Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Анализ молекулярно-генетических нарушений хромосомы 6, ассоциированных с прогрессией рака шейки матки

о

На правах рукописи

0034028Б5

Беляков Илья Сергеевич

Анализ молекулярно-генетических нарушений хромосомы б, ассоциированных с прогрессией рака шейки матки

(Онкология -14.00.14)

1 9 I г л п 1 - ...,.': - _ ^

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 2009

003482865

Работа выполнена в лаборатории онкогеномики (руководитель - до. биологических наук, профессор H.H. Мазуренко) НИИ канцероге! Учреждение Российской академии медицинских наук Российс! онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН (директор - акаде РАН и РАМН М.И.Давыдов).

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор H.H. Мазуренко

доктор медицинских наук М.Г. Якубовская доктор биологических наук, профессор А.Ф. Карпухин

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Защита состоится «/$» t^ffi 2Ф%. в ^^часов на заседании

Диссертационного совета Д.001.017.01 при РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Автореферат разослан « »_2009_г.

Ученый секретарь Диссертационного совета РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, доктор медицинских наук, профессор / 'Ю.В.Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. Актуальность проблемы.

Рак шейки матки (РШМ) - одна из наиболее распространенных опухолей женщин.

Основным этиологическим фактором РШМ являются вирусы папиллом человека (HPV) «высокого» риска, в основном, HPV 16 и 18 типов [zur Hausen et al., 1976, 2002]. HPV «высокого» риска групп 16 и 18 типов выявляются в 95% РШМ [Bosch et al., 1995, Smith et al., 2007]. Онкобелки E6 и Е7 HPV 16 и 18 типа инактивируют белки р53 и pRb, блокируют апоптоз, вызывают нарушение контроля клеточного цикла и иммортализацию, индуцируют нестабильность генома. Процесс опухолевой - трансформации проходит ряд морфологически различимых стадий предрака (цервикальные интраэпителиальные неоплазии или CIN) и рака шейки матки (РШМ). Большинство CIN спонтанно регрессируют в течении 6 месяцев. При этом рак шейки матки развивается в течение 10-15 лет менее чем у 1% женщин, инфицированных HPV «высокого» риска [Khan et al., 2005]. Активности только вирусных онкогенов недостаточно для развития рака, необходимо накопление ряда генетических нарушений, и, вероятно, наличие генетической предрасположенности. Важной задачей молекулярной онкологии является мониторинг и выявление генетических нарушений, необходимых для прогрессии CIN в рак. Метод анализа потери гетерозиготности (LOH, loss of heterozygosity) позволяет выявлять хромосомные локусы с высокой частотой аллельных делеций, содержащих потенциальные гены-мишени этих нарушений. Настоящая работа является продолжением исследования нарушений на хромосоме 6 при РШМ [Kisseljov et al., 1996, 2002; Mazurenko et al., 1999]. В результате изучения 30 локусов на хромосоме 6 в образцах РШМ были выявлены районы с высокой частотой аллельных делеций. Среди них локус 6р21.3, содержащий гены главного комплекса гистосовместимости (human lymphocyte antigens, HLA) I-III класса, а также два новых района аллельных делеций на длинном плече (6ql4 и 6q 16-21) [Мазуренко и др., 2003, 2006]. Несмотря на интерес к изучению короткого плеча хромосомы 6, содержащего гены HLA, вовлеченные в противовирусный и противоопухолевый иммунный ответ, конкретные гены-мишени аллельных делеций при раке шейки матки неизвестны. Также практически отсутствуют данные о генетических нарушениях на длинном плече хромосомы 6 в CIN и РШМ. В связи с этим представлялось важным исследовать нарушения хромосомы 6 в CIN и РШМ для определения потенциальных генов-мишеней, локализованных в районах частых аллельных делеций. Дальнейшие планы состояли в выяснении экзон-интронной структуры этих генов, их экспрессии на уровне мРНК, а также в исследовании влияния аллельных делеций на экспрессию и сплайсинг мРНК в образцах РШМ.

Прогрессия CIN в РШМ сопровождается интеграцией HPV «высокого» риска в геном клетки, активацией экспрессии онкобелков Е6 и Е7, а также формированием клона

трансформированных клеток на стадии CIN II-III. Кроме того, внутриопухолевая генетическая гетерогенность РШМ является основой для селекции и адаптации опухолевых клеток в ходе прогрессии: инвазии, метастазировании и возникновении устойчивости к проводимой лучевой и химиотерапии. Представлялось актуальным исследовать генетическую гетерогенность CIN и РШМ с помощью молекулярно-генетических методов анализа LOH и инактивации X-хромосомы, используя ДНК, полученную при микродиссекции криостатных срезов.

2. Цели и задачи работы.

Целью работы является исследование молекулярно-генетических нарушений хромосомы

6 для определения генов, локализованных в районах частых аллельных делеций, ассоциированных с прогрессией CIN и рака шейки матки.

В соответствии с целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Исследовать потерю гетерозиготности в локусах хромосомы 6 в препаратах ДНК из криостатных срезов CIN и РШМ.

2. Исследовать генетическую гетерогенность и клональность CIN и РШМ путем анализа препаратов ДНК из различных участков CIN и РШМ, полученных с помощью микродиссекции криостатных срезов.

3. С помощью компьютерного анализа in silico определить гены на хромосоме 6, содержащие микросателлитные маркеры с высокой частотой аллельных делеций.

4. Исследовать структуру и экспрессию двух новых генов-мишеней из районов с высокой частотой аллельных делеций на коротком и длинном плечах хромосомы 6.

3. Научная новизна.

Установлено, что потенциальной мишенью аллельных делеций микросателлитного маркера D6S273, является новый ген LY6G6D, расположенный в районе генов HLA III класса (6р21.3). Делеции маркера D6S273 выявлены на ранних стадиях канцерогенеза шейки матки в CIN. Впервые предложена экзон-интронная структура гена LY6G6D, которая объединяет два гена G6D и G6F в один, при этом микросателлит D6S273 картирован в 8 интроне гена LY6G6D. Показано, что три основных мРНК G6D, G6F и MEGT1, кодируемых геном LY6G6D, имеют общую рамку считывания. Установлено, что MEGT1 и G6F имеют гомологию с суперсемейством иммуноглобулинов. При раке шейки матки выявлены аберрантные формы сплайсинга мРНК G6D. При изучении экспрессии гена LY6G6D в культурах опухолевых клеток, выявлена новая форма сплайсинга мРНК G6D в клеточной линии миелобластного лейкоза KG1.

Обнаружен район частых аллельных делеций размером ~500 т.п.н. между микросателлитами D6S268 и D6S278 в локусе 6q 16-21, повреждения которого характерны для РШМ, но редко встречаются в CIN. Впервые установлена экзон-интронная структура гена LOC571Q7, во втором интроне которого картирован микросателлитный маркер D6S268.

Впервые изучена экспрессия гена ШС57107 на уровне мРНК в РШМ и клеточных линиях РШМ и культурах клеток ряда опухолей.

При изучении генетических нарушений в образцах РШМ, подвергнутых множественной микродиссекции, обнаружен случай РШМ с двумя независимыми клонами опухолевых клеток, что подтверждает возможность образования нескольких синхронных клонов РШМ и стимулирует дальнейшее изучение внутриопухолевой гетерогенности РШМ.

4. Научно-практическая значимость работы.

Работа имеет теоретическое значение и посвящена выявлению генов, повреждения которых могут быть важны для прогрессии рака шейки матки. Описаны новые гены, их экзон-интронная структура и экспрессия в РШМ и опухолевых клеточных линиях.

Анализ потери гетерозиготности выполнен на ДНК, полученной с применением метода микродиссекции криостатных срезов, что позволяет исключить выявление генетических нарушений, вызванных фиксацией опухоли в парафине.

С помощью метода множественной микродиссекции криостатных срезов РШМ исследована внутриопухолевая генетическая гетерогенность ряда случаев рака шейки матки и синхронных CIN и выявлен случай РШМ с двумя независимыми клонами рака. Исследование выполнено для каждого случая с помощью трех независимых методов: анализа потери гетерозиготности, Х-хромосомной инактивации и формы персистенции HPV. Подтверждено, что делеции микросателлитного маркера D6S273 наследуются клоном опухолевых клеток.

5. Апробация работы.

Диссертационная работа апробирована 4 июня 2009 года на совместной научной конференции лабораторий иммунологии онкогенных вирусов, молекулярной биологии вирусов, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, вирусного канцерогенеза, механизмов гибели опухолевых клеток, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей и скрининга канцерогенов НИИ Канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН. Материалы диссертации доложены на 12 Европейской онкологической конференции в 2003г. в Копенгагене (ЕССО 12) и 19-ой конференции Европейской ассоциации исследования рака в 2006г в Будапеште (EACR 19). По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ.

6. Структура и объем работы.

Диссертация состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы и приложение. Материалы диссертации изложены на 144 страницах машинописного текста, включая 29 таблиц, 43 рисунка и список литературы (234 ссылки на работы отечественных и зарубежных авторов).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Обзор литературы.

Обзор литературы посвящен молекулярно-генетическим нарушениям при раке шейки матки. Подробно описана структура HPV и функции вирусных онкогенов, обеспечивающих трансформацию эпителия шейки матки и возникновение генетической нестабильности. Анализируются генетические нарушения на различных хромосомах человека, выявленные как на стадии CIN, так и в РШМ. Особое внимание обращено на генетические изменения в локусе HLA (6р21.3), вызывающие нарушения противовирусного иммунного ответа. Освещаются вопросы генетической гетерогенности и клональности CIN и рака шейки матки.

2. Материалы и методы.

Исследование генетической нестабильности проведено на препаратах ДНК от 44 больных CIN и плоскоклеточным РШМ, проходивших лечение в 1998-2004гг. в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Для выделения ДНК были собраны гистологически однородные участки опухолевых клеток, CIN, нормального эпителия или стромы путем мануальной (патолог др.Х.Ни., г.Уппсала, Швеция), либо лазерной микродиссекции криостных срезов диагностических и операционных биопсий (C.B. Винокурова, г.Гейдельберг, Германия). Препараты РНК и ДНК из культур клеток рака шейки матки SiHa, HeLa выделены с помощью набора TRI Reagent («Sigma»), РНК из культур клеток HepG2, NB4, KG1, К562 и Н9 любезно предоставлены к.м.н. Е.Ю.Рыбалкиной, а образцы РНК из нормальной ткани и РШМ получены из лаборатории молекулярной биологии вирусов (руководитель проф. Ф.Л. Киселев).

В работе использованы: полимеразная цепная реакция (ПЦР), анализ потери гетерозиготности (LOH), электрофорез в денатурирующем 6% полиакриламидном геле, блот-гибридизация с радиоактивно-меченным олигонуклеотидным зондом по Саузерну, серебрение продуктов ПЦР в ПААГ, анализ инактивации Х-хромосомы, обратная транскрипция, быстрое определение концов кДНК (RACE, rapid amplification of cDNA ends), компьютерный анализ экзон-шпронной структуры генов in silico. Статистическая обработка данных проводилась при помощи точного критерия Фишера.

3. Результаты и обсуждение.

Характеристика клинических материалов.

Важной особенностью материала является выделение с одного среза нескольких гистологически верифицированных участков нормальной и опухолевой ткани. С помощью микродиссекции криостатных срезов 36 образцов РШМ было собрано 53 участка опухолевых клеток и 36 участков нормальной ткани (эпителия или стромы). Кроме того, в 9 случаях РШМ

было выявлено 14 участков синхронных CIN I-III. Всего в настоящем исследовании использовано 111 препаратов ДНК, полученных из фокусов рака и CIN от 36 больных РИМ и 8 больных CIN. В работе использованы образцы ДНК CIN и РШМ, содержавшие HPV 16 типа.

Изучение генетических нарушений на хромосоме 6 в CIN и раке шейки матки

Данная работа направлена на выявление генов на хромосоме 6 в локусах с высокой частотой аллельных делеций, которые ассоциированы с прогрессией CIN и/или РШМ. Всего было исследовано 13 локусов: прителомерные локусы 6р25 и 6q27, район главного комплекса гистосовместимости HLA (6р21.3), а также локусы на длинном плече хромосомы б, нарушения в которых ранее изучены не были. Потерю гетерозиготности регистрировали как полное отсутствие или уменьшение интенсивности (более 50%) одного из аллелей в ДНК из опухоли по сравнению с ДНК из нормальной ткани (рис.1).

М4 М8_ МЗ N11 МС21 NT NT NTNCINT NC1N

Hm Ht LOH Ht/LOH LOH

Рис. 1. Потеря гетерозиготности маркера D6S278 в препаратах ДНК из CIN и РШМ, полученных в результате микродиссекции криостатных срезов (гибридизация с (СА)12-зондом по Саузерну). Обозначения: N - строма, Т - рак, Hm - гомозигота, Ht -гетерозигота, LOH -потеря гетерозиготности, стрелка указывает утрату аллеля.

Анализ потери гетерозиготности показал достаточно высокую частоту LOH в ДНК CIN I-III на коротком плече хромосомы 6 районе генов HLA (6р21.3, маркеры D6S276, D6S273) и в прителомерных локусах 6р25 (D6S344) и D6S281 (6q27) (рис.2). На длинном плече хромосомы 6 в большинстве исследуемых локусов (D6S275, D6S268, D6S278, D6S3I1) наблюдалась достоверно более высокая частота LOH в образцах ДНК из рака шейки матки по сравнению с ДНК из CIN.

6р

6q

| 25 I 24

I 23 22

21. 3 21. 2 21. 1

12 11. 2 11. 1 11 12

13

:

15

16

21 22

23

24

25

26 27

Mn.H.DöS

1,58 "344

24,24 . 31,74 ■ 36,26 ' 43,50 '

276 273 291 271

93,01 , 275

107,59 - 268 108,16 !278

141,32-310 148,31 i 311 152,64 ¡ 290 161,594305 169,094281

CIN I-III РШМ

p=0,016*

p=0,017* p=0,04*

p=0,04*

.LOH

25% 50%

Рис. 2. Частота аллельных делеций на хромосоме 6 в образцах ДНК CIN и РШМ. *- локусы со статистически достоверными различиями частоты LOH в CIN и РШМ.

Изучение генетической гетерогенности рака шейки матки

Множественная микродиссекция криостатных срезов позволила выделить ДНК из участков рака, CIN и нормальной ткани от одного и того же больного. Исследовали LOH в 13 микросателлитных локусах в ДНК из 29 участков клеток, полученных при множественной микродиссекции 10 образцов РШМ. Кроме того, анализ LOH и Х-хромосомной инактивации проведен с препаратами ДНК, полученными при лазерной микродиссекции 10 образцов РШМ, содержащих 26 участков РШМ и 6 участков CIN I-III.

Метод анализа инактивации Х-хромосомы позволяет исследовать гетерогенность в опухолях, происходящих из разных клеток. Он основан на том, что у женщин на стадии раннего эмбриогенеза в каждой клетке происходит инактивация одной из двух Х-хромосом метилированием, в результате во взрослом организме Х-хромосома инактивирована мозаично. Метод анализа инактивации Х-хромосомы заключается в определении статуса метилирования

первого экзона гена андрогенового рецептора человека (HUMARA) с помощью метилчувствительной рестриктазы Hhal [Allen et al., 1992]. Девять из 10 исследованных случаев РШМ оказались информативными - гетерозиготными по гену HUMARA.

Признаки генетической гетерогенности выявлены в случае РШМ N3: аллельные делеции маркеров D6S273 и D6S276 выявлены только в ДНК CIN III, но не в ДНК из участков рака шейки матки или метастаза в лимфоузел, что подтвердил анализ инактивации Х-хромосомы.

Особый интерес представляет случай РШМ №467, при лазерной микродиссекции которого обнаружены два независимых участка рака и выделены 5 препаратов ДНК: 467.1 (ЗТ, 4Т) и 467.2 (ЗТ, 4Т, 5Т). При анализе LOH генетические нарушения обнаружены только на 6р (маркеры D6S344, D6S276 и D6S273) и только в препаратах ДНК из участка 467.1, что указывает на генетическую гетерогенность участков рака 467.1 и 467.2 (табл. 1).

Таблица 1. Анализ генетической гетерогенности рака шейки матки №467.

Метод 467.1 467.2

ЗТ 4Т ЗТ 4Т 5Т

Анализ LOH на хромосоме 6 D6S344 6р25 • О О О О

D6S276 6р22.1 • • О О о

D6S273 6р21.3 • • о о о

D6S271 6р21.2-21.1 О О о о о

D6S275 6ql6 — — — — —

D6S268 6q 16.3-21 О о о о о

D6S278 6q 16.3-21 о о о о о

D6S305 6q25

АРОТ [Винокурова с.в.1 ОТ-ПЦР анализ статуса HPV16 в опухолевой ДНК Эпис. Эпис. Инт. Инт. Инт.

Инактивация Х-хромосомы Анализ статуса метилирования гена HUMARA XI XI Х2 Х2 Х2

Обозначения: О-гетерозигота,--гомозигота, потеря гетерозиготности,

XI, Х2 - аллели гена HUMARA.

Анализ X - хромосомной инактивации показал, что во всех ДНК из образца рака 467.1 инактивирован аллель XI гена HUMARA, а в ДНК из участков рака 467.2 - аллель Х2, что подтверждает данные о генетической гетерогенности, полученные при анализе LOH. Независимо к.м.н. Винокуровой C.B. при анализе методом АРОТ [Klaes et al., 1999] статуса персистенции HPV в клетках рака 467.1 была выявлена эписомальная форма HPV 16, а в клетках рака 467.2 - интегративная. Таким образом, тремя независимыми методами убедительно показано наличие двух независимых клонов рака шейки матки у больной № 467. Это событие достаточно редкое и выявлено лишь в одном из 9 случаев РШМ.

Гены-мишени аллельных делеций

С целью выявления генов-мишеней аллельных делеций в РШМ проведен анализ генного окружения микросателлитных маркеров на хромосоме 6 с помощью баз данных и поисковых служб Национального центра биотехнологической информации (ЫСВ1) США, доступных через интернет, и было показано, что большинство исследованных в работе микросателлитов на хромосоме 6, расположены в генах (табл.2).

Таблица 2. Микросателлитные маркеры хромосомы 6, картированные внутри генов.

Маркер Локализация Ген Официальное полное название гена в базе данных NCBI Функции

D6S344 6р25

D6S276 6р22.1 DCDC2 doublecortin domain containing 2 расхождение хромосом

D6S273 6р21.3 G6D lymphocyte antigen 6 complex, locus G6D суперсемейство Ьуб

D6S291 6р21.31 PNPLA1 patatin-like phospholipase domain containing 1 везикулярный транспорт

D6S271 6р21.1 XP05 exportin 5 компонент ядерных пор

D6S275 6ql4 -

D6S268 6ql 6.3-21 PDSS2 (LOC57107) prenyl (decaprenyl) diphosphate synthase, subunit 2 регуляторная субъединица трансизопренил-дифосфатсинтетазы

D6S278 6q 16.3-21 LOC642741 псевдоген

D6S310 6q23-24 -

D6S311 6q22-23 SASH1 SAM and SH3 domain containing 1

D6S290 6q25 -

D6S305 6q25.3 PARK2 Parkinson disease (autosomal recessive, juvenile) 2, parkin убиквитинлигаза ЕЗ

D6S281 6q27 WDR27 WD repeat domain 27 содержит домен \VD40

Обозначения: *- микросателлитный маркер картирован в межгенном участке.

Для исследования были выбраны два микросателлитных локуса: D6S273 в районе генов HLA III класса (6р21.3), который делетирован не только в РШМ, но и в CIN, и район между маркерами D6S268-D6S278 (6qI6-21), нарушения в котором характерны для РШМ. Используя генетические карты проекта NCBI, мы установили, что маркер D6S273 попадает в ген G6D, а маркер D6S268 - в ген LQC57107 [Belyakov et al., 2003].

Изучение гена LY6G6D

В районе микросателлита D6S273 картированы два гена G6E и G6D [Ribas et al., 1999], охарактеризованы три варианта сплайсинга гена G6D (мРНК из GenBank AJ315535, AJ315536, AJ315537) [Mallya et al., 2002], и описан ген G6F на основании мРНК AJ496460 из клеточной линии К562 хронического миелолейкоза [de Vet et al., 2003].

Мы провели независимое исследование и в базе данных экспрессируемых последовательностей NCBI обнаружили 21 мРНК генов G6F, G6D и G6E человека, свиньи и мыши. У человека экспрессия гена G6D имеет место, как на стадии эмбриогенеза, так и во взрослом организме в коже, селезенке, красном костном мозге (мегакариоцитах), простате. Кроме того, экспрессия гена G6D выявлена в раке толстой кишки.

Особое внимание привлекли две высоко гомологичные мРНК, каждая из которых содержала последовательности генов G6F и G6D. Это мРНК AF195764 размером 1266 пар нуклеотидов, выделенная из мегакариоцитов человека в 1999г. Mueller R и Ziegler BL, и мРНК CJ013883 из лимфоузла кишечника свиньи, секвенированная японскими исследователями [Ueníshí et al., 2004]. В связи с этим мы уточнили экзон-интронную структуру генов G6D, G6E и G6F, путем множественного выравнивания мРНК и последовательности геномного контига NT_007592.11 с помощью программы bl2seq по алгоритму gapped BLAST [Altschul et al., 1997] и установили, что мРНК AF195764 (транскрипт MEGT1) кодируется ранее неописанным геном. Мы предлагаем в качестве кандидата рассматривать ген LY6G6D, и описываем его экзон-интронную структуру с учетом данных GenBank (табл.3).

Таблица 3. Экзон-интронная структура гена LY6G6D [Беляков и др., 2009].

мРНК Форма Экзоны/интроны гена LY6G6D

сплайсинга 1 2 3 4 5 6 7 Инт.7 8 Инт.8# 9

Начало 2950? 3523 3936 6092 6418 6633 11424 11479 11570 13467 13645

Конец 3023 3852 4199 6247 6484 6661? 11478 11569 11692 13587 13982*

Длина 48? 330 264 156 67 29 55 91 123 121 338

MEGT1## + + + + + + +

G6F ## + + + + + +

А** + + +

G6D В + + + +

С + + +

Обозначения: * - граница экзона уточнена в данной работе, ? - 5'-граница экзона требует уточнения, # - границы области в интроне 8, входящей в форму сплайсинга Б транскрипта йбО; № - транскрипт МЕОТ1 представлен мРНК АР 195764, трансрипт й6Р - мРНК А.Н96460; * * - формы сплайсинга транскрипта 060: форма А представлена мРНК АДЗ15535, В - мРНК АШ5536, С - АШ5535.

Схематически экзон-интронная структура гена ЬУбОбО представлена на рис.3, продукты генов вбИ и вбИ обозначены транскриптами вбР и ОбБ. Ген ЬУбОбО состоит из 9 экзонов и кодирует три основных мРНК: МЕОТ1, 06Р и 060. Ген ввБ перекрывается с последовательностью гена ЬУбОбБ в области 1-6 экзонов, а ген вбБ перекрывается с последовательностью гена ЬУбОбЭ в области 7-9 экзонов. В соответствии с предлагаемой экзон-интронной структурой, микросателлит ОбЭ273 (г16657 в ОепВапк) располагается в 8 интроне гена ЬУбОбБ в позиции 12247-11927 п.н. (в обратной ориентации). В интроне б гена ЬУбвбО картирован ген ЬУбйбЕ в обратной ориентации, который включает четыре экзона и кодирует мРНК длиной около 890 п.н. По результатам данной работы удалось выявить неизвестный ранее экзон гена и описать новый вариант сплайсинга мРНК гена ЬУбОбЕ.

Транскрипт 66Р (мРНК ОепВапк А.1496460) общей длиной 898 п.н. при трансляции т зШсо кодирует белок размером 296ак. Транскрипт ОбЭ (мРНК А1315535) общей длиной 402 п.н. при трансляции т бШсо кодирует белок размером 132ак. При трансляции мРНК АР195764 (транскрипт МЕвТ) в рамке +1 получен белок размером в 381ак, который в области 20-120 ак имеет гомологию с суперсемейством иммуноглобулинов, также как и белок ОбР. Необходимо отметить, что нами при трансляции т бШсо мРНК йбР обнаружен стоп-кодон в экзоне 6.

Трвнифипт МЕйТ! Транскрипг ОбК

Ген ЬУбОбЕ

.га

1 2 3 2972 пл.

5 6 Экзоны гена ЬУбОбБ 7 8 10000 пл.

Рис. 3. Экзон-интронная структура и основные мРНК гена ЬУбОбО [Беляков и др., 2009]. Обозначения: А, В, С - формы сплайсинга транскрипта йбВ.

Анализ транслированных ¡п бШсо мРНК 0013883 (рамка +1) гена ЬУбОбО свиньи и мРНК МЕОТ1 (мРНК из ОепВапк АП95764 рамка +3) показал высокую гомологию белков: 73.1% сходных и 67.5% идентичных аминокислот. Транскрипт МЕОТ1 и транскрипт СбБ имеют общую рамку считывания в области экзонов 8 и 9 [Беляков и др., 2009]. При трансляции ш бШсо мРНК вбБ вьмвлена гомология с суперсемейством белков Ьу-6. К суперсемейству Ьу-6 относят ряд онкомаркеров: рецептор урокиназного активатора плазминогена иРАК (С087),

белок комплемента CD59, блокирующий сборку атакующего комплекса антител, а также [ антиген стволовых клеток простаты, PSCA.

Таким образом, наличие мРНК MEGT1 у человека и свиньи, а также общая рамка считывания транскриптов G6F, G6D и MEGT1 подтверждают возможность существования гена LY6G6D человека, предложенного нами [Беляков и др., 2009].

Уточнение экзон-интронной структуры гена LY6G6D

При исследовании экспрессии мРНК гена LY6G6D в образцах клеточных линий мы установили, что экспрессируется только транскрипт G6D, но не транскрипты MEGT1 или G6F (рис.4), тогда как ранее транскрипция G6D и G6F была обнаружена в клетках К562 [de Vet et al., 2003]. В то же время, оставались неясными некоторые характеристики мРНК гена LY6G6D: где локализуются первый экзон транскрипта G6D и сайт начала транскрипции; последний экзон ранскрипта и сайт полиаденилирования мРНК G6D.

SiHa HeLaHepG2 Н9 NW М

Scrap ее сия

экзонов 1 - 2 128пн

экзонов 8-9 309пн GAPDH 450пн

ИЦ'У*-11 _____;]

» _ 200пн

»>.- ^ - 300пе

500пн 400пн

Рис. 4. Анализ экспрессии мРНК гена ЬУбОбБ в опухолевых клеточных линиях.

Последовательность 5'-области транскрипта G6D определяли с помощью метода быстрой амплификации 5'-конца мРНК (5'-RACE), используя мРНК из клеток SiHa и набор для [ синтеза кДНК MINT (Евроген, Россия). Продукт второго раунда амплификации 5-RACE длиной 1000 п.н. (для формы сплайсинга В продукт Ex7_Forl - Ex9_Rev2 составляет 515п.н.), после очистки и проверки с помощью ПЦР и праймеров положительного контроля (Ex8_For -Ex9_Rev) подвергали секвенированию. Было установлено, что последовательность продукта ¡ ПЦР соответствует транскрипгу G6D в форме сплайсинга В, то есть с нарушением сплайсинга j интрона 7. Крайней точкой при прочтении транскрипта G6D является позиция 11505 гена 'LY6G6D (+82 от старта транскрипции мРНК G6D), которая соответствует 27-ой позиции интрона 7.

Для определения транскрибируемой области экзона 9 и сайта полиаденилирования

транскрипта G6D мы применили метод быстрой амплификации З'-конца мРНК (З'-RACE)

[Frohman et al, 1988]. РНК клеточной линии рака шейки матки SiHa обрабатывали ДНКазой и

13

затем получали кДНК с помощью обратной транскриптазы M-MuLV, лишенной активности РНКазы Н (RevertAid™, «Fermentas»), и праймера Frohman-polyT. Далее кДНК амплифицировали в два раунда.

AI800033 (247) С AUCUAADGTC A GAJ.GAC АААС All С CUUCUSUG A&UCAUUAAAAU'C'UAUGAA.CC AC U CUAA SiHa (351) CATCTAATEIG-AGAAGACAAACAICCTTCTSTG-ASTC.

Сигнал полиаденилирования

ПолиА-хвост

Рис. 5. Результат определения З'-пограничных последовательностей экзона 9 гена LY6G6D в мРНК из клеточной линии SiHa.

Продукты второго раунда после селекции праймерами внутреннего контроля очищали для дальнейшего секвенирования. Результаты секвенирования продукта размером около 450п.н. представлены на рис.5. В результате использования метода З'-RACE установлено, что полиаденилирование мРНК в клеточной линии РШМ SiHa начинается в позиции 13925 фрагмента контига NT_007592.11, аналогично мРНК из простаты AI800033. В результате проведенного анализа с помощью программы HCPolya на основании гомологии с базой данных сайтов полиаденилирования Института биомедицинских технологий (Institute for Biomedical Technologies ITB - CNR, Италия) определен сайт полиаденилирования """ТСАТТААААТ.

Варианты сплайсинга мРНК G6D

В литературе описаны три варианта сплайсинга мРНК G6D (рис.бА): форма А представлена мРНК AJ315535, форма В - мРНК AJ315536, форма С - мРНК AJ315537 [Mallya et al., 2002]. При трансляции вариантов сплайсинга мРНК G6D сохранение интактной рамки считывания происходит только при варианте сплайсинга А (рис.бВ).

в Экзон 7 8 D6S273 Интрон 8

Форма сплайсинга А ("интактная")_

|MkpqfvgillsslIgaalgnrmrcyncggspsssckeavttcgegrpqpgleqiklpgnppvtlihqhpacvaahbcnqvetesvgdvtyp| ahrdcylgdlcnsavashvapagilaaaataltcllpglwsg]

Формы сплайсинга В и D (аномально ранний стоп-кодон)

[Mkpqfvgillssllgaalg]keaas

Форма сплайсинга С_

¡Mkpqfvgillssllgaalgnrmrcyncggspsssckeavttcgegrpqpgleqiklpgn[rrcflrglkiplgslkshllcprrqvlkpgvq I hpsfilslspsdldsptsslrrspslqssgdrvggrrdlsspqgllpgrpvqqrrgkpcgpcrhfgcssyrpdlslartveriggvgvekg

I

Рис. 6. Варианты сплайсинга мРНК G6D гена LY6G6D и их белковые продукты. А. Варианты сплайсинга мРНК G6D и новая форма сплайсинга D. В. Результаты трансляции in silico различных форм сплайсинга мРНК G6D гена LY6G6D и новой формы сплайсинга D. Обозначения: в рамках аминокислоты, идентичные для всех вариантов сплайсинга.

В случае варианта сплайсинга В происходит нарушение сплайсинга интрона 7, при считывании последовательности которого активируется скрытый стоп-кодон и кодируется 1 белок, состоящий, только из сигнального пептида посттрансляционных модификаций (25 аминокислот). В случае формы сплайсинга С интрон 7 сплайсируется правильно, однако, нарушение сплайсинга интрона 8 приводит к сдвигу рамки считывания и потери важного DLCN-сайта заякоривания на мембране.

LOHD6S273 + + + - -

233 2ii 210 йНа Heia ¿45 ¿46 К Т 31 Т Т М 1 N Т М

Рис. 7. Анализ сплайсинга транскриптов G6D в образцах рака шейки матки, культур клеток SiHa, HeLa, Н9, KG1. Обозначения: +/- потеря аплеля/ сохранение гетерозиготности по маркеру D6S273, N - нормальная ткань, Т - рак шейки матки.

Экзон 9

H9KG1 М

-бООп.н ;-500п.н.

Для исследования вариантов сплайсинга мРНК гена ЬУбСбО в образцах РНК из нормальной и опухолевой ткани шейки матки и культур опухолевых клеток методом ОТ-ПЦР были использованы праймеры к 7-9 экзонам гена ЬУбОбО. Продукты ПЦР имели различный размер в зависимости от варианта сплайсинга. Для подтверждения полученных результатов продукты ПЦР секвенировали.

Таблица 4. Анализ экспрессии мРНК гена ЬУбОбО в образцах РШМ и некоторых опухолевых клеточных линиях.

Образец Статус LOH маркера D6S273 Форма сплайсинга

норма опухоль

210 • н.т. в

233 • А, В А

235 • А А

436 • н.т. А, В

445 О А А, В

446 О А, В А, В, С

447 н.т. н.т. А, В

448 • н.т. А

455 О А*, В* н.т.

SiHa о н.т. А, В*

HeLa о н.т. А, В*

Н9 н.т. н.т. В*

KG1 н.т. н.т. D*

Обозначения: •- LOH D6S273, О- сохранение гетерозиготности D6S273,

А, В, С, D - формы сплайсинга транскрипта G6D, *- данные подтверждены

секвенированием; н.т. - образец не тестировали.

При анализе экспрессии 7-9 экзонов LY6G6D были выявлены полосы размером 402п.н., соответствующие варианту сплайсинга А и ПЦР-продукт размером 493п.н., соответствующий варианту сплайсинга В (рис.7). В ряде случаев в нормальной ткани и в культурах опухолевых клеток обнаружены две формы сплайсинга А и В. В культуре клеток миелобластного лейкоза KG1 обнаружен ПЦР-продукт размером 650п.н., который, как показало секвенирование, объединяет последовательности мРНК форм сплайсинга В и С и является новым вариантом сплайсинга, обозначенный нами как форма D мРНК G6D (рис.бА). Такой же ПЦР продукт, соответствующий форме сплайсинга D мы обнаружили в мРНК из крови донора №20. Результаты трансляции in silico представлены на рис.бВ и, как видно, в данной форме нарушен сплайсинг интронов 7 и 8. Формы сплайсинга В и D кодируют идентичный пептид.

Представлялось важным изучить варианты сплайсинга в образцах РШМ с различным статусом LOH маркера D6S273, находящегося в 8 интроне гена LY6G6D. При анализе образцов

мРНК из РШМ форма сплайсинга А выявлена в 7 из 8 случаев, форма В - в 5 из 8, форма С - в 1 из 8 случаев (табл.4). Смешанная экспрессия форм сплайсинга А и В наблюдалась в 4 из 8 случаев РШМ и в 3 из 5 случаев нормальной ткани шейки матки. При сопоставлении данных анализа сплайсинга и статуса LOH маркера D6S273, форма В выявлена в обоих случаях РШМ с сохранением гетерозиготности маркера D6S273 и в 2 из 5 случаев РШМ с LOH маркера D6S273. Только одна форма сплайсинга выявлена в 4 из 5 случаев РШМ с потерей гетерозиготности D6S273. Полученные данные указывают на возможность существования мутаций, влияющих на сплайсинг мРНК G6D.

Поиск мутаций, влияющих на сплайсинг LY6G6D

Механизм сплайсинга состоит в вырезании интронов и точном соединении экзонов без нарушения рамки считывания. Надежность функционирования этого механизма обеспечивают консервативные последовательности (рис.8):

1) донорный сайт сплайсинга GU располагается на границе экзона и 5'-области интрона;

2) акцепторный сайт AG располагается на границе экзона и З'-области интрона;

3) сайт ветвления (braneh-сайт) с консенсусной последовательностью CURAY, взаимодействующий ковалентно через аденозин консенсуса с донорным сайтом сплайсинга в ходе последовательного вырезания интрона. Мутация в любом из этих сайтов может приводить к нарушению сплайсинга интрона. Так, нарушение любого из сайтов сплайсинга интрона 7 приведет к образованию формы сплайсинга В, а нарушение акцепторного сайта сплайсинга интрона 8 приведет к образованию формы сплайсинга С (см. рис.бА). Важно отметить, что для появления определенной формы сплайсинга достаточно одной мутации в донорном (GT) или акцепторном сайте (AG). Консервативность branch-еайта не ограничивается консервативным аденозином, так как мутации в сайте CURAY снижают силу связывания с субъединицей сплайсеосомы U2.

Экзон Донорный сайт Braneh-сайт Акцепторный сайт Экзон

SSRAGU..........CürSy......18 -п. н.....УУ YY Y YY Y Y YNC22 G

Рис. 8. Консервативные сайты сплайсинга мРНК млекопитающих.

Примечание: R - пурины А или G, Y- пиримидины С, U, Т (обозначения R и Y приводятся по классификации IUPAC).

Кроме того, представлялось интересным исследовать нарушения в структуре микросателлита D6S273. По данным литературы, СА-микросателлиты, располагающиеся в З'-области интрона, могут влиять на сплайсинг [Hui et al., 2003, 2005], поскольку последовательность микросателлита может бьгть сайтом связывания для основного фактора сплайсеосомы HnRNP L.

Для выявления мутаций в гене LY6G6D, нарушающих нормальный сплайсинг, на первом этапе мы исследовали интрон 7 в ДНК из образцов, в мРНК которых были выявлены варианты сплайсинга В и D: образец ДНК из крови донора №20 (форма D) и SiHa (форма В), HeLa (форма В). Для этого ДНК амплифицировали с праймерами к интрону 7 и с праймерами к микросателлиту D6S273, находящемуся в интроне 8, и очищенные ПЦР- продукты секвенировали. В результате мы не обнаружили мутации в интронах 7 и 8 гена LY6G6D в ДНК из клеточных линий РШМ HeLa, SiHa и образце крови №20, последовательность микросателлита D6S273 также не была нарушена. Кроме того, мы определили размер аллелей микросателлита D6S273 в исследованных образцах, все изученные образцы оказались гетерозиготны по микросателлиту D6S273 (табл.4).

Таким образом, впервые изучена экспрессия гена LY6G6D на уровне мРНК в образцах РШМ, культурах клеток РШМ и некоторых опухолевых линиях клеток. В нормальной и опухолевой ткани шейки матки выявлены три варианта сплайсинга мРНК G6D гена LY6G6D, описанные в литературе (А, В, С). В клеточной линии острого миелобластного лейкоза KG1 и образце крови донора обнаружена новая форма сплайсинга D мРНК G6D, имеющая ряд общих черт строения с формами сплайсинга В и С. Для трех вариантов сплайсинга (В, С и D) по данным трансляции in silico показано, что сплайсинг вызывает нарушение кодируемых белков, причем в случае форм сплайсинга В и D, кодируется белок, состоящий, только из сигнального пептида посттрансляционных модификаций (25 аминокислот). При выявлении только данной формы сплайсинга, например, как показано в случае РШМ №210, можно, по-видимому, говорить об отсутствии экспрессии гена на уровне белка. В редкой при РШМ форме сплайсинга С происходит нарушение сплайсинга интрона 8, в котором картирован микросателлит D6S273, при этом считывается около 100 нуклеотидов интрона 8, что приводит к нарушению рамки считывания гена. На уровне белка происходит потеря важного DLCN-сайта, отвечающего за прикрепление белка к мембране. Потеря гетерозиготности внутригенного микросателлитного маркера D6S273 не изменяет паттерн сплайсинга мРНК гена. По-видимому, сплайсинг мРНК G6D и аллельные делеции микросателлита D6S273 являются независимыми событиями. Проведенный анализ ДНК из клеточных линий РШМ SiHa и HeLa (форма сплайсинга В) и образец крови донора (форма D) не выявил мутаций сайтов сплайсинга интрона 7.

Ген LOC571Q7

Экзон-интронная структура гена LOC57107

В данной работе выявлен локус 6ql6-21 хромосомы 6, содержащий маркеры D6S268 и D6S278, которые показали низкую частоту LOH в CIN и высокую частоту аллельных делеций (>50%) в раке шейки матки. Поскольку микросателлитные маркеры D6S268 и D6S278

находятся на расстоянии ~ 500т.п.н., то можно предполагать, что эти маркеры формируют, так называемый, минимальный район частых аллельных делеций. Важно отметить, что в данный район попадают всего четыре гена: LOC57107, SOBP, SCML4, SEC63 и псевдоген LOC642741, что отличает район 6q 16-21 от ранее изученных минимальных районов на других хромосомах, в которых картированы десятки генов.

Мы установили, что микросателлитный маркер D6S268 картирован в гене LOC57107 [Belyakov et al., 2003], в то время как D6S278 картирован в псевдогене LOC642741. В базе данных GenBank мы обнаружили 201 мРНК гена LOC57107. Ген ШС57107 экспрессируется в эмбриональном периоде в мозге, сердце, печени и селезенке и убиквитарно во взрослом организме. Размер гена LOC57107 составляет 337947п.н. и он включен в проект NCB1 «гигантские гены» (huge genes).

Таблица 5. Экзон-интронная структура гена LOC571Q7.

Экзоны 1 2sh/2 2b** 3 4 5 6 7 8 9/9sh 10 11 12 13 14

5'- граница# 468341'/ 468484* 437454*/ 437457* 437168 328270* 312230 252125 242410 223517 190180 188378/ 188468 175796* 171752 167980 152945 132675

3'-граница 468303 437266/ 436888 436950 328241 312096 251927 242085 223446 190007 188337 175523 171720 167873 152853* 130496

размер 39/182* 189/570* 219« 30* 135 199 326 72 174 132/42 274* 33 108 93* 2180

Обозначения: *-границы экзонов требуют уточнения, **- экзон 2Ь также как и экзон 2бЬ входят в состав экзона 2, #- границы экзонов указаны во фрагменте 1151273 6-12222736п.н. контига N1 025741.14.

На основании анализа in silico 30 мРНК из генетической базы данных GenBank нами определена экзон-интронная структура гена LOC57107 (табл.5). Ген состоит из 14 экзонов. Протяженность кодирующей части гена ШС57107 составляет около 3500п.н. Для гена характерен альтернативный сплайсинг, при этом из мРНК удаляется до половины транскрибируемых экзонов. Наиболее важным является разделение всех мРНК на две группы в зависимости от наличия экзона 6. Зрелые мРНК, содержащие шестой или четырнадцатый экзон, полиаденилированы. По данным GenBank мРНК, содержащие шестой экзон, экспрессируются на стадии эмбриогенеза в сердце, печени, селезенке, а во взрослом организме в эндометрии, альвеолоцитах легких, а также в различных типах опухолей (хондросаркоме, аденокарциноме желудка и толстой кишки).

Нами проведено изучение in silico основных транскриптов гена LOC57107 и вариантов их сплайсинга и установлена экзон-интронная структура гена LOC57107 и обнаружено 11 форм альтернативного сплайсинга мРНК гена (рис.9). Маркер D6S268 находится во втором интроне гена LOC57107. Представляет интерес экзон 2, который обнаружен в мРНК в двух формах. В частности, в мРНК нормальной соединительной ткани (DC296191) и мРНК из некоторых

19

новообразований (АА312388, АА226989) он укорочен и обозначен 2sh. Вариант сплайсинга мРНК BI551760 включает экзоны 1, 4, 5, 7, 8, 11, 13 и экспрессируется в гиппокампе мозга. В состав мРНК из эмбриональной печени и селезенки (Н49821) входят экзоны 2, 4, 5, 7-9, 11, 12, 14. Вариант сплайсинга, включающий экзоны 2sh, 4, 5, 7, представлен тремя опухолевыми мРНК: эмбриональная опухоль семенников (BQ220380), опухоль мозга (ВМ017975 и АА226989). При анализе мРНК BG177085 из лимфомы человека мы обнаружили, что экзон 2 гена LÛC57107 имеет сложное строение и его структура требует уточнения.

Трансляция in silico некоторых мРНК LOC57107

Для трансляции in silico мы использовали геномные последовательности экзонов мРНК из контигов NT_025741.14 (GenBank), NW_001838990.2 и NW_923184.1 (база данных Celera). Положение старт-кодона в мРНК различного экзонного состава различается, выявлены старт-кодоны в экзонах 1 (например, мРНК BI551760) и 2. Установлено, что мРНК BI551760 гена LOC57107 кодирует белок размером 220ак, имеющий высокую гомологию с суперсемейством трансизопренилдифосфатсинтетаз (pBLAST, CDD) - ферментов полимеризации изопренилпирофосфата. Среди продуктов синтеза этих ферментов - стероиды, фарнезилпирофосфат и геранилгеранилпирофосфат, необходимые для модификации белков, боковая цепь убихинона (важного компонента дыхательной цепи митохондрий). Для суперсемейства пренилсинтетаз характерно наличие семи консервативных доменов, два из которых каталитические и включают три остатка аспарагина (DDxxD). У белка ШС57107 в консервативных каталитических доменах отсутствуют DDxxD-сайты, характерные для всех пренилсинтетаз. Мы определили, какие экзоны гена кодируют функциональные домены фермента: экзон 4 кодирует домен I, экзоны 5 и 9 кодируют каталитические домены синтетазы II и VI, лишенные DDxxD-консервативных сайтов. Домен III кодируется экзоном 5, домен IV -экзоном 7, домен V - экзоном 8, домен VII - экзоном 14. Высокая гомология белка LOC571Û7 с суперсемейством пренилсинтетаз и отсутствие каталитических свойств позволяет предполагать, что данный белок функционирует совместно с полноценной каталитической субъединицей. По данным литературы, белок LOC57107 функционирует в форме гетеротетрамера с белком DLS1 - полноценной пренилсинтетазой человека и отвечает за синтез боковых цепей убихинона [Saiki etal., 2005].

Таким образом, проведенный нами анализ вариантов сплайсинга 201 мРНК гена LOC57107, позволяет говорить о тканеспецифическом альтернативном сплайсинге.

В связи с тем, что маркер D6S273 картирован в интроне 2, мы уделили особое внимание экзонам 2 и 3 и вариантам сплайсинга, затрагивающим их. Установлено, что экзон 2 подвержен сложному сплайсингу, в том числе с неполным сплайсингом интрона 2.

Ген

ЬОС57Ю7

1 2 Ц68268

«■-к

5 б 7 8 9 11 13 14

350т.п.н.

I

2зЬ

II

гэь 2Ь

А

5 б ро1уА

УГ

10 11

'ис.9. Схема альтернативного сплайсинга некоторых мРНК гена ШС57107.

При анализе мРНК и структуры экзона 2 мы установили, что РНК ААЗ12388, БС296191, ^А226989 содержат экзоны 2бЬ, 4, 5, б, а мРНК ВЕ617435, ВМ017975, ВХ119736, ВМ796326 -жзон 2. Основная рамка считывания экзона 2зЬ содержит несколько стоп-кодонов, а экзоны 2

(не включая последовательность 2эЬ) и 4 содержат интактную основную рамку считывания со старт-кодоном в ней. Таким образом, экзон 2зЬ не транслируется и, вероятно, выполняет | регуляторные функции. Исходя из данных положений, нами проведена трансляции ¡п зШсо мРНК, содержащих экзоны 2вЬ и 2. Наиболее крупные белки кодируются мРНК В1551760 из гиппокампа мозга (220ак) и мРНК ВЕ617435 (292ак). Наиболее протяженный экзон 14 размером 2180п.н. транслируется не полностью, основная рамка содержит много стоп-кодонов, ) размер транслируемого пептида составляет 52ак.

Анализ экспрессии мРНК гена LOC57107 в образцах нормальной и опухолевой ткани шейки матки и некоторых опухолевых клеточных линиях

Цель исследования состояла в оценке влияния аллельных делеций в локусе D6S268 и других нарушений на экспрессию мРНК гена LOC57107 в образцах нормальной ткани и рака шейки матки и опухолевых клеточных линиях. Данные об экспрессии мРНК гена LOC57107 в эпителии шейки матки или РШМ в базе данных GenBank отсутствуют, также как и данные о 5'-структуре транскриптов, включающих экзон 3. Поэтому межэкзонные праймеры были подобраны к хорошо охарактеризованным экзонам 2, 2sh, 4, 5 по мРНК АА226989 (GenBank).

мРНК АА226989 For_Ex4 Rev_Ex5

For Ех2 Rev Ех4

Экзон А

318п.н. 177п.н. 241п.н.

Рис.10. Праймеры, использованные для исследования экспрессии мРНК гена ЬОС57Ю7. 1, 2,3 - продукты ПЦР; праймеры подобраны к мРНК АА226989 (ОепВапк).

Анализ экспрессии мРНК гена ШС57107 проводили методом полугнездового ОТ-ПЦР в два раунда, продукты второго раунда №2 и Х"3 имели размер 177п.н. и 241п.н. (рис.10, 11).

177пн

#210 #218 #235 Т N Т N Т М 7—w « »-¡i gg _ бООпн

■ Mi «Ш «-■ м " 300пН . " - ЮОпн

3:241пнч 2:177пн-

GAPDH

SiHa HepG2 NB4 HcLa К562 23232323 23М '¡т-»*** Ш' бООпн

ь'. .....

. .I»1» Ш*"' - 200пн

~ - ЮОпн

SiHaHqiGS I®4 HeU К562

. — 500пн 400пн

Рис. 11. Анализ экспрессии мРНК гена ШС57107 при раке шейки матки (А) и в некоторых опухолевых клеточных линиях (Б). Обозначения: *2 - продукт №2, *3 - продукт №3.

Экспрессия мРНК гена ШС57107 выявлена в случаях с аллельной делецией маркера D6S268 (№210 и №235 случаях РШМ) и LOH-отрицательных (№218) образцах рака шейки матки и в опухолевых клеточных линиях РШМ SiHa и HeLa, хронического миелолейкоза К562. В клеточной линии гепатокарциномы HepG2 выявлен продукт с праймерами продукта №3, но аномального размера. Не выявлена экспрессия мРНК гена LOC57107 в клеточной линии промиелоцитарного лейкоза NB4.

Размер

ПЦР-продукта 177п.н.

бООп.н.

Фрагмент "I ; =11 II I I

гена LOC57107 2sh 2b D6S268 Интрон2 ЭкзонЗ 4

■*— Экзон 2 —►

Рис. 12. Нарушение сплайсинга второго интрона гена LOC57107 при РШМ.

Минорный продукт размером около бООп.н. выявлен в треке продукта №2 во всех исследованных образцах РШМ и препаратах нормальной ткани шейки матки. Как показало секвенирование продукт бООп.н. из клеток SiHa содержит экзон 2. Аналогичный продукт эбнаружен нами в базе данных GenBank, при анализе мРНК, полученных как из нормальной гкани: семенников (BI465307), эмбрионального сердца (W57910 и W57911), эмбриональной печени и селезенки (ВХ119736); так и из опухолевых тканей: рака желудка (ВМ796326), толстой кишки (ВЕ617435), астроцитомы (ВМ017975) и семиномы (BQ220380).

В данной работе показано, что рамки считывания экзона 4 при трансляции in silico мРНК с коротким вариантом экзона 2sh (мРНК W57910) и мРНК с «длинным» вариантом экзона 2 (мРНК ВЕ617435) не отличаются. Таким образом, впервые описана экзон-интронная структура гена LOC57107 из района частых аллельных делеций 6ql6-21, повреждения которого характерны для РШМ, но редко встречаются в CIN. Установлено, что микросателлитный маркер D6S268 расположен во втором интроне гена LOC57107. Ген включает 14 экзонов и кодирует регуляторную субъединицу трансизопренилдифосфатсинтетаз. В данной работе, впервые изучена экспрессия гена ШС57107 на уровне мРНК в РШМ и клеточных линиях РШМ и культурах клеток ряда опухолей. В нормальной и опухолевой ткани шейки матки выявлено нарушение сплайсинга интрона 2 в мРНК гена LOC57107, в котором картирован микросателлитный маркер D6S268. При этом не выявлены нарушения рамки считывания или нонсенс-мутации при трансляции in silico мРНК с «нарушением» сплайсинга интрона 2 (длинный вариант экзона 2). Значение вставки размером 100 аминокислот для структуры и

23

функции белка LOC57107 не известно и предстоит изучить в дальнейшем. Возможное влияние

делеции внутригенного микросателлита D6S268 на характер сплайсинга интрона 2 предстоит

изучить в дальнейшем.

ВЫВОДЫ:

1. При анализе потери гетерозиготности на хромосоме 6 в ДНК из криостатных срезов CIN и рака шейки матки показана высокая частота аллельных делеций в CIN в районе генов HLA (6р21.3) и прителомерных локусах 6р25 и 6q27, тогда как на длинном плече хромосомы 6 выявлены локусы (D6S275, D6S268, D6S278, D6S311) с достоверно более высокой частотой LOH в РШМ по сравнению с CIN.

2. Установлено, что большинство локусов на хромосоме 6 с высокой частотой LOH находятся внутри генов. Для изучения генов, ассоциированных с прогрессией рака шейки матки, выбраны локусы D6S273 (6р21.3, аллельные делеции выявлены в CIN) и D6S268 (6р 16-21, аллельные делеции выявлены преимущественно в раке шейки матки).

3. Изучение генетической гетерогенности CIN и РШМ с помощью анализа LOH и X-хромосомной инактивации выявило поликлональность рака шейки матки в 1 из 9 случаев (11%) РШМ.

4. С помощью компьютерного анализа установлена экзон-интронная структура гена LY6G6D (6р21.3), содержащего микросателлит D6S273 в интроне 8: показано, что ген LY6G6D включает ранее описанные гены G6F и G6D и кодирует три независимых мРНК (MEGT1, G6F, G6D) с общей рамкой считывания. Белки MEGT1 и G6F имеют последовательности гомологичные суперсемейству иммуноглобулинов; а белок G6D - последовательности гомологичные лимфоцитарным антигенам Ly-6.

5. При изучении структуры мРНК гена LY6G6D в 6 из 8 случаев рака шейки матки выявлены аберрантные формы сплайсинга В и С. Обнаружена новая форма сплайсинга D мРНК G6D в культуре клеток миелобластного лейкоза KG1. Показано, что аберрантные формы сплайсинга В и D мРНК G6D не являются результатом мутации в интроне 7 гена LY6G6D.

6. С помощью компьютерного анализа установлена экзон-интронная структура гена LOC57107 (6ql6-21), который состоит из 14 экзонов и содержит маркер D6S268 в интроне, ген LOC57107 кодирует трансизопренилдифосфатсинтетазу.

7. Показано нарушение сплайсинга интронов в мРНК генов LY6G6D и LOC57107, содержащих микросателлитные маркеры D6S273 и D6S268, в образцах и клеточных линиях рака шейки матки.

писок работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Мазуренко Н.Н., Беляков И.С., Блиев А.Ю., Биджиева Б.А., Винокурова С.В. Идентификация локусов хромосомы 6, вовлеченных в прогрессию рака шейки матки. Сборник трудов «Технологии генодиагностики в практическое здравоохранение», Москва, 2002., 156-158.

2. Киселев Ф.Л., Мазуренко Н.Н., Киселева Н.П., Кобзева В.К., Семенова J1.A., Павлова Л.С., Беляков И.С., Блиев А.Ю., Ешелев Э.М., Иванова Т.А, Петренко А.А. Молекулярные маркеры рака шейки матки. Вестник РАМН, 2002, 1,8-14.

3. Мазуренко Н.Н, Беляков И.С, Блиев А.Ю., Семенова J1.A., Павлова JI.C. Фрагменты генома, участвующие в канцерогенезе шейки матки. Сборник трудов: Геном человека, Москва, 2001, 64.

4. Мазуренко Н.Н., Беляков И.С., Блиев А.Ю., Винокурова С.В., Биджиева Б.А. Молекулярные маркеры клональности и прогрессии рака шейки матки. Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, 2002, 6 (1), 118.

5. Mazurenko N., Belyakov I., Bliyev A., Vinokourova S., Guo Z., Ни X., Kisseljov F. Intratumoral heterogeneity and markers of cervical cancer progression mapped on chromosome 6. Revista de Oncologia, 2002,4, Supp 1.1, 113.

6. Мазуренко H.H., Беляков И.С., Блиев А.Ю., Гуо Ж., Ху К., Винокурова С.В., Павлова Л.С., Понтен Я., Киселев Ф.Л. Генетические изменения на хромосоме 6, ассоциированные с прогрессией рака шейки матки. Молекулярная биология, 2003, 38(3), 472-481.

7. Belyakov I., Mazurenko N. Cellular sequences on chromosome 6 possibly involved in cervical cancer progression. AACR special conference: Oncogenomics, Jan. 2003, Phoenix, Arizona, USA.

8. Belyakov I., Mazurenko N. Identification of two loci of frequent allelic deletions on chromosome 6 involved in cervical cancer progression. Proceedings book of ECCO conference, Copenhagen 2003, Eur. J. of Cancer, Suppl.Vl, N5, P.S181

9. Н.Н.Мазуренко, И.С.Беляков, Ю.А.Блиев. Генетическая гетерогенность и маркеры прогрессии рака шейки матки. Материалы Ш съезда онкологов и радиологов СНГ, 2004, Минск 25-28 мая; часть I. 312.

10. Beliakov I.S., Mazurenko N.N. Two genes on chromosome 6 affected with frequent allelic losses in cervical carcinomas. Proceedings of 18th Meeting of the European Association for Cancer Research. Insbruck, 2004, p.97.

11. Beliakov I., Mazurenko N. Novel aberrant splicing form of Ly6G6D gene involved in cervical cancer progression. Proceedings of 19th Meeting of the European Association for Cancer Research, Budapest, Hungary, 1-4 July, 2006, p.270.

12. Беляков И.С., Мазуренко Н.Н. Исследование структуры и экспрессии гена Ly6G6D у больных раком шейки матки. Вопросы онкологии, 2007,53(1), 6-7.

13.I.S.Beliakov, T.A.Karakasheva, N.N.Mazurenko. Abnormal splicing of mRNA of Ly6G6D gene may be involved in cervical cancer progression. ECCO 14, Barcelona, Spain 23-27 September, 2007. Eur. J. of Cancer, 2007, Suppl., V5, N4, P.317.

14. Беляков И.С., Каракашева T.A., Мазуренко Н.Н. Экзон-интронная структура гена LY6G6D. Молекулярная биология, 2009,43 (4), 590-598.

Подписано в печать 13.10.09 Формат 60x84/16. Бумага офсетная.

____-Заказ № 809 Тираж 100 экз._

Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24