Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Анализ мутаций в генах TP53, NOTCH1, SF3B1 и B1RC3 у больных хроническим B-клеточным лимфолейкозом

На правах рукописи

Северина Наталия Александровна

«Анализ мутаций в генах ТР53, NOTCH I, SF3B1 и B1RC3 у больных хроническим В-клеточным лимфолейкозом»

14.01.21 - Гематология и переливание крови

Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005556283

4 ДЕК 2014

Москва, 2014 г.

005556283

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Гематологическом научном центре Министерства здравоохранения

Российской Федерации

Научные руководители:

доктор биологических наук Судариков Андрей Борисович кандидат медицинских наук Никитин Евгений Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Куцев Сергей Иванович, заместитель директора ФГБУ медико-генетический центр РАН

кандидат медицинских наук Демидова Ирина Анатольевна, заведующая лабораторией молекулярной диагностики ГКБ № 62 г.Москва

Ведущая организация: ФГБУ «Российский онкологический научный центр» им. Н. Н. Блохина

Защита состоится 2014 г., в ¿/часов на заседании

диссертационного совета в ФГБУ ГНЦ МЗ РФ (125167, г. Москва, Новый Зыковский пр-д, д.4.)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ ГНЦ МЗ РФ. Автореферат разослан «10» WJ-Z'JlmL 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук •

Буланов А. Ю

Актуальность работы

Хронический лимфолейкоз один из самых распространённых видов лейкоза среди взрослого населения, после 60 лет число заболевших возрастает экспоненциально. Клиническое течение B-XJ1J1 значительно различается, время жизни пациентов может варьировать от 1-2 лет до 15 и более. Несмотря на то, что классификации по Rai и Binet остаются достаточно точными для идентификации пациентов с тяжелыми стадиями заболевания, они не могут предсказать успешность терапии. Поиск маркеров тяжести течения и прогноза заболевания до сего момента остается актуальной задачей, несмотря на существование таких сильных предсказательных показателей как мутационный статус генов иммуноглобулинов (оценка уровня зрелости лейкозной клетки-предшественницы), цитогенетические характеристики, уровень бета2-микроглобулина и др. По результатам полногеномного секвенирования семи целых геномов и более 200 целых экзомов у больных хроническим В-клеточным лимфолейкозом было выявлено несколько генов, мутации в которых повторяются у данной группы больных с частотой более 5% и принадлежат к консервативным сигнальным путям клетки. К ним относится сигнальный путь NOCTH1, путь транспорта и процессинга мРНК (ген SF3BI), путь врожденного воспалительного ответа (ген BIRC3), путь регулирования клеточного цикла (ген ТР53). Влияние мутаций данных генов на патогенез В-ХЛЛ и эффективность терапии до сих пор до конца не ясно. В настоящем исследовании был проведен анализ мутаций в генах ТР53, SF3BI, NOTCH1 и BIRC3. Генетический материал из опухолевых клеток больных B-XJUI, нуждающихся в проведении терапии, был получен до начала терапии. Далее все больные получали лечение в режиме FCR или FCR-lite. Таким образом, возможно соотнести наличие мутаций в генах ТР53, SOTCHI, SF3B1 и B/RC3 с эффектами терапии при исследовании данной однородной группы пациентов и оценить взаимосвязь с уже известными лабораторными маркерами В-ХЛЛ.

Цель исследования

Изучение связи мутаций в генах ТР53, NOTCH], SF3B1 и BIRC3 при В-клеточном хроническом лимфолейкозе и их влияния на прогноз и течение заболевания.

Задачи исследования

1. Исследование генов ТР53, NOTCH I, SF3BI и BIRC3 на наличие мутаций у больных B-XJIJT до получения ими медикаментозной терапии режима FCR.

2. Изучение функциональной активности гена ТР53 с помощью скринингового метода FASAY для подтверждения инактивирующего влияния мутаций в гене ТР53 и определения частоты мутантного аллеля.

3. Анализ взаимосвязи мутаций в вышеуказанных генах с прогнозом и течением заболевания, а также с другими прогностическими маркерами при В-ХЛЛ.

4. Определение прогностической значимости мутаций генов ТР53, NOTCH 1, SF3BI и BIRC3 при В-ХЛЛ.

Научная новизна исследования

Впервые в России проведено рандомизированное исследование мутаций в генах ТР53, NOTCH/, SF3BI и BIRC3 для первичных больных хроническим В-клеточным лимфолейкозом.

Научно-практическая ценность

Ранняя диагностика неблагоприятного течения при B-XJIJ1 на основании наличия мутаций в генах ТР53 и NOTCH1 позволит выделить группу больных «повышенного риска» до начала лечения. Анализ мутаций в генах ТР53, NOTCH1, SF3BI и BIRC3 поможет выявить больных с генетическими аномалиями среди больных с нормальным кариотипом, диагностированным методом FISH.

Внедрение в практику Все использованные методики внедрены в клиническую практику ФГБУ ГНЦ МЗ РФ и использованы в диагностике.

Материалы-диссертации были неоднократно доложены:

1 .Конгресс гематологов России, 2-4 июля 2012 г.. Москва;

2.IX Российская конференция с международным участием, «Злокачественные лимфомы», 18-19 октября 2012 г., Москва;

3.Всероссийская научно-практическая конференция «Молекулярно-генетические и иммуногенетические методы диагностики в практике врача гематолога», 25-26 апреля 2013 г., Санкт-Петербург.

Положения, выносимые на защиту

Проведено первое в России рандомизированное исследование взаимосвязи

мутаций в генах ТР53, NOTCH!, SF3B1 и BIRC3 с неблагоприятным с прогнозом и ответом на терапию у первичных больных B-XJU1. Мутация по крайней мере одного из исследуемых генов выявлена в 45% случаев (у 68 из 155), двух генов одновременно в 3% случаев (у 5 из 155). Частота мутаций гена ТР53 - 10% (16 из 155). Выявлена статистически значимая связь наличия мутации в гене ТР53 с делецией хромосомы 17р (р=0,001) и IgVH без мутаций (р=0,01). Частота мутации c.7541_7542delCT гена NOTCHI у больных В-ХЛЛ 17% (26 из 155), ассоциирована с трисомией 12 (р=0,006), IgVH без мутаций (р=0,025), отсутствием мутаций в гене SF3B1 (р=0,04). Частота мутаций гена SF3B1 - 16% (25 из 155), ассоциирована с отсутствием делении 17 хромосомы (р=0,001). Частота мутаций гена BIRC3 — 5% (4 из 81). Статистически значимой ассоциации с другими биологическими и прогностическими параметрами не выявлено. Апробация

Диссертация апробирована на объединенной проблемной комиссии «Клинические исследования в гематологии (гемобластозы, депрессии кроветворения; ТКМ; миело- и лимфопролиферативные заболевания; опухоли лимфатической системы; патология красной крови; ИТП; порфирии)» и «Фундаментальные исследования в гематологии, трансплантологии, трансфузиологии: Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; биохимия; биофизика» ФГБУ ГНЦ МЗ РФ (24 февраля 2014г.)

