Автореферат и диссертация по медицине (14.04.01) на тему:Разработка липосомальной лекарственной формы противоопухолевого препарата араноза

005050459

На правах рукописи

Козеев Сергей Геннадьевич

РАЗРАБОТКА ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПРЕПАРАТА АРАНОЗА

14.04.01 - Технология получения лекарств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 * МАР 2013

Москва-2013

005050459

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, профессор

Краснюк Иван Иванович

доктор фармацевтических наук, профессор

Оборотова Наталия Александровна

Официальные оппопенты:

доктор химических наук,

Харитонов Юрий Яковлевич

профессор, заведующий кафедрой физической, аналитической и коллоидной химии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, заслуженный деятель науки РФ

доктор фармацевтических наук, Гузев Константин Сергеевич ведущий специалист отдела обеспечения качества ЗАО «Ретиноиды»

Ведущая организация:

Воронежский государственный университет

Защита диссертации состоится «20» марта 2013 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.040.09 при Первом МГМУ имени И.М. Сеченова по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Первого МГМУ имени И.М. Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан «¿3» февраля 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.040.09, доктор фармацевтических наук,

профессор Садчикова Наталья Петровна

Актуальность темы

Лекарственная терапия опухолей является актуальным разделом современной медицины. Однако большинство химиопрепаратов обладают рядом недостатков, к которым относится недостаточная избирательность действия и, вследствие этого, высокая общая токсичность, а также устойчивость опухолевых клеток к проводимой химиотерапии. На сегодняшний день описано много механизмов, приводящих к множественной лекарственной резистентности. Поэтому создание рациональных лекарственных форм, позволяющих наиболее полно реализовать возможности противоопухолевых препаратов, является актуальной задачей.

Существует ряд подходов к увеличению эффективности лекарственных препаратов, среди которых использование новых фармацевтических технологий для создания систем транспорта известных противоопухолевых лекарственных веществ (JIB). Одним из наиболее оптимальных вариантов для повышения их доставки к опухолевым клеткам является использование носителей, таких как липосомы.

Опухолевые ткани отличаются от нормальных наличием деформированных капилляров с проницаемыми стенками и замедленным кровотоком. Благодаря данным эффектам, наноразмерные лекарственные формы, такие как липосомы, накапливаются в опухолевой ткани, тем самым повышая терапевтический эффект JIB, которое они переносят.

Липосомы представляют собой везикулы, состоящие из одной или нескольких фосфолипидных мембран, внутри которых находится водное пространство. В их водное пространство могут быть включены водорастворимые лекарственные вещества, а в липидный бислой -гидрофобные. Липосомы способны транспортировать ЛВ, снижать его общетоксическое действие, увеличивать терапевтический эффект. Основываясь на этих свойствах, липосомальные системы доставки противоопухолевых препаратов могут обуславливать фармакологическое преимущество перед нелипосомальными формами лекарств.

В настоящем исследовании при создании липосомальных лекарственных форм (ЛЛФ) в качестве модельного препарата использовали отечественное противоопухолевое JIB аранозу.

Арабинопиранозилметил нитрозомочевина (араноза) — отечественный противоопухолевый препарат, производное нитрозомочевины, синтезирована в конце 1970-х годов в лаборатории органического синтеза, лекарственная форма «Араноза лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,5 г» создана в лаборатории разработки лекарственных форм Онкологического научного центра АМН СССР. В результате клинических испытаний в конце 80-х годов установлена эффективность препарата при меланоме. Несмотря на преимущества перед аналогами (производными нитрозомочевины) - большая широта терапевтических доз и возможность применения в амбулаторных условиях, араноза обладает недостаточной селективностью действия.

В РФ в настоящее время ЛЛФ аранозы не производятся, импорт дорогостоящих зарубежных препаратов резко сужает возможность применения лекарственных препаратов в отечественной клинической практике. Разработка и производство ЛЛФ аранозы для лечения онкологических больных позволит увеличить эффективность проводимой химиотерапии.

Цель исследования Получение липосомальной лекарственной формы противоопухолевого лекарственного вещества аранозы для увеличения селективности доставки в опухоль.

Задачи исследования

1. На основе технологических исследований выбрать состав ЛЛФ аранозы.

