Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПРИ ПРОГРЕССИРОВАНИИ ОПУХОЛЕВОЙ ПАТОЛОГИИ ШЕЙКИ МАТКИ, АССОЦИИРОВАННОЙ С ВИРУСОМ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА

Орнер Ирина Юрьевна

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПРИ ПРОГРЕССИРОВАНИИ ОПУХОЛЕВОЙ ПАТОЛОГИИ ШЕЙКИ МАТКИ, АССОЦИИРОВАННОЙ С ВИРУСОМ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология 14.01.12 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

" 9 ЛЕН 2010

Челябинск - 2010

004617109

Работа выполнена в НИИ иммунологии и на кафедре онкологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию"

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Аклеев Александр Васильевич

доктор медицинских наук,

профессор Гамза Валерий Николаевич

Ведущая организация: Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, г. Екатеринбург

Защита состоится"_" декабря 2010 года в_часов на заседании диссертационного совета Д 208. 117 03 при ГОУ ВПО "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию" по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию"

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Телешева Лариса Федоровна Жаров Александр Владимирович

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Н.В. Тишевская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В общей структуре заболеваемости органов репродуктивной системы у женщин России рак шейки матки (РШМ) занимает 3-е место после рака молочной железы и рака тела матки. Ежегодно в России регистрируется около 12000 вновь заболевших и умирает около 6000 женщин. Стандартизированный показатель заболеваемости на 2008 г. составил 11,2 на 100 000 населения (Чиссов В.И., 2009). Оценивая современное состояние и перспективы онкологической заболеваемости в России, многие онкологи отмечают существенный рост показателей запущенности РШМ (Максимов С.Я., Гусейнов К.А., 2004). Так по Челябинской области количество первично-выявленных больных с III-IV стадией РШМ составило в среднем 50,2% за период с 1998 по 2008 годы (Важенин А.В., 2010). Кроме того, в последнее десятилетие четко прослеживается увеличение заболеваемости у молодых женщин до 40 лет. Особенно заметно повышение заболеваемости РШМ у женщин до 29 лет - ежегодный прирост составляет 2,1 % (Давыдов И.И., Аксель Е. М., 2002; Чиссов В.И, 2008, 2009; Шакирова Э.Ж., 2007).

В настоящее время вирус папилломы человека (ВПЧ) считается инициирующим фактором в генезе РШМ. Папилломавирусная инфекция (ПВИ) чрезвычайно сложна для диагностики и терапии, так как требует длительного обследования и лечения половых партнеров. Особенно сложна для диагностики латентная форма ПВИ, при которой морфологических изменений в ткани не выявляют (Кузнецова Ю.Н., 2006; Минкина Г.Н. и др., 1982, 2001). Более чем у 15% женщин ВПЧ обнаруживается в эпителии шейки матки, хотя клиническая симптоматика заболевания отсутствует (Bosch F.X. et al., 1994).

Известно, что только у незначительной части женщин, инфицированных ВПЧ, развивается рак шейки матки, поэтому существуют факторы или кофакторы, способствующие злокачественному прогрессированию опухоли (Аполихина И. А., 2002). К кофакторам относят генетические факторы, способные модулировать эффект ВПЧ, иммуносупрессию, эндогенные гормональные факторы (Bosch F. et al., 1994, 1995, 1997; Syrjanen К., 2008). У женщин с нормальной работой механизмов контроля над пролиферацией происходят дегенерация и последующее отторжение поврежденных клеток. При нарушении механизмов контроля, тесно связанных с иммуносупрессией, инфекция прогрессирует, и развиваются субклиническая, а затем и клиническая стадии заболевания (Sillman F., Stanek A., Sedlis F., 1984). Поэтому одной из проблем практической гинекологии является тщательный отбор больных с повышенным риском возникновения цервикаль-ного рака. Морфологические изменения шейки матки, представляющие собой предраковые состояния, обозначаются как плоскоклеточные интраэпителиаль-ные поражения (ПИП), squamous intraepithelial lesions, цервикальная интраэпи-телиальная неоплазия (ЦИН) или дисплазия (Сычугов Г.В., 2006).

Сведения об изменениях показателей клеточного и гуморального звеньев иммунитета при ПВИ и отдельных стадиях канцерогенеза прослеживаются в работах многих авторов (Аполихина И. А., 2002; Кулаков В. И., 2004; При-лепская В.Н., 2007; Роговская С.И., 2008; Сухих Г.Т., 1997; Bais A.G., 2005;

Manickam A., 2007; Patel S., 2009). Несмотря на это, особенности иммунологического статуса при различных стадиях РШМ остаются неизученными. Поэтому процесс изучения закономерностей и механизмов взаимодействия иммунной системы в процессе канцерогенеза, ассоциированного с ВПЧ, поможет разработать в будущем принципы его регуляции и оптимизации диагностики РШМ.

Цель исследования

Установление особенностей показателей системного, местного иммунитета, сравнение уровней антигена плоскоклеточной карциномы (SCCA) в зависимости от стадии неопластического процесса шейки матки, ассоциированного с вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска, и обоснование возможности использования иммунологических показателей для диагностики тяжелой дисплазии и рака шейки матки.

Задачи исследования

1. Оценить состояние системного иммунитета и сравнить уровни антигена плоскоклеточной карциномы у женщин с ЦИН III и различными стадиями рака шейки матки, ассоциированными с вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска.

2. Изучить иммунологические показатели цервикального секрета у женщин с ЦИН III и различными стадиями рака шейки матки, ассоциированными с вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска.

3. Определить взаимосвязи между иммунологическими показателями системного, местного иммунитета и уровнями антигена плоскоклеточной карциномы у женщин с ЦИН III и различными стадиями рака шейки матки, ассоциированными с вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска.

4. Разработать иммунологические критерии для дифференциальной диагностики ЦИН III и рака шейки матки, ассоциированных с вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска.

Научная новизна

У больных тяжелой дисплазией и РШМ впервые выявлены особенности изменения иммунного статуса, связанные с прогрессией опухолевой патологии.

Независимо от стадии неопластического процесса шейки матки выявлены однонаправленные изменения факторов системного иммунитета: увеличение числа CD10+ клеток, снижение CD3+ , CD4+ и NK-клеток, повышение уровней ИНФ-а, ИНФ-у, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 и снижение уровня ФНО-а в сыворотке крови. Обнаружены выраженные изменения в системе локальной иммунной защиты: повышение общего количества лейкоцитов, угнетение внутриклеточного кислородозависимого метаболизма и резерва бактерицидной функции нейтрофилов, усиление лизосомальной активности, а также снижение активности и интенсивности фагоцитоза, повышение уровня slg А и выраженное снижение уровней ИНФ-а и ФНО-а при росте концентраций ИНФ-у, ИЛ-2, ИЛ-10 цервикальной слизи.

Установлено, что уровни SCCA до начала лечения зависят от стадии заболевания, при этом, уровень SCCA значительно возрастает у больных РШМ I стадии относительно показателя группы больных Cr. in situ. У обследуемых

женщин обнаружены взаимосвязи между уровнями SCCA и показателями системного и местного иммунитета, что подтверждает сопричастность данного гликопротеина к иммунологическим процессам и, следовательно, значимость онкомаркера для диагностики РШМ.

Выявлены особенности иммунного статуса, характерные для определенной стадии заболевания. У больных ЦИН III выявлено увеличение относительного количества лимфоцитов при уменьшении числа нейтрофилов крови, наблюдается увеличение CD56+ и CD25+ лимфоцитов периферической крови, повышение общего количества лейкоцитов и лизосомальной активности нейтрофилов, снижение показателей НСТ-теста, активности и интенсивности фагоцитоза, повышение уровня slgA цервикальной слизи, снижение уровней ИНФ-а и ФНО-а при росте концентраций ИНФ-у, ИЛ-2, ИЛ-10 в цервикальной слизи; у женщин с Cr. in situ выявлено сокращение количества CD3+, CD4+, CD25+ лимфоцитов, снижение CD95+, CD16+, CD56+ клеток и соотношения CD4+/ CD8+, повышение уровня ИЛ-10 в сыворотке крови. В системе локальной защиты обнаружено снижение количества жизнеспособных нейтрофилов и повышение уровней ИНФ-а и ИЛ-4 цервикальной слизи; У больных РШМ I стадии выявлено увеличение относительного числа HLA-DR+ лимфоцитов и снижение концентрации ИНФ-а и Ig М крови, со стороны местного иммунитета-снижение уровня IgM, повышение уровня Ig G и рост концентрации ИЛ-2 цервикальной слизи; у женщин с РШМ II-III стадий обнаружено снижение количества HLA-DR+ и CD 11b+ лимфоцитов, рост уровней ИНФ-у, ИЛ-2 и ИЛ-10 периферической крови, также выявлено повышение общего количества лейкоцитов, уровней Ig М, Ig G, ИЛ-4 и ИЛ-10 цервикальной слизи.

На основании проведенного иммунологического исследования, с помощью дискриминантного метода математического анализа с использованием иммунологических показателей разработан способ диагностики тяжелой дис-плазии и РШМ, ассоциированных с ВПЧ высокого канцерогенного риска.

Теоретическая и практическая и значимость

Полученные сведения об изменении и взаимосвязях иммунологических показателей существенно расширяют представления об особенностях иммунного статуса больных при прогрессировании опухолевой патологии шейки матки. Разработанная математическая модель, построенная на основании иммунологических показателей системного и местного иммунитета, позволяет использовать её как дополнительный метод, применяемый для дифференциальной диагностики тяжелой дисплазии и ранних стадий рака шейки матки, ассоциированных с ВПЧ высокого канцерогенного риска (ВКР) с достаточно высокой точностью.

Положения, выносимые на защиту

1. При ЦИН III и раке шейки матки регистрируются изменения всех звеньев системного иммунитета, характер которых зависит от стадии неопластического процесса. Уровень ЭССАдо начала лечения рака шейки матки зависит от стадии заболевания.

2. Выявлены выраженные изменения иммунологических показателей цервикальной слизи у женщин с ЦИН III и различными стадиями рака шейки

матки, ассоциированными с вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска.

3. Прогрессирование опухолевой патологии шейки матки сопровождается не только изменением показателей системного и местного иммунитета, но и изменением взаимосвязей между ними.

4. Разработанная математическая модель с использованием иммунологических показателей периферической крови и цервикальной слизи позволяет использовать иммунологические дифференциально-диагностические критерии для ранних стадий неопластического процесса шейки матки.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы на 1-ом Российско-Чешском медицинском форуме (Челябинск, 2006), на научно-практической конференции «Репродуктивное женское здоровье. ВПЧ инфекция» (Челябинск, 2007), на X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009), на Российской научно-практической конференции «Стратегия развития онкорадиологической службы в регионах РФ» (Челябинск, 2010).

Публикации По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе 8 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего работы 129 отечественных и 89 иностранных авторов. Диссертация изложена на 161 страницах компьютерного текста и включает 28 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для решения поставленных задач за период с 2005 по 2009 год в НИИ иммунологии и на кафедре онкологии ГОУ ВПО Челябинской государственной медицинской академии Росздрава было проведено иммунологическое обследование 83 женщин, которые находились на лечении в государственном лечебно-профилактическом учреждении Челябинском окружном онкологическом диспансере.

Критериями включения пациентов в данное исследование являлись:

1. Клинически и морфологически подтвержденный диагноз ЦИН III, Сг. in situ и РШМ с I-III стадию.

2. Верифицированное методом ПЦР наличие ДНК ВПЧ высокого канцерогенного риска (ВКР): 16,18, 31, 33 типов в соскобах цервикального канала.

3. Возраст пациенток от 20-54 лет

4. Индекс качества жизни по шкале Карновского не менее 80%.

5. Отсутствие значимой экстрагенитальной патологии (сахарный диабет, аутоиммунные заболевания, обострение хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта, носоглотки и урогенитального тракта).

6. Информированное согласие пациенток на участие в исследовании.

Всего в исследование было включено 83 пациентки, которые согласно положениям Международной классификации болезней и проблем, связанных со здоровьем 10-го пересмотра (МКБ-10, 1995), Классификации опухолей Всемирной организации здравоохранения: Патология и генетика опухолей молочной железы и женских половых органов (Tavasolli F.A., Devilee P., 2003) и Классификации злокачественных опухолей TNM (шестое издание, 2002), разделили на 4 группы: группа с ЦИН III, в которую вошли 20 пациенток; группу с преинвазивным РШМ (Cr. in situ) составили 20 женщин; группа с РШМ I стадии (HaNOMO, TlbNOMO), в которую вошли 20 пациенток; группу с РШМ 11-111 стадий (T2aN0M0, T2bN0M0, T2bN1M0, T3aN0M0, T3aN1M0, T3bNOMO) составили 23 женщины.

Контрольную группу, полученную методом случайной выборки, составили 20 женщин с латентной ПВИ, при обследовании которых с применением клинических, инструментальных и морфологических методов исследования изменений в шейке матки и иной гинекологической патологии выявлено не было.

Возраст больных варьировал от 20 до 54 лет. Средний возраст женщин составил 39,2 ± 1,7. Группа контроля и группы больных ЦИН III и РШМ были сопоставимы по возрасту.

Все больные ЦИН III и раком шейки матки прошли обязательный объем диагностических исследований, который включал в себя:

1. Клинические методы (сбор анамнеза, методы визуального и физикаль-ного онкологического обследования, оценку общего состояния по шкале Кар-новского, определение распространенности плоскоклеточного рака согласно Международной классификации TNM). Обследование проводилось врачом онкологом-гинекологом.

Инструментальные: УЗИ, УЗДГ сосудов малого таза, KT, MPT - по показаниям. При отсутствии визуальных признаков опухолевой ткани и у женщин контрольной группы проводилась прицельная биопсия шейки матки под контролем кольпоскопа. При наличии визуальной опухоли использовали ножевую биопсию. Методика проведения исследования была стандартной и осуществлялась врачом-гинекологом (Прилепская В.Н., 1997).

2. Морфологическое исследование цервикобиоптатов. Исследование и постановка диагноза производились специалистом-гистологом в лаборатории ГЛПУ ЧОКОД.

3. Молекулярно-биологические: для определения качественного состава микрофлоры половых путей и типирования ВПЧ ВКР пациенткам осуществлялось молекулярно-биологическое исследование методом ПЦР

4. Иммунологические методы: для оценки иммунологических показателей у женщин исследовались периферическая кровь и цервикальная слизь. В периферической крови было определено абсолютное число лейкоцитов, абсолютное и относительное число нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов и их субпопуляций, оценена функциональная активность нейтрофилов, концентрации иммуноглобулинов, циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) и общая активность комплемента. Также определялись концентрации онкомар-

кера SCCA и цитокинов: ИНФ-а, ИНФ-у, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ФНО-а. В церви-кальной слизи определяли общее количество лейкоцитов, абсолютное и относительное содержание жизнеспособных клеток, функциональную активность нейтрофилов. Также были определены уровни иммуноглобулинов А, М, G, секреторного иммуноглобулина А и концентрации цитокинов: ИНФ-а, ИНФ-у, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ФНО-а.

Было проведено:

- определение субпопуляционного состава лимфоцитов крови с помощью иммунофлюоресцентного анализа в модификации Сибиряка С. В. и со-авт. (1997) с пременением моноклональных антител производства НПЦ «Мед-БиоСпектр», Москва;

- определение уровня SCCA в сыворотке крови методом ИФА, с использованием соответствующей тест-система CanAg SCC EIA производства FUJIREBIO™ Diagnostics, Швеция;

- оценка функциональной активности нейтрофилов с исследованием фагоцитарной и лизосомальной активности (Фрейдлин И.С., 1986) и кислоро-дозависимого метаболизма (Маянский А.Н., Виксман М.К., 1979);

- определение концентрации иммуноглобулинов в цервикальной слизи и в сыворотке крови методом ИФА, с использованием иммуноферментных тест-системы ООО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск);

- определение ЦИК методом, предложенным В.Гашковой и соавт. (1978);

- определение общей активности комплемента по 50% гемолизу (Резникова Л.С., 1967);

- определение уровней цитокинов сыворотке крови и цервикальной слизи методом ИФА, с использованием соответствующих тест-систем ТОО «Цито-кин» (г. Санкт-Петербург).

5. Статистические методы: Результаты оценивали с помощью пакета статистических программ «Statistica for Windows 6.0» с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±т). Различия между сравниваемыми группами считали достоверными при р < 0,05, по непараметрическим критериям Mann-Whitney, Wald-Wolfowitz. Для сравнения качественных признаков и процентных соотношений использовали критерий %2 и точный критерий Фишера. Определение взаимосвязей показателей проводили с помощью корреляционного анализа по Spearmen. Для построения диагностической модели использовали пошаговый дискриминантный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При поступлении в ГЛПУ ЧОКОД у 69 (83,1%) пациенток преобладали жалобы на кровянистые выделения из половых путей, у 8 (9,6%) из них были обильные кровянистые выделения со сгустками, у 31 (37,3%) беспорядочные кровянистые выделения, у 30 (36,1%) контактные кровянистые выделения. На обильные водянистые со зловонным запахом бели предъявляли жалобы 38 (45,7%) женщин, боли внизу живота -47 (56,6%), поясничной области -12 (14,5%), 38 (45,7%) на слабость и недомогание и только 2 (2,4%) человека

жалоб не предъявляли.

Сопутствующие гинекологические заболевания были отмечены у 42 (50,6%) пациенток. Наиболее часто встречались миома тела матки у 15 (18,1 %) больных, хронический аднексит и эндометрит - 10 (13,2%), хронический цервицит-13 (15,7%), гиперпластические процессы эндометрия-3 (3,6%). У 36 (43,4%) пациенток в анамнезе имелась эрозия шейки матки.

Распределение больных по стадиям было следующим: рак шейки матки la (HaNOMO) диагностирован у 12 (60%) пациенток; lb (TbNOMO) у 8 (40%). По системе TNM II и III стадия распределялась следующим образом: с метастазами в регионарные лимфатические узлы: T2bN1 МО у 1 (4,3%) женщины и T3aN1M0 у 1 (4,3%) пациентки и без метастазов: T2aN0M0 у 11 (47,8%), T2bN0M0 у 4 (17,4%), T3aN0M0 у 5 (21,7 %), ТЗЫМОМО у 1 (4,3%).

У всех пациенток клинический диагноз рака шейки матки имел морфологическое подтверждение по гистологической классификации опухолей шейки матки ВОЗ (2003): плоскоклеточный ороговевающий (keratinizing) у 16 (19,3%) и неороговевающий (nonkeratinizing) у 65 (78,3%) больных, низкодифференци-рованный из базальных клеток (Basaloid) у 2 (2,4%) женщин с РШМ II-III стадий. Форма роста первичной опухоли при РШМ у 11 (25,6%) больных была экзофит-ной, у 7 (16,3%) - эндофитной и у 25 (58,1%) пациенток - смешанной.

По результатам молекулярно-биологического исследования (ПЦР), у пациенток контрольной группы патогенных микроорганизмов из цервикально-го канала выявлено не было. Из условно-патогенных бактерий из цервикаль-ного канала была выделена Ureaplasma urealyticum у 4 (20%) женщин. У пациенток с ЦИН III и РШМ из цервикального канала выделялись следующие условно-патогенные микроорганизмы: Ureaplasma urealyticum 24 (28,9%), Mycoplasma hominis 8(9,6%), Mycoplasma genitalium 1 (1,2%), Gardnerella vaginalis 12 (14,5%). Патогенных микроорганизмов (Chlamydia trachomatis), вирусов простого герпеса и цитомегаловирусов у обследованных больных выявлено не было. Нами зарегистрированы ассоциации условно-патогенных микроорганизмов у женщин с ЦИН III и Cr. in situ (10% от общего количества больных в каждой из этих групп).

Выявлено, что при распределении генотипов ВПЧ ВКР у всех обследованных женщин преобладает 16 генотип ВПЧ в составе моно- и микстинфекции (р <0,001). У больных тяжелой дисплазией и РШМ преобладает моноинфекция по сравнению со смешанной папилломавирусной инфекцией (р < 0,001).

Результаты, полученные при изучении клеточного состава периферической крови, выявили, что у женщин с тяжелой дисплазией шейки матки наблюдается относительный количественный рост числа лимфоцитов при относительном уменьшении содержания нейтрофилов. По данным некоторых авторов, соотношение числа нейтрофилов и лимфоцитов до оперативного лечения является важным прогностическим признаком выживаемости онкологических больных. Считается, что коэффициент соотношения числа нейтрофилов и лимфоцитов, превышающий значение 5, связан с худшим прогнозом (Cho Н„ Hur H.W., Kim S.W. et al. 2009; Cook E.J., Goulder F. et al„ 2005; Walsh S.R., Kishi Y., Kopetz S., Chun Y.S. et al., 2009). Следовательно, рост числа

лимфоцитов крови отражает активацию и сохранение эффективности функций противоопухолевого иммунитета на стадии предрака шейки матки. При РШМ 11-111 определяется достоверное снижение числа лимфоцитов, как в относительном, так и в абсолютном значениях, что указывает на истощение резерва основного звена противоопухолевой защиты.

Показатели субпопуляционного состава лимфоцитов на всех стадиях опухолевой прогрессии имеют однонаправленные изменения (таблица 1), выражающиеся в снижении количества CD3+, CD4+ и увеличении числа CD10+ лимфоцитов. Выявленные изменения отражают работу противоопухолевого иммунитета и связаны как со снижением относительного содержания клеток, несущих эти рецепторы, так и с тенденцией к снижению относительного и абсолютного числа лимфоцитов крови по мере прогрессирования опухоли.

Показатели у больных с ЦИН III при сравнении с контрольными значениями характеризуются ростом числа CD10+, CD56+, CD34+, CD25+ лимфоцитов. Изменения субпопуляционного состава лимфоцитов у пациенток с тяжелой дисплазией могут отражать как активационные процессы в системном иммунитете, так и супрессивное воздействие, связанное с CD4+25+ лимфоцитами, способствующее опухолевой прогрессии (Мейл Д., 2007).

У больных РШМ II-III стадий снижается количество CD8+ и CD16+ клеток, свидетельствующее о нарушении эффекторных и регуляторных механизмов противоопухолевого иммунитета.

У пациенток с Cr. in situ по сравнению с показателями при ЦИН III выявлено снижение большинства количества кластеров дифференцировки CD3+, CD4+, CD16+, CD25+, CD56+, CD95+ клеток и соотношения CD4+/CD8+. Выявленные изменения отражают реакцию иммунной системы в ответ на необратимые цитопатологические изменения в эпителии шейки матки. Показатели начальной стадии инвазивного рака характеризуются ростом числа лимфоцитов с HLA-DR+, более поздних стадий - снижением количества CD11b+ клеток, CD34+, HLA-DR+ лимфоцитов и ростом содержания пула клеток с рецептором CD10+. Важно отметить повышение CD4+/CD8+ при РШМ II-III стадий, связанное с падением числа цитотоксических лимфоцитов, что подтверждает дезинтеграцию иммунных механизмов на поздних стадиях неопластического процесса.

При изучении показателей функциональной активности нейтрофилов периферической крови обнаружен рост фагоцитарного числа у больных ЦИН III относительно контрольной группы и снижение активированного НСТ-теста у пациенток с РШМ II-III стадий относительно показателя группы с РШМ I стадии (таблица 2). В гуморальном звене системного иммунитета обнаружено снижение уровня IgM у пациенток с РШМ I стадии относительно показателя в группе женщин с Cr. in situ (таблица 3). Полученные данные указывают на вовлеченность фагоцитов крови и гуморальных факторов в иммунологический процесс, связанный с опухолевой прогрессией.

Результаты исследования выявили, что в группах с РШМ I стадии и РШМ II-III стадий достоверно повышались уровни онкомаркера по сравнению с группой контроля. Необходимо отметить значительное повышение SCCA у жен-

Таблица 1

Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови у обследованных женщин, (М±т)

Показатели Контрольная группа п = 20 Больные

ЦИН III п = 20 С г. ¡п вИи П = 20 РШМ I стадии п = 20 РШМ М-Ш стадии п= 23

1 2 3 4 5 6

СЭЗ, % 35,6 ±3,0 34,8 ±2,19 29,5 ± 2,11 26,1 ± 1,8 р 1-4= 0,009 29,7 ± 2,6

СИЗ, х109л 0,4 ± 0,04 0,45 ±0,05 0,32 ± 0,04 р1-3= 0,04; р2-3= 0,01 0,27 ±0,03 р1-4= 0,004 0,27 ± 0,02 р1-5= 0,002

С 04, % 27,3 ±1,9 30,1 ±2,31 20,45 ± 1,90 р1-3= 0,01; р2-3= 0,002 15,60 ± 1,10 р1-4< 0,001 18,70 ± 1,90 р1-5= 0,001

С04, *109/л 0,31 ± 0,02 0,38 ±0,04 0,22 ± 0,03 р1-3=0,006; р2-3=0,001 0,17 ±0,01 р1-4< 0,001 0,19 ± 0,02 р1-5< 0,001

С 08, % 18,95 ±1,26 21,9 ±1,93 20,3 ± 1,76 18,9± 1,6 15,7 ± 1,27 р1-5= 0,04

СР8, * 109/л 0,26 ± 0,03 0,3 ±0,02 0,24 ± 0,02 0,21 ±0,03 0,2 ± 0,03 р1-5= 0,04

СР4/С08 1,34 ±0,1 1,46 ±0,08 1,06 ± 0,08 р2-3 <0,001 0,96 ±0,08 р1-4= 0,004 1,2 ± 0,09 р4-5= 0,02

СРЮ, % 5,8 ± 0,78 6,85 ±1,09 7,6 ± 0,66 5,9 ±0,51 11,3± 0,93 р1-5= 0,01; р4-5 <0,001

СйЮ, *10э/л 0,09 ± 0,01 0,1 ±0,02 р1-2< 0,001 0,1 ± 0,02 р1-3 <0,001 0,1 ±0,01 р1^1 < 0,001 0,11 ± 0,01 р 1 -5 <0,001

СЭ11 ь, % 11,4 ± 0,73 16,9 ±1,25 14,5 ± 0,97 17,6 ±1,60 12,8 ± 1,00 р4 -5= 0,03

С011Ь,»109/ л 0,12 ± 0,01 0,19 ±0,02 0,16 ± 0,02 0,18 ±0,02 0,12 ± 0,01

С 016,% 16,8 ± 1,47 15,5 ±1,43 13,1 ± 1,10 р1-рЗ= 0,04 14,1 ±1,22 13,15 ±0,98 р1-5= 0,03

С016, х109/л 0,19 ± 0,02 0,21 ±0,03 0,14 ± 0,02 р1-3= 0,04; р2-3 =0,001 0,14 ±0,02 р1-р4= 0,04 0,13 ± 0,02 р1-5= 0,03

С020, % 16,1 ±1,24 15,1 ±1,41 16,65 ±1,22 13,6 ±1,09 13,7 ±1,21

СР20,хЮ9/Л 0,2 ± 0,02 0,17 ±0,02 0,18 ± 0,02 0,14 ±0,02 р1-р4= 0,03 0,1 3 ± 0,02 р1 -5= 0,01

С025, % 11,8 ± 0,83 17,2 ±1,1 р1-2= 0,04 9,35 ± 0,98 р2-3= 0,003 10,25 ± 0,92 13,15 ± 1,2

С025,х109/ л 0,12 ± 0,01 0,22 ±0,05 0,12 ± 0,03 0,11 ±0,01 0,13 ± 0,01

С 034, % 8,25 ± 0,98 11,9 ±1,28 р1-2= 0,04 10,9 ± 1,3 12,7 ±0,97 р1^1= 0,02 9,05 ± 0,83 р4-5= 0,02

СО 34, *109/л 0,11 ± 0,01 0,16 ±0,02 0,16 ± 0,03 0,14 ±0,02 0,09 ± 0,01 р4-5= 0,04

Продолжение таблицы 1

1 2 3 4 5 6

CD56, % 10,95 ±,75 15,6 ±1,37 р1-2= 0,002 12,75 ±1,05 13,7 ±0,84 р1-4= 0,04 12,75 ± 1,2

CD56, *10э/л 0,13 ±0,01 0,22 ± 0,03 р1-2= 0,02 0,13 ± 0,02 р2-3= 0,04 0,15 ±0,01 0,14± 0,02

CD95, % 12,1 +0,9 17,2 ±1,21 12,55+0,98 13,7 ±0,84 11,45 ±1,04

CD95, х10э/л 0,14 ±0,01 0,21 ±0,03 0,13± 0,02 р2-3= 0,04 0,13±0,01 0,11+0,01

HLA-DR, % 12,55 ±1,05 13,45+1,19 13,15+1,04 20,5+1,90 р1-4= 0,01 рЗ-4= 0,007 11,3+1,05 р4-5 <0,001

HLA-DR, % 12,55 ± 1,05 13,45+1,19 13,15+1,04 20,5 ±1,90 р1-4= 0,01 рЗ-4= 0,007 11,3+1,05 р4-5 < 0,001

Примечание к таблицам 1-7: р1 -2,3,4,5 - статистическая достоверность различий показателей больных от показателей группы контроля; р2 -3- статистическая достоверность различий показателей группы женщин с Сг. in situ от показателей группы пациенток с ЦИН III; рЗ-4 - статистическая достоверность различий показателей группы женщин с PlilM I стадии от показателей группы пациенток с Cr. in situ; р4 -5 - статистическая достоверность различий показателей группы женщин с PlilM II - III стадий от показателей группы пациенток с PLUM I стадии; п- число обследованных женщин. Значение показателя представляет собой среднее ± ошибка среднего. Полужирным шрифтом выделены достоверные отличия при межгрупповом анализе.

У УАШЖ X

/ Г /

Рис 1. Уровень SCCA при различных стадиях опухолевой прогрессии шейки

матки

Примечание: 1- группа контроля; 2 - больные ЦИН III; 3 - больные Cr. in situ; 4 - больные РШМ I; 5 - больные РШМ II-III; * - статистическая достоверность различий показателей больных от показателей группы контроля; ** - статистическая достоверность различий показателей группы женщин с РШМ I стадии от показателей группы пациенток с Cr. in situ;

щин с РШМ I стадии относительно группы с Cr. in situ (рис.1). Рост уровней онкомаркера при инвазивных формах рака может быть связан как с увеличением объема опухолевой ткани, так и с поражением базальной мембраны, ведущим к проникновению антигена плоскоклеточной карциномы в кровеносное русло. Отсутствие достоверных отличий уровней SCCA между показателями больных РШМ II-III стадий и РШМ I стадии может быть связано с наличием в группе больных РШМ II-III стадий женщин с низкодифференциро-ванными формами плоскоклеточного рака, при котором не происходит повы-

Таблица 2.

Показатели функциональной активности нейтрофилов периферической крови у обследуемых женщин, (М ± т)

Показатели Контрольная группа п = 20 Больные

ЦИН III п = 20 Cr. in situ n = 20 РШМ I стадии п = 20 РШМ II-III стадий п = 23

Лизосомапьная активность нейтрофилов, у. е. 242,3117,14 239,5± 16,0 236,0113,6 231,8117,3 223,4115,2

НСТ-тест спонтанный, % 25,4± 1,4 23,9±2,8 25,512,4 26,612,8 22,112,1

НСТ-тест спонтанный, у.е. 0,54±0,05 0,42±0,04 0,451 0,04 0,47 1 0,05 0,3610,04

НСТ-тест активированный, % 34,05±3,3 37,65±2,89 39,251 3,7 45,85 14,1 32,15±2,9 р4-5=0,02

НСТ-тест активированный, у.е. 0,60±0,03 0,65±0,07 0,691 0,07 0,77 1 0,09 0,5610,05

Функциональный резерв нейтрофилов, у.е. 1,36±0,13 1,34±0,11 1,5310,14 1,54 1 0,10 1,5510,12

Фагоцитарное число, у.е. 2,94±0,24 3,5 ±0,20 р1-2 = 0,03 3,210,19 3,1 ±0,18 3,410,28

Активность фагоцитоза нейтрофилов, % 40,35±2,12 43,1±2,6 44,513,6 45,411,8 41,912,9

Интенсивность фагоцитоза нейтрофилов, у.е. 1,23±0,14 1,4910,09 1,491 0,13 1,5910,1 1,5410,12

Таблица 3.

Содержание гуморальных факторов в сыворотке крови у обследуемых

женщин, (М±т)

Показатели Контрольная группа п = 20 Больные

ЦИН III п = 20 Cr. in situ n = 20 РШМ I стадии n =20 РШМ II- III стадий п = 23

lq А, г/л 1,39 + 0,09 1,32 ±0,09 1,66 10,12 1,58 10,09 1,61 1 0,14

Ig М, г/л 1,3 10,15 1,13 10,08 1,41 10,13 1,06 ±0,1 рЗ-4 = 0,01 1,271 0,11

Ig G, г/л 8,4 1 0,4 9,131 0,38 9,13 10,37 8,05 10,49 8,451 0,52

ЦИК у. е. 113,91 11,6 109,3 19,4 109,31 7,3 101,7 ±8,41 111,7 ± 8,43

СН 50 у.е. 55,11 1 1,17 57,45 1 1,38 55,761 1,59 56,86 1 1,84 57,81 ± 2,34

шения уровня SCCA (Yuan S.H., Liang X.F., Jia W.H., et al., 2008).

Таблица 4.

Уровень цитокинов в периферической крови у обследуемых женщин,

(М±т)

Показатели Контрольная группа Больные

ЦИН III Cr. in situ РШМ I стадии РШМ II-III стадий

ИФН-а, пг/мл 13,07±0,51 21,75 ± 0,66 р1-р2< 0,001 20,78 ± 0,92 р1-3< 0,001 16,73 ±0,77 р1-4< 0,001 рЗ-4= 0,001 17,82 ± 1,35 р1-5 = 0,004

ИФН-Y, пг/мл 21,42±1,37 27,19 ±2,39 39,05 ± 5,29 р1-3= 0,008 27,21 ±3,65 240,74 ± 67,8 р1-5 < 0,001 р4-5 < 0,001

ИЛ-2, пг/мл 4,25±0,57 5,82 ±0,6 7,61 ± 0,86 р1-3= 0,002 5,7 ±0,8 Р1-4 = 0,002 9,14 ± 0,66 р1-5 = 0,002 р4-5= 0,04

ИПА, пг/мл 1,22±0,11 1,46 ±0,13 2,59 ± 0,7 р1-3 = 0,01 2,0 ± 0,19 р1-4= 0,001 2,3 ±0,45 р1-5 = 0,009

ИЛ-10, пг/мл 3,98±0,33 6,43 ±0,15 р1-2 < 0,001 8,87 ± 0,9 р1-3< 0,001 р2-3 < 0,001 10,55 ±3,18 р1-4< 0,001 16,33 ±4,28 р1-5 < 0,001 р4-5 = 0,007

ФНО-а, пг/мл 3,69 ±0,52 1.13 ± 0,1 р1-2 < 0,001 1,36 ± 0,09 р1-3= 0,005 1,7 ± 0,14 р1-4= 0,002 2,29 ± 0,42 р1-5 = 0,004

Изучение цитокинового профиля показало однонаправленные изменения уровней цитокинов крови при всех стадиях опухолевой прогрессии по сравнению с показателями контрольной группы (таблица 4), выражающиеся в росте концентраций интерферонов, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 и снижении уровня ФНО-а. Характерным явилось то, что у больных с ЦИН III повышались уровни ИНФ-у, ИЛ-10, а при РШМ I стадии достоверно повышались уровни ИНФ-а, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 относительно значений контрольной группы при сниженном уровне ФНО-а. Полученные результаты могут служить свидетельством работы системного иммунитета на всех стадиях канцерогенеза с тенденцией к преобладанию уровней цитокинов Th2 ответа. Стабильное нарастание уровней ИНФ-у может быть связано с его продукцией как Thl-лимфоцитами, так и опухолевыми клетками (Mueller М.М., 2004).

По данным некоторых авторов, рост уровней ИНФ-у и ИЛ-4 при раке органов репродуктивного тракта женщин не предотвращает ангиогенез и способствует опухолевой прогрессии (Глухова Т.Н., Салов И.А., Турлупова Т.И., 2010). Уменьшение содержания в сыворотке крови ФНО-а во всех исследуемых группах относительно контрольных значений может быть связано с повышением уровня растворимой формы TNF-рецепторов, связывающих данный цитокин. Снижение уровня ФНО-а может свидетельствовать также о наруше-

нии функционального профиля фагоцитов, NK-клеток и клеточного апоптоза (Кубанов A.A., 2005).

По мере прогрессирования неопластического процесса для каждой группы больных выявлены характерные изменения уровней цитокинов: в группе больных Cr. in situ, в отличие от показателей при ЦИН III, происходит рост уровня ИЛ-10, что указывает на усугубление нарушений в работе регулятор-ных Thl-лимфоцитов и антиген-презентирующей функции макрофагов. При РШМ I стадии относительно показателей пациенток с Cr. in situ происходит снижение продукции ИНФ-а, подавляющего трансляцию белков ВПЧ, который должен оказывать противовирусный иммунитет и сдерживать развитие опухолевой трансформации. Для поздних стадий канцерогенеза характерно резкое повышение уровней ИНФ-у, ИЛ-2 и ИЛ-10, связанное с их продукцией активированными лимфоцитами, опухолевыми клетками и массированным поступлением данных цитокинов из очага неопластического процесса в кровеносное русло (Кубанов A.A., 2005; Mueller М.М., 2004).

Установлено, что существует ряд общих изменений иммунологических показателей в цервикальной слизи у обследованных пациенток при сравнении со здоровыми женщинами: повышение общего количества нейтрофилов, усиление лизосомальной активности, угнетение внутриклеточного кислоро-дозависимого метаболизма нейтрофилов и резерва их бактерицидной функции, а также снижение активности и интенсивности фагоцитоза (таблица 5). Характерными особенностями являются: при Cr. in situ - снижение относительной жизнеспособности нейтрофилов, при РШМ I стадии - повышение фагоцитарного числа на фоне сниженных активности и интенсивности фагоцитоза, при РШМ II-III стадий - рост абсолютного количества жизнеспособных клеток. Необходимо отметить, что нейтрофилы, являясь представителями системы врожденного иммунитета, служат "первой линией" защиты от ПВИ. Поэтому снижение большинства показателей их функциональной активности при тяжелой дисплазии и РШМ указывает на нарушение эффективности работы нейтрофилов и подтверждает ведущую роль адаптивного иммунитета в противоопухолевой защите (Stern P.L., Kitchener Н.С., 2009).

Показатели функциональной активности нейтрофилов у больных Cr. in situ достоверно отличались от показателей при ЦИН III снижением относительной жизнеспособности фагоцитов, у пациенток с РШМ II-III стадий от показателей группы с РШМ I стадии - нарастанием общего числа лейкоцитов. Полученные данные могут свидетельствовать как о нарушении функций фагоцитов на фоне ПВИ при тяжелой дисплазии, так и о нарастании местной воспалительной реакции у больных РШМ I стадии, сопровождающей опухолевый процесс и характеризующейся модификацией функциональной активности нейтрофилов цервикальной слизи (Мальцева В.Н., 2006; Тотолян A.A., Фрейдлин И.С., 2000).

Показатели гуморальных факторов иммунитета представлены в таблице 6. При изучении гуморальных факторов защиты цервикальной слизи у всех женщин с предраком и РШМ отмечено значительное повышение уровней slg А относительно контроля. При Cr. in situ и инвазином раке обращает на себя

Таблица 5.

Количество и функциональная активность нейтрофилов цервикальной слизи у обследованных женщин, (М±т)

Показатели Контрольная группа п = 20 Больные

ЦИН III п = 20 Cr. In situ n= 20 РШМ I стадии п = 20 РШМ II-III стадии п = 23

Общее количество лейкоцитов, 109/л 9,33 ±0,9 17,01±1,8 р1-2<0,001 22,21±1,90 р1-3<0,001 27,4±1,7 р14< 0,001 31,12±0,7 р1^< 0,001 р4-5= 0,001

Кол1мество жизнеспособных нейтрофилов, 109/л 8,74 ±0,8 10,8841,50 12,14±2,1 9,14±0,92 13,38 ±2,3 р1-5= 0,04

Колтество жизнеспособных нейтрофилов, % 66,95 ±2,3 61,35±4,3 44,5+3,5 р1 -3=0,002 р2-3= 0,002 53,25±4,6 47,95±4,56 р1-5= 0,03

Лизосомаль-ная активность нейтрофилов, у.е. 25,0 ±2,1 103,1±9,4 р1-2<0,001 153,2±16,7 р1-3< 0,001 142,9±12,2 рМ< 0,001 202,6±30,6 р1Ч< 0,001

НСТ-тест спонтанный, % 38,0 ±2,7 29,25±2,8 р1-2 = 0,04 28,9±2,07 р1-3=0,03 24,6±2,7 р1-р4= 0,02 26,65±1,85 р 1-5= 0,003

НСТ-тест спонтанный, у.е. 0,56 ±0,03 0,43±0,07 Р1-2 = 0,006 0,45±0,03 р1-рЗ = 0,02 0,48±0,07 0,43±0,05 р1-5= 0,03

НСТ-тест активированный,% 50,0 ±2,9 32,9±3,0 р1-2=0,002 39,1±3,4 р1-3 =0,02 32,2±32 р1-4 < 0,001 37,4±4,07 р1-5= 0,01

НСТ-тест активированный, у.е. 0,73 ±0,03 0,51±0,07 р1-2 = 0,04 0,62 ±0,06 0,51±0,07 р1-4= 0,01 0,62±0,07

Сункциональ-ный резерв уейтро филов, У.е 1,37 ±0,09 1,19±0,25 р1-2 = 0,02 1,81 ±0,27 1,62t0,27 1,49±0,17

Активность фагоцитоза нейтрофилов, % 40,15 ±2,3 32,5±2,41 р1-2 = 0,01 30,1±2,80 р1-3 =0,04 28,1 ±22 р1-4 < 0,001 32,0±2,95 р1-5= 0,04

Интенсивность фагоцитоза нейтрофилов, У.е. 1,3 ± 0,11 0,69±0,09 р1-2 = 0,01 0,83±0,14 р1-3 =0,04 0,87±0,08 р1-4 = 0,02 0,84±0,06 р1-5 = 0,01

Фагоцитарное число, у.е. 2,07 ±0,08 2,29±0,15 2,54±0,2 3,11±0,19 р1-4 = 0,01 2,74±0,15 р1-5= 0,02

Таблица 6

Показатели гуморальных факторов иммунитета цервикальной слизи у обследованных женщин, (М±т)

Показатели Контрольная группа п = 20 Больные

цинш п= 20 Cr. in situ n = 20 РШМ I стадии n = 20 РШМ II-III стадии n= 23

slg А, мг/л 18,1±1,7 55,7 ±7,1 р1-2 < 0,001 75,1 ± 11,18 p1-3< 0,001 55,0± 8,2 p1-4< 0,001 73,7 ±9,89 p1-5< 0,01

Ig А, мг/мл 0,52±0,07 0,56 ±0,08 1,16 ±0,32 0,58 ±0,07 0,96 ±0,14 p1-5= 0,04

Ig М, мг/мл 0,23±0,02 0,34 ±0,08 0,24 ± 0,03 0,15+0,01 p1-4= 0,003 p3-4= 0,02 0,44 + 0,09 P1-5< 0,001 p4-5= 0,03

Ig G, мг/мл 0,91±0,04 0,76 ±0,06 1,53 ±0,26 p1-3= 0,03 3,0+0,86 p1-4< 0,001 p3-4< 0,001 5,75 ±1,05 p1-5< 0,001 p4-5= 0,01

Таблица 7.

Уровень цитокинов цервикальной слизи у обследуемых женщин, (М±т)

Показатели Контрольная группа п = 20 Больные

ЦИН III п = 20 Cr. in situ n = 20 РШМ I стадии n = 20 РШМ II-III стадии n = 23

ИФН-а, пг/мл 949,66±89,4 521,86±52,7 р1-2 < 0,001 710,74119,8 p1-3 = 0,004 p2-3 = 0,005 694,73±10,8 p1-4= 0,003 629,5±12,6 p1-5 = 0,003

ИФН-у, пг/мл 302,95±45,5 722,44±72,7 р1-2 < 0,001 628,56±94,1 p1-3 = 0,02 646,46±61,2 p1-4= 0,004 689,62±8,8 p1-5 = 0,005

ИЛ-2, пг/мл 51,9±5,1 109,15±15,1 р1-2 < 0,001 89,64 1 17,1 130,16±16,6 p1-4< 0,001 p3-4= 0,002 139,89±10,7 p1-5 < 0,001

ИЛ-4, пгУмл 145,68±23,9 91,7±8,1 111,2 ± 8,5 p2-3 = 0,04 124,9 ± 17,3 316,6 ±62,4 p1-5 = 0,04 p4-5 = 0,04

ИЛ - 10, пг/мл 87,93±19,6 183,2±7,0 р 1 -2 < 0,001 183,38110,0 p1-3< 0,001 192,85 ±7,9 p1-4 < 0,001 219,36±17,3 p1-5 < 0,001 p4-5 = 0,04

ФНО-а, пг/мл 115,0±31,8 66,19±4,05 р 1 -2 = 0,001 66,18 ±2,7 p1-3 = 0,006 66,15 ±4,8 p1-p4 = 0,03 71,46 ±5,7 p1-5 = 0,02

внимание изменение уровня IgG в сторону увеличения по сравнению с таковым в контрольной группе. Необходимо отметить у больных РШМ I стадии снижение уровня Ig М, а у женщин с РШМ 11-111 стадий повышение концентраций Ig А и Ig М относительно контрольных значений.

В зависимости от стадии неопластического процесса выявлено: при РШМ

I стадии достоверное снижение уровня Ig М и повышение уровня Ig G относительно показателей больных Cr. in situ, а при PI1IM 11-111 стадий - повышение концентрации Ig М и Ig G относительно показателей женщин с PLUM I стадии. Обращает на себя внимание снижение уровня Ig М у больных РШМ 1 стадии относительно показателя женщин с Cr. in situ в сыворотке крови и цервикаль-ной слизи. Снижение уровня Ig М у больных PI1IM I стадии в цервикальной слизи наблюдается и относительно контрольных значений, что соотносится со снижением числа B-лимфоцитов по сравнению с показателями группы контроля в периферической крови у женщин данной группы. Существующие изменения отражают сдвиги в гуморальном звене системного и местного иммунитета, связанные с инвазией и прогрессией опухоли. Выработка и накопление антител при РШМ связаны с массированной антигенной нагрузкой на фоне развивающихся цитопатологических изменений эпителия и являются отражением напряженной работы гуморального звена иммунитета, подтверждающей преобладание функций Th-2 при всех изучаемых стадиях заболевания. Эти данные не противоречат литературным данным и согласуются с полученными изменениями иммунологических показателей крови (Гадецкая H.A., 2007; Rosha-Zavaleta L., 2003).

Изменения цитокинового профиля цервикального секрета имеют характеристики сходные с таковыми в сыворотке крови (таблица 7). Во всех группах больных наблюдается выраженное снижение уровней ИНФ-а и ФНО-а и рост концентраций ИНФ-у, ИЛ-2, ИЛ-10 относительно группы контроля. Обращает на себя внимание наличие реципрокных отношений между уровнями ИНФ-у в сыворотке крови и в цервикальной слизи: рост концентрации ИНФ в сыворотке и снижение в слизи. Существующие изменения могут быть связаны с более поздней активацией факторов системного иммунитета с учетом местного характера заболевания и, следовательно, служить свидетельством изменения функциональной активности лейкоцитов периферической крови.

Необходимо отметить, что в группе с ЦИН III в цервикальной слизи достоверно снижены уровни ИНФ-а и ФНО-а и существенно повышены концентрации ИНФ-у, ИЛ-2 и ИЛ-10 относительно группы контроля. Снижение уровня ИНФ-а связано с истощением противовирусных механизмов защиты при тяжелой дисплазии (Ota К., MatsumiyaT., Sakuraba Н., 2010). Изменение уровня ФНО-а в сторону снижения может свидетельствовать о проявлении его про-канцерогенной (антиапоптотической) активности, поскольку при повышенных концентрациях проявляется антиканцерогенная активность ФНО-а, приводящая к некрозу опухоли.

Повышение концентраций цитокинов Th1 (ИНФ-у, ИЛ-2) при повышенном уровне ИЛ-10 у больных ЦИН III может быть связано с особенностями регуляции механизмов клеточной кооперации на начальных этапах опухолевой прогрессии, что подтверждается данными литературы (Pardo-Govea Т., Callejas D., Nunez-Troconis J., 2005). Таким образом, сохраняется "равновесие" между уровнями цитокинов Th1 и Th2 типов (Мейл Д., 2007). Что, возможно, обеспечивает обратимость существующих изменений в эпителии шейки матки. Хотя многие исследователи отмечают наличие сдвига секреции Th1 -цитокинов в сторону

Th2-MHTOKHH0B у женщин сдисплазией шейки матки (Clerici М., Merola М„ Ferrario Е. et al., 1996; Clerici М., Merola М., Ferrario Е. et al., 1997).

Изменения цитокинового профиля цервикальной слизи при межгрупповом сравнительном анализе имеют свои особенности: в группе с Cr. in situ относительно показателей при ЦИН III отмечается повышение уровней ИНФ-а и ИЛ-4. У больных РШМ I стадии определяется рост концентрации ИЛ-2 по сравнению с показателями при Cr. in situ. При РШМ II-III стадий изменяются уровни ИЛ-4 и ИЛ-10 в сторону увеличения относительно показателей больных РШМ I стадии. Изменение уровней факторов регуляции свидетельствует об активности иммунологических процессов, протекающих при росте опухоли, ассоциированной с вирусной инфекцией, Соотношение концентраций цито-кинов слизи демонстрирует истощение противовирусных механизмов защиты, преимущественное преобладание Th-2 профиля лимфоцитов и активную секрецию факторов регуляции раковыми клетками. Клетки растущей опухоли претерпевают процессы структурно-функциональной перестройки, идущие в различных направлениях по законам прогрессии - независимо друг от друга (Райхлин Н.Т., 1973). Поэтому продукция широкого спектра цитокинов: ФНО-а, ИЛ-1, 2, 4,10 трансформированными клетками, создающая и поддерживающая определенное микроокружение развивающейся опухоли носит хаотичный, нерегулируемый характер (Mueller М.М., 2004).

Иммунологические показатели в сравниваемых группах исследовали методом корреляционного анализа для выявления структуры и характера взаимосвязей. Взаимосвязи определялись между уровнями онкомаркера, цитокинов и другими иммунологическими показателями, так как именно цитокины осуществляют реализацию механизмов врожденного и регуляцию системы адаптивного иммунитета, составляющих основу контроля над процессами, вызванными ВПЧ (Stern P.L., Kitchener Н.С., 2009).

Необходимо отметить, что в группе контроля были установлены обратные взаимосвязи между уровнем онкомаркера и абсолютными значениями CD16+ и CD25+. Следовательно, мы можем предположить что, чем выше напряженность факторов врожденного и активность адаптивного иммунитета, тем меньше уровень SCCA. Предраковые изменения в эпителиальном слое шейки характеризуются наличием прямой связи между уровнем онкомаркера и относительным числом CD11+, что может свидетельствовать о нарастании межклеточных контактов. Установленная обратная связь между уровнем SCCA и уровнем ИЛ-2 крови в группе больных Cr. in situ доказывает важность адекватности иммунных активационных процессов в противоопухолевой защите организма. Появление прямой корреляционной связи между уровнем онкомаркера и процентным содержанием HLA-DR+ в группе больных aPLUM I стадии может быть связано с процессами вторичной активации иммунной системы на фоне повреждения базальной мембраны при инвазии опухоли. Существование корреляционных взаимосвязей между уровнем SCCA и иммунологическими показателями крови доказывает участие онкомаркера в иммунологических процессах, сопровождающих течение РШМ (Hsu К.F., Huang S.C., Shiau A.L., et al., 2007; Yuan S.H., Liang X.F., Jia W.H., et al., 2008).

Взаимосвязи между показателями системного иммунитета.в группе с ЦИН III характеризуются ростом их количества по сравнению с контрольной группой, 8 из которых установлены между уровнем ИНФ-у и показателями субпо-пуляционного состава лимфоцитов, что свидетельствует о напряженной работе клеточного звена иммунитета. У пациенток с Cr. in situ и PLUM I стадии происходит снижение количества взаимосвязей, при этом в группе больных Cr. in situ 5 связей установлены между уровнем ИЛ-10 и другими показателями периферической крови. Снижение количества взаимосвязей и преобладание связей между уровнем ИЛ-10 и другими показателями периферической крови при Cr. in situ может быть связано с преобладанием супрессорного влияния на Th1-звено лимфоцитов, возможно, ведущее впоследствии к несостоятельности иммунного ответа при опухолевой прогрессии.

Исследование взаимосвязей между уровнями цитокинов и другими иммунологическими показателями цервикальной слизи показало, что наибольшее количество корреляционных взаимосвязей наблюдается в группе больных ЦИН III, при этом 3 прямые взаимосвязи существуют между уровнями ИНФ-а, ИЛ-2 и показателями функциональной активности нейтрофилов, обратные взаимосвязи наблюдаются между уровнями ИЛ-4, ИЛ-10, ФНО-а и показателями функциональной активности нейтрофилов, что может отражать работу регуляторных механизмов противовирусного и противоопухолевого иммунитета, позволяющих при определенных условиях осуществить регрессию неопластического процесса (Роговская С.И., 2008). У пациенток с Cr. in situ и РШМ I стадии происходит снижение количества взаимосвязей. Одна прямая связь в группе больных Cr. in situ установлена между уровнем ИНФ-а и показателем активности фагоцитоза, обратная связь - между уровнем ИНФ-у и Ig А цервикальной слизи, что может свидетельствовать о нарушении регуляции местного иммунитета в ответ на необратимые цитопатологические изменения эпителия шейки матки. Корреляционные взаимосвязи при PLUM II-III стадий характеризуются увеличением их числа. Их появление может быть связано с нарастанием воспалительной реакции в прилежащих к растущей опухоли тканях. Наличие корреляционных связей между уровнями цитокинов, характеризующих преимущественно Т-клеточный иммунный ответ, и показателями функциональной активности нейтрофилов подтверждает их модификацию в ответ на опухолевый процесс (Мальцева В.Н., 2006).

При оценке взаимосвязей между иммунологическими показателями периферической крови и цервикальной слизи, установлено, что наибольшее количество корреляционных взаимосвязей между показателями периферической крови и цервикальной слизи наблюдается в группе больных РШМ I, при этом 5 прямых взаимосвязей существуют между уровнем SCCA и показателями функциональной активности нейтрофилов цервикальной слизи. Выявленные особенности корреляционных взаимосвязей могут быть связаны с нарушением целостности базальной мембраны и увеличением продукции онкомаркера, ведущим к изменению функциональной активности нейтрофилов, поступающих в очаг опухолевой деструкции.

В результате проведенных исследований были зарегистрированы дос-

товерные отличия многих иммунологических показателей у больных предра-ком и PLUM в зависимости от стадии заболевания. Это дает возможность разработки иммунологических критериев для дифференциальной диагностики между ЦИН III и Cr. in situ, между Сг. in situ и PLUM I стадии, то есть ранними стадиями неопластического процесса.

Известно, что гистологическое исследование является основным, наиболее достоверным и обязательным методом диагностики РШМ. Показаниями к прицельной биопсии являются наличие видимых изменений эпителия шейки матки или патологических результатов цитологического исследования. Биопсия берется с участков поражения, где изменения имеют наихудшие проявления, и в области стыка цилиндрического и многослойного плоского эпителия. При несоответствии результатов кольпоскопии, цитологии и биопсии проводится повторное гистологическое исследование с других участков эпителия, а в сложных случаях с применением выскабливания цервикального канала или конизации шейки матки (Косенко И.А., 2003; Шахова Н.М., 2006).

Для сокращения частоты повторных диагностических биопсий, учитывая мультицентричный характер поражения эпителия и одновременное присутствие различных степеней поражения, мы предлагаем использовать иммунологические критерии как метод дополнительной диагностики ранних стадий РШМ. Важность предлагаемого подхода к диагностике заключается в подтверждении или исключении наличия участков поражения эпителия, соответствующих более выраженной стадии заболевания, чем установленной при гистологическом исследовании. Это послужит основой для изменения тактических подходов к лечению женщин молодого и среднего возраста с целью сохранения репродуктивной функции.

С помощью пошагового дискриминантного анализа были выделены наиболее информативные параметры для построения математической модели. В результате в линейную дискриминантную функцию в качестве наиболее информативных были включены следующие показатели:

1. Для дифференциальной диагностики ЦИН III и Сг. in situ: содержание CD10, (х10э/л), CD 20, (хЮ9/л), CD25, (х109/л). лимфоцитов периферической крови, функциональный резерв нейтрофилов цервикальной слизи, у. е. (ФРНС), уровни ИЛ-10, пг/мл крови (ИЛ-10К) и уровни ИНФ-у, пг/мл (ИНФ-уС) и ФНО-а, пг/мл (ФНО-аС) слизи.

2. Для дифференциальной диагностики Cr. in situ и РШМ I: уровень SCCA, мг/л, уровни lg G, г/л (IgGK), ИНФ-а, пг/мл (ИНФ-аК) и ФНО-а, пг/мл (ФНО-аК) периферической крови.

В результате вычисления диагностических коэффициентов для определения были предложены следующие формулы:

1. F(x1) = - 15,671 х CD10 + 13,993 х CD20 - 15,035 х CD25 + 0,488 х ФРНС + 0, 633 х ИЛ-10К + 0,1 х ИНФ-у С - 0,081 х ФНО-аС - 4,786

2. F(x2) = 0,620xSCCA - 0,285xlgGK- 0,372хИНФ-аК + 1,854хФНО-аК + 5,653

Применение данных формул подразумевает формальную подстановку

значений иммунологических показателей, полученных при обследовании пациентки, и вычисление значений дискриминатнтных функций. В качестве то-

чек разделения используются значения середины расстояний между координатами центров распределений. Если значение дискриминатнтных функции больше значения середины расстояния, то больную необходимо отнести к последующей группе, если меньше, то к предыдущей. В нашем случае координаты точки разделения для обеих формул равны 0. Таким образом, формально, если значение дискриминатнтной функции F(x1) больше 0, то больную необходимо отнести к группе с Сг. in situ, если меньше, то к группе с ЦИН III. Если значение дискриминатнтной функции F(x2) больше 0, то больную необходимо отнести к группе с РШМ I, если меньше, то к группе с Сг. in situ.

Результаты валидизации полученных линейных дискриминантных функций показали, что точность диагностики при помощи данной модели составляет 87,5% между ЦИН III и Сг. in situ, между Сг. in situ и РШМ I стадии - 90 %.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о перспективности проведения дальнейших исследований в этом направлении, а расширение спектра иммунологических исследований предоставит возможность для построения более точной математической модели.

ВЫВОДЫ

1. У больных цервикальной интраэпителиальной неоплазией III и раком шейки матки преобладает 16 генотип вируса папилломы человека в составе моно- и микстинфекции. На всех стадиях прогрессии опухолевой патологии шейки матки доминирует моноинфекция вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска.

2. Независимо от стадии неопластического процесса шейки матки, ассоциированного с вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска, наблюдаются однонаправленные изменения факторов системного иммунитета: рост числа CDIO+клеток, снижение общего числа Т-лимфоцитов, CD4+ и NK-клеток крови, повышение уровней ИНФ-а, ИНФ-у, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 и снижение уровня ФНО-а в сыворотке крови.

3. Для всех стадий прогрессии опухолевой патологии шейки матки характерны однонаправленные изменения в системе локальной иммунной защиты: повышение общего количества лейкоцитов, угнетение внутриклеточного кислородозависимого метаболизма и резерва бактерицидной функции нейтрофилов, усиление лизосомальной активности, снижение активности и интенсивности фагоцитоза нейтрофилов, повышение уровня slgA и выраженное снижение уровней ИНФ-а и ФНО-а при росте концентраций ИНФ-у, ИЛ-2, ИЛ-10 цервикальной слизи.

4. У больных с цервикальной интраэпителиальной неоплазией III в отличии от пациенток с латентной папиллома вирусной инфекцией отмечается увеличение относительного количества лимфоцитов при снижении процентного содержания нейтрофилов периферической крови, наблюдается увеличение числа CD56+ и CD25+ клеток. Изменения цитокинового профиля сыворотки крови характеризуются повышением содержания ИНФ-а, ИЛ-10 и снижением ФНО-а. Показатели местного иммунитета отличает повышение об-

щего количества лейкоцитов и лизосомальной активности нейтрофилов, снижение показателей НСТ-теста, активности и интенсивности фагоцитоза; повышение уровня slg А и снижение уровней ИНФ-а и ФНО-а при росте концентраций ИНФ-у, ИЛ-2, ИЛ-10 в цервикальной слизи.

5. При Cancer in situ в отличии от цервикальной интраэпителиальной нео-плазии III наблюдается сокращение субпопуляций CD3+, CD4+, CD25+ лимфоцитов, снижение CD95+, CD16+, CD56+ клеток и соотношения CD4+/ CD8+, и повышается уровень ИЛ-10 в сыворотке крови. В системе локальной защиты происходит снижение количества жизнеспособных нейтрофилов и повышение уровней ИНФ-а и ИЛ-4 цервикальной слизи.

6. У больных раком шейки матки I стадии по сравнению с пациентками с Cancer, in situ выявлены увеличение относительного числа HLA-DR+ лимфоцитов и снижение концентраций ИНФ-а и Ig М крови. Показатели местного иммунитета отличает снижение уровня IgM, повышение уровня lg G и рост концентрации ИЛ-2 цервикальной слизи.

7. Отличительной особенностью рака шейки матки II-III стадий относительно I стадии являются снижение количества HLA-DR+ и CD11b+лимфоцитов, рост уровней ИНФ-у, ИЛ-2 и ИЛ-10 крови. Показатели цервикальной слизи характеризуются повышением общего количества лейкоцитов, уровней IgM, IgG и ростом концентраций ИЛ-4 и ИЛ-10.

8. Концетрация SCCA до начала лечения зависит от стадии заболевания. Выраженное повышение уровней онкомаркера наблюдается при раке шейки матки I-III стадий. Выявленные взаимосвязи между уровнями SCCA и иммунологическими показателями характеризуются при цервикальной интраэпителиальной неоплазии III - прямой связью между уровнем онкомаркера и относительным числом CD11+ лимфоцитов крови, при Cancer in situ - обратной связью с уровнем ИЛ-2 крови, при раке шейки матки I стадии - прямой связью с процентным содержанием HLA-DR+ лимфоцитов.

9. Математическая модель, разработанная на основании дискриминант-ного анализа иммунологических показателей периферической крови и цервикальной слизи, позволяет проводить дифференциальную диагностику между цервикальной интраэпителиальной неоплазией III и Cancer in situ - с точностью 87,5%, между Cancer in situ и раком шейки матки I стадии - с точностью до 90%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При комплексном обследовании женщин с ЦИН и РШМ рекомендуется определять наличие ДНК вируса папилломы человека высокого канцера-генного риска в соскобе цервикального канала с помощью метода ПЦР.

2. При обследовании женщин с установленным диагнозом ЦИН III и Cr. in situ, ассоциированных с ВПЧ ВКР, целесообразно применять иммунологическое исследование цервикальной слизи и периферической крови с использованием показателей, входящих в математическую модель, для дополнительной дифференциальной диагностики ЦИН III, Cr. in situ и РШМ I стадии.

Для дифференциального диагноза между ЦИН III и Cr. in situ: содержание CD10, CD 20, CD25, лимфоцитов и уровень ИЛ-10 периферической крови; функциональный резерв нейтрофилов, уровни ИНФ-у, и ФНО-а, церви-кальной слизи: F(x1) = - 15,671 х CD10 + 13,993 х CD20 - 15,035 х CD25 + 0,488 х ФРНС + 0, 633 х ИЛ-10К + 0,1 х ИНФ-у С - 0,081х ФНО-аС - 4,786

Если значение дискриминатнтной функции F(x1) больше 0, то больную необходимо отнести к группе с Cr. in situ, если меньше, то к группе с ЦИН III.

Для дифференциального диагноза между Cr. in situ и РШМ I стадии: уровни SCCA, IgG, ИНФ-а, и ФНО-а, периферической крови.

F(x2) = 0,620xSCCA - 0,285xlgGK - 0,372хИНФ-аК + 1,854хФНО-аК + 5,653

Если значение дискриминатнтной функции F(x2) больше 0, то больную необходимо отнести к группе с РШМ I, если меньше, то к группе с Cr. in situ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Абрамовских, О.С. Частота выявления ВПЧ 16/18 типов у женщин с патологическими процессами шейки матки методом ПЦР / О.С. Абрамовских, В.Ф. Долгушина, Л.Ф. Телешева, И.Ю. Орнер И.Ю..// Современные проблемы диагностики и лечения дисбактериозов: материалы конф. Посвящ. 10-летию НПЦ диагностики, лечения и профилактики дисбактериозов НИИ иммунологии ЧелГМА и 60-летию ГОУ ВПО "Челябинская государственная медицинская академия МЗ РФ". - Челябинск, 2004. - С.3-4.

2. Зурочка, А.В. Возможности оценки иммунного статуса путем сравнительного анализа результатов, полученных разными методами фенотипиро-вания / А.В. Зурочка, И.Ю. Орнер, C.B. Квятковская, К.В. Никушкина, О.С. Абрамовских// Материалы IV конференции Иммунологов Урала. - 2005.- №1(4). -С. 189-190.

3. Телешева, Л.Ф. Выявление высокоонкогенных типов ВПЧ у сотрудников предприятия газовой промышленности Челябинской области / Л.Ф. Телешева, И.Ю. Орнер, О.С. Абрамовских, И.Л. Батурина, К.В. Никушкина, Н.А. Луговская // Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека: материалы конф., посвящ. 25-летию ЦНИЛ ЧелГМА. - Челябинск, 2006.-С.169-171.

4. Телешева, Л.Ф. Изменения субпопуляционного состава лимфоцитов у женщин с папилломавирусной инфекцией, работающих на промышленном предприятии Челябинской области / Л.Ф. Телешева, О.С. Абрамовских, И.Ю. Орнер, И.Л. Батурина, К.В. Никушкина // 1-ый Российско-Чешский медицинский форум: сб. материалов. - Челябинск, 2006. - С.179-181.

5. Абрамовских, О.С. Анализ частоты выявления ВПЧ у женщин с пред-раком и раком шейки матки, проживающих в Челябинской области / О.С. Абрамовских, И.Ю. Орнер, Л.Ф. Телешева, К.В. Никушкина, М.А. Беренда // Генодиагностика инфекционных заболеваний: сб. тр. / под ред. В.И. Покровского. - М.: Универ. Книга; Пайс, 2007. - Т.З. - С.75-76.

6. Телешева, Л.Ф. Активность противоопухолевого иммунитета у жен-

щин с предраком и раком шейки матки, ассоциированном с вирусом папилломы человека, в Челябинской области / Л.Ф. Телешева, И.J1. Батурина, И.Ю. Орнер, О.С. Абрамовских, II Мед иммунология. - 2009. - Т.11, № 45. - С.438-439.

7. Батурина, И.Л. Изменение показателей местного иммунитетау женщин с местнораспространенными формами рака шейки матки, ассоциированного с вирусом папилломы человека (ВПЧ), до и после лечения / И.Л. Батурина, О.С. Абрамовских, И.Ю. Орнер, Л.Ф. Телешева, A.B. Жаров II Вест. Уральской мед. Академ. Науки. - 2009.- №1-/2. - С.74-76.

8. Летяева, О.И. Иммунологические особенности персистирующей папилломавирусной инфекции шейки матки / О.И. Летяева, О.С. Абрамовских, Л.Ф. Телешева, И.Ю. Орнер, И.Л. Батурина, М.А. Беренда II Вест. Уральской мед. Академ. Науки. - 2009,- №1-/2. - С.119-120.

9. Телешева, Л.Ф. Изменение апоптотической активности CD95+ клеток у женщин с заболеваниями шейки матки, ассоциированными с папилломавирусной инфекцией / Л.Ф. Телешева, И.Л. Батурина, И.Ю. Орнер, О.С. Абрамовских // "X Международный конгресс Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии": сб. тр. - Казань, 2009. - с.210.

10. Батурина, И.Л. Возрастные особенности развития местнораспрост-раненных форм рака шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией / И.Л. Батурина, И.Ю. Орнер, A.B. Жаров, Л.Ф. Телешева, О.С. Абрамовских, // Научно-практическая конферненция с международным участием "Совершенствование медицинской помощи при онкологических заболеваниях, включая актуальные проблемы детской гематологии и онкологии. Национальная онкологическая программа": VII съезд онкологов России:сб. материалов. - М„ 2009. - Т.Н. - С. 43.

11. Абрамовских, О.С. Инновационный подход к диагностике папилломавирусной инфекции урогенитального тракта женщин Челябинской области / О.С. Абрамовских, М.А. Беренда Л.Ф. Телешева, И.Ю. Орнер, И.Л. Батурина II Оптимизация высшего медицинского и фармакологического образовании: менеджмент качества и инновации: материалы I науч.-практ. конф. - Челябинск: Изд-во ЧелГМА, 2010. - С.11-13.

12. Телешева, Л.Ф. Антиген плоскоклеточной карциномы в ранней диагностике рака шейки матки / Л.Ф. Телешева, И.Ю. Орнер, И.Л. Батурина, A.B. Жаров, О.С. Абрамовских, К.В. Никушкина II Уральский мед. журн. -2010.-№ 03(68).-С.81-83.

13. Абрамовских, О.С. Оптимизация диагностики папилломавирусной инфекции в Челябинской области / О.С. Абрамовских, М.А. Зотова, Л.Ф. Телешева, И.Ю. Орнер, И.Л. Батурина, А.Н. Ахматова, К.В. Никушкина, Л.Г. Хав-люк // Материалы Российской научно-практической конференции "Стратегия развития онкорадиологической службы в регионах РФ". - Челябинск, 2010. -С.5-6.

14. Батурина, И.Л. Определение уровня экспрессии антигена плоскоклеточной карциномы в сыворотке крови и его взаимосвязь с показателями Т-клеточного звена иммунитета у пацменток местнораспространенными фор-

мами рака шейки матки / И.Л. Батурина, И.Ю. Орнер, О.С. Абрамовских, Л.Ф. Телешева, A.B. Жаров, М.А. Зотова, К.В. Никушкина // Материалы Российской научно-практической конференции "Стратегия развития онкорадиологичес-кой службы в регионах РФ". - Челябинск, 2010. - С.7-9.

15. Орнер, И.Ю Антиген плоскоклеточной карциномы в диагностике рака шейки матки / И.Ю. Орнер, И.Л. Батурина, О.С. Абрамовских Л.Ф. Телешева, М.А. Зотова // Материалы российской научно-практической конференции "Стратегия развития онкорадиологической службы в регионах РФ" - Челябинск, 2010.-С.91-92.

16. Абрамовских, О.С. Цитокиновый профиль цервикальной слизи у женщин с латентной папилломавирусной инфекцией / О.С. Абрамовских, М.А. Зотова, В.Ф. Долгушина, А.Н. Ахматова, Л.Ф. Телешева, И.Ю. Орнер, Е.А. Мезенцева// Вестн.Уральской мед. Академ. Науки. -2010. - № 2/1(29). -С.85.

17. Абрамовских, О.С. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови при неопластической патологии шейки матки, ассоциированной с вирусом папилломы / О.С. Абрамовских, И.Ю. Орнер, М.А. Зотова, И.Л. Батурина, Л.Ф. Телешева, К.В. Никушкина, Л.Ф. Чернова // Вестн. Уральской мед. Академ. Науки. - 2010. - № 2/1(29). - С.86.

18. Батурина, И.Л. Сопоставление показателей Т-клеточного звена иммунитета и содержание антигена плоскоклеточной карциномы в сыворотке крови у пациенток с местнораслространенными формами рака шейки матки / И.Л. Батурина, И.Ю. Орнер, О.С. Абрамовских, Л.Ф. Телешева, A.B. Жаров, К.В. Никушкина II Мед иммунология. - 2010. - Т.12, № 45. - С.387-392.

19. Орнер, И.Ю. Сравнительный анализ иммунологических показателей периферической крови у пациенток с тяжелой дисплазией и раком

На правах рукописи

Орнер Ирина Юрьевна

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПРИ ПРОГРЕССИРОВАНИИ ОПУХОЛЕВОЙ ПАТОЛОГИИ ШЕЙКИ МАТКИ, АССОЦИИРОВАННОЙ С ВИРУСОМ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология 14.01.12 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск-2010

Отпечатано в типографии BNL. Подписано в печать 17.11.10 г. Формат 60x84 Vie. Гарнитура Arial Суг. Бумага офсетная. Печать на ризографе. Объем 1 усл. п.л. Тираж 100 экз.

Актуальность проблемы

Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека (ВПЧ), привлекают внимание различных специалистов в связи с резким ростом инфицированности населения данным возбудителем, значительной его контагиозностью и способностью вызывать злокачественную патологию. Ежегодно диагностируется около 500 ООО новых случаев рака шейки матки (PLIIM), из них почти половина (234 ООО) заканчивается летально (ВОЗ, 2005). Считают, что доля рака шейки матки среди всей злокачественной патологии у женщин трудоспособного возраста составляет 12% (Евстигнеева Н.П., Кубанов A.A., Гомберг М.А., 2006).

В общей структуре заболеваемости органов репродуктивной системы у женщин России рак шейки матки (РШМ) занимает 3-е место после рака молочной железы и рака тела матки. Ежегодно регистрируется около 12000 вновь заболевших и умирает около 6000 женщин. Оценивая современное состояние и перспективы онкологической заболеваемости в России, многие онкологи отмечают существенный рост показателей запущенности РШМ (Максимов С .Я., Гусейнов К.А., 2004). Удельный вес больных РШМ III-IV стадиями в 2008г. составлял 48,3%.Кроме того, в последнее десятилетие четко прослеживается увеличение заболеваемости у молодых женщин до 40 лет. Особенно заметно повышение заболеваемости РШМ у женщин до 29 лет - ежегодный прирост составляет 2,1% (Давыдов И.И., Аксель Е. М., 2002; Чиссов В.И, 2008, 2009; Шакирова Э.Ж., 2007).

Несмотря на существование в настоящее время четкой концепции о фоновых, предраковых процессах и РШМ, достаточно надежного тестового контроля (цитологический, кольпоскопический), РШМ до настоящего времени остается одной из важнейших проблем онкогинекологии (Харитонова Т.В., 2002).

На сегодняшний момент ВПЧ считается инициирующим фактором в генезе РШМ. ПВИ (папилломавирусная инфекция) чрезвычайно сложна для диагностики и терапищ так как требует длительного обследования и лечения половых, партнеров. Особенно сложна для диагностики латентная форма 11ВИ, при которой морфологических изменений в, ткани не выявляют. (Кузнецова Ю.Н., 2006; Минкина Т.Н. и др., 1982, 2001). Более чем у 15% женщин ВПН обнаруживается в эпителии шейки матки, хотя клиническая симптоматика заболевания-отсутствует (Bosch F.X. et al., 1994).,

Известно, что только? у незначительной/ части женщин, инфицированных ВГТЧ, развивается рак шейки матки, поэтому существуют факторы или кофакторы, способствующие злокачественному прогрессированию опухоли (Аполихина И. А., 2002). К кофакторам, относят генетические факторы, способные* модулировать эффект ВПЧ, иммуносупрессию^ эндогенные гормональные'факторы (Bosch F. et al., 1994, 1995, 1997; Syrjänen К., 2008): У женщин с нормальной работой механизмов контроля, над пролиферацией; происходят дегенерация и последующее отторжение поврежденных клеток. При нарушении механизмов контроля, тесно связанных с/ иммуносупрессией, инфекция прогрессирует, и развиваются субклиническая, а затем и- клиническая стадии заболевания (Sillman F., Stanek А., Sedlis F. et al., 1984); При: восстановлении нарушенных механизмов .регрессия неопластического процесса может, произойти на любом этапе канцерогенеза (Роговская С. И:, 2005). Большое значение в противостоянии организма вирусным инфекциям придается иммунекомпетентным клеткам и гуморальным факторам, действующим на системном и локальном уровнях. Поскольку ВГТЧ эпителиотропен^ важное значение имеет состояние системы местной защиты органов-репродуктивной системы (Роговская С.И., Кулаков В. И. 2003).

Местная' защита. половой сферы женщины- обусловлена ее анатомическими и физиологическими особенностями, наличием нормальной микрофлоры, гуморальных и клеточных факторов иммунитета (Долгушина

В.Ф., 1991; Медведев Б.И., Коваленко B.JI и др., 2001).

Секреты слизистых репродуктивного тракта женщин играют важную роль в функционировании локального иммунного комплекса (Долгушин И.И., Долгушина В.Ф. и др., 1997; Дергачева Т.И., Юкляева Н.В. и др., 1999). Состав секретов представлен достаточно широким спектром иммунологических факторов, которые представляют собой уникальную иммунологическую среду со своими количественными и качественными характеристиками (Медведев Б.И., Долгушина В.Ф., 1993).

Сведения об изменениях показателей клеточного и гуморального звеньев иммунитета при ПВИ и отдельных стадиях канцерогенеза прослеживаются в работах многих авторов (Аполихина И. А., 2002; Кулаков В. И., 2004; Прилепская В.Н., 2007; Роговская С.И., 2008; Сухих Г.Т., 1997; Bais A.G., 2005; Manickam А., 2007; Patel S., 2009 и др.). Предпринимаются попытки установить влияние этиологического агента на иммунопатогенез неопластического процесса. Несмотря на это, особенности иммунологического статуса при различных стадиях РШМ остаются неизученными. Существующие по этому вопросу данные разрозненны и противоречивы. Поэтому процесс изучения закономерностей и механизмов взаимодействия иммунной системы с вирусами и пораженными ими клетками продолжается. С пониманием роли различных иммунных факторов в процессе канцерогенеза, ассоциированного с ВПЧ, связывают разработку в будущем принципов его регуляции и оптимизации диагностики РШМ.

Цель исследования

Установление особенностей показателей системного, местного иммунитета, сравнение уровней антигена плоскоклеточной карциномы (SCCA) в зависимости от стадии неопластического процесса шейки матки, ассоциированного с вирусом папилломы человека и обоснование возможности использования иммунологических показателей для уточняющей диагностики тяжелой дисплазии и рака шейки матки.

Задачи исследования

1. Оценить состояние системного иммунитета и сравнить уровни антигена плоскоклеточной карциномы у женщин с ЦИН III и различными стадиями рака шейки матки, ассоциированными с вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска.

2. Изучить иммунологические показатели цервикального секрета у женщин с ЦИН III и различными стадиями рака шейки матки, ассоциированными с вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска.

3. Определить взаимосвязи между иммунологическими показателями системного, местного иммунитета и уровнями антигена плоскоклеточной карциномы у женщин с ЦИН III и различными стадиями рака шейки матки, ассоциированными с вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска.

4. Разработать иммунологические критерии для уточняющей диагностики ЦИН III и рака шейки матки, ЦИН III и различными стадиями рака шейки матки, ассоциированными с вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска.

Научная новизна

Согласно поставленным задачам, в результате проведенного комплексного исследования системного и местного иммунитета у больных тяжелой дисплазией и РШМ выявлены изменения иммунного статуса, связанные с прогрессией опухолевой патологии.

Независимо от стадии неопластического процесса шейки матки выявлены однонаправленные изменения факторов системного иммунитета: приток лимфопоэтических клеток-предшественников (CD 10+), снижение общего числа Т-лимфоцитов, CD4+ и NK-клеток крови и изменения цитокинового профиля периферической крови. Обнаружены выраженные изменения в системе локальной иммунной защиты: повышение общего количества лейкоцитов, угнетение внутриклеточного кислородозависимого метаболизма и резерва бактерицидной функции нейтрофилов, усиление лизосомальной активности, а также снижение активности и интенсивности фагоцитоза, изменение показателей гуморального иммунитета и цитокинового профиля цервикальной слизи.

Подтверждено, что уровни SCCA до начала лечения зависят от стадии заболевания, и установлено, что уровень SCCA значительно возрастает у больных PLLIM I стадии относительно показателя группы больных Cr. in situ. Обнаружены корреляционные взаимосвязи между уровнями SCCA у обследуемых женщин и показателями системного и местного иммунитета, подтверждающие сопричастность данного гликопротеина к иммунологическим процессам и, следовательно, значимость онкомаркера для диагностики РШМ.

Выявлены особенности иммунного статуса, характерные для определенной стадии заболевания:

1. У больных ЦИНIII выявлено увеличение относительного количества лимфоцитов при относительном уменьшении нейтрофильной составляющей лейкоцитов крови, наблюдается приток CD56+ клеток и увеличение CD25+ лимфоцитов, повышение общего количества лейкоцитов и лизосомальной активности нейтрофилов, снижение показателей НСТ-теста, активности и интенсивности фагоцитоза, повышение уровня slgA, изменение цитокинового профиля периферической крови и цервикальной слизи.

2. У женщин с Cr. in situ выявлено сокращение субпопуляций CD3+, CD4+, CD25+ лимфоцитов, снижение CD95+, CD 16+, CD56+ клеток и соотношения CD4+/ CD8+ и повышение уровня ИЛ-10 в сыворотке крови. В системе локальной защиты обнаружено снижение количества жизнеспособных нейтрофилов и повышение уровней ИНФ-а и ИЛ-4 цервикальной слизи.

3. У больных РШМ I стадии выявлено увеличение относительного числа HLA-DR+ лимфоцитов и снижение продукции ИНФ-а и IgM крови, со стороны местного иммунитета - снижение уровня IgM, повышение уровня IgG и рост концентрации ИЛ-2 цервикальной слизи.

4. У женщин с РШМ II-III стадий обнаружено снижение количества HLA-DR+ и CDllb+ лимфоцитов, рост уровней ИНФ-у, ИЛ-2 и ИЛ-10 периферической крови, также выявлено повышение общего количества лейкоцитов, уровней IgM, IgG и рост концентраций ИЛ-4 и ИЛ-10 цервикальной слизи.

Выявлено изменение числа и характера корреляционных взаимосвязей между показателями системного и местного иммунитета при тяжелой дисплазии и РШМ, отражающее нарушение регуляции механизмов противовирусной и противоопухолевой защиты и доказывающее перенапряженность функционирования иммунной системы в ответ на прогрессирование опухолевой патологии.

На основании особенностей проведенного иммунологического исследования и анализа взаимосвязей внутригрупповых иммунологических показателей с помощью дискриминантного метода математического анализа разработан способ дифференциальной диагностики тяжелой дисплазии и PUIM, ассоциированных с ВПЧ ВКР.

Практическая и теоретическая значимость

Полученные сведения об изменении и взаимосвязях иммунологических существенно расширяют представление об особенностях иммунного статуса больных при прогрессировании опухолевой патологии шейки матки. Разработанная математическая модель, построенная на основании иммунологических показателей системного и местного иммунитета, позволяет использовать её как дополнительный метод, применяемый для дифференциальной диагностики ранних стадий рака шейки матки, ассоциированных с ВПЧ ВКР, с достаточно высокой точностью.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При НИН III и раке шейки матки регистрируются изменения всех звеньев системного иммунитета, характер которых зависит от стадии неопластического процесса. Уровень SCCA до начала лечения рака шейки матки зависит от стадии заболевания.

2. Выявлены выраженные изменения иммунологических показателей цервикальной слизи у женщин с ЦИН III и различными стадиями рака шейки матки, ассоциированными с вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска.

3. Прогрессировать опухолевой патологии шейки матки сопровождается не только изменением показателей системного и местного иммунитета, но и изменением взаимосвязей между ними.

4. Выявленные изменения иммунологических показателей периферической крови и цервикальной слизи позволяют сформулировать иммунологические дифференциально-диагностические критерии ранних стадий неопластического процесса шейки матки.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследований внедрены в клиническую практику ГЛПУ ЧОКОД, в лабораторную диагностику НИИ иммунологии ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава и в педагогическую практику кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы на 1-ом Российско-Чешском медицинском форуме (Челябинск, 2006), на научно-практической конференции «Репродуктивное женское здоровье. ВПЧ инфекция» (Челябинск, 2007), на X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009), на Российской научно-практической конференции «Стратегия развития онкорадиологической службы в регионах РФ» (Челябинск, 2010). По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе 8 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего работы 129 отечественных и 88 иностранных авторов. Диссертация изложена на 165 страницах компьютерного текста и включает 28 таблиц.

ВЫВОДЫ

1, У больных цервикальной интраэпителиальной неоплазией III и, раком шейки5 матки преобладает 16 генотип; вируса папилломы человека в составе моно- и микст инфекции. На всех стадиях прогрессии^ опухолевой патологии шейки, матки доминирует моноинфекция вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска.

2. Независимо- от стадии неопластического процесса5 шейки» матки, ассоциированного с ВПЧ. наблюдаются однонаправленные изменения факторов системного иммунитета:, приток лимфопоэтических клеток-предшественников (СШ0+), снижение общего числа Т-лимфоцитов, CD4+ и NK-клеток крови, повышение уровней ИНФ-а, ИНФ-у, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 и снижение уровня ФНО-а в сыворотке крови. 3. Для. всех стадий опухолевой прогрессии шейки матки характерны однонаправленные изменения в системе локальной иммунной защиты: повышение общего количества лейкоцитов, угнетение внутриклеточного кислородозависимого метаболизма и резерва бактерицидной функции-нейтрофилов, усиление лизосомальной активности, снижение активности, и интенсивности фагоцитоза нейтрофилов цервикальной" слизи,г повышение уровня slg А- и выраженное снижение уровней ИНФ-а. и ФНО-а при росте концентраций ИНФ-у, ИЛ-2, ИЛ-10 цервикальной слизи.

4. У больных цервикальной интраэпителиальной неоплазией III в отличии от пациенток с латентной папилломавирусной инфекцией отмечается увеличение относительного количества ' лимфоцитов при снижении процентного содержания нейтрофилов периферической крови. Наблюдается увеличение числа CD56+ и CD25+ клеток. Изменения цитокинового профиля сыворотки крови характеризуются повышением содержания ИНФ-а, ИЛ-10 и снижением ФНО-а. Показатели местного иммунитета отличает повышение общего количества лейкоцитов и лизосомальной активности нейтрофилов, снижение показателей НСТ-теста, активности и интенсивности фагоцитоза; повышается уровень slg А и снижаются уровни ИНФ-а и ФНО-а при росте концентраций ИНФ-у, ИЛ-2, ИЛ-10 в цервикальной слизи.

5. При Cancer in situ в отличии от цервикальной интраэпителиальной неоплазии III наблюдается сокращение субпопуляций CD3+, CD4+, CD25+ лимфоцитов, снижение CD95+, CD16+, CD56+ клеток и соотношения CD4+/ CD8+, и повышается уровень ИЛ-10 в сыворотке крови. В системе локальной защиты происходит снижение количества жизнеспособных нейтрофилов и повышение уровней ИНФ-а и ИЛ-4 цервикальной слизи.

6. У больных РШМ I стадии по сравнению с пациентками с Cancer in situ выявлены увеличение относительного числа HLA-DR+ лимфоцитов и снижение концентраций ИНФ-а и IgM крови. Показатели местного иммунитета отличает снижение уровня IgM, повышение уровня IgG и рост концентрации ИЛ-2 цервикальной слизи.

7. Отличительной особенностью, „рака шейки матки П-Щ стадий относительно I стадии являются снижение количества HLA-DR+ и CDllb+ лимфоцитов, рост уровней ИНФ-у, ИЛ-2 и ИЛ-10 крови. Показатели цервикальной слизи характеризуются повышением общего количества лейкоцитов, уровней Ig М, Ig G и ростом концентраций ИЛ-4 и ИЛ-10.

8. Концентрация SCCA до начала лечения зависит от стадии заболевания. Выраженное повышение уровней онкомаркера наблюдается при раке шейки матки I-III стадий. Выявленные взаимосвязи между уровнями SCCA pi иммунологическими показателями характеризуются при цервикальной интраэпителиальной неоплазии III — прямой связью между уровнем онкомаркера и относительным числом CD11+ лимфоцитов крови, при Cancer in situ - обратной связью между уровнем SCCA и уровнем ИЛ-2 крови, при раке шейки матки I стадии - прямой связью с процентным содержанием HLA-DR+ лимфоцитов.

9. Математическая модель, разработанная на основании дискриминантного анализа иммунологических показателей периферической крови и цервикальной слизи, позволяет проводить дифференциальную диагностику между ЦИН III и Cr. in situ с точностью 87,5%, между Cr. in situ и РШМ I стадии с точностью до 90 %.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При комплексном обследовании женщин с ЦИН и РШМ рекомендуется определять наличие ДНК вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска в соскобах из цервикального канала с помощью метода ПЦР.

2. При обследовании женщин с установленным диагнозом ЦИН III и Cr. in situ, ассоциированных с ВПЧ ВКР, целесообразно применять иммунологическое исследование цервикальной слизи и периферической крови с использованием показателей, входящих в математическую модель, для дополнительной дифференциальной диагностики ЦИН III, Cr. in situ и РШМ I стадии.

Для дифференциального диагноза между ЦИН III и Cr. in situ: содержание CD10, CD 20, CD25, лимфоцитов и уровень ИЛ-10 периферической крови; функциональный резерв нейтрофилов, уровни ИНФ-у, и ФНО-а, цервикальной слизи:

F(xl) = - 15,671 x CD10 + 13,993 x CD20 - 15,035 x CD25 + 0,488 x ФРНС + 0,

633 x ИЛ-10К + 0,1 x ИНФ-у С - 0,081 x ФНО-аС - 4,786 Если значение дискриминатнтной функции F(xl) больше 0, то больную необходимо отнести к группе с Cr. in situ, если меньше, то к группе с ЦИН III.

Для дифференциального диагноза между Cr. in situ и РШМ I стадии: уровни SCCA, IgG, ИНФ-а, и ФНО-а, периферической крови. F(x2) = 0,620 х SCCA - 0,285 х IgGK - 0,372 х ИНФ-аК + 1,854 х фНО-аК + 5,653

Если значение дискриминатнтной функции F(x2) больше 0, то больную необходимо отнести к группе с РШМ I, если меньше, то к группе с Cr. in situ.