Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Антигенная активность полисахаридно-белковых антигенных препаратов E. coli K1 разных О-серогрупп

¿и

* !

шдаш шщшлшш нш ссор

11АУЧНО-ИССЛЩОЕАТЕЛЬСК1Ш ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК ИМ.И.И. МЕЧНИКОВА

На правах рукопяся

ГОНЧАРОВ ВЛДЙШР СЕРГЕЕВИЧ

ЗГДК«57 6»8.037. Я. 001.5-.57G.B51.48

1шшш тшость шилчггаьс-бепонх ишиш ар»пар!Т01 Е. сои К! рпш 0-с?*«швп.

14.00.36 - аллергология и яялувология 03.00.07 - микробиология

Автореферат дассерхвдаи на соескшнй ученей степозш кзндадата иэдютвскйх паук

Москва - 1991

ГиЗста in'ii-v.

gr .оьз'хок

и

iUíir4;mií pjuobOAii'í't.

:.. V0¡>

ОС«щцалыь.э' oiuiouoavH

/'Si.'.'í'JT} 1.Г0,!„Г1Ц'.'«"" z

кпдцгдат ft

FUI. H/j¡

' Вэдзпцэо учрааднио, дшзиоэ оггш о наутао-щштцчоскэй «ож: дассэртацшх - Московская Мэдвщшскап ¿кадокия 154. К.И. Сеченова.

Егдкта состо;иоя 21 ноября 1991 года с 14 часов пз эесад адоциализсровавного учоного сотепа ( Д 001.38.0i ) Кау иослэдоватольского пнстатута вакцки и сывороток ил. i;.П. Ыачш А!/Л СССР iro вдросу: I030S4, г. Москва, тарэулок Мочишсовс, д.Ба.

С диссертацией uosso ^осшшсошться л 6к0ж;отеко Hay исслодовагельского института вшсцин и сывороток им. ИЛ;. Вачалю

Автореферат разослан " " октября 1991 г.

/

Учошй секретарь шлцшлизировшшого со кандидат медицинских

Н.Г. Кудряв

:ГСТВ£ИШ vflTEKl

, w l>

. it. :lei««i

Jtaw сертдцн

ОБШ 2iPiK?EPICTSKA РАБОТЫ

дуальность проблем

"Заболевания, шзнвае?-яе капсульнша грамогрицательгаши микроорганизмами, в частности В. ooli К1, составляют существенную долю в структуре инфекций, обусловленных условнопатогепнши микроорганизмами. Летальность при этих заболеваниях продолжает оставаться достаточно высокой. Так, при зперихяозном менингите у детей первых дней жизни она составляет 40-60 в то время как при менингококковом менингите только 6-20 % (Bemaeowaki 8s Kunze, 1987).

• В патогенезе внекниечных фора экершиюзов вакяую роль играют ЛПС п KI-антигеи. В работах последних лет показано, что KI-антигеи способствует резистентности микроорганизмов к фагоцитозу и резистентности к К0МПЛбМ9НТзавис2Ш!ду лизису (БиегЬагта et al, 1990, Roberts, 1989).

Большинство опубликованных работ посвящены изучению протектив-ной роли 0-антитена и О-антител эшерихий. lia основании этих исследований били предприняты неоднократные попытки создания корпускуляр-■ гшх и антигенных препаратов, содержащих s-ЛШ В. ooli разных 0-серогрупп, и только в последние года появшшсь матэриалы о роли в защите KI-антигена, в частности о протективной активности сывороток, содержащих KI-алтзггэла (Kaljsoг et al 1983, Plaiclüco et al 1905, 19Э8). Эти данные свидетельствовуют об актуальности исследований Еммувогеиных свойств .ретаратов, содержащих как О- так и К1~антигени Б. coli. Однако слабив кимуногегошо свойства очищенного препарата KI-антигена усложняет подхода к созданию икмупогетшх препаратов.

Kai« известно, KI-антигон Е. coli и серологически идентичный с тш групповой полисахарид Neisseria meningitidis серогруппы В схода по химической структуре и серологически идентичны (Казрог et al, ' 1973). В специальных исследованиях показано, что иммунологическую инертность этих антигенов в очищенном виде моето преодолеть с по-

мощь» шковалэнтного их соединения с различными болтами. Для менингококков, в частности, показана перспективность использования шдо-ленного из клеточной стенки микроорганизма комплекса груштового полисахарида с Овлкоми наружной Мэморааы (tioreno, 1933» 1983; А.П. Аллилуев, И.А. Басяакьян и др.,198В). Этй матурязлн можно рассматривать в качестве предпосылок создания икмуногениых препаратов на основа KI-fi^riiraVtii в. ooli.

t

ЦЕЛЬ настогсцого цсслодоватш состояла в выбора итвшов и способов получения палисахоридао-белнових препаратов, в которая сохраняется антигенная активность О- и KI-антигенов к. ooli. j

В задачи работы входило:

1. Создание коллекции птилцов с хороивй окспресснай Ш-впитопоз.

2. Отработка реглуоа получения полисахарйлно-солкошг антигенных препаратов,

3. Оценка антигенной актншоста полисахвридно-Зелкошх препаратов, полученных из втеымоэ Е. ooli разных О-серогруш,

4. Оироделанно возмояности использования получэнных препаратов ялл создания еритроцитарних диагностшумов.

Натаа шанав и ¡дашыашя mmwsnk ияшжяш i

ШЬШШЕШОЙ.

Впорше установлено, что из бактериальной массы штаммов в. ooli KI рьзщи O-cepoiTpynn с полюдью цотавлоно можо выделить полиса-херидно-Селковие препараты, обеспэчиваядав синтез 0- и KI-антител к повнааншо резистентность иммушзированшх животных к заражению вирулентным итамком В. ooli. Показь^а возможность использования полисахеркдно-ОелксБЫХ препаратов Е. ooli KI в качестве сенситиноп для приготовлении эритропитарных диагиостикумов. Разработанный -нами дйвгн:.-стикум Е. coll KI Сы использован при изучении иммунного ста-

тусе. добровольцев и оценке онтигагаюй вктюзяоста повой кониигококко-1 вой ваадиш, разргяЗоташюй в НИИ ни. И.И. Мечникова я ШСИШ им. : Г.Н. ГэСрнчовского.

; . üozffiMiEifl р ЕЧЯРИГЙОКЦЗ. 1ш wmuxj

I. Из бионасси Етаяаюв в. coli KI разных O-cepo групп ыозно виде лить ¡полисахоридно-йалховыэ прэпврзты, содэржетао до 40,í ивпсульного (полисахарида в пересчете па содерзшко сиаловоЯ кислота. ! 2. Полнсахаридно-Оолковнв препараты в. oolL KI шзивапт у кпвопшх образование 0- з Kl-й'лтртал з обесгтачгпзаит резистентность яммупизировйщщх имей к зорагатго шфулоитнш htomíou В. coli fll. 3. Пол1сахАрвдю~б9лкои10 прэпэроти В. coli KI >',огут буть пспольаовщш а качества сепслтшюя для получения еритроинторицс доагкоотикуноп, обаспочнваск;» - Т9стнроЕйШ1э ситптел к серолопгчаски идентичным капсульид» полнсахяр:тд;.м в. ooii KI я N. r.enin.;jltídie сорогрупш В.

' дш&гйшш вайям

Иатериалы диссертация долоквки и овсукдены на конфзронциях молодых учещгх КИИВС sai. If.И. Ызчкйюпа II июня 1987 г я 21 июня 1990 г.

Диссертация апробировало на научной конференции отдала средств и «этодов югмунопроЯшшктнни и ш-г-сунотерагши НИИ векши и сывороток £34. U.U. МЭЧНККОВа АЫН СССР 14 5П21Я 1991 года.

! ШйШЩШШ

По маторпалем диссертоши опубликоэало три работа. Список работ пр;.!логво?ся в кокдо рвфэрата.

Шт. •& сщшра еэШн Диссергашш состоят из вводс^азл, двух глав обзора литературы, огжсота:' ипторчялса и котодоп, четырех глав собстьошмх исс л© ло т< ■ tiríí. обсуждения результатов, внвсдоэ и спмоха

цитируемой литературы. Работа шшютрирована 5 рисунками и 18 таблицами.

СОНШШ Р1ШН.

I. шткпшм я шода исслцдовшш.

1.1. йгиеш ¿.coli.

В работе использовали II штаммов в. ooli с разной антигенное структурой, из которых 4 шташа (U9/41, кгОа, ¥11119/41 и H-6I) из коллекции лаборатории непарентеральйшс методов ишунизвции НИИ вакцин и сывороток им. И.Й.Мечникова АМН СССР, 2 втамма (U5/41. i В17509/41 ) из коллекции лаборатории условнопатогенных квшроорганЕз-мов того «э института, полученные от ст.н.с.И.Н.Улисно, втамм Ы-17 выделен из коммерческого препарата "Колнбактерин". Штаммы Z43Î, Z41 и Z307, выделенные от больных о инфекциями мочевнводящих путей получены из г.Ростока (Германия) через ст.н.с.Ю.А.Ратинера. Штакм 9-80 выделен в лаборатории проф. H.H. Костюковой (НИИЭМ им. К.Ф.Га иалей АМН СССР) из спикаомозговой яидкости ребенка, больного менкн гитом. Все штаммы более года хранились в лиофшгзированном состоя нии.

1.2. Питательные среда и культивирование.

Культивирование в. ooli проводили на кидких и плотных пнтател: тех средах, приготовленных на основе гвдролизата мяса или казеи сродней степени расщепления по Хоттингеру при +37 °С в течение 16-18, 24 и 48 часов.

1.3. Экспериментальные животные.

В опытах были использована шп CBA/Lac. весом iO-12 рандомбредные белые мыши, весом 10-14 г и морские свинки, вес 500-700 г.

1.4. Микробиологические «атода.

Наличие KI-антигена определяли в реакции агглютинации на сто; с коммерчески мвнингококковой серогрупш В сывороткой и с пома

да акции трипафлавиновой агглютинации и кислотной реверсии. Для иден-?ификащш s- и R-штаммов использовали пробы о кипяченном и трипафла-шновую агглютинацию. О-шинген определяли в реакции агглютинации с щерихиозными О-снворотками 01, 02 , 07 , 016, 04Б H 083 серогрупп. [аличие у клеток штаммов <&5мбриальннх антигенов тестировали в реак-1ии гемагглютинации (РТА). РТА ставши на стекле с форыалинизирован-ши эритроцитами человека КО) и II(А) групп, Rh+ а с эритроцитами врана. Определяли также чувствительность реакции к присутствию -маннозы.

Вирулентность культур исследовали путем впутриОрстинного введет мышам взвесей культур в 0,4 jt агаре. Гибель мышей учитывали в очение трех суток после заражения. .5. Способы получения антигенных препаратов.

Микробные клетка с плотной питательной среда па основа гидроли-ата казеина по Хоттингеру смывали холодным 0,65 % раствором Haoi, 3 7,2 ил» дистиллированной водой. Убитые микробные взвеси получали /тем трехкратной обработки бактериального сгагаа холодным ацетоном, ия получения полисахаридяо-белковых антигенных препаратов бакте-юльный смыв обрабатывали цэтая-3-метил-вммоний бро>лидом 1втавлоном).

,6. Метода химического и шмунохшического анализа препаратов.

Сналовую кислоту определяли по методу Svennerhola (1957) в |акции с резорциновым реактивом. ( (

Количество балка определяли по мэтоду Ьалхгу с соовт. (1951).

¡зучонзе состава белков проводили с помощью вертикального олвктро-

' ' - , ■ ti&f iïs'Â'iW'

рэза (ЕФ) в полишфялемадвом голо (ПААГ) в присутствии додецщл-дьфзта Ка (SDS-Na) на пластинках толщаЁнсЙ!<$-2 m * (Laemli, ; Î970 •Электрофорез проводами на прз!борэ ; консгрухздст г*пститута Яиохшши СССР, размера пластин 113*115 • сострв препаратов

'fiami s даоЗтй рухторлоня. (1958),

?. ;йi'o. ,.ч !г<ух\от:П&сяМ д.солэдовадаЗ.

Антигенную активность KI- и О-антигенов е. coli в полисахарзд-но-белковых препаратах тестировали по интенсивности нарастания кола-чества антителобразущих клеток н титров специфических антител у \ I иммунизированных кивотных. Тестирование антикапсульных и О-аптлием проводили с помощью днагностакутиов но свахах и формалиниэированных ; эритроцитах барана. В качестве сенсзтинов использовала очздэнншЗ капеульшз полисахарид менингококков серогруппы В и юдасахарадао-бэлкошэ яраварага Е. ooli KI.

Иммуногекиоотъ антигенных препаратов изучали в опыта! активной защиты мышей при внутркбрхзшшой шмуназацаи и заразэниз спустя ?-Ю дней разными дозами «ивах шкробов в 0,43 егар© нда в срадэ, содер-у.ааей агарозу и яшлезо. Гкбаль ssracKraus учатазаля в мчеякэ ТЕ пасов.

Г.8. Метода статистического анализа.

Статистическую обработку получении регульгакш грогодаж о-Зцз-прияятыш методами (А.П. Ашаркн, В."А. Воробьев, 3£>£2>. 1.9. ОфэрАвэниэ диссертации.

Работа оформлена с помощь» персонального кошъжгорй зкя гс/Ai и ряда коммерческих программ.

2, Р£3штш исаддошш

2.1. Иккробиологичоская характеристика штааиов В. ooii MI.

Для получения полисахарэдно-белковых внтягенгаа препаратов необходимо было составить коллекцию шташоз синтезируэдах нэ плотвдх питательных среда» KI- а "полный" (Б-)-О-антиген. В связи с тем, что в поласаййр'ддло-белковне препараты 1 эгут попасть белки фимбряй необходима было охарактеризовать нсслэдуоиае штаммы по способности к сгдаеэу фаыбрнй.

2.I.I. Идентифшация KI-антигена.

Кчглгг^э Ki-азтигеыа тестировали у штдммов в. ooli выращоиных на

гадкой к плотаой питательных средах при 37 °0 в течение 18, 24 и 48 часов. Пргг определении KI-капсульного ентигена, icpo«e реакция аггя»-ткнацкз с Е.!9кзотококковой серогрухш В сьшоротко$, попользовали те::~э доЕоязятаяыгай иэтод тестировагшя капсюльного аитвгеаа - рее:<-!>:» «ргпз&агкгоооз агглзтшацда я кислотной рэвэрош. ^аввквгга дополигблького гс-этода обусявмэао грудкоотяиа тазнтайкквцза KI-ангзгека, свзззаЕнкг врзадэ всего с отсутствием преидакткрушк

ТфОЛНЧЬКХ иЭН2лГСКС^02ИХ СОрОГрУШИ В Й ВЧарИЗКОЗЕНГ. КГ-СЕВОЯОТС-К,

и ивязжеи £цзта2рсзгнкэго к гшщэтазвровакзого вгршгсов KI-сагйггыа, потерт о&ргэ?г? с ^згЕтежокковоа еаороткэ агтлоткяата разной сзгекошлгогг. В Ерсзздеиаз osa?ex j веста псслэдовеазш: стгг^-з US/41. tЕ-С1, С173Су/41 Е ?11119/41 КЬазткгсн тзстй-рзэага ео пса срок»' кглтпз^ровзакя на хгшл в плотных ожгтэлыш срэдах. Сгеш K-I7 n essek. опытах ВГ-анэигэпа кэ скнгза^сзг."?. KI-ектзгея у st¡sü»d 243?, 2411, 2307 л даоа ^сткровкл?.? в сор-

тах с ео1сльзо2Гйй8:-1 плотксй штатольяой срада. 2.1,2. Идокте&зацЕЯ О-Елгагена.

3 задачу ксслэдсзайш входило дндаевэпциация штсммоз о к- и

i

8-ЛПС и опрэдэлешгв пррлгддэгносги атетаоо с G-ЛПС к О-сорогрушэ. С яоггшьи проба с ккпячекпэа, е такко ревкцда трягафлавиновой агг-г-тга-яаош и кислотной рэверсгн, Casa установлено наличие трех птоммов с R-ДПС. У 8-яте?.вдов в раеющз атглзэтянэции с oaepuxncEKHJsj 0-савороткама определены антитеза сврогрувт С2, 02 (у 3 оташзв), 07, 01S, 045 п 033 . йл.э. Сйфвдэлвнио фЕЗ-ídpsa.

. У ярапбдб1««х *с<шдовааийх устаювдзао, что катай сссле^зггс-ннг. птедаов раглнчеллсь по способности обусловливать ианногочусе-т:-iv.HhVji} туи .»«asHou'opesücvwniyB гематтлагинацк» в oaBHCswn-. от зрзда i»№v4Wf ят плотная) в spat»:« культ13щ>0В8Ейя (2Д «л»: 43 ■¡гасоэ). По ¡»зудиеим яоздело&анвй swaso Сало предположить, чгз »« ект.ггзнтм ярзязратм кз баггезраедагах вззйсзй, вкргаегзагх э «--ж'.«.*

в

16-18 часов на плотной питательной среде, будут попадать только следы фимбрий.

2.1.4. Вирулентность культур.

Дополнительные сведения о синтезе К1-ангигена получали при изучении способности шташов вызывать гибель мшаей при внутрибршин-еом заражении 20-ти часовыми хивими культурами с плотной питательной среды в 0,4 Я агаре в дозах 10®, 10*, 10°, 10е и Ю7 шкробшх клеток. При этом, наибольший процент погибших кивотных был обнаружен грушах мышей, заракэнных культурами штаммов ид/41 и 1Г5/41 (96,0 t 4,0Я и 92,0 t 5.5% соотвотствэнно). Культуры Н-61 и В17509/41 обусловливали равный процент гибели швотдах (76,0 1 9.7$). Наименьшая гибель мшпей (В.О±5.5Й) отмочена в группе шшотных, заракзшшх штаммом М-17, единственным не синтезирующим К1-антигена штаммом насей коллекции.

2.1.5. Протоктнвная активность убитых микробных взвесей.

В связи с тем, что для получения антигенных препаратов рекомендуется использовать итаиш микроорганизмов, обладающих протективной активностью в виде корпускулярных препаратов, были поставлены опыты активной защиты мышей, в которых в качестве иммуногенов использовали ацетоновые порспки, суспендированные в 0,85% растворе хлорида натрия, в дозе 50 ют. Ыышей шиунизировали шутрибрпшшно за 7 дней до заражения взвесью швых ¡слеток штамма и$/41 в 0,4% агаре.

Было выяснено, что ацетоновые корпускулярные препараты штаммов иэ/41, Н-61, А20а к Б17509/41 защищали от 45,5 до 23,3 % мышей от заражения дозой 250-103 микробных клеток при 100 % гибели кивотпых в контроле. При сшшэшш зарагкавдэй дозы до Ю'Ю'минробннх клеток в группах ьишей, вакцинированных препаратами из штаммов ид/41 и £11119/41, резистентными окозгтись более 80 % мышей. При этом,наиболее высокая резистентность отмочена в группе ипзотных, иммунизированных корпускулярным препаратом из гомологичного штамма.

Теким озразом,в результате проведенных исследований было выяс-

ю, что из II псслодовашшх нами штаммов 7 ( иэ/41, U5/41, 1119/41. В17509/41, Н-61, 120а а N9-80 ) сил тезирует KI-ентпгоя, ШС а принаддеяат к разник 0-серогруппа.ч. Эти штанин вирулентны я tttss-jfl, а уСиткf» эцетоном мжробгше взвеси этих птаюлов загшавт Ботних от заре?:йй1й енрулентм штаммом Е. ooli KI. EJtowu Ы-17 был гшетьагез^, которая KI-антигена яе синтезировал. Штата Z437, Z411 Z307 имояи П-ЛПС и К1-ентигон.

Для получения псгасагарэдно-белховиг аптич?нных препаратов мы »чля- .цэлэсообразтж« попользовать OKI-err-wKit U9/41, U5/41. П19/41, В17509/41. и-61, А20а и О-атЕМ* «17 в качестве контроля, 2 Получопггэ шлксзхардас-белчовна: препаратов.

Прл етсюр^ способа телу чех" л Еьткгешнх препаратов В. coli KI в зчестве прототипа ¡Зал использован кэтод. позволивший получать тз.гу-згепнне полнеахарюто-болковыа препараты из менингококков серогруп-i В. Штод состоял в обрЕСо-; ;в бактериальной масса цэтил-3-ггмж-ттгй Срсотдс« (цотавлопем) с посла душой двухкратной екст-акциой голясахарпдно-белкових ко.мплэксов раствором хлористого калька и частачноЗ очистки цутеи фракционирования спиртом (В.И. Кувакя-а, 1986). При выборе способа обработки бактериальной кассы В. coli I баш использованы разные концентрации цэтавлона и способы обра-отка микробных взвесой. .2.1. Опиты по схеме Ы I.

• В начала работа кы использовали схему, отработанную для нешга-•ококхои серогруппу в Л.Д. Сивцевой (1987). При использовании этой :хот (схема I). убитую картиолятом иихробнув вззось путтолировали 2 iaca я затем центрифугировала прл ЗООО о<5/ккн в течение часа. Препараты получали раздельно из надосадка и осадка микробной взЕеси.В згштах с В ooli при культивировании на плотной питательной среде во фракции, полученной кз надосадха кнкробноЯ гзвеси (фра:чцая I), нам ае удалось определить валэгчгэ сяаловой кислота. Развившееся Оуроа окрагшзанге проб при определена свидетельствовало, по описанию

'Б7еппег1ю1ю (1957), о высокой концентрации в препаратах гоксоз, мэиапдих определению сиаповой кислоты.

Наличие капсулыюго полисахарида определено нам в препаратах, получениях из осадка мизеробной массы, обработанной цетавлоноы в концентрациях до 0,1 и I,05. При втом обнаружены различия в содерка-ir.iiI бежа и снеловой кислоты, а такко неодинаковей выход капсулыюго по.тасахарвда (КПС) в пересчете на сиаловую кислоту в препаратах из 0,1 и I% цвта&лоповых осадков, полученных из двух использованных • штаымов оо11 и9/41 и Н-61 (табл.1).

Таблица I.

Характеристика'препаратов-штаммов Н-61 и 09/41. получешшх г.о схеме Т.

ШГАШ • Фракция виход сухого в-ва шсгЛС9 кккр. пл. содЕИШсге % СОДЕШАШЕ Опаловой кислот )я:г/Ю9 шкр. кл.

белка сиаловой кислот

Н-61 I • 11,9 23,4 - -

II 12,1 41.0 9,3 1,2

III 12,0 26,4 20,8 ' 2,7

U9/41 I 11 ,8 16,0 - -

11 7,2 3G,0 13,5 1,0

III 5.4 17,5 40,4 ■ 2,0

Тагам образом, уч] тгаая, что в препаратах из надосадкз бак-uaccu е. ooli по удаотся опродоллть спаловув кислоту йз-зз васокого содержания гоксоз и, вероятно, ЛИС Е. ooli, ш сочли нецелесообразным проводить шрвоначольное раздэлокиа1 Опквзвеси на осадок и нэдоса-доя в последующем обрабатывали цетавлоном исходный бактериальный ошв. . ■

2.2.2. Ошта по схеме N 2.

Бактериальную массу штаммов U9/J1 (две серии опытов), TJ5/41, 911119/41, Ы7509/41, н-61, А20а и M--I7, внраценнув на плотной питг>-

>■ дой среде с гздролизвтом казияна по Хоттингору, осаждал! О. \% товлоном ■ с последующи центри £угироввнием (осадок фракция А ), а тем'Надосадок обрабатывали 0,5% цетаплоном (осадок фракшш Б).При ом, из цетавлоновых осадков обеих фракций удавалось получать про-раты, содержание сиадову» кислоту. Наличие сиаловой кислота тости-вали во (^акциях А иташов U9/-Î1 (сер.8), U5/41, Fin 19/41, 7509/41 , Н-61 И А20а и во фракциях Б втвимов U9/41 (сер.З и .U5/41, Р11119/41, В17509/41 (тебЛ.2).

Химичбочф эдагез препаратов поксзал.что так icq как п опытах.по ема и I, вдоятсз различия в содержании балка и опаловой кислоты.во акциях А к Б, то есть Фракциях, полученных при обработке цетавло-м в разных концентрациях. Содержание сиаловой кислоты и выход КПС л визе в препаратах фракций А всех штаммов, гдч сиалояая кислоте .редзлялась и в А и в Б фракциях. Исключена составляли препарзты, 'лучоишо кз штзгаа U9/-11 в обеих сериях опытов (сер.З и сер.в). ;е выло содоркалке сиаловоit кислоты было во фракции Б, чем во Фрьх-м А. Кроме того, в препарате фракции А шта-ето U9/41 сер.8 содерлз-:е белка превосходило содержать опаловой кислота, s во фракциях В ( этого атвмна (сор.З и 8) содержание сиаловой кислоты было лызе »дерзания болса. Наиболее высокий гаход рапсульяого полисахарид1» » (расчета на сиалогуо кислоту в cru тех по схеме 2 был обнаружен в »парках • из "штамма .U5/41 (ю.2 мягЛО*) и вгьмн U9/<1 'Л.Ъ сг/10").

. По результатам проглденшх исследован*»/; г" cci.sû ÎI2. Этот способ обработки цотавлоно« Олсхзчлгльксй ипсси t )li Kl с плотной питательной среды позволил получать у 4 ч.ч G итезкрувдих Kl-aiirarou ттачмов по даа препарата в которых ест«деялось екчлопая кислота. Кроме того, при использовании схомы M 2 не ^бовэлось добзвлегия дополнительного реагента - мэргл:олята, та:: даадзлои цепользуешЗ для оемвд.огавг кислых продуктов, иискт^и;:-/ег '1ЛД{робше клетки. Получошшо прэпарата фракций А к В км-оли

разный химический состав (содержание белка и сиаловой кислоты), что могло обусловливать их разные иммунологические свойства.

Таблица 2.

Характеристика препера.тв, получе!шых из штаммов разных О-серогрупп

со схеме 7,

N гр выход сухого СОДЕРЖАНИЕ % СОДВРЯАНИЕ сиаловой кислоты мкг/109 микр. КЛ.

ШТАММ Станция в-ва мкг/109 мэтр. КЛ. белка сиаловой кислоты

09/41 А 7.7 . 42,0 13.5 1,0

сер. 8 Б 13.6 16,4 30,0 4,0

119/41 А 20.2 . 32.2 <1

сер.З Б 16.7 13.э : 37.7 6.3

В17509/41 А 8.1 43.7 24.0 2.0

Б 7.2 15-7 16.а 1.2

А20а А 6.6 41.0 11.2 0.7

Б 5.1 19-0 - -

М-17 А 4.а 69.Э <1

Б 5.1 25.7 <1

05/41 А 17.5 12.0 41.3 7.2

В 9.2 18.5 32.1 з.о

РЛ1119/41 А 11.9 23.7 19.5 2.3

Б 1.3 29.7 16.1 о.з

Н-61 А 13.6 17.3 18.4 1 2.5

Б 4.1 24.0 -

Примечание: " - " - буроэ 01фалпшшп:э проб.

В дальнейшие иссладовашяч ш приступил! к изучению йййуйохи-мических и иммунологических свойств препаратов,полученных по схеме N2.

2.3. Характеристика полисахарадао-белковых препаратов.

Для хах «жторастикя полисахарапно-бэлксвах препаратов были ис-

пользованы иммунохимические, электрофоретические и иммунологические методы.

2.3.1. Изучение антигенного состава препаратов.

Антигешшй состав полученных препаратов Сил исследован в имму-нодаффузии по Оухтерлоня. Отсутствие преципитирувдих К1 антиген сывороток но позволило использовать этот метод для идентификации К1-антигена в препаратах. Наличие преципитатов мы тестировали только в опытах с сыворотками к гомологичным О-антигенам. Отмечены различия в количестве линий преципитации у препаратов фракций А и Б. При этом, наличие двух типичных для О-аптагвна линий преципитации в опытах с гомологичной О-сшзороткой обноруявш в .большинстве препаратах фракций А,и только у одного препарата из фракции Б (штамм А20а фракция Б).

2.3.2. Изучение белкового состава препаратов.

Полипептадный состав франций Л и Б, выделенных из разных штаммов, был исследован с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (БШ-ПААГ). В этих опытах мы решали два вопроса: I) различаются ли по набору белков препарата фракций А и Б, и 2) входят ли в состав препаратов белка комплекса наружной мембраны В. оо11: белок А (40Ш, В (38,5К0), С (38Ш)) и й (Збмэ). Особешо нас интерисовал белок ,с !1ч 4ОМ), так как он по данным литературы (ОогаЬНоъ, 1985. ямшвм, 1985) ассоциирован с полисахаридом.

В проведенных исследованиях ш установили различия в составе белков различных молекулярных масс в препаратах Е. ооП К1, фракций А и Б. Обращал на себя внимание тот факт, что у ряда прегаратов фракций А (штаммы 49/41 сер.8, Ы-17 н Н-61) в диапазоне Мт 38-40 М), идентифицировалась единая белковая зона. Этот результат мог являться следствием очень прочных связей в этом белковш комплексе и его плохой растворимостью. Раздельно белковые зош, соответствующе белкам с Кт 40; 38,5 и 38 Ш>, на электрофоре грамма были идентифицированы в опытах при исследовании препаратов Б фракций штаммов от/41

обе серии, M-I7, H-6I и препарата Слракции А штамма иэ/41 сер.з. Препарат U9/41 сер.ЗА содержал оолок с Мш 36 kB, который такке тестировали во всех исследованных фракциях А и только в одном препарате фракции Б штамма H-6I. Таким образом, нами были обнаружены различия в белковом составе препаратов фракций А и Б. Установлено твкже, что в состав препаратов входят белки комплекса наружной мембраны, однако, в наборе этих белков имеются штаммовые различия.

Обнярукеннне нами различия в химическом составе, иммунохимичес-кой и злактрофоретччвской характеристиках препаратов фракций А и Б обусловили целесообразность раздельного изучения биологической активности этих фракций.

2.4. Выбор условий сорбции полисахаридао-белковых препаратов для получения диагностикумов, тестируоддх KI- и О-антитела е. coli.

В задачи этого раздела работы входило исследование способности полнсохарадно-белковш-. препаратов сенсибилизировать эритроциты барана. Особое внимание прл этом было обращено на условия получения дасгностакугюв, тосткрувдах штккапсулыше антитела.

В атих исследованиях использовали фЬршалшшзирозвнные неташзи-ровагсше врзтрадаты барана, хороао сорбарувдкэ по данным литература антигащ хкдасаяаридной природа (Б.В. Кервльншс, 1974). В качестве сопсншюп бшш использованы препараты фрйкщй! А и Б штамма иу 41. гзти препараты продет вдшш определенный }жтерос„ тек как былй полу-чшш из эталонного но Kl-шп-игену вташа 3. doli. В KITA с квштго-кокковша и евершмюзшмп 02-сшюротками öaso, уокановлеио, что ио-жш-зоваияно проиврата сенсибилизирую*? гаитрошда? «, йолучэйкш? анаг-iiüCTHuyiiCx вишодот аитихашулыше z О-акюетеде» йгк svom аккэгмск эр;процпгарш1х пранзра'тсй »»'.иоила о? усяогк* пмюкФт&мзгг, Так, црассрата фрш&& А (<?ep. ß к 0), ^т/^зарп^ы^цо иргротш кв хзодя-v ' бете, о&шэчаволк пулуче<ниа дявгаосгг^.ок, тес-щруавдх 02-GJiTi';Töj;a, а яретшрзкг фракщс: Б (сэр., в ж 3} -- яоеяфуадаг зпташт оудьяка mtitWA, Дня получений да&гссигахуыоэt *всгарушах KI

антитела, препараты фракций Б мокно было использовать как непрогре-тые, так и прогретые. Подтвержденное с помощью РПГА наличие в препаратах штамма U9/41 KI- и 02-антигенов E.ooli позволило приступить к изучению антигенной активности этих препаратов в опытах на животных. 2.5. Биологическая активность полисахвридно-бзлковых антигенных препаратов К. ooli KI в опытах на животных.

Биологическую активность полисахаридно-белковых антигенных препаратов в. ooli KI оценивали по способности обеспечивать увеличение количества антителобразуедих клеток (АОК) и обеспечивать синтез антител к KI- и О-антигенам у гквотных, крот того, определяли им-мувогенную активность в опытах акг.тной зенита мышей, предварительно изучив "острую" токсичность исследуемых препаратов. 2.5.1. Определение способности голисахарвджмзегговшс препаратов увеличивать количество АОК к обеспечивать синтез антител.

При определении антителобразувщих ¡слеток мотодом пассивного локального гемолиза в гело было выяснено, что фракции А и Б полученных нами препаратов способны обеспечивать статистически существенное увеличение АОК, синтезирующих О-антигелэ. Тан количество АОК в селезенках мышей, получавших препарат штамма U9/41 фракции Б составляло 2325 ± 565 АОК на селезенку, получавших препарат штамма IJ-I7 фракции А 4900 t 1088 АОК на селэзепку. В контрольной группе количество АОК не превышало 137 ± 72 АОК на селезенку. Раззпща между опытны;®! и контрольной группой была статистически значима ( t=3,8 и 4,37 соответственно, р<0,05 ). Установить KI-антигенную активности» препаратов ни при определении АОК, ни при тестировании антикапсульдах антител в сыворотках крови мыиеЯ в РПГА нам не удалось. Наличие KI-антигенной активности препаратов ш определили и по нарастанию титров антикап-сулышх антител в F1TTA в опытах на морских свинках. У иммунизированных морск'..< свинок отмечено более чем 4-х кратное нарастание титров антикзпсульннх антител (табл. 3). Наличие антигенной активности у полисам аридно-белковых препаратов по даишм тоста jeme, Nordin

(1963) и РПГА свидетельствовало о целесообразности сравнительного определения их токсичности и ишуногенности. .Таблица з. Динамика титров антител у морских свинок.

£ Препарат ДЛЯ ишунизации Диагностикам Тигры антител в зависимости от кратности инъекции

п/г I 2 3

I М.meningitidis серогруппи В КПС КшВ* U9/41 сер.БЗБ U5/41 Свр.54Б 1 :Э2 1:32 1:2 1:128 1:128 1:128 1:512 1:512 1:512

2 U9/41 сер.ВБ КПС NmB* U9/41 сер.БЗБ U5/41 сер.Б4Б 1:32 1:16 1:8 1:32 1:32 1:32 1:512 1:256 1:128

3 U9/41 сер.аБ КПС НтВ* U9/41 сер.БЗБ U5/41 С0р.54Б 1:2 1:2 1:2 1:32 1:32 1:32 1:512 1:512 не опр

4 U5/41 сер.4Б КПС ПяВ* U9/41 сер.БЗБ U5/41 сер 54Б <1:2 <1:2 <1:2 1 :Э2 на опр. 1:32 1:256 1:256 1:128

* Примечание: КПС ЫтВ - диагностику»! из очищенного препарата капсульиого полисахарида менингококков серогруппп В.

2.5.2. токсичность полисахарвдно-болковых препаратов.

Сравнительное изучешш токсичности шшюахарпдао-белковых препаратов, полученных при фракционировании втш^лов 05/41, А20а и Н-61 показало, что препараты фракций А насколько превосходят по токсичности препараты, полученные из фракций Б. Следует при атом подчеркнуть, что во изученные прапарага яра шутриоршшшом введении в дис '00 ¡от1 по' шзивали гибели шаей.

2.5.3. Определение иммуногенной активности препаратов в опытах активной защиты мышей.

Таблица 4. Защитная способность препаратов из штамма 119/41 в опытах заражения культурой гомологичного штамма в 0,4 % агаре.

« группы Препарат U9/41 Отношение числа погибших (числитель) к числу взятых в опыт (знаменатель) мышей в зависимости от дозы культуры для заражения, »10 микробных клеток Средняя летальная доза и ее доверительный интервал при р=0,05, «Ю'микр. клеток

10 10* 10* Ы)эо I/nax Xr> t г»

I ацетоно-новая Чо ч, 9/ю 79,43 199,50 31.05

2 ПС-белковый сер.вА Чо 10/10 31,62 52,24 17,17

3 ПС-белковый сер.8Б а'ю 8, '10 31,62 71,88 13.88

4 Контроль % % 7,94 25.47 2,48

Статистический анализ

Существенность различий (р) Р < 0,05 Р > 0,05

по критерию t-Studenta.

I и 2, I и 3,

Сравниваемые группы I и 4, 2 и 4 2 и 3, 3 и 4

В этих опытах при впутрибргаинной иммунизации ttmeü было установлено, что sie следованию препараты защищают животных от заражения вирулентным штаммов E.coli KI (табл. 4 и 5). Отмечено статистически значимое увеличение xd в группах нквотных, иммунизированных ацетоновой в£.-:цгоюй и полисахаридно-белковым препаратом U9/41 сер.8А по

сравнению с контрольными кьшаш. К рома того, в опытах, где зарагаыщу) дозу вводили о Ре-агарозо (табл.б) установлано статистически значимое увеличение и>во в группе ышшй, шыунизированных препоратон в: и таю.! а, гетерологачного по 0-антигену итадау, использованному для заражения.

Таблица • 5. Защитная спосоОиость полиспхаридао-белкоил препаратов при шугрибришнном заравдшпГ культурой 1)9/41 в -агароэа.

В Группы Препарат Отновекко числа погибши (чйслит«ль) к числу взятых в опыт (знаменатель) шаей в зависимости от до;ш для зыраздшя, юмробиио клетки Средняя литальная д и ео доверительный те рвал при р«0,0Ь, микробные клетки

100 БОО 2500 Ы&о \jria я I/.

1 Полисахарид-но-балковаЯ сер. ЗБ. и?/41 '20 10, 20 '20 бзб.б 1*10,0 2 Ы

г Полисахарвд-но-балловый сер./ 4Б. «5/41 0. 20 у19 1б/ 21 362.4 847,4 155

э Контроль - 17/ лга г1/ 2Э/ 26 73.

Статпспгческий анализ

Существенность различий (р) по критерию гтБ^авта. Р < 0,05 р > 0,05

Сравниваешэ группы I Е 3, 2 И 3 1 и 2

ЗАКЛКШШЕ. ■

Для ров;зння задач по шбору птайыа и способа получ»/шя тиии-,-харидно-Сэ.ккокых антигенных препаратов, в которых <хх{.аняла,гь 01.

«•явность 0- и KI-антигенов е. coli, мы собрали коллекции OKI -гаммов Е. coli, которио при культивировании на плотной питатолыгой юдп с гидролизатом казеина средней степени расщепления по Хоттин->ру СИНТвЗИрОВВЛИ KI- П "ПОЛНЫЙ" з- О-аитигон.

В' проведенных нами исследованиях установлено, что испо.пьзоввн-й способ двухкратной обработка цятавлоном в концентрациях до 0,1?. 0.5Ж позволяет получать полиснхаридзю-белковые пропярята, рмличо-нося по содержании болка и сяеловоП кислоты, а такие имемцие рпз-Г) антигенный и белковый состав.

Показана возмонюсть использования полисахаридно-белковых про -ратов е. coli KÍ в качество сонсппшов для приготовления оритроци-31QJX диагностикумов. При этом, га препаратов, полученных при обра-гко 0,1« цетавлоиом т получали диагностику^, тестирущио 0-гитела, о из препаратов 0,5$ цетявлона снтикалсулышэ антитела я. .1.

Иолиспхаридно-болковне препараты обусловливала у яявотнмх про-low антикапсулымх и гомологичных 0-антител, обладали умеренной сичностью, но вызывал гибели мышей при введении обычной для полиаридных препаратов человеческой дозы (200 мкг).

Использованный нами способ позволил получить полисахаридно • (с.В1э антигшгане препараты, способные в опытах активной защиты яцать шптй от заразсения вирулентным штаммом E.ooli KI.

. шводы

1з бактериальной мисси итаммон в. coli Kl разных О-серагрупи с |дой питательной среды получены полисахеридно-белховые препараты, рчагдие до 40'.' капсулыгого полисахарида в пересчете на сиаловую оту.

становле'ны различия в химическом и антигенном составе пропара-получоншх при фракционировании надосодков и осадков культур. ■> высокой содержание сиалоной кислоты, tro сравнению с б^пкоч.

тестировали в препаратах из надосадков (фракции Б). Наличие 0-внтигваа установлено в препаратах из осадков (фракции А).

3. Полисахаридно-белковые препараты Е. ooli KI были использовали в качестве сенситинов для получения эрг.троцитарных диагностикумов, тестирующих антикапсульныо и О-антитела. О-диагносгикумы получены из прогретых препаратов, цетавлоновых осадков микробных клеток (фракция А). Диагностикуш, выявляющие аптикапсулыые антитела - из препаратов надосадков культур (фракция Б) как прогретых, так и напрогретых.

4. При внутрнОршинной иммунизации кашей талисахаридно-бвлковыми препаратами Е. ooli KI установлено увеличение количества АОК и тигров 0-антител. Способность полисахарвдио-белковых препаратов обеспечивать синтез антикапсульных антител обнаружена при иммунизации морских свинок.

Б. Препараты в дозах 1000 к 5000 ист, полученные из осадков культур (фракции А), вызывала гибель большего числа особей, по сравнению с препаратами, полученными из надосадков культур (фракции Б). Все исследованные препараты в дозе 200 шег не вызывали гибели мыаей. 6. Полисахаридно-белковые препарата обеспечивают в опытах активной защити мышей защиту швауназированных ¡шзотных как от заражения гомологичным штаымом, так и от заражения итамиоы другой О-серогрушш.

Ошмж работ, опубликованных щ> шш ЛШёЁШШл.

1. Защитная активность сыворотки крови, содержащей антитала к KI-штигену ешерихий. - ЁЫЭй, 1989, Ш2, c.III-112. (соавт. Е.В. Зайцева, A.M. Мордаицкнй, B.W. Боровкова, Л.А. Л анаша).

2. Антитела к Н. meningitidis сорогруппы В у ладей с различной способностью к адгезии менингококков. - ШЭИ, 1990, й8, с.114-116. (соавт. Л.А. Левина Е.В. Зайцева, A.M. Ыордвицкий).

°>. йнфобцологичаская характеристика втамюв Escherichia coli К1. -ДШ, 1991,. Ш, с.81. у

Соискатель: к £ J рхл/иф-1^ J