2. Разработать способ получения устойчивой при хранении лиофилизированной ЛЛФ аранозы для внутривенного введения.

3. Определить показатели качества для стандартизации ЛЛФ аранозы и разработать методики качественного и количественного анализа.

4. Сравнить цитотоксическую активность известной лекарственной формы «Араноза лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,5 г» и

4

новой ЛЛФ «Араноза липосомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 100 мг» в опытах in vitro и противоопухолевое действие в опытах in vivo.

Научная новизна результатов исследования Впервые предложен состав и разработана технология получения отечественного противоопухолевого препарата - липосомальной аранозы в виде лиофилизата для приготовления раствора для инъекций. Изучено влияние различных криопротекторов на стабильность липосом с аранозой до и после лиофилизации. Разработан режим лиофилизации липосомальной аранозы.

Предложены методики качественного и количественного анализа ЛЛФ аранозы: определение компонентов лекарственной формы методом тонкослойной хроматографии и спектрофотометрическое определение содержания действующего вещества в лекарственной форме. Выбраны показатели качества лиофилизированной ЛЛФ аранозы. Показана стабильность лекарственной формы в процессе исследуемого срока хранения.

В экспериментах in vitro и in vivo по изучению цитотоксического и противоопухолевого действия показано, что липосомальный препарат обладает большей избирательностью действия по сравнению со свободной лиофилизированной формой аранозы.

Практическая значимость полученных результатов Создана новая липосомальная лекарственная форма высокоактивного противоопухолевого ЛВ аранозы. В лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН утвержден лабораторный регламент на производство ЛЛФ аранозы.

Разработан проект ФСП на препарат: «Араноза липосомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 100 мг».

Представляется возможность проведения расширенных испытаний in vivo для изучения ЛЛФ аранозы на новых опухолевых моделях.

Положения, выносимые на защиту 1. Состав и технология получения ЛЛФ аранозы.

5

2. Выбор криопротектора и условий лиофилизации ЛЛФ аранозы.

3. Методики качественного и количественного анализа ЛЛФ аранозы.

4. Данные оценки эффективности действия липосомальной аранозы in vitro и in vivo.

Апробация работы

Материалы проведенных исследований представлены на конференциях: Итоговой всероссийской научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» (Москва, январь 2011 и 2012 гг.), X Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 22-23 марта 2011г.), III Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (Саратов, 6-7 сентября 2011г.), XI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Нижний Новгород, 31 мая - 1 июня 2012г.), Межкафедральной научной конференции на кафедре фармацевтической технологии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (Москва, 31 августа 2012 г.).

Личный вклад автора Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и их внедрения в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.01 - Технология получения лекарств. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно

6

пунктам 1, 3 и 4 паспорта специальности технология получения лекарств.

Связь задач исследования с проблемным планом

Диссертационная работа выполнена в соответствии с комплексной научной темой ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (номер государственной регистрации 01.2.006 06352). Тема включена в план научных исследований кафедры фармацевтической технологии «Разработка научных основ технологии, стандартизации и организации производства лекарственных средств».

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, полностью отражающих ее содержание, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований и их обсуждений, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 19 рисунками. Библиографический список включает 166 наименований, в том числе 96 - на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Получение дисперсии многослойных липосом аранозы

Для получения дисперсии многослойных липосом с инкапсулированной аранозой использовали метод Бэнгхема. Компоненты липидного бислоя: яичный фосфатидилхолин (ФХ), холестерин (Хол), фосфатидилэтаноламин-полиэтиленгликоль-2000 (ФЭ-ПЭГ-2000) растворяли в хлороформе. Полученный раствор фильтровали под вакуумом через фильтр с размером пор

0,22 мкм, количественно переносили в стерильную круглодонную колбу и выпаривали на роторном испарителе BÜCHI Rotavapor R-200 при температуре выше температуры фазового перехода липидов (+37°С) и давлении 24 мм рт. ст. до получения тонкой липидной плёнки на стенках кол бы. Для полного удаления хлороформа проводили досушивание под вакуумом в течение 60 мин. Полученную липидную плёнку гидратировали предварительно профильтрованным (через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм) 2% раствором аранозы с добавлением сорбиновой кислоты при постоянном перемешивании. Предфильтрацию полученной дисперсии мультиламеллярных везикул проводили через фильтры с диаметром пор 0,4 мкм.

