Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Араноза в комбинированной химиотерапии рака легкого (экспериментальное исследование)

9 10'6

987 йа правах рукописи

ПОКРОВСКИЙ ВАДИМ СЕРГЕЕВИЧ

АРАНОЗА В КОМБИНИРОВАННОЙ ХИМИОТЕРАПИИ РАКА ЛЕГКОГО

(экспериментальное исследование)

14.01.12 - Онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2010 г.

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре имени Н.Н.Блохина РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Трещалина Елена Михайловна

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Горбунова Вера Андреевна Островская Лариса Анатольевна

Ведущая организация: ФГУ МНИОИ им. П.А.Герцена Росздрава

Защита диссертации состоится « X » Luo^ 2010 г. на заседании диссертационного совета (Д.001.017.02) Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН

Автореферат разослан« <х » L^lQU^ 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор .

Ю.А. Барсуков

ГОСУД А Р С т В с Н '-! А Я Б И Б Л И О i' ЕКА !

_20 12__ _i

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Рак легкого представляет собой одну из наиболее распространенных форм злокачественных новообразований и занимает первое место в структуре онкологической заболеваемости и смертности мужчин в России |Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2009]. Эффективность полихимиотерапии (ПХТ) немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) не превышает 30-40%, мелкоклеточного рака легкого (МРЛ) достигает 80%, и практически у всех больных развивается рецидив или появляются отдаленные метастазы [Pujol J.L. et al, 2000; Переводчикова Н.И., 2005; Niell H.B. et al, 2005]. В связи с этим разработка новых схем ПХТ рака легкого представляется актуальной. В лечении как МРЛ, так и НМРЛ основную роль играют комбинации на основе препаратов платины [Pujol J.L. et al, 2000]. Помимо препаратов платины, показана эффективность ингибиторов топоизомеразы II (этопозид), топоизомеразы I (ирино-текан, топотекан), производных нитрозомочевины (нимустин), противоопухолевых антибиотиков (адриамицин, амрубицин), таксанов, винкаалкалоидов и некоторых других препаратов [Ardizzoni A. et al, 2003; De Marinis F. et al, 2003; Dongiovanni V. Et al, 2006; Eckardt J.R. et al, 2006; Heigener D.F. et al, 2008; Natale R.B. etal, 2008; Rudin CM et al, 2008]. В отделении химиотерапии НИИ КО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН была разработана схема AVP (ACNU+vepeside+platidianr.; нимустин+этопозид+цисплатин), высокоэффективная при МРЛ и, что особенно важно, активная при наличии метастазов в головной мозг. Несмотря на высокую эффективность, для схемы характерна выраженная гематологическая (в том числе отсроченная) токсичность, вызванная нимустином [Семина О.В., 2003]. Поэтому для создания новых эффективных комбинаций целесообразен поиск других препаратов из класса нитрозопроизводных, обладающих меньшей гематологической токсичностью. Араноза (Ar) — отечественный препарат из класса производных нитрозомочевины. По сравнению с другими производными нитрозомочевины, для аранозы характерны больший диапазон терапевтических доз, отсутствие выраженной гематологической токсичности, а также хорошая сочетаемость с другими противоопухолевыми препаратами [Муханов В.И. и др., ¡980; Лесная H.A., 2002; Перетолчина Н.М. и др., 2000]. В настоящем исследовании в качестве комбинантов для сочетания с аранозой использованы высокоэффективные при МРЛ противоопухолевые препараты: этопозид (£), иринотекан (i), топотекан (Т), гемцита-бин (G) и цисплатин (Р), обладающие различными механизмами действия и спектрами побочных эффектов [МсСаЪе F.L., Johnson R.K., 1994; GuichardS. et al, 1998; De Cesare M. et al, 2000; Nam С. etal, 2006].

Таким образом, разработка новых схем ПХТ с использованием Ar и различных цитостати-ков, эффективных при МРЛ, может расширить возможности лечения этой патологии. Про-

веденное исследование важно также для фундаментальной науки, поскольку описывает новые биологические феномены взаимодействия и совместимости препаратов в новых комбинациях и чувствительности к ним известных моделей опухолевого роста. Цель исследования: поиск и экспериментальное изучение эффективных схем комбинированной химиотерапии рака легкого с аранозой. Задачи исследования:

1. Изучить эффективность и переносимость двух- и трехкомпонентных комбинаций на основе Аг на моделях перевиваемых опухолей легкого у иммунокомпетентных мышей.

2. Изучить наиболее эффективные комбинации с включением Аг на подкожных ксено-графтах рака легкого человека у бестимусных мышей.

3. Оценить «острую» токсичность препаратов, входящих в состав комбинаций с Аг.

4. Оценить гематологическую токсичность отобранных эффективных комбинаций с Аг.

5. Отобрать наиболее перспективные комбинации для клинического изучения. Научная новизна

Впервые:

• на различных моделях рака легкого мышей и человека изучены терапевтические дозы Е, I, Т и <3 в комбинациях с Аг и/или Р и охарактеризована эффективность и переносимость конкретных сочетаний препаратов;

• описана чувствительность моделей рака легкого мышей и человека и различия в чувствительности к конкретным препаратам и схемам ПХТ с Е, Р, 1,Т,Ои Аг;

• определена «острая» токсичность (ДЦ16, ДЦ84, ДЦ50, ЛДюо, сроки гибели мышей и спектр токсических эффектов) Е, Р, / и Т в сочетании сАгв терапевтической дозе. Установлено, что Аг не влияет на «острую» токсичность Е,ТиР, но увеличивает токсичность I;

• проведено сравнительное изучение гематологической токсичности эффективных двойных и тройных комбинаций с Аг, Р, Е, I, Т или О. Установлено, что Аг в терапевтической дозе не увеличивает гематологическую токсичность изученных сочетаний;

• в результате доклинического изучения специфической противоопухолевой активности, «острой» и гематологической токсичности комбинаций с Аг найдены перспективные для клинического изучения сочетания ТАг, ЕРАг, 1РАг, ТРАг.

Научно-практическая значимость

Полученные данные имеют фундаментальное и практическое значение для экспериментальной и клинической онкологии. Данные о взаимовлиянии различных препаратов имеют фундаментальное значение для понимания причин синергизма удачных сочетаний и повышения избирательности противоопухолевого действия препаратов с помощью комбинированной терапии. Данные о проявлениях «острой» токсичности отдельных цитостатиков и их

комбинаций в сочетании с Аг важны для понимания механизма развития побочных эффектов и их предупреждения на основе прогноза кумуляции токсичности. Данные об особенностях гематологической токсичности лежат в основе понимания лимитирующих критериев включения Аг в схемы ПХТ с препаратами другого механизма действия. Все перечисленные сведения существенно дополняют систему фундаментальных знаний экспериментальной (доклинической) химиотерапии. Положительная оценка эффективности и переносимости отобранных комбинаций с Аг имеет практическое значение, т.к. позволяет считать указанные сочетания перспективными для клинического изучения при MPJI. Получение двух патентов РФ свидетельствует о коммерческой ценности полученных результатов. Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на следующих конференциях.

• V конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», М., 19-25 мая 2008 г.;

• Конференция отделения химиотерапии НИИ КО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, М., 19 декабря 2008 г.;

• Итоговая научная конференция с международным участием «Татьянин день» и XI школа молодых исследователей «Достижения молекулярной медицины и разработка новых способов диагностики и лечения болезней человека», М., 22-23 января 2009 г.;

• 2Cfh International congress on Anti-Cancer Treatment, Paris, 2-6 февраля 2009 г.;

• VIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», М., 2009 г.;

• Заседание Ученого Совета НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, М., 22 сентября 2009 г.;

• Совместная конференция подразделений НИИ ЭДиТО и НИИ КО РОНЦ имени Н.Н. Блохина РАМН, а также НИИНА имени Г.Ф. Гаузе РАМН и ИБМХ имени В.Н. Орехо-вича РАМН, М., 8 апреля 2010 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, в т.ч. 8 научных статей в изданиях, рекомендованных ВАК, и 5 тезисов. Получено 2 патента РФ. Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 104 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 3 глав с описанием результатов исследований, главы «Обсуждение результатов», выводов, списка сокращений и списка литературы, включающего 137 источников, из них 47 отечественных и 90 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 16 рисунками и 15 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Лабораторные животные. Эксперименты выполнены на изогенных мышах-самцах CsyBU, BDF/ и Balb/c разведения РОНЦ и из питомника РАМН «Столбовая», которых содержали в виварии РОНЦ на брикетированных кормах. Для трансплантации опухолей человека использованы иммунодефицитные мыши-самцы Balb/c nude разведения РОНЦ, которых содержали в специализированном кондиционированном отсеке с соблюдением требований, предъявляемым к конвенциональным животным.

Опухолевые модели. Использованы культура клеток опухолей человека и перевиваемые опухоли мышей и человека из Банка опухолевых штаммов РОНЦ: мышиные эпидермоид-ная карцинома легкого Льюис (LLC) и полиморфноклеточный рак легкого PJI67; а также ксенографты рака легкого человека PJI4, полученные из культуры клеток эпителиоподобно-го рака легкого А549 {Cat №CCL-185 АТСС). Опухоли трансплантировали мышам подкожно (п/к) или внутримышечно (в/м) по стандартным методикам.

Препараты, диапазон разовых доз и режимы введения. Все препараты вводили внутри-брюшинно (в/б) в дозах: Аг 50-200 мг/кг троекратно; Е 2,5-15,0 мг/кг троекратно; Р 2,5 или 3,0мг/кг троекратно; /20-100 мг/кг однократно; Т 0,5-10,0 мг/кг однократно либо троекратно; G 60 троекратно или 100-300 мг/кг однократно. Лечение начинали на 2-е, 7-е или 10-е сутки после трансплантации опухоли. Интервалы при 2-кратном курсе 48 ч, при 3-кратном курсе — 24 или 72 ч. А вводили в 5% растворе глюкозы, остальные препараты — в

0.9% растворе натрия хлорида. В комбинации препараты вводили в последовательности: [Е,

1, Т или G] - Р - Аг с интервалом 10-20 мин для исключения прямого контакта в брюшной полости.

Оценка противоопухолевого эффекта. Использовали стандартные критерии: торможение роста опухоли ТРО>50% (опухоли мышей) и «treatment/control» Т/С<42% (модель РЛ4); увеличение продолжительности жизни УПЖ>25%; излечение (опухоль не определяется 6090 суток). Показатели эффективности двойных и тройных комбинаций определяли в сравнении с контрольными группами мышей без лечения и с группами, получавшими соответствующую монотерапию или двойные комбинации. Положительные результаты воспроизводились.

Оценка переносимости лечения у мышей с опухолью. О переносимости воздействий судили по состоянию и поведению мышей с опухолью. При этом фиксировали достоверное уменьшение массы тела (>30%) и селезенки (косвенные признаки общей, иммуно- и гематологической токсичности), а также гибель от токсичности. Павших или умерщвленных передозировкой эфирного наркоза в конце опыта мышей подвергали аутопсии для визуального определения патологических изменений внутренних органов. Умерщвление животных выпол-

няли в соответствии с Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием принципов, изложенных в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей», ЕЭС, Страсбург, 1985 г., а также руководствуясь требованиями Хельсинкской декларации и Всемирной медицинской ассоциации [Большаков О.П. и др., 2002], рекомендациями, содержащимися в Директивах Европейского сообщества (86/609 ЕС), Приложении к приказу министра здравоохранения СССР №755 от 12.08.1977. Оценка токсикомодифицирующего действия Аг в двойных сочетаниях. Использовали здоровых мышей Balb/ с обоего пола. Аг вводили в/б однократно в дозе 100 мг/кг (-1/4 МПД) через 1-3 мин после введения изучаемого препарата. Модифицируемые цитостатики вводили в/б однократно в большом диапазоне доз вплоть до смертельных. В сравниваемых группах мышей оценивали общее состояние, особенности поведения, потребления корма и воды, изменения в физиологических отправлениях, количество павших животных, сроки гибели и динамику массы тела и селезенки. За состоянием и поведением животных наблюдали в течение 3 ч после введения препаратов и затем ежедневно в течение 60 дней. Количественную токсичность модифицируемого препарата отдельно или в сочетании с Аг определяли по методу наименьших квадратов с использованием пробит-анализа. Для каждого препарата и его сочетания с Аг рассчитывали величины токсических доз ЛД16, ЛД5о, ЛД84 и ЛДюо- О наличии токсикомодифицирующего действия судили по изменению ЛД5о препарата в сочетании с Аг.

Оценка гематологической токсичности. Использовали здоровых мышей линии Balb/c. Изучены комбинации EPAr, IPAr, ТРАг, ТАг. Аг вводили 3-кратно в разовой дозе 100 мг/кг. Комбинаты вводили однократно или 3-кратно по указанным выше схемам. Контрольная группа мышей получала в/б 3-кратно 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Взятие крови из хвостовой вены выполняли многократно в течение 38 дней с учетом отсроченной гематологической токсичности Аг. Определяли стандартные гематологические показатели общее количество лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитарную формулу при помощи автоматического гематологического анализатора «Abacus Junior vet» (Австрия). Для морфологического исследования клеток периферической крови проводили микроскопическое исследование мазков после фиксации в метаноле и окраски азур П-эозином. Кроме того, оценивали концентрацию гемоглобина, гематокрит, эритроцитарные индексы, тромбокрит и средний объем тромбоцитов.

Статистическая обработка данных проводилась по методу Фишера-Стьюдента в модификации Р.Б. Стрелкова, рассчитывая доверительные интервалы средних сравниваемых величин. Достоверными считали различия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Эффективность и переносимость препаратов в монотерапии на п/к LLC. Для оценки эффективности ПХТ предварительно определили диапазон эффективных и переносимых доз каждого из препаратов на мышах с п/к LLC при начале лечения через 48 часов после п/к трансплантации. Терапевтические дозы и режимы введения препаратов подбирали с учетом кратности введения в клинике, данных об острой токсичности препаратов у мышей, а также об активности изученных другими авторами схем. Результаты представлены в табл. 1. Видно, что монотерапия даже при применении близких к МПД доз была эффективна лишь в

Таблица 1. Эффективность и переносимость монотерапии Е, I, T,G,P и Аг на п/к LLC

Препарат Разовая доза, мг/кг Сутки введения Суммарная доза, мг/кг Эффективность Переносимость

ТРО, % на сутки после трансплантации УПЖ, % Уменьшение массы тела, %** Уменьшение массы селезенки, %

10 18 26

Е 5 2,3,4 15 57* 31 22 15 2 9

15 2,3,4 45 70* 40 35* 11 И 37*

I 20 2 20 40* 18 7 2 0 4

40 2 40 43* 19 17 0 3 9

60 2 60 87* 55* 18* 29 <10 31

100 2 100 83* 63* 46* 9 7 19

Т 1 2,3,4 3 98* 69* 28 28* <10 50*

2 2,3,4 6 100* 88* 51* 36 <15 59*

2,5 2 2,5 13 16 6 10 <5 12

5 2 5 95* 80* 71* 36 <5 3

10 2 10 93* 74* 63* 46* <5 3

15 2 15 99* 92* 83* 25 <10 42

G 60 2, 5,8 180 98* 81* 67* 3 <10 0

200 2 200 83* 53* 42 11 <10 29*

300 2 300 97* 86* 77* 43* <10 23*

Р 3 2,3,4 9 85* 61* 51* 37* 5 31*

Аг 100 2,3,4 300 83* 58* 46* 16 6 37*

200 2,3,4 600 74* 53* 38* 6 8 38

Примечание: 'достоверно по отношению к контролю, р<0,05; ** 5-10-е сутки после лечения

отношении первичной опухоли без продления жизни (исключая Р, Т и в при некоторых режимах применения) и без излечения мышей. Косвенный признак гематологической токсичности — достоверное уменьшение массы селезенки, может свидетельствовать о риске повышения токсичности при ПХТ. Для ПХТ были дополнительно использованы меньшие разовые дозы Р — 2,5 мг/кг, Аг — 50 и 75 мг/кг иО — 100 мг/кг. При сопоставимой эффективности изученных режимов применения Т в схемах ПХТ использовали троекратное и однократное введение. Для улучшения переносимости троекратного курса лечения Т в комбинациях использованы разовые дозы <1 мг/кг с исключением дозы 15 мг/кг при однократном введении. Дальнейшее изучение монотерапии в показало, что непосредственное ТРО и переносимость обоих режимов применения достоверно не отличаются. Поскольку отдаленный эффект при однократном введении в был лучше, чем при троекратном, УПЖ=43% против 3%, в схемах ПХТ с включением в использовали преимущественно однократное введение. Эффективность и переносимость комбинации ЕР на п/к 1ХС. Применение ЕР показало (табл. 2), что эта схема высокоэффективна на п/к ЬЬС в прямой зависимости от дозы Е. Эта зависимость прослеживается на 14-е сутки после окончания лечения, ТРО возрастало в 1,31,5 раза пропорционально дозе Е в диапазоне от 5 до 15 мг/кг. Несмотря на то, что даже при максимальной из изученных доз Е 15 мг/кг излечения мышей добиться не удалось, продолжительность жизни животных в этой группе достоверно возросла, УПЖ=66% (р<0,05). В легких всех павших мышей контрольной и подопытных групп обнаружены метастазы, визуальные различия в степени поражения легких не выявлены.

Переносимость всех видов лечения была удовлетворительной. В результате аутопсии павших от опухолевого процесса мышей каких-либо патологических изменений внутренних органов не наблюдали, кроме достоверного уменьшения массы селезенки на 40% при применении Е в высокой дозе 15 мг/кг. Таким образом, результаты изучения чувствительности п/к ЬЬС к стандартной схеме ЕР показали, что применение этой схемы не приводит к полному эффекту (излечению) даже при применении близкой к МПД дозы Е. Данные об увеличении риска гематологической токсичности при применении высоких доз Е послужили основанием для снижения дозы Е в тройной комбинации ЕРАг до <10 мг/кг. Эффективность и переносимость комбинации 1Р на п/к ЬЬС. Схема 1Р оказалась более эффективной, чем ЕР, при дозе 140 мг/кг отмечали излечение 10% мышей. При повышении дозы I до 60 мг/кг, как непосредственный (ТРО), так и отдаленный (УПЖ) эффекты не улучшались. Переносимость 1Р была удовлетворительной. У всех животных на протяжении недели после лечения (кроме мышей, получивших / в дозе 20 мг/кг) отмечали умеренную диарею (гастроинтестинальная токсичность) при незначительной потере массы тела (<20%).

Таблица 2. Эффективность и переносимость двухкомпонентных комбинаций ЕР, 1Р, ТР и вР на п/к ЬЬС

Схема лечения Разовая доза, мг/кг Сутки введения Суммарная/ доза, мг/кг ТРО, % (сутки после трансплантации) Излечение УПЖ, % Уменьшение средней массы селезенки, %

10 18 26

Е Р 5 2,5 2, 3,4 2,3,4 15 7,5 88* 56* 42* 0/10 2 0

10 2,5 2,3,4 2, 3,4 30 7,5 99* 75* 67* 0/7 30 27*

15 2,5 2,3,4 2,3,4 45 7,5 100* 85* 67* 0/8 66* 40*

I Р 20 2,5 2 2, 3,4 20 7,5 77* 65* 47* 0/8 8 21

40 2,5 2 2,3,4 40 7,5 100* 92* 84* 1/10 48* 34

60 2,5 2 2,3,4 60 7,5 92* 86* 69* 0/8 11 21

Т Р 0,75 2,5 2,3,4 2,3,4 2,25 7,5 93* 72* 63* 0/10 12 37*

5 2,5 2 2,3,4 5 7,5 99* 96* 89* 0/8 42* 22

10 2,5 2 2, 3,4 10 7,5 100* 98* 92* 3/8 41* 57*

в Р 100 2,5 2 2,3,4 100 7,5 92* 92* 93* 3/8 42* 50*

Примечание: 'достоверно по отношению к контролю, р<0,05

Эффективность и переносимость комбинации ТР на п/к ЬЬС. При применении ТР с 3-крагаым введением Т УПЖ или излечения мышей не отмечали. Использование Т однократно в разовой дозе 5 или 10 мг/кг повысило как непосредственную эффективность комбинации, ТРОотах=99-100%, так и отдаленный эффект, УПЖ=41-42%. Применение Т в дозе 10 мг/кг излечивает 38% мышей. Переносимость ТР была удовлетворительной: поведение мышей без особенностей, потеря массы тела не превышала 20%. Переносимость комбинации ТР определяется режимом введения и дозой Т: меньше побочных эффектов наблюдали при однократном введении Г в дозе 5 мг/кг.

Эффективность и переносимость комбинации СР на п/к ЬЬС. При применении ОР с однократным введением б в дозе 100 мг/кг на протяжении всего периода наблюдения ТРО=92-93% (р<0,05), УПЖ=42%, излечение 38%. В легких павших от опухоли мышей обнаружены метастазы. Переносимость СУ была удовлетворительной, гибели мышей от токсичности не отмечали, потеря массы тела <20%.

Эффективность и переносимость комбинации РАг на п/к LLC. Комбинация РАг при разовых дозах Р 2,5 мг/кг и Аг 100 и 150 мг/кг (табл. 3) оказалась сопоставимой по эффективности с IP, TP и GP (см. табл. 2). Отсутствие опухоли у 10-30% животных прослежено до 90 суток, в результате констатировано излечение 10-30% животных. Таким образом, РАг оказалась существенно эффективнее монотерапии каждым из препаратов по всем использованным критериям. Состояние мышей было удовлетворительным. Результаты аутопсии павших или умерщвленных на 93 сутки наблюдения мышей показали отсутствие видимых изменений внутренних органов, за исключением достоверного уменьшения массы селезенки на 51-57% (р<0,05).

Эффективность и переносимость комбинации ЕАг на п/к LLC. Комбинация ЕАг оказалась менее эффективной, чем РАг, и сопоставимой по ТРО и УПЖ с ЕР. Комбинация ЕАг с дозой Е 5 мг/кг сходна как по эффективности, так и по переносимости с монотерапией Аг и Е. Излечения животных не наблюдали. Переносимость лечения была удовлетворительной. Поскольку эффективность схемы ЕАг с дозами Я 10 и 15 мг/кг была сопоставимой, но имела место тенденция к повышению токсичности с увеличением дозы Е, в дальнейшем при изучении трехкомпонентной комбинации ЕРАг использовали дозы <10 мг/кг в режиме троекратного введения.

Эффективность и переносимость комбинации IAr на п/к LLC. Схема LAr проявляла противоопухолевое действие в прямой зависимости от дозы I в интервале 40-60-100 мг/кг. Эта зависимость особенно четко прослежена на 26-е сутки опыта, когда последовательное увеличение дозы I в 2,5 раза привело к увеличению ТРО от 42 до 83% и излечению 10% мышей. Таким образом, IAr оказалась менее эффективной комбинацией по сравнению с IP или с РАг. Переносимость лечения по схеме IAr была удовлетворительной только при дозе 60 мг/кг и ухудшалась при увеличении дозы I. При всех дозах I наблюдали умеренную диарею при незначительной потере массы тела (<20%) и уменьшении средней массы селезенки на 45-60% (р<0,05). Достоверной зависимости уменьшения средней массы селезенки от дозы I не выявлено.

Эффективность и переносимость комбинации ТАг на п/к LLC. Схема ТАг оказалась значительно более эффективной, чем монотерапия Т или Аг и представляется наиболее перспективной из изученных двухкомпонентных комбинаций. Противоопухолевый эффект ТАг был устойчивым и привел к достоверному УПЖ=27-90% (р<0,05) и излечению 13-50% мышей. Наиболее эффективным оказался режим с однократным введением топотекана в дозе 10 мг/кг. Эффективность комбинации ТАг при однократном и троекратном введении Т в изученных дозах сопоставима. При этом в троекратном режиме для достижения показанного эффекта требуются значительно меньшие суммарные дозы Т, чем при однократном. Это

Таблица 3. Эффективность и переносимость двухкомпонентных комбинаций РАг, ЕАг, IAr, ТАг и GAr на п/к LLC

Схема лечения Разовая доза, мг/кг м И Э 1) Суммарная доза, мг/кг ТРО, % (сутки после трансплантации) о S3 я <L> В" £ Гибель ►0 Ю О vO S a tf- s « „• о 2 К 9 « я л и Й

а ч С. u гV Я О в 10 18 26 14 СП К >> (D Ч О 5. О t; с а 3 о О

Р 2,5 100 2,3,4 2,3,4 7,5 300 100* 99* 93* 3/10 23 0/10 51*

Аг 2,5 150 2, 3,4 2,3,4 7,5 450 100* 98* 89* 1/10 29 0/10 57*

5 150 2,3,4 2,3,4 15 450 89* 51* 26* 0/10 7 0/10 33

Е Аг 10 100 2,3,4 2,3,4 30 300 93* 86* 75* 0/8 25 0/8 51*

15 100 2, 3,4 2,3,4 45 300 98* 88* 82* 0/8 36 0/8 56*

30 100 2 2, 3,4 30 300 92* 65* 48* 0/9 25 0/9 57*

I 40 100 2 2,3,4 40 300 98* 56* 42* 0/8 16 0/8 60*

Аг 60 100 2 2,3,4 60 300 100* 91* 70* 0/9 21 0/9 45*

100 150 2 2,3,4 100 450 100* 94* 83* 1/10 6 6/10** 48

0,5 100 2,3,4 2,3,4 1,5 300 100* 99* 91* 1/8 68* 0/10 70*

0,75 100 2,3,4 2,3,4 2,25 300 100* 99* 95* 2/10 27* 0/10 62*

Т Аг 1 100 2,3,4 2,3,4 3 300 100* 100* 98* 2/7 90* 0/10 45*

5 100 2 2,3,4 5 300 99* 87* 69* 0/10 59* 0/10 35*

10 100 2 2,3,4 10 300 100* 95* 93* 5/10 72* 0/10 25

60 100 2, 5,8 2,3,4 180 300 - - - 0/8 - 7/8** 79*

G Аг 100 100 2 2,3,4 100 300 98* 91* 92* 3/9 18 0/9 0

200 100 2 2,3,4 200 300 100* 77* 63* 0/9 41* 0/9 29

Примечание: »достоверно по отношению к контролю, р<0,05; "гибель от токсичности на 6-17 сутки после окончания лечения

соответствует данным, полученным при изучении эффективности монотерапии, и позволяет предполагать кумуляцию эффекта Т при многократном применении малых доз. Переносимость лечения была удовлетворительной, гибели мышей от токсичности не наблюдали. Потеря массы тела мышей во всех группах не превышала 20%; достоверной зависимости уменьшения средней массы селезенки от дозы Г при троекратном применении не выявлено. Переносимость комбинации ТАг зависит от кратности введения Т: меньше побочных эффектов наблюдали при однократном введении. В то же время прямого влияния изменения дозы Г на переносимость комбинации не отмечали.

Эффективность и переносимость комбинации GAr на п/к LLC. Комбинация оказалась сходной по эффективности с GP и РАг. При однократном применении G в дозе 100 мг/кг излечено 33% мышей. Переносимость GAr зависела от режима введения и дозы G. При однократных дозах G <200 мг/кг переносимость лечения была удовлетворительной и не вызывала гибели от токсичности или существенной потери массы тела. При троекратном применении G в дозе 60 мг/кг комбинация оказалась высокотоксичной и вызвала гибель 88% животных на 6-17 сутки при снижении массы селезенки на 79%.

Эффективность и переносимость комбинации ЕРАг на п/к LLC. В качестве основной группы сравнения для комбинации ЕРАг была выбрана схема ЕР— «золотой стандарт» ПХТ MPJI. Результаты (табл. 4) показали потенцирование эффекта вплоть до полного излечения мышей. Так, получено излечение 43-100% мышей при использовании различных доз Аг от 50 до 200 мг/кг, причем эффект не зависел от дозы Аг. Эти данные подтверждают важные свойства Аг — широкий диапазон терапевтических доз и благоприятный профиль токсичности, которые определяют эффективность и относительно низкую токсичность комбинаций Аг с комплексными соединениями платины, а также с другими цитостатиками.

Таблица 4. Сравнительная эффективность и переносимость ЕРАг и ЕР на п/к LLC

Разовая доза, мг/кг УПЖ% Излечение Уменьшение средней массы селезенки, %

Е Р Ar

5 2,5 - 2 0/10 0

10 2,5 - 30 0/7 27*

15 2,5 - 66* 0/8 40*

2,5 2,5 100 - 7/8 50*

10 2,5 100 - 7/7 61*

5 2,5 50 - 7/7 47*

5 2,5 75 - 8/8 57*

5 2,5 100 - 18/21 63*

5 2,5 150 52* 6/14 58*

5 3 200 - 19/19 76*

Примечание: "достоверно по отношению к контролю, р<0,05

Переносимость ЕРАг сопоставима с переносимостью двойной комбинации ЕР: гибели животных от токсичности не отмечалось. Уменьшение средней массы селезенки было более выраженным, чем при двойных комбинациях. Наиболее выраженное уменьшение массы селезенки (до 76% по сравнению с контрольной группой, р<0,05) отмечали при использовании 200 мг/кг Аг, 3 мг/кг Р и 5 мг/кг Е. Уменьшение массы тела через 6 дней после окончания лечения составило не более 25% при всех изученных дозах комбинантов. Эффективность и переносимость комбинации IPAr на п/к LLC. В качестве основной группы сравнения для трехкомпонентной комбинации IPAr была выбрана широко применяемая в клинике при лечении MP Л схема IP. Результаты представлены в табл. 5. Применение IPAr приводит к излечению 90-100% мышей, что можно расценивать как выраженное потенцирование. Этот эффект получен при высокой дозе Р и относительно низких дозах / и Аг. Таким образом, терапевтические результаты применения комбинации IPAr сходны с таковыми ЕРАг. Переносимость IPAr была удовлетворительной и сопоставимой с двойной комбинацией IP. Масса тела мышей через 7 дней после окончания лечения уменьшалась не более чем на 25%. Восстановление массы тела наблюдали к 20-м суткам после окончания лечения. Одним из побочных эффектов была умеренная диарея (гастроинтестинальная токсичность), которую отмечали и в группах сравнения. Видимых патологических изменений внутренних органов при аутопсии не отмечали, за исключением косвенного признака гематологической токсичности — достоверного уменьшения массы селезенки на 44—45% (р<0,05), также сопоставимого с группами сравнения. Таким образом, показана высокая эффективность и удовлетворительная переносимость IPAr при относительно невысоких дозах InAr, соответствующих 1/6-1/3 и 1/3 МПД. Ожидаемые побочные эффекты можно корректировать путем уменьшения доз препаратов.

Эффективность и переносимость комбинации ТРАг на п/к LLC. Эффективность и переносимость лечения по схеме ТРАг сравнивали с двухкомпонентной комбинацией ТР. Результаты представлены в табл. 6. Показано, что применение ТРАг как при троекратном, так и при однократном введении Т приводит к полному излечению животных, опухоли у всех мышей не определялись до конца эксперимента.

Переносимость ТРАг при изученных дозах была удовлетворительной и сопоставимой с двойными комбинациями, включающими препараты в соответствующих дозах. В течение недели после окончания лечения масса тела животных уменьшалась не более чем на 25% и восстанавливалась к 20-м суткам опыта. Видимых патологических изменений внутренних органов при аутопсии не отмечали, за исключением уменьшения массы селезенки на 4369% (р<0,05). Масса селезенки снижалась в большей степени при троекратном введении Т, что соответствует данным, полученным при изучении переносимости монотерапии Т, а

также двухкомпонентных комбинаций ТАг и ТР. Таким образом, показана высокая эффективность и удовлетворительная переносимость ТРАг при относительно невысоких дозах Т и Аг (1/8-1/2 и 1/3 МПД).

Таблица 5. Сравнительная эффективность и переносимость комбинаций IPAr и IP на п/к LLC

Разовая доза, мг/кг УПЖ% Излечение Уменьшение средней массы селезенки, %

I Р Аг

20 2,5 - 8 0/8 21

40 2,5 - 48* 1/10 34

60 2,5 - 11 0/8 21

40 2,5 100 74 9/10 45*

20 2,5 100 - 12/12 44*

Примечание: "достоверно по отношению к контролю, р<0,05

Таблица 6. Сравнительная эффективность и переносимость комбинаций ТРАг и TP на п/к LLC

Схема Разовая доза, мг/кг Сутки введения УПЖ% Излечение Уменьшение массы селезенки, %

Т Р 0,75 2,5 2,3,4 2,3,4 12 0/10 37*

5 2,5 2 2,3,4 42* 0/8 22

10 2,5 2 2,3,4 41* 3/8 57*

Т Р Аг 0,75 2,5 100 2,3,4 2,3,4 2,3,4 - 10/10 69*

2,5 2,5 100 2 2,3,4 2,3,4 70* 5/8 43*

5 2,5 100 2 2,3,4 2, 3,4 - 8/8 48*

10 2,5 100 2 2,3,4 2, 3,4 - 8/8 50*

Примечание: "достоверно по отношению к контролю, р<0,05

Эффективность и переносимость комбинации GPAr на п/к LLC. Комбинацию GPAr сравнивали с двухкомпонентными схемами GP, GAr и РАг. Результаты представлены в табл. 7. Показано, что применение GPAr приводит к излечению 100% мышей. Этот эффект получен при высокой дозе Р и невысоких дозах G и Аг, которые составляют соответственно 3/4, 1/6-1/3 или 1/3 МПД. Переносимость GPAr была удовлетворительной и сопоставимой с

двойными комбинациями. Масса тела через 3-7 дней после окончания лечения уменьшалась не более чем на 25%. Восстановление показателя наблюдали к 20-м суткам после окончания лечения. Видимых патологических изменений внутренних органов при аутопсии не отмечали.

Таблица 7. Сравнительная эффективность и переносимость комбинаций GP и GPAr на п/к LLC

Схема Разовая доза, мг/кг Сутки введения УПЖ% Излечение Уменьшение массы селезёнки,%

G Р 100 2,5 2 2,3,4 42* 3/8 50*

G Р Аг 100 2,5 100 2 2,3,4 2, 3,4 - 14/14 33*

50 2,5 100 2 2,3,4 2,3,4 - 10/10 31*

Примечание: 'достоверно по отношению к контролю, р<0,05

Сравнительная эффективность и переносимость комбинаций EPAr, IPAr, ТРАг на в/м LLC. Для выявления различий в противоопухолевом действии комбинаций EPAr, IPAr и ТРАг, высокоэффективных на модели п/к LLC, использовали развившуюся в/м трансплантированную LLC. Этот вариант LLC более устойчив к терапии многими противоопухолевыми препаратами, что позволяет дать более строгую сравнительную оценку ингибирования опухолевого роста препаратами и их комбинациями.

Лечение начинали на 7 или 10-е сутки после трансплантации опухоли, при достижении среднего размера 1410 [1107-4713] ммЗ (на 7-е сутки) или 1919 [1592-^2246] ммЗ (на 10-е сутки). Результаты представлены в табл. 8. Показано, что при применении всех изученных комбинаций на 5-6-е сутки после окончания лечения наблюдался непосредственный эффект с ТРО=65-84% (р<0,05). Более длительное ТРО, сохранявшееся на протяжении 12-14 дней, было отмечено после применения комбинации ТРАг. Достоверных различий между группами не выявлено. Значимого УПЖ или излечения при применении препаратов в указанных дозах не наблюдали (УПЖ <18%). Переносимость лечения была удовлетворительной, гибели животных от токсичности не отмечали, потеря массы тела на 5-10-е сутки после окончания лечения не превышала 20%. Достоверное (р<0,05) уменьшение средней массы селезенки отмечали только в группе EPAr с высокой дозой £ 10 мг/кг троекратно и в группе IPAr. Таким образом, существенных различий в противоопухолевой активности и переносимости между изучаемыми комбинациями на модели развившейся опухоли LLC выявлено не было.

Таблица 8. Сравнительная эффективность и переносимость комбинаций ЕРАг, IPAr и ТРАг на в/м LLC

Разовая Суммарная доза, мг/кг Сутки введения ТРО%, на сутки после Уменьшение

Схема доза, окончания лечения средней массы

мг/кг 5-6 12-14 селезенки, %

5 15 10,11,12

Е Р Аг 2,5 150 7,5 450 10, И, 12 10,11,12 84* 55* 29

10 30 7, 8,9

2 100 6 300 7, 8,9 7, 8,9 65* 38 51*

I 30 30 7

Р 2 6 7,8,9 66* 44 37*

Аг [_ 100 300 7, 8,9

Т 0,75 2,25 7, 8, 9

Р 2 6 7, 8,9 76* 69* 30*

Аг 100 300 7, 8,9

Примечание: 'достоверно по отношению к контролю, р<0,05

Сравнительная эффективность и переносимость комбинаций ТА г, ЕРАг, 1РАг, ТРАг и вРАг на РЛ67. Использовали охарактеризованные ранее дозы и режимы введения препаратов, высокоэффективные на модели 1ХС. Показано, что одинаково высокоактивными являются комбинации ЕРАг, 1РАг и ТРАг. При их применении ТРО на 18 сутки после трансплантации (14 сутки после окончания лечения) составляет 84, 86 и 84%, соответственно, с сохранением пограничного эффекта на 34-е сутки после окончания лечения, ТРО=52-56%, различия между группами недостоверны. ОРАг и ТАг уступают по эффективности другим изученным комбинациям, ТРО на 18 сутки составляет только 66 и 67%, соответственно, различия между этими группами недостоверны. УПЖ в группах ТАг, ЕРАг, 1РАг, ТРАг, ОРАг составило 22, 28, 33, 32, 26%, соответственно. Во всех группах, кроме ОРАг, УПЖ по сравнению с контролем было достоверным (р <0,05). Переносимость всех видов лечения была удовлетворительной, гибели животных от токсичности не отмечали, потеря массы тела на 10 сутки после окончания лечения не превышала 15%. Уменьшение массы селезенки по результатам аутопсии в группах ТАг, ЕРАг, 1РАг, ТРАг, ОРАг составило 36, 23, 15, 37, 13%, соответственно. Достоверные (р<0,05) отличия массы селезенки от контроля выявлены только в группе ТРАг.

Эффективность Аг и комбинации РАг на РЛ4. Препараты вводили двукратно, на 2 и 4-е сутки после трансплантации опухоли, разовые дозы Аг — 100 мг/кг, Р — 2,5 мг/кг. Аг давала минимальный эффект, 7УС=55-81% на 7-20 сутки после окончания лечения с большим разбросом в 1руппе. При применении комбинации РАг значимого противоопухолевого эффекта также не наблюдали, 7/0=56-59%. Переносимость Аг и комбинации РАг была удов-

15

летворнтельной: гибели от токсичности не отмечали, состояние и поведение мышей без особенностей, потеря массы тела на 10-е сутки опыта <10%.

Эффективность Т и комбинации ТАг на РЛ4. При сравнительном изучении Т и комбинации ТАг препараты вводили двукратно, на 2 и 4-е сутки после трансплантации опухоли, разовые дозы Аг 100 мг/кг, Т 0,5 мг/кг. При применении только Т достоверного противоопухолевого эффекта достичь не удалось: Т/Ст/л=76%. При использовании ТАг был отмечен противоопухолевый эффект (Т/Сшгп=35%), который сохранялся в течение 22 суток после окончания лечения. Переносимость лечения была удовлетворительной: состояние и поведение мышей без особенностей, потеря массы тела <10%, гибели от токсичности не отмечали. Эффективность комбинаций ЕР и ЕРА г на РЛ4. Изучение трехкомпонентной комбинации ЕРАг на РЛ4 проводили в сравнении с комбинацией ЕР, которая является стандартной схемой ПХТ МРЛ в клинике. Препараты вводили двукратно, на 2 и 4-е сутки после трансплантации опухоли, разовые дозы Аг — 100 мг/кг, Р — 2,5 мг/кг, Е — 5 мг/кг. Показано, что двойная комбинация ЕР малоэффективна, 7УС=57-90%. Показатели терапии ЕР аналогичны таковым, полученным, ранее при применении РАг. Трехкомпонентная схема с включением в комбинацию Аг дала терапевтический выигрыш, проявившийся достоверным ингибирова-нием роста, 7УС=23% (р<0,05), которое удерживалось на значимом уровне в течение 39 суток. Таким образом, добавление Аг к комбинации ЕР заметно улучшает результаты лечения. Переносимость комбинаций ЕР и ЕРАг была удовлетворительной: гибели от токсичности не отмечали, состояние и поведение мышей без особенностей, потеря массы тела животных <20%. При аутопсии видимых патологических изменений внутренних органов не отмечали. Эффективность комбинаций 1Р и 1РАг на РЛ4. Эффективность трехкомпонентной комбинации 1РАг на РЛ4 сравнивали zlP.Pl мг/кг и Аг 100 мг/кг вводили двукратно с интервалом 48 ч, I применяли однократно в дозе 20 мг/кг. Комбинация 1Р не вызывала достоверного ТРО по сравнению с контрольной группой, но показала минимально значимый результат: 7УС=42-70%. Добавление к комбинации Аг было результативным и привело к существенному увеличению эффективности на 17-е сутки после окончания лечения, Т/С =16% (р<0,05). При этом противоопухолевый эффект сохранялся на значимом уровне в течение 33 суток. Переносимость обеих комбинаций была удовлетворительной. Добавление Аг в схему 1Р не усугубляло ее токсичности: гибели не отмечали, состояние и поведение мышей без особенностей, потеря массы тела животных <20%. Одним из побочных эффектов комбинации 1РАг была умеренная диарея (гастроинтестинальная токсичность), сопоставимая с таковой в группе сравнения.

Эффективность комбинаций ТР и ТРАг на РЛ4. Эффективность трехкомпонентной комбинации ТРАг на РЛ4 изучали в сравнении с двухкомпонентной комбинацией ТР. Терапию

проводили в режиме двукратного введения препаратов на 2 и 4-е сутки после трансплантации опухоли. Т применяли в дозе 0,5 мг/кг, Р — 2 мг/кг, Аг— 100 мг/кг. Комбинация ТР не вызывала достоверного торможения роста опухоли: Г/С>58%. Включение Аг в комбинацию ТР (сочетание ТРАг) привело к 7У031% на 6 сутки с сохранением эффекта на значимом уровне в течение 14 суток после окончания лечения. Переносимость обеих комбинаций была удовлетворительной: гибели не отмечали, состояние и поведение мышей без особенностей, потеря массы тела животных <20%. При аутопсии видимых патологических изменений внутренних органов не отмечали. Следовательно, добавление Аг к схеме ТР повышало ее эффективность и не усугубляло токсичности.

Влияние Аг на «острую» токсичность других комбинантов. Учитывая данные, полученные при изучении эффективности схем ПХТ с включением Аг, представлялось целесообразным изучение влияния Аг на «острую» токсичность препаратов, входящих в наиболее перспективные комбинации. Изучаемые препараты вводили в токсических дозах с добавлением Аг 100 мг/кг однократно или без нее, сравнивая полученные результаты. Рассчитанные токсические дозы ДЩб, ЛД50, ДЦв4 и ЛДюо Р, Е, I и Т в сочетании с Аг или без нее представлены в табл. 9. Показано, что Аг в дозе 100 мг/кг не усугубляет токсичности Е, Р и Т я достоверно ухудшает переносимость I.

Таблица 9. Токсичные дозы Р,Е,1иТв монорежиме и в сочетании сАг 100 мг/кг

Препараты Токсические дозы, мг/кг

ДЦ,6 ДЦ50 ДЦ84 ДЦ100

Р 12,23 15,89 [14,7-17,1] 19,54 21,37

Р+Аг 10,38 14,13 [12,9-15,4] 17,89 19,77

Е 62,32 98,87 [86,7-111,1] 135,42 153,69

Е+Аг 63,26 92,58 [80,6-104,6] 121,91 136,57

I 193,73 231,32 [218,8-243,9] 268,91 287,71

1+Аг 121,15 181,89 [161,7-202,1]* 242,61 272,97

Т 16,46 22,00 [20,2-23,9] 27,55 30,32

Т+Аг 20,06 25,87 [23,9-27,8] 31,68 34,58

Примечание: "различия достоверны: между группами «/» и «1+Ап р<0,05; между «7\> и «Т+Аг» р=0,05

Гематологическая токсичность Аг. Аг в разовой дозе 200 мг/кг вызывает один пик лейко-цитопении на 3-7-е сутки (р<0,05 к контролю) и небольшое уменьшение лейкоцитов на 14-е сутки (р<0,05 к контролю). Общее количество лейкоцитов на 3 сутки составляет 15%, а на 7-е сутки 25% от контроля, т.е. достоверно уменьшается в 7 раз (р<0,05). Затем показатель

начинает восстанавливаться, и на 14-е сутки общее число лейкоцитов составляет 50% от контроля. К 17-м суткам достигает 63% (р>0,05), восстановление показателя до 93% от ис-~ ходного уровня происходит к 21-м суткам. Анализ формулы крови при применении Аг показал, что относительная лейкоцитопения в период наиболее глубокого угнетения реализуется, в основном, за счет лимфоцитов. Количество нейтрофилов на 3-5-е сутки составляет 54 и 43% от контроля, соответственно, а к 10-м суткам, наоборот, резко возрастает более чем в 2 раза и составляет 208% (р<0,05). Другие исследованные показатели (гемоглобин, гематокрит, эритроцитарные индексы, тромбокрит и др.) на протяжении всего срока наблюдения существенно не изменялись. Таким образом, после в/б введения Аг в разовой дозе 200 мг/кг (суммарно 600 мг/кг) при ежедневном троекратном курсе у животных с лимфоид-ным типом кроветворения на фоне относительной длительно восстанавливающейся лейкопении, за счет лимфоцитопении выявлен отсроченный нейтрофилез.

Гематологическая токсичность комбинаций с Аг. Проведено сравнительное изучение гематологической токсичности эффективных на моделях рака легкого комбинаций ЕРАг, 1РАг, ТРАг и ТАг. В качестве контроля использовали показатели кроветворения интактных мышей. Исходный средний уровень лейкоцитов во всех группах составлял 7,72 х 109/л. Во всех группах комбинированного воздействия {ЕРАг, 1РАг, ТРАг, ТАг) на 3-7 сутки выявлена лейкопения со снижением общего числа лейкоцитов до 26-56% от контроля, при этом в группах ЕРАг и ТАг отмечали более быстрое восстановление количества лейкоцитов (к 10 суткам). После применения 1РАг общее количество лейкоцитов восстанавливалось только к 17-м суткам (рис. 1). Наиболее глубокая и длительная лейкоцитопения наблюдалась после

Сутки

—«— ЕРАг - -«- ■ РАг —ТРАг —я— ТАг

Рис. 1. Содержание лейкоцитов в периферической крови мышей, на сутки после окончания лечения (* достоверно по отношению к контролю, р<0,05).

введения ТРАг. Так, количество лейкоцитов на 3 сутки снижалось в 4 раза (26% от контрольного значения) и было достоверно (р<0,05) ниже, чем в группе ЕРАг. На 17 сутки количество лейкоцитов составило 64%, что достоверно ниже (р<0,05) уровня лейкоцитов при применении ЕРАг, 1РАг и ТАг. При применении комбинаций ЕРАг, 1РАг и ТРАг достоверной нейтропении не было (рис. 2). В группе ЕРАг на 10-е сутки зафиксировано достоверное увеличение количества нейтрофилов на 78% (р<0,05) по сравнению с исходным уровнем. Только при применении комбинации ТАг на 3 сутки после введения выявлена кратковременная нейтропения с достоверным снижением числа нейтрофилов до 27% (р<0,05), т.е. более чем в 3 раза по сравнению с исходным уровнем, и восстановлением к 7-м суткам. Другие исследованные показатели (гемоглобин, гематокрит, эритроцитарные индексы, тром-бокрит и др.) на протяжении всего срока наблюдения существенно не изменялись.

Сутки

— ЕРАг —РАГ ■ -«- - ТРАГ —*—ТАг

Рис. 2. Содержание нейтрофилов в периферической крови мышей, на сутки после окончания лечения (* достоверно по отношению к контролю, р<0,05).

ЕРАг в использованных дозах демонстрирует относительно мягкую и кратковременную гематологическую токсичность, что было достигнуто снижением дозы Е до -'/«МПД. При использовании более высокой дозы Е может возрастать относительная лимфоцитопения. Для снижения риска гематологической токсичности при добавлении Аг к ЕР целесообразна коррекция доз всех препаратов.

IP А г представляется наименее токсичной комбинацией, причиной чего может быть относительно низкая гематологическая токсичность I. Тем не менее, выявленная гематологическая токсичность IP в клинике, а также представленные ранее данные о достоверном уменьшении величины токсической дозы I при добавлении Аг также диктуют необходимость осторожного подбора доз препаратов при применении тройной комбинации в клинике.

ТРАг в изученных дозах в сравнении с другими комбинациями обладает наиболее высокой гематологической токсичностью. Одним из путей коррекции осложнения может быть измёг нение режима применения комбинации.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В работе представлены результаты доклинического изучения эффективности и токсичности новых схем ПХТ с включением Ar. Использованные экспериментальные модели не являются строго соответствующими определенным клиническим формам рака легкого, поскольку искусственный характер перевиваемых опухолевых моделей (в том числе и ксенографтов опухолей человека) обусловливает такое изменение биологических свойств, что гистологическая структура перестает быть фактором, достоверно определяющим эффективность химиотерапии. В то же время изученные модели существенно отличаются друг от друга по ключевым характеристикам (кинетика опухолевого роста, чувствительность к химиотерапии и др.), что позволяет говорить об их сходстве с некоторыми клиническими нозология-ми. Так, модель LLC, рекомендованная для доклинического изучения противоопухолевых цитостатиков и их комбинаций с прогностической значимостью для клинической химиотерапии солидных новообразований, характеризуется высокой чувствительностью к препаратам, сопоставимой с чувствительностью к ним MPJI в клинике [Pujol J.L. et al, 2000; Пере-водчикова Н.И., 2005; Niell H.B. et al, 2005].

Ar является одним из наиболее перспективных препаратов для совместного применения с Т, I, Е и Р, поскольку в этом случае соблюдаются все принципы комбинирования цитостатиков: они обладают доказанной эффективностью при MPJ1; различными механизмами действия и разными спектрами токсических эффектов [McCabe F.L., Johnson R.K, 1994; Guichard S. et al, 1998; De Cesare M. et al, 2000; Nam С. et al, 2006].

Полученные результаты позволили выявить наиболее эффективные комбинации: двухком-понентную ТА г и 4 трехкомпонентные комбинации EP Ar, IPAr, ТРАг, GPAr, показавшие на модели LLC сопоставимую эффективность. Терапия с использованием отобранных комбинаций в эффективных переносимых дозах и режимах позволяет добиться частичного, а в случае трехкомпонентных комбинаций — полного излечения мышей с развившимся LLC. На модели PJI67 комбинация GPAr оказалась достоверно менее эффективной по сравнению с другими трехкомпонентными схемами. Показано также, что Ar в разовой дозе 100 мг/кг троекратно существенно ухудшает переносимость G в разовой дозе 60 мг/кг и приводит к гибели 88% животных, тогда как монотерапия G в указанной дозировке не вызывает гибели при сохранной массе тела. Это позволяет считать комбинацию GPAr в изученных дозах при использованном режиме применения менее перспективной по сравнению с другими.

Использование трех моделей рака легкого показало, что в изученных комбинациях невозможно выявить основной цитостатик, а следует говорить лишь о наличии или отсутствии изменения эффекта при комбинированном применении препаратов. Так, в реализации противоопухолевого эффекта ТАг на модели НС основную роль играет Т, а на модели РЛ4 повышение эффективности комбинированного лечения происходит, в основном, за счет Аг. Особое внимание обращает на себя равно высокий противоопухолевый эффект в большом диапазоне доз как Аг, так и других препаратов, что свидетельствует о терапевтической активности комбинации даже при невысоких дозах (например, в комбинации ЕРАг 1/3-1/12 МПД для Е и 1/6-2/3 для Аг). Существенное увеличение эффективности комбинации РАг после добавления Е в дозе, которая в монотерапии существенно не ингибирует рост опухоли, возможно, обусловлено способностью Е останавливать клеточный цикл в С2/М-фззе и, соответственно, синхронизировать популяцию опухолевых клеток [УатаисЫ Н. е/ а1, 2009]. При изучении гематологической токсичности во всех группах комбинированного воздействия {ЕРАг, 1РАг, ТРАг, ТАг) глубина лейкоцитопении на 3-7 сутки после окончания введения препаратов была достоверно (р<0,05) меньше, чем при введении аранозы в высокой дозе (26-55% от контрольных значений), при этом в группах ЕРАг и ТАг отмечали более быстрое восстановление количества лейкоцитов (к 10 суткам). После применения 1РАг общее количество лейкоцитов восстанавливалось только к 17-м суткам. Наиболее глубокая и длительная лейкоцитопения наблюдалась после введения ТРАг. Так, количество лейкоцитов на 3 сутки снижалось в 4 раза (26% от контрольного значения) и было достоверно (р<0,05) ниже, чем в группе ЕРАг. На 17 сутки количество лейкоцитов составило 64%, что достоверно ниже (р<0,05) уровня лейкоцитов при применении ЕРАг, 1РАг и ТАг. Восстановление наблюдали только к 21-м суткам.

Таким образом, в настоящей работе выявлены эффективные комбинации различных противоопухолевых препаратов с Аг, ориентированные на лечение МРЛ. Показана на мышах безопасность отобранных сочетаний с учетом основного вида лимитирующей токсичности — гематологической и с прогнозом общей переносимости лечения.

выводы

1. Двойные комбинации аранозы с цисплатином, этопозидом, иринотеканом, топотеканом " или гемцитабином на моделях рака легкого животных и/или человека достоверно более эффективны по сравнению с монотерапией.

2. Среди двойных комбинаций только топотекан+араноза вызывает излечение 50% мышей с карциномой легкого Льюис (р<0,05).

3. Тройные комбинации на основе сочетания араноза+цисплатин с добавлением этопозида, иринотекана, топотекана или гемцитабина эффективнее двойных по критерию излечения мышей с карциномой легкого Льюис (р<0,05).

4. Тройные комбинации с основой араноза+цисплатин и этопозидом, иринотеканом или то-потеканом в сравнении с отдельными препаратами или двойными сочетаниями более эффективны на модели рака легкого человека РЛ4. Комбинация этопозид+цисплатин+араноза более эффективна, чем прототип — этопозид+цисплатин (р<0,05).

5. Араноза в однократной дозе 100 мг/кг не вызывает усиления общей токсичности циспла-тина, этопозида и топотекана, но достоверно увеличивает количественную токсичность иринотекана в 1,3 раза (р<0,05).

6. Комбинация араноза+топотекан и трехкомпонентные схемы на основе аранозы и циспла-тина с включением этопозида, иринотекана или топотекана имеют лучшие терапевтические характеристики для клинического изучения при мелкоклеточном раке легкого.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Покровский B.C. Доклиническое изучение комбинаций аранозы с цисплатином и иринотеканом на модели рака легкого / Покровский B.C., Лесная H.A., Романенко В.И., Трещалина Е.М. // Вопросы онкологии. — 2009.—№3.—том 55, —С. 341-344.

2. Покровский B.C. Эффективность и переносимость комбинаций с включением этопозида, цисплатина и аранозы при лечении эпидермоидной карциномы легкого Льюис у мышей / Лесная H.A., Покровский B.C., Романенко В.И., Трещалина Е.М. // Российский биотерапевтический журнал. — 2009. — №3. — С. 69-74.

3. Покровский B.C. Перспективы развития комбинированной химиотерапии диссеминированного мелкоклеточного рака легкого / Покровский B.C., Трещалина Е.М., Бычков М.Б. // Российский биотерапевтический журнал. — 2009. — №3. — С. 61-68.

4. Покровский B.C. Эффективность и переносимость комбинаций аранозы с цисплатином и гемцитабином на модели рака легкого / Покровский B.C., Лесная H.A., Романенко В.И., Трещалина Е.М. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2009. — №12. — С. 674-677.

5. Покровский B.C. Эффективность комбинаций аранозы с цисплатином и ингибиторами топоизомераз на подкожных гетеротрансплангатах рака легкого человека / Покровский B.C., Лесная H.A., Андронова Н.В., Трещалина Е.М. // Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. — 2010. — №1. — С. 35-39

6. Покровский B.C. Эффективность и переносимость комбинации аранозы с топотеканом на мышах с перевиваемым раком легкого / Покровский B.C., Лесная H.A., Романенко В.И., Трещалина Е.М. // Сибирский онкологический журнал. — 2010. — №2. — С. 20-23.

7. Покровский B.C. Эффективность и переносимость комбинаций аранозы с цисплатином и топотеканом в эксперименте / Покровский B.C., Лесная H.A., Романенко В.И., Трещалина Е.М. // Российский онкологический журнал.'— 2010. — №3. — С. 22-24.

8. Покровский B.C. Гематологическая токсичность некоторых схем комбинированной терапии с включением аранозы / Покровский B.C., Трещалин М.И., Бодягин Д.А., Трещалина Е.М. // Экспериментальная и клиническая фармакология. —2010. — №5. — С. 36-40.

9. Патент РФ №2365370. Способ лечения рака легкого / Лесная H.A., Покровский B.C., Романенко В.И., Трещалина Е.М. Заявлено 29.04.08. — 8 с.

10. Патент РФ №2367436. Способ лечения рака легкого / Лесная H.A., Романенко В.И., Покровский B.C., Трещалина Е.М., Преображенская М.Н. Заявлено 26.05.08. — 5 с.

11. Pokrovsky V.S. A new triplet of combined chemotherapy with irinotecan, cisplatin and aranoza for lung cancer therapy / Pokrovsky V.S., Lesnaya N.A., Romanenko V.l., Treshalina H.M. // Abstract book of 20th International Congress of Anti-Cancer Treatment. Paris, 2009. — P. 379.

12. Покровский B.C. Предварительные результаты доклинического изучения эффективности и переносимости комбинаций этопозид + цисплатин и этопозид + цисплатин + араноза на модели карциномы легкого Льюис / Покровский B.C., Лесная H.A., Романенко В.И., Трещалина Е.М. // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», М-, 21-22 апреля 2009 г. — Российский биотерапевтический журнал. — 2009. — №2. — С. 14.

13. Покровский B.C. Предварительные результаты доклинического изучения эффективности и переносимости комбинаций ирииотекан + цисплатин и иринотекан + цисплатин + араноза на модели карциномы легкого Льюис / Покровский В.С, Лесная H.A., Романенко В.И., Трещалина Е.М. // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», М., 21-22 апреля 2009 г. — Российский биотерапевтический журнал. —2009. — №2. — С. 14.

14. Покровский B.C. Результаты доклинического изучения эффективности и переносимости комбинации топотекан + араноза на модели карциномы легкого Льюис / Покровский B.C., Лесная H.A., Романенко В.И., Трещалина Е.М. // Материалы IV региональной конференции молодых ученых-онкологов им. Н.В. Васильева. — Сибирский онкологический журнал. —■ 2009. — С. 159.

15. Покровский B.C. Сравнительное изучение эффективности и переносимости трехкомпонентных комбинаций с аранозой на модели внутримышечно трансплантированной карциномы легкого Льюис / Покровский В.С, Лесная H.A., Романенко В.И., Трещалина Е.М. // Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», Нижний Новгород, 18-19 мая 2010 г. — Российский биотерапевтический журнал. — 2010. — №2. — С. 76.

Подписано в печать 28.05.10 Формат 60x84/16 Бумага офисная «5уе1оСору». Тираж 100 экз. Заказ № 477 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

-2228 0

2009129145

1.1. Актуальность проблемы

Рак легкого представляет собой одну из наиболее распространенных форм злокачественных новообразований и занимает первое место в структуре онкологической заболеваемости и смертности мужчин в России [8]. Эффективность полихимиотерапии (ПХТ) немелкоклеточного рака легкого (HMPJI) не превышает 30-40%, мелкоклеточного рака легкого (MPЛ) достигает 80%, и практически у всех больных развивается рецидив или появляются отдаленные метастазы. В связи с этим разработка новых схем ПХТ для лечения рака легкого представляется актуальной.

В лечении как MPJI, так и HMPJI основную роль играют комбинации на основе препаратов платины. Помимо препаратов платины, при раке легкого показана эффективность ингибиторов топоизомеразы II (этопозид), топоизомеразы I (иринотекан, топотекан), производных нитрозомочевины (нимустин), противоопухолевых антибиотиков (адриамицин, амрубицин), таксанов, винкаалкалоидов и некоторых других препаратов.

В отделении химиотерапии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН была разработана схема A VP (ACNU+vepeside+platidiam; нимустин+этопозид+ цисплатин), высокоэффективная при MPJI и, что особенно важно, активная при наличии метастазов в головной мозг [41]. Несмотря на высокую эффективность A VP, для схемы характерна выраженная гематологическая (в том числе отсроченная) токсичность, вызванная нимустином. Это определяет целесообразность поиска других препаратов из класса нитрозопроизводных, обладающих меньшей гематологической токсичностью.

Араноза (Аг) — отечественный препарат из класса производных нитрозомочевины. По сравнению с другими препаратами, для аранозы характерны больший диапазон терапевтических доз, отсутствие выраженной гематологической токсичности, а также хорошая сочетаемость с другими противоопухолевыми препаратами [23, 31, 32, 35]. В настоящей работе в качестве комбинантов для сочетания с аранозой использованы высокоэффективные при MPJI противоопухолевые препараты: этопозид (Е), иринотекан (I), топотекан (7), гемцитабин (G) и цисплатин (Р), обладающие различными механизмами действия и спектрами побочных эффектов.

Разработка новых схем ПХТ с использованием аранозы и различных цитостатиков, эффективных при раке легкого может расширить химиотерапевтические возможности лечения этой патологии. Это исследование актуально также для фундаментальной науки, поскольку описывает новые биологические феномены взаимодействия и совместимости препаратов в новых комбинациях и чувствительности к ним известных моделей опухолевого роста.

Выводы

1. Двойные комбинации аранозы с цисплатином, этопозидом, иринотеканом, топотеканом или гемцитабином на моделях рака легкого животных и/или человека достоверно более эффективны по сравнению с монотерапией.

2. Среди двойных комбинаций только топотекан+араноза вызывает излечение 50% мышей с карциномой легкого Льюис (р<0,05).

3. Тройные комбинации на основе сочетания араноза+цисплатин с добавлением этопозида, иринотекана, топотекана или гемцитабина эффективнее двойных (излечение до 100% мышей с карциномой легкого Льюис, р<0,05).

4. Тройные комбинации с основой араноза+цисплатин и этопозидом, иринотеканом или топотеканом в сравнении с отдельными препаратами или двойными сочетаниями более эффективны на модели рака легкого человека РЛ4.

5. Араноза в однократной дозе 100 мг/кг не вызывает усиления общей токсичности цисплатина, этопозида и топотекана, но увеличивает количественную токсичность иринотекана.

6. Комбинация араноза+топотекан и трехкомпонентные схемы на основе аранозы и цисплатина с включением этопозида, иринотекана или топотекана имеют лучшие терапевтические характеристики для клинического изучения при мелкоклеточном раке легкого.

1.3. Заключение

За последние 30 лет химиотерапия MPJI достигла значительных успехов. В клиническую практику прочно вошли около 20 препаратов, относящихся к различным классам: комплексные соединения платины, ингибиторы топоизомераз I и II, антрациклиновые антибиотики, таксаны, хлорэтиламины, антиметаболиты пиримидинов. Не потеряли своего значения при комбинированном лечении этой патологии и нитрозопроизводные мочевины. Однако ни одна из существующих схем лечения, ни, тем более, монохимиотерапия, не позволяют добиться устойчивого эффекта и удовлетворительных отдаленных результатов лечения. Именно по этой причине стандарты лечения MPJI периодически пересматриваются. При этом преимущество отдается удовлетворительно переносимым комбинациям с высокой эффективностью. Поскольку известные ранее трехкомпонентные комбинации, несмотря на терапевтические преимущества, имели выраженные побочные эффекты, в 1990-х годах признанным стандартом химиотерапии MPJI была схема ЕР, которая в последние годы вытесняется комбинацией IP. Таким образом, основой для лечения MPJI в схемах ПХТ являются комплексные соединения платины.

Аранозу можно считать одним из наиболее перспективных кандидатов на включение в схемы ПХТ, поскольку она отличается относительно мягкой гематологической токсичностью, большим диапазоном терапевтических доз и высокой эффективностью в сочетании с противоопухолевым препаратами различного механизма действия, особенно с препаратами платины.

Для подготовки новых комбинаций с аранозой к клиническому изучению важно оценить их эффективность и безопасность в эксперименте. Эта задача облегчается известными данными о клинической эффективности различных комбинаций с включением нитрозопроизводных, в частности, нимустина, а также описанием эффективных доз и режимов применения препаратов в монотерапии. Анализ клинической эффективности потенциальных комбинантов для аранозы показал, что наиболее перспективно использование препаратов, активность которых при раке легкого доказана. На этом основании выбор кандидатов для сочетаний с аранозой или с дуплетом араноза+цисплатин сделан в пользу этопозида, иринотекана, топотекана и гемцитабина. Важно, что в литературе имеются также сведения о потенциальных рисках применения препаратов при лечении MPJI как в монорежиме, так и в схемах ПХТ. Наиболее значимым побочным эффектом большинства схем, особенно с включением нитрозопроизводных, является гематологическая токсичность. Следовательно, исследование, направленное на подготовку новых комбинаций с аранозой к клиническому изучению, должно включать экспериментальное обоснование эффективности и переносимости новых комбинаций, особенно, отсутствие высокой гематологической токсичности.

Таким образом, имеющиеся данные экспериментальных и клинических исследований аранозы и современных схем лечения рака легкого свидетельствуют о недостаточной эффективности комбинаций, и возможность улучшения отдаленных результатов лечения связана с разработкой новых схем ПХТ.

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Животные

В опытах использовали 978 мышей-самцов гибридов первого поколения BDF\, 90 линейных мышей-самцов С57В1, 330 здоровых мышей-самцов Balb/c массой тела не менее 18 г из разведения РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН или питомника РАМН «Столбовая», а также 228 мышей-самцов Balb/c nude массой тела 18-22 г разведения РОНЦ РАМН.

Мышей BDF\, Balb/c и C^Bl содержали в виварии с естественным освещением на брикетированном корме и постоянном доступе к воде. Перед лечением мышей распределяли на группы (п=6-14). В одной группе мышей препараты не вводили и считали ее контрольной (п=10-12).

Мышей Balb/c nude разводили и содержали в специализированном кондиционированном отсеке с избыточным притоком стерилизованного на входе воздуха, в стерильных условиях при естественном освещении на брикетированном корме («Мэст», РФ), стерильной бумажной подстилке и постоянном доступе к стерильной воде (конвенциональные условия содержания). Манипуляции с мышами выполняли под ламинарами. Перед лечением мышей распределяли на группы (п=10-14). Одну из групп оставляли без лечения и считали контрольной (п=10-12).

2.2. Опухолевые модели

Использованы 3 модели рака легкого: мышиные метастазирующие — эпидермоидная карцинома легкого Льюис (LLC) и полиморфноклеточный рак легкого РЛ67; а также подкожные ксенографты рака легкого человека РЛ4, полученные из культуры клеток эпителиоподобного рака легкого А549 {Cat KoCCL-185 ATCQ [44, 46, 52]. Модели LLC и РЛ4 широко применяются в экспериментальной онкологии для доклинической оценки противоопухолевой активности как новых препаратов, так и их комбинаций [78, 99]. Модель РЛ67 при относительно медленном росте подкожных узлов отличается низкой чувствительностью к химиотерапии и полиорганным метастазированием — в легкие, почки, сердце, яичники и надпочечники. Эта модель использована при изучении тех комбинаций, которые вызвали излечение мышей с LLC с целью оценки уровня эффективности на более агрессивной модели [21, 39].

В опытах использованы 2-15-й пассажи LLC, 3-й пассаж PJI67 и 8-15-й пассажи PJI4 in vivo. Штаммы LLC и PJI67 поддерживали на мышах-самцах C57B16 при в/м трансплантации, в опыт опухоль трансплантировали в/м или подкожно (п/к) мышам-самцам BDFj. Штамм PJI4 поддерживали на мышах-самцах Balb/c nude при п/к трансплантации, в опыт опухоль трансплантировали п/к. Трансплантацию опухолей выполняли по стандартной методике, принятой в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН [46, 52]. 2.3. Препараты

Араноза (Аг) лиофилизированная («ГЛЭС», РФ) во флаконах по 500 мг; вводили в 1% концентрации в дозах 50, 75, 100, 150, 200 мг/кг.

Этопозид (£) инъекционный раствор («TEVA», Нидерланды) вводили в 0,1% концентрации при разовых дозах 2,5; 5,0; 10,0; 15,0 мг/кг. Режим и в/б путь введения был выбран при учете клинической практики троекратного введения этопозида в течение цикла ПХТ и данных [77], согласно которым введение мышам с лейкозом Р388 этопозида в/б в эквивалентных дозах равноценно или даже несколько превосходит по эффекту в/в введение при сопоставимой переносимости.

Цисплатин (Р) инъекционный раствор («Ebeve», Польша) вводили в 0,025% концентрации разовых дозах 2,5 или 3,0 мг/кг. В/б путь введения был выбран на основании данных [73], согласно которым на модели L1210 цисплатин в терапевтических дозах более эффективен при в/б пути введения, чем при в/в при сопоставимой переносимости.

Иринотекан (7) инъекционный раствор («ТЕУА», Аргентина) вводили в 0,3-0,6% концентрации в дозах 20, 30, 40, 60 и 100 мг/кг. Максимальная терапевтическая доза и в/б путь введения были выбраны согласно данным

64] показавшим, что при в/б пути введения иринотекан более эффективен и значительно менее токсичен, чем при в/в введении.

Топотекан (7) лиофилизированный {«Glaxo Smith Kline», Великобритания) вводили в 0,008-0,04% концентрации в разовых дозах 0,5; 0,75; 1,0; 2,0; 2,5; 5,0; 10,0 мг/кг. В/б путь введения был выбран с учетом данных о том, что при в/в и в/б введении эффективность и переносимость топотекана одинакова, а пероральное введение топотекана оказывается не всегда эффективным [92].

Гемцитабин (G) лиофилизированный («Eli Lilly», Франция) применяли в 1% концентрации при однократном введении в дозах 100, 200 или 300 мг/кг в/б, при троекратном — в разовой дозе 60 мг/кг в/б (суммарная доза 180 мг/кг). Кратность введения была выбрана при учете режимов применения препарата в клинике.

Все препараты вводили в/б на 2-4-е сутки после п/к трансплантации опухоли или на 7-10-е (10-12-е) сутки после в/м трансплантации. Этопозид, иринотекан, топотекан, гемцитабин и цисплатин вводили в 0,9% растворе натрия хлорида, аранозу — в 5% растворе глюкозы. В опытах на модели LLC этопозид, цисплатин и аранозу вводили троекратно с интервалом 24 ч, иринотекан — однократно, топотекан — однократно или троекратно с интервалом 24 ч, гемцитабин — однократно или троекратно с интервалом 72 ч. В опытах на модели PJI4 этопозид, цисплатин, аранозу и топотекан вводили 2-кратно с интервалом 48 ч, иринотекан — однократно.

В группах комбинированного лечения препараты вводили в последовательности: [этопозид, иринотекан, топотекан или гемцитабин] -цисплатин — араноза с интервалом 10-20 мин. 2.4. Оценка противоопухолевого эффекта

Эффективность лечения мышей с LLC и PJI67 оценивали по стандартным критериям: торможению роста опухоли (ТРО%), увеличению продолжительности жизни (УПЖ%) и излечению животных. Значимыми считали ТРО>50%, УПЖ>25%; в опытах на PJI4 использовали критерий Т/С<42% «treatment/control» [46, 52]. Излеченными считали животных, у которых в течение 60-90 дней опухоль не определялась. Показатели эффективности определяли в сравнении с контрольными группами мышей.

2.5. Оценка переносимости лечения у мышей с опухолью

О переносимости химиотерапевтического воздействия судили по состоянию и поведению мышей. При этом фиксировали достоверное уменьшение массы тела (>30%) и селезенки (косвенные признаки общей, гематологической и иммунотоксичности), а также гибель от токсичности. Павших или умерщвленных передозировкой эфирного наркоза мышей подвергали аутопсии для визуального определения патологических изменений внутренних органов. Селезенку взвешивали на торсионных весах с ценой деления 20 мг и рассчитывали массовые коэффициенты.

2.6. Оценка токсикомодифицирующего действия аранозы в двойных комбинациях

Опыты проведены на интактных мышах Balb/c. Для определения токсикомодифицирующего действия аранозу в дозе 100 мг/кг (—1/4 МПД) в/б вводили однократно через 1—3 мин после изучаемого препарата [35]. Модифицируемые препараты вводили в/б однократно в следующих дозах:

• цисплатин — в 0,1-0,3% концентрации в дозах 9; 12; 15; 18; 21 мг/кг;

• этопозид — в 0,5-2,0% концентрации в дозах 30; 60; 90; 120; 150 мг/кг (в монорежиме) и 30; 60; 75; 90; 105; 120; 150 мг/кг (в сочетании с аранозой);

• иринотекан— в 2% концентрации в дозах 120; 180; 210; 240; 270; 300; 360 мг/кг (в монорежиме) и 100; 120; 180; 240; 300; 360 мг/кг (в сочетании с аранозой);

• топотекан— в 0,2-1,0% концентрации в дозах 12; 17; 22; 27; 32 мг/кг (в монорежиме) или 12; 17; 22; 27; 32; 34 мг/кг (в комбинации с аранозой).

Учитывая циркадные ритмы и зависимость токсичности препаратов от введения в разное время суток [25, 87], опыты проводили в осенне-зимний период, введение препаратов выполняли в 10-11 ч утра.

Для оценки влияния аранозы на токсичность модифицируемых препаратов в сравниваемых группах мышей оценивали общее состояние, особенности поведения, потребления корма и воды, изменения в физиологических отправлениях, количество павших животных, сроки гибели и динамику массы тела, а также изменение массы селезенки. За состоянием и поведением животных наблюдали в течение 3 ч после введения каждой пары препаратов и затем ежедневно в течение 60 дней. Взвешивали животных один раз в 5 дней на электронных лабораторных весах «CAS MW-II» с ценой деления 0,1 г. Выживших после введения препаратов животных умерщвляли на 60-е сутки путем передозировки эфирного наркоза. Затем проводили вскрытие и аутопсию внутренних органов, визуально оценивая наличие патологических изменений. Селезенки извлекали и взвешивали на электронных весах, как описано выше.

Количественную токсичность каждого препарата отдельно или в сочетании с аранозой определяли по методу наименьших квадратов с использованием пробит-анализа. Для каждого модифицируемого препарата и его сочетания с аранозой рассчитывали величину токсических доз (ЛД16, ЛД50, ЛД84 и ЛДюо) при помощи компьютерной программы «StatPlus-2006» [1]. О наличии токсикомодифицирующего действия судили по изменению величины ЛД5о препарата в сочетании с аранозой. 2.7. Оценка гематологической токсичности

Гематологическую токсичность сочетаний изучали на здоровых мышах линии Balb/c. Аранозу вводили троекратно в разовых дозах 100 мг/кг (в комбинациях EPAr, IPAr, ТРАг, ТАг), суммарная доза 300 мг/кг. Комбинанты вводили по схемам: • цисплатин — троекратно в дозе 2 мг/кг (суммарная доза 6 мг/кг);

• этопозид — троекратно в дозе 5 мг/кг (суммарная доза 15 мг/кг);

• иринотекан — однократно в дозе 30 мг/кг;

• топотекан — троекратно в дозах 0,5 мг/кг в комбинации ТРАг или 0,75 мг/кг в комбинации ТАг (суммарные дозы 1,5 и 2,25 мг/кг, соответственно).

Контрольной группе мышей в/б вводили 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида троекратно.

Учитывая характер гематологической токсичности аранозы, взятие крови из хвостовой вены выполняли в течение 38 суток на следующие сроки: день 0 (фон), 3-й, 5-й, 7-й, 10-й, 14-й, 17-й, 21-й, 24-й, 31-й и 38-й дни после введения. Общее количество лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитарную формулу определяли при помощи автоматического гематологического анализатора «Abacus Junior vet» (Австрия). Для морфологического исследования клеток периферической крови проводили микроскопическое исследование мазков после фиксации в метаноле и окраски азур II—эозином. Кроме того, оценивали концентрацию гемоглобина, гематокрит, эритроцитарные индексы, тромбокрит и средний объем тромбоцитов.

2.8. Статистическая обработка

Для выполнения экспериментов составляли группы численностью, достаточной для проведения статистического анализа и расчета показателей достоверности. Статистическую обработку полученных данных проводили по методу Фишера-Стьюдента в модификации Р.Б. Стрелкова, рассчитывая доверительные интервалы средних сравниваемых величин. Достоверными считали различия при р<0,05.

Глава 3. Эффективность и переносимость комбинаций с аранозой на моделях рака легкого мышей

3.1. Эффективность и переносимость препаратов в монотерапии на модели LLC

Для оценки эффективности ПХТ предварительно определили диапазон эффективных и переносимых доз каждого из препаратов на мышах с п/к LLC. Курс лечения начинали через 48 часов после п/к трансплантации LLC. Эффективными считали дозы, приводящие на 5—15 сутки после окончания лечения к ТРО >50%.

Терапевтические дозы и режимы введения препаратов подбирали с учетом кратности введения препаратов в клинике, данных об острой токсичности препаратов у мышей, а также об активности изученных другими авторами схем введения препаратов в монотерапии или в составе схем ПХТ [14, 28, 43, 82, 128]. Были использованы следующие дозы: этопозид — 5 или 15 мг/кг троекратно; иринотекан — 20, 40, 60 или 100 мг/кг однократно; топотекан — 1 или 2 мг/кг троекратно либо 2,5; 5; 10 или 15 мг/кг однократно; гемцитабин — 60 мг/кг троекратно либо 200 или 300 мг/кг однократно; цисплатин — 3 мг/кг троекратно, араноза — 100 или 200 мг/кг троекратно.

Полученные данные представлены в табл. 1. Видно, что эффективность иринотекана, цисплатина и аранозы была практически одинаковой, ТРО max составило 87, 85 и 83% соответственно. Эффективность этопозида была меньше и даже при максимальной дозе 15 мг/кг троекратно не достигла уровня аранозы и цисплатина, ТРОтах составило 70%. Монотерапия топотеканом или гемцитабином была более эффективной, чем применение других препаратов. При троекратном введении топотекана в дозах 1 или