Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Апоптоз кардиомиоцитов как типовая реакция альтерированного сердца

а правах рукописи

Благо нравов Михаил Львович

АПОПТОЗ КАРДИОМИОЦИТОВ КАК ТИПОВАЯ РЕАКЦИЯ АЛЬТЕРИРОВАННОГО СЕРДЦА

14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

2 СЮН 2011

Москва-2011

4849349

Работа выполнена на кафедре общей патологии и патологической физиологии медицинского факультета Российского университета дружбы народов

Научный консультант:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Фролов Виктор Алексеевич

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор Войнов Владимир Антипович

доктор медицинских наук, профессор Русанова Анна Георгиевна

доктор медицинских наук, профессор Рогов Константин Аркадьевич

Учреждение РАМН Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН

Защита диссертации состоится « Л?» 2011 года в /¿Г часов

на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.203.06 при ^Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, уЛгМиклухо-Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале УНИБЦ (Научная библиотека) Российского университета дружбы народов (117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6)

Автореферат размещён на сайте www.vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан «_» _2011 г.

Ученый секретарь Совета Д 212.203.06 Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор , Г.А. Дроздова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По данным ВОЗ, ежегодно в мире от сердечно-сосудистых заболеваний умирают более 16,5 млн. человек, что составляет 29,3% общей смертности. При этом на долю ишемической болезни, гипертензивного и воспалительного поражения сердца суммарно приходится 14,9 % [WHO, 2004].

При длительном течении многих видов патологии сосудов и сердца с высокой долей вероятности происходит формирование хронической сердечной недостаточности (ХСН), которая на сегодняшний день стала одной из самых распространённых и вместе с тем до конца нерешённых проблем клинической медицины. Так, пятилетняя и десятилетняя выживаемость больных с ХСН составляет 50% и 10% соответственно [К. Maclntyre et al., 2000; M.R. Cowie et al., 2000; A. Mosterd et al., 2001], а при наличии дисфункции левого желудочка (ЛЖ) значительно увеличивается риск внезапной сердечной смерти [S.S. Chugh et al., 2008].

Применяемые в современной кардиологической практике медикаментозные средства, оказывающие влияние на патогенез основного заболевания или корректирующие проявления сердечной недостаточности, дают, как правило, лишь временный эффект. На этом фоне неизбежным последствием хронического воздействия на сердце патогенного фактора является прогрессирующее снижение количества жизнеспособных кардиомиоцитов (КМЦ). В этой связи в последнее десятилетие в число приоритетных задач фундаментальных исследований в области экспериментальной и клинической кардиологии устойчиво входит поиск возможных способов преодоления нарушений тканевого гомеостаза сердечной мышцы.

В настоящее время практически не вызывает сомнения тот факт, что определённые патологические процессы в сердечно-сосудистой системе могут сопровождаться как некрозом КМЦ, так и индукцией одного из вариантов программированной клеточной гибели - апоптоза или аутофагии. Показано, что активность апоптотических процессов повышается в миокарде при артериальной гипертензии [A. González et al., 2006], на фоне прогрессирующей дилатационной кардиомиопатии [ЕЛ. Лушникова и др., 2006], аритмогенной правожелудочковой дисплазии [В.Г. Цыпленкова и др., 2007], а также при миокардитах [V. Kyto et al., 2004]. Относительно роли программированной клеточной гибели в изменении морфологии миокарда при его ишемическом повреждении однозначного мнения среди исследователей нет. В одних публикациях отмечается, что очаговая ишемия сопровождается усилением апоптоза КМЦ [М.Г. Рыбакова и др., 2005; A. Abbate et al., 2007], однако, другие авторы придерживаются противоположной точки зрения [G. Takemura et al., 2006]. Некоторое время назад появились данные, свидетельствующие о том, что при ишемии ЛЖ апоптотической гибели подвергаются также КМЦ правого желудочка (ПЖ) [A. Abbate et al., 2008]. Что касается апоптоза КМЦ при воздействии на миокард кардиотоксических веществ, то по этому вопросу

содержится очень мало сведений, как в российской, так и в зарубежной литературе.

Наиболее многочисленные и при этом согласующиеся друг с другом результаты, свидетельствующие об усилении апоптоза КМЦ, были получены при изучении гипертонического повреждения миокарда. Исследования по данной проблеме, проведённые ранее на кафедре общей патологии и патологической физиологии РУДН, позволили установить, что на первой стадии экспериментальной артериальной гипертензии в миокарде обоих желудочков сердца с одной стороны развивается гипертрофия миофибрилл, а с другой - увеличивается интенсивность апоптоза КМЦ. При этом между двумя указанными процессами устанавливается достоверная положительная корреляционная связь. Из этого был сделан вывод, что усиление апоптоза КМЦ при гипертензии является фактором, лимитирующим развитие чрезмерной гипертрофии сердечной мышцы [В.А. Фролов и др., 2004]. Вместе с тем, на сегодняшний день в литературе практически отсутствуют данные о возможном участии апоптотических процессов в морфологической перестройке ЛЖ при адаптации сердца к внезапному повышению систолического сопротивления, которое наблюдается, в частности, при некоторых формах гипертонического криза.

Альтернативным вариантом программированной клеточной гибели является аутофагия, которая сопровождается образованием в цитоплазме аутофагосом, содержащих продукты деградации митохондрий и других интрацеллюлярных субстанций. В отличие от апоптоза, аутофагия не связана с каспазными механизмами и опосредуется катепсиновыми белками и протеазами лизосом [R.A. Lockshin et al., 2002; L.E. Broker et al., 2005]. Считается, что подобный способ элиминации больше характерен для клеток, не способных с самовоспроизведению: для КМЦ, нейронов [К.Е. Larsen et al., 2002; A. Terman et al., 2005]. Интенсификация аутофагии КМЦ происходит при некоторых формах кардиомиопатии [W. Martinet et al., 2007; P. Tannous et al., 2008], при гипертензивной перегрузке сердца [В.А. Rothermel et al., 2008], a также на фоне гибернации миокарда [J. Slezak et а!., 2009].

Известно, что КМЦ млекопитающих являются конечно-детерминированными клетками, обладая крайне низким потенциалом к регенерации в естественных условиях. В этой связи сравнительно недавно получила распространение концепция, согласно которой индукцию апоптоза КМЦ предлагается расценивать в качестве одного из факторов, опосредующих переход от первичной альтерации миокарда к развитию хронической сердечной недостаточности при некоторых заболеваниях сердца [D. Petrovic, 2004; А.К. Sharma et al., 2007]. Подобное видение проблемы во многом определило дальнейший вектор научных исследований, направленных на разработку методов лечения ХСН. Так, в ряде публикаций сообщается о том, что апоптоз КМЦ успешно поддаётся медикаментозной коррекции [G. Mercanoglu et al., 2008; C.D. Garciarena et al., 2009].

Как уже было сказано ранее, некоторые заболевания сердечно-сосудистой системы сопровождаются активизацией аутофагии КМЦ. На этой основе

возникло предположение о том, что и данная разновидность гибели клеток также способна внести свой вклад в развитие XCII [К. Nishida et al., 2008; G.R. De Meyer et al., 2010].

Следует обратить внимание, что убедительных доказательств наличия связи усиления того или иного варианта программированной клеточной гибели со значительным уменьшением массы КМЦ или выраженным нарушением функции ЛЖ и ПЖ в литературных данных не приводится. С другой стороны, апоптоз, являясь нормальным физиологическим феноменом, играет очень важную роль в поддержании тканевого гомеостаза, обеспечивая элиминацию клеток, несущих мутации или содержащих неоантигены. Так, установлено, что при аутоиммунных заболеваниях подавляется апоптоз [Н. Mountz et al., 1994]. Возникает вопрос: всегда ли можно расценивать активизацию апоптоза клеток сердечной мышцы исключительно как негативное явление?

Необходимо также отметить, что в большинстве работ, опубликованных на сегодняшний день, исследовался сам факт индукции апоптозных процессов на основе выявления тех или иных специфических маркёров. Вместе с тем, механизмы апоптогенной сигнальной транедукции в клетках миокарда изучены недостаточно.

Очевидно, что медикаментозный контроль над апоптозом КМЦ может значительно расширить возможности фармакотерапии сердечно-сосудистых заболеваний. Однако фундаментом для разработки обоснованных подходов к данной проблеме является поиск как общих закономерностей, определяющих роль и место программированной клеточной гибели КМЦ, так и конкретных патогенетических механизмов, опосредующих индукцию апоптотических процессов. Таким образом, дальнейшее изучение этого вопроса представляется весьма актуальным. Современное состояние проблемы позволяет допустить в качестве гипотезы, что усиление апоптоза КМЦ является неспецифическим ответом миокарда на воздействие патогенного фактора. В этой связи исследование проводилось в русле разрабатываемой в течение многих лет на кафедре общей патологии и патологической физиологии РУДН концепции о типовых реакциях альтерированного сердца. [В.А. Фролов, 1967; Д.П. Билибин, 1987; ВА. Фролов с соавт., 1995].

Цель исследования.

Изучить особенности центральной гемодинамики, морфо-функциональное состояние сердца и апоптоз КМЦ при трёх типах патологических процессов: гемодинамической перегрузке ЛЖ, очаговой ишемии ЛЖ и диффузном токсическом поражении миокарда; выявить роль указанных патологических процессов в изменении интенсивности апоптотической гибели сердечных миоцитов.

Задачи исследования.

1. Провести анализ центрального артериального давления на фоне острой и хронической перегрузки сердца, очаговой ишемии ЛЖ и дифтерийной интоксикации.

2. Изучить особенности функционального состояния ЛЖ и ПЖ при различных типах повреждения сердца.

3. Исследовать влияние отдельных патологических процессов в сердце на морфологическое состояние миокарда.

4. Определить активность экструзии ядер КМЦ ЛЖ и ПЖ при различных вариантах альтерации сердца.

5. Дать качественную и количественную оценку фрагментации ДНК в ядрах КМЦ при острой перегрузке ЛЖ, очаговой ишемии ЛЖ и диффузном токсическом повреждении миокарда.

6. Исследовать влияние различных вариантов патологических процессов в сердце на индукцию каспазного каскада в миокарде.

7. Оценить механизмы апоптогенной сигнальной трансдукции в клетках миокарда ЛЖ и ПЖ на фоне развития в сердце патологических процессов различного генеза.

Научная новизна. Впервые показано, что при дифтерийной интоксикации и стенозировании восходящей аорты на фоне нарушения биомеханических характеристик ЛЖ не происходит значительного изменения упруго-эластических свойств центральных артерий.

Впервые установлено, что возникновение необратимой фибрилляции желудочков, возникающей при острой коронарной недостаточности, жёстко зависит от времени суток.

Данные морфологического исследования показали, что наиболее глубокое повреждение миокарда происходит в ЛЖ на фоне внезапного повышения посткагрузки. При этом в ткани наблюдаются признаки выраженного внеклеточного отёка, гиперемии и инфильтрации лимфоцитами и гистиоцитами, что свидетельствует о развитии воспалительной реакции. Очаговая ишемия ЛЖ не сопровождается выраженной деструкцией миофибрилл в пренекротической зоне миокарда.

На основании морфологического, иммуногистохимического и биохимического исследования впервые установлено, что на фоне острой гемодинамической перегрузки JDK происходит активизация апоптотичсских процессов в миокарде обоих желудочков сердца.

Впервые показано, что при дифтерийной интоксикации возрастает интенсивность экструзии ядер КМЦ, активизируется фрагментация ДНК в миокарде ЛЖ и ПЖ, а также индукция каспазного каскада в ЛЖ. Полученные данные дают основание говорить об усилении апоптоза КМЦ в обоих желудочках сердца.

Применение морфологической методики детекции апоптоза КМЦ позволило установить, что при дифтерийной интоксикации, а также при острой гемодинамической перегрузке ЛЖ в миокарде обоих желудочков сердца повышается интенсивность экструзии ядер КМЦ во внеклеточное пространство. Однако на фоне ишемического повреждения ЛЖ данный механизм не выражен, несмотря на наличие биохимических и иммуногистохимических признаков усиления апоптоза.

С использованием биохимической методики получены принципиально новые данные о механизмах апоптогенной сигнальной трансдукции в клетках миокарда под влиянием различных патологических факторов. Так, при

стенозировании восходящей аорты индукция каспазного каскада осуществляется в ЛЖ по внешнему (рецепторно-опосредованному) пути. При ишсмическом повреждении ЛЖ, дифтерийном поражении миокарда, а также при перегрузке ПЖ активация каспаз происходит только по внутреннему (митохондриальному) пути.

Теоретическая н практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований позволили расширить существующие представления о фундаментальных механизмах регуляции тканевого гомеостаза миокарда при воздействии на сердце различных патогенных факторов.

В работе показано, что независимо от природы патологического процесса типовым ответом, сопровождающим развитие морфо-функциональных изменений альтерированного миокарда, является интенсификация апоптоза КМЦ обоих желудочков сердца. Установлены конкретные пути апоптогенной сигнальной транедукции и их связь с отдельными нарушениями структуры и сократительной способности сердечной мышцы.

Полученные данные являются основой для постановки новых задач, в частности, по изучению молекулярных механизмов индукции апоптоза при тех или иных заболеваниях сердечно-сосудистой системы, а также открывают возможности для поиска дополнительных методов медикаментозного воздействия на миокард, направленных на управление механизмами программированной клеточной гибели КМЦ.

Выявлены хронобиологические особенности возникновения фибрилляции желудочков при экспериментальной острой коронарной недостаточности. Полученные результаты могут быть использованы для разработки мероприятий, направленных на медикаментозную хронопрофилактику фибрилляции желудочков у пациентов с ишемической болезнью сердца. Кроме того, дается рекомендация исследователям выполнять операции по моделированию очаговой ишемии у кроликов не позднее 15:00 часов с целью минимизации потерь животных.

Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре общей патологии и патологической физиологии медицинского факультета ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» Минобрнауки РФ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Различные по своей природе патологические процессы (очаговая ишемия ЛЖ, острая гемодинамическая перегрузка ЛЖ, дифтерийная интоксикация) сопровождаются развитием комплекса выраженных структурных и функциональных нарушений как ЛЖ, так и ПЖ, некоторые из которых (деструкция миофибрилл, увеличение внутрижелудочкового давления и др.) могут иметь прямое или опосредованное влияние на процесс программированной гибели КМЦ.

2. При острой гемодинамической перегрузке сердца, вызванной стенозированием восходящей аорты, происходит повышение интенсивности апоптоза КМЦ в обоих желудочках за счёт индукции каспазного каскада, реализуемой в ЛЖ либо только по внешнему (рецепторно-опосредованному)

пути, либо по внешнему и внутреннему (митохондриальному) путям, что с учётом признаков воспалительного ответа миокарда косвенно указывает на возможность участия в данной реакции некоторых цитокинов, включая ФНО-а. Тот же тип патологического воздействия на сердце сопровождается в ПЖ активизацией лишь внутреннего пути.

3. Очаговое ишемическое повреждение ЛЖ приводит к увеличению интенсивности апоптотических процессов как в макроскопически неизменённой области самого ЛЖ, так и в миокарде ПЖ. Апоптогенная сигнальная трансдукция осуществляется в КМЦ обоих желудочков по митохондриальному пути. Ведущим механизмом инициации агюптозных стимулов в ЛЖ является гипоксия КМЦ, а в ПЖ - его умеренная гемодинамическая перегрузка, обусловленная застоем крови в малом круге кровообращения в связи со снижением сократительной способности ЛЖ.

4. Диффузное токсическое поражение сердца влечёт за собой усиление апоптоза КМЦ, при этом конкретные молекулярные механизмы, ответственные за данный процесс, имеют определённые особенности для ЛЖ и ПЖ. В ЛЖ передача внутриклеточного сигнала осуществляется по митохондриальному пути с последующим повышением активности каспазы-3. В данном случае за апопотическую гибель КМЦ ПЖ ответственны либо другие ферменты каспазного каскада, либо некаспазные медиаторы.

5. Интенсификация апоптоза КМЦ на фоне выраженных морфо-функциональных изменений миокарда, связанных с альтерацией сердца различного генеза, носит типовой характер. При некоторых видах патологических процессов имеются общие механизмы индукции программированной гибели клеток, однако, для отдельных вариантов повреждения сердечной мышцы характерна специфика в развитии данного феномена.

Апробация работы.

Работа апробирована на VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации», г. Москва, 2007 г; на Международном симпозиуме «Адаптационная физиология и качество жизни: проблемы традиционной и инновационной медицины», посвященном 80-летию академика РАМН H.A. Агаджаняна, г. Москва, 2008 г; на Первом Российском съезде по хронобиологии и хрономедицине с международным участием, г. Владикавказ, 2008; на XIV Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации», г. Москва, 2009 г; на 6 Международном конгрессе по патофизиологии, г. Монреаль (Канада), 2010 г; на VIII Всероссийской конференции по патологии клетки, г. Москва, 2010 г; на Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», г. С.-Петербург, 2010 г; на совместном заседании кафедры общей патологии и патологической физиологии и кафедры патологической анатомии РУДН, 2011 год.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 34 работы, в том числе 1 монография и 17 статей в журналах, входящих в перечень, утверждённый ВАК РФ.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, 4-х глав, в которых изложены результаты собственного исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 230 страницах машинописного текста, содержит 40 таблиц и 59 рисунков. Библиография включает 440 источников российской и зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были поставлены на 210 кроликах-самцах породы «Шиншилла» массой тела 3-3,5 кг и 20 морских свинках. В основных сериях исследования на моделях острой гемодинамической перегрузки ЛЖ, очаговой ишемии ЛЖ и дифтерийной интоксикации в сроки 1, 3 и 5 суток изучались характеристики центрального артериального давления, функциональное и морфологическое состояние желудочков сердца, апоптоз КМЦ с использованием морфологической, иммуногистохимической и биохимической методик. В качестве контроля использовались интактные кролики того же пола, возраста и веса. На каждую из 3-х моделей приходилось по 48 кроликов. Морские свинки использовались для титрования дифтерийного токсина.

Для уточнения особенностей некоторых исследуемых явлений были проведены эксперименты в четырёх дополнительных сериях. В первой из них (20 кроликов) проводился анализ центрального артериального давления в контроле и при вазоренальной гипертензии сроками 1, 2 и 4 недели. Во второй серии на 16 кроликах изучались хронобиологические особенности возникновения фибрилляции сердца методом ЭКГ. В третьей серии (10 кроликов) исследовалась сократительная функция сердца в контроле и через 30 мин от начала острой коронарной недостаточности. В четвёртой серии (20 кроликов) оценивалась интенсивность перекисного окисления липидов в миокарде ЛЖ при дифтерийной интоксикации в контроле и через 1, 3 и 5 сут от начала эксперимента.

Содержание животных и работа с ними проводились в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г. На проведение экспериментов получено разрешение этического комитета медицинского факультета РУДН (протокол № 22 от 20.09.2005 г.).

Методики моделирования патологических процессов. Очаговую ишемию ЛЖ моделировали путём перевязки нисходящей ветви левой коронарной артерии на границе её средней и нижней трети. Гсмодинамическую перегрузку ЛЖ воспроизводили методом сужения восходящей аорты на 1/3 от её первоначального диаметра при помощи металлической спирали. Диффузное поражение миокарда вызывали посредством внутривенного введения животным пативного дифтерийного токсина в количестве 0,3 минимальной летальной дозы, предварительно оттитрованной на морских свинках. Моделирование вазоренальной артериальной гипертензии выполняли путём

сужения брюшной аорты на 1/3 от её исходного диаметра над местом отхождения от неё почечных артерий по Н. Goldblatt et al. (1934).

Методика исследования функционального состояния сердечнососудистой системы. На аппаратно-программном комплексе «Микард», представляющем собой совмещенный с персональным компьютером аналогово-цифровой преобразователь с электроманометрическими датчиками, проводили измерение различных показателей, характеризующих состояние системной и внутрисердечной гемодинамики. Оценку упруго-эластических свойств центральных артерий и биомеханических особенностей ЛЖ проводили методом анализа пульсовой волны.

Методика исследования морфологического состояния сердца. Структурные особенности миокарда ЛЖ и ПЖ изучались методом световой микроскопии полутонких срезов на микроскопе Nikon Eclipse Е-400 с видеосистемой на основе камеры Watec 22IS (Япония). Количественный анализ выполняли методом морфометрии. В каждом препарате с помощью морфометрической программы «Tay Морфология» в 30 полях зрения определяли в об. % содержание миофибрилл, коллагена, сосудов, участков повреждения миокарда, а также объёма внеклеточных пространств.

Исследование апоптоза КМЦ. Апоптоз КМЦ изучали с использованием трёх независимых методик: морфологической, иммуногистохимической и биохимической.

Морфологическое исследование апоптоза КМЦ заключалась в количественном анализе полутонких срезов миокарда ЛЖ и ПЖ (см. выше). В каждом из 30 полей зрения подсчитывали общее количество ядер КМЦ, а среди них - число «свободно лежащих ядер», т.е. ядер с изменённой морфологией (маргинация и конденсация хроматина), находящихся в межклеточных пространствах. Далее вычисляли индекс апоптоза - отношение числа «свободно лежащих ядер» к общему количеству ядер КМЦ.

Иммуногисгг.охимическое исследование апоптоза КМЦ проводилось путём постановки на гистологических срезах миокарда реакции TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) с использованием стандартного набора реактивов Apo-BrdU-IHC In Situ DNA Fragmentation Assay Kit (BioVision, США), позволяющей выявлять в ядрах клеток наличие фрагменгированной ДНК. Индекс апоптоза определяли как отношение числа TUNEL-позитивных ядер КМЦ к общему количеству ядер КМЦ в 50 полях зрения для каждого препарата.

Биохимическая методика исследования механизмов апоптоза КМЦ заключалась в оценке специфической активности эффекторной каспазы-3 и инициаторной каспазы-8 в миокарде колориметрическим методом на ИФА-ридере Sunrise (Тесап) при длине волны 405 им по скорости расщепления синтетического субстрата Ac-DEVD-pNA (N-ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп-нитроанилин) и Ac-IETD-pNA (N-ацетил-Иле-Глу-Тре-Асп-нитроанилин)

Оборудование Центра коллективного пользования (НОЦ) Российского университета дружбы народов, созданного в рамках Инновационной образовательной программы РУДН.

10

соответственно. Все реактивы, использованные в данном исследовании, были произведены фирмой «Sigma» (США).

Статистическая обработка данных проводилась с помощью программ, разработанных на кафедре общей патологии и патологической физиологии РУДН, а также программы «Biostat». Вычислялись среднее значение, ошибка среднего и среднеквадратическое отклонение. Использовался t-критерий Стьюдента. За достоверное принималось отличие средних при р<0.05. Также проводился корреляционный анализ. Связь оценивали по абсолютной величине г - коэффициента корреляции как сильную при г>0.75; связь средней силы -при г = 0.5-0.74; как слабую - при г = 0.25-0.5 (H.A. Плохинский, 1970). г<0.25 оценивалось как отсутствие связи.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности функционального состояния сердечно-сосудистой системы при различных типах повреждения сердца.

В табл. 1 представлены данные, отражающие изменения показателей системной и внутрисердечной гемодинамики при острой перегрузке ЛЖ.

Таблица 1. Показатели функционального состояния сердечно-сосудистой системы в контроле и на различных сроках острой гемодинамической перегрузки ЛЖ (М±т)._

Показатель Контроль Сроки эксперимента

1 сут 3 сут 5 сут

АДсист, мм рт.ст. 135 ±2,6 85 ± 1,3* 105 ±3,2* 110 ± 4,1*

АДдиаст, мм рт. ст. 98 ±1,6 57 ±1,0* 60 ±2,2* 65 ± 3,9*

ВПВО, мсек 31,5 ±1,6 34,8 ± 2,0 44,0 ± 1,1* 48,1 ± 1,7*

ВРПВ, мсек 96,9 ±1,7 101,9 ±0,7* 103,2 ±1,7* 106,0 ±1,9*

ВДр ЛЖ, мм рт.ст. 146,3 ± 7,4 114,2 ±3,7* 127,4 ±3,3* 128,4 ±2,5*

ВДм ЛЖ, мм рт. ст. 247,9 ± 6,5 167,7 ±4,3* 189,0 ±6,3* 195,0 ± 6,0*

ВДр ПЖ, мм рт.ст. 37,5 ± 1,5 28,0 ± 1,5* 29,8 ±2,1* 30,2 ± 1,2*

ВДм ПЖ, мм рт. ст. 54,7 ±2,3 40,7 ±2,3* 43,0 ±3,6* 44,2 ±1,8*

Примечание: здесь и в табл. 2-7 звёздочкой отмечены показатели, достоверно отличающиеся от контроля прир<0,05.

При анализе центрального артериального давления обращают на себя внимание следующие особенности. Систолическое и диастолическое артериальное давление (АДсист и АДдиаст) достоверно снижено по сравнению с контролем на всех сроках эксперимента, что представляется вполне закономерным на фоне выраженного стеноза восходящей аорты. Время появления волны отражения (ВПВО) в 1-е сутки исследования практически не отличается от контрольного уровня, но, начиная с 3-х суток, наблюдается его достоверное увеличение. Это может быть вызвано снижением степени констрикции артерий и артериол, а также упругости стенки центральных сосудов на фоне гипотонии, обусловленной стенозом аорты. При этом неуклонно нарастает время распространения пульсовой волны (ВРПВ).

11

Поскольку пульсовая волна представляет собой сумму ударной и отражённой волн [Котовская Ю.В., Кобалава Ж.Д., 2007], следует предположить, что это связано с удлинением ударной волны в результате нарушения биомеханических характеристик ЛЖ.

К концу 1 суток исследования наблюдается выраженное снижение реального внутрижелудочкового давления в ЛЖ (ВДр ЛЖ). На 3-й сутки эксперимента ВДр ЛЖ достоверно повышается относительно 1-х суток, но контрольного уровня не достигает. Далее, до 5-х суток значение данного показателя практически не меняется. Динамика максимально развиваемого внутрижелудочкового давления ЛЖ (ВДм ЛЖ) выглядит аналогично. Таким образом, в первые 5 суток от начала стенозирования восходящей аорты для ЛЖ характерно выраженное снижение сократительной активности, а также глубокое угнетение его потенциальной работоспособности, что косвенно свидетельствует о наличии знергодефицита в миокарде.

Реальное и максимально развиваемое давление в ПЖ (ВДр ПЖ и ВДм ПЖ) достоверно снижаются на 1 сутки эксперимента и далее вплоть до 5-х суток практически не меняются. По-видимому, в первые часы от начала стенозирования аорты довольно быстро развивается застой крови в малом круге кровообращения, за счёт чего нагрузка на ПЖ резко увеличивается.

При очаговой ишемии ВПВО не меняется по сравнению с контролем ни в один из сроков эксперимента (табл. 2). ВРПВ достоверно увеличивается на 1-е сутки исследования. Очевидно, что это связано с удлинением ударной волны, поскольку, как было упомянуто выше, пульсовая волна представляет собой сумму ударной и отражённой волн. Вероятнее всего, причиной данного изменения, как и в случае со стенозированием аорты, служит значительное нарушение биомеханических свойств ЛЖ. На 3-й сутки ВРПВ возвращается на исходный уровень и далее уже не меняется вплоть до 5-х суток.

Таблица 2. Показатели функционального состояния сердечно-сосудистой системы в контроле и на различных сроках очаговой ишемии ЛЖ (М+т).

Показатель Контроль Сроки эксперимента

1 сут 3 сут 5 сут

АДсист, мм рт.ст. 122,7 ±1,6 105,7 ±2,9* 115,3 ±2,9* 123,5 ± 2,0

АДдиаст, мм рт. ст. 106,6 ±1,0 83,5 ± 2,8* 95,8 ±1,7* 106,4 ±2,1

ВПВО, мсск 39,32 ±3,3 36,2 ±2,2 39,7 ±1,4 38,1 ±3,1

ВРПВ, мсек 102,6 ±3,2 114,5 ±3,4* 108,2 ±3,0 104,4 ±3,4

ВДр ЛЖ, мм рт.ст. 135,7 ±3,2 110,6 ±3,1* 115,6 ±2,8* 117,4± 1,1*

ВДм ЛЖ, мм рт. ст. 182,8 ±3,4 131,8 ±3,7* 139,9 ±3,8* 144,6 ±3,8*

ВДр ПЖ, мм рт.ст. 31,5 ±0,6 50,1 ± 1,0* 47,1 ± 1,2* 46,6 ± 0,8*

ВДм ПЖ, мм рт. ст. 47,0 ± 1,0 59,8 ± 1,5* 53,3 ± 1,6* 55,6 ±1,3*

Таким образом, анзлиз пульсовой волны свидетельствует о том, что упруго-эластические свойства центральных артерий не претерпевают существенных изменений в первые несколько суток от начала острой

коронарной недостаточности, а наблюдаемые нарушения системной гемодинамики вероятнее всего связаны с развитием систолической дисфункции ЛЖ.

На 1-е сутки после моделирования очаговой ишемии отмечается значительное достоверное снижение ВДр ЛЖ (на 18,5%). В последующие сроки эксперимента данный показатель начинает постепенно увеличиваться, однако, вплоть до 5-х суток он остаётся достоверно ниже контрольного уровня. Аналогичная динамика характерна и для ВДм ЛЖ.

ВДр ПЖ в конце 1-х суток исследования достоверно увеличивается, затем, в последующие сроки, несколько снижается, но остаётся при этом выше нормы, что, по-видимому, связано со значительно возросшей на ПЖ гемодинамической нагрузкой, обусловленной застоем крови в малом круге кровообращения. Кроме того, начиная с первых суток, значительно сокращается разница между ВДр ПЖ и ВДм Г1Ж, однако, абсолютное значение ВДм ПЖ на всех сроках остается достоверно выше, чем в контроле.

Хронобиологические особенности возникновения фибрилляции сердца при очаговой ишемии ЛЖ. В ходе проведённого исследования была установлена чёткая связь между возникновением ФЖ сердца и временем суток, в которое животным выполняли операцию по воспроизведению острой коронарной недостаточности (ОКН). У кроликов, которым ОКН моделировалась в зимний период (декабрь) с 15:30 до 18:00 часов, во всех случаях (7 животных) на 9 - 15 минуте после перевязки коронарной артерии возникала фибрилляция желудочков: сначала в виде коротких фрагментов, чередующихся с синусовым ритмом, затем переходящая в постоянную необратимую форму, заканчивающуюся асистолией и гибелью животных. Кролики, у которых перевязка коронарной артерии была выполнена в период с 11:00 до 15:00, в 89 % случаев (8 животных из 9) выжили после операции. При этом даже явлений обратимой кратковременной фибрилляции у них не наблюдалось. И лишь один кролик из 9, прооперированных в данный период, погиб от ФЖ. Эти результаты в значительной степени определили выбор времени постановки наших экспериментов.

Влияние ОКН на функциональное состояние желудочков сердца. В предыдущих подразделах были описаны изменения сократительной активности ЛЖ и ПЖ, развивающиеся в течение первых 5-ти суток от начала нарушения проходимости нисходящей ветви левой коронарной артерии. При этом минимальный срок, в который производилась оценка функционального состояния желудочков, был 24 часа. Между тем, как было показано в предыдущем подразделе, уже в первые минуты после возникновения ишемии могут произойти фатальные события в сердце. В этой связи мы сочли необходимым провести дополнительную серию экспериментов, в которой реальная и потенциальная работоспособность ЛЖ и ПЖ изучались на фоне ОКН. Согласно данным, представленным в табл. 3, развитие ОКН в остром эксперименте не сопровождается статистически значимым изменением ВДр ЛЖ и ВДр ПЖ. Вместе с тем, ВДм ЛЖ и ВДм ПЖ достоверно снижаются. Таким образом, в самый ранний период ишемического повреждения ЛЖ

выраженного снижения реальной сократительной активности ЛЖ и ПЖ не происходит. Однако угнетается их потенциальная работоспособность. Следовательно, по крайне мере, латентное нарушение функции обоих желудочков сердца развивается уже с первых минут формирования коронарной недостаточ ности.

Таблица 3. Показатели функциональной активности ЛЖ и ПЖ кроликов в

роле и через 30 мин от начала ОКН (М±т).

Показатель Контроль ОКН

ВДр ЛЖ, мм рт.ст. 137,9 ±5,95 147,5 ±3,51

ВДм ЛЖ, мм рт. ст. 258,8 ± 3,63 248,3 ±1,95*

ВДр ПЖ, мм рт.ст. 36,5 ± 0,74 37,4 ±0,32

ВДм ПЖ, мм рт. ст. 71,7 ±1,37 60,5 ±0,33*

Результаты исследования системной и внутрисердечной гемодинамики при дифтерийной интоксикации приведены в табл. 4.

Таблица 4. Показатели функционального состояния сердечно-сосудистой системы в контроле и на различных сроках дифтерийной интоксикации (М±т).

Показатель Контроль Сроки эксперимента

1 сут Зсут 5 сут

АДсист, мм рт.ст. 142,8 ± 1,8 124,4 ±3,7* 116,8 ±0,6* 131,8 ±3,3*

АДдиаст, мм рт. ст. 119,4 ±1,4 105,6 ±3,5* 105,2 ±0,5* 110,2 ±3,0*

ВПВО, мсек 40,2 ±1,3 36,4 ± 1,6 39,2 ±1,1 39,7 ±2,8

ВРПВ, мсск 107,9 ±2,1 109,4 ±2,8 116,5 ±3,4* 117,6 ±3,8*

ВДр ЛЖ, мм рт.ст. 139,6 ±1,3 113,7 ± 1,5* 114,2 ±1,7* 123,4 ±2,1*

ВДм ЛЖ, мм рт. ст. 231,4 ±6,5 178,3 ±4,7* 146,3 ± 3,2* 187,3 ±4,4*

ВДр ПЖ, мм рт.ст. 36,4 ± 1,2 28,7 ± 0,7* 29,7 ±0,8* 33,9 ±1,0

ВДм ПЖ, мм рт. ст. 53,5 ±1,8 41,9 ±1,3* 35,4 ± 1,0* 51,4 ±2,2

БПВО не меняется ни на одном из сроков исследования. ВРПВ достоверно увеличивается к 3-м суткам процесса и остаётся на данном уровне вплоть до 5-х суток. Это могло бы свидетельствовать о снижении жёсткости артериальной стенки центральных сосудов. Однако поскольку время прихода волны отражения не меняется, следует предположить, что опять же замедление пульсовой волны не связано с изменением свойств сосудистой стенки и скорее обусловлено удлинением ударной волны вследствие значительного снижения сократительной силы ЛЖ.

В 1-е сутки наблюдения отмечалось достоверное снижение ВДр ЛЖ и ВДм ЛЖ соответственно на 20% и 23%. На 3-й сутки исследования ВДр ЛЖ оставалось на уровне 1-х суток, а ВДм ЛЖ продолжало снижаться, достигая максимально низкого значения (уменьшение на 37% по сравнению с контролем). К 5-м суткам исследования ВДр ЛЖ увеличивалось по сравнению с двумя предыдущими сроками, но, тем не менее, оставалось достоверно ниже

нормы. ВДм ЛЖ также увеличивалось относительно 3-х суток, но контрольного уровня не достигало. Таким образом, на 3-й сутки от начала дифтерийной интоксикации наблюдается наиболее глубокое угнетение, как реальной сократительной активности, так и потенциальной работоспособности ЛЖ.

ВДр ПЖ и ВДм ПЖ достоверно уменьшаются на 1-е сутки исследования. Однако, в отличие от ЛЖ, дальнейшего снижения ВДр не наблюдается. ВДм Г1Ж на 3-й сутки продолжает снижаться и достигает минимального за всё время эксперимента уровня. К 5-м суткам как ВДр ПЖ, так и ВДм ПЖ возвращаются практически к исходному значению и уже достоверно от контроля не отличаются.

Морфологическая характеристика миокарда при альтерации сердца различного генеза.

При острой гемодинамической перегрузке ЛЖ были обнаружены следующие особенности. В ЛЖ с 1-х суток стенозирования аорты наблюдается выраженное повреждение ткани: площадь участков деструкции возрастает по сравнению с контролем в 13,4 раза, а в последующие сроки этот показатель, хоть и немного снижается, но, тем не менее, остаётся в несколько раз выше контрольного значения. В ПЖ доля повреждённых участков миокарда достоверно увеличивается только на 5-е сутки, отличаясь от нормы лишь в 1,44 раза. При этом на всех сроках исследования объёмная доля участков деструкции в ЛЖ достоверно выше, чем в ПЖ (рис. 1).

срок исследования, сут Рис. 1. Площадь участков деструкции в миокарде ЛЖ и ПЖ при острой перегрузке ЛЖ. Столбики - средние значения, планки погрешностей -ошибки среднего (в %). Серые столбики - ЛЖ, чёрные столбики - ПЖ. * р<0.05 по сравнению с контрольной группой.

В ЛЖ уже на 1-е сутки происходит достоверное снижение площади жизнеспособных миофибрилл (на 29,8%), а затем данный показатель вплоть до 5-х суток практически не изменяется. Для ПЖ уменьшение доли мышечных волокон не характерно (рис. 2).

100 90 • 80 ■

контроль 13 5

срок исследования, сут

Рис. 2. Объёмная доля мышечных волокон в миокарде ЛЖ и ПЖ при острой перегрузке ЛЖ. Столбики - средние значения, планки погрешностей - ошибки среднего (в %). Серые столбики - ЛЖ, чёрные столбики - ПЖ. * р<0.05 по сравнению с контрольной группой.

Кроме того, в 1-е сутки эксперимента в миокарде ЛЖ наблюдается увеличение площади микрососудов. В ПЖ объёмная доля сосудов, напротив, уменьшается к 3-м суткам исследования.

Для миокарда ЛЖ также характерно достоверное увеличение объёма внеклеточного пространства на всех сроках эксперимента, что указывает на развитие зкстрацеллюлярного отёка.

Наконец, в ЛЖ появляется лейкоцитарная инфильтрация, которая вкупе с упомянутыми выше внеклеточным отёком и гиперемией свидетельствует о развитии воспалительного ответа. В ПЖ подобные: явления отсутствуют.

В отличие от острой перегрузки, при очаговой ишемии в ЛЖ не наблюдается выраженного нарушения структурной целостности ткани. По-видимому, в макроскопически неповреждённых участках миокарда имеет место гибернация без явных некротических явлений. В ПЖ, испытывающем газодинамическую перегрузку на фоне ослабления сократительной активности ЛЖ, уже с 1-х суток возникает деструкция ткани, которая в последующие сроки лишь усугубляется.

Обращает на себя внимание значительное повышение по сравнению с контрольной группой содержания коллагена, которое обнаруживается в ЛЖ уже с 1-х суток и достигает максимума на 3-й сутки. В ПЖ достоверное увеличение объёмной доли коллагена отмечается на 5-е сутки (рис. 3). По-видимому, усиление синтеза коллагена представляет собой одну из ранних защитных реакций сердечной мышцы на повреждение, направленную на повышение собственной прочности.

20 18 16 14 12 Ю

«5 о О й

6 4 2 0

контроль

срок исследования, сут Рис. 3. Содержание коллагена в миокарде ЛЖ и ПЖ при очаговой ишемии ЛЖ. Сплошная линия - ЛЖ, прерывистая линия - ПЖ; а, б - линии тренда для ЛЖ и ПЖ соответственно; *р<0.05 по сравнению с контрольной группой.

Анализ морфологического состояния миокарда при дифтерийной интоксикации выявил две наиболее характерных особенности:

1. отмечается нарастающее по мере развития патологического процесса увеличение площади деструкции миофибрилл, которое к 5-м суткам достигает более высокой степени в ПЖ (рис. 4). Очевидно, что при одной и той же концентрации дифтерийного токсина ПЖ, имеющий значительно меньшую мышечную массу по сравнению с ЛЖ, подвергается в конечном итоге более интенсивному повреждающему воздействию.

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 О

*

Й8

контроль 13 5

срок исследования, сут

Рис. 4. Площадь участков деструкции в миокарде ЛЖ и ПЖ при дифтерийной интоксикации. Столбики - средние значения, планки погрешностей -ошибки среднего (в %). Бесцветные столбики - ЛЖ, серые столбики - ПЖ. * р<0.05 по сравнению с контрольной группой.

2. в миокарде обоих желудочков сердца снижается содержание коллагена (рис. 5), что можно связать с денатурирующим эффектом дифтерийного токсина, хотя в литературе отсутствуют сведения, подтверждающие данную гипотезу.

контроль

1 3

срок исследования, сут

Рис. 5. Содержание коллагена в миокарде ЛЖ и ПЖ при дифтерийной интоксикации. Сплошная линия - ЛЖ, прерывистая линия - ПЖ; * р<0.05 по сравнению с контрольной группой.

Влияние острой гемодинаминеской перегрузки ЛЖ на апоптотические процессы в миокарде ЛЖ и ПЖ,

Согласно данным морфометрического анализа, на 1-е сутки исследования в миокарде ЛЖ достоверно увеличивается абсолютное количество «свободно лежащих ядер» (рис. 6).

1 1 0,8 0,8 0,7 0,6 0,5 ОД

о;< 0,2 -од о

контроль 13 5

срок исследования, су га

контроль 13 5

срок исследования, сут

Рис. 6. Морфологические показатели апоптоза КМЦ миокарда ЛЖ и ПЖ. а -«свободно лежащие ядра»; б - индекс апоптоза (отношение числа «свободно лежащих ядер» к общему количеству ядер КМЦ). Сплошная линия - ЛЖ, прерывистая линия - ПЖ. * р<0.05 по сравнению с контрольной группой.

18

В последующие сроки данный показатель неуклонно возрастает и к 5-м суткам становится в 2,5 раза выше контрольного уровня. Аналогичная динамика наблюдается и в отношении индекса апоптоза.

В ПЖ в первые трос суток исследования количество «свободно лежащих ядер» и индекс апоптоза практически не отличаются от контроля, но на 5-е сутки оба показателя достоверно увеличиваются.

Результаты иммуногистохимического исследования апоптоза. В ЛЖ в контрольной группе иммуногистохимическая реакция на олигонуклеотиды -продукты фрагментации ДНК отрицательна в большей части ядер КМЦ. ИЖЕЬ-позитивные КМЦ встречаются в незначительном количестве.

На 1-е сутки исследования в миокарде ЛЖ существенно увеличиваегся количество ПЖЕЬ-позитивньгх КМЦ. В большинстве участков с положительной иммуногистохимической реакцией находятся одиночные окрашенные ядра. По' данным морфометрического анализа, наблюдается достоверное повышение по сравнению с контрольной группой индекса апоптоза (рис. 7 А). К 3-м суткам эксперимента количество ТЦЫЕЬ-позитивных КМЦ продолжает увеличиваться. По сравнению с предыдущим сроком гораздо чаще встречаются участки, представляющие собой группы клеток с положительной ИГХ реакцией. Необходимо отметить, что для ТНИБЬ-позитивных КМЦ не характерны признаки нарушения их структурной целостности. Также отмечается выраженное повышение индекса апоптоза относительно предыдущего срока исследования.

0.35

о,з ■

0.25 ■ 0.2 • 0.15 0.1 0,05

о

гЬ

контроль 13 5

срок исследования, суш

0.35 ■ 0.3 ■ 0.25 0,2 ■ 0.15 ■ 0,1 0.05 -0

"А Г-Ь

контроль 13 5

срок исследования, еут

Рис. 7. Индекс апоптоза (отношение числа Т1ПЧ(ЕЬ-1юзитивных ядер к общему количеству ядер КМЦ) в миокарде желудочков сердца при острой гемодинамической перегрузке ЛЖ. А - ЛЖ, Б - ПЖ; планки погрешностей -ошибки среднего (в %); * р<0.05 по сравнению с контрольной группой.

На 5-е сутки отмечается некоторое уменьшение количества ПЖЕЪ-позитивных ядер КМЦ. Индекс апоптоза начинает снижаться, однако, он по-прежнему остаётся на уровне, достоверно более высоком по сравнению с контрольной группой.

В ПЖ в контрольной группе наблюдается небольшое количество ТЦКЕЬ-позитивных ядер КМЦ. Аналогичная картина характерна для миокарда ПЖ вплоть до 3-х суток от начала стенозирования аорты. При этом индекс апоптоза на 1 и 3 сутки эксперимента практически не меняется (рис. 7Б). Однако на 5-е сутки отмечается резкое увеличение числа положительно окрашенных ядер КМЦ, а индекс апоптоза повышается в 2,3 раза по сравнению с контролем.

В табл. 5 представлены данные биохимического исследования апоптотической активности в миокарде желудочков сердца кроликов при стенозе восходящей аорты.

Таблица 5. Активность каспаз в миокарде желудочков сердца при острой гемодинамической перегрузке ЛЖ (М±т).___

j Показатель Контроль 1 сутки 3 суток 5 суток

ЛЖ Каспаза-3 нмоль/мин/мл 0,1 ±0,01 0,16 ±0,02* 0,16 ± 0,02* 0,15 ±0,04

Каспаза-8 нмоль/мин/мл 0,19 ± 0,05 0,39 ± 0,05* не определяли не определяли

ПЖ Каспаза-3 нмоль/мин/мл 0,08 ± 0,01 0,11 ±0,03 0,17 ±0,01* 0,14 ±0,01*

Каспаза-8 нмоль/мин/мл 0,28 ± 0,06 не определяли 0,35 ± 0,03 не определяли

В данной и в последующих сериях эксперимента оценка активности каспазы-8 проводилась только в контроле и на тех сроках, когда активность каспазы-3 достигала максимального значения. Это связано с тем, что каспаза-8 является инициаторным ферментом и по её активности можно лишь судить о вовлечённости внешнесигнального механизма в процесс стимуляции апоптоза.

Из данных табл. 5 следует, что через 1 сутки от начала стенозирования восходящей аорты происходит достоверное увеличение активности каспазы-3 по сравнению с контрольной группой. К концу 3-х суток процесса этот показатель остаётся на уровне предыдущего срока исследования, а к 5-м суткам немного снижается и уже не имеет достоверного отличия от контроля. Активность каспазы-8 в миокарде ЛЖ на 1-е сутки патологического процесса значительно и достоверно повышена по сравнению с контрольной группой. Полученные результаты свидетельствуют о том, что индукция апоптотической гибели клеток миокарда ЛЖ осуществляется, в том числе, по внешнему сигнальному пути, для которого ключевым механизмом является взаимодействие специфических рецепторов с внеклеточными лигандами-триггерами апоптоза.

В ПЖ на первые сутки эксперимента наблюдается лишь тенденция к увеличению активности каспазы-3. Однако через 3 суток данный показатель резко возрастает и становится достоверно выше по сравнению с контролем. К 5-м суткам наблюдается некоторое снижение активности каспазы-3 относительно предыдущего срока, но отличие от контрольного, значения продолжает оставаться достоверным. На 3-й сутки эксперимента, когда,

согласно нашим данным, активность каспазы-3 достигает своего пикового уровня, активность каспазы-8 в миокарде ГШ не имеет статистически значимого отличия от контрольной группы. Это указывает на отсутствие участия в индукции каспазного каскада внешних аполтогенных ситмулов, опосредующих своё влияние через рецепторный аппарат клеток.

Влияние очаговой ишемии ЛЖ на апэптотическне процессы в миокарде желудочков сердца.

При морфологическом исследовании апоптоза КМЦ были получены следующие результаты. В ЛЖ индекс апоптоза не имеет статистически значимого отличия от контроля ни на одном из сроков исследования (рис. 8). Таким образом, экструзия ядер как механизм апоптоза КМЦ при очаговой ишемии ЛЖ не выражена.

Для ПЖ характерна иная картина. Индекс апоптоза достоверно увеличивается к концу первых суток эксперимента, а затем снижается практически до уровня контроля. По-видимому, немедленной реакцией ПЖ на перегрузку, вызванную ослаблением сократительной функции ЛЖ в результате его очаговой ишемии, является усиление апоптоза КМЦ, но несколько позже происходит включение определённых адаптационных механизмов, снижающих его интенсивность.

о,з-

0,250,2" 0,150,1 ■ 0,050 ■

контроль 1 з 5

срок исследования, сут

Рис. 8. Индекс апоптоза (отношение числа «свободно лежащих ядер» к общему количеству ядер КМЦ) в миокарде ЛЖ при его очаговой ишемии. Сплошная линия - ПЖ, прерывистая линия - ЛЖ. * р<0.05 по сравнению с контрольной группой.

Иммуногистохимическая оценка апоптоза КМЦ при очаговой ишемии ЛЖ. В контрольной группе в миокарде ЛЖ ТЦЫЕЬ-позитивные ядра КМЦ определяются в незначительном количестве. Индекс апоптоза составляет 0,14 (рис. 9А). На 1-е сутки от начала эксперимента данный показатель остаётся без изменений. Однако на 3-й сутки число положительно окрашенных ядер КМЦ

21

*

существенно возрастает. При этом отмечается достоверное увеличение индекса аиоптоза. К 5-м суткам исследования индекс апоптоза возвращается на уровень контроля.

В ПЖ в контрольной группе обнаруживается небольшое количество ТШ4ЕЬ-позитивных ядер КМЦ. Индекс апоптоза, как и в ЛЖ, составляет 0,14. На 1-е сутки происходит увеличение количества положительно окрашенных ядер (рис. 9Б). Достоверно повышается индекс апоптоза. На 3-й сутки интенсивность апоптотических процессов практически не отличается от предыдущего срока. К 5-м суткам исследования отмечается снижение индекса апоптоза, но при этом он продолжает оставаться достоверно выше контрольного уровня.

0,35

о,з

0.25 • 0.2 ■ 0.15 0.1 0,05 О

ЕЙа

гЬ

контроль 13 5

срок исследования, суш

0,35 1 0.3 ■ 0.25 -0.2 0.15 0,1 ■ 0,05 • О

контроль 13 5

срок исследования, сут

Рис. 9. Индекс апоптоза (отношение числа ТЦЫЕЬ-позитивных ядер к общему количеству ядер КМЦ) в миокарде желудочков сердца при очаговой ишемии ЛЖ. А - ЛЖ, Б - ПЖ; планки погрешностей - ошибки среднего (в %); * р<0.05 по сравнению с контрольной группой.

Результаты биохимического исследования апоптоза КМЦ при очаговой ишемии ЛЖ представлены в табл. 6.

Таблица 6. Активность каспаз в миокарде желудочков сердца при очаговом

Показатель Контроль 1 сутки 3 суток 5 суток

ЛЖ Каспаза-3 нмоль/мин/мл 0,1 ±0,01 0,23 ± 0,03* 0,26 ± 0,04* 0,15 ±0,04

Каспаза-8 пмолъ/мин/мл 0,19 ±0,05 не определяли 0,27 ± 0,04 не определяли

ПЖ Каспаза-3 нмоль/мин/мл 0,08 ±0,01 0,14 ± 0,02* 0,17 ±0,03* 0,16 ±0,02*

Каспаза-8 нмоль/мин/мл 0,28 ± 0,06 не определяли 0,34 ± 0,04 не определяли

К концу 1-х суток эксперимента в миокарде ЛЖ достоверно увеличивается активность каспазы-3. На 3-й сутки данный показатель

продолжает повышаться, достигая максимума, а на 5-е сутки начинает снижаться относительно предыдущего срока и уже не отличается достоверно от контроля. Полученные данные указывают на активизацию ферментных механизмов, ответственных за апоптоз, в миокарде ЛЖ в острый период его ишемического повреждения. Активность каспазы-8, которая определялась на 3-и сутки исследования, приобретает лишь тенденцию к увеличению, но не имеет статистически значимого отличия от контроля. Таким образом, индукция каспазного каскада при ишемии ЛЖ осуществляется, по-видимому, только по внутреннему (митохондриальному) пути и не зависит от внешних механизмов сигнальной трансдукции, опосредованных мембранными рецепторами смерти.

В миокарде ПЖ сердца при очаговой ишемии ЛЖ также отмечается достоверное повышение активности каспазы-3, причём на всех трёх сроках эксперимента. Как и в ЛЖ, активность каспазы-8 в миокарде ПЖ на 3-й сутки исследования не имеет достоверного отличия от контрольного уровня, что опять же свидетельсгвует о реализации механизмов апоптоза клеток миокарда лишь по внутреннему сигнальному пути.

Влияние дифтерийной интоксикации на апоптотические процессы в миокарде ЛЖ и ПЖ.

Морфологическая оценка интенсивности апоптоза КМЦ. На 1-е сутки эксперимента отмечается незначительная тенденция к увеличению числа «свободно лежащих ядер» и индекса апоптоза (рис. !0).

срок исследования, сут срок исследования, сут

Рис. 10. Морфологические показатели, характеризующие апоптоз КМЦ миокарда ЛЖ и ПЖ при дифтерийной интоксикации; а - «свободно лежащие ядра»; б - индекс апоптоза (отношение числа «свободно лежащих ядер» к общему количеству ядер КМЦ). Сплошная линия - ЛЖ, прерывистая линия -ПЖ. * р<0.05 по сравнению с контрольной группой.

К 3-м суткам тенденция к повышению уровня данных показателей сохраняется, однако, отличие от контрольной группы по-прежнему остаётся статистически незначимым. К исходу 5-х суток количество «свободно лежащих ядер» и индекс апоптоза впервые становится достоверно выше контрольного значения. Полученные данные позволяют говорить о том, что к 5-м суткам

дифтерийной интоксикации в миокарде ЛЖ происходит активизация апоптотических процессов, реализуемых за счёт механизма экструзии ядер КМЦ.

В ПЖ на 1-е сутки эксперимента остаются практически в пределах контроля как количество «свободно лежащих ядер», так и индекс апоптоза. На 3-й сутки наблюдается достоверное увеличение числа «свободно лежащих ядер», а также появляется тенденция к повышению индекса апоптоза. К 5-м суткам исследования количество «свободно лежащих ядер» ещё больше возрастает, а также резко увеличивается и становится достоверно выше контрольного уровня индекс апоптоза. Таким образом, экструзия ядер как проявление апоптотической активности КМЦ отчётливо выражена при дифтерийной интоксикации и в ПЖ.

При иммуногистохимическом исследовании в миокарде ЛЖ на 1-е сутки от начала дифтерийной интоксикации отмечается увеличение количества ТЦКЕЬ-позитивных КМЦ. Достоверно повышается индекс апоптоза (рис. 11А). В последующие сроки наблюдается дальнейшее увеличение данного показателя.

В ПЖ на 1-е сутки эксперимента индекс апоптоза не отличается от нормы, на 3-й сутки отмечается его достоверное повышение, однако, к 5-м суткам он возвращается на контрольный уровень (рис. 11 Б). Таким образом, динамика активности апоптотических процессов при токсическом повреждении сердца отличается для ЛЖ и ПЖ.

0.35 0,3 0,25 0,2 0.15 ■ 0,1 • 0,05

о

*

рЬ|

контроль 13 5

срок исследования, суш

0.35 0,3 ■ 0.25 ■ 0,2 0,15 ■ 0.1 0,05 0

контроль 13 5

срок исследования, суш

Рис. 11. Индекс апоптоза (отношение числа ТиМ2Ь-позитивных ядер к общему количеству ядер КМЦ) в миокарде желудочков сердца при дифтерийной интоксикации. А - ЛЖ, Б - ПЖ; планки погрешностей - ошибки среднего (в %); * р<0.05 по сравнению с контрольной группой.

Согласно данным биохимического исследования, специфическая активность каспазы-3 в миокарде ЛЖ на 1-е сутки дифтерийной интоксикации остаётся на уровне контроля (табл. 7). Далее, приобретая выраженную тенденцию к увеличению на 3-й сутки исследования, она становится достоверно выше нормы к 5-м суткам.

Таблица 7. Активность каспаз в миокарде желудочков сердца при дифтерийной интоксикации (М±т)._____

Показатель Контроль 1 сутки 3 сую к 5 суток

ЛЖ Каспаза-3 нмоль/мин/мл 0,11 ±0,01 0,1 ±0,02 0,14 ±0,01 0,15 ±0,0!*

Каспаза-8 нмоль/мин/мл 0,61 ±0,02 не определяли не определяли 0,75 ±0,1

ПЖ Каспаза-3 нмоль/мин/мл 0,09 ±0,02 0,1 ±0,02 0,11 ±0,04 0,08 ± 0,02

Для активности каспазы-8 в миокарде ЛЖ характерна лишь незначительная тенденция к увеличению на 5-е сутки эксперимента. В связи с этим следует полагать, что активизация апоптотических процессов в ЛЖ при дифтерийной интоксикации в основном обусловлена передачей стимулируюшего сигнала по внутреннему (митохондриальному) пути.

В отличие от ЛЖ, в миокарде ПЖ достоверного изменения активности каспазы-3 не происходит ни на одном из сроков исследования. В этой связи определение активности каспазы-8 не проводилось. Полученные данные свидетельствуют о том, что молекулярные механизмы, ответственные за апоптотическую гибель клеток миокарда при его диффузном токсическом повреждении, также имеют свои особенности в ЛЖ и ПЖ.

О неспецифическом характере активизации апоптотических процессов в альтерированном м::окарде и возможных механизмах, инициирующих индукцию программированной гибели КМЦ.

Результаты проведённого исследования позволяют говорить об усилении апоптоза КМЦ на фоне выраженных изменений морфо-функционального состояния сердца, наблюдаемых при воспроизведении трёх различных моделей патологических процессов.

Так, при иммуногистохимическом исследовании было обнаружено, что в миокарде ЛЖ количество Т1ЖЕЬ-позитиеных ядер КМЦ достоверно повышено на всех сроках исследования при стенозировании восходящей аорты и при дифтерийной интоксикации. При очаговой ишемии увеличение числа положительно окрашенных ядер наблюдается на 3-й сутки. При этом наиболее высокая активность апоптотических процессов в ЛЖ характерна для острой гемодинамической перегрузки, при которой к 3 -м суткам эксперимента индекс апоптоза достигает значения 0,32 (в контрольной группе данный показатель равен 0,14).

В ядрах КМЦ ПЖ при острой коронарной недостаточности ЛЖ отмечается повышение интенсивности фрагментации ДНК на всех трёх сроках эксперимента с максимумом на 3-й сутки, а при дифтерийной интоксикации и острой перегрузке ЛЖ - на одном из сроков (на 3-й и 5-е сутки соответственно).

Таким образом, очевидно, что принципиально отличающиеся друг от друга типы альтерации сердца сопровождаются включением одной общей реакции - индукции апоптоза КМЦ обоих желудочков, что позволяет, на наш

взгляд, расценивать её в качестве неспецифического ответа миокарда на повреждение. Вместе с тем, отсутствие синхронности в интенсификации апоптотической гибели, а также существенные отличия в характере функциональных и структурных изменений при разных видах патологического воздействия на сердце заставляют задуматься о существовании определённых особенностей в реализации внутриклеточных механизмов в каждом конкретном случае.

Рассмотрим возможные молекулярные процессы, обеспечивающие передачу апоптозных сигналов в клетках миокарда. Классический путь индукции апоптотической гибели клеток большинства млекопитающих осуществляется с участием аспартат-специфических цистеиновых протеаз, относящихся к семейству каспаз (ICE/CED-3 - interleukin-1 beta-converting enzyme - интерлкейкин-1 бета-превращающий фермент). К настоящему времени описано более 15 ферментов из данного семейства, которое включает в себя 3 подгруппы: провоспалительные, инициаторные и эффекторные. Последние 2 подгруппы формируют так называемый каспазный каскад, ответственный за индукцию, транедукцию и амплификацию внутриклеточных апоптотических сигналов [I. Chowdhury et al., 2008].

Индукция апоптоза может быть обусловлена как внешними стимулами, передаваемыми в клетку через мембранные «рецепторы смерти» (Fas-L и другие лиганды, относящиеся к суперсемейству рецепторов к TNF - фактору некроза опухолей) [D.R. Schultz et al., 2003; M.S. Sheikh et al., 2003], так и специфическими изменениями внутриклеточных молекул, в частности, нарушениями нативной структуры ДНК, при которых запускается митохондриальный механизм программированной клеточной гибели [Kim R. et al., 2006]. Реализация первого из названных путей обеспечивается с участием каспазы-8 [F.L. Kiechle al., 2002; Н.М. Beere, 2005]. Во втором случае через поры митохондриальной мембраны в цитоплазму выходит цитохром С и другие факторы, активирующие каспазный каскад [A. Jourdain et al., 2009; L. Scorrano, 2009]. Однако при любом из описанных вариантов конечным ферментом каспазной цепи, необходимым для конденсации хроматина, фрагментации ДНК с последующим образованием апоптозных телец, является каспаза-3 [A.G. Porter et al., 1999]. Таким образом, данный медиатор может быть использован в качестве универсального маркёра для оценки интенсивности программированной клеточной гибели, независимо от конкретного пути её реализации.

Как уже упоминалось ранее, многие авторы разделяют точку зрения, согласно которой хроническая перегрузка ЛЖ сопровождается усилением апоптоза КМЦ ЛЖ. Нами было показано, что активность эффекторной каспазы-3, напрямую связанной с запуском апоптотической гибели клеток, повышается также и при острой перегрузке ЛЖ. Таким образом, можно утверждать, что на фоне острого стеноза восходящей аорты усиление апоптоза КМЦ опосредовано каспазными механизмами.

Одновременное увеличение активности инициаторной каспазы-8 в миокарде ЛЖ указывает на то обстоятельство, что индукция каспазного каскада

осуществляется, в том числе, по внешнему пути, связанному с передачей апоптогенного сигнала через мембранные рецепторы смерти. Возможной причиной включения данного механизма мы считаем выраженное нарушение структурной целостности миокардиальных элементов, вызванное чрезмерной нагрузкой, падающей на ЛЖ при внезапно возникающем стенозе аорты. Данное повреждение, вызывая воспалительный ответ (отчётливые признаки воспаления были обнаружены нами при морфологическом исследовании), может привести к накоплению в миокарде активных молекул цитокинового семейства, включая те из них, которые являются триггерами апоптоза (ФНО-а и др.), в том числе для КМЦ [S.B. Haudek et a]., 2007]. Вместе с тем, трудно с уверенностью сказать, является ли данный механизм единственным, или он сочетается с активацией каспаз по внутреннему (митохондриальному) сигнальному пути. В некоторых исследованиях было показано, что при экспериментальной хронической перегрузке сердца различного генеза в КМЦ повышается активность как каспазы-8, так и каспазы-9 (опосредующей митохондриальный путь апоптоза) [S.D. Lee et al., 2006; N. Moorjani et al, 2006]. Однако на сегодняшний день в литературе нет данных относительно того, меняется ли активность указанных каспаз при острой перегрузке сердца. В качестве возможной причины активации митохондриального механизма можно рассматривать компенсаторное и при этом избыточное поступление в КМЦ ионов кальция, что, по утверждению X. Chen и соавт. (2005), с одной стороны ведёт к повышению сократительной способности КМЦ, а с другой вызывает индукцию апоптоза по внутреннему сигнальному пути.

С целью выяснения возможных вариантов взаимосвязи между индукцией каспазного каскада и изменениями внутрисердечной гемодинамики при острой перегрузке ЛЖ мы провели корреляционный анализ по средним значениям между соответствующими показателями ЛЖ и ПЖ (табл. 8).

Таблица 8. Корреляционные связи между показателями сократительной

Пары показателей Коэффициент коррелкции

ВДр ЛЖ - активность каспазы-3 в ЛЖ -0,9

В Дм ЛЖ - активность каспазы-3 в ЛЖ -0,96

ВДр ПЖ - активность каспазы-3 в ПЖ -0,64

ВДм ПЖ - активность каспазы-3 в ПЖ - 0,66

Результаты корреляционного анализа свидетельствуют о том, что для процесса в целом существует сильная отрицательная связь между реальным и максимально развиваемым внутрижелудочковым давлением ЛЖ и активностью каспазы-3 в ЛЖ. На первый взгляд, имеются основания рассматривать два механизма, которыми можно объяснить данную связь: либо сократительная способность ЛЖ падает в результате апоптотической гибели КМЦ, обеспечиваемой каспазой-3, либо снижение сократительной способности миокарда ЛЖ становится причиной индукции каспазного каскада. Однако есть

27

соображения, которые заставляют усомниться в существовании прямой взаимосвязи между установленными в ходе настоящего исследования явлениями. С одной стороны, судя по степени повышения активности каспазы-3 в ЛЖ, усиление апоптоза клеток миокарда происходит не настолько резко, чтобы за короткий срок привести к значительной потере числа КМЦ и, как следствие, вызвать выраженное снижение сократительной функции миокарда. С другой стороны, на сегодняшний день отсутствуют доказательства возможности индукции апоптоза КМЦ в результате снижения контрактильной активности сердечной мышцы. В этой связи представляется более убедительным следующее объяснение результатов корреляционного анализа по ЛЖ. Рассматриваемые нами явления могут быть связаны общим причинным фактором, в качестве которого следует в первую очередь рассматривать выраженную деструкцию миофибрилл.

Повышение активности каспазы-3 в ПЖ сердца представляется также вполне закономерным, поскольку при значительной перегрузке ЛЖ развивается застой крови в малом круге кровообращения и, как следствие, увеличивается нагрузка на миокард ПЖ. Однако в данном случае не происходит выраженного повреждения структурных элементов сердечной мышцы, в связи с чем при отсутствии воспалительной реакции апоптогенная сигнальная трансдукция реализуется лишь по внутреннему (митохондриальному) пути, о чём убедительно свидетельствует статистически незначимое отличие активности каспазы-8 в контроле и на 3-й сутки исследования. Возможно, именно это и обусловливает существование отрицательной корреляционной связи лишь средней силы между показателями сократительной способности ПЖ и активностью каспазы-3.

При очаговой ишемии ЛЖ, как показали результаты настоящего исследования, в пренекротической зоне ЛЖ наблюдается повышение активности касапазы-3 в миокарде обоих желудочков сердца. Активность каспазы-8 не отличается достоверно от контроля ни в ЛЖ, ни в ПЖ. При этом в ЛЖ деструкции миофибрилл практически не наблюдается, а в миокарде ПЖ имеются признаки умеренного повреждения. Напомним также, что воспалительные явления не характерны ни для ЛЖ, ни для ПЖ.

Данные корреляционного анализа между функциональными показателями желудочков сердца и активностью каспазы-3 приведены в табл. 9.

Таблица 9. Корреляционные связи между показателями сократительной

Пары показателей Коэффициент корреляции

В Др ЛЖ - активность каспазы-3 в ЛЖ -0,86

В Дм ЛЖ - активность каспазы-3 в ЛЖ -0,86

ВДр ПЖ - активность каспазы-3 в ПЖ + 0,89

ВДм ПЖ - активность каспазы-3 в ПЖ + 0,65

Между ВДр JDK и активностью каспазы-3, а также между ВДм ЛЖ и активностью каспазы-З в ЛЖ отмечается сильная отрицательная корреляционная связь. Однако, как и при острой перегрузке ЛЖ, мы не склонны видеть в этих результатах прямую взаимозависимость. По-видимому, снижение сократительной функции ЛЖ и апоптоз КМЦ связаны общим механизмом, в роли которого весьма вероятно может выступать гипоксия в ишемизированных КМЦ. Известно, что выраженный и продолжительный дефицит кислорода в клетках стимулирует митохондриальные механизмы их апоптотической гибели [А.Е. Greijer et al., 2004]. В частности было установлено, что в условиях гипоксии в клетках активизируется фактор HIF-1-alpha (hypoxia inducible factor 1-alpha - фактор, индуцируемый при гипоксии 1-альфа), который стабилизирует проапоптознын белок р53 [D. Chen et al., 2003], а также увеличивает продукцию белков BNIP3 и NIX, связывающих и тем самым подавляющих активность антиапоптозного протеина Вс1-2 [J.M. Boyd et al., 1994; R.K. Bruick, 2000; H.M. Sowter et al., 2001]. Кроме того, гипоксия, нарушая транспорт электронов и протонов по дыхательной цепи, приводит к снижению мембранного потенциала и резкому увеличению проницаемости внутренней мембраны митохондрий. В результате в цитоплазму клетки из митохондрий начинает усиленно поступать цитохром С, который, как известно, является важнейшим внутриклеточным индуктором каспазного каскада [А.Е. Greijer et al., 2004].

Для ПЖ характерна сильная положительная корреляционная связь между ВДр ПЖ и активностью каспазы-3 и положительная связь средней силы между ВДм ПЖ и активностью каспазы-3, что выглядит вполне закономерно и свидетельствует сб индукции ферментативных механизмов апоптоза вследствие значительной гемодинамической перегрузки ПЖ. Это согласуется с данными ряда авторов, показавших, что апоптоз КМЦ усиливается при повышении нагрузки, падающей на миокард [G. Condorelli et al., 1999; В .А. Фролов и др., 2004; Т. Hang, et al., 2007].

При диффузном поражении миокарда, вызванном воздействием дифтерийного токсина, поиск взаимосвязи между функциональным состоянием сердца и каспазной активностью проводился лишь для ЛЖ, т.к. изменения активности каспазы-3 в ПЖ не наблюдалось. При этом достоверных корреляционных связей выявлено не было (табл. 10). По-видимому, имеется определённый асинхронизм в развитии сократительной дисфункции и индукции каспазных механизмов в ПЖ.

Таблица 10. Корреляционные связи между показателями сократительной способности и активностью каспазы-3 при дифтерийной интоксикации.

Пары показателей Коэффициент корреляции

ВДр ЛЖ - активность каспазы-3 в ЛЖ -0,16

ВДм ЛЖ - активность каспазы-3 в ЛЖ -0,42

Следует отметить, что при дифтерийной интоксикации в миокарде ЛЖ происходит стимуляция каспазного каскада по митохондриальному пути, о чём свидетельствует повышение активности каспазы-3 при отсутствии изменения активности каспазы-8. Известно, что фрагмент А дифтерийного гистотоксина, проникающий в клетки, инактивирует фермент трансферазу-Н, необходимый для элонгации полипептидных цепей. В результате в клетках угнетается протеосинтез [В.А. Фролов, М.В. Далин, 1996]. Поскольку в КМЦ процесс обновления белкового состава происходит очень интенсивно, следует предположить, что при дифтерийной интоксикации многие клетки, начиная испытывать дефицит сократительных протеинов, теряют способность полноценно функционировать и встают на путь апоптоза. Однако трудно ответить на вопрос, какой конкретно механизм при данных условиях инициирует возникновение апоптогенного сигнала и его трансдукцию по митохондриальному пути.

Стимуляция каспаз также может быть связана с изменением активности лизосомцых ферментов. Под действием дифтерийного токсина повышается доля свободной (неседиментируемой) активности Ы-ацетил-р-О-глюкозаминидазы, основного фермента лизосом КМЦ [В.А. Фролов, М.В. Далин, 1996], что свидетельствует о повышении проницаемости лизосомальных мембран. При этом имеются данные, согласно которым дестабилизация мембран лизосом с выходом их ферментов в цитоплазму сопровождается деградацией анти-апоптозных протеинов семейства Вс1-2, а это в свою очередь приводит к высвобождению цитохрома С из митохондрий и активированию каспаз [и. Яершк е1 а1., 2010].

Кроме того, дифтерийный токсин конкурентно ингибирует в клетках-мишенях цитохром В [М. Кай, 1972]. В подобных условиях будет происходить нарушение процессов внутриклеточного дыхания и синтеза АТФ. При дефиците последнего, как было показано в некоторых работах, наблюдается повышение активности про-апоптозных белков Вах и Вак, вследствие чего из митохондрий в цитозоль опять же начинает поступать цитохром С, вызывающий индукцию каспазного каскада [Р. 8а1китаг е! а1., 1998; А.Е. Огеуег е1 а]., 2004].

С чем же связано расхождение данных по активности каспазы-3 в ЛЖ и ПЖ? Очевидно, что дифтерийный токсин оказывает одинаковое воздействие на КМЦ обоих желудочков сердца. Однако при одной и той же концентрации токсина в крови его содержание на единицу миокардиалыюй ткани будет выше в ПЖ, обладающем значительно меньшей массой, чем ЛЖ. При этом возможно, что при прямом воздействии на каспазу-3 дифтерийного токсина, накапливающегося в относительно большом количестве в ПЖ, происходит ингибирование этого фермента. В определённой степени подтверждением данной гипотезы служат результаты проведённых нами одиночных исследований, при которых дифтерийный токсин вводился животным в дозе, превышающей Е)ЬМ. На этом фоне, как в ЛЖ, так и в ПЖ определялась активность каспазы-3, более низкая, чем у кроликов, подвергавшихся воздействию токсина в количестве, соответствующем ОЬМ. Вместе с тем,

вызывая определенные метаболические нарушения в КМЦ Г1Ж, дифтерийный токсин может опосредованно стимулировать каспазный каскад, на что косвенно указывает достоверное повышение активности каспазы-3 в ЛЖ. Результирующий же эффект заключается в отсутствии изменений данного показателя в ПЖ при введении животным токсина в дозе 0,3 DLM/кг массы тела.

При сравнении данных биохимического и иммуногистохимического исследования обращает на себя внимание тот факт, что дифтерийная интоксикация является единственным из исследованных нами типов поражения сердца, при котором возможно повышение содержания TUNEL-позитивных КМЦ без увеличения активности каспазы-3. Так, в ЛЖ количество положительно окрашенных ядер КМЦ возрастает уже с 1-х суток эксперимента и в последующие сроки продолжает увеличиваться, а каспаза-3 становится достоверно выше нормы лишь на 5-е сутки. В ПЖ активность каспазы-3 практически не меняется ни на одном из сроков, хотя на 3-й сутки количество ядер КМЦ с положительной реакцией TUNEL повышается по сравнению с контрольной группой. В связи с этим возникают два предположения. Во-первых, интенсификация апоптотических процессов при повреждении миокарда дифтерийным токсином может происходить с участием других эффекторных касг.аз, например, каспазы-7, активность которой нами не определялась. Во-вторых, известно, что существуют альтернативные пути индукции апоптоза клеток, так называемые некаспазиые механизмы. В частности, при возникновении апоптогенного сигнала из митохондрий в цитоплазму, а затем в ядро поступает митохондриальный флавопротеин AIF (apoptosis inducing factor, фактор индуцирующий апоптоз) [Е. Daugas et al., 2000], который активирует эндонуклеазу, расщепляющую ДНК [S.A. Susin et al., 1999; S.A. Susin et al., 2000; E. Daugas et al., 2000], а также способен самостоятельно вызывать конденсацию хроматина и фрагментацию нуклеиновых кислот [S.A. Susin et al., 1999].

Необходимо отдельно остановиться на морфологической оценке апоптоза КМЦ, основанной на подсчёте «свободно лежащих ядер». Считается, что экструзия ядра из клетки в экстрацеллюлярное пространство представляет собой один из механизмов апоптотической гибели КМЦ [M.S. Runge et al., 2000; В.Г. Цыпленкова и др., 2007]. Вместе с тем, литературные данные не дают однозначного ответа на вопрос, является ли данный процесс следствием активизации каспазного каскада или это самостоятельный способ реализации апоптоза. Обратимся к результатам нашего исследования. Данные морфологического и биохимического исследования в целом согласуются друг с другом для обоих желудочков сердца при стенозировании восходящей аорты, а также для ЛЖ при дифтерийной интоксикации. Между тем, в остальных случаях наблюдаются определённые расхождения. Так, индекс апоптоза, рассчитанный как частное от числа «свободно лежащих ядер» и общего количества ядер КМЦ, практически не меняется в ЛЖ при очаговой ишемии, тогда как активность каспазы-3 достоверно увеличивается уже с 1-х суток. При той же модели в ПЖ на 1-е сутки данные по «свободно лежащим ядрам» и

каспазе-3 согласуются, однако, к 3-м суткам активность каспазы-3 становится ещё выше, а индекс апоптоза возвращается на уровень контроля. Наконец, при дифтерийной интоксикации индекс апоптоза возрастает к 5-м суткам эксперимента, при этом активность каспазы-3 не отличается от контроля на всём протяжении исследования. Итак, при очаговой ишемии в ЛЖ и ПЖ, а также при дифтерийной интоксикации в ПЖ количество «свободно лежащих ядер» не зависит от изменения активности каспазного каскада, что позволяет, на наш взгляд, расценивать экструзию ядер как альтернативный механизм апоптотической гибели КМЦ.

Таким образом, активизацию апоптоза КМЦ можно рассматривать как типовую реакцию альтерированного сердца, учитывая при этом, что некоторые конкретные механизмы, ответственные за возникновение и передачу апоптогенных стимулов в клетках миокарда, могут иметь определённые специфические особенности. Представляется, что данная реакция необходима для того, чтобы элиминировать из миокарда повреждённые и функционально неполноценные КМЦ и тем самым, во-первых, предупредить развитие вторичных заболеваний, в частности, аутоиммунных процессов, а во-вторых, оптимально перераспределить нагрузку на функционирующие элементы сердечной мышцы.

ВЫВОДЫ

1. Различные по своей этиологии патологические процессы в сердце приводят к практически однотипным нарушениям сократительной функции и биомеханических характеристик ЛЖ, а также к развитию комплекса выраженных морфологических изменений в миокарде обоих желудочков. Сократительная способность ПЖ ухудшается при стенозировании аорты и при дифтерийной интоксикации, а при очаговой ишемии ЛЖ возникает умеренная перегрузка ПЖ, не вызывающая на ранних сроках эксперимента развитие его систолической дисфункции. Некоторые из функциональных и структурных изменений миокарда ЛЖ и ПЖ могут иметь прямое или опосредованное влияние на процесс апоптотической гибели КМЦ.

2. Острая гемодинамическая перегрузка ЛЖ приводит к интенсификации апоптоза КМЦ обоих желудочков сердца, о чём свидетельствуют данные морфологического, иммуногистохимического и биохимического исследования. Одним из механизмов усиления апоптотических процессов в клетках миокарда является индукция каспазного каскада, проявляющаяся в виде увеличения активности эффекторной каспазы-3.

3. Активность инициаторной каспазы-8 при стенозировании восходящей аорты достоверно повышается в ЛЖ и не меняется в ПЖ, указывая на участие внешних сигнальных механизмов в реализации апоптотической гибели клеток в ЛЖ и на передачу апоптогенного сигнала лишь по внутреннему (митохондриальному) пути в ПЖ. Можно предположить, что триггерами апоптоза КМЦ ЛЖ являются воспалительные цитокины, в частности ФНО-а,

накопление которых представляется закономерным на фоне выраженной деструкции миокарда.

4. При инфаркте миокарда в прекекротической зоне ЛЖ, а также в ПЖ повышается активность каспазы-3 и содержание ТИК'ЕЬ-позитивных ядер КМЦ, однако, количество «свободно лежащих ядер» нарастает лишь в ПЖ и только на 1-е сутки эксперимента. Следовательно, ишемическое повреждение ЛЖ приводит к росту интенсивности апоптоза КМЦ в миокарде обоих желудочков, при этом механизм экструзии ядер отсутствует в ЛЖ и выражен незначительно в ПЖ.

5. В миокарде обоих желудочков сердца при острой коронарной недостаточности активность каспазы-8 достоверно не меняется, что указывает на отсутствие внешних (рецепторно-опосредованных) механизмов в индукции апоптоза КМЦ как при ишемии ЛЖ, так и при перегрузке ПЖ. Таким образом, передача апоптогенного сигнала осуществляется в обоих желудочках сердца лишь по внутреннему сигнальному пути. Наличие сильной отрицательной корреляционной связи между активностью каспазы-3 и показателями функционального состояния ЛЖ для процесса в целом косвенно свидетельствует о потенцировании механизмов апоптоза КМЦ по митохондриальному пути под действием гипоксии. Наиболее вероятней причиной индукции каспазного каскада в ПЖ является его гемодинамическая перегрузка, вызванная ослаблением сократительной способности ЛЖ.

6. Диффузное поражение сердечной мышцы, вызванное дифтерийным токсином, приводит к индукции апоптоза КМЦ ЛЖ, что подтверждается наличием трёх дополняющих друг друга признаков: увеличением количества ТЦКЕЬ-позитивных ядер, числа «свободно лежащих ядер» КМЦ и повышением активности каспазы-3. При этом активность каспазы-8 не имеет статистически значимого отличия от контрольного уровня, в связи с чем в качестве ведущего механизма инициации апоптотических процессов в миокарде ЛЖ следует считать митохондриальный путь сигнальной транедукции.

7. В ПЖ дифтерийная интоксикация сопровождается усилением апоптоза КМЦ, о чём позволяют судить данные иммуногистохимического и морфологического исследования, однако, активность каспазы-3 практически не меняется в первые'5 суток дифтерийной интоксикации. Нельзя исключить, что для ПЖ в связи с его меньшей массой применявшаяся в эксперименте доза дифтерийного токсина является более значительной, чем для ЛЖ, и подавляет собственный апоптогенный эффект, опосредованный, предположительно, метаболическими нарушениями, за счёт прямой инактивации каспазы-3 и (или) других ферментов каспазного каскада.

8. Отсутствие при диффузном поражении миокарда достоверного повышения активности каспазы-3 в первые трое суток эксперимента в ЛЖ и на всём протяжении исследования в ПЖ на фоне увеличения содержания олигонуклеотидов - продуктов фрагментации ДНК позволяет предположить, что при токсическом воздействии индукция апоптоза КМЦ может быть связана

с другими ферментами каепазного семейства либо возникать за счёт некаспазных механизмов.

9. При некоторых вариантах повреждения сердца при наличии иммуногистохимических и биохимических признаков активизации апоптоза клеток миокарда увеличения количества «свободно лежащих ядер» не наблюдается. В этой связи можно рассматривать экструзию ядра в межклеточное пространство в качестве альтернативного механизма апоптотической гибели КМЦ.

10. Апоптоз КМЦ представляет собой типовую реакцию альтерированного сердца, опосредуемую как общими, так и специфическими для различных типов патологических процессов инициальными механизмами, которая может быть направлена на элиминацию повреждённых и функционально неполноценных клеточных элементов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Благонравов МЛ., Фролов В.А. Артериальное давление и сократительная функция желудочков сердца на ранних стадиях гипертонического процесса. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2005. - Г. 140.-№ 8. - С. 133-135.

2. Благонравов МЛ. Морфологические основы изменения сократительной функции левого желудочка при острой очаговой ишемии. // Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации: Материалы VIII международного конгресса. - Москва, 2007. - С. 145-147.

3. Благонравов МЛ. Морфо-функционалыюе состояние миокарда левого желудочка при его ишемическом повреждении в эксперименте. // Вестник РУДН. Серия Медицина. - 2007. - № 4. - С. 5-11.

4. Халберг Ф., Корнелиссен Ж., Катинас Г.С., Чибисов С.М., Радыш И.В., Благонравов МЛ., Фролов В.А. Семисуточный мониторинг артериального давления и ЧСС является оптимальным временем при определении нормы и патологии сердечно-сосудистой системы. // Вестник РУДН. Серия Медицина. -2007.-№6.-С. 32-38.

5. Сотерн Р., Корнелиссен Ж., Халберг Ф., Чибисов С.М., Благонравов МЛ. Закономерности оценки индивидуальной минуты. // Вестник РУДН. Серия Медицина. - 2007. - № 6. - С. 50-55.

6. Благонравов М.Л. Особенности функционального состояния и морфологии правого желудочка сердца при ишемическом повреждении левого. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. -Т. 145.- №4.-С.392-394.

7. Благонравов М.Л., Фролов В.А., Чибисов С.М. О некоторых патогенетических и адаптационных механизмах острой коронарной патологии. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. -Т. 145.-№5.-С516-520.

8. Благонравов МЛ. Инновационные методики в морфометрическом анализе полутонких срезов миокарда. // Адаптационная физиология и качество

жизни: проблемы традиционной и инновационной медицины: Материалы международного симпозиума, посвященного 80-летию академика РАМН H.A. Агаджаняна. - Москва, 2008. - С. 53-55.

9. Благонравов М.Л., Чибисов В.А., Фролов В.А. Применение инновационных технологий в хронокардиологии // Адаптационная физиология и качество жизни: проблемы традиционной и инновационной медицины: Материалы международного симпозиума, посвящённого 80-летию академика РАМН H.A. Агаджаняна. - Москва, 2008. - С. 56-58.

10. Благонравов М.Л., Зотова Т.Ю., Зотов А.К., Касем К.Ю., Горячев В.А. Изменения временной организации ритма сердца на фоне перевязки коронарных артерий. // Адаптационная физиология и качество жизни: проблемы традиционной и инновационной медицины: Материалы международного симпозиума, посвященного 80-летию академика РАМН H.A. Агаджаняна. - Москва, 2008. - С. 55-56.

11. Благонравов МЛ., Фролов В.А., Чибисов С.М. Роль многолетних колебаний регуляции показателей артериального давления кроликов в динамике дифтерийной интоксикации. // Первый Российский съезд по хронобиологии и хрономедицине с международным участием: Материалы съезда. - Владикавказ, 2008. - С. 13-15.

12. Халберг Ф., Корнелиссен Ж., Снегслова Дж., Фишер Б., Добшак П., Кеннер Т., Планета 3., Душек Дж., Гомолка П., Аль-Кубати М., Швацкопф О., Благонравов М.Л., Чибисов С.М., Агарвал Р.К, Артериальное давление или, вернее, синдром нарушения вариабельности артериального давления (VVDS). Дискуссия в Брно 6 октября 2008 года. // Вестник РУДН. Серия Медицина. - 2008. - JS» 7. - С. 13-19.

13. Благонравов МЛ., Фролов В.А. Анализ центрального артериального давления кроликов в динамике дифтерийной интоксикации. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 20(1'). - Т. 147. - № 4. - С. 377-379.

14. Благонравов МЛ. О соотношении апоптоза и некроза кардиомиоцитов в нарушении клеточного гомеостаза миокарда при экспериментальной дифтерийной интоксикации. // Эколого-физиологические проблемы адаптации: Материалы XIV международного симпозиума. - Москва, 2009. - С. 86-88.

15. Благонравов М.Л. Сезонные особенности реактивных изменений морфологии миокарда в процессе его адаптации к воздействию дифтерийного токсина. // Эколого-физиологические проблемы адаптации: Материалы XIV международного симпозиума. - Москва, 2009. - С. 89-91.

16. Касем К.Ю., Зотова Т.Ю., Благонравов М.Л., Горячев В.А. Изменения режима управления при анализе вероятностных распределений R-R интервалов у кроликов с экспериментальной гипертензией // Эколого-физиологические проблемы адаптации: Материалы XIV международного симпозиума. - Москва, 2009.-С. 221-222.

17. Благонравов МЛ., Демуров Е.А., Фролов В.А., Онуфриев М.В. Сократительная функция сердца и состояние некоторых звеньев липидного метаболизма при острой дифтерийной интоксикации. //

Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Т. 148. -№ 9.-С.254-256.

18. Касем К.Ю., Фролов В.А., Зотова Т.Ю., Благонравов 'МЛ. Особенности изменения сократительной функции сердца при сочетании экспериментальной артериальной гипертензии с острой коронарной недостаточностью на фоне применения антагонистов кальция. // Вестник РУДН. Серия Медицина.-2009.-№4.-С. 23-28.

19. Фролов В.А., Дроздова Г.А., Мустяца В.Ф., Благонравов M.JI. Гипотензивная терапия и сердце: Монография. —М.: РУДН, 2009. - 292 е.: ил. - (Библиотека классического университета).

20. Благонравов МЛ., Фролов В.А. Изменения архитектоники миокарда и апоптоз кардиомиоцитов в динамике экспериментальной дифтерийной интоксикации. // Архив патологии. - 2010. — Т. 72. - № 2.-С. 30-34.

21. Благонравов M.JI., Азова М.М., Фролов В.А. Хронобиологические особенности возникновения фибрилляции желудочков сердца при экспериментальной острой коронарной недостаточности II Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 149. — № 5. - С. 492494.

22. Благонравов M.JL, Азова М.М., Фролов В.А. Биохимическое исследование апоптоза клеток миокарда при острой перегрузке левого желудочка в эксперименте. И Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. - 2010. - № 8. - С. 49-53.

23. Blagonravov M., Frolov V., Shastun S. Cardiomyocyte apoptosis and necrosis in experimental diphtheria intoxication // 6th International Congress of Pathophysiology. - Montréal, 2010. - P. 94-95.

24. Зотов A.K., Зотова Т.Ю., Благонравов M.JI. Регрессионный анализ функциональной асимметрии левого и правого желудочков сердца в условиях вазоренальной артериальной гипертензии. // Математическая биология и биоинформатика: Сборник докладов III международной конференции. -Пущино, 2010. - С. 44-46.

25. Благонравов М.Л., Онуфриев М.В. О возможном влиянии острой перегрузки сердца на интенсивность апоптотической гибели клеток миокарда левого желудочка. // VIII Всероссийская конференция по патологии клетки: Сборник трудов. - Москва, 2010. - С. 37-39.

26. Благонравов МЛ., Азова М.М., Онуфриев М.В., Фролов В.А. Активность некоторых ферментов каспазного каскада и сократительная функция миокарда при экспериментальной очаговой ишемии левого желудочка. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Том 150. - № 12. - С. 612-615.

27. Благонравов МЛ., Онуфриев М.В., Демуров Е.А., Гуляева Н.В., Фролов В.А. Оценка активности каспазы-3 в ткани миокарда кроликов при экспериментальной гемодинамической перегрузке левого желудочка сердца. // Биомедицинская химия. - 2010. - Т. 56. - № 6. - С. 719-725.

28. Благонравов МЛ., Азова М.М., Фролов В.А. Влияние экспериментальной очаговой ишемии на активность апоптотических процессов в миокарде левого желудочка. // Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине: Сборник трудов Первой международной научно-практической конференции. / под ред. А.П. Ку-динова, Б.В. Крылова. - Санкт-Петербург, 2010. - Т. 3. - С. 57-58.

29. Азова М.М., Благонравов М.Л., Фролов В.А. Исследование апоптоза клеток миокарда левого желудочка при экспериментальной артериальной гипертензии // Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине: Сборник трудов Первой международной научно-практической конференции. / под ред. А.П. Ку-динова, Б.В. Крылова. - Санкт-Петербург, 2010. - Т. 3,- С. 16-17.

30. Фролов В.А., Благонравов М.Л., Зотов А.К., Зотова Т.Ю. Анализ стадийности изменений параметров гемодинамики при формировании экспериментальной артериальной гипертензин у кроликов. // Бюллетень эксперименгальной биологии и медицины. - 2С11. - Т. 151. - № 1. - С. 1316.

31. Благонравов МЛ. Индукция каспазного каскада как неспецнфический ответ миокарда на повреждение. //' Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011. - Т. 151. - № 2. - С. 128131.

32. Благонравов МЛ., Азова М.М., Фролов В.А. Активность каспазы 3 и каспазы 8 в миокарде желудочков сердца при экспериментальной дифтерийной интоксикации. // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. - 2011. - № 2. - С. 28-31.

33. Благонравов М.Л., Ковязин В.А., Коршунова А.Ю., Бабичен-ко И.И., Фролов В.А. Структурные изменения миокарда при острой перегрузке левого желудочка в эксперименте. // Архив патологии. -2911. -Т. 73. - № 1.-С 34-38.

34. Благонравов МЛ. Особенности функционального состояния сердца при острой гемодинамической перегрузке левого желудочка в эксперименте. // Вестник РУДН. Серия Медицина. - 2011. - т 1. - С. 7-11.

Работа выполнена при поддержке Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (гос. контракт от 30 сентпбря 2009 г. № 02.740.11.0440 и гос. контракт от 27 августа 2009 г. № П1258).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДдиаст - диастолическое артериальное давление

АДеист - систолическое артериальное давление

В Дм - максимальное внутрижелудочковое давление

ВДр - реальное внутрижелудочковое давление

ВПВО - время появления волны отражения

ВРПВ - время распространения пульсовой волны

ИГХ - иммуногистохимия, иммуногистохимический

КМЦ - кардиомиоцит

ЛЖ - левый желудочек

ОКН - острая коронарная недостаточность

ПЖ - правый желудочек

ФНО-а - фактор некроза опухолей альфа

ХСН - хроническая сердечная недостаточность

DLM - dosis letalis minima (минимальная летальная доза)

TUNEL - Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling

РЕЗЮМЕ

докторской диссертации М.Л. Благонравова «Апоптоз кардиомиоцитов как типовая реакция альтерированного

сердца».

В данной работе изучались механизмы апоптоза кардиомиоцитов при нарушениях морфо-функционального состояния сердца, вызванных различными типами альтерации. Эксперименты проводились на самцах кроликов, у которых в разных группах исследования моделировали острую перегрузку левого желудочка, очаговую ишемию левого желудочка и диффузное токсическое повреждение миокарда. В сроки 1, 3 и 5 суток от начала соответствующего патологического процесса исследовались особенности центральной гемодинамики, морфо-функциональные характеристики сердца и механизмы апоптоза кардиомиоцитов с использованием морфологической, иммуногистохимической (TUNEL) и биохимической методик. Установлено, что некоторые изменения структуры и функции миокарда могут иметь прямое или опосредованное влияние на индукцию программированной гибели кардиомиоцитов. Также показано, что активность апоптотических процессов повышается в обоих желудочках при всех исследованных типах повреждения сердечной мышцы на тех или иных сроках. Таким образом, апоптоз кардиомиоцитов можно рассматривать как типовую реакцию альтерированного сердца. Однако конкретные механизмы, ответственные за возникновение и передачу апоптогенных сигналов, могут иметь определённые специфические особенности.

SUMMARY

of the dissertation «Cardiomyocyte apoptosis as a typical response of the damaged myocardium» by M.L. Blagonravov.

Mechanisms of cardiomyocyte apoptosis under cardiovascular disturbances caused by different kinds of alteration were studied in this work. The experiments were performed on male rabbits in which hemodynamic overload of the left ventricle, an acute ischemia of the left ventricle and a diffuse toxic damage of the myocardium were modeled in different groups. 1, 3 and 5 days after the onset of the corresponding pathologic process we investigated some parameters of central hemodynamics, morphological and functional changes of the heart and mechanisms of cardiomyocyte apoptosis with the use of morphological, immunohistochemical and biochemical methods. It was found that some structural and functional changes of the myocardium can have a direct or a mediated influence on the induction of programmed cardiomyocyte death. It was also shown that the activity of apoptotic processes increases in the myocardium of both ventricles under all the investigated types of myocardial damage at some or other terms. Thus cardiomyocyte apoptosis can be considered as a typical response of the damaged myocardium. However particular mechanisms which are responsible for initiation and transduction of apoptotic signals can have some certain specific properties.

Подписано в печать: 27.04.2011

Заказ № 5448 Тираж -150 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность проблемы.

По данным ВОЗ, ежегодно в мире от сердечно-сосудистых заболеваний умирают более 16,5 млн. человек, что составляет 29,3% общей смертности. При этом на долю ишемической болезни, гипертензивного и воспалительного поражения сердца суммарно приходится 14,9 % [WHO, 2004].

При длительном течении многих видов патологии сосудов и сердца с высокой долей вероятности происходит формирование хронической сердечной недостаточности (ХСН), которая на сегодняшний день стала одной из самых распространённых и вместе с тем до конца нерешённых проблем клинической медицины. Так, пятилетняя и десятилетняя выживаемость больных с ХСН составляет 50% и 10% соответственно [К. Maclntyre et al., 2000; M.R. Cowie et al., 2000; A. Mosterd et al., 2001], а при наличии дисфункции левого желудочка (ЛЖ) значительно увеличивается риск внезапной сердечной смерти [S.S. Chugh et al., 2008].

Применяемые в современной кардиологической практике медикаментоз- ные средства, оказывающие влияние на патогенез основного заболевания или корректирующие проявления сердечной недостаточности, дают, как правило, лишь временный эффект. На этом фоне неизбежным последствием хронического воздействия на сердце патогенного фактора является прогрессирующее снижение количества жизнеспособных кардиомиоцитов (КМЦ). В этой связи в последнее десятилетие в число приоритетных задач фундаментальных исследований в области экспериментальной и клинической кардиологии устойчиво входит поиск возможных способов преодоления нарушений тканевого гомеостаза сердечной мышцы.

В настоящее время практически не вызывает сомнения тот факт, что определённые патологические процессы в сердечно-сосудистой системе могут сопровождаться как некрозом КМЦ, так и индукцией одного из вариантов программированной клеточной гибели - апоптоза или аутофагии. Показано, что активность апоптотических процессов повышается в миокарде при артериальной гипертензии [A. González et al., 2006], на фоне прогрессирующей дилатационной кардиомиопатии [E.JL Лушникова и др.,

2006], аритмогенной правожелудочковой дисплазии [В.Г. Цыпленкова и др.,

2007], а также при миокардитах [V. Kyto et al., 2004]. Относительно роли программированной клеточной гибели в изменении морфологии миокарда при его ишемическом повреждении однозначного мнения среди исследователей нет. В одних публикациях отмечается, что очаговая ишемия сопровождается усилением апоптоза КМЦ [М.Г. Рыбакова и др., 2005; A. Abbate et al., 2007], однако, другие авторы придерживаются противоположной точки зрения [G. Takemura et al., 2006]. Некоторое время назад появились данные, свидетельствующие о том, что при ишемии ЛЖ апоптотической гибели подвергаются также КМЦ правого желудочка (ПЖ) [A. Abbate et al., 2008]. Что касается апоптоза КМЦ при воздействии на миокард кардиотоксических веществ, то по этому вопросу содержится очень мало сведений, как в российской, так и в зарубежной литературе.

Наиболее многочисленные и при этом согласующиеся друг с другом результаты, свидетельствующие об усилении апоптоза КМЦ, были получены при изучении гипертонического повреждения миокарда. Исследования по данной проблеме, проведённые ранее на кафедре общей патологии и патологической физиологии РУДН, позволили установить, что на первой стадии экспериментальной артериальной гипертензии в миокарде обоих желудочков сердца с одной стороны развивается гипертрофия миофибрилл, а с другой - увеличивается интенсивность апоптоза КМЦ. При этом между двумя указанными процессами устанавливается достоверная положительная корреляционная связь. Из этого был сделан вывод, что усиление апоптоза КМЦ при гипертензии является фактором, лимитирующим развитие чрезмерной гипертрофии сердечной мышцы [В.А. Фролов и др., 2004].

Вместе с тем, на сегодняшний день в литературе практически отсутствуют данные о возможном участии апоптотических процессов в морфологической перестройке ЛЖ при адаптации сердца к внезапному повышению систолического сопротивления, которое наблюдается, в частности, при некоторых формах гипертонического криза.

Альтернативным вариантом программированной клеточной гибели является аутофагия, которая сопровождается образованием в цитоплазме аутофагосом, содержащих продукты деградации митохондрий и других интрацеллюлярных субстанций. В отличие от апоптоза, аутофагия не связана с каспазными механизмами и опосредуется катепсиновыми белками и протеазами лизосом [R.A. Lockshin et al., 2002; L.E. Broker et al., 2005]. Считается, что подобный способ элиминации больше характерен для клеток, не способных с самовоспроизведению: для КМЦ, нейронов [К.Е. Larsen et al., 2002; A. Terman et al., 2005]. Интенсификация аутофагии КМЦ происходит при некоторых формах кардиомиопатии [W. Martinet et al., 2007; P. Tannous et al., 2008], при гипертензивной перегрузке сердца [В.А. Rothermel et al., 2008], а также на фоне гибернации миокарда [J. Slezak et al., 2009].

Известно, что КМЦ млекопитающих являются конечно-детерминирован- ными клетками, обладая крайне низким потенциалом к регенерации в естественных условиях. В этой связи сравнительно недавно получила распространение концепция, согласно которой индукцию апоптоза КМЦ предлагается расценивать в качестве одного из факторов, опосредующих переход от первичной альтерации миокарда к развитию хронической сердечной недостаточности при некоторых заболеваниях сердца [D. Petrovic, 2004; А.К. Sharma et al., 2007]. Подобное видение проблемы во многом определило дальнейший вектор научных исследований, направленных на разработку методов лечения ХСН. Так, в ряде публикаций сообщается о том, что апоптоз КМЦ успешно поддаётся медикаментозной коррекции [G. Mercanoglu et al., 2008; C.D. Garciarena et al., 2009].

Как уже было сказано ранее, некоторые заболевания сердечнососудистой системы сопровождаются активизацией аутофагии КМЦ. На этой основе возникло предположение о том, что и данная разновидность гибели клеток также способна внести свой вклад в развитие ХСН [К. Nishida et al., 2008; G.R. De Meyer et al., 2010].

Следует обратить внимание, что убедительных доказательств наличия связи усиления того или иного варианта программированной клеточной гибели со значительным уменьшением массы КМЦ или выраженным нарушением функции JDK и ПЖ в литературных данных не приводится. С другой стороны, апоптоз, являясь нормальным физиологическим феноменом, играет очень важную роль в поддержании тканевого гомеостаза, обеспечивая элиминацию клеток, несущих мутации или содержащих неоантигены. Так, установлено, что при аутоиммунных заболеваниях подавляется апоптоз [Н. Mountz et al., 1994]. Возникает вопрос: всегда ли можно расценивать активизацию апоптоза клеток сердечной мышцы исключительно как негативное явление?

Необходимо также отметить, что в большинстве работ, опубликованных на сегодняшний день, исследовался сам факт индукции апоптозных процессов на основе выявления тех или иных специфических маркёров. Вместе с тем, механизмы апоптогенной сигнальной трансдукции в клетках миокарда изучены недостаточно.

Очевидно, что медикаментозный контроль над апоптозом КМЦ может значительно расширить возможности фармакотерапии сердечно-сосудистых заболеваний. Однако фундаментом для разработки обоснованных подходов к данной проблеме является поиск как общих закономерностей, определяющих роль и место программированной клеточной гибели КМЦ, так и конкретных патогенетических механизмов, опосредующих индукцию апоптотических процессов. Таким образом, дальнейшее изучение этого вопроса представляется весьма актуальным. Современное состояние проблемы позволяет допустить в качестве гипотезы, что усиление апоптоза КМЦ является неспецифическим ответом миокарда на воздействие патогенного фактора. В этой связи исследование проводилось в русле разрабатываемой в течение многих лет на кафедре общей патологии и патологической физиологии РУДН концепции о типовых реакциях альтерированного сердца. [В.А. Фролов, 1967; Д.П. Билибин, 1987; В.А. Фролов с соавт., 1995].

Цель исследования.

Изучить особенности центральной гемодинамики, морфо-функциональное состояние сердца и апоптоз КМЦ при трёх типах патологических процессов: гемодинамической перегрузке ЛЖ, очаговой ишемии ЛЖ и диффузном токсическом поражении миокарда; выявить роль указанных патологических процессов в изменении интенсивности апоптотической гибели сердечных миоцитов.

Задачи исследования.

1. Провести анализ центрального артериального давления на фоне острой и хронической перегрузки сердца, очаговой ишемии ЛЖ и дифтерийной интоксикации.

2. Изучить особенности функционального состояния ЛЖ и ПЖ при различных типах повреждения сердца.

3. Исследовать влияние отдельных патологических процессов в сердце на морфологическое состояние миокарда.

4. Определить активность экструзии ядер КМЦ ЛЖ и ПЖ при различных вариантах альтерации сердца.

5. Дать качественную и количественную оценку фрагментации ДНК в ядрах КМЦ при острой перегрузке ЛЖ, очаговой ишемии ЛЖ и диффузном токсическом повреждении миокарда.

6. Исследовать влияние различных вариантов патологических процессов в сердце на индукцию каспазного каскада в миокарде.

7. Оценить механизмы апоптогенной сигнальной трансдукции в клетках миокарда ЛЖ и ПЖ на фоне развития в сердце патологических процессов различного генеза.

Научная новизна.

Впервые показано, что при дифтерийной интоксикации и стенозировании восходящей аорты на фоне нарушения биомеханических характеристик ЛЖ не происходит значительного изменения упруго-эластических свойств центральных артерий.

Впервые установлено, что возникновение необратимой фибрилляции желудочков, возникающей при острой коронарной недостаточности, жёстко зависит от времени суток.

Данные морфологического исследования показали, что наиболее глубокое повреждение миокарда происходит в ЛЖ на фоне внезапного повышения постнагрузки. При этом в ткани наблюдаются признаки выраженного внеклеточного отёка, гиперемии и инфильтрации лимфоцитами и гистиоцитами, что свидетельствует о развитии воспалительной реакции. Очаговая ишемия ЛЖ не сопровождается выраженной деструкцией миофибрилл в пренекротической зоне миокарда.

На основании морфологического, иммуногистохимического и биохимического исследования впервые установлено, что на фоне острой гемодинамической перегрузки ЛЖ происходит активизация апоптотических процессов в миокарде обоих желудочков сердца.

Впервые показано, что при дифтерийной интоксикации возрастает интенсивность экструзии ядер КМЦ, активизируется фрагментации ДНК в миокарде ЛЖ и ПЖ, а также индукция каспазного каскада в ЛЖ. Полученные данные дают основание говорить об усилении апоптоза КМЦ в обоих желудочках сердца.

Применение морфологической методики детекции апоптоза КМЦ позволило установить, что при дифтерийной интоксикации, а также при острой гемодинамической перегрузке ЛЖ в миокарде обоих желудочков сердца повышается интенсивность экструзии ядер КМЦ во внеклеточное пространство. Однако на фоне ишемического повреждения ЛЖ данный механизм не выражен, несмотря на наличие биохимических и иммуногистохимических признаков усиления апоптоза.

С использованием биохимической методики получены принципиально новые данные о механизмах апоптогенной сигнальной трансдукции в клетках миокарда под влиянием различных патологических факторов. Так, при стенозировании восходящей аорты индукция каспазного каскада осуществляется в ЛЖ по внешнему (рецепторно-опосредованному) пути. При ишемическом повреждении ЛЖ, дифтерийном поражении миокарда, а также при перегрузке ПЖ активация каспаз происходит только по внутреннему (митохондриальному) пути.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Результаты проведённых исследований позволили расширить существующие представления о фундаментальных механизмах регуляции тканевого гомеостаза миокарда при воздействии на сердце различных патогенных факторов.

В работе показано, что независимо от природы патологического процесса типовым ответом, сопровождающим развитие морфо-функциональных изменений альтерированного миокарда, является интенсификация апоптоза КМЦ обоих желудочков сердца. Установлены конкретные пути апоптогенной сигнальной трансдукции и их связь с отдельными нарушениями структуры и сократительной способности сердечной мышцы.

Полученные данные являются основой для постановки новых задач, в частности, по изучению молекулярных механизмов индукции апоптоза при тех или иных заболеваниях сердечно-сосудистой системы, а также открывают возможности для поиска дополнительных методов медикаментозного воздействия на миокард, направленных на управление механизмами программированной клеточной гибели КМЦ.

Выявлены хронобиологические особенности возникновения фибрилляции желудочков при экспериментальной острой коронарной недостаточности. Полученные результаты могут быть использованы для разработки мероприятий, направленных на медикаментозную хронопрофилактику фибрилляции желудочков у пациентов с ишемической болезнью сердца. Кроме того, даётся рекомендация исследователям выполнять операции по моделированию очаговой ишемии у кроликов не позднее 15:00 часов с целью минимизации потерь животных.

Внедрение результатов исследования.

Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре общей патологии и патологической физиологии медицинского факультета ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» Минобрнауки РФ.

Положения, выносимые на защиту

1. Различные по своей природе патологические процессы (очаговая ишемия ЛЖ, острая гемодинамическая перегрузка ЛЖ, дифтерийная интоксикация) сопровождаются развитием комплекса выраженных структурных и функциональных нарушений как ЛЖ, так и ПЖ, некоторые из которых (деструкция миофибрилл, увеличение внутрижелудочкового давления и др.) могут иметь прямое или опосредованное влияние на процесс программированной гибели КМЦ.

2. При острой гемодинамической перегрузке сердца, вызванной стенозированием восходящей аорты, происходит повышение интенсивности апоптоза КМЦ в обоих желудочках за счёт индукции каспазного каскада, реализуемой в ЛЖ либо только по внешнему (рецепторно-опосредованному) пути, либо по внешнему и внутреннему (митохондриальному) путям, что с учётом признаков воспалительного ответа миокарда косвенно указывает на возможность участия в данной реакции некоторых цитокинов, включая ФНО-а. Тот же тип патологического воздействия на сердце сопровождается в ПЖ активизацией лишь внутреннего пути.

3. Очаговое ишемическое повреждение ЛЖ приводит к увеличению интенсивности апоптотических процессов как в макроскопически неизменённой области самого ЛЖ, так и в миокарде ПЖ. Апоптогенная сигнальная трансдукция осуществляется в КМЦ обоих желудочков по митохондриальному пути. Ведущим механизмом инициации апоптозных стимулов в ЛЖ является гипоксия КМЦ, а в ПЖ — его умеренная гемодинамическая перегрузка, обусловленная застоем крови в малом круге кровообращения в связи со снижением сократительной способности ЛЖ.

4. Диффузное токсическое поражение сердца влечёт за собой усиление апоптоза КМЦ, при этом конкретные молекулярные механизмы, ответственные за данный процесс, имеют определённые особенности для ЛЖ и ПЖ. В ЛЖ передача внутриклеточного сигнала осуществляется по митохондриальному пути с последующим повышением активности каспазы-3. В данном случае за апопотическую гибель КМЦ ПЖ ответственны либо другие ферменты каспазного каскада, либо некаспазные медиаторы.

5. Интенсификация апоптоза КМЦ на фоне выраженных морфо-функциональных изменений миокарда, связанных с альтерацией сердца различного генеза, носит типовой характер. При некоторых видах патологических процессов имеются общие механизмы индукции программированной гибели клеток, однако, для отдельных вариантов повреждения сердечной мышцы характерна специфика в развитии данного феномена.

Апробация работы.

Работа апробирована на VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации», г. Москва, 2007 г; на Международном симпозиуме «Адаптационная физиология и качество жизни: проблемы традиционной и инновационной медицины», посвященном 80-летию академика РАМН H.A. Агаджаняна, г. Москва, 2008 г; на Первом Российском съезде по хронобиологии и хрономедицине с международным участием, г. Владикавказ, 2008; на XIV Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации», г. Моеква, 2009 г; на 6 Международном конгрессе по патофизиологии, г. Монреаль (Канада), 2010 г; на VIII Всероссийской конференции по патологии клетки, г. Москва, 2010 г; на Международной .научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», г. С.-Петербург, 2010 г; на совместном заседании кафедры общей патологии и патологической физиологии и кафедры патологической анатомии РУДН, 2011 год.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 34 работы, в том числе 1 монография и 17 статей в журналах, входящих в перечень, утверждённый ВАК РФ.

Структура и объём диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, 4-х глав, в которых изложены результаты собственного исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 230 страницах машинописного текста, содержит 40 таблиц и 59 рисунков. Библиография содержит 440 источников российской и зарубежной литературы.

выводы

1. Различные по своей этиологии патологические процессы в сердце приводят к практически однотипным нарушениям сократительной функции и биомеханических характеристик ЛЖ, а также к развитию комплекса выраженных морфологических изменений в миокарде обоих желудочков. Сократительная способность ПЖ ухудшается при стенозировании аорты и при дифтерийной интоксикации, а при очаговой ишемии ЛЖ возникает умеренная перегрузка ПЖ, не вызывающая на ранних сроках эксперимента развитие его систолической дисфункции. Некоторые из функциональных и структурных изменений миокарда ЛЖ и ПЖ могут иметь прямое или опосредованное влияние на процесс апоптотической гибели КМЦ.

2. Острая гемодинамическая перегрузка ЛЖ приводит к интенсификации апоптоза КМЦ обоих желудочков сердца, о чём свидетельствуют данные морфологического, иммуногистохимического и биохимического исследования. Одним из механизмов усиления апоптотических процессов в клетках миокарда является индукция каспазного каскада, проявляющаяся в виде увеличения активности эффекторной каспазы-3.

3. Активность инициаторной каспазы-8 при стенозировании восходящей аорты достоверно повышается в ЛЖ и не меняется в ПЖ, указывая на участие внешних сигнальных механизмов в реализации апоптотической гибели клеток в ЛЖ и на передачу апоптогенного сигнала лишь по внутреннему (митохондриальному) пути в ПЖ. Можно предположить, что триггерами апоптоза КМЦ ЛЖ являются воспалительные цитокины, в частности ФНО-а, накопление которых представляется закономерным на фоне выраженной деструкции миокарда.

4. При инфаркте миокарда в пренекротической зоне ЛЖ, а также в ПЖ повышается активность каспазы-3 и содержание ТиМЗЬ-позитивных ядер КМЦ, однако, количество «свободно лежащих ядер» нарастает лишь в ПЖ и только на 1-е сутки эксперимента. Следовательно, ишемическое повреждение ЛЖ приводит к росту интенсивности апоптоза КМЦ в миокарде обоих желудочков, при этом механизм экструзии ядер отсутствует в ЛЖ и выражен незначительно в ПЖ.

5. В миокарде обоих желудочков сердца при острой коронарной недостаточности активность каспазы-8 достоверно не меняется, что указывает на отсутствие внешних (рецепторно-опосредованных) механизмов в индукции апоптоза КМЦ как при ишемии ЛЖ, так и при перегрузке ПЖ. Таким образом, передача апоптогенного сигнала осуществляется в обоих желудочках сердца лишь по внутреннему сигнальному пути. Наличие сильной отрицательной корреляционной связи между активностью каспазы-3 и показателями функционального состояния ЛЖ для процесса в целом косвенно свидетельствует о потенцировании механизмов апоптоза КМЦ по митохондриальному пути под действием гипоксии. Наиболее вероятной причиной индукции каспазного каскада в ПЖ является его гемодинамическая перегрузка, вызванная ослаблением сократительной способности ЛЖ.

6. Диффузное поражение сердечной мышцы, вызванное дифтерийным токсином, приводит к индукции апоптоза КМЦ ЛЖ, что подтверждается наличием трёх дополняющих друг друга признаков: увеличением количества Т1ЖЕЬ-позитивных ядер, числа «свободно лежащих ядер» КМЦ и повышением активности каспазы-3. При этом активность каспазы-8 не имеет статистически значимого отличия от контрольного уровня, в связи с чем в качестве ведущего механизма инициации апоптотических процессов в миокарде ЛЖ следует считать митохондриальный путь сигнальной транс дукции.

7. В ПЖ дифтерийная интоксикация сопровождается усилением апоптоза КМЦ, о чём позволяют судить данные иммуногистохимического и морфологического исследования, однако, активность каспазы-3 практически не меняется в первые 5 суток дифтерийной интоксикации. Нельзя исключить, что для ПЖ в связи с его меньшей массой применявшаяся в эксперименте доза дифтерийного токсина является более значительной, чем для ЛЖ, и подавляет собственный апоптогенный эффект, опосредованный, предположительно, метаболическими нарушениями, за счёт прямой инактивации каспазы-3 и (или) других ферментов каспазного каскада.

8. Отсутствие при диффузном поражении миокарда достоверного I повышения активности каспазы-3 в первые трое суток эксперимента в ЛЖ и на всём протяжении исследования в ПЖ на фоне увеличения содержания олигонуклеотидов - продуктов фрагментации ДНК позволяет предположить, что при токсическом воздействии индукция апоптоза КМЦ может быть связана с другими ферментами каспазного семейства либо возникать за счёт некаспазных механизмов.

9. При некоторых вариантах повреждения сердца при наличии иммуногистохимических и биохимических признаков активизации апоптоза клеток миокарда увеличения количества «свободно лежащих ядер» не наблюдается. В этой связи можно рассматривать экструзию ядра в межклеточное пространство в качестве альтернативного механизма апоптотической гибели КМЦ.

10. Апоптоз КМЦ представляет собой типовую реакцию альтерированного сердца, опосредуемую как общими, так и специфическими для различных типов патологических процессов инициальными механизмами, которая может быть направлена на элиминацию повреждённых и функционально неполноценных клеточных элементов.