Печатные работы:

По теме диссертации опубликовано 2 статьи в отечественных журналах, рекомендованных ВАК, и 4 тезисов докладов в отечественных и зарубежных изданиях.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 90 страницах. Содержит 4 рисунка, 4 графика,

21 таблицу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа по исследованию генов выполнена на базе лаборатории молекулярной гематологии ФГБУ ГНЦ МЗ РФ (зав. лаб. - д.б.н. Судариков А.Б.).

I. Методы, используемые для РА8АУ

1. Выделение РНК

Мононуклеары периферической крови выделяли стандартным методом центрифугирования в градиенте Ficoll-Hypaque. После выделения их мгновенно замораживали в жидком азоте и помещали на хранение при -70°С. мРНК из замороженных образцов клеток выделяли методом экстракции с гуанидин-тиоцинатом фенолом и хлороформом, спектрофотометрически определяли концентрацию.

2. Обратная транскрипция

В реакцию обратной транскрипции добавляли по 2 мкг РНК каждого образца. кДНК синтезировали в течении 1 часа +37°С с использованием 1 мкл 10 мМ случайных праймеров в качестве затравки и обратной транскриптазы М-МЬУ (Ргогг^а).

3. Амплификация кодирующей последовательности гена ТР53 для РА8АУ

На полученной кДНК ТР53 была амплифицирована кодирующая "последовательность гена - регион между 4 и 10 экзоном (кодоны 42 и 374 соответствующие центральному домену). Праймеры для ПЦР реакции РЗ (5'-АТТ-

TgATgCTgTCCCCggACgATATTgAA(S)C-3'), и P4 5'-ACCCTTTTTggAgCTTCAg TgggCTggAgT(S)g-3'), где S - тиофосфатная связь предохраняет праймер от дефадации полимеразой, обладающей 3'-5'-экзонуклеазной активностью. Реакция проводилась с полимеразой PFU (Promega) в объеме 25 мкл: 2,5 мкл с разведенной в 5 раз кДНК, 125нМ специфичных праймеров, 125нМ смеси нуклеотидов, 2,5 мкл стандартного буфера (Promega). Условия реакции: (92°С, 2,5 мин), последующие 35 циклов: 92°С 30 сек, 57°С 30 сек, 72°С 240 сек, 72°С 15 мин. При работе в оптимальных условиях PFU полимераза допускает минимальное количество ошибок по сравнению с другими термостабильными полимеразами.

4. Подготовка плазмид pSS16 и pLS76 для FASAY

Плазмидные вектора, любезно предоставленные нашей лаборатории Prof. RNDr. J. Smardova (Department of Pathology, University Hospital, 625 00 Brno, Czech Republic), были трансфецированы методом электропорации в ячейке BioRad в штамм Е. Coli MGS 109, обладающий устойчивостью к пенициллину. Трансформанты высевали на селективную среду содержащую ампициллин. Полученные отдельные колонии бактерий культивировали в жидкой среде LB до D600=l. Из полученной культуры были выделены плазмиды pSS16 и pLS76 методом щелочного лизиса. Выделенная ДНК очищена центрифугированием в градиенте CsCh и разбавлена в воде до концентрации 1мг/мл.

5. Рестрикция и очистка плазмиды pSS16

Рестрикцию плазмиды pSS 16 осуществляли рестриктазами HindIII и Peel в буфере W компании СибЭнзим, в результате этого концевые участки плазмиды становятся гомологичны концам амплифицированного фрагмента гена ТР53, что необходимо для проведения метода FASAY. После рестрикции проводили электрофорез в 1% легкоплавкой агарозе (Sigma). Нужный фрагмент вырезали и очищали с помощью фенол-хлороформной экстракции (щелочной фенол (рН=7)). Полученный после очистки материал готов для использования в FASAY.

6. Рутинная культивация дрожжей

Культивация дрожжей S. cerevisiae штамма ylG397, имеющего генотип

MATaade2-l leu2-3, 112lrpl-lhis3-l 1.15canl-100ura3-l URA3 3xRGC::pCYCl:: ADE. производили на среде YPD с избытком аденина (200 мкг/мл) во избежание появления спонтанных мутаций.

7. Функциональный анализ разделенных аллелей ТР53 в дрожжах

Трансформацию дрожжей производили с помощью линейного вектора pSS16, содержащего LEU2 - маркер положительной селекции по лейцину, методом литий-ацетатной трансформации. Дрожжевые клетки с помощью гомологичной рекомбинации встраивают участок ТР53 в вектор pSS16, содержащий в себе обе концевые последовательности гена ТР53. Клетки 2-3 дня культивировали при температуре 30°С на среде YNB с добавлением гистидина, триптофана, урацила 20 мкг/мл и добавлением аденина до 5 мкг/мл. Экспрессия в дрожжевых клетках функционально-активного ТР53 приводит к активации транскрипции гена ADE2, т.к. ген ТР53 связывается с промотером гена ADE2 и активирует синтез аденина, необходимого для роста дрожжевых клеток. Соответствующие дрожжевые колонии в этом случае бесцветны. Экспрессия мутантного ТР53 приводит к окрашиванию колоний в красный цвет: функция мутантного белка Р53 нарушена, и выработка аденина за счет транскрипции гена ADE2 не происходит. Запускается иной путь синтеза аденина, где промежуточный продукт обмена имеет красный цвет, он накапливается в клетке, придавая ей соответствующую окраску. Соотношение бесцветных и красных колоний демонстрирует количество функционально активных/мутантных ТР53. Схема метода представлена на рисунке 1. Красные клетки хорошо отличимы от белых колоний, но максимум насыщенности приобретают после дополнительных 2 дней культивации при температуре 4°С. При наличии более 15% красных колоний проводили секвенирование гена ТР53 для подтверждения наличия мутации.

ч

'■4

| | 1 и-Ас

Гамсформация

. - - ~______6 дрожжевых

выделение % сО^А \ % ТР53 клеток |

Позволяет оценить функциональную |§|г активность гена ТР53 мшат7тзз % клеток опухоли, содержащих мутации _

А

"Шё

Рисунок 1. Иллюстрация метода РА8АУ:

А. Схема метода РАБАУ. В. Пример чашек с трансформантами

8. Выделение ДНК из колоний дрожжей для проведения подтверждающего секвенирования

Изолированно растушую колонию стерильной зубочисткой снимапи с чашки Петри и суспендировали в 100 мкл воды, после 3 минутного кипячения остужали и добавляли 100 мкл водного хлороформа. Суспензию центрифугировали 5 минут, супернатант отбирали и добавляли по 5-10 мкл в ПЦР реакцию. Полученные продукты красных колоний сиквенировали для подтверждения наличия мутации в гене ТР53. Для анализа брали по 5 красных колоний.

II. Методы, используемые для непосредственною изучения

последовательности генов путем ПЦР и сиквенсного анализа

1. Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови

Мононуклеары периферической крови выделяли стандартным методом

9

центрифугирования в градиенте Ficoll-Hypaque (Sigma). Клетки лизировали добавлением WCLB-лизирующего буфера, после этого насыщенным раствором аммония хлорида (1/4 объема) осаждали белки, а нуклеиновые кислоты оставались в водном растворе. ДНК осаждали добавлением Зх объемов этанола. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически по поглощению при А260 нм.

2. Аллель-специфичная ПЦР исследование мутаций NOTCH 1

Наличие делеции c.7544_7545delCT, составляющей 80% всех мутаций в

гене NOTCHI (34 экзон, домен PEST) было исследовано с помощью аллель-специфичной ПЦР (ARMS-PCR). Праймеры FW_5'-NOTCHl-gTgACCgC AgCCCAgTT-3', i FMNOTCH1 -5'-TCCTCACCCCgTCCCgA-3', RNOTCHl-5'-AAggCTTgggAAAggAAgC-3'. В реакцию объемом 25 мкл добавляют 2 мкл 50нг/мкл геномной ДНК, 0.1 мМ FW праймера, 0.5 мМ FM_NOTCHl парймера и 0,3 мМ праймера RNOTCH1, 2,5-кратный буфер. 2,5-кратные dNTP, 2,5-кратный магний, 0,2 мкл Tag полимеразы (Синтол, Россия) Параметры реакции: 92 °С, (2,5 мин) и последующие 35 циклов из 95 °С ЗОсек, 57 °С ЗОсек. 72 °С 40 сек, 72 °С 10 мин.

Чувствительность данного метода позволяет выявить наличие делеции даже при 10% мутантных аллелей. Наличие делеции подтверждалось секвенированием по Сэнгеру. На рисунке 2 показан результат электрофореза в 2% агарозе продуктов аллель-специфичной ПЦР, дикий вариант гена NOTCH 1 (Wt) имеет 1 полосу напротив контрольной полосы ЗООЬр маркера молекулярного веса. При наличии делеции в гене NOTCHI происходит амплификация с обоих прямых праймеров. что при проведении электрофореза визуализируется, как появление дополнительной полосы продукта чуть ниже 200Ьр маркера молекулярного веса (Del).

-300200

Рисунок 2. Результат электрофореза продуктов алель-специфичной ПЦР

При наличии делеции в гене NOTCHI. выявленной с помощью аллель-специфичной ПЦР на электрофорезе визуализируется полоса продукта размером в183 нуклеотида и располагается ниже полосы дикого аллеля. Продукт амплификации дикого аллеля имеет размер 283 нуклеотидов и располагается на уровне 300 относительно маркера молекулярного веса и служит положительным контролем прохождения ПЦР реакции.

3. Амплификация последовательностей генов ТР53, B/RC3, SF3B1 и

NOTCHI и секвенирование по Сэнгеру

Последовательности генов BIRC3 (экзоны 6-9, RefSeq NM_001165.3), ТР53 (экзоны 4-8, RefSeq NM_000546.4), NOTCH1 (PEST домен; RefSeq NM_017617.2) и SF3B1 (экзоны 14-16, RefSeq NM_012433.2) были амплифицированны с помощью ПЦР (условия представлены в таблице 1), очищены с помощью BigDye X-terminator (Promega) и исследованы методом секвенирования по Сэнгеру на приборе ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Полученные сиквенсы генов были сопоставлены с соответствующими референсными последовательностями. При анализе был использован программный пакет Mutation Surveyor (SoftGenetics). Синонимные мутации, полиморфизмы, (на основании dbSNP13, базы данных Ensembl), были исключены из анализа. Молекулярные исследования проводились вслепую

относительно клинических данных.

Последовательность праймеров Состав ПЦР реакции Условия ПЦР

Ген BIRC3

6 экзон F - CCTAATATgTgTTAAATTCTTTgTTCC Обший объем -25 мкл ДНК -lOOng Магний • 1-5 тМ Нуклеотиды - 0.1 гпМ Полимераза Tag -0.25 Праймеры - 167 пМ (каждый) 1.3 мин-95 °С

R - AgACTgATATCAAATCCTTATgAAAAT

7 экзон F - TggAAggAAgTTTgTgAgCA 2. 30с - 95°С П.2-П.4.- повтор 40 раз

R - AAgAgCgTATTTTCAATTgACTTAgA 3. 40с - 58°С

8 экзон F - TCATAgTAATgCTTTTTCTTTTTCTCC 4. 40с - 72°С

R - AggCAgTTTgCTTCTTCAgTg 5. 10 мин - 72°С

9 экзон F - TgAAGAAgCAAACTgCCTTTTAT

R - AAAgTTTAgACgATgTTTTggTTC

Ген ТР53

4 экзон F - TgAggACCTggTCCTCTgAC Общий объем -25 мкл ДНК - 50 ng Магний -l,8mM Нуклеотиды -0.1 шМ Полимераза Tag -0.25 Праймеры - 167 пМ 1. 3 мин-95°С

R - AgAggAATCCCAAAgTTCCA 2. 30с - 95°С Снижение на 0,5°С каждые 3 цикла до 60"С

5-6 экзон F - TgTTCACTTgTgCCCTgACT 3. 40с - 62°С

R - TTAACCCCTCCTCCCAgAgA 4. 40с - 72"С

7 экзон F - CTTgCCACAggTCTCCCCAA 5. 30 с - 95°С П.5-П.7 - повтор 30 раз

R - AggggTCAgAggCAAgCAgA 6. 40с - 60"С

8 экзон F - TTgggAgTAgATggAgCCT 7. 40с - 72"С

R - AgTgTTAgACTggAAACTTT 8. 10 мин - 72°С

Ген SF3B1

14 ЭКЗОН F - TggAAAgAAATggTTgAAgA Общий объем -25 мкл ДНК -lOOng Магний - 1,2 шМ Нуклеотиды - 0.1 тМ Полимераза Tag -0.25 Праймеры -167пМ 1. 3 мин - 95°С

R - AAgACCCTgTCTCCTAAAgAAAAA 2. 30с - 95ПС 3. 40с - 58ПС 4. 40с - 72°С П.2-П.4-повтор 30 раз

15 экзон F - TgCAgTTTggCTgAATAgTTg

R - CCAATAgCCTTCAAgAAAgCAg

16 экзон F - CACTTTAAAATTCTgTTAgAACCATgA 5. 10 мин - 72иС

R - gCTgAAgCAgCAACTCCTTA

Ген NOCTH1 (PEST домен)

34 ЭКЗОН F - TCCACCAgTTTgAATggTCA R - AAggCTTgggAAAggAagC Общий объем -25 мкл ДНК -100ng Магний - 1,8 тМ Нуклеотиды -0.1 шМ Полимераза Tag- 0.25 Праймеры - 167 пМ 1.3 мин - 95°С 2. 30с - 95°С 3.40с-60"С 4. 40с - 72°С 5. 10 мин - 72°С п 2-П.4-повтор 42 раза

Таблица 1. Последовательность праймеров и условия ПЦР для

амплификации генов ТР53, BIRC3, SF3BI и NOTCHI

III. Анализы, проведенные другими исследователями в рамках протокола MLSG08

В рамках протоколов MLSG08 проводились следующие исследования:

- Мутационный статус генов вариабельного региона иммуноглобулинов. Исследование проводилось в лаборатории Сударикова А.Б. старшим научным сотрудником Бидерман Б.В.

- Цитогенетические аберрации исследовались методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с зондами LSI ATM, LSI p53, LSI D13S319, LSI 13q34 и Сер 12. - зав. лаб. кариологии Обуховой Т.Н.

Исследование уровня бета-2-микроглобулина и соотношения легких цепей определялись методами белкового электрофореза с иммунофиксацией (Free Light Chain Assay) - сотр. лаборатории .иммунохимии Варламовой Е.Ю.

Исследование минимальной остаточной болезни для оценки

эффективности терапии проводили методами 4-цветной проточной цитофлуориметрии, а также с помощью аллель-специфичной ПЦР сотрудниками кафедры клинической лабораторной диагностики Российской медицинской академии последипломного образования.

- Иммунофенотипирование с целью первичной диагностики проводили на базе кафедры клинической лабораторной диагностики Российской медицинской академии последипломного образования, благодарим за помощь в проведении исследования профессора Луговскую С.А.

Статистическая обработка данных

Непараметрические данные сравнивали с помощью двустороннего у2-критерия с поправкой Йейтца. Различия считали достоверными при Р=0,05. Кривые беспрогрессивной выживаемости и общей выживаемости после терапии строили по методу Каплан-Мейера и сравнивали с помощью лог-ранк метода. Многофакторный анализ проведен с помощью регрессионного анализа Кокса. Статистический анализ был выполнен с помощью программы STATISTICA 6.0.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика пациентов

Пациенты B-XJUI <60 лет, а также больные в возрасте от 60 до 70 лет с индексом коморбидности 6 и менее получали лечение FCR. Больных B-XJUI старше 70 лет, а также пациентов в возрасте от 60 до 70 лет с индексом коморбидности 7 и более рандомизировали на группы с менее токсичным лечением по схеме FCR-Lite (вариант FCR с редукцией доз флударабина и циклофосфана). Схемы лечения представлены в таблице 2. FCR

Циклофосфамид 250 мг/м2 в дни 1-3 Флударабин 40 мг/м2 в дни 1-3

Ритуксимаб 375 мг/м2 в день 0 или 1 на 1 курсе; 500 мг/м2 в день 0 или 1 на курсах 2-6

FCR-Lite

Циклофосфамид 150 мг/м2 в дни 1-3 Флударабин 32 мг/м2 в дни 1-3

Ритуксимаб 375 мг/м2 в день 0 или 1 на 1 курсе; 500 мг/м2 в день 0 или 1 на курсах 2—6

Таблица 2. Схемы терапии

В рамках исследования до начала терапии была проведена оценка следующих прогностических маркеров: цитогенетических аберрацией методом FISH (флуоресцентная гибридизация in situ), мутационного статуса генов вариабельного региона иммуноглобулинов. Было проведено исследование генов ТР53, NOTCH1, SF3B1 и BIRC3. Анализ мутаций в наиболее важных в функциональном отношении экзонах был проведен путем секвенирования по Сэнгеру: в гене ТР53 (4-9 экзоны), SF3B1 (14-16 экзоны), BIRC3 (6-9 экзоны). Исследование гена ТР53 было так же проведено с помощью метода FASAY, скринингового метода позволяющего оценить функциональную активность гена ТР53 и выявить процентное соотношения мутантного и дикого аллеля. Исследование наиболее частой мутации гена NOTCHI - делеции c.7544_7545delCT (34 экзон, домен PEST), составляющей 80% всех мутаций в этом гене, было проведено с помощью аллель-специфичной ПЦР с последующим секвенированием по Сэнгеру для подтверждения наличия мутации. Данные результатов терапии были неизвестны до окончания исследования. Данные о прогностических маркерах (IgVH) и мутациях генов (BIRC3, ТР53) были доступны не для всех больных (точно число указано в описании исследования генов и соответствующих таблицах).

В большинстве случаев лечение проводилось амбулаторно. Качественные и количественные оценки течения заболевания, стадии, показаний к началу терапии, результатов лечения и качество ответа были проведены к.м.н. Никитиным Е.А. Исходное обследование, промежуточная и финальная оценка эффекта проводились в ГНЦ.

Частота выявления мутаций

Выявлено 73 мутации в исследуемых генах. Мутация хотя бы в одном из исследуемых генов выявлена в 45% случаев (68 из 155), двух генов одновременно в 3% случаев (у 5 из 155) (таблица 3). Мутации представлены миссенс мутациями 61% (43 из 73) и в 41% делениями (30 из 73), расположенными в экзонах или сайтах сплайсинга. Полиморфизмы г нов или синонимные мутации (за исключением полиморфизма 72 кодона гена ТР53) были исключены из анализа. Все обнаруженные мутации являются гетерозиготными. Миссенс-мутация в 30 случаев произошла за счет транзиции в 10 случаях за счет трансверзии. Делеции в основном представлены утратой 2-х оснований (ген NOTCH1), в одном случае - одного основания (ген BICR3), в одном случае выявлена протяженная делеция (ген ТР53). В таблице 4 представлены данные ассоциации мутаций генов с клинико-лабораторными

показателями.

«та ]

SFSB1 | m 1 ■ 1 и 1 11! '!

sotchi Р :

TPS3 Ч

Таблица 3. Распределение выявленных мутаций

Характеристика Всего, п=155 TPS3 mt, 11=16 TPS3 wt, n=139 Р NOTCHlmt, n=26 NOTCHlvit, 11=129 P

Медиана возраста (разброс) 59 (33-79) 60 (44-79) 59 (33-77) 62 (47-79) 59 (33-74)

Мужчины/ Женщины 105/50 10/6 91/44 0,77 16/10 77/40 0,03

Стадии Вше!: А 12 1 (6%) 10(8%) 0.78 2 (6%) 10(9%) 0,97

В 1 14 12(75%) 100 (72%) 0.93 18(71%) 96 (76%) 0,5

С 27 3 (19%) 23 (17%) 0.4 6 (23%) 21 (15%) 0,42

Норм кариотип 29 3 (19%) 29 (21%) 0,75 5 (26%) 24(21%) 0,94

del 13q 14 76 7(44%) 68 (49%) 0,37 9 (36%) 63 (54%) 0,18

tris 12 21 0 (0%) 21 (15%) 0,13 10(32%) 11 (9%) 0,001

dell lq23 30/13 1 (11%) 28 (20%) 0,34 4 (23%) 24 (17%) 0,87

dell7p 12 9 (56%) 2(1%) 0,001 1 (6%) 7 (7%) 0,73

IgVH mt/ IgVH unmt 82/43 11-3 (69-19%) 71-39 (51-24%) 0.01 21 -4 (81-15%) 61-39 (61-39%) 0,03

mt 1VS3 16 - - - 3 (12%) 13 (10%) 0,72

mt NOTCH I 26 3(19%) 23 (17%) 0,07 - - -

mt SF3BI 25 1 (6%) 24(17%) 0,23 1 (3%) 24 (19%) 0,04

mt HIRC3 4 из 81 0 (0 %) 4 (3 %) 0,46 0 (0%) 4 (3 %) 0,71

B2-M >4 мг/л 81 из 132 9 из 9 70 из 119 0,01 16 из 21 62 из 104 0,8

Таблица 4. Корреляция мутаций в генах ТР53, NOTCH 1, SF3B1 и BIRC3 с клинико-лабораторными показателями В-ХЛЛ.

Характеристика Всего, 11=155 SF3H1 mt, п=25 SF3B1 »(, п=130 Р HIRC3 mt, п=4 131RC3 wt, 11=77 Р

Медиана возраста (разброс) 59 (33-79) 58 (41-67) 59 (33-77) - 60 (49-62) 55 (40-72) -

Мужчины/ Женщины 105/50 18/7 84/40 0,3 4/0 58/21 0,77

Стадии Вте1: А 12 0 12(9%) 0,09 0 (0%) 7 (9%) 0,78

В 114 19(76%) 95 (73%) 0,8 3 (75%) 59 (77%) 0,93

С 27 6 (24%) 21 (16%) 0,16 1 (25%) 12(16%) 0,4

Норм, кариотип 29 10(40%) 26 (20%) 0,11 2 (50%) 15(20%) 0,75

ае113ч14 76 12 (48%) 63 (49%) 0,9 2 (50%) 39(51%) 0,37

№12 21 1 (4%) 20(15%) 0,13 0 (0%) 13 (17%) 0,08

ае111 я23 30/13 4(16%) 26 (20%) 0,64 0 (0%) 15 (20%) 0,34

ае117р 12 0 (0%) 12 (9%) 0,001 0 (0%) 6 (8 %) 0,001

^УН пи/ 1е\'Н ишти 82/43 14/5 (56-20%) 68/37 (52-28%) 0,62 3 - 1 (75-25%) 40-22 (56-29%) 0,2

гт Т1'53 16 0 (0%) 16(12%) 0,07 0 (0%) 9(12%) -

плЮП'Н! 26 1 (4%) 25(19%) 0,06 0 (0%) 10(13%) 0,07

ПЙ ХРЗВ! 25 - - 0 (0 %) 18(24%) 0,23

гт втсз 4 из 81 0 (0%) 4 (3%) 0,35 - - 0,46

В2-М >4 мг/л 81 из 132 11 ИЗ 21 69 из 106 0,3 2 из 3 39 из 66 1

Таблица 4 (продолжение).

Результаты секвеннрования гена ТР53

При секвенирование гена ТР53 (4-9 экзоны) выявлены мутации у 16 из 155 (10%) больных. В 15 случаях - это миссенс-мутации, расположенные в ДНК-связывающем домене, в 1 случае - протяженная делеция. В четвертом экзоне

была выявлена мутация у одного пациента (p.RllOL), у 1 пациента выявлена мутация в 6 экзоне (р.Е224А), в 7 экзоне выявлена мутация у 6 больных (р.Е244К, P-R248G, p.I255F, p.M237I, p.G245D, 1 протяженная делеция) и мутации у 8 больных выявлены в 8-9-ом экзонах (p.R282G №2, p.C283F, P.C283S, P.R283C p.V272M, p.R273H, p.C275F).

Выявлена статистически значимая связь наличия мутации в гене ТР53 с делецией хромосомы 17р (р=0,001) и IgVH без мутаций (р=0,01), повышенным уровнем бета2-микроглобулина (р=0,01) - таблица 4.

Полиморфизм 72 кодона гена ТР53 (замена пролина или аргинин) может оказывать влияние на течение заболевания за счет более сильной апоптогенной активности одного из вариантных состояний аллеля. Считается, что аргинин в 72 кодоне более эффективен в отношении активации апоптоза за счет механизма проникновения белка р53 в митохондрии и высвобождения цитохрома С. Вариант с пролином более эффективен в отношении запуска механизмов репарации и остановки клеточного цикла в фазе G2. Полученные нами данные характеризуют преобладание гомозиготного состояния аллеля: Arg/Arg - 57%, Arg/Pro - 35%, Pro/Pro - 8%, частоты распределения характерны для европейской популяции. Сравнение биологических и клинических показателей В-ХЛЛ при гомозиготном и гетерозиготном состоянии аллеля 72 кодона статистически значимых различий не выявило.

Результаты метода FASAY

Для исследования функциональной активности и определения частоты мутантного аллеля было проведено исследование гена ТР53 с помощью метода FASAY. Исследование проведено у 38 пациентов из 155, что связано с доступностью РНК, выделенной до начала терапии, только для этих пациентов. При исследовании мутаций ТР53 методом FASAY в качестве границы, дискриминирующей положительный или отрицательный результат использовали 15% красных колоний. Данное рубежное значение было получено экспериментально при исследовании 30 образцов РНК крови здоровых доноров, при этом количество красных колоний на превышало 10-13%.

,v».v» FASAY, % красных колоний ТР53, мутации FISH delI7p

1 94% 8 экзон p.R282G 92%

2 88% 7 экзон р.М2371 91%

3 78% 7 экзон p.I255F 81%

4 73% 8 экзон p.R282G 84%

5 73% 7 экзон p.G245D 93%

6 57% 8 экзон p.C283F Нет

7 48% 7 экзон р.Е224А Нет

8 36% 8 экзон p.R283C Нет

9 25% 8 экзон p.C275F 23%

10 23% 6 экзон р.Е224А Нет

11 23% 8 экзон p.V272M Нет данных

12 17% Нет Нет

13 16% Нет Нет

14-38 6%-13% Нет Нет

Таблица 5. Результаты метода FASAY. данные секвенирования и FISH

анализа.

В 25 случаях из 38 процент красных колоний не превышал рубежного значения, в среднем составлял 8% (6%-13%), для этих образцов не были выявлены мутации в гене ТР53 и/или делеции 17р хромосомы (таблица 5). В 13 случаях процент красных колоний превышал рубежное значение, однако наличие мутации при помощи секвенирования было подтверждено в 11 случаях из 13. Отсутствие мутации в 2-х случаях скорее всего связано с деградацией РНК в процессе хранения, либо функциональным дефектом, обусловленным мутациями за пределами секвенированного района гена. Так же необходимо отметить, что процент делеции 17р, если она выявлена при помощи FISH-исследования, близок в численном выражении проценту красных колоний, что свидетельствует об общности механизмов делеции и мутации 17 хромосомы и гена ТР53.

Результаты исследования гена NOTCH1

Наиболее часто встречающаяся мутация в гене NOTCH1 у больных В-ХЛЛ расположена в PEST-домене, представляет собой делецию 2-х нуклеотидов (c.7541_7542delCT), была выявлена с помощью аллель-специфичной ПЦР у 26 пациента из 155. Все образцы были так же проанализированы с помощью секвенирования по Сэнгеру, которое подтвердило наличие мутации.

18

В группе больных с мутацией в гене NOTCHI чаще выявляется трисомия 12 хромосомы (10/26 vs 11/117. р=0,006), немутированный вариант генов иммуноглобулинов (25/26 vs 53/117, р=0,025), отсутствие мутаций в гене SF3BI (1/26 vs 21/117, р=0,04), таблица 4.

Результаты секвеннрования гена SF3BI

Исследование гена SF3BI проведено у 155 больных при помощи секвенирования. Мутации были обнаружены у 25 (16%). Мутации SF3B1, выявленные в данном исследовании расположены в 14 - 16 экзонах, в области консервативного региона гена в пределах 4 — 9-ого мотивов повторов HEAT. Мутации во всех случаях были представлены миссенс-мутациями: в 14 экзоне выявлено 7 миссенс-мутаций из 25 (28%), в 15 экзоне 14 (56%), в 16 экзоне - 4 (16%). Наиболее часто выявляемая мутация р.Е700К в 15 экзоне (9 из 25) и p.G742D в 16 экзоне (4 из 25), таблица 4.

Мутация гена SF3B1 ассоциирована с отсутствием делеции 17 хромосомы (0/24 vs 10/122 р=0,001). Статистически значимой ассоциации с другими биологическими и прогностическими параметрами не выявлено.

Результаты секвенировання гена BIRC3

Мутация в гене B1RC3 выявлена у 4 из 81 пациента (5%).

Деления в гене BIRC3 выявлена у 1 больного в 7 экзоне, повторяющаяся миссенс-мутация Q529L обнаружена у Зх больных из 81 в 8 экзоне. Формально проведено статистическое исследование наличия связи мутации в гене BIRC3 с другими прогностическими маркерами при B-XJIJ1, однако, в виду малого количества выявленных мутаций оценки не являются статистически достоверными, таблица 4.

Анализ мутации в генах TP53, SF3B1, NOTCHI и BIRC3 при нормальном кариотипе

Мы провели оценку взаимосвязи наличия мутаций генов ТР53, SF3BI, NOTCHI и BIRC3 в отсутствие хромосомных аберраций. Из 29 больных с нормальным кариотипом по данным FISH мутации генов были обнаружены у

19. В одном случае мутации были обнаружены в 2х генах одновременно, во всех остальных случаях мутации были выявлены только в одном из исследуемых генов. Чаще всего мутации были идентифицированы в генах SF3BI (9 из 19) и NOTCH1 (6 из 19). В гене ТР53 всего у 3 из 19 пациентов, в гене B1RC3 - у 1 из 19. У 6 из 29 больных с нормальным кариотипом была выявлена первичная рефрактерность к проводимой терапии, рецидив заболевания у 15 из 29, хотя отсутствие хромосомных аберраций считается прогностически благоприятным признаком. Однако, молекулярный анализ генов позволяет в этих случаях выявить наличие иных генных аномалий, что может быть важно для прогноза течения заболевания и назначения терапии.

Ответ на терапию

Под полной ремиссией понимали исчезновение всех проявлений болезни. Под частичной - сокращение опухоли более, чем на 50%. Прогрессию констатировали, если имелась отрицательная динамика со стороны, по крайней мере, одного проявления опухоли (рост лимфоцитоза, рост лимфоузлов, рост селезенки).

Группы больных Больные с мутацией SF3B1 Больные с мутацией NOTCH! Больные с мутацией ТР53 Больные с мутацией BIRC3 Больные без мутации генов

Число больных N=25 N = 26 N=16 N = 4 N = 89

Частичная ремиссия/ рецидив 15/4 8/3 3/3 2/? 32/7

Полная ремиссия/ рецидив 7/1 9/4 3/1 1/? 42/3

Прогрессия 1 6 9 1 4

Таблица 6. Мутации генов и ответ на терапию (Данные ответа на терапию были доступны не для всех 155 пациентов)

В группе больных с мутацией гена SF3B1 (таблица 6) частота полных

ремиссий составила 7 случаев из 25, рецидив заболевания произошел у 1

больного из 7 с полной ремиссией. Частичная ремиссия была у 15 больных из

25, у четырех наблюдался последующий рецидив. Прогрессия заболевания без

ответа на терапию была у 1 больного. Среди 26 больных с мутацией гена

NOTCH1 полная ремиссия после полученной терапии была у 9 больных,

рецидив заболевания произошел у 4 из 9. Частичная ремиссия была у 8 больных

20

с последующим рецидивом у 3. Прогрессия - у 6 больных. У 3 из 16 больных с мутацией гена ТР53 ответ на терапию оценивался как полная ремиссия, с последующим рецидивом у 1 больного. Частичная ремиссия была так же у 3 из 16, у всех в дальнейшем произошел рецидив. У 9 больных ответа на терапию не было. В группе больных с мутацией гена В1ЯСЗ частичная ремиссия у 2 из 4, полная ремиссия у 1 больного, данные о дальнейшем состоянии больных нет. Прогрессия заболевания была у 1 больного из 4. В группе больных без мутаций в исследуемых генах полных ремиссий было 42 из 89 с последующим рецидивом у 3. Частичная ремиссия у 32 из 89, рецидив у 7 из 32. Профессия заболевания была 4 больных.

Временные показатели эффективности терапии

В качестве временных показателей эффективности терапии использовали беспрогрессивную и общую выживаемость.

Под временем до начала терапии понимали временной интервал от даты постановки диагноза до момента начала терапии. Под беспрогрессивной выживаемостью понимали интервал от первого дня терапии до одного из следующих событий:

- рецидив после полной или частичной ремиссии;

- появление признаков прогрессии на фоне терапии;

- назначение нового варианта терапии по поводу рецидива;

- смерть (от В-ХЛЛ, осложнений В-ХЛЛ или осложнений терапии).

Под общей выживаемостью после терапии понимали интервал от последнего дня получения медикаментозного лечения до смерти или последнего визита.

6, ЫмГГРбЗ

А. Беспрогрессивная выживаемость

Б. Общая выживаемость

График 1. Беспрогрессивная (А) и общая (Б) выживаемость больных, получавших FCR. в зависимости от хромосомных нарушений и мутаций в гене NOTCH 1 и ТР53. Больные с мутацией гена ТР53 и делецией 17 хромосомы на графике объединены в группу badTP53. Отдельные кривые для генов SF3B1 и B1RC3 не представлены, т.к. мутации этих генов достоверно не влияли на выживаемость больных.

Наиболее благоприятный прогноз (график 1) у больных с del 13q и трисомией 12. Группа больных без хромосомных аберраций, с делецией llq (при любых прочих данных) и с мутациями NOTCHI (при любых прочих данных) характеризуются промежуточным прогнозом. Наконец, группу наихудшего прогноза составляют пациенты с делецией 17р и мутациями TP53 (badTP53). Анализ общей выживаемости показывает, что группа больных с мутациями NOTCH! явно выдается из общей массы больных. NOTCH! характеризует пациентов с первичной рефрактерностью к FCR, в соответствии с современным определением рефрактерное™.

Анализ не выявил различий в общей и беспрогрессивной выживаемости для больных с мутациями в гене SF3B1 (график 2).

В виду малого количества случаев выявления мутаций гена B/RC3 оценки связи с выживаемостью не являются статистически достоверными (данные не приведены).

р-0.5

W1SF3B1 ml SF3B1

Время, месяиы

Время, месяцы

mtSF3B1 wtSF3B1

р-0.16

А. Беспрогрессивная выживаемость

Б. Общая выживаемость

График 2. Беспрогрессивная (А) и общая (Б) выживаемость больных, получавших FCR. в зависимости от хромосомных нарушений и мутаций в ген eSF3BJ.

С учетом данных по выживаемости, полученных при анализе исследуемых генов мы провели многовариантный анализ. В тестируемой модели рассматривались только генетические маркеры, ассоциированные с прогнозом. В модели, сравнивающей различные маркеры, имеющие прогностическое значение рассматривались отсутствие делении 13q, отсутствие трисомии 12 хромосомы, наличие делеции 1 lq, наличие делеции 17р и/или мутаций ТР53, наличие мутаций NOTCH!, а также мутационный статус генов IgVH. При анализе беспрогрессивной выживаемости с отрицательным прогнозом ассоциировались делеция 17р, отсутствие делеции 13q, мутации NOTCH 1 и вариант XJU1 без мутаций IgVH. При анализе обшей выживаемости прогностическое значение сохраняли только делеция 17р/мутации ТР53 и мутации NOTCH 1. Таким образом, мутации NOTCH1 выступают вторым фактором после повреждения ТР53, определяющем прогноз (таблицы 7 и 8).

Параметр Отношение рисков (95% ДИ) Р

Отсутствие Делеция Del(13q) 0,5 (0,37 - 0,67) 0,017

Отсутствие трисомии 12 хромосомы 0,5 (0,33 -0,74) 0,08

Делеция Del( 11 q) 1,1 (0,82- 1,48) 0,7

Делеции 17р/мутации ТР53 5,6 (4,1-7,6) 0,000001

Мутации NOTCH 1 0,53 (0,39 - 0,72) 0,038

Мутационный статус генов IgVH 0,35 (0,25 - 0,49) 0,001

Таблица 7. Модель многовариантного анализа, основанная на беспрогрессивной выживаемости

Параметр Отношение рисков (95% ДИ) Р

Отсутствие Делеция Del(13q) 0,52 (0,29 - 0,95) 0,28

Отсутствие трисомии 12 хромосомы 0,91 (0,44- 1,89) 0,9

Делеция Del(l lq) 1,33 (0,71 -2,46) 0,64

Делеции 17р/мутации ТР53 13,09 (8,13-21,1) 0,000001

Мутации NOTCH1 0,4 (0,25 - 0,64) 0,05

Мутационный статус генов IgVH 0,31 (0,14-0,64) 0,11

Таблица 8. Модель многовариантного анализа, основанная на общей выживаемости

Заключение

Впервые в России проведено исследование мутаций в генах ТР53, SF3B1, NOTCH1 и BIRC3 в рамках рандомизированного протокола применения режима FCR у 155 больных хроническим В-клеточным лимфолейкозом. Образцы ДНК больных были получены до начала терапии, исследование проводилось вслепую. Медиана возраста больных составила 59 лет (66% мужчин и 34% женщин). Различий по распределению прогностических маркеров среди мужчин и женщин не выявлено. Медиана наблюдения за больными составила не менее 34 месяцев. Мутации хотя бы в одном из исследуемых генов были обнаружены у 48% больных (у 68 из 155), большая часть из них представлена миссенс-мутациями, расположенными в функционально значимых регионах генов. Мутации в гене ТР53 были выявлены у 16 больных (10%), мутации в гене NOTCHI были найдены у 17% (у 26 пациента из 155). Мутации в гене SF3B1 были выявлены у 16% больных (у 25 из 155), мутации гена BIRC3 только у 5% больных (4 из 81).

Однозначной связи между феноменом или патогенезом В-ХЛЛ, с учетом обнаруженных мутаций в генах ТР53, SF3B1, NOTCHI и BIRC3 не установлено. Не выявлена ассоциация мутации в генах с тем, что женщины болеют реже, чем мужчины и возрастом возникновения заболевания. У 35% (у 6 из 29) больных не выявлены мутации при отсутствии хромосомных аберраций, что свидетельствует о наличие повреждения других механизмов/генов, приводящих к развитию В-ХЛЛ.

Достоверная корреляция между мутациями в гене ТР53 и рефрактерностью к флударабнну. а так же наличие делении в гене NOTCHI и худшей общей выживаемостью позволяют нам выделить группу пациентов с неблагоприятным прогнозом. Возможно, при накоплении большего числа данных мы сможем более точно оценить влияние мутаций в генах SF3BI и BIRC3 на прогноз и течение заболевания у больных В-ХЛЛ.

Выводы

1. Мутация по крайней мере в одном из исследуемом гене ТР53, NOTCHI, SF3BI и BIRC3 была обнаружена в 45% случаев (у 68 из 155), в том числе в 66% (у 19 из 29) больных с нормальным кариотипом по данным FISH.

2. Мутации гена ТР53 выявляются у 10% (16 из 155) больных и коррелируют с рефрактерностью к флударабин-содержащим режимам, более короткой беспрогрессивной и общей выживаемостью. Сиквенсный анализ мутаций гена ТР53 рекомендовано проводить всем пациентам с диагнозом В-ХЛЛ до начала терапии.

3. Мутации гена NOTCH1 выступают вторым фактором после мутаций ТР35 и делеций 17 хромосомы, определяющем прогноз. Выявляются у 17% (26 из 155) больных B-XJ1J1, ассоциируются с худшей общей и беспрогрессивной выживаемостью и с другими маркерами неблагоприятного прогноза. Скрининг мутации c.7544_7545delCT гена NOTCH1 рекомендовано проводить всем пациентам с диагнозом В-ХЛЛ до начала терапии.

4. Мутации в гене SF3B1 были выявлены у 16% больных (25 из 155). Мутации гена BIRC3 выявлены только у 5% (4 из 81) больных. Статистически значимой ассоциации с прогнозом течения заболевания установить не удалось. ■

Печатные работы:

1. «Нарушение гена ТР53 у больных хроническим лимфолейкозом». Е.А. Никитин, H.A. Северина, Т.Н. Обухова, Б.В. Бидерман, Д.Г. Кисиличина, Е.В. Наумова, С.А. Луговская, Е.Ю. Варламова, И.Б. Капланская, Ю.В. Сидорова, М.Е. Почтарь, Е.В. Домрачева, В.Л. Иванова, Л.Г. Ковалева, В.В. Птушкин, А.Б. Судариков. Журнал "Клиническая онкогематология", том 5, №.4, стр. 316-322, 2012 г.

2. «Мутации генов при ХЛЛ: новые аспекты патогенеза, открытые с помощью технологий полногеномного секвенирования» авторы Северина H.A., Бидерман Б.В., Никитин Е.А., Судариков А.Б. Журнал «Гематология и трансфузиология», том 59, №3, стр. 40-48,2014 г.

Тезисы:

1. «Мутации ТР53 без делеции 17р могут быть связаны с рефрактерностью к терапии». Журнал «Гематология и трансфузиология», материалы «Конгресса гематологов России», приложение, том 57, №3, стр. 76-77, 2012 г.

2. «Low Frequency Of IGHV4-39/IGHD6-13/IGHJ5 Rearrangement With Stereotyped HCDR3 (subset #8) In Russian and Ukrainian Chronic Lymphocytic Leukemia Patients». Bella Biderman, Nadiia Bilous, Nataliya Severina, Andrey Sudarikov, Eugene Nikitin, Iryna Kryachok, Iryna Abramenko and Anatoliy Chumak. Bloodjournal.hematologylibrary.org Blood October 21, 2013 vol. 122 no. 21 5276 (ASH2013)

3. «Анализ мутаций генов TP53, NOTCHi, SF3B1 и BIRC3 у больных хроническим лимфолейкозом», Северина H.A., Никитин Е.А., Обухова Т.Н., Бидерман Б.В., Меликян А.Л., Судариков A.A. Гематология и трансфузиология, материалы «11 Конгресса гематологов России», приложение 1, том 59, стр. 117, 2014 г.

4. «Значение повреждения гена ТР53 у больных хроническим лимфолейкозом». Северина H.A., Никитин Е.А., Обухова Т.Н., Кисиличина Д.Г., Наумова Е.В., Варламова Е.Ю., Капланская И.Б., Сидорова Ю.В., Почтарь М.Е., Домрачева Е.В., Иванова JI.B., Ковалева Л.Г., Птушкин В.В., Судариков A.A. Вестник гематологии, том 9, №2, стр. 47-48, 2013 г.

Благодарности

Выражаю искреннюю благодарность моим научным руководителям д.б.н. Сударикову А.Б. и к.м.н. Никитину Е.А за помощь, поддержку и кропотливую работу по анализу лабораторных и клинических данных, а так же всем сотрудникам ФГБУ ГНЦ МЗ РФ и ГКБ им. С.П. Боткина, принимавшим участие в проведении исследований.

Подписано в печать: 21.08.2014 Тираж: 100 экз. Заказ № 1273 Отпечатано в типографии «Реглет» . Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru