Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Исследования по оптимизации производства и стандартизации лиофилизированных препаратов на примере противоопухолевых лекарственных средств

На правах рукописи

Клочкова Татьяна Ивановна

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ОПТИМИЗАЦИИ ПРОИЗВОДСТВА

И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ПРИМЕРЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

15.00.01-технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина Российской Академии медицинских наук

Научный консультант: Доктор фармацевтических наук, профессор Пётр Вячеславович Лопатин

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор Иван Иванович Краснюк Доктор фармацевтических наук, профессор Борис Михайлович Пятин Доктор фармацевтических наук, профессор Владимир Алексеевич Северцев

Ведущая организация: Институт контроля лекарственных средств

заседании Диссертационного Совета Д 208.040.09 при Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 208.040.09,

Н.П. Садчикова

ФГУ «НЦ ЭСМН» МЗ РФ, г. Москва

Защита состоится « » ¿2-^ 2005 г. в « /Г,

час на

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. В настоящее время с помощью химиотерапии можно излечить лишь 10 % всех злокачественных опухолей, однако её роль в лечебном процессе постоянно возрастает. Химиотерапия является постоянным компонентом комбинированных и комплексных схем лечения (26,8 %) и химиолучевой терапии (3,4 % больных). Кроме того, химиотерапия часто применяется как единственно возможное паллиативное средство при лечении генерализованного опухолевого процесса. Пред- и после операционная или лучевая адъювантная химиотерапия повышает эффективность этих этапов лечения. В настоящее время, лекарственная терапия является необходимым компонентом лечения злокачественных новообразований, которая улучшает эффективность лечения онкологических больных и применяется во все возрастающих объемах.

Это обуславливает необходимость создания новых противоопухолевых лекарственных средств (ЛС) и внедрение их в промышленное производство.

По виду лекарственных форм (ЛФ) все противоопухолевые препараты делятся в основном на пероральные лекарственные средства, выпускаемые в основном в виде таблеток и парентеральные лекарственные средства, выпускаемые, главным образом, в виде сублимационно-высушенных препаратов. Небольшая группа препаратов выпускается в виде растворов для инъекций или в виде сухой рассыпки порошков для инъекций.

В работах П.В. Лопатина и во временных методических указаниях, действующих в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН представлен порядок организации работ по созданию и изучению новых противоопухолевых ЛС. Предложенный П.В. Лопатиным методический подход к разработке противоопухолевых препаратов даёт общее направление исследований к решению задачи и не учитывает особенностей технологических процессов, используемых при приготовлении лекарственного средства. Решение выше сказанного связано с развитием методических и методологических подходов к разработке противоопухолевых ЛС и современной технологии их производства.

Создание противоопухолевого препарата - сложная многофакторная задача, требующая знания и учета особенностей биологического, фармакологического действия лекарственного вещества (ЛВ), физико-химических характеристик ЛВ и технологии получения ЛФ.

Исходя из особенностей противоопухолевых субстанций - термолабильности, гидролитической неустойчивости, в некоторых случаях высокой гигроскопичности, сублимационная сушка является необходимым элементом технологии получения стабильных противоопухолевых лекарств.

Сублимационная сушка используется в фармацевтической промышленности для получения препаратов для инъекций, глазных капель, липосомальных лекарственных форм, гемостатических губок, трансплантатов и др.

Применение сублимационной сушки в производстве лекарственных средств является одним из способов получения препарата высокого качества. Процесс лиофилизации длителен и энергетически емок. Поэтому разработка экономичного процесса сублимации является крайне важным элементом в промышленном выпуске лекарств.

Государственная Фармакопея СССР XI издания, Фармакопеи США и Великобритании не имеют специальной статьи, регламентирующей требования к качеству лиофилизированных препаратов. По имеющимся требованиям лио-фильно-высушенные препараты относятся к «сухим инъекциям», что определяет перечень показателей качества, используемых в стандартизации данных лекарственных средств.

Однако лиофильно-высушенные препараты имеют ряд особенностей, которые не отражены в общих статьях для инъекционных препаратов. Поэтому совершенствование методов стандартизации, унификация методик и создание общих требований к качеству лиофильно-высушенных лекарств является актуальным.

Сложность проблемы обусловлена высокими требованиями, предъявляемыми на всех этапах создания лекарства, к стандартизации технологических

процессов и качеству готовой продукции с целью производства высокоэффективных и безопасных лекарственных препаратов.

В России имеется опыт по производству противоопухолевых препаратов из группы хлорэтиламинов, антибиотиков, антиметаболитов, но только начиная с 1996 г. в широкую медицинскую практику введен первый отечественный противоопухолевый препарат из группы метилнитрозомочевин (МНМ) - араноза.

Согласно гигиеническим критериям оценки и классификации условий труда по показателям вредности и опасности факторов производственной среды, производство противоопухолевых препаратов относится к 1 классу опасности. Поэтому является необходимым решение вопросов, связанных с утилизацией отходов, безопасностью проведения производственного процесса и организацией профилактических мероприятий, направленных на снижение повреждающего воздействия на персонал.

Всё выше изложенное подчеркивает важность и актуальность исследования по оптимизации технологии получения и стандартизации лиофильно-высушенных препаратов.

Цель работы. Теоретическое и экспериментальное обоснование разработки экономичной технологии лиофильно-высушенных препаратов и стандартизации лиофилизированных субстанций и лекарственных форм.

Задачи исследования.

1. Сформулировать требования к разработке, а также выбору критериев и методов оценки качества лиофильно-высушенных лекарственных средств.

2. Разработать систему технологических решений, использование которой позволит создать экономичную технологию получения лиофилизированных препаратов.

3. Обосновать оптимальные условия замораживания продукта, подлежащего лиофилизации, и исследовать влияние низких температур на качество готового продукта.

4. Исследовать условия интенсификации процесса сублимационной сушки и на этой основе разработать оптимальные процессы лиофилизации проти-

воопухолевых препаратов из группы МНМ, ХЭА, комплексных соединений металлов, препаратов растительного происхождения и препаратов крови.

5. Провести исследования и разработать рекомендации по безопасному ведению технологического процесса получения противоопухолевых лекарственных средств.

Научная новизна исследования.

Выбраны и обоснованы критерии и методы оценки качества лиофилизи-рованных субстанций и лекарственных форм. На основе теоретических и практических данных сформулированы общие требования к качеству лиофильно-высушенных лекарств. Для гармонизации терминологии в определении названия лиофилизированных ЛФ предложено использовать термин «ЛИОФИЛИ-ЗАТ», который является кратким, точным, и обладает информативностью о технологии получения ЛФ или ЛВ и не связан с формой и составом получаемого продукта.

Разработана модель и сформулированы методические указания по разработке инъекционных сублимационно-высушенных препаратов на основе водорастворимых хлорэтиламинов (Утверждены зам. Директора ВОНЦ АМН СССР Морозом Л.В., 1984 г.)

Предложена система технологических решений, которая позволяет комплексно подойти к созданию экономичной технологии получения лиофильно-высушенных препаратов.

Разработаны приемы интенсификации процесса сублимационной сушки с использованием регулирования режимов замораживания, подвода тепла и контролируемого вакуума. На этой основе разработаны оптимальные процессы лиофилизации противоопухолевых препаратов из группы МНМ (араноза, лизо-мустин, БХНМ), комплексных соединений металлов (цисплатин, сетремед), производного антрацендиона (митоксантрон), полисахарида (палюстран) и препарата крови - лимфокинина, которые позволяют получать продукты, соответствующие требованиям ВФС, ФСП и проектов ФСП и обеспечивающие значительный экономический эффект.

Впервые внедрены в широкую медицинскую практику противоопухолевые препараты из группы МНМ - араноза и лизомустин. На основе технологических решений, представленных в данной работе, впервые организовано опытно-промышленное производство субстанции и ЛФ препарата араноза.

Разработаны рекомендации по безопасному ведению технологического процесса получения противоопухолевого препарата - араноза, включающие: утилизацию отходов, профилактику неблагоприятного воздействия препарата на персонал, занятый в производстве, выбор средств индивидуальной защиты персонала.

Новизна полученных результатов подтверждается 2-мя патентами РФ. Практическая значимость работы.

В результате проведенных исследований разработаны и находятся на разных уровнях внедрения, следующие противоопухолевые препараты:

• «Араноза» - субстанция (ФСП 42-0105-0655-00) и лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного введения 0,5 г (ФСП 42-0105-065600), защищен патентом РФ (№ 1683190, 1993 г.). Разрешено медицинское применение и промышленный выпуск субстанции (ОПР от 31.12.99) и лекарственной формы аранозы (ОПР от 30.12.99. и ОПР 17495490-22003). Препарат зарегистрирован в Государственном реестре (приказ МЗ РФ № 432 от 31.12.96. - Р№ 96/432/4 ЛФ аранозы, Р№ 96/432/1 субстанция аранозы; перерегистрация: Р№ 000449/01-2001 - субстанция и Р№ 000449/02-2003 - ЛФ) и введен в перечень жизнено-необходимых препаратов.

• «Лизомустин» - лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного введения 0,1 г (ФСП 42-0105-0867-01) рекомендован к медицинскому применению.

• «Митоксантрон» - лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,02 г (ФСП 42-0105-1261-01) защищен патентом РФ (№ 2093158,1997 г.) и рекомендован к медицинскому применению.

Введение в широкую медицинскую практику новых противоопухолевых препаратов позволяет снизить затраты на лечение больных, расширить ассортимент применяемых в онкологической практике лекарственных средств.

Апробация работы. Материалы исследований представлены на:

Научной конференции «Токсикологические аспекты безопасности готовых лекарственных форм» (Москва, 1981); III Съезде фармацевтов Казахской ССР (Кустанай, 1987); научно-практической конференции «Резервы совершенствования лекарственного обеспечения населения РСФСР» (Владимир, 1991); республиканской конференции «Проблемы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» (Москва, 1991); Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1992,1995,1996,1998); Международной научной конференции «Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности» (Томск, 2000); Central European Symposium on Pharmaceutical Technology (Portoroz, Slovenia, 1997); World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology (Paris, 1998; Berlin, 2000; Florence, 2002); 9th International Pharmaceutics Technology Symposium (Ankara, 1998); 4th European Congress of Pharmaceutical Sciences (Milan, 1998); 3 rd International Symposium on Pharmaceutical Chemistry (Turkey, 2001); 4th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology (Florence, 2002); Межлабораторной конференции ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН - июнь 2004 г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 52 научные работы, получено 2 патента и 1 авторское свидетельство на изобретение.

Связь темы диссертации с плановыми исследованиями ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

Диссертационная работа является частью НИР ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН по проблеме «Злокачественные образования» и связана с планом РАМН по теме: «Создание лекарственных форм противоопухолевых препара-

препаратов и нормативно-технической документации на их производство», государственный регистрационный номер 01.9.60007291.

Основные положения, выносимые на защиту

Комплекс критериев экспериментально-теоретического обоснования технологии и оценки качества лиофилизированных противоопухолевых препаратов из классов МНМ, ХЭА, комплексных соединений металлов, антрацендио-нов, полисахаридов и препаратов крови.

Унифицированный подход к стандартизации лиофилизированных ЛФ для инъекций на примере противоопухолевых препаратов.

Методологические подходы к созданию лиофилизированных лекарственных средств на примере противоопухолевых соединений. Разработка оптимальных процессов лиофилизации противоопухолевых препаратов из группы МНМ, ХЭА, комплексных соединений металлов, препаратов растительного происхождения и препаратов крови.

Теоретическое и экспериментальное обоснование по безопасному ведению технологического процесса получения противоопухолевых лекарственных средств.

Объем и структура диссертации. Диссертация содержит _247_ страниц машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 6-ти глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов, списка литературы, включающего 227_ источников, из них _109_ на иностранном языке, и 30 приложений. Работа иллюстрирована 26 рисунками и 40 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили новые отечественные противоопухолевые соединения и их ЛФ, отобранные в отделе экспериментальной химиотерапии и лаборатории разработки лекарственных форм НИИ экспериментальной диагно-

стики и терапии опухолей (НИИ ЭД и ТО) ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина. В качестве объектов исследования выбраны противоопухолевые препараты, относящиеся к различным классам соединений, таким как производные метилнитро-зомочевины (МНМ) - араноза [3-(а-Ь-арабинопиранозил-1)-1-метил-1-нитрозомочевина], лизомустин [смесь изомеров положения нитрозогруппы: 9-(2-хлорэтил)-7-нитрозо- -гомоцитруллин (1) и 9-(2-хлорэтил)-9-нитрозо гомоцитруллин (2)], БХНМ [1,3-бис(2-хлорзтил)-1-нитрозомочевина]; хлорэти-ламина (ХЭА) - рибонордопан [5-ди-(2-хлорэтил)аминоуридин гидрохлорид]; комплексные соединения металлов - цисплатин /Цис-Дихлородиамминплатина (II)], сетремед [Ь-серинато-Ь-треонинат меди(П)]; препарат растительного происхождения - палюстран [полисахарид, выделенный из наземной части растения Сотагит ра1тШв (сабельник болотный)] и иммунопрепарат - лимфоки-нин (нативный интерликин-2). Качество всех соединений и вспомогательных веществ соответствовало действующей нормативной документации. В исследованиях использованы химико-фармацевтические, физико-химические, химико-аналитические, химиотерапевтические и токсикологические методики. Ряд исследований выполнялся совместно с к.б.н. Перетолчиной Н.М. (отдел экспериментальной химиотерапии, зав. отд. - д.м.н., проф. Герасимова Г.К.) и лабораториями - химико-фармацевтического анализа (зав. лаб. - к.х.н. Кикоть Б.С.), токсикологии (зав. лаб. - Михайлова Л.М.), с д.м.н. Шеренешевой Н.И. (лаборатория нетоксичных иммуномодуляторов) НИИ ЭД и ТО РОНЦ РАМН. Некоторые разделы работы выполнялись совместно с Институтом органического синтеза УрО РАН, г. Екатеринбург под руководством д.х.н. Краснова В.П..

2. СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ

Все рассматриваемые нормативные документы в перечне ЛФ для инъекций включают вещества или порошки для приготовления растворов или инфузий для инъекций. В таблице 1. представлены термины и определения сухих лекарственных форм, которые можно найти в фармакопеях и других нормативных документах. Из табл. 1. видно, что только в Британской Фармакопее (ВР-2004)

вводится термин «лиофильно-высушенные препараты», которые рассматриваются как порошки для инъекций или в/в инфузий.

Таблица 1.

Термины и определения сухих лекарственных форм

Фармакопея или другой нормативный документ Термин Определение

ВР-2004 Лиофильно-высушенные продукты для парентерального применения Порошки для инъекций или в/в инфузий

USP 27-NF 19 Вещества для приготовления инъекций Сухие твердые вещества, которые при добавлении подходящего растворителя образуют растворы, отвечающие всем требованиям растворов для инъекций

ГФХ1 Сухие твердые вещества Порошки, пористые массы, таблетки, которые растворяют в стерильном растворителе непосредственно перед введением

ОСТ 91500.05.001-00 Порошки для инъекций Стерильные твердые лекарственные средства, применяемые для приготовления растворов или суспензий для инъекций

Перечисленные выше термины, используемые для названия лиофилизи-

рованной ЛФ, не обладают краткостью и точностью определения названия ЛФ. Для гармонизации терминологии в определении названия лиофилизированных ЛФ предлагается использовать термин «ЛИОФИЛИЗАТ», который является кратким, точным и обладает информативностью о способе получения ЛС, но не связан с формой, составом и внешним видом получаемого продукта.

По требованиям к нормативной документации лиофильно-высушенные препараты для инъекций относятся к «сухим инъекциям», что определяет перечень показателей качества, используемых в стандартизации данных лекарственных средств. В соответствии с общими требованиями и особенностями технологии лиофилизированных препаратов отобраны следующие основные показатели качества:

Основные показатели качества лиофилизированных препаратов:

1. Описание (Внешний вид)

2. Растворимость

3. Подлинность

4. Средняя масса и однородность по массе

5. Прозрачность

6. Цветность

7. рН

8. Механические включения

9. Посторонние примеси (родственные соединения)

10. Пирогенность или Бактериальные эндотоксины (ЛАЛ тест)

11. Токсичность

12. Стерильность

13. Однородность дозирования

14. Остаточная влажность или потеря влаги при высушивании

15. Остаточные растворители (неводные)

16. Количественное определение

Выделенные показатели зависят от технологии получения продукта.

Критерии качества определяются свойствами продукта, подлежащим высушиванию и технологией получения. На основании собственных исследований и анализа имеющихся данных по стандартизации объектов исследования сделана попытка сформулировать требования к показателям качества лиофили-зированных продуктов. В таблице 2. представлены показатели качества лиофи-лизированных препаратов, зависящие от способа получения и физико-химических свойств исследуемых веществ.

Таблица 2.

Показатели качества лиофилизированных препаратов, зависящие от способа получения

Наименование показателя Зависимость показателя от сушки Критерии показателя качества лиофилизированных препаратов

Описание Продукт принимает форму, которую имеет раствор при замораживании. Сухая пористая масса может иметь трещины и рассыпаться при встряхивании. В результате лиофильной сушки рибонордопана получается продукт, цвет которого варьирует от светло-желтого до зеленовато-желтого. В описании субстанций правильнее вводить термин «лио-филизированный порошок», для ЛФ - «лиофилизирован-ная сухая пористая масса». Цвет полученной массы бывает однородным, четким или с оттенком. Оттенков цвета может быть несколько в зависимости от свойств самого продукта и способа замораживания.

Растворимость Все исследуемые препараты хорошо растворялись в воде или рекомендованном растворителе. Препарат лимфокинин должен растворятся в 3,0 мл дистиллированной воды в течение 3 мин при комнатной температуре и встряхивании. Указывается время полного растворения при получении раствора в соответствии с инструкцией по применению. Раздел «Растворимость» включается при необходимости.

Средняя масса и однородность по массе В случае стандартизации препаратов - араноза и лизому-стин, полученные результаты укладывались в интервале 0,90 - 1,10 для аранозы и в интервале 0,17 - 0,23 для лизому-стина, т.е. допустимое отклонение средней массы продукта составило в два раза большее значение, чем рекомендует ГФ XI (араноза - 10 %, лизому-стин -15 %). Представленные в ГФ XI допустимые отклонения от средней массы содержимого одного сосуда можно использовать для характеристики лиофилизированных одно-компонентных препаратов. Выбор интервала для многокомпонентного состава обусловлен содержанием всех его составляющих. В случае отклонения двух ингредиентов от основного значения на 5 % суммарное отклонение по массе составит 10 %.

Прозрачность Раствор лимфокинина в 3 мл воды может быть прозрачным или слегка опалесцирующим. Определение прозрачности регламентируется ГФ XI. Растворы лиофилизированных препаратов прозрачны, иногда имеет место легкая опа-лесценция, особенно у препаратов белкового происхождения.

Цветность Для препарата араноза введено два эталона цветности № 3 "в" и 3 "г", потому что раствор ЛФ аранозы окрашен в желтый цвет, но при различном освещении возможна слабая флюоресценция раствора, имеющая зеленоватый оттенок. 0,5 % раствор рибонор-допана в воде не превышает интенсивность окрашивания эталонов 5 "б" или 5 "г". Определение цветности раствора проводится согласно требованиям общей статьи ГФ XI или используется СФ- метод, особенно для сильно окрашенных растворов. Некоторые вещества могут иметь два или несколько оттенков у получаемых растворов. Поэтому в разделе Цветность раствора

для этих препаратов вводится два или больше эталонов.

рН Установлено, что в диапазоне значений рН от 2,00 до 2,50 рибонордопан обладает наи- Лиофилизированные препараты могут иметь два показателя значения рН. Основной,

большей устойчивостью в водных растворах. Данное значение рН является не физиологичным. Дополнительно определяется значение рН в прилагаемом растворителе, которое колеблется в пределах 6,0 - 8,0. заданный интервал значений рН, который определяется в воде и интервал значений рН в прилагаемом растворителе.

Однородность дозирования По ГФ XI данный показатель определяется для сухих лекарственных средств для инъекций, масса содержимого сосуда которых составляет 0,05 г и менее. Масса содержимого сосуда лиофильно-высушен-ного препарата не может быть 0,05 г и менее. При массе активного вещества 0,05 г и менее. Во всех случаях определения однородности дозирования отклонение содержания действующего вещества не должно превышать ± 15 %.

Остаточная влажность или потеря влаги при высушивании Увеличение содержания воды в продукте выше 3 % приводит к постепенному гидролизу рибонордопана в процессе хранения и размоканию продукта. Для палюстрана экспериментально установлена остаточная влажность в пределах 12 %. Увеличение содержания остаточной влажности препарата происходит в процессе хранения в результате гигроскопичности ЛФ аранозы, ли-зомустина, сетремеда и др. Остаточная влажность — основной показатель, характеризующий эффективность процесса, а также пригодность препарата к длительному хранению. Числовые показатели влажности продукта зависят от физических свойств препарата. В конце процесса лио-филизации этот показатель не превышает 3 % для большинства продуктов. В процессе хранения возможно увеличение влажности до 10 - 15 %.

Остаточные органические растворители Современные технологии разработки липосомальных ЛФ и использование при растворении ЛВ органических растворителей в качестве сораство-рителей вызывает необходимость вводить этот показатель качества. Данный показатель необходимо включать в нормативный документ, если в процессе получения лиофилизированного продукта использовались органические растворители для получения раствора, подвергающегося в последующем сушке.

Для количественного определения активных ЛВ разработаны спектрофо-тометрические методики, учитывающие особенности химической структуры и функциональных групп. Относительная ошибка разработанных методик количественного определения ЛВ в лиофилизированных ЛФ не превышала ±2 %.

Как отмечалось выше, лизомустин представляет собой смесь изомеров положения нитрозо-группы определенного состава. В связи с тем, что изомеры лизомустина отличаются друг от друга по противоопухолевому эффекту и токсичности, изомерный состав препарата является важнейшим показателем его качества. Для определения изомерного состава лизомустина разработан метод, основанный на разделении его изомеров методом ВЭЖХ. На хроматограмме лизомустин дает два хорошо разрешенных и различающихся по интенсивности пика изомеров (I) и (II) (рис.1.) с временами удерживания 3,8-4,2 мин и 4,9-5,2 мин, соответственно, соотношение площадей которых соответствует соотношению изомеров в препарате. Отнесение пиков сделано по времени удерживания индивидуальных изомеров (I) и (II), полученных по специальной методике. Относительная ошибка среднего результата не превышает ±2,0 %. Содержание изомера (2) в ЛФ лизомустина укладывалось в интервал от 23,0 % до 27,0 %.

А

В

Рис. 1. Хроматограммы разделения изомеров лизомустина в субстанции лизомустина (А) и лекарственной форме (В)

1 - изомер (I); 2 - активный изомер (П) Для обнаружения и определения допустимых норм содержания посторонних примесей в препаратах использовали метод ТСХ. Метод ВЭЖХ, используемый для определения содержания изомеров в препарате лизомустин, не дает информации о содержании специфических примесей в нём.

3. ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ОПТИМИЗАЦИИ ПРОИЗВОДСТВА ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ

По своему принципу лиофилизация является комплексным процессом, на результат которого могут оказывать влияние различные факторы, в том числе и состав раствора, подлежащего сушке. Правильный выбор состава, концентрации раствора, наполнителей, толщины слоя, условий замораживания и сублимации позволяет получить качественный продукт. На рис. 2. представлена схема разработки сублимационно-высушенных препаратов, из которой видно, что при создании лиофилизированной ЛФ необходимо учитывать:

- биологические факторы (способ введения, местные тканевые реакции, биологическая активность, влияние растворов на кровь и белки плазмы);

- физико-химические факторы (собственные физико-химические свойства вещества; фотодинамическая, гидролитическая, термическая стабильность вещества, его гигроскопичность);

- технологические факторы (приготовление растворов, возможность сушки данного состава, способ и продолжительность замораживания, режим сушки, вид первичной упаковки).

3.1. Выбор состава растворов, подлежащих высушиванию

В результате проведенных комплексных исследований и анализа литературных данных выбраны составы ЛФ исследуемых препаратов, которые подвергали сушке (табл. 3.). Дополнительно, на основании рекомендаций клиницистов, попробовали увеличить дозировку лизомустина в 1 флаконе ЛФ. Максимальная концентрация цитостатика, которая может быть получена в единице упаковки, ограничена - плохой растворимостью лизомустина в воде, вместимостью первичной упаковки (до 20 мл) и объемом высушиваемого раствора. Поэтому, дополнительно изучили состав, содержащий повышенное количество лизомустина, и новый состав, содержащий лактозу. Для увеличения дозировки лизомустина в ЛФ до 0,25 г предложено готовить раствор, содержащий заведо-

Рис. 2. Схема разработки сублимационно-высушенных противоопухолевых препаратов

мый 0,5 % избыток субстанции лизомустина, который позволяет получить необходимую 3 % концентрацию раствора.

Таблица 3.

Составы растворов, которые подвергали сушке

Состав для сушки Кол-во Назначение Литературный

ингредиентов ингредиента источник

(в г на 100 мл

воды)

Араноза 10,0 Действующее вещество Краснова М.А. и

ПВП 10,0 Формообразователь и др.,1979;

стабилизатор Клочкова Т.И. и

Кислота сорбиновая 0,008 Коррекция значения рН др., 1986, 1988,

1993; Мкртчян

Т.В. и др., 1987;

Лопатин П.В. и

ДР., 1987

Лизомустин 2,0/3,5 Действующее вещество Мкртчян Т.В.,

Полиглюкин или 2,0 Формообразователь 1988

Декстран Сыропятова

Кислота лимонная 0,1 Коррекция значения рН, Е.Б., 1991

солюбилизатор

Лизомустин 2,0 Действующее вещество

Лактоза 1,0 Формообразователь

Кислота лимонная 0,1 Коррекция значения рН,

солюбилизатор

Рибонордопан 5,0 Действующее вещество Клочкова Т.И. и

Натрия хлорид 7,26 Стабилизатор др., 1979,1981,

1982

Митоксантрон 2,0 Действующее вещество Оборотова Н.А.,

ПВП 6,0 Формообразователь Клочкова Т.И. и

Кислота лимонная 0,1 Коррекция значения рН др., 1999,1999

Сетремед 10,0 Действующее вещество Игнатьева Е.В.,

2001

БХНМ 0,5 Действующее вещество Оборотова Н.А. и

ПВП 20,0/10/5 Формообразователь и др., 1996, 2000

стабилизатор Сыропятова

Спирт этиловый 95 % 5,0 мл Сорастворитель Е.Б., 1991

Лимфокинин 170 000 ME Действующее вещество Разработка лабо-

Полиглюкин 5,3 Формообразователь ратории клеточ-

ного иммунитета

РОНЦ АМН

Цисплатин 0,1 Действующее вещество ВНИХФИ.1978 .

Маннит 0,5 Формообразователь ,

Сорбит 0,5 Формообразователь

Натрия хлорид 0,9 Стабилизатор и

формообразователь

Состав лизомустина, содержащий лактозу, проявил тот же противоопухолевый эффект на Ь 1210 (УПЖ 80-100 %), что и ЛФ лизомустина с декстра-ном. Излеченные животные забиты через 2,5 - 3 месяца наблюдения без признаков заболевания.

3.2. Изучение влияния растворов исследуемых веществ на кровь

При разработке состава ЛФ для внутрисосудистых инъекций одним из критериев оценки ЛФ является совместимость их с кровью, т.к. взаимодействие лекарственного средства как с плазмой, так и с форменными элементами крови может стать причиной нежелательных осложнений.

Определение совместимости растворов с кровью проводили с изотониро-ванными растворами с целью исключения осмотического гемолиза. Механический гемолиз учитывался в контрольном опыте с изотоническим раствором натрия хлорида.

Таблица 4.

Сравнительное изучение гемолитического действия растворов

противоопухолевых препаратов

Исследуемый раствор Значение рН раствора Величина оптической плотности Примечание

Натрия хлорид 0,9 % 5,0-7,0 0,143 Контрольный раствор, осадок эритроцитов правильной формы и красного цвета

Лизомустин 0,5 % раствор, изотонированный натрия хлоридом 5,5-6,0 0,096 Осадок эритроцитов не отличается от контроля

Лизомустин 1,0 % раствор, изотонированный натрия хлоридом 4,0 - 5,0 0,162 Осадок эритроцитов не отличается от контроля

Рибонордопана - 0,0250 Натрия хлорида - 0,0364 Воды для инъекций - 5 мл 1,9-2,0 2,505 Полный гемолиз эритроцитов

Рибонордопана- 0,0250 Натрия хлорида - 0,0364 Натрия фосфата Двузамещенного - 0,0210 Воды для инъекций - 5 мл 5,0 - 7,0 0,055 Осадок эритроцитов не отличается от контроля

Полученные данные показывают, что растворы лизомустина не обладают гемолитическим и денатурирующим действием на мембрану эритроцитов. Ри-бонордопан в изотонированном растворе обладает специфическим действием на мембрану эритроцитов, в результате которого происходит полный гемолиз последних. Добавление эквимолярного количества нейтрализующих веществ -натрия гидрокарбоната, натрия гидроксида, натрия фосфата двузамещенного увеличивает значение рН растворов до 5,0 - 7,0 и приводит к снятию гемолиза. Наличие неизмененного осадка эритроцитов по сравнению с контролем свидетельствует о том, что денатурация белков эритроцитов не наблюдается. Следовательно, в состав лекарственной формы рибонордопана необходимо вводить нейтрализующее вещество, увеличивающее значение рН раствора до 5,0 - 7,0.

Окончательный выбор растворителя для введения препарата в кровеносное русло сделан на основе изучения местно-тканевых реакций при внутривенном введении. В таблице 5. представлен перечень растворителей, рекомендованных для применения совместно с исследуемыми препаратами.

Таблица 5.

Перечень рекомендованных растворителей

Наименование Рекомендованный Значение рН Примечание

препарата растворитель

Араноза 5,0 % раствор глюкозы 3,0-4,5 —

Лизомустин 5,0 % раствор глюкозы 3,0-4,5 —

Рибонордопан 0,42 % раствор натрия фосфата двузамещенного 2,0-2,5 (в воде) 6,0-8,0 (в растворителе) Растворитель входит в комплект вторичной упаковки

Митоксантрон 0,9 % раствор натрия хлорида 3,0 - 4,0 —

Сетремед 0,9 % раствор натрия хлорида 7,5-8,0 —

Такие растворители как 5,0 % раствор глюкозы и 0,9 % раствор натрия хлорида, которые широко используются в медицинской практике, не включали в комплект вторичной упаковки. Специальные растворители, такие как 0,42 %

раствор натрия фосфата двузамещенного, вводили в комплект вторичной упаковки.

3.3. Технология приготовления растворов сложного состава

При проведении 2-ой фазы клинического изучения противоопухолевых препаратов возникла необходимость масштабирования производства, т.е. пересмотра и усовершенствования имеющейся технологии с целью увеличения выхода продукции и сокращения потерь сырья и материалов.

Первоначальный способ приготовления «концентрата» предусматривал использование весо-объёмного способа с доведением раствора до заданного объема. Приготовление большего количества раствора (например, до 3 литров) по этой методике затруднительно. Поэтому экспериментально определили коэффициент замещения ПВП и аранозы и в дальнейшем готовили растворы с использованием точного количества растворителя. Коэффициент увеличения объема водного раствора при растворении ПВП и аранозы составил 0,67 мл/г для обоих соединений, количество аранозы берется в пересчете на 100 % вещество.

Коэффициент увеличения объема водного раствора при растворении по-лиглюкина и лизомустина составил 0,25 мл/г для обоих соединений, количество лизомустина берется в пересчете на 100 % вещество.

Чтобы избежать сильного распыления порошков аранозы, лизомустина, их сначала смачивали небольшим количеством растворителя, а затем, смывая, полностью переносили в ёмкость для растворения. Сравнительный анализ различных серий ЛФ аранозы и лизомустина показал, что при приготовлении концентрата можно использовать стеклянные и эмалированные емкости без ухудшения качества готовой продукции.

3.4. Выбор фильтрующих материалов

Особенностью технологии инъекционных противоопухолевых препаратов является использование метода стерилизующей фильтрации, что обусловлено высокой реакционной способностью и термолабильностью лекарственных веществ. Для этой цели используют фильтры различных фирм и марок.

С целью расширения ассортимента стерилизующих мембран изучали возможность использования фильтров "МИНрог" марки 08 и ОУИР (поливини-лидендифторид), "Владипор" МФА-А1 (целлюлозы ацетат), "Мифил" (капрон). Фильтры оценивали по двум параметрам: скорость фильтрования и устойчивость действующих веществ при контакте с мембранами разных марок.

Наибольшая скорость фильтрования достигалась при использовании фильтров марки GSWP и незначительно снижалась в ряду "Мифил" > ОУИР > МФА-А1. Ни материал мембран, ни возможные следы химических реагентов не оказывают существенного влияния на стабильность растворов лизомустина и аранозы. С точки зрения ускорения стадии фильтрования, наиболее оптимальными являются фильтры марки GSWP, которые, однако, могут быть заменены отечественными стерилизующими мембранами. Для фильтрования раствора аранозы можно использовать мембраны марок ОУИР и «Мифил».

Для растворов БХНМ для стерилизующей фильтрации лучше использовать мембранные фильтры, изготовленные из полимеров, устойчивых к воздействию спирта этилового, который входит в состав прописи раствора БХНМ. Поэтому для стерилизующей фильтрации растворов БХНМ рекомендовано использовать фильтры на основе поливинилидендифторида (ОУИР), капрона (Мифил) или аналогичных материалов.

3.5. ИССЛЕДОВАНИЕ И ВЫБОР УСЛОВИЙ ЗАМОРАЖИВАНИЯ

При определении и выборе условий замораживания растворов, подлежащих высушиванию необходимо:

- определить температуру замораживания раствора;

- изучить влияние продолжительности замораживания на качество готового продукта;

- выбрать способ замораживания;

- исследовать устойчивость растворов при низких температурах.

3.5.1. Определение температуры замораживания

Определение температуры замораживания проводили с использованием термического метода, электрометрического анализа и экспертных оценок.

Пример замораживания смеси в воздушной охладительной среде представлен на рис. 3. На кривой замораживания видно эвтектическое разделение раствора и его полное замерзание в области температур (-35 + -40) °С, что и является эвтектической зоной 5,0 % раствора рибонордопана. Результаты проведенного исследования позволяют считать, что процесс замораживания раствора рибонордопана протекает в соответствии с литературными данными [Лыков А.В., 1968] и имеет периоды - охлаждения, переохлаждения, кристаллизации и понижения температуры.

Этим же методом определены зоны эвтектики для растворов лизомусти-на, аранозы и БХНМ, которые находятся в области температур - для лизому-стина и БХНМ (-20 т -25) °С; для растворов аранозы - (-25 -г- -28) °С.

Температуру замораживания для лимфокинина выбрали на основе литературных данных [Подольский М.В., 1973], учитывая то, что эвтектическая температура для сыворотки крови составляет -37 °С.

Для 1,0 % раствора палюстрана проведен электрометрический анализ значения криогидратной температуры. На рис. 4. представлена зависимость электрического сопротивления (Rm) от температуры (tm) 1,0 % раствора палю-страна с отмеченным значением криогидратной температуры равной -28

°С. Поэтому значение температуры, достигаемое в термическом центре замораживаемого препарата, принято равным -30 °С -35 °С.

По данным ДСК представленным в докладе фирмы «Edwards» [Мартинис СМ., 1975], следует, что в 10 % растворе ПВП после кристаллизации 78 % воды, 22 % содержащейся воды взаимодействует с ПВП, которая приводит к образованию стекловидной массы. Переход в стекловидную форму происходит при температуре -22 °С. Ниже температуры этого перехода вещество находится

Рис. 3. Кривая замораживания водного раствора РНД (5,0 %)

с натрия хлоридом (7,28 %) в воздушной охладительной среде

Рис. 4. Зависимость электрического сопротивления (Кш) от температуры (1ш) 1,0 % раствора палюстрана

в твердом состоянии. Поэтому, для растворов, содержащих ПВП, приняли температуру замораживания в пределах (-40 -г -45) °С.

3.5.2. Выбор способа замораживания

Дробное замораживание использовали при производстве субстанций ара-нозы и палюстрана в сочетании с быстрым замораживанием в жидкой охладительной среде. Данный способ замораживания применяли при пристеночном замораживании растворов в ёмкостях объёмом 500 мл. При сушке субстанции аранозы в поддонах использовали сочетание замораживания в морозильнике и на полке в сублимационной установке. В таблице 6. представлены режимы дробного замораживания субстанций - палюстрана и аранозы.

Таблица 6.

Режимы дробного замораживания субстанций

Наименование препарата Замораживание в жидкой охладительной среде Замораживание в воздушной охладительной среде Замораживание в сублимационной установке

Температура, °С Время, час Температура, °С Время, час Температура, •с Время, час

Араноза -60 0,5 -40 От 6 до 24 -40+-45 2

-60 0,5 - - -40+ -45 4

- - -40 До 6 -40 + -45 2

Палюстран -70 0,25 -40 От 2 до 24 и дольше -30+ -35 2

Для замораживания ЛФ препаратов использовали непрерывное замораживание в камере лиофильной установки.

3.5.3. Влияние продолжительности замораживания на качество готового продукта Для разработки экономичного процесса лиофилизации необходимо не только определить нужный режим сушки, но и выбрать экономичный режим замораживания.

В таблице 7. представлены данные показывающие, что качество готового продукта может зависеть от продолжительности замораживания.

Таблица 7.

Зависимость качества готового продукта от продолжительности и способа замораживания

Наименование Способ Продолжитель- Качество готового

объекта замораживания ность заморажи- продукта

исследования вания, час.

Араноза-субстанция Дробное 3-4 Соответствует требованиям ФСП

Дробное 6-7 Соответствует требованиям ФСП

Дробное 24-26 Появление карамелизованного продукта, увеличение времени растворения в воде

Непрерывное 3-5 Соответствует требованиям ФСП

Араноза -лекарственная Непрерывное 3-5 Соответствует требованиям ФСП

форма Дробное 4-6 Соответствует требованиям ФСП

Дробное 24-26 Появление карамелизованного продукта, увеличение времени растворения в воде

Это исследование позволило выбрать оптимальный режим замораживания субстанции и лекарственной формы аранозы, продолжительность которого не должна превышать 6-8 часов. Возможно использование непрерывного и дробного замораживания Оптимальным является непрерывное замораживание на полке сублимационной установки - температура (-40 -¡- -45) °С, с последующим выдерживанием при этой температуре 3-4 часа. Из полученных данных сделано заключение, что образование карамели свойственно самой аранозе.

На основе ряда сушек и оценки качества готовой продукции выбраны оптимальные и экономичные режимы замораживания исследуемых препаратов. В таблице 8. представлены параметры замораживания для растворов, имеющих толщину слоя до 10 мм, при увеличении толщины слоя время замораживания

увеличивалось, но период выдерживания препарата при низкой температуре соответствовал показателю, представленному в таблице 8.

Таблица 8.

Параметры замораживания препаратов в сублимационной установке

Наименование препаратов Способ замораживания Температура полки, °С Время, час Примечание

Араноза -субстанция Дробное -40 + -45 3-4 Общее время 6 часов

Непрерывное -40 + -45 3-4 Не более 6 часов

Араноза - ЛФ Дробное -40 +-45 3-4 Не более 6 часов

Непрерывное -40 + -45 3-4 Не более 6 часов

Лизомустин Непрерывное -40 +-45 3-4 -

БХНМ То же -40 + -45 3-4

Палюстран Дробное -40 * -45 3-4 Общее время от 6 до 24 часов

Цисплатин Непрерывное -40 -45 4-5

Мнтоксантрон Тоже -40+ -45 3-4

Сетремед Тоже -30 4- -35 3-4

Лимфокинин Тоже -35 + -40 3-4

3.5.4. Изучение устойчивости растворов при низких температурах

Время замораживания растворов в среднем составляет 3-4 часа, но может быть увеличено до нескольких суток в случае возникновения аварийных ситуаций. Поэтому для получения качественного продукта в процессе сублимации необходимо изучить устойчивость растворов при длительном хранении при низких температурах.

Промышленное производство препаратов из группы НАМ только сейчас начинает развиваться в связи с введением в медицинскую практику новых противоопухолевых препаратов - араноза и лизомустин. Поэтому исследование стабильности этих лекарственных средств при низких температурах является актуальным. Концентрация и пропись растворов аранозы и лизомустина соответствовали растворам, используемым в производстве ЛФ.

Таблица 9.

Динамика изменения концентрации НАМ при температуре -45 °С

Препарат Начальная концентрация, г/мл Среднее значение коэффициента регрессии, г/мл

Араноза 0,1 +0,00008

Лизомустин 0,02 -0,000012

БХНМ, содержащая - 20 % ПВП 10 % ПВП 5 % ПВП 0,005 -0,000008 -0,0000002 -0,000006

Таблица 10

Свойства растворов НАМ после хранения при температуре -45 °С в течение 3 недель

Препарат Прозрачность раствора после оттаивания Изменения в качестве лиофилизированного продукта

Араноза Прозрачный раствор Образование карамелизованного продукта. Увеличение времени растворения.

Лизомустин Прозрачный раствор Увеличение содержания дополнительных примесей.

БХНМ, содержащая - 20 % ПВП Прозрачный раствор

БХНМ, содержащая • 10 % ПВП Осадок и помутнение раствора начиналось через 5-7 суток хранения при низкой температуре -

БХНМ, содержащая - 5 % ПВП Помутнение после оттаивания. Наличие осадка в виде тонких игольчатых кристаллов, которые самостоятельно растворялись в течение суток при комнатной температуре или мгновенно в 96 % спирте этиловом -

Для растворов БХНМ проводили параллельные исследования растворов, содержащих 20, 10 и 5 % ПВП, с целью установления зависимости между количеством вспомогательного вещества и стабильностью БХНМ при низких температурах. Из данных, представленных в табл. 9, видно, что коэффициенты уравнения регрессии для всех производных НАМ незначительны.

Таким образом, концентрация изученных производных НАМ в растворе не меняется при температуре (-40 + -45) °С в течение 3 недель. Однако длительное хранение исследуемых растворов при низких температурах сказывалось на других свойствах растворов (табл.10.). Длительное хранение растворов НАМ при низких температурах не желательно. В экстренных ситуациях возможно хранение при низкой температуре растворов аранозы с последующими перерастворением, замораживанием и сушкой.

3.6. ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ СУБЛИМАЦИОННОЙ СУШКИ РАСТВОРОВ

Основное влияние на скорость сушки продукта оказывает процесс подвода тепла к продукту и величина вакуума в сублимационной установке. Определение этих параметров позволяет разработать экономичный режим сублимации продукта.

3.6.1. Изучение влияния температурного режима на скорость процесса лиофилизации

На сублимационных установках тепло к продукту передается в основном за счёт проводимости, и лишь незначительная часть - за счёт излучения. Передача тепла за счёт проводимости регулируется законом Фурье: (ёТ/ёх), где скорость передачи тепла непосредственно определяется градиентом температуры (ёТ/ёх) и термической проводимостью (к). В этом случае движущей силой по передаче тепла от нагревающих полок к замороженному продукту является разница температур между полкой и продуктом.

Скорость процесса лиофилизации зависит от режима подвода тепла к продукту на стадии первичного обезвоживания. Начальная температура сушки

определяется температурой эвтектики и возможностями используемого оборудования, конечная температура определяется свойствами препарата. Режим подвода тепла в процессе сушки определяется индивидуально для каждого препарата и зависит от множества факторов, в том числе от природы продукта, его количества, толщины замороженного слоя и других.

Режимы сублимационных сушек противоопухолевых препаратов различных химических групп (НАМ, палюстрана, лимфокинина, цисплатина и др.) отработаны на установках Минифаст Б-0.2 (Италия) и Ь/-9.2 (Фригера, Чехия), имеющих следующие основные характеристики: температура десублиматора не хуже -65 °С; предельное абсолютное давление в сублиматоре не выше 5-10 Па. Качество высушенного продукта оценивали по основным физико-химическим показателям согласно нормативно-технической документации.

В таблице 11. представлены основные температурные параметры сублимационной сушки противоопухолевых препаратов различных химических соединений и составов. Для определения продолжительности сушки за «период основной сушки» приняли промежуток времени, когда температура продукта достигала температуры полки. На первом этапе сушки при удалении основной влаги для субстанций - аранозы и палюстрана давали максимальную температуру нагрева полок, которую после достижения продуктом температуры 0 °С снижали до температуры, поддерживаемой на протяжении всего периода досушивания. В случае БХНМ подвод тепла осуществляли дробно. Сначала сушку проводили при температуре полки О °С, которую после достижения продуктом этой температуры доводили до +20 °С. Скорость подвода тепла составила в этом случае 1,0 °С/мин на каждом этапе повышения температуры.

Для препаратов - араноза и лизомустин, палюстран, митоксантрон, сет-ремед и лимфокинин - оптимальная скорость подвода тепла - 1 °С/мин. Для препарата цисплатин скорость подвода тепла составила 5 °С/час. Интенсивный подвод тепла к полкам позволил значительно сократить период основной сушки до 10 - 13 часов в случае сетремеда, митоксантрона, лимфокинина и палюстрана, до 18 - 19 часов в случае аранозы и лизомустина и до 45 часов в случае

цисплатина. Общее время основной сушки для БХНМ составило 24 часа.

В качестве примера, на рис. 5. представлен график сушки ЛФ митоксан-трона, аналогичный график получается при сушке ЛФ сетремеда и лимфокини-на; на рис. б. - график сушки субстанции аранозы. Рисунки отображают два переменных показателя: температура полки и температура продукта. Остальные показатели процесса сушки оставались без дополнительных изменений.

Таблица 11.

Основные температурные параметры сублимационной сушки

Наименование Температура Максимально Скорость Период

препарата продукта, "С допустимая подвода основной

температура тепла, сушки, час

нагрева, "С •С/мин

Араноза - -40,0+-45,0 +40,0 1,0 18,0

субстанция 0 + +20,0 +20,0

Араноза - ЛФ -40,0 +-45,0 +20,0 1,0 18,0

Палюстран - -40,0+-45,0 +60,0 1,0 13

субстанция 0 + +30,0 +30,0

Лизомустин — ЛФ -40,0+-45,0 +20,0 1,0 19,0

Цисплатин - ЛФ -40,0 +-45,0 +20,0 5,0 "С/час 45,0

Лимфокинин - ЛФ -40,0 ' +20,0 1,0 10,0

Сетремед - ЛФ -40,0+-45,0 +20,0 1,0 6,0-7,0

Митоксантрон - ЛФ -40,0+-45,0 +20,0 1,0 7,0-8,0

БХНМ - ЛФ -40,0+-45,0 0,0 1,0 18,0

0 + +20,0 +20,0 1,0 3,0

Е = 22-24

Продолжительность всего процесса сублимации, включая процесс замораживания и досушивания, для препаратов показана в таблице 12. Использование интенсивного подвода тепла при сушке для: аранозы - субстанция, ЛФ -митоксантрона, сетремеда, лимфокинина и цисплатина оказалось вполне достаточным, чтобы получить оптимальной режим сушки и экономический эффект от 20 до 50 %. Толщина высушиваемого слоя не превышала 10 мм.

Качество полученной продукции соответствовало показателям действующей на момент разработки режимов сушки нормативно-технической документации (ВФС или ФСП).

а

г?

с 2 V

Н

30 20 10 О

-30 -40 -50

/ У ✓

; ✓

•

1 2/3 4 ,.1г - 5 в 7 ✓ ✓ —Ж 8 9 10

/

/ ✓ '

А---А"

Время, час

Рис. 5. График сушки лекарственной формы митоксантрона

... Температура полки _ ▲ „Температура продукта

и 30

о

я 20

а.

£ 10

я

о. 0

ш

с 10

0>

Н 20

30

■40 ■

-50 J

------------\

I

-I-1-1-1-1--1—т—I—'

1 13 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27

О

I . О

I

Время, час

Рис. 6. График сушки субстанции аранозы

— — Температура полки

— о- Температура продукта

Таблица 12.

Продолжительность процесса сублимации препаратов

с использованием интенсивного подвода тепла

Наименование Объем Тол- Про- Общее время

препарата высу- щина должи- сушки,час

шивае- слоя, тель- Интен- По Экономиче-

мой про- мм ность сивный ЛТР* ский эффект,

дукции, основ- подвод или час, (%)

л ной сушки, час тепла ОПР**

Араноза-субстанция 5,0 10 18 26-27 —

Араноза - ЛФ 2,0 10 18 26-27 34* 7-8 (20-23)

Сетремед - ЛФ 0,5 5 6-7 14-15 24* 9-10 (38-42)

Митоксантрон-ЛФ 0,5 5 7-8 15-16 —

Лимфокинин-ЛФ 0,2 10 10 17-18 40* 22-23 (55-57)

Палюстран 5,0 10 13 29-30 —

- субстанция

Цисплатин - ЛФ 2,0 10 45 70-75 100** 25-30 (25-30)

3.6.2. Использование контролируемого вакуума в оптимизации процесса лиофилизации продукта

При очень глубоком вакууме теплопередача от нагревательных пластин к продукту осуществляется только излучением, теплопроводность и конвекция газов в этом случае очень слабы. Поэтому температуру пластин нужно сильно повышать для обеспечения подвода к продукту необходимого тепла с целью поддержания температуры сублимации в допустимых пределах.

Контролируя давление в камере сублимационной установки, можно управлять коэффициентом теплопередачи между пластиной нагрева и продуктом. Для обеспечения повышения давления в камере лиофильной сушки в ходе фазы сублимации самым оптимальным способом является инжекция неконденсирующегося газа, такого как воздух или азот.

Разработку режимов сушки с использованием инжекции воздуха для изменения вакуума проводили на установках - Минифаст Б-0.2 (ЕёуагЛз, Италия) и Ь/-9.2 (Фригера, Чехия), имеющих следующие основные характеристики:

температура десублиматора не хуже -65 °С; возможность нагрева полок до +60 °С, наличие специального инжектора для припуска воздуха.

Использование контролируемого вакуума применили для составов содержащих ВМС, когда толщина высушиваемого слоя больше 10 мм, или тогда, когда оба фактора присутствуют одновременно. Из представленных данных (табл. 13.) видно, что применение контролируемого вакуума позволяет сократить технологический процесс получения сублимационно-высушенных препаратов на 5 - 8 часов и получить экономический эффект от 15 до 26 %.

Таблица 13.

Продолжительность процесса сублимации препаратов с использованием интенсивного подвода тепла и контролируемого вакуума (в пределах 40 45 Па)

Наименование Объём, Тол- Продол- Общее время сушки, час

препарата л щина житель-

слоя, ность ос- С кон- По Экономи- .

мм новной троли- ЛТР* ческий

сушки, час руемым вакуумом или табл. 12** эффект, час, (%)

Араноза - ЛФ 2,0 10 11-12 20-22 26-27** 4-7(15-26)

Палюстран - субстанция 5,0 10 10 22-24 29-30** 7-8 (23-27)

Лизомустин -ЛФ (0,1 г) 2,0 10 13 21-22 36* 8-9 (22-26)

Лизомустин -ЛФ (0,25 г) 4,0 15 17 25-26 —

Однако, следует заметить, что интенсификация сушки за счет контролируемого вакуума зависит и от состава высушиваемого препарата. Так, например, применение контролируемого вакуума в случае ЛФ БХНМ, содержащей до 20 % ПВП и 5 % спирта этилового, приводило к ухудшению качества готового продукта.

В результате разработаны оптимальные и экономичные режимы сушки ЛФ - аранозы, лизомустина и субстанции палюстрана. На рис. 7. и 8. представлен график сушки ЛФ лизомустина. Рис. 7. отображает два переменных показателя - температуру полки и температуру продукта, на рис. 8. представлен

Время, час

Рис. 7. График сушки ЛФ лизомустина 0,25 г

---Температура полки, град. С

—*—Температура продукта, град. С

Время, час

1 2 3 4 5 6 7 в 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Рис. 8. График изменения вакуума при сушке ЛФ лизомустина 0,25 г

-♦-Значение вакуума, Па

показатель вакуума в процессе сушки. Качество полученной продукции соответствовало показателям нормативно-технической документации (ВФС или ФСП), действующей на момент разработки режимов сушки. Разработанные режимы сублимационной сушки субстанции и ЛФ аранозы и лизомустина использованы при опытно-промышленном производстве этих препаратов, режим сушки палюстрана использован при его наработке для предклиниче-ского изучения.

4. РАЗРАБОТКА МЕРОПРИЯТИЙ ПО БЕЗОПАСНОСТИ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ

Токсичность противоопухолевых препаратов представляет опасность для медицинского персонала, для работников фармацевтической и химической промышленности. При передаче этих соединений для промышленного производства необходимо решить следующие задачи:

- разработать методики направленной деструкции противоопухолевых препаратов с целью получения не токсичных продуктов разложения;

- разработать методики определения противоопухолевых веществ в сточных водах и в воздухе рабочей зоны;

- на основе экспериментальных или экспертных оценок разработать рекомендации по обеспечению безопасности производства и оптимальных санитарно-гигиенических условий труда работающих, провести выбор индивидуальных средств защиты;

- разработать меры профилактики, позволяющие повысить общую сопротивляемость организма человека к неблагоприятным факторам, связанным с общим токсическим действием цитостатиков.

4.1. Способы утилизации отходов на примере препарата «АРАНОЗА»

В задачи исследования входило определение устойчивости улучшенных образцов аранозы в водных растворах и поиск оптимальных условий дезактивации этого препарата. Стабильность аранозы определяли спектрофо-

тометрическим методом, который характеризуется хорошей воспроизводимостью и точностью выполнения. Для изучения устойчивости аранозы в растворах готовили 2,5 % и 10,0 % растворы субстанции аранозы в воде и в растворителе, используемом для приготовления лекарственной формы.

Таблица 14.

Относительное содержание аранозы в водных растворах после экспозиции при УФ-свете при температуре +20 °С

Время, час 10,0 % раствор аранозы 2,5 % раствор аранозы

0 100,0 100,0

1 98,6 99,9

2 98,0 97,4

3 96,2 97,4

24 92,2 92,6

48 89,3 86,0

Проведенное исследование показало, что субстанция аранозы с 98 % содержанием основного действующего вещества, получаемая с использованием сублимационной сушки, относительно устойчива в водных растворах. Аналогичные результаты получены и для растворов, используемых для приготовления лекарственной формы.

Изучение действия щелочных растворов (NaOH и №2СОз) в концентрациях 5 % и 0,5 % показали, что полное разложение аранозы наблюдается через 3 часа даже при концентрации щелочей 0,5 % (рН среды 10-11). Слабощелочной раствор NaHCCb (рН среды 8,0-9,0) действует гораздо слабее. Минимальное время, необходимое для полного разложения аранозы в растворах, составляет 3 часа при использовании 0,5 % растворов NaOH и Nа2СОз и 24 часа при применении 5,0 % раствора №НСОз.

Следовательно, для дезактивации отходов производства аранозы можно использовать 0,5 % растворы NaOH и №2СОз Основными продуктами разложения аранозы в этом случае является пергидро^-арабинопиранозо-(1,3^1)-оксазинон-2 и метиловый спирт [Муханов В.И. и др., 1984].

С учётом того, что в процессе производства лекарственных средств используется перекись водорода возникла необходимость исследовать реакцию взаимодействия аранозы с перекисью водорода.

10 % раствор аранозы в воде смешивали с 3 % раствором перекиси водорода в соотношении 1:1 и выдерживали в темном месте при комнатной температуре. УФ-спектр поглощения аранозы в смеси с перекисью водорода снимали через каждые 24 часа до полного разложения препарата. По данным УФ-спектроскопии полное разложение аранозы в смеси с перекисью водорода происходит через 144 часа. После полного разложения аранозы измеряли значение рН реакционной смеси (рН 0.6) и доводили значение рН смеси до 6.0 и 7.0 титрованием 0,1 N раствором едкого натра (потенциометриче-ское определение значения рН). Полученный раствор разливали по 5 мл во флаконы вместимостью 20 мл, замораживали и лиофилизировали. Высушенные образцы представляли собой массу белого цвета, хорошо растворимую в ДМСО и метаноле, затем их исследовали методом ЯМР.

Учитывая большую информативность спектров 13С по сравнению с'Нв данном случае основным методом идентификации соединений выбран ЯМР13С. Анализ полученных данных показал, что в спектрах ЯМР13С продуктов окисления аранозы отсутствуют сигналы, относящиеся к сигналам исходной аранозы. Среди имеющихся в спектре ЯМР13С сигналов наиболее интенсивными являются семь сигналов при 26.8, 68.0, 69.9, 71.4, 74.9, 83.3 и 160.9 м.д. По-видимому, они принадлежат веществу, являющемуся основным продуктом разложения аранозы. Симуляция углеродных спектров ЯМР соединений по их структурной формуле с помощью программы ACD/CNMR Predictor позволила предположить, что веществом, которому удовлетворяют приведенные выше параметры, с большей долей вероятности, может быть 3-D-арабинопиранозил-1-метилмочевина (АПММ). Съемка спектров 13С{Н} и DEPT-135 раствора АПММ в CD3OD подтвердила данное предположение. Более того, добавление в раствор с продуктами разложения аранозы некото-

рого количества АПММ приводит к полному совпадению и росту в спектре ЯМР13С описанных выше сигналов.

Аналогичным способом доказано присутствие среди продуктов разложения аранозы небольших количеств метилмочевины и L-арабинозы. С некоторой натяжкой можно предположить наличие альдегидной и NHCH3-группе N-метилформамида. Оставшиеся сигналы в спектре 13С{Н} в области от 60 до 100 м.д. можно интерпретировать как сигналы смеси продуктов конденсации арабинозы и родственных соединений. Более определенный вывод о строении этих соединений сделать в данном случае не представлялось возможным из-за их низкой концентрации в растворе.

4.2. Определение НАМ в жидких отходах производства

Для обнаружения метилнитрозомочевины (МНМ), БХНМ и лизому-стина в жидких отходах исследована возможность обнаружения низких концентраций НАМ в водных и водно-спиртовых растворах методом ВЭЖХ. Работы проводились на хроматографе «Милихром 4-УФ» (Россия) с детектированием при длине волны 230 нм. Длина колонки 62 мм, внутренний диаметр 2 мм, адсорбент Separon С-18 (Чехия) с размером частиц 5 мкм, эффективность 1200 - 1500 т. т.. Температура колонки - комнатная. В качестве подвижной фазы для определения лизомустина и МНМ использовали смесь: этанол 95 % - 0,01 М водный раствор КН2РО4 (1 : 9), скорость элюирования 100 мкл/мин. Для определения следов БХНМ в качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и воды в соотношении 1:1, скорость элюирования 100 мкл/мин. Определена возможность достоверного обнаружения (соотношение сигнал/шум = 3) МНМ в концентрации 0,1 мг/л, БХНМ в концентрации свыше 0,2 мг/л и изомеров лизомустина в концентрациях от 0,25 мг/л (по изомеру, содержащемуся в большем количестве). При анализе сточных вод со всех стадий получения исследуемых соединений наличие примесей, не влияло на результаты определения.

4.3. Защита персонала от воздействия противоопухолевых препаратов (Экспертная оценка)

По данным зарубежной литературы, всему медицинскому и фармацевтическому персоналу, работающему с противоопухолевыми препаратами, необходимо соблюдать меры предосторожности. Например, работать рекомендуется в перчатках, используя маски и защитные средства для глаз (Knowles R.S., Virden J.E., 1980; Jagun Olabisi et all, 1982; Waksvik H. et all, 1981). По мнению Jagun 01. et all (1982), использование халатов с длинными рукавами, перчаток из поливинилхлорида, масок, и защита глаз уменьшат вредное воздействие цитостатиков на персонал. Кроме того, подготовка препарата для введения больному должна проводится в вытяжных ламинарных установках, а использованные шприцы, пузырьки от лекарства и ампулы требуют специальных средств для их удаления.

Безопасность производства противоопухолевых препаратов регламентируется строительными и санитарно-гигиеническими нормами на стадии проектирования и эксплуатации производственных мощностей.

На основе экспертно-аналитических оценок, можно дополнить практические рекомендации по защите персонала от неблагоприятного воздействия противоопухолевых препаратов в случаях непосредственного контакта с ними следующими положениями.

Коллективные меры защиты:

- Медицинский персонал, а также персонал, производящий противоопухолевые препараты, должен иметь полную информацию о наличии канцерогенных, мутагенных, раздражающих свойств у препарата с которым они работают.

- Работу с препаратами необходимо проводить под вытяжным шкафом. Одним из необходимых условий работы с противоопухолевыми препаратами является максимальная герметизация процесса.

- Обязательны полное удаление рассыпанного порошка или пролитого раствора и обработка загрязнённых поверхностей.

- Обработку загрязнённой спецодежды, инструментария, посуды необходимо проводить в течение 3-6 часов.

- К техническим тербованиям следует отнести установку фильтров для улавливания выбросов в рабочую зону и атмосферу окружающей среды.

Приведённые ниже рекомендации по работе с противоопухолевыми препаратами являются общими для любых противоопухолевых лекарств.

Индивидуальные меры защиты:

- Персонал должен избегать контактов с инъекционными препаратами, порошками, защищая руки, глаза и дыхательные пути.

- Работа обязательно проводится в перчатках и в одежде имеющей длинные рукава. Для работы с препаратами из группы НАМ лучше использовать перчатки из поливинилхлорида (Jagun 01. et all, 1982).

- При работе необходимо надевать респиратор. Глаза нужно защищать специальными очками.

- Участки кожи, контактирующие с препаратом, обрабатывают мылом и водой.

Эти действия будут способствовать снижению неблагоприятного воздействия противоопухолевых препаратов на медицинский и фармацевтиче--ский персонал.

4.4. Профилактика неблагоприятного воздействия противоопухолевых препаратов на персонал, занятый в производстве

Для снижения канцерогенного воздействия аранозы на организм совместно с д.мед.н. Шеренешевой Н.И. проведено исследование антиканцерогенного действия в-каротина на развитие опухолей почек у крыс, индуцированных аранозой. Полученные результаты, показывающие канцерогенность аранозы, подтверждают известный факт - наличие канцерогенной активности у противоопухолевых препаратов из класса НАМ. Внутривенное однократное введение аранозы в дозе 250 мг/кг массы тела индуцировало у крыс опухоли различной локализации (см. табл. 15.).

Таблица 15.

Влияние в-каротина на канцерогенез у крыс, индуцированных аранозой

Число крыс Группа и характер воздействия

Араноза Араноза + в-каротин

Самки (23 крысы) Самцы (23 крысы) Самки (23 крысы) Самцы (20 крыс)

С опухолями 17 (74 %) 8 (35 %) 7 (30 %) 4 (20 %)

С несколькими опухолями 3 (18 %) - 1 (14 %) 1 (25 %)

С мезенхимной опухолью почки 14 (61 %) 2 (9 %) 7 (30 %) -

С фиброаденомой молочной железы 1 -

С саркомой матки 1 - - -

С саркомой кожи и подкожной клетчатки 2 3 - 3

С саркомой тонкой кишки - - - 1

С саркомой тазовой полости - 1 - -

С лимфолейкозом 2 2 1 1

Примечание: По отношению к количеству крыс, доживших до обнаружения первой опухоли 2По отношению к количеству крыс с опухолью

Введение в-каротина сопровождалось снижением как общей частоты новообразований, так и частоты опухолей почек у крыс, индуцированных аранозой, а также некоторым удлинением среднего латентного периода их развития. Таким образом, настоящее исследование показало возможность уменьшения канцерогенного действия аранозы при применении в-каротина Полученные результаты являются экспериментальным обоснованием возможности использовать в-каротин для снижения риска возникновения вторых первичных злокачественных опухолей при лечении онкологических больных препаратом араноза и для профилактики возникновения новообразований у медицинского и фармацевтического персонала, работающего с этим препаратом.

ВЫВОДЫ

1. На основании результатов собственных исследований и обобщения литературных данных предложена концепция создания лиофилизированных лекарственных форм, которая учитывает:

- биологические факторы (путь и безопасность при различных способах введения, в том числе, местные тканевые реакции, биологическую активность, влияние растворов на кровь и белки плазмы);

- физико-химические факторы (собственные физико-химические свойства вещества; фотодинамическую, гидролитическую, термическую стабильность вещества);

- технологические факторы (способ приготовления растворов, возможность сушки данного состава, способ и продолжительность замораживания, режим сушки).

2. Оптимизирована технология приготовления растворов сложного состава (араноза, лизомустин) с использованием коэффициентов замещения и определён порядок смешивания ингредиентов, что позволило сократить время растворения, а также повысить безопасность работы персонала. Расширен ассортимент фильтрующих материалов, используемых в производстве аранозы и лизомустина. При производстве «Аранозы лиофилизата для приготовления раствора для инъекций 0,5 г» увеличен выход продукции в 2 раза при переходе на другую первичную упаковку.

3. Предложен алгоритм выбора температуры и условий замораживания растворов, подлежащих сублимационной сушке, включающий - определение температуры и продолжительности замораживания; выбор способа замораживания; исследования устойчивости растворов при низких температурах.

4. Различными методами определены температуры замораживания растворов исследуемых соединений (аранозы, лизомустина, БХНМ, сетремеда, палюстрана, лимфокинина). Выбраны оптимальные режимы их заморажива-

ния. Показано, что качество готового продукта зависит от продолжительности замораживания.

Не рекомендовано длительное хранение в замороженном состоянии препаратов - лизомустин и БХНМ. В экстренных ситуациях возможно хранение при низкой температуре растворов аранозы с последующим перерастворением, замораживанием и сушкой.

5. Показана зависимость скорости сушки от градиента температур между полками и продуктом, целесообразность использования интенсивного подвода тепла при сушке препаратов: араноза - субстанция, лекарственных форм - митоксантрона, сетремеда и лимфокинина. Использование интенсивного подвода тепла при сушке позволяет получить экономический эффект от 20 до 50%.

Применение контролируемого вакуума позволяет, в ряде случаев, сократить технологический процесс получения сублимационно-высушенных препаратов ещё на 15 - 26 %. Интенсификация сушки за счет контролируемого вакуума зависит от состава высушиваемого продукта.

Разработаны режимы сублимационной сушки субстанции и лекарственных форм аранозы и лизомустина для их опытно-промышленного производства.

6. Сформулированы подходы для решения вопросов, связанных с безопасным ведением технологического процесса.

Разработаны методики направленной деструкции аранозы с целью получения не токсичных продуктов разложения.

Разработаны методики определения противоопухолевых веществ из группы метилнитрозомочевин (метилнитрозомочевина, БХНМ, лизомустин) в сточных водах, аранозы в воздухе рабочей зоны.

7. Совместно с д.м.н. Шеренешевой Н.И. показана возможность уменьшения канцерогенного действия аранозы путём применения в-каротина.

Предложены практические рекомендации по защите персонала от неблагоприятного воздействия противоопухолевых препаратов в случаях непосредственного контакта с ними.

8. На основе анализа литературных и экспериментальных данных сформулированы требования к показателям качества лиофилизированных лекарственных средств. Для гармонизации терминологии в определении названия лекарственной формы лиофилизированного продукта предложено использовать термин «ЛИОФИЛИЗАТ».

Определены основные показатели качества лиофилизированных субстанций и лекарственных форм. Сформулированы требования к показателям качества, зависящим от технологии получения продукта.

9. Выбраны и разработаны методики, позволяющие контролировать качество лиофилизированных веществ в ходе выполнения технологических операций, а также качество готовой продукции.

В соавторстве разработаны и утверждены:

• ФСП 42-0656-00 «Араноза» субстанция, препарат зарегистрирован в Государственном реестре Российской федерации;

• ФСП 42-0655-00 «Араноза, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,5 г», препарат зарегистрирован в Государственном реестре Российской федерации;

• ФСП 42-0867-01 «Лизомустин, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,1 г», препарат рекомендован к медицинскому применению.

Основные работы, опубликованные по материалам диссертации:

1. Клочкова Т.И., Лопатин П.В., Оборотова Н.А и др. Влияние биофармацевтических факторов на терапевтический и побочные эффекты противоопухолевых препаратов // Кн.: Материалы научной конференции «Токсикологические аспекты безопасности готовых лекарственных форм», тезисы докладов, М., -1981, С. 32- 34

2. Юшков С.Ф., Клочкова Т.И., Лопатин П.В. и др. Местные тканевые реакции и их значение при создании готовых противоопухолевых средств // Кн.: Материалы научной конференции «Токсикологические аспекты безопасности готовых лекарственных форм», тезисы докладов, М., -1981, С. 69 -70

3. Клочкова Т.И., Оборотова Н.А., Мкртчян Т.В. и др. Исследование совместимости противоопухолевых препаратов с кровью // Химиотерапия опухолей в СССР, -М., -1986, в. 45, С. 98-102

4. Клочкова Т.И., Лопатин П.В. Методический подход к разработке лекарственных форм противоопухолевых веществ для инъекций // Тезисы доклада. Ш съезд фармацевтов Казахской ССР, г. Кустанай, -1987, С. 281-282

5. Клочкова Т.И., Лопатин П.В., Мкртчян Т.В. и др. Масштабирование производства лекарственной формы аранозы лиофилизированной для инъекций и его особенности // Химиотерапия опухолей в СССР, -М., -1988, в. 51, С. 63-66

6. Сыропятова Е. Б., Иванова Л.А., Клочкова Т.И. Мембранные фильтры для стерилизующей фильтрации (Обзор) // Фармация, -1990, № 6, С. 72-76

7. Клочкова Т.И., Сыропятова Е.Б., Иванова Л.А. Возможность использования мембранных фильтров для стерилизующей фильтрации растворов аранозы и нитруллина // Химиотерапия опухолей в СССР, -М., -1991, в. 57, С. 190-193

8. Клочкова Т.И. Иванова Л.А., Сыропятова Е.Б. Устойчивость растворов нитрозоалкилмочевин при низких температурах // Химиотерапия опухолей в СССР, -М., -1991, в. 57, С. 185-189

9. Сыропятова Е.Б., Клочкова Т.И. Специальные методы сушки в фармацевтическом производстве // Химико - фармацевтическое производство: Обзорная информация, -М.: НИИСЭНТИ, 1995. -вып.7. -11 с.

10. Шеренешева Н.И., Финько В.Е., Клочкова Т.И. Антиканцерогенное действие ß-каротина на развитие опухолей почек у крыс, индуцированных 3-(а-Ь-арабинопиранозил)-1-(метил)-1-нитрозомочевиной (АМНМ) // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, «Медицина», -М.,-1996, № 4, -С. 453-455

11. Левит Г.Л., Гришаков АН., Краснов В.П., Клочкова Т.И. N®-(алкиламинокарбонил)нитрозо-а,(0-диаминокарбоновые кислоты. IV. Изуче-

ние гидролитической устойчивости изомеров положения нитрозогруппы нитрозо-№>-(2-хлорэтиламинокарбонил) -а,<в-диаминокарбоновых кислот // Химико - фармацевтический журнал, -1996, -30, № 11, С. 683-684

12. Klochkova Т., Syropyatova E., Kunenkova N. The stability of solution ofnitrosoalkylureas at low temperatures // Farmacevtski vestnik, -1997, vol. 48, Special Insure -C. 376-377

13. Klochkova Т., Orlova 0. The optimization of regimen of liophilization for palustran substanse // Farmacevtski vestnik, -1997, vol. 48, Special Insure -C. 374 -375

14. Klochkova Т., Syropyatova E., Kunenkova N. The choice of membrane fil-ters for sterility filtration of the nitrosoalkylureas solu-tions -1997, vol. 48, Special Insure -C. 372-373

15. Klochkova Т., Volodin Y.Y., Kunenkova N. et all Determination of optimal conditions of aranoze deactivation // Proceed. 9th Inter Pharm. Tech-nol.Symp.(IPTS 98), Sept. 7-9,1998, Ankara-TURKEY, P. 155-156

16. Шеренешева Н.И., Финько В.Е., Клочкова Т.И. и др. Антиканцерогенное действие палюстрана на развитие опухолей у крыс, индуцированных 3-(a-L- арабинопиранозил)-1-(метил)-1-нитрозомочевиной (АМНМ) // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1998, т. 125, № 5, С. 566568

17. Шеренешева Н.И., Финько В.Е., Клочкова Т.И. и др. Изучение влияния циннабарина на канцерогенез у крыс, индуцированный бинопиранозил)-1-(метил)-1-нитрозомочевиной // Вестник ОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, -1998, № 3, С. 10-12

18. Оборотова НА, Кикоть Б.С., Клочкова Т.И. и др. Технологические и химикофармацевтические исследования Бисантрона - новой лекарственной формы воспроизведенного противоопухолевого препарата Митоксантрон // Химико - фармацевтический журнал, -1999, -33, № 10, С. 54 - 56

19. Перетолчина Н.М., Клочкова Т.И. Михайлова Л.М. и др. Араноза -новый противоопухолевый препарат // Практическое пособие для онкологов и врачей, РОЩ РАМН, М., -2000. -22 с.

20. Klochkova Т., Kunenkova N., Romanenko V. The optimization of lyo-phylization process for antitumour preparation Aranoza. I. Freezing // 3rd Wold Meeting APV / APGI - Berlin, Germany, 3-6 April, 2000, -P.977-978

21. Краснов В.П., Авдюкова H.B., Клочкова Т.И. и др. Спектрофото-метрическое определение содержания основного вещества в субстанции противоопухолевого препарата лизомустин // Аналитика и контроль, -2001, -т. 5, №2, С. 168-170

22. Гришаков А.Н., Клочкова Т.И., Левит Г.Л. и др. Количественное определение содержания изомеров в субстанции и лекарственной форме пре-

парата лизомустин методом ВЭЖХ // Аналитика и контроль, -2001, -т. 5, № 2, С. 143-145

23. Klochkova Т., Krasnov V., Grishakov A. et all Determination of related substances in lysomustine by thin-layer chromatography // Abstract book 4th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics, Pharmaceutical Technology, 8-11 April 2002, Florence, P. 323 - 324

24. Klochkova Т., Tcheltsov P., Sakharov S. et all Investigation of aranoza and hydrogen peroxide interaction //11th International Pharm. Technol. Symp. (IPTS-2002), Sept. 9-11,2002 Istambul-Turkey, P. 181-182

25. Клочкова Т.И. Изучение безопасности производства противоопухолевых препаратов из группы метилнитрозомочевин // тезисы доклада, Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты. -М., 20-23 марта 2003; Российский биотерапевтический журнал, -2003, № 1, С. 25-26

26. Клочкова Т.И., Игнатьева Е.В., Ярцева И.В. и др. Определение посторонних примесей в препарате лизомустин // Хим. - фарм. журнал, -2004, -т. 38, № 5, С. 45 - 47

Материалы диссертации защищены патентами:

1. Краснова М.А., Мкртчян Т.В., Лопатин П.В., Клочкова Т.И. и др. «Противоопухолевое средство» Патент № 1683190 от 23 июня 1993 г., Официальный бюллетень «Изобретения. Полезные модели», -1995, № 11.

2. Оборотова Н.А., Полозкова А.П., Клочкова Т.И. и др. «Противоопухолевое средство» Патент № 2093158 от 20 октября 1997 г., Официальный бюллетень «Изобретения. Полезные модели» № 29.

Служба множительной техники ГУ РОНЦ им. Н Н. Блохина РАМН Подписано в печать /Р /,¿003Зыяз № 2.0 Тираж 100 экз

(

22f.!4P2;55v

;o

Актуальность исследования. В настоящее время с помощью химиотерапии можно излечить лишь 10 % всех злокачественных опухолей, однако её роль в лечебном процессе постоянно возрастает. Химиотерапия является постоянным компонентом комбинированных и комплексных схем лечения (26,8 %) и ч химиолучевой терапии (3,4 % больных). Кроме того, химиотерапия часто применяется как единственно возможное паллиативное средство при лечении генерализованного опухолевого процесса. Пред- и после операционная или лучевая адъювантная химиотерапия повышает эффективность этих этапов лечения. В настоящее время, лекарственная терапия является необходимым компонентом лечения злокачественных новообразований, которая улучшает эффективность лечения Онкологических больных и применяется во все возрастающих объемах.

Это обуславливает необходимость создания новых противоопухолевых лекарственных средств (JIC) и внедрение их в промышленное производство.

По виду лекарственных форм (ЛФ) все противоопухолевые препараты делятся в основном на пероральные лекарственные средства, выпускаемые в основном в виде таблеток и парентеральные лекарственные средства, выпускаемые, главным образом, в виде сублимационно-высушенных препаратов. Небольшая группа препаратов выпускается в виде растворов для инъекций или в виде сухой рассыпки порошков для инъекций.

В работах П.В. Лопатина и во временных методических указаниях, действующих в РОНЦ им. H.H. Блохпна РАМН представлен порядок организации работ по созданию и изучению новых противоопухолевых ЛС. Предложенный П.В. Лопатиным методический подход к разработке противоопухолевых препаратов даёт общее направление исследований к решению задачи и не учитывает особенностей технологических процессов, используемых при приготовлении лекарственного средства. Решение выше сказанного связано с развитием методических и методологических подходов к разработке противоопухолевых ЛС и современной технологии их производства.

Создание противоопухолевого препарата - сложная многофакторная задача, требующая знания и учета особенностей биологического, фармакологического действия лекарственного вещества (J1B), физико-химических характеристик JIB и технологии получения ЛФ.

Исходя из особенностей противоопухолевых субстанций - термолабильности, гидролитической неустойчивости, в некоторых случаях высокой гигроскопичности, сублимационная сушка является необходимым элементом технологии получения стабильных противоопухолевых лекарств.

Сублимационная сушка используется в фармацевтической промышленности для'получения препаратов для инъекций, глазных капель, липосомальных лекарственных форм, гемостатических губок, трансплантатов и др.

Применение сублимационной сушки в производстве лекарственных средств является одним из способов получения препарата высокого качества. Процесс лиофилизации длителен и энергетически ёмок. Поэтому разработка экономичного процесса сублимации является крайне важным элементом в промышленном выпуске лекарств.

Государственная Фармакопея СССР XI издания, Фармакопеи США и Великобритании не имеют специальной статьи, регламентирующей требования к качеству лиофилизированных препаратов. По имеющимся требованиям лио-филыю-высушенные препараты относятся к «сухим инъекциям», что определяет перечень показателей качества, используемых в стандартизации данных лекарственных средств.

Однако лиофильно-высушенные препараты имеют ряд особенностей, которые не отражены в общих статьях для инъекционных препаратов. Поэтому совершенствование методов стандартизации, унификация методик и создание общих требований к качеству лиофильно-высушенных лекарств является актуальным.

Сложность проблемы обусловлена высокими требованиями, предъявляемыми на всех этапах создания лекарства, к стандартизации технологических процессов и качеству готовой продукции с целью производства высокоэффективных и безопасных лекарственных препаратов.

В России имеется опыт по производству противоопухолевых препаратов из группы хлорэтиламинов, антибиотиков, антиметаболитов, но только начиная с 1996 г. в широкую медицинскую практику введен первый отечественный противоопухолевый препарат из группы метилнитрозомочевин (МНМ)- араноза.

Согласно гигиеническим критериям оценки и классификации условий 1 труда по показателям вредности и опасности факторов производственной среды, производство противоопухолевых препаратов относится к 1 классу опасности. Поэтому является необходимым решение вопросов, связанных с утилизацией отходов, безопасностью проведения производственного процесса и организацией профилактических мероприятий, направленных на снижение повреждающего воздействия на персонал.

Все выше изложенное подчеркивает важность и актуальность исследования по оптимизации технологии получения и стандартизации лиофильно-высушенных препаратов.

Цель работы. Теоретическое и экспериментальное обоснование разработки экономичной технологии лиофильно-высушенных препаратов и стандартизации лиофилизированных субстанций и лекарственных форм.

Задачи исследования.

1. Сформулировать требования к разработке, а также выбору критериев и методов оценки качества лиофильно-высушенных лекарственных средств.

2. Разработать систему технологических решений, использование которой позволит создать экономичную технологию получения лиофилизированных препаратов.

3. Обосновать оптимальные условия замораживания продукта, подлежа щего лиофилизации, и исследовать влияние низких температур на качество готового продукта.

4. Исследовать условия интенсификации процесса сублимационной сушки и на этой основе разработать оптимальные процессы лиофилизации противоопухолевых препаратов из группы МНМ, ХЭА, комплексных соединений металлов, препаратов растительного происхождения и препаратов крови.

5. Провести исследования и разработать рекомендации по безопасному ведению технологического процесса получения противоопухолевых лекарственных средств.

Научная новизна исследования.

Выбраны и обоснованы критерии и методы оценки качества лиофилизи-рованных субстанций и лекарственных форм. На основе теоретических и практических данных сформулированы общие требования к качеству лиофильно-высушенных лекарств. Для гармонизации терминологии в определении названия лиофилизированных ЛФ предложено использовать термин «ЛИОФИЛИ-ЗАТ», который является кратким, точным, и обладает информативностью о технологии получения ЛФ или ЛВ и не связан с формой и составом получаемого продукта.

Разработана модель и сформулированы методические указания по разработке инъекционных сублимационно-высушенных препаратов на основе водорастворимых хлорэтиламинов (Утверждены зам. Директора ВОНЦ АМН СССР Морозом Л.В., 1984 г.)

Предложена система технологических решений, которая позволяет комплексно подойти к созданию экономичной технологии получения лиофильно-высушенных препаратов.

Разработаны приемы интенсификации процесса сублимационной сушки с использованием регулирования режимов замораживания, подвода тепла и контролируемого вакуума. На этой основе разработаны оптимальные процессы лиофилизации противоопухолевых препаратов из группы МНМ (араноза, лизомустин, БХНМ), комплексных соединений металлов (цисплатин, сетремед), производного антрацендиона (митоксантрон), полисахарида (палюстран) и препарата крови - лимфокинина, которые позволяют получать продукты, соответствующие требованиям ВФС, ФСП и проектов ФСП и обеспечивающие значительный экономический эффект.

Впервые внедрены в широкую медицинскую практику противоопухолевые препараты из группы МНМ - араноза и лизомустин. На основе технологических решений, представленных в данной работе, впервые организовано опытно-промышленное производство субстанции и ЛФ препарата араноза.

Разработаны рекомендации по безопасному ведению технологического процесса получения противоопухолевого препарата - араноза, включающие: утилизацию отходов, профилактику неблагоприятного воздействия препарата на персонал, занятый в производстве, выбор средств индивидуальной защиты персонала.

Новизна полученных результатов подтверждается 2-мя патентами РФ. Практическая значимость работы.

В результате проведенных исследований разработаны и находятся на разных уровнях внедрения, следующие противоопухолевые препараты:

• «Араноза» - субстанция (ФСП 42-0105-0655-00) и лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного введения 0,5 г (ФСП 42-0105-065600), защищен патентом РФ (№ 1683190, 1993 г.). Разрешено медицинское применение и промышленный выпуск субстанции (ОПР от 31.12.99) и лекарственной формы аранозы (ОПР от 30.12.99. и ОПР 17495490-22003). Препарат зарегистрирован в Государственном реестре (приказ МЗ РФ № 432 от 31.12.96. - Р№ 96/432/4 ЛФ аранозы, Р№ 96/432/1 субстанция аранозы; перерегистрация: Р№ 000449/01-2001 - субстанция и Р№ 000449/02-2003 - ЛФ) и введен в перечень жизнено-необходимых препаратов.

• «Лизомустин» - лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного введения 0,1 г (ФСП 42-0105-0867-01) рекомендован к медицинскому применению.

• «Митоксантрон» - лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,02 г (ФСП 42-0105-1261-01) защищен патентом РФ (№ 2093158, 1997 г.) и рекомендован к медицинскому применению.

Введение в широкую медицинскую практику новых противоопухолевых препаратов позволяет снизить затраты на лечение больных, расширить ассортимент применяемых в онкологической практике лекарственных средств.

Апробация работы. Материалы исследований представлены на:

Научной конференции «Токсикологические аспекты безопасности готовых лекарственных форм» (Москва, 1981); III Съезде фармацевтов Казахской ССР (Кустанай, 1987); научно-практической конференции «Резервы совершенствования лекарственного обеспечения населения РСФСР» (Владимир, 1991); республиканской конференции «Проблемы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» (Москва, 1991); Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1992,1995,1996,1998); Международной научной конференции «Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности» (Томск, 2000); Central European Symposium on Pharmaceutical Technology (Portoroz, Slovenia, 1997); World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology (Paris, 1998; Berlin, 2000; Florence, 2002); 9th International Pharmaceutics Technology Symposium (Ankara, 1998); 4th European Congress of Pharmaceutical Sciences (Milan, 1998); 3rd International Symposium on Pharmaceutical Chemistry (Turkey, 2001); 4th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology (Florence, 2002); Межлабораторной конференции ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН - июнь 2004 г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 52 научные работы, получено 2 патента и 1 авторское свидетельство на изобретение.

Заключение

Проведенное исследование показало, что субстанция аранозы с 98 % содержанием основного действующего вещества, получаемая по новой методике, относительно устойчива в водных растворах. Поэтому использование гидролиза в водных растворах и УФ облучения малоэффективно для разрушения препарата. Для дезактивации отходов производства аранозы можно использовать 0,5 % растворы ЫаОН и N82003. Минимальное время необходимое для полного разложения аранозы в растворах составляет 3 часа при использовании 0,5 % растворов ЫаОН и КагСОз.

Взаимодействие аранозы с перекисью водорода приводит, в основном, к образованию АПММ, метилмочевины, Ь-арабинозы и родственных ей соединений, которые не являются токсичными веществами. Смесь получаемых продуктов можно утилизировать сбросом в канализацию.

Для обнаружения МНМ, ВСЬШ и лизомустина в жидких отходах разработана методика с использованием обращеннофазовой ВЭЖХ. При анализе сточных вод со всех стадий получения исследуемых соединений выявлено, что наличие примесей не влияло на результаты определения.

Показана возможность уменьшения канцерогенного действия аранозы при применении Р-каротина. Полученные результаты являются экспериментальным обоснованием возможности использования Р-каротина для профилактики возникновения новообразований у медицинского и фармацевтического персонала, работающего с препаратами производными НАМ.

На основе экспертных оценок разработаны рекомендации по обеспечению безопасности производства и оптимальных санитарно-гигиенических условий труда работающих.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 6. СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛИОФИЛЬНО-ВЫСУШЕННЫХ

ПРЕПАРАТОВ

Первоначально процесс сублимации широко применялся для получения препаратов крови, вакцин, сывороток. Введение процесса лиофилизации в производство лекарственных препаратов позволило получать стандартные, устойчивые субстанции и лекарственные формы термолабильных и гидролитически неустойчивых соединений, создавая лекарственные препараты для инъекционного применения.

2.1. Выбор показателей качества, критериев и методов оценки качества лнофнлизнрованных субстанций н лекарственных форм

Государственная Фармакопея СССР XI издания (ГФ XI) [29, 30], Фармакопеи США (ШР) [211] и Великобритании (ВР) [129] не имеют специальной статьи, регламентирующей требования к качеству лиофилизирован-ных препаратов. В общих статьях, посвященных инъекционным препаратам, приведены номенклатурные перечни ЛФ для инъекций. В таблице 6.1. представлены основные типы препаратов для инъекций, которые можно найти в фармакопеях и других нормативных документах. Рассматриваемые нормативные документы (табл. 6.1) в перечне ЛФ для инъекций включают сухие вещества или порошки для приготовления растворов или инфузий для инъекций.

В таблице 6.2. представлены термины и определения сухих лекарственных форм, которые можно найти в фармакопеях и других нормативных документах.

Только Британская Фармакопея (ВР-2004) вводит термин «лиофильно-высушенные препараты» (табл. 6.2.), которые рассматриваются как порошки для инъекций или внутривенных инфузий.

Классификация лекарственных форм для инъекций

Фармакопея или другой нормативный документ

Категории парентеральных препаратов ВР-2004 и8Р 27-^ 19 ГФ XI ОСТ 91500.05.001-00

Инъекции Инъекции Растворы для инъекций Растворы для инъекции

Порошки для инъекций или в/в инфузнй Сухие вещества для приготовления инъекций Сухие твердые вещества Порошки для инъекции

Эмульсии для инъекций Эмульсин Эмульсин для инъекций

Суспензии для инъекций Суспензии Суспензии для инъекций

Сухие вещества для приготовления инъекционных суспензий — —

Внутривенные (в/в) инфузин — Инфузнон-пые растворы —

Концентраты для инъекций или в/в инфузнй — — —

Имплантанты — — —

Перечисленные в табл. 6.2. термины, используемые для определения лиофилизированной ЛФ, не обладают краткостью и точностью. Для гармонизации терминологии в определении названия лиофилизированных ЛФ предлагается применить термин «ЛИОФИЛИЗАТ», который не только лаконичен, а и обладает информативностью о способе получения ЛФ и не связан с формой и составом получаемого продукта.

Используемый в настоящее время термин «Порошки для инъекций» г вполне подходит для определения лиофилизированных субстанций.

По требованиям к нормативной документации лиофильновысушенные препараты для инъекций относятся к «сухим инъекциям», что определяет перечень показателей качества, используемых в стандартизации данных лекарственных средств. В таблице 6.3. представлен сравнительный ряд оценок качества сухих ЛФ для инъекций по материалам различных Фармакопей и НТД. Перечень включает показатели качества, указанные как в общих, так и в частных фармакопейных статьях.