г., Санкт-Петербург); межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии - междисциплинарные проблемы» (27-30 сентября 2010 г., Санкт-Петербург); 11-й научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, СПбМАПО «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2011» (24 мая 2011 г., Санкт-Петербург); First European Joint Congress of EFCC and UEMS (13-16 October 2010, Lisbon, Portugal); 21st International Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 19th IFCC-EFCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 8th Annual Meeting of the German Society of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (15-19 May 2011, Berlin, Germany).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 3 - публикации в изданиях, определенных перечнем ВАК Минобразования и науки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 18 рисунками. Указатель литературы содержит 121 наименование, из которых 62 отечественные и 59 зарубежные.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для решения задач исследования была сформирована группа пациентов с ХИВЭБ из 345 человек, которые проходили обследование и лечение в клинике ВЦЭРМ с 2008 год по 2010 год.

Возраст обследованных пациентов находился в диапазоне от 22 до 69 лет (средний возраст 39,0 лет ±11,7 лет). Женщины составляли 57% («=197), мужчины -43% («=148).

В работу не включались лица с наличием симптомов острой ИВЭБ и атипичных лимфоцитов в крови, а также лица, имеющие сопутствующие аутоиммунные заболевания, клинические проявления и наличие лабораторных маркеров ВИЧ 1 и 2 типов, вирусных гепатитов, онкологических заболеваний, психические расстройства, больные после химио- или лучевой терапии.

Критериями отбора пациентов в группу ХИВЭБ являлось наличие жалоб: быстрая утомляемость, общая слабость, эмоциональная лабильность, депрессивные состояния, бессонница, головная боль, ознобы, дискомфорт в горле, боли в мышцах. При клиническом обследовании обращали внимание на увеличение лимфатических узлов, субфебрилитет, гиперемию зева. У некоторых больных имело место увеличение печени и селезенки (табл. 1).

Таблица 1

Клинические проявления у пациентов с ХИВЭБ

Клинические проявления Количество, абсолютное Количество, %

Астеновегетативный синдром 345 100

Поражения лимфоглоточного кольца 231 67

Периферическая лимфоаденопатия 162 47

Артралгия, миалгия, невралгия 131 38

Субфебрилитет 107 31

Гепатолиенальный синдром 41 12

Данные клинического обследования пациентов свидетельствовали о полиморфном и неспецифичном характере клинических проявлений, тем не менее, клинические проявления были стойкими.

В условиях клинической лаборатории пациентам проводилось:

■ определение специфических антител к белкам ВЭБ, вируса простого герпеса 1 и 2 типов (ВПГ1/2), цитомегаловируса (ЦМВ) методом ИФА;

■ определение молекулярных особенностей белков ВЭБ методом ИБ;

■ общий анализ крови;

■ определение субпопуляционного состава лимфоцитов;

■ определение содержания, спонтанной и индуцированной продукции интерферонов альфа (IFN-a) и гамма (IFN-y).

Для определения антител IgM к VC А р18, IgG к EBNA-1 р72 и ЕА р138 ВЭБ использовались коммерческие диагностические тест-системы «ВектоВЭБ-VCA-IgM», «ВектоВЭБ-NA-IgG» и «ВектоВЭБ-EA-IgG» производства ЗАО «ВЕКТОР-БЕСТ», Россия, IgG к VCA ВЭБ - «ДС-ИФА-АНТИ-ВЭБ-УСА-G» (ООО НПО «Диагностические системы», Россия). С помощью тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ВЭБ-VCA-G - АВИДНОСТБ» (ООО «НПО «Диагностические системы»», Россия) определялся индекс авидности IgG-VCA.

При проведении ИБ использовалась тест-система «Anti-EBV-Profile 2 EUROLINE (IgG)», разработанная фирмой «EUROIMMUN», Германия. В сыворотке крови одновременно выявлялись антитела IgG к пяти белковым антигенам ВЭБ с различной молекулярной массой: VC A gpl25 - нативный белок, VC А р19 - рекомбинантный белок, EBNA-1 - рекомбинантный, р22 - рекомбинантный белок, EA-D -рекомбинантный. Для выполнения процедур ИБ использовалась автоматизированная система ProfiBLOT 48 («TECAN Austria GmbH», Австрия). Результаты ИБ обрабатывались при помощи компьютерной программы EuroLineScun в полуколичественном выражении.

Антител IgM к белкам ВПГ 1/2 определялись методом ИФА на тест-системе «ВектоВПГ-IgM» (ЗАО «ВЕКТОР-БЕСТ», Россия), IgM и IgG к ЦМВ и IgG к ВПГ 1/2 - иммунохемшиоминесцентным методом на анализаторе Immulite 2000 («Siemens MSD», США).

Клинический анализ крови проводили с помощью гематологического анализатора Coulter LH500 («Beckman-Coulter», США).

Исследование клеточного звена иммунитета включало определение следующих субпопуляций лимфоцитов: CD3+ (Т-лимфоциты), CD3+CD( 16+56)+ (T-NK-клетки), CD4+ (Т-хелперы), CD3+CD8+ (Т-киллеры), CD4+CD8+ (дубль-позитивные Т-клетки), CD3-CD8+ (активированные NK-клетки), CD3-CD(16+56)+ (NK-

клетки), CD 19+ (В-лимфоциты), CD25+ (рецепторы к ИЛ-2), лимфоциты экспрессирующие HLADR, лимфоциты, экепрессирующие маркер готовности к апоптозу (CD95). Рассчитывался иммунорегуляторный индекс CD4/CD8. Иммунофенотипирование клеток периферической крови осуществляли в многоцветном анализе методом проточной цитометрии на Cytomics FC500 («Beckman-Coulter», США).

Из параметров цитокинового звена иммунитета определялись содержание в сыворотке, спонтанная и индуцированная продукция IFN-a (ООО «Протеиновый контур», Россия) и IFN-y (ООО «Цитокин», Россия) методом ИФА.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel 2007», «Statistica 6.0». Для проверки согласия с нормальным типом распределения использовали критерий Шапиро-Уилка W. Был использован метод описательной статистики с определением медианы показателей и интерквартильного размаха - [25; 75]. Для определения различий в двух группах использовали непараметрический U критерий Манна-Уитни. При сравнении нескольких групп проводился дисперсионный анализ Краскелла-Уоллиса и медианный тест, сравнение средних рангов для всех групп.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выявление специфических антител к антигенам вируса

Эпштейна-Барр методом иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга

Для подтверждения этиологии ВЭБ в возникновении симптомов заболевания у обследованных пациентов с подозрением на ХИВЭБ были использованы серологические методы исследования.

На первом этапе работы проведено полуколичественное определение продукции специфических IgG к капсидным (VCA), нуклеарным (NA) и ранним (ЕА) белкам ВЭБ в сыворотке пациентов (и=345) методом ИФА.

Обследование пациентов с ХИВЭБ не выявило антител класса М к капсидному белку VCA, что позволило исключить острую ВЭБ-инфекцию.

Частота определения антител IgG к VCA, NA и ЕА ВЭБ у обследованных пациентов представлены на рис. 1.

^50

•

■

I УН

! Ш

,..........

10*

^Л/СА

ЕВ1МА-1

ие-ЕА

* - различие с частотой выявления ^О к УСА и ЫА достоверно (р<0,001, Пирсон и хи-квадрат).

Рис. 1. Частота выявления ^С к антигенам ВЭБ у пациентов с ХИВЭБ методом ИФА.

Показано, что у обследованных пациентов чаще выявлялись антитела класса в направленных к УСА и ЫА, чем к ЕА (р<0,001), что подтверждало наличие хронической ВЭБ-инфекции.

У обследованных пациентов антитела к УСА выявлялись в 305 (88%) из 345 случае, а к ЫА ВЭБ - 320 (92%) из 345 пациентов с ХИВЭБ и были наиболее часто определяемыми серологическими маркерами.

Частота выявления ^О к раннему белку - ЕА, была достоверно ниже, чем к ЫА и к УСА и составляла 10% (я=36).

Характеристика фенотипических профилей специфичекого гуморального иммунного ответа при ХИВЭБ представлена в табл. 2.

Таблица 2

Частота выявления различных профилей специфического гуморального ответа при ХИВЭБ

Профили антител к антигенам ВЭБ Количество пациентов Количество пациентов, %

УСА+ЫА 245 71%

УСА+МА+ЕА 36 10%

УСА 25 7%

ЫА 39 12%

Показано, что у пациентов с ХИВЭБ достоверно чаще выявлялось сочетание антител класса G к VCA и NA (р<0,001), что являлось отражением хронической персистенции вируса.

У 10% (п=36) пациентов были определены антитела к VCA, NA и ЕА. Появление в сыворотке антител класса G к этим белкам отражало активацию хронического процесса.

«Изолированное» выявление IgG к VCA регистрировалось в 7% случаев (п=25). Оценка стадии инфекционного процесса у этих пациентов не могла быть однозначной и требовала дополнительных диагностических подходов, позволяющих определять антитела к пептидам gpl25, р22 и р19 VCA вируса.

В ходе исследования ни у одного из пациентов не было выявлено сочетание антител IgG к EA+VCA. Важно отметить, что данный профиль специфических антител ассоциирован с ВЭБ-связанными онкологическими заболеваниями (Gulley M.L. et al., 2008).

«Изолированное» выявление антител к NA в 12% можно интерпретировать как стадию перенесенного инфекционного процесса с «потерей» синтеза IgG к VCA (паст-инфекция) или элиминацию ВЭБ. Их определение имело ретроспективное значение.

Для установления или подтверждения инфекционного процесса с определением стадии жизненного цикла вируса у пациентов с наличием IgG к VCA при отсутствии IgG к NA был использован метод ИБ (и=25).

Среди пациентов с фенотипическим профилем специфического гуморального ответа VCA в 80% случаев выявлялись антитела IgG к VCA gpl25 при соотношении gpl25/p22>l, что свидетельствовало об обострении инфекции. Антитела IgG к VCA р19, маркера завершения обострения инфекционного процесса, были выявлены у 5 (20%) пациентов с ХИВЭБ.

Низкоавидные антитела IgG к VCA с индексом авидности меньше 60% были выявлены в 14% случаев (я=34) среди пациентов с профилем антител к VCA+NA, в 8% (п=3) с профилем антител к VCA+NA+EA. У пациентов с изолированным выявлением антител к VCA низкоавидные антитела не определялись. При использовании ИБ у всех пациентов с низким индексом авидности были обнаружены IgG к VCA р22 - маркеру давней ИВЭБ.

Для сравнения ИФА и ИБ из общей группы пациентов с ХИВЭБ методом случайно выборки были отобраны 80 человек (табл. 3).

Таблица 3

Сопоставимость методов ИФА и ИБ

Метод Серологический маркер Спектр вирусных белков Класс антител Результат

«+» «-»

ИФА ЕА р138 IgG 10 (12%) 70 (88%)

ИБ ЕА EA-D IgG 21 (26%) 59 (74%)

ИФА VCA р18 IgG 66 (83%) 14 (17%)

ИБ VCA gp 125 IgG 65 (81%) 15 (19%)

р19 IgG 66 (83%) 14 (17%)

р22 IgG 59 (74%) 21 (26%)

ИФА EBNA-1 р72 IgG 65 (81%) 15(19%)

ИБ EBNA-1 р79 IgG 61 (76%) 19 (24%)

Технология ИБ позволила установить наличие антител класса G к ранним белкам ВЭБ - EA-D у 21 пациента (26%). Таким образом, было показано, что диагностическая ценность выявления антител к ранним белкам ВЭБ методом ИБ в два раза выше, чем методом ИФА.

Представленные в табл. 3 данные указывают на сопоставимость методов ИФА и ИБ по выявлению антител класса G к VCA (83%). Преимущество метода ИБ заключалось в возможности выявления антител к вирусному капсидному антигену gpl25 - маркер обострения инфекции, и р22 - маркер давности инфекционного процесса.

Положительные результаты IgG к EBNA-1 в ИФА (81%) превалировали над результатами IgG к EBNA-1 в ИБ (76%), однако различия были не достоверные. Установленные вариации результатов ИФА и ИБ объяснялись различием используемых в исследовании рекомбинантных вирусных антигенов - р72 и р79 и давали возможность полагать, что антитела направленные к EBNA-1 р72 продуцируются чаще, чем к EBNA-1 р79.

Таким образом, показана дополнительная диагностическая значимость метода ИБ при выявлении у пациентов только IgG к VCA методом ИФА. Метод ИБ является более чувствительным при

реактивации ХИВЭБ. Использование индекса авидности IgG к VCA для определения давности инфекционного процесса не всегда является надежным. Альтернативой данному тесту может быть определение антител IgG к р22 вирусного белка УСА методом ИБ.

Характеристика показателей клеточного иммунного ответа пациентов с хронической инфекцией, вызванной вирусом Эпштейна-Барр

Для характеристики особенностей иммунного ответа при ХИВЭБ у 345 пациентов были проанализированы показатели иммунной системы.

Количество лейкоцитов в крови у более 80% пациентов с ХИВЭБ находилось в пределах референтного интервала. Абсолютный лимфоцитоз и моноцитоз наблюдался у 69 и 76 пациентов с ХИВЭБ, что составляло 20,3% и 22,0%, соответственно, от всей обследуемой группы.

Результаты исследования субпопуляционного состава лимфоцитов представлены на рис. 2.

804 60% 40% 20% 0%

ЛШ

н*

19%

иг%

<? / / У / / /

I Выше референтного интервала □Нижереференгного ингериала

Рис. 2. Особенности параметров клеточного иммунитета у пациентов с ХИВЭБ.

У 26% обследованных пациентов было повышено абсолютное содержание клеток CD3+. При подсчете относительного содержания CD3+ лимфоцитов, увеличение количества отмечалось у 46,9% пациентов. Медиана и интерквартильный размах показателя в группе с ХИВЭБ составляли (76,0 [71,0; 79,0])%, что превышало значения установленного референтного интервала. Таким образом, при исследовании показателя относительного и абсолютного содержания CD3+ лимфоцитов у каждого четвертого пациента отмечалось повышение числа Т-клеток, преимущественно за счет Т-хелперов (Th).

37% пациентов характеризовалось снижением числа Т-киллеров. В связи с этим у 55,4% пациентов с ХИВЭБ отношение лимфоцитов CD4/CD8 увеличивалось. Медиана данного показателя составляла 1,8 [1,3; 2,4]. Наблюдалось увеличение доли CD3+CD4+ (Th) и снижения доли CD3+CD8+(T-Karmepbi) за счет миграции в очаг воспаления.

Имело место увеличение абсолютного содержания «дубль»-позитивных Т-клеток (CD4+CD8+) у 50% лиц с ХИВЭБ. Повышенное количество незрелых «дубль»-позитивных Т-клеток могло быть обусловлено значимой вирусной нагрузкой и свидетельствовало о наличии аутоиммунного компонента в характере иммунного реагирования, последнее подтверждалось увеличением числа пациентов с повышенным индексом соотношения CD4/CD8.

Изменения субпопуляционного состава лимфоцитов в группе пациентов с ХИВЭБ также характеризовались тенденцией к уменьшению абсолютного и относительного содержания С03+С08+(Т-киллеры) и CD3-CD( 16+56)+ (NK-клетки). Снижение количества клеток с киллерной активностью в периферической крови свидетельствовало либо о недостаточности цитотоксической активности врожденного и адаптивного иммунного ответа, либо о миграции этих клеток в очаг воспаления, у одной трети пациентов с ХИВЭБ. При этом у 20% пациентов наблюдалось увеличение количества CD3+CD(16+56)+ клеток, так называемых TNK-клеток эффекторов, обладающих свойствами, как Т-лимфоцитов, так и NK-клеток и играющих регуляторную роль в воспалительных процессах, ограничивая интенсивность иммунного ответа, а также аутоагрессию (Ярилин A.A., 2010).

Увеличение количества клеток, экспрессирующих низкоаффинный рецептор к IL-2 - CD25 наблюдалось в 19,4% случаев, что указывало на активацию и пролиферацию клеток у 19,4% обследуемых пациентов.

При проведении корреляционного анализа была выявлена достоверная умеренная взаимосвязь абсолютного содержания клеток CD25+ с абсолютным содержанием клеток CD3+CD4+ (р<0,05; г,=0,37). Связь абсолютного содержания клеток с CD25+ с клетками CD3+CD8+ была слабая - rt=0,17. Выявленные достоверные положительные корреляции указывали на активацию преимущественно Th.

При анализе субпопуляций, экспрессирующих «поздние» маркеры активации, выявлено увеличение количества клеток CD95+ у 12% пациентов и увеличение клеток HLA DR+ у 9,2% пациентов.

Количество В-лимфоцитов было снижено у 27% обследованных пациентов, что отличало острую ВЭБ-инфекцию от хронической. Снижение числа В-лимфоцитов у одной третьи пациентов с ХИВЭБ можно объяснить следующими причинами. Во-первых, происходит дифференцировка в антигенспецифические плазматические клетки-продуценты специфических антител, во-вторых, процессы апоптоза В-лимфоцитов превалируют над пролиферацией, в-третьих, происходит накопление В-клеток в периферических органах иммунной системы - лимфоузлах, селезенке, лимфоидных скоплениях.

Характеристика цитокиновой системы включала оценку спонтанной, индуцированной продукций и содержания в сыворотке IFN-a и IFN-y.

Медиана показателей содержания в сыворотке IFN-a и медиана спонтанной продукции in vitro имела низкие значения, что указывало на отсутствие адекватного противовирусного ответа как in vivo (уровень в сыворотке), так и in vitro (клетки не были преактивированы в организме хозяина имеющейся ИВЭБ). Низкий уровень индуцированной продукции IFN-a свидетельствовал о снижении функциональной способности клеток отвечать на антигенный стимул.

Анализ показателей IFN-y выявил, что у 71% пациентов с ХИВЭБ спонтанная продукция IFN-y и у 51% пациентов содержание в сыворотке IFN-y превышали референтные значения, отражая высокую функциональную активность Thl. Наблюдалась положительная корреляция (р<0,05; гт=0,35) содержания в сыворотке и спонтанной продукции IFN-y и числом Т-киллеров, что свидетельствует об активации адаптивного иммунного ответа.

Таким образом, при обследовании пациентов с ХИВЭБ было установлено, что преобладал Thl тип иммунного ответа, о чем

свидетельствовали увеличение количества клеток CD3+CD4+ и высокая способность лейкоцитов к продукции IFN-y. Вместе с тем, у пациентов с ХИВЭБ наблюдалось снижение количества клеток с киллерной активностью в периферической крови: CD3+CD8+ и CD3-CD( 16+56)+.

Анализ показателей IFN-a выявил, что у всех пациентов с ХИВЭБ резкое снижение уровня сывороточного IFN-a сочеталось с существенным понижением индуцированной продукции IFN-a лейкоцитами, что указывало на депрессию этого звена иммунной защиты, а также являлось показанием для назначения терапии препаратами IFN-a.

Взаимосвязь показателей специфического гуморального и клеточного иммунитета у пациентов с хронической инфекцией, вызванной вирусом Эпштсйна-Барр

На основании лабораторных данных пациенты с ХИВЭБ были разделены на группы.

Первую группу составили пациенты с хронической персистирующей инфекцией, вызванной ВЭБ («=245), которые характеризовались наличием антител класса G к VCA и NA.

Вторую группу составили пациенты с реактивацией ХИВЭБ («=20). У этих пациентов с помощью метода ИБ были определены антитела IgG к VCA gpl25 и VCA р22.

Третью группу (и=39) составляли пациенты с паст-инфекцией, у которых были выявлены только IgG к NA.

Пациенты с реактивацией ХИВЭБ и наличием антител IgG к VCA, NA и ЕА составили четвертую группу (и=36).

При сравнении показателей клеточного иммунитета в четырех группах пациентов с ХИВЭБ, значения медиан относительного и абсолютного содержания моноцитов и лимфоцитов крови не имели достоверных различий. Пациенты второй группы, с обострением ХИВЭБ, характеризовались тенденцией к относительному лимфоцитозу, а значение медианы составило (38 [29; 46]) %.

Результаты исследования субпопуляционного состава лимфоцитов представлены в табл. 4.

Таблица 4

Показатели клеточного звена иммунной системы (медиана [нижний квартиль; верхний квартиль]) _

Показатель 1-я группа (п=245) 2-я группа (п=24) 3-я группа (п=39) 4-я группа (п=36) Референтный интервал

СОЗ+, в мкл. 1500 [1210; 17561 2060* [1704; 2333] 1594 [1329; 1951] 1234 [1090; 16541 950-И 800

СЭЗ+, % 77 [71; 82] 76[72; 781 77 [73; 79] 75 [69; 79] 52-76

СБЗ+СО(16+56)+, в мкл. 73 [45; 1621 108 [58;166] 85 [62; 1991 59 [40; 1411 5-200

СБЗ+СО(16+56)+, % 4,3 [2,3; 8,21 3,6 [2,5; 5,31 3,9 [2,7; 6,9] 3,8 [1,4; 4,71 0,1-8,0

СБЗ+С04+, в мкл. 902 [752; 1064] 1339 [693; 15771 939 [878; 1039] 781 [714;1244] 570-1100

С03+С04+, % 47 [39; 531 47 [41; 511 43 [41; 531 48 [46; 511 31-46

СОЗ+СБ8+ (Т-киллеры), в мкл. 485 [383; 677] 682 [554; 8321 669 [437; 823] 356* [300; 4841 450-850

СОЗ+СБ8+,% 25 [21; 311 24 [23; 37] 26 [20; 35] 23 [18; 27] 23,0-40,0

СБ4+СБ8+, в мкл. 17 Г9; 331 16 [9; 31] 12 [7; 241 3* Г2~81 5-18

С04+С08+, % 0,8 [0,5; 1,51 0,7 [0,3; 2,3] 0,4 [0,4; 1,2] 0,2* [0,1; 0,51 0,1-1,1

СОЗ-СОБ+, в мкл. 81 [45; 110] 105 [67;135] 72 [48; 77] 75 [46;141] 18-150

С03-С08+, % 4,2 [2,4; 6,6] 3,8 Г2,4; 5,91 2,7 [2,4; 3,91 4,3 Г2,8; 6,61 1,5-6,0

Соотношение В4/С08 1,9 [1,3; 2,4] 2,0 [1,0; 2,2] 1,7 [1,2; 2,6] 2,2 [1,6; 2,9] 1,0-1,7

С03-(С016+56)+, в мкл. 171" И15; 3031 370 [228; 594] 289 [245; 329] 174" [127; 2551 180-420

СОЗ-СВ(16+56)+, % 8" Г6; 141 15 [12; 17] 14 [10; 181 9" Г8; 14] 9-19

*- значимое отличие от остальных групп (р<0,050; дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса и медианный тест);

- значимое отличие от 2-й и 3-й групп (р<0,050; непараметрический и критерий Манна-Уитни).

Наиболее многочисленная первая группа пациентов с ХИВЭБ, характеризовалась достоверным снижением относительного и абсолютного количества ЫК-клеток (СОЗ-СБ16+56+), которые определяют эффективность противовирусного ответа.

У пациентов с обострением ХИВЭБ (вторая группа) отмечалось достоверное увеличение абсолютного числа CD3+ лимфоцитов, что связано, по всей вероятности, с активностью процессов пролиферации антигенспецифичных Т-клеток.

Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов у пациентов с паст-инфекцией (третья группа) выявила, что исследуемые показатели не выходили за пределы референтных значений. Этот факт являлся подтверждением, что NA, стимулировал выработку специфических антител, являющихся диагностическими маркерами паст-инфекции.

Четвертая группа пациентов с реактивацией ХИВЭБ характеризовалась сниженным количеством в периферической крови Т-киллеров и NK-клеток, что указывало на подавление противовирусного ответа.

Анализ количества В-лимфоцитов, которым конституционно присуща экспрессия HLADR, выявил разницу более чем в 5% между количеством клеток HLADR+ и содержанием В-лимфоцитов во всех группах пациентов с ХИВЭБ. Можно предположить, что маркеры поздней активации HLADR экспрессировались Т-лимфоцитами, что указывало на активацию в Т-клеточном звене. В большей степени активация наблюдалась у пациентов с реактивацией ХИВЭБ (VCA+NA+EA).

Сравнительный анализ показателей продукции IFN-a (табл. 13) выявил, что содержание в сыворотке и спонтанная продукция имели достоверно сниженные значения в первой группе пациентов с ХИВЭБ. Выявленное достоверное снижение количества NK-клеток в периферической крови пациентов с хронической персистирующей инфекцией совместно с достоверно низкими показателями продукции IFN-a in vivo и in vitro указывает на низкую противовирусную активность клеток иммунной системы. При реактивации ХИВЭБ в четвертой группе пациентов эти показатели были достоверно выше, чем в остальных группах, но не превышали референтных интервалов. Это указывало на отсутствие адекватной активации клеток ВЭБ. Не обнаружено достоверных различий между величинами индуцированной продукции IFN-a у пациентов с различными фазами ХИВЭБ, а средние показатели не превышали нижнюю границу референтного интервала (табл. 5).

Таблица 5

Характеристика показателей системы интерферонов у пациентов с ХИВЭБ _(медиана [нижний квартиль; верхний квартиль])_

Группа IFN-a IFN-y

Содержание в сыворотке (0-50) Продукция Содержание в сыворотке (0-50) Продукция

спонтанная (0-50) индуцированная (100-500) спонтанная (30-50) индуцированная (1000-5000)

пг/мл пг/мл

1-я 2 [2;3] 2* Г2;71 90 [50; 1481 54 [31; 120] 66 [34;128] 534 [335; 956]

2-я 4 ГЗ; 111 2 [2; 111 101 [56; 161] 58 [46; 1061 279* [201;382] 799 [760; 10411

3-я 7 [8; 22] 7[2;26] 84 [50; 159] 42 Г27; 113] 143 [41;280] 554 [319; 9741

4-я 16* [4; 321 20* [6; 501 58 [26; 120] 57 [47; 302] 91 [57; 1501 703 [416; 1079]

*- значимое отличие от остальных групп (¿><0,005; непараметрический U критерий Манна-Уитни)

Во второй группе пациентов с обострением ХИВЭБ выявлено достоверное увеличение спонтанной продукции IFN-y, что сочеталось с увеличением числа Т-клеток. В связи с длительностью вирусной инфекции клетки, продуцирующие IFN-y к моменту обследования были функционально истощены, и при их исследовании in vitro отмечалось снижение индуцированной продукции у 75% пациентов. В других группах продолжался вялотекущий с низкой иммуногенной активностью процесс, отражением которого явилось достоверное увеличение спонтанной продукции IFN-y, но не столь значительное, как во второй группе пациентов с ХИВЭБ, что характерно для хронической инфекции.

Выявлялась сильная взаимосвязь между относительным количеством клеток CD3+CD16+CD56+ и спонтанной продукцией IFN-y у пациентов третьей группы, что позволило предположить, что именно TNK-клетки вносят вклад в увеличение продукции IFN-y (rx=0,87; р< 0,05). Известно, что TNK-клетки выполняют регуляторную функцию, являясь основными продуцентами IFN-y. Активация этих клеток свидетельствует о том, что при латентной вирусной инфекции (третья группа пациентов) снижение числа NK-клеток сопровождается подключением «резервного» звена противовирусной защиты.

В четвертой группе пациентов с ХИВЭБ определялась положительная корреляция между показателями продукции интерферонов и количеством клеток их продуцирующих. Выявленные статистически значимые корреляции отражали активацию моноцитов и клеток с киллерным потенциалом.

Влияние микстинфицирования герпесвирусами па показатели иммунного ответа

У пациентов с ХИВЭБ в 83% (п=286') были обнаружены антитела 1^0 к антигенам вируса простого герпеса 1 и 2 типа (ВПГ 1/2) и цитомегаловируса (ЦМВ), что свидетельствовало о частой ассоциации вирусов семейства НегрезуМае.

Специфические антитела 1§М к антигенам ЦМВ и ВПГ 1/2 выявлены не были, что позволило исключить активное течение вирусной инфекции у пациентов.

Сочетание антител класса 1§0 к ВЭБ и ВПГ 1/2 встречалось в 9%, сочетание антител класса к ВЭБ и ЦМВ - 6%.

Моноинфекция, обусловленная ВЭБ встречалась крайне редко, была установлена у пяти человек (2%) молодого возраста (от 25 до 32 лет).

Была выявлена положительная корреляция уровня антител герпесвирусов (сумма индексов позитивности) от возраста (р=0,05; гт=0,37). Таким образом, возраст являлся предрасполагающим фактором формирования микстформ герпесных инфекций.

При проведении анализа изменения параметров клеточного звена иммунной системы при сочетанном инфицировании ВЭБ с ЦМВ и/или ВПГ 1/2 выявлено достоверное снижение относительного содержания лимфоцитов в группе пациентов с ХИВЭБ и наличием серологических маркеров ЦМВ относительно групп пациентов с наличием антител к ВПГ 1/2.

У пациентов с ХИВЭБ при наличии к ЦМВ количество лимфоцитов составило (22,5 [19,5; 26,5]) % и не выходило за пределы референтного интервала - 19^-37 %.

Полученные данные указывают на тенденцию к относительному лимфоцитозу среди пациентов с серологическими маркерами ВПГ 1/2 типов. У 30% обследованных пациентов с ХИВЭБ и наличием серологических маркеров ВПГ 1/2 был выявлен относительный лимфоцитоз, что указывает на активное влияние ВПГ 1/2 на иммунную систему (рис. 3).

* - различия достоверны при р<0,05

Рис. 3. Относительное содержание лимфоцитов у пациентов с

микст инфекцией

Результаты исследований не показали взаимосвязи между наличием микстинфекции и субпопуляционным составом лимфоцитов.

Содержание в сыворотке крови и спонтанная продукция ШЫ-а не превышали 50 мг/мл, и достоверно не различались у пациентов с различными формами герпесной микстифекции.

Индуцированная продукция №N-0 в группе пациентов с наличием антител к трем герпесвирусам составляла (86 [50; 198]) пг/мл и была больше, чем при герпесном микстинфицировании, обусловленном двумя вирусами: ВЭБ и ЦМВ - (17 [14; 157]) пг/мл; ВЭБ и ВПГ - (63 [2; 198]) пг/мл, однако достоверных различий не выявлено.

При оценке уровня №N-7 у пациентов с микстинфекцией были выявлены достоверные различия показателей спонтанной продукции 1РМ-у. Спонтанная продукция ШИ-у, отражающая преактивацию мононуклеаров персистирующими вирусами, при наличии антител к трем герпесвирусам составила (76 [37; 159]) пг/мл и была выше установленного референтного интервала.

У пациентов с ХИВЭБ в сочетании с антителами к ЦМВ или ВПГ 1/2 эта преактивация была незначительной и не проявлялась повышением спонтанной продукции №N-7.

У пациентов с ХИВЭБ и наличием антител к ЦМВ отмечались наименьшие показатели индуцированной продукции №N-7 - (374 [247; 385]) пг/мл (р<0,05).

Таким образом, на основании проведенных исследований охарактеризованы механизмы иммунной защиты у пациентов при различных фазах ХИВЭБ и выделена группа наиболее информативных лабораторных показателей, которые вошли в алгоритм диагностики ВЭБ-инфекции (рис. 4).

Острая инфекция

1 -1-- ■ ■;

Профиль Профиль Профиль

УСА М+УСА

Паст-инфекция

Низкий риск развития осложнений связанных с ВЭБ-инфекцией

р22 давняя инфекция

ИБ

р19 завершение обострения

др125 обострение

ИФА или ИБ ЕА_

Назначение специфической терапии

Мониторинг иммунологических показателей

СОЗ+

CD3-CD.i16+56)+ С03+С08+ С03+С04+

Рис. 4. Алгоритм лабораторной диагностики ВЭБ-инфекции.

выводы

1. У пациентов с хронической ВЭБ-инфекцией достоверно чаще выявляются антитела класса IgG к нуклеарным EBNA-1 и капсидным белкам VCA (92% и 88%, соответственно); а антитела IgG к ранним антигенам ЕА - в 10% случаев. Специфический гуморальный иммунный ответ на хроническую ВЭБ-инфекцию в 71% случаев представлен VCA+EBNA-1; 12% - EBNA-1; 10% - VCA+EBNA-1+ЕА; 7% - VCA.

2. Использование метода иммуноблоттинга позволило в два раза чаще выявлять антитела к ранним антигенам, по сравнению с традиционным методом ИФА, при этом частота обнаружения ядерных и капсидных белков разными методами анализа была сопоставимой.

3. Методом иммуноблоттинга среди пациентов с профилем антител класса G к VCA в 80% случаев была установлена активация хронической ВЭБ-инфекции, которая характеризовалась наличием антител IgG к gpl25 и соотношением gpl25/p22>l.

4. Особенностью хронической персистирующей инфекции, характеризующейся специфическим гуморальным иммунным ответом, представленным антителами IgG к VCA+NA, является уменьшение абсолютного и относительного содержания NK-клеток и выраженное снижение продукции IFN-a, имеющие значение для определения тактики иммунотерапии.

5. При обострении хронической ВЭБ-инфекции, когда соотношение вирусных белков VCA gpl25/p22>l, наблюдается активация Т-клеточного звена, проявляющаяся в увеличении абсолютного количества зрелых Т-лимфоцитов и спонтанной продукции IFN-y.

6. Реактивация хронической ВЭБ-ассоциированной инфекции, которая характеризуется наличием антител класса G к VCA+NA+EA, отличается достоверным снижением в периферической крови клеток с киллерной активностью - CD3+CD8+ и CD3-CD(16+56)+.

7. Частота распространения IgG к ВПГ 1/2 и ЦМВ среди пациентов с хронической инфекцией, обусловленной вирусом Эпштейна-Барр составляет 98% и увеличивается с возрастом. При хронической микстинфекции, вызванной ВЭБ и ЦМВ отмечается значительное снижение индуцированной продукции IFN-y.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для получения полноценной информации при клинико-лабораторной диагностике и дифференцировке стадий ХИВЭБ рекомендуется применять следующие подходы:

- на этапе определения наличия инфицирования ВЭБ использовать чувствительные методики (определение 1§0 к УСА и ^О к ЕВИА-1 методом ИФА);

- на этапе дифференцировки стадий ХИВЭБ использовать наиболее специфичные методики к отдельным антигенам ВЭБ методом ИБ).

2. Использование показателей в комбинации (содержание в сыворотке, спонтанная продукция, индуцированная продукция) позволяет оценить напряженность системы интерферонов при ХИВЭБ.

3. На основании выявленных особенностей показателей специфического гуморального и клеточного иммунного ответа при ХИВЭБ, с учетом взаимосвязи различных звеньев иммунитета, а также возможностью использования метода ИБ были выделены наиболее информативные лабораторные показатели, которые вошли в алгоритм диагностики и дифференцировки стадий ХИВЭБ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных изданиях по перечню ВАК Минобрнауки РФ

1. Горейко Т.В. Использование метода иммуноблотинга в диагностике хронической инфекции вируса Эпштейна-Барр / Т.В. Горейко, Л.Б. Дрыгина // Мед.-биол. и соц.-психол. пробл. безопасности в чрезв. ситуациях. - 2010. - №3. - С. 58-61.

2. Горейко Т.В. Комплексное изучение показателей специфического иммунного ответа и интерферонового статуса у пациентов с длительным субфебрилитетом, обусловленным вирус Эпштейна-Барр инфекцией / Т.В. Горейко, Л.Б. Дрыгина // Российский аллергологический журнал. - 2010. - №1, вып.1. — С 5152.

3. Горейко Т.В. Роль цитокинов в патогенезе хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр / Т.В. Горейко, Н.М. Калинина, Л.Б. Дрыгина // Цитокины и воспаление -2011. - №4 - С. 50-54.

Статьи, тезисы докладов и статей

4. Горейко Т.В. Оценка информативности метода иммуноблотинга в диагностике вируса Эпштейна-Барр инфекции // Т.В. Горейко, Л.Б. Дрыгина // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: сборник тезисов юбилейной научно-практической конференции молодых ученых 22.04.2010 г. - Санкт-Петербург: СПбМАПО, 2010. - С. 203-204.

5. Горейко Т.В. Возможности диагностики инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр / Т.В. Горейко, Л.Б. Дрыгина // Лаборатория. -№ 2.-2010.-С. 29.

6. Горейко Т.В. Современные представления об иммунопатогенезе инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр // Т.В. Горейко, Н.М. Калинина, Л.Б. Дрыгина // Инфекция и иммунитет. - Т.1, №2. - 2011. -С. 121-130.

7. Горейко Т.В. Влияние структуры герпес-вирусного микстинфицирования на показатели иммунного ответа / Т.В. Горейко, Л.Б. Дрыгина // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: сборник тезисов научно-практической конференции молодых ученых 24.05.2011 г. - Санкт-Петербург: СПбМАПО, 2011. - С. 27-29.

8. Goreyko T.V. Interrelation between the cellular and specific humoral immune response in patients with a chronic Epstein-Barr virus infection / T.V. Goreyko, L.B. Drygina // Abstract of First European Joint Congress of EFCC and UEMS «Laboratory Medicine in Health Care», 13-16 October 2010, Lisbon, Portugal. -P. 50.

9. Goreyko T.V. Chronic Epstein-Barr Virus infection in association with Herpes Simplex Virus types 1 and 2, Human Cytomagalovirus / T.V. Goreyko, L.B. Drygina // Abstract of 21st International Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 19th IFCC-EFCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 8th Annual Meeting of the German Society of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 15-19 May 2011, Berlin, Germany. - P. 522.

Подписано в печать 03.08.11 Формат 60х84'/16 Цифровая Печ. л. 1.0 Уч.-изд. л. 1.0 Тираж 100 Заказ 02/08 печать

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 8)

Оглавление диссертации Горейко, Татьяна Владимировна :: 2011 :: Санкт-Петербург

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ОБ ЭТИОЛОГИИ, ИММУНОПАТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЯХ И ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ВИРУСОМ ЭПШТЕЙНА-БАРР.

1.1. Этиология и патогенез инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

1.2. Динамика развития иммунного ответа при инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

1.3. ВЭБ-ассоциированные заболевания и их терапия.

1.4. Современные методы и стратегия диагностики инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Общая характеристика обследованных групп пациентов.

2.2. Клиническая характеристика обследуемых групп пациентов.

2.3. Лабораторные методы исследования.

2.3.1. Серологические методы исследования.

2.3.2. Определение показателей клеточного иммунитета и интерферонового статуса.

2.4. Статистические методы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Выявление специфических антител к антигенам вируса Эпштейна-Барр методом иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга.:.

3.2. Характеристика показателей клеточного иммунного ответа у пациентов с хронической инфекцией, обусловленной вирусом Эпштейна-Барр.

3.3. Взаимосвязь показателей специфического гуморального и клеточного иммунитета у пациентов с хронической инфекцией, вызванной вирусом

Эпштейна-Барр.

3.4. Влияние микстинфицирования герпесвирусами на показатели иммунного ответа.

Введение диссертации по теме "Клиническая лабораторная диагностика", Горейко, Татьяна Владимировна, автореферат

Актуальность исследования. Инфицированность вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ) регистрируется во всем мире и охватывает около 90% населения (Самарин Д.В., 2008; Carville А. et al., 2008; Sargsyan S.A. et al., 2010). Заражение происходит в любом возрасте, но преимущественно — в детском и молодом возрасте. Известны случаи врожденной инфекции, вызванной ВЭБ (ИВЭБ), подтвержденной методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА). Новорожденные становятся восприимчивыми к ВЭБ после исчезновения естественного пассивного иммунитета. Около 50% детей заражаются в возрасте до 5 лет, у большинства из них болезнь протекает в субклинической форме, а симптомы зачастую имеют неспецифический характер и не отличаются от прочих детских инфекций (Симованьян Э.Н. и соавт., 2006; Павленко O.A. и соавт., 2009).

Наиболее частым типичным проявлением первичной ИВЭБ является инфекционный мононуклеоз (ИМ), возникающий в 50% случаев при инфицировании в юношеском или во взрослом возрасте (Тимченко В.Н., 2001; Иванова В.В. и соавт., 2004; Самарин Д.В., 2008). Активное изучение ВЭБ, как этиологического фактора ИМ, проводилось в 70-е годы XX века. В качестве единственных лабораторных критериев ИМ служили: появление атипичных мононуклеаров в клиническом анализе крови (наиболее специфичный показатель); выявление неспецифических гетерофильных антител в реакции Пауля-Буннеля (Straus S.E. et al.,1993). Таким образом, к настоящему времени хорошо изучена только одна из форм ИВЭБ - инфекционный мононуклеоз.

Хроническая инфекция, обусловленная ВЭБ (ХИВЭБ) практически не исследована (Малашенкова И.К. и соавт., 2007; Павленко O.A. и соавт., 2009). Принято считать, что ХИВЭБ имеет выраженные клинические проявления только на фоне тяжелой депрессии иммунной системы, например, при иммуносупрессивной терапии, синдроме приобретенного иммунодефицита

Алексеев А.В., 2009). Однако в последние годы наметился рост клинических проявлений ХИВЭБ у пациентов без тяжелой иммунной патологии. Об этом свидетельствует увеличение уровня заболеваемости ХИВЭБ. Так в России за последние 10 лет отмечается рост заболеваемости ИВЭБ в два раза (с 6,8 в 2000 году до 12,1 на 100 тысяч населения в 2008 году) (Бошьян Р.Е., 2009). Подобная динамика определяется с одной стороны развитием иммунодепрессии, обусловленной неблагоприятными факторами внешней и внутренней среды (Исаков В.А. и соавт., 2006; Ruan J.L. et al., 2004; Son S.W. et al., 2009), с другой стороны, появлением новых методов лабораторной диагностики ИВЭБ (Долгих Т.И., 2010; Siennicka. J. et al., 2007). Несмотря на то, что настороженность врачей различного профиля в отношении ХИВЭБ повысилась, своевременная диагностика с дифференцировкой стадий вирусной инфекции проводится не всегда. Это связано с тем, что клинические проявления ИВЭБ могут варьировать в зависимости от состояния иммунной системы, сочетанного вирусного инфицирования и других причин. Нет единого мнения о перечне лабораторных показателей, которые могут иметь решающее значение в алгоритме диагностике. Поэтому изучение клинико-лабораторных особенностей ХИВЭБ и поиск лабораторных маркеров, имеющих диагностическую и прогностическую значимость, является актуальной задачей.

Открытым остается вопрос о том, можно ли рассматривать персистенцию ВЭБ в макроорганизме как форму своеобразного симбиоза, или она связана с индукцией иммунодефицитного состояния, механизмы которого продолжают изучать до настоящего времени (Petrova М. et al., 2006; Holmoy Т., 2008; Gulley. M.L. et al., 2008; Bieging K.T. et al., 2009). Отечественными и зарубежными учеными получены данные о ведущей роли иммунных механизмов в патогенезе ИВЭБ (Исаков В.А., 2006). Согласно современным представлениям, при ИВЭБ меняются параметры клеточного и гуморального иммунитета, динамика которых изучена только при острой форме инфекции. Практически отсутствуют данные по изменению показателей иммунной системы при латентной ИВЭБ, реактивации ХИВЭБ как у детей, так и взрослых.

Особенностью гуморального иммунного ответа человека на ИВЭБ является дифференцированная во времени продукция специфических иммуноглобулинов класса М (^М) и О (^в) на различные вирусные белки, которые появляются на разных стадиях заболевания (РазсИаЬ М.О. е! а1., 2010). При изменениях в Т-клеточном- звене иммунитета продукция специфических антител к вирусным белкам ВЭБ может меняться. Этот феномен во многом затрудняет диагностику и установление стадии инфекции.

Несмотря на появление новых лабораторных технологий, применяемых для установления ИВЭБ, до сих пор? нет определенности в отношении диагностической ценности многих из них ^епшска 1. е1 а1., 2007). Методы ИФА и различные варианты иммуноблоттинга (ИБ), которые в настоящее время стали использоваться при серологическом исследовании, различаются по спектру определяемых антигенных белков ВЭБ, что также оказывает влияние на интерпретацию результатов анализа и выявление стадии течения инфекции. В настоящее время не накоплен достаточный отечественный опыт по применению ИБ в диагностике ИВЭБ, что сопряжено, с трудностью интерпретации результатов данного исследования.

Использование методов молекулярной диагностики при ИВЭБ также имеет определенные ограничения. Это обусловлено тем, что ВЭБ может сохраняться в виде латентной инфекции (ДНК вируса содержится в небольшом количестве В-лимфоцитов). Эпизодическая асимптоматическая реактивация проявляется в том, что 10-г20% здоровых людей выделяют ВЭБ со слюной (Мирошникова М.А. и соавт., 2002; 81епшска I. а1., 2007). В связи с этим методом ПЦР можно подтвердить этиологическую роль ВЭБ в развитии заболевания только при наличии соответствующей клинической картины и в комплексе с другими лабораторными методами.

Значительный рост атипичных форм ИВЭБ среди взрослого населения, разнонаправленность мнений о причинах их возникновения, ограниченность данных о взаимосвязи показателей гуморального и клеточного звеньев иммунного ответа при ХИВЭБ, неопределенности при выборе метода лабораторной дифференциальной диагностики и сложности при интерпретации результатов лабораторных исследований указывают на актуальность темы и служат основанием для проведения данного исследования.

Вышеизложенное позволило сформировать цель настоящего исследования.

Задачи исследования:

1. Определить диагностическую* значимость выявления специфических антител к антигенам вируса Эпштейна-Барр у пациентов с хронической персистирующей» инфекцией для установления стадии инфекционного процесса при использовании различных серологических методов.

Научная новизна исследования

С использованием новых лабораторных технологий впервые охарактеризован специфический гуморальный иммунный ответ при хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

Теоретическая и практическая значимость

Выполненные исследования и полученные результаты расширяют научные представления об иммунопатогенезе хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр. Описаны на новом методическом уровне атипичные стадии инфекции, обусловленной вирусом Эпштейна-Барр. Охарактеризованы взаимоотношения вирус-хозяин при персистенции вируса Эпштейна-Барр.

На основании проведенного исследования выделена группа наиболее информативных лабораторных показателей для повышения качества диагностики ХИВЭБ и прогнозирования возможных осложнений. Даны рекомендации для практикующих врачей о возможностях использования современного серологического метода иммуноблоттинга. Предложены алгоритмы выявления атипичных стадий течения инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

Основные положения, выносимые на защиту:

Личный вклад автора

Автором составлен дизайн исследования и проведен анализ комплексного обследования 345 больных с ХИВЭБ. Совместно со специалистами автор принимал участие в клиническом обследовании пациентов. В ходе выполнения работы проведен аналитический обзор современной отечественной и зарубежной литературы. Автором самостоятельно выполнены иммунохимические исследования. Проведено сопоставление полученных результатов исследования с результатами исследования параметров клеточного звена иммунной системы. При участии специалистов научно-исследовательской лаборатории (НИЛ) клеточного иммунитета, НИЛ клинической диагностики ФГУЗ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. A.M. Никифорова» МЧС России были выполнены соответствующие исследования, на что имеются ссылки в диссертации. Автором самостоятельно проведен статистический анализ полученных результатов, сделаны научные выводы.

Внедрение результатов в практику

Результаты исследования внедрены в практическую деятельность Клинической больницы № 122 имени Л.Г. Соколова ФМБА России, кафедры инфекционных заболеваний у детей имени профессора М.Г. Данилевича ГОУ ВПО СПБГПМА Минздравсоцразвития России.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы представлены на национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - практическому здравоохранению» (25-26 февраля 2010 г., Москва); Всероссийском конгрессе «Лабораторные технологии при организации медицинской помощи» (27 мая 2010 г., Москва); юбилейной 10-й научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 125-летию основания СПбМАПО «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины — 2010» (22 апреля 2010 г., Санкт-Петербург); межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии — междисциплинарные проблемы» (2730 сентября 2010 г., Санкт-Петербург); 11-й научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, СПбМАПО «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2011» (24 мая 2011 г., Санкт-Петербург); First European Joint Congress of EFCC and UEMS (13-16 October

2010, Lisbon, Portugal); 21st International Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 19th IFCC-EFCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 8th Annual Meeting of the German Society of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (15-19 May 2011, Berlin, Germany).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 3 -публикации в изданиях, определенных перечнем ВАК Минобразования и науки РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 18 рисунками. Указатель литературы содержит 121 наименование, из которых 62 отечественные и 59 зарубежные.

Заключение диссертационного исследования на тему "Оценка информативности лабораторных показателей при хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр"

выводы

7. Частота распространения ^С к ВПГ 1/2 и ЦМВ среди пациентов с хронической инфекцией, обусловленной вирусом Эпштейна-Барр составляет 98% и увеличивается с возрастом. При хронической микстинфекции, вызванной ВЭБ и ЦМВ отмечается значительное снижение индуцированной продукции 1Ш-у.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

- на этапе определения наличия инфицирования ВЭБ использовать чувствительные методики (определение к УСА и к ЕВМА-1 методом ИФА);

- на этапе дифференцировки стадий ХИВЭБ использовать наиболее специфичные методики (^в к отдельным антигенам ВЭБ методом ИБ).

2. Использование показателей ПТЧ в комбинации (содержание в сыворотке, спонтанная продукция, индуцированная продукция) позволяет оценить напряженность системы интерферонов при ХИВЭБ.

3. На основании выявленных особенностей показателей специфического гуморального и клеточного иммунного ответа при ХИВЭБ, с учетом взаимосвязи показателей различных звеньев иммунитета, а также возможностью использования метода ИБ для диагностики и дифференцировки стадий ХИВЭБ были выделены наиболее информативные лабораторные показатели (рис. 18).

И ФА дМ

Острая инфекция дО

ШГ

УСА

Профиль

ЫА

Профиль УСА

Паст-инфекция

Низкий риск развития осложнений связанных с ВЭБ- и н фекци ей ИБ

Р22 давняя инфекция р19 завершение обострения др125 обострение

Профиль ЫА+УСА или ИВ

ЕА

Назначение специфической терапии

Мониторинг иммунологических показателей

СРЗ+

СОЗ-СО ("16+56)-СОЗ+СОВ+ СОЗ+ОС>4+

Рис. 18. Предлагаемый алгоритм диагностики ВЭБ-инфекции

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Горейко, Татьяна Владимировна

1. Авидность антител в практике врача / М.В. Черных, Н.Г. Сагдатдинова, Д.С. Куреляк, Е.В. Гаврилюк, О.И. Кулагина // Медицина в Кузбассе: актуальные вопросы здравоохранения города Кемерово. 2006. —№ 4. — С. 177.

2. Алексеев A.B. Полиморфизм проявлений Эпштейна-Барр вирусной инфекции в практике врача дерматовенеролога / A.B. Алексеев // Дніпровський медичний часопис. 2009. - Том 1, № 4. - С. 15-19.

3. Боковой А.Г. Инфекционный мононуклеоз болезнь или синдром? / А.Г. Боковой, М.О. Гаспарян, Н.Б. Танина // Детские инфекции. - 2003. -№ 1. - С.66-68.

4. Бошьян P.E. Инфекция, вызванная вирусом Эпштейна-Барр: эпидемиологические проявления и лабораторная диагностика: автореф. дис. канд. мед. наук: 14.00.30 / Бошьян P.E. М., 2009. - 25 с.

5. Бутенко З.А. Современные представления о вирусном онкогенезе: фундаментальные и прикладные аспекты / З.А. Бутенко, A.A. Фильченков // Экспериментальная онкология. 2000. - № 2. - С. 239-245.

6. Воспалительная кардиомиопатия: современное состояние проблемы / Е.А. Белявский, К.А. Зыков, О.Ю. Нарусов, В.П. Масенко, A.A. Скворцов, А.Ю. Щедрина, С.Н. Терещенко // Терапевтический архив. 2010. - № 8. -С. 62-71.

7. Ю.Гариб Ф.Ю. Иммунная память при аутоиммунных заболеваниях / Ф.Ю. Гариб, А.П. Ризопулу // Аллергология и иммунология. 2008. - Том 9. -№ 4. - С. 449-453.

8. П.Горецкая М.В. Иммунорегуляторные эффекты печени / М.В. Горецкая // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2010. - № 2. - С. 23-33.

9. Долгих Т.И. Современная лаборатория: диагностический потенциал и мониторинг актуальных инфекционных заболеваний: пособие для врачей / Т.И. Долгих. Омск, 2010. - 56 с.

10. З.Долгих Т.И. Современная стратегия лабораторной диагностики герпесвирусных инфекций, ассоциированных с перинатальной патологией / Т.И. Долгих // Справочник заведующего КДЛ. 2011. - №4. -С. 21-32.

11. Иванова B.B. Иммунопатогенез инфекционной болезни у детей / В.В. Иванова, Г.Ф. Железникова, И.В. Шилова // Педиатрия. 2005. - № 4. -С. 61-65.

12. Исаков В.А. Герпесвирусная инфекция / В.А. Исаков, С. Б. Рыбалкин, М. Г. Романцов // Рекомендации для врачей: СПб, 2006.- С 95.

13. Калоева З.В. Эпштейн-Барр вирусная инфекция в этиологии фосфолипидного синдрома / З.В. Калоева, Н.Ю. Мелехова, А.Н. Иванян, Ю.О. Воробьев // Материалы IV съезда акушеров-гинекологов России / глав. ред. Г.Т. Сухих. Москва, 2008. - С. 105.

14. Кетлинский С.А. Цитокины / С.А. Кетлинский, A.C. Симбирцев СПб: ООО «Издательство Фолиант», 2008 - 552 с.

15. Кишкун A.A. Иммунологические и серологические исследования в клинической практике. М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2006. - 536 с.

16. Клинические формы хронической Эпштейн-Барр-вирусной инфекции: вопросы диагностики и лечения / И.К. Малашенкова, H.A. Дидковский, Ж.Ш. Сарсания, М.А. Жарова, E.H. Литвиненко, И.Н. Щепеткова, Л.И.

17. Чистова, O.B. Пичужкина, Т.С. Гусева, О.В. Першина // Лечащий врач. -2009.-№9.

18. Козлов В.А. Практические аспекты диагностики и лечения иммунных нарушений: руководство для врачей / В.А. козлов, А.Г. Борисов, C.B. Смирнова, A.A. Савченко. Новосибирск: Наука, 2009. - 274 с.

19. Кравченко И.Э. Нестабильность клеточного генома при патологических состояниях инфекционного генеза / И.Э. Кравченко, В.Х. Фазылов, В.В. Семенов // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2010. - № 4. - С. 46-50.

20. Крамарев С.О. Эпштейна-Барр вирусная инфекция у детей / С.О. Крамарев, Н.Т. Литвиненко, Л.О. Палатная // Современная педиатрия. -2004. №4(5) - С. 105-109.

21. Кудин А.П. Эта «безобидная» вирус Эпштейна — Барра инфекция. Часть 1. Характеристика возбудителя. Реакция иммунной системы на вирус / А.П. Кудин // Медицинские новости. 2006. - № 7. - С 25-32.

22. Лапин C.B. Иммунологическая лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний / C.B. Лапин, A.A. Тотолян. — СПб.: Человек, 2010 -272 с.

23. Лобзин Ю.В. Руководство и атлас по инфекционным и паразитарным болезням человека. Под ред: Лобзина Ю.В., Козлова С.С. Спб: Феникс, 2008. - 932 с.

24. Лукьянова Н. Ю. Роль генов р53 и Ьс12 в апоптозе и лекарственной резистентности опухолей / Н.Ю. Лукьянова, Г.И. Кулик, В.Ф. Чехун // Вопросы онкологии. 2000. -Т. 46, №2. -С. 121-128.

25. Маркеры герпесвирусных инфекций при циррозах / Т.А. Гаранжа, Т.А. Туполева, Н.Г. Ярославцева, Д.С. Тихомиров, A.B. Сомова, E.H. Игнатова, Л:0. Грумбкова, Ф.П. Филатов // Мир вирусных гепатитов. -2007.-№4.-С. 22.

26. Мирошникова М.И. Выявление осложнений Эпштейн-Барр вирусной инфекции / М.И Мирошникова, В.Е Казмирчук // Перинаталог1я та пед1атр1я. 2002. - № 4. - С. 51-58.

27. Назаренко Г.И. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований / Г.И. Назаренко, A.A. Кишкун. — М., 2007. — 544 с.

28. Новикова H.A. Хранение и. реализация генетической информации вирусов: учебно-методический материал по программе повышения квалификации «Хранение и обработка информации в биологических системах» / H.A. Новикова: Нижний Новгород, 2007. 84 с.

29. Тюляндин, H. Мюллер-Ланч // Русский журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. — 2002. — Т.6. № 1. — С. 22-32.

30. Павленко O.A. Роль вируса Эпштейна-Барра в патологии верхних отделов пищеварительного тракта у детей / O.A. Павленко, В.А. Щербак // Дальневосточный медицинский журнал. 2009. - № 3. - С. 53-55.

31. Паин П.Ю. Влияние гепатотропных вирусов на течение гепатита А / П.Ю. Паин, А.А.Яковлев // Вестник Российской военно-медицинской академии.- 2008. -№1 (21). С. 57-61.

32. Пальцев М.А. «Функциональность» антител и ее клиническое значение / М.А. Пальцев, А.Г. Габибов, C.B. Сучков // Аллергология иммунология.- 2008. Том 9. - № 4. - С. 453-455.

33. Полимеразная цепная реакция: использование в лабораторной клинической диагностике: учеб. пособие / И.Ю. Стюф, Н.Б. Серебряная, Л.Ф. Шабанова, М.И. Зарайский, A.B. Козлов; Последипломное медицинское образование. Издательский дом СПбМАПО, 2003. - 53 с.

34. Применение Аллокина—альфа в терапии вирусных инфекций / Ф.И.Ершов, В.А.Исаков, Г.П.Беккер, М.Ю.Серебряков, Т.В.Сологуб, Н.Б.Серебряная, М.С.Тищенко, С.И.Черныш // Руководство для врачей: Москва Санкт-Петербург, 2008. - 115 с.

35. Прогностическое значение маркеров хронической активной Эпштейна-Барр вирусной инфекции у больных хроническим гепатитом С / Г.М.Дубинская, Е.М. Изюмская, В.А. Боднарь, Ю.В.Литвиненко, Е.Н.Минак // Мир вирусных гепатитов. 2007. - № 4. - С. 23.

36. Рабсон А., Ройт. А., Делвейз П. Основы медицинской иммунологии: Пер. с англ. М.: Мир, 2006. - 320 с.

37. Редькин Ю.В. Инфекционные заболевания: особенности взаимоотношений в системе «инфект-хозяин» / Ю.В. Редькин, А.Ю. Одокиенко // Иммунопатология, аллергология, инфектология. — 2005.-№2.-С. 73-79.

38. Салахова А.Х. Особенности специфического гуморального иммунитета при персистенции вируса Эпштейна-Барр в небных миндалинах / А.Х. Салахова, Л.Ф. Азнабаева, H.A. Арефьева // Современные проблемы науки и образования. 2005. - № 2. - С. 84.

39. Самарин Д.В. Современные подходы к диагностике Эпштейна-Барр вирусной инфекции /Д.В.Самарин //Клінічна імунологія. Алергологія. Інфектологія. 2008. - № 2. - С. 15-18.

40. Сарбасова Ж.О. Годовая динамика показателей иммунитета, цитокинового статуса учащихся« школы-интерната / Аллергология и иммунология. 2009. - Том 10. - № 1. - С. 68.

41. Сизякина Л.П. Современные принципы терапии иммуно-опосредованных заболеваний / Л.П. Сизякина, Т.А. Калашникова // Аллергология и иммунология. 2008. - Том 9. -.№ 4. - С.447-448.

42. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: Справочник. — М.:АстраФармСервис, 2007. 1632 с.

43. Таточенко В.К. Острые тонзиллиты в детском возрасте: диагностика и лечение / В.К. Таточенко, М.Д. Бакрадзе, A.C. Дарманян // Современная педиатрия. 2009. - № 5 (27). - С. 63-67.

44. Тимченко В.Н. Инфекционные болезни у детей / В. Н. Тимченко. СПб.: СпецЛит, 2001 - 597 с.

45. Уровень сывороточных цитокинов при лимфопролиферативных заболеваниях / Н.П. Домникова, Е.Е. Петрусенко, О.В. Решетников, С.Л. Рыжикова, H.A. вараксин // Новости «Вектор-Бест». 2010. - №2 (56). -С. 4-7.

46. Цуркану А.И. Иммунологический профиль при хроническом вирусном гепатите «С» в ассоциации с герпес-вирусной инфекцией / А.И. Цуркану, Л.П. Андриеш // Аллергология и иммунология. 2009. - Том 10. - № 2. -С. 236-237.t

47. Шилова О.Ю. Ассоциация рака гортани' с вирусами папилломы человека и Эпштейна-Барр / О.Ю. Шилова // Сибирский онкологический журнал -2007 Приложение № 2 - С. 126-127.

48. Шилова О.Ю. Инфицированность онкогенными вирусами папилломы человека Эпштейна-Барр больных воспалительными и хроническими заболеваниями миндалин / О.Ю. Шилова //'Сибирский онкологический журнал 2009 - Приложение № 1 С. 220-221.

49. Экспрессия маркеров апоптоза и пролиферации у больных с онкопатологией / O.A. Ставинская, В.П. Репина., A.B. Полетаева., Л.К. Добродеева, О.В. Кривоногова // Аллергология и иммунология. 2009. — Том 10. - № 2 - С. 254-255.

50. Южакова Д.В. К вопросу о распространенности серологических маркеров вирусной инфекции Эпштейна-Барр у детей / Д.В. Южакова, С.А. Царькова, Д.В. Беседина // Аллергология и иммунология.- 2009. Том 10.-№1.-С. 61-62.

51. Absence of Epstein-Barr virus in the brain and CFS of patients with multiple sclerosis / S.A. Sargsyan et al. // Neuology. 2010. - Vol. 74. - P. 11271135.

52. Activation of the Epstein-Barr Virus BMRF1 and BZLF1 Promoters by ZEBRA in Saccharomyces cerevisiae / K. J. Countryman, L. Heston, L. Gradoville, H. Himmelfarb, S.H. Serdy, G. Miller // Journal of Virol. 1994. -Vol. 68 (11).-P. 7628-7633.

53. Ahsan N. Epstein-Barr Virus Transforming Protein LMP1 Plays a Critical Role in Virus Production / N. Ahsan,T. Kanda, K. Nagashima, K. Takada / Journal of Virology. 2005. - Vol. 79 (7). - P. 4415-4424.

54. AP-1 homolog BZLF1 of Epstein-Barr virus has two essential functions dependent on the epigenetic state of, the viral genome / M. Kalla, A. Schmeinck, M. Bergbauer, D. Pich, W. Hammerschmidt // PNAS. 2010. -Vol.-107.-P. 850-855.

55. Avgil M. Herpes simplex virus and Epstein-Barr virus infections in pregnancy: consequences of neonatal or intrauterine infection / M. Avgil, A. Ornoy // Reprod Toxicol. 2006. - Vol. 21(24). - P. 436^145.

56. Bennett N J. Mononucleosis and Epstein-Barr Virus Infection / N.J. Dennett, J. Domachowske // eMedicine. Электронные данные - 2009. -Режим доступа: http://emedicine.medscape.com/specialties, свободный.

57. Bieging К.Т. Epstein-Barr virus LMP2A bypasses p53 inactivation in a MYC model of lymphomagenesis // К. T. Bieging, A. C. Amick AC, R. Longnecker // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2009. Vol. 7. - 17945-17950.

58. Binnicker M. J. Evaluation of a Multiplex Flow Immunoassay for Detection of Epstein-Barr Virus-Specific Antibodies / M. J. Binnicker et al. // Clinical and Vaccine Immunology. 2008. - Vol. 15 (9). - P. 1410-1413.

59. Carville A. Comparative pathobiology of macaque lymphocryptoviruses / A. Carville, K. G. Mansfield // Comp. Med. 2008. - Vol. 58(1). - P. 57-67.

60. Chronic Epstein-Barr virus-related hepatitis in immunocompetent patients / M. Petrova, M. Muhtarova, M. Nikolova, S. Magaev, H. Taskov, D. Nikolovska, Z. Krastev // World Journal of Gastroenterology 2006. - Vol. 12(35). - P. 5711-5716.

61. Control of Epstein-Barr virus reactivation by activated CD40 and viral latent membrane protein 1 // B. Adler, E. Schaadt, B. Kempkes, U. Zimber-Strobl, B. Baier, G.W. Bornkamm // PNAS 2002. - Vol. 99 (1). - 437-442.

62. Ebell M.H. Epstein-Barr virus infectious mononucleosis. / M.H. Ebell // Am Fam Physician. 2004. - Vol.70(7) . - P. 1279-1287.

63. Ehlin-Henriksson B. Epstein-Barr virus infection negatively impacts the CXCR4-dependent migration of tonsillar B cells / B. Ehlin-Henriksson, F. Mowafi, G. Klein, A. Nilsson // Immunology. 2006. - Vol. 117(3). - P. 37985. •

64. Epstein-Barr Virus (EBV)-Infected Monocytes Facilitate Dissemination of EBV within the Oral Mucosal Epithelium. / S. Tugizov, R. Herrera, P. Veluppillai, J. Greenspan,D. Greenspan, J: M. Palefsky // J. Virol. 2007. -Vol. 81(11).-P. 5484-5496.

65. Fatal hepatitis during Epstein-Barr virus reactivation / B. Cacopardo, G. Nunnari, M.T. Mughini, S. Tosto, F. enanti, L. Nigro // Eur. Rev. Med. Parmacol. Sci. 2003. - Vol. 7. - P. 107-109.

66. Guerreiro M. Human peripheral blood and bone marrow EBV-specific T-cell repertoire in latent infection reveals distinct memory T-cell subsets / M. Guerreiro et al. // Eur. J. Immuno. 2010. - Vol. 15. - P. 1566-1576.

67. Gulley M.L. Laboratory Assays for Epstein-Barr Virus-Related Disease / M.L. Gulley, W. Tang // J. Mol. Diagn. 2008. - Vol. 10(4). - P. 279-292.

68. Hess R.D. Routine Epstein-Barr virus diagnostics from the laboratory perspective: still challenging after 35 years / R.D. Hess // J. Clin. Microbiol. -2004. Vol. 42(8). - P. 3381-3387.

69. Hjalgrim H., Askling J., Sorehsen P. et al. Risk of Hodgkin disease and other cancers after infectious mononucleosis / H. Hjalgrim, J. Askling, P. Sorehsen // J. Natl. Cancer Inst. 2000. -Vol. 92, N 18. -P. 1522-1528.

70. HoImoy T. Vitamin D status modulates the immune response to Epstein Barr virus: Synergistic effect of risk factors in multiple sclerosis / T. Holmoy // Med. Hypohteses. 2008. -Vol. 70 (1). -P. 66-69.

71. Hudnall S.D. Herpesvirus prevalence and viral load in healthy blood donors by quantitative real-time polymerase chain reaction / S.D. Hudnall et al. // Transfusion . 2008. - Vol. 48(6). - P. 1180-1187.

72. Hui K.F. Suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) induces viral lytic cycle in Epstein-Barr virus-positive epithelial malignancies and mediates enhanced cell death / K. F. Hui, A. K. Chiang // Int. J. Cancer. 2010. - Vol. 126 - P. 24792489.

73. Identification of novel helper epitopes of MAGE-A4 tumour antigen: useful tool for the propagation of Thl cells / T. Ohkuril, D. Wakital, K. Chamoto, Y. Togashi, H. Kitamura, T. Nishimura // British Journal of Cancer. 2009. -Vol. 100.-P. 1135-1143.

74. IJpelaar H. Новые возможности пренатальной диагностики врожденного токсоплазмоза и цитомегаловирусной инфекции / Н. IJpelaar // Лаборатория. 2005. - № 7. - С. 47-54.

75. Kanavaros H. Expression of p53, p21/wafl, bcl2, Rb and ki67 protein in Hodgkin lymphomas / H. Kanavaros, K. Sefanaki, V. Georgoulias // Histopathology. 2000. - Vol. 15(2). -P. 445-453.

76. Kasahara, Y, Yachie A. Cell type specific infection of Epstein-Barr virus (EBV) in EBV-associated hemophagocytie lymphohistiocytosis and chronic active EBV infection // Crit Rev Oncjl Hematol.-2002.-Vol. 44, №3.-p. 283294.

77. Kimura H. Identification of Epstein-Barr virus (EBV)-infected lymphocyte subtypes by flow cytometric in situ hybridization in EBV-associated lymphoproliferative diseases / H. Kimura et al. // J. Infect. Dis. 2009. -Vol. 200(7). - P. 1078-1087.

78. Leigh R. Genitourinary manifestations of epstein-barr virus infections / R. Leigh, P. Nyirjesy // Curr. Infect. Dis. Rep. 2009. - Vol. 11(6). - P. 449-456.

79. Lorenzo C.V. Genital ulceration as presenting symptom of infectious ononucleosis / C.V. Lorenzo, W.S. Robertson // J Am Board Fam Pract. -2005.-Vol. 18.-P. 67.

80. Low prevalence of subgingival viruses in periodontitis patients / L. Nibali, C. Atkinson, P. Griffiths, U. Darbar, T. Rakmanee, J. Suvan, N. Donos // J. Clin. Periodontol. 2009. - Vol. 36 (11). - P. 928-932.

81. Lucchesi W. Differential Gen Regulation by Epstein-Barr Virus Type 1 and Type 2 EBNA2 / W. Lucchesi et al. // Journal of Virology. 2008. - Vol. 82, №15. - P.7456-7466.

82. Lünemann J.D. EBV in MS: guilty by association? / J.D Lünemann, C. Münz // Trends Immunol. 2009. - Vol.30(6). - P. 243-248.

83. Lünemann J.D. EBV in MS: guilty by association? / J.D Lünemann, C. Münz // Trends Immunol. 2009. - Vol.30(6). - P. 243-248.

84. MaraS. Roles of Epstein-Barr virus glycoproteins gp350 and gp25 in the infection of human epithelial cells / S. Maruo, L. Yang, K. Takada // Journal of General Virology. 2001. - Vol. 82. - P. 2373-2383.

85. Multiple sclerosis after Infectious Mononucleosis / T.R. Nielsen, K. Rostgaard, N.M. Nielsen, N. Koch-Henriksen, S. Haahr, P.S. Sorensen, H. Hjalgrim // ARHC NEUROL. 2007. - Vol. 64. - P. 72-75.

86. Nuclear factor-Y and Epstein Barr virus in nasopharyngeal cancer / M.C. Chia, A. Leung, T. Krushel, N.M. Alajez, K.W. Lo, P. Busson, H.J. Klamut, C. Bastianutto, F.F. Liu // Clin. Cancer Res. 2008. - Vol. 14(4). - P. 984-994.

87. Ozone hole and Southern Hemisphere climate change / S.W. Son, N F. Tandon, L.M. Polvani, D.W. Waugh // Geophysical Research Letters 2009. -P. 36.

88. Palefsky J.M. Evidence for trafficking of Epstein-Barr virus strains between hairy leukoplakia and peripheral blood lymphocytes / J.M. Palefsky, J. Berline, D. Greenspan, J.S. Greenspan // J. Gen. Virol. 2002. - Vol. 83(Pt 2).-P. 317-321.

89. Pender M. P. Preventing and curing multiple sclerosis by controlling Epstein-Barr virus infection / M.P. Pender // Autoimmun Rev. 2009. - Vol. 8(7).-P. 563-568.

90. Poole B.D. Epstein-Barr virus, and molecular mimicry in systemic lupus erythematosus / B.D. Poole, H. Scofield, J.B. Harley, J.A. James // Autoimmunity. 2006. - Vol. 39(1). - P. 63-70.

91. Resting B cells as a transfer vehicle for Epstein-Barr virus infection of epithelial cells / C. D. Shannon-Lowe, B. Neuhierl, G. Baldwin, A. B. Rickinson, H.J. Delecluse . // Microbiology. 2006. - Vol. 103(19). - P. 7201-7202.

92. Salvetti M. Epstein-Barr virus and multiple sclerosis / M. Salvetti, G. Giovannoni, F. Aloisi // Curr Opin Neurol. 2009. - Vol. 22(3). - P. 201-206.

93. Search for Anti-EA (D) Antibodies in Subjects with an «Isolated VCA IgG» Pattern / M. De Paschale, D. Cagnin, T. Cerulli, M.T. Manco, C. Agrappi, P.Mirri, A. Gatti, C.Rescaldani, P. Clerici . 2010. - Article ID 695104,4 pages.

94. Siennicka J. Laboratory diagnosis of Epstein-Barr virus infection / J. Siennicka, A. Trzcinska // Med. Dosw. Mikrobiol. 2007. - Vol. 59(3). - P. 259-266.

95. Straus S.E. Epstein-Barr virus infections: biology, pathogenesis, and management / S.E. Straus, J.I. Cohen, G. Tosato, J. Meier // Ann. Intern. Med. -1993.- 118(1).-P. 45-58.

96. Sung N.S. Epstein-Barr virus: Encyclopedia of life sciences Электронный ресурс. / N.S. Sung, J.S. Pagano // Nature Publ. Group. -2001. -Режим доступа: http://www.els.net, свободный.

97. Systemic lupus erythematosus and Epstein-Barr virus / I.Tazi, S. Fehri, K. Elghrari, T. Ouazzani, N. Benchemsi // East Mediterr Health J. 2009. -Vol. 15(3). - P. 701-708.

98. Tavani A., La Vecchia C., Franceschi S. et al. Medical history and risk of Hodgkin and nonJHodgkin lymphomas / A. Tavani, C. La Vecchia, S. Franceschi // Eur. J. Cancer Prev. -2000. -Vol. 9, N 1. -P. 59-64.

99. Walther L.E. Infectious mononucleosis / L.E. Walther // HNO. 2005. -Vol. 53(4).-P. 383-392.

100. Young L.S. Epstein-Barr virus: 40 years on / L.S. Young, A.B. Rickinson // Nat. Rev. Cancer. 2004. - Vol. 4(10). - P. 757-768.