Получение дисперсии однослойных липосом аранозы Измельчение небольших объёмов дисперсии (до 10 мл) проводилось на ручном мини экструдере Avanti Mini-Extruder последовательно через мембранные фильтры "Nuclepore" с диаметром пор 0,2 и 0,1 мкм. Однородные по размерам везикулы получали после 11 циклов экструзии.

В процессе масштабирования технологии измельчение проводили на экструдере LIPEX последовательно через мембранные фильтры с размером пор 0,2 и 0,1 мкм и давлении инертного газа 1,5 атмосфер. Однородные по размерам везикулы получали после 9 циклов экструзии.

Определение размера липосом На всех стадиях технологического процесса размер везикул определяли с использованием метода корреляционной спектроскопии светорассеяния на наносайзере Nicomp 380 Submicron Particle Sizer.

Определение эффективности включения аранозы в липосомы Для отделения липосом от не включившейся в везикулы аранозы применяли метод гель-фильтрации на колонке С-16 «GE Healthcare» с использованием гель-сорбента Sephadex G-50. Контроль разделения фракций осуществляли с помощью проточного спектрофотометра Uvis-920.

Количественное определение

Содержание аранозы определяли методом спектрофотометрии в

8

УФ-области на спектрофотометре Сагу 100 Varian, Inc. при 240±2 нм.

Изучение цитотоксической активности Для оценки роста опухолевых клеток и цитотоксической активности исследуемой ЛЛФ аранозы в опытах in vitro использован МТТ-тест. Опыт проводили на клеточных линиях опухолей человека: Mel Kor - метастатическая меланома и Jurkat - Т-клеточный лимфобластный лейкоз. Планшеты с клетками инкубировали в течение 72 часов. Измерения проводили на фотометрическом анализаторе иммуноферментных реакций «АИФР-01 Униплан». Определение противоопухолевого действия

С целью сравнения противоопухолевого действия ЛЛФ аранозы с лиофилизатом свободной аранозы, провели исследование на мышах (самки гибриды первого поколения BDF1) с перевитыми опухолями лимфоцитарной лейкемии Р-388 и меланомы В-16 при различных путях введения.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выбор состава липосомальной дисперсии аранозы Молярные соотношения липидных композиций липосом подбирали экспериментально с учётом воспроизводимости технологического процесса для получения стандартной и стабильной ЛЛФ аранозы.

В качестве основного компонента, формирующего липидный бислой, использовали фосфатидилхолин. Холестерин приводит к увеличению жесткости мембраны липосом, уменьшает текучесть липидного бислоя, а так же увеличивает его упругость и механическую прочность. Таким образом, присутствие Хол способствует повышению стабильности структуры везикул. Для предотвращения захвата липосом в кровяном русле клетками ретикуло-эндотелиальной системы добавляли фосфатидилэтаноламин, конъюгированный с гидрофильным полимером - полиэтиленгликолем, что приводит к увеличению циркуляции липосом в кровяном русле. Для стабилизации аранозы при хранении оптимальное значение pH среды создавали добавлением сорбиновой кислоты.

Молярные соотношения компонентов прописи подбирались

9

экспериментально. Для выбора состава ЛЛФ аранозы в ходе исследований были наработаны модельные композиции, качество которых оценивали по ряду показателей, таких как размер липосом, стабильность, эффективность включения, фильтруемость через стерилизующие мембраны.

Влияние состава и метода изготовления на размер липосом и эффективность включения аранозы В табл. 1 представлены результаты оценки качества моделей ЛЛФ аранозы по параметрам качества: размер везикул и эффективность включения аранозы. Многослойные липосомы всех модельных составов гомогенизировали путём экструзии через поликарбонатные фильтровальные мембраны.

Как видно из табл. 1, состав №1 имел низкий процент включения ЛВ. В составах №2 и №5 наблюдали одинаково высокий процент включения аранозы, но в последнем из перечисленных был более крупный размер везикул и дисперсия значительно хуже экструдировалась. Вероятно, это связано с увеличенным содержанием ФХ, что не оказало положительного влияния на эффективность включения ЛВ. Составы №3 и №4 имели более низкий процент включения аранозы, чем состав №2, что связано с увеличением в прописи количества аранозы.

Таблица 1

Изменение эффективности включения аранозы и размера липосом в зависимости от состава

Состав № Молярные соотношения ФХ:Хол:ФЭ-ПЭГ-2000:А Размер липосом после экструзии, нм Эффективность включения аранозы,%

1 1,0:0,36:0,025:0,30 163±4 58±2

2 1,0:0,24:0,017:0,81 167±2 81±2

3 1,0:0,24:0,017:0,99 195±5 71±3

4 1,0.0,18:0,013:0,74 197±4 71±3

5 1,0:0,18:0,013:0,60 183±3 79±2

Примечание: А-араноза.

Таким образом, наилучшим по оцениваемым параметрам оказался состав № 2, в котором обеспечена высокая эффективность включения (81±2%) и оптимальный размер везикул равный 167±2 нм (Рис. 1).

Рис. 1. Размер липосом аранозы (состав 2)

В исследованиях показано, что введение альфа-токоферола в состав липосомального бислоя привело к резкому снижению стабильности дисперсии и эффективности включения аранозы.

Сравнение эффективности измельчения липосомальной дисперсии методами измельчения ультразвуком, гомогенизации и экструзии на изучаемых моделях показало, что только экструзия позволяет получить гомогенные везикулы нужного размера и сохранить первоначальную эффективность включения аранозы (Табл. 2). Воздействие УЗ привело к незначительному уменьшению размера липосом и к резкому уменьшению эффективности включения ЛВ. Вместе с тем воздействие УЗ катализирует перекисное окисление ФХ, снижая качество липосомального препарата. При гомогенизации липосом на микрофлюидайзере также снижается эффективность включения аранозы.

Таблица 2

Влияние способа измельчения на показатели качества липосом аранозы

Способ измельчения До измельчения После измельчения

Размер липосом, нм Эффективность включения,% Размер липосом, нм Эффективность включения,%

Измельчение ультразвуком 360±5 81±2 250±12 55±3

Гомогенизация (микрофлюидизация) 360±5 81±2 130±11 50±3

Экструзия 360±5 81±2 166±5 80±2

В табл. 2 видно, что экструзия состава №2 позволила получить стабильные в ходе всего технологического процесса липосомальные дисперсии требуемого размера с высоким значением включения аранозы.

Влияние экструзии и фильтрации на размер везикул и эффективность включения аранозы Эффективность включения аранозы и размер везикул до экструзии и фильтрации, а также после экструзии через фильтры с диаметром пор 0,45; 0,22, и 0,1мкм представлены в табл. 3.

Таблица 3

Влияние экструзии и фильтрации на размер липосом и включение аранозы

Стадии технологического процесса Размер липосом, нм Эффективность включения, %

Свежеприготовленная липосомальная дисперсия 370±15 82±4

Экструзия 0,45 мкм 320±16 81±3

Экструзия 0,22 мкм 210±7 80±2

Экструзия 0,1 мкм 170±5 78±2

Как видно из табл. 3, при получении однослойных липосом (после экструзии) из многослойных происходит уменьшение размера до оптимального и немного снижается включение аранозы.

Выбор криопротектора для лиофилизации липосомальной дисперсии

аранозы

Основными параметрами качества, определяющими изменения в дисперсной системе, является размер везикул и эффективность включения ЛВ,

которые определяли до и после лиофилизации. По изменению данных показателей делали вывод о влиянии криопротектора на стабильность липосом.

Результаты влияния криопротекторов: сахарозы, лактозы и глюкозы на показатели качества липосом до и после лиофилизации представлены в

табл. 4 и 5.

Таблица 4

Влияние концентрации криопротектора на размер липосом

Криопротектор Концентрация криопротектора

5% 10% 15%

Размер липосом аранозы, нм

ДО после до после до после

лиофилизации

Сахароза 177±2 205±5 190±6 195±5 195±5 215±5

Лактоза 185±3 195±5 177±3 167±3 185±5 192±6

Глюкоза 177±2 300±40 177±3 400±100 185±5 350±70

Как видно из представленных в табл. 4 результатов, криопротекторы сахароза и лактоза в концентрации 10% имеют преимущество перед глюкозой по размеру получаемых липосом во всём изученном диапазоне концентраций.

Таблица 5

Влияние криопротектора на включение аранозы в липосомы

До лиофилизации После лио ¡илизации

Криопротектор Размер везикул, Эффективность Размер везикул, Эффективность

нм включения, % нм включения, %

Сахароза 10% 187±7 77±2 195±5 73±2

Лактоза 10% 177±3 81±1 167±2 77±2

Из полученных в табл. 5 данных можно сделать следующий вывод: при сравнении показателей качества составов с лактозой и сахарозой, оптимальные значения размера везикул и эффективности включения наблюдали после лиофилизации липосомальной дисперсии аранозы с криопротектором -лактозой с концентрацией 10%.

Таким образом, в результате проведённых исследований выбран состав липосомальной дисперсии аранозы с молярным соотношением ФХ:Хол:ФЭ-ПЭГ-2000:А равным 1:0,24:0,017:0,81, соответственно, содержащий сорбиновую кислоту в концентрации 0,08% и криопротектор лактозу в концентрации 10%. Состав ЛЛФ аранозы на 1 флакон представлен в табл. 6.

Таблица б Состав ЛЛФ аранозы на 1 флакон

Компонент Количество, г

Фосфатидилхолин 0,38

Холестерин 0,038

ФЭ-ПЭГ-2000 0,025

Араноза 0,1

Лактоза ■ 0,5

Сорбиновая кислота 0,004

Влияние лиофилизации на качество ЛЛФ аранозы

В ходе исследований установлено, что от режима лиофилизации зависит стабильность ЛЛФ при хранении, количество включённой в липосомы аранозы, а также размер везикул. Также на скорость и качество сублимации влияет концентрация липидов и лекарственного вещества в ЛЛФ, объём высушиваемого препарата, площадь поверхности испарения, наличие и свойства криопротектора.

В результате проведённых исследований выбран оптимальный режим лиофилизации (Рис. 2).

Как видно из рис. 2, общее время сушки составляет 31 час и включает стадии: замораживание, первичная и вторичная сушка. Разработанный режим лиофилизации позволяет получить стабильный в процессе хранения лекарственный препарат, при котором после регидратации эффективность включения JIB остается на уровне 77±2 % и сохраняется размер везикул 167±2 нм.

Технология изготовления ЛЛФ аранозы

По результатам эксперимента разработана ЛЛФ аранозы. При сравнении методов получения липосомальной дисперсии оптимальные показатели качества получены при экструдировании. Стабилизировали липосомы лиофилизацией. Технологическая схема изготовления ЛЛФ аранозы представлена на рис. 3.

Рис. 3. Технологическая схема изготовления ЛЛФ аранозы 16

Разработка методики количественного определения аранозы

Количественное определение аранозы в ЛЛФ проводили методом спектрофотометрии. На электронном спектре поглощения спиртового разведения аранозы максимум поглощения наблюдали при 240±2 нм (Рис. 4). Подчинение основному закону светопоглощения - закону Бугера-Ламберта-Бера наблюдается в области концентраций разведения от 2 до 28 мкг/мл.

Abs

(/Vavelength (nm)

Рис. 4. Электронные спектры поглощения спиртовых разведений 1 - ЛЛФ аранозы, 2 - PCO аранозы, 3- «Пустые» липосомы

Из рис. 4 видно, что пустые липосомы не поглощают в области максимума ЛВ, поэтому измерение оптической плотности ЛЛФ проводили относительно 95% этилового спирта.

Таблица 7

Результаты количественного определения аранозы в липосомалыюй дисперсии при

240±2 нм

№ образца Оптическая плотность разведения липосом Оптическая плотность раствора PCO Содержание аранозы в дисперсии (мг/мл) Метрологические характеристики (р=95%; t p,f= 2,57)

1 0,497 0,485 20,51 n — 6 X =20,12 Sx =0,27 S=0,11 ДХ = 0,28 є=1,56%

2 0,495 0,482 20,11

3 0,496 0,484 20,48

4 0,497 0,484 20,51

5 0,494 0,519 19,01

6 0,495 0,482 20,11

Воспроизводимость методики оценивали на модельных образцах липосом с точными навесками аранозы (Табл. 7).

Как видно из табл.7, относительная ошибка количественного определения аранозы в липосомальной дисперсии не превышает 1,56%.

Количественное определение аранозы в лиофилизированной ЛЛФ

В ходе разработки методики количественного определения аранозы в лиофилизированной ЛЛФ методом прямой УФ-спектрофотометрии изучены спектры поглощения лиофилизированных и свежеприготовленных липосомальных дисперсий аранозы. Они оказались идентичны.

Из данных табл.8 следует, что ошибка среднего результата количественного определения аранозы в лиофилизированной ЛЛФ составляет 0,18%, т.е. не превышает пределов допустимых норм отклонений.

По результатам определения специфичности, линейности, правильности, прецизионности и аналитической области разработанные методики количественного определения применимы в диапазоне концентраций ЛВ от 80

до 120%.

Таблица 8

Результаты количественного определен™ лиофилизированной ЛЛФ аранозы

№ образца Содержание аранозы во флаконе, мг Метрологические характеристики (р=95%; 1 р>(= 2,57)

1 99,80 п=6

2 100,10 Х~= 99,90

3 99,70 Бх= 0,17

4 99,80 Бх =0,065

5 100,10 ДХ = 0,18

6 99,90 г =0,18%

Применение метода тонкослойной хроматографии для качественного анализа ЛЛФ аранозы

Для качественного анализа ЛЛФ аранозы методом ТСХ выбрана система растворителей «бензол-этилацетат-метанол» в соотношении 6:3:1. Пластинки

18

«вогЬШ» с нанесёнными пробами хроматографировали восходящим способом (Рис. 5). Липосомальные растворы наносились в объёме 10 мкл, контрольные-5 мкл. Пятна детектировали в УФ-свете при длине волны 254 нм, а затем проявляли парами йода, выдерживая в йодной камере 1-2 минуты.

о> о о о

о о о о

о о о

® * © о «

* 3 1 s ° г о

Рис. 5. ТСХ ЛЛФ аранозы в системе «бензол:этилацетат:метанол» (6:3:1) 1-Лиофилизированная ЛЛФ аранозы, 2-Свежеприготовленная липосомальная дисперсия аранозы, З-Субстанция аранозы, 4-«Пустые» липосомы, 5-Фосфатидилхолин, 6-Холестерин, 7-ФЭ-ПЭГ-2000, 8-Сорбиновая кислота.

Как видно из Рис. 5, на хроматограмме пробы лиофилизированной ЛЛФ аранозы видны чёткие пятна: Rf~0,15 (араноза); Rf~0,8 (холестерин); Rf~0,7 (сорбиновая кислота). В пробе свежеприготовленной липосомальной дисперсии пятна детектировали на тех же уровнях Rf, что и для лиофилизированных. В обоих образцах пятно фосфатидилхолина жёлтого цвета наблюдали на старте (Rf~0).

Изучение противоопухолевого действия ЛЛФ аранозы в опытах in vivo Изучили противоопухолевое действие ЛЛФ аранозы по сравнению с нелипосомальной ЛФ на двух опухолевых моделях при различных путях введения (Табл. 9 и 10).

Таблица 9

Изучение противоопухолевого действия липосомалыюй и нелипосомальной ЛФ аранозы на мышах с перевитой лимфоцитарной лейкемией Р-388

Препарат № группы Доза (мг/кг) Путь введе ния Дни введения СПЖ (дни) УПЖ, %

Контроль 1 - - 10,89±1,05 -

ЛЛФ араноза 4 175 в/в 1 и 5 18,8±1,31 73*

5 250 в/бр 1 и 5 13,6±0,89 98*

6 300 в/бр 1 и5 23,4±2,19 115

7 350 в/бр 1 и5 22,2±4,38 104

Нелипосомальная ЛФ аранозы 8 175 в/в 1 и 5 14±1,0 29

9 250 в/бр 1 и 5 22,6±2,07 108*

10 300 в/бр 1 и5 22,2±5,63 104

11 350 в/бр 1 и5 22,6±4,34 108

Таблица 10

Изучение противоопухолевого действия липосомалыюй и нелипосомальной ЛФ аранозы на мышах с перевитой меланомой В-16 при в/в введении

Препарат Доза (мг/кг) ТРО, % (дни от начала опыта) УПЖ, % Гибель от токсичности

7 10 14 17 20 24

Нелипосомальная ЛФ аранозы 175 67 69 56 58 43 32 17 0/8

250 85 87 62 57 51 41 3* 0/9

300 74 90 66 62 49 34 3 1/9

350 91 92 66 53 29 21 16 2/9

ЛЛФ аранозы 175 75 83 70 62 43 36 7 0/9

250 71 98 95 76 51 51 37* 0/9

300 86 98 88 72 65 14 20 1/9

350 92 99,7 99,8 72 72 66 34 3/9

Как видно из табл. 9, на лимфоцитарной лейкемии Р-388 при внутривенном введении в дозе 175 мг/кг наиболее активной оказалось ЛЛФ аранозы, которая вызывает увеличение продолжительности жизни (УПЖ) мышей равное 73%, тогда как УПЖ при использовании нелипосомальной ЛФ составляет 29%.

После внутрибрюшинного введения наибольший противоопухолевый

эффект для нелипосомальной ЛФ аранозы установлен в дозе 250мг/кг (УПЖ

20

108%) по сравнению с ЛЛФ аранозы для которой УПЖ равно 98%. При применении ЛЛФ аранозы в дозах 300 и 350 мг/кг терапевтический эффект статистически не отличался от противоопухолевого действия нелипосомальной ЛФ аранозы в тех же дозах (Табл. 9)

Из табл.10 видно, что при двукратном внутривенном введении препаратов мышам с перевитой меланомой В-16 большая активность показана при применении ЛЛФ аранозы по сравнению с нелипосомальной ЛФ аранозы. По УПЖ противоопухолевый эффект статистически значимо (р<0,05) выше при введении этих ЛФ в дозе 250 мг/кг: 37 и 3%, соответственно.

Цитотоксическая активность ЛЛФ аранозы в опытах in vitro

Цитотоксическую активность ЛЛФ аранозы оценивали в опытах in vitro на клеточных линиях опухолей человека по сравнению с нелипосомальной ЛФ аранозы (Табл. 11).

Таблица 11

Сравнение цитотоксическоН активности лекарственных форм аранозы

Цитотоксичность на клетках линии Mel Ког, %

Доза препарата ЛФ ЛЛФ ЛФ ЛЛФ ЛФ ЛЛФ

24 ч 48 ч 72 ч

5 мг/мл 59 64 72 83 91 90

2,5 мг/мл 57 67 59 79 89 86

2 мг/мл 58 58 57 68 63 76

1 мг/мл 51 68 54 78 71 84

0,5 мг/мл 23 31 33 57 50 66

0,25 мг/мл 18 12 33 44 37 56

Цитотоксичность на клетках линии Jurkat, %

Доза препарата ЛФ ЛЛФ ЛФ ЛЛФ ЛФ ЛЛФ

24 ч 48 ч 72 ч

5 мг/мл 75 84 87 92 94 93

2,5 мг/мл 73 81 86 93 89 93

2 мг/мл 77 71 87 85 91 89

1 мг/мл 51 75 74 85 85 92

0,5 мг/мл 26 54 43 58 59 72

0,25 мг/мл 16 24 32 38 36 48

Как представлено в табл.11, на клеточной линии метастатической

меланомы Mel Kor максимальный цитотоксический эффект нелипосомальной ЛФ аранозы составил 91 % в концентрации 5 мг/мл, а для ЛЛФ эффект 84 % показан в концентрации 1 мг/мл. В дозе 2,5 и 5 мг/мл цитотоксичность ЛЛФ аранозы равна 86 и 90%, но не превышала значение для нелипосомальной ЛФ.

Цитотоксическая активность ЛЛФ аранозы на Т-клеточном лимфобластном лейкозе Jurkat составила 92 % в такой же концентрации как и на Mel Ког - 1 мг/мл. Для нелипосомальной ЛФ максимальную цитотоксичность 94 % установили в концентрации 1мг/мл.

Сравнение цитотоксической активности двух лекарственных форм аранозы показало, что для ЛЛФ средняя величина ИК50 (концентрация препарата, вызывающая гибель 50% клеток) ниже, чем для нелипосомального лиофилизированного препарата на обеих клеточных линиях на всех сроках инкубации, что говорит о большей эффективности липосомальной формы аранозы.

Общие выводы

1. В результате проведенных исследований предложен состав липосомальной лекарственной формы аранозы со средним диаметром липосом 167±2 нм и включением 77±2%. Разработана технология изготовления липосомальной лекарственной формы аранозы. Введение в состав дисперсионной среды лактозы позволило проводить лиофилизацию липосомальной дисперсии аранозы с минимальным снижением эффективности включения лекарственного вещества и размера везикул.

2. Предложены спектрофотометрические методики количественного определения аранозы в липосомальной лекарственной форме путем измерения оптической плотности спиртовых разведений при 240±2 нм.

3. В результате исследования хроматографического поведения аранозы в липосомальной лекарственной форме методом ТСХ предложена оптимальная система растворителей «бензол-этилацетат-метанол» в

соотношении 6:3:1 и показана эффективность этой системы для подтверждения качественного состава липосом.

4. В проект ФСП «Араноза липосомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 100 мг» внесены показатели качества, предложенные для стандартизации препарата.

5. При изучении цитотоксического эффекта липосомальной лекарственной формы аранозы в опытах in vitro на метастатической меланоме Mel Kor и Т-клеточном лимфобластном лейкозе Jurkat установлена цитотоксичность в меньших дозах по сравнению с нелипосомальной лекарственной формой аранозы.

6. Проведенные исследования in vivo показали, что в/в введение аранозы в липосомальной лекарственной форме мышам с перевитой лимфоцитарной лейкемией Р-388 и меланомой В-16 повышает селективность действия препарата, расширяя тем самым диапазон терапевтических доз и снижая токсичность.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Козеев С.Г., Котова Е.А. Технологические приемы загрузки гидрофильных лекарственных препаратов в липосомы // Тезисы итоговой Всероссийской научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» [Электронный ресурс] - Приложение к журналу «Сеченовский вестник». - Том 3, №1 - С.69. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. - 1 электрон, опт. диск (CD-ROM).

2. Котова Е.А., Козеев С.Г., Краснюк И.И., Оборотова H.A. Установление качественного состава липидов в липосомальных препаратах методом тонкослойной хроматографии // Материалы X Всероссийской научной конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», г. Москва, 22-23 марта 2011 г. -Российский биотерапевтический журнал - 2011. - Том 10, №1. - С. 36-37.

3. Котова Е.А., Санарова Е.В., Козеев С.Г., Ланцова A.B., Орлова О.Л., Партолина С.А., Игнатьева Е.В., Краснюк И.И., Оборотова H.A. Окисление фосфолипидов липосом в процессе лиофилизации // Материалы III Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология», г. Саратов, 6-7 сентября 2011 г. - Российский биотерапевтический журнал - 2011. - Том 10, №4. - С. 101-102.

4. Санарова Е.В., Котова Е.А., Козеев С.Г., Ланцова A.B., Игнатьева Е.В., Краснюк И.И., Оборотова H.A. Качество липосомальных фосфолипидов на этапах технологического процесса // Химико-фармацевтический журнал. -2012. - Том 46, №3. - С. 50-53.

5. Зиновьев П.А., Козеев С.Г. Принципы разработки липосомальной лекарственной формы аранозы // Сборник тезисов Итоговой Всероссийской студенческой научной конференции с международным участием «Татьянин день».-2012.-С. 79-80.

6. Козеев С.Г., Барышникова М.А., Афанасьева Д.А., Полозкова С.А., Оборотова H.A., Ланцова A.B. Сравнение цитотоксического действия двух лекарственных форм аранозы // Материалы XI Всероссийской научной конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», г. Нижний Новгород, 31 мая - 1 июня 2012 г. — Российский биотерапевтический журнал. — 2012. — Том 11, №2. - С. 24.

7. Козеев С.Г., Барышникова М.А., Полозкова С.А., Оборотова H.A. Разработка наноструктурированной липосомальной формы аранозы // Материалы XI Всероссийской научной конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», г. Нижний Новгород, 31 мая - 1 июня 2012 г. - Российский биотерапевтический журнал. - 2012. -Том 11,№2.-С. 24.

Подписано в печать:

07.02.2013

Заказ № 8132 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru