Автореферат и диссертация по медицине (14.00.06) на тему:Анализ экспрессии генов в миокарде предсердия пациентов с фибрилляцией предсердий

На правах рукописи

Харлап Мария Сергеевна

АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В МИОКАРДЕ ПРЕДСЕРДИЯ У ПАЦИЕНТОВ С ФИБРИЛЛЯЦИЕЙ ПРЕДСЕРДИЙ ПО ДАННЫМ МЕТОДА кДНК ТРАНСКРИПЦИОННЫХ МАТРИЦ

14.00.06 — Кардиология 03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА 2008

Работа выполнена в ОКЭФ и ОССХ НИИ клинической кардиологии им. А. Л. Мяс-никова и в Лаборатории генной инженерии НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росмед-технологий.

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор Голицын Сергей Павлович

кандидат физико-математических наук Бибилашвили Роберт Шалвович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Панченко Елизавета Павловна

доктор медицинских наук,

профессор Ижевская Вера Леонидовна

Ведущая организация — ГОУ ВПО Российский Государственный Медицинский Университет им Н.И. Пирогова МЗ и СР РФ.

Защита состоится ^'CttCtQ^tX^ 2008 года в 13.00 часов на заседании Диссертационного Совета по присуждению ученой степени кандидата медицинских наук (Д 208.073.04) в ФГУ РКНПК Росмедтехнологий (121552, Москва, ул 3-я Черепковская. 15А).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ Российского Кардиологического научно-производственного комплекса Росмедтехнологий.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного Совета,

кандидат медицинских наук

Т. Ю. Полевая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Повышенный интерес к исследованию фибрилляции предсердий (ФП) определяется клинической значимостью этого заболевания, как наиболее часто встречаемой формы нарушения ритма сердца (IIPC), распространенность которой приближается к эпидемическим пропорциям [Nattel S., 2005; Heeringa J., 2006].

Недостаточная эффективность лечебных мероприятий rio предотвращению эпизодов ФП и удержанию синусового ритма сердца (CP) в определенной мере объясняется не совсем полным пониманием молекулярной патофизиологии этого заболевания [Brugada R., 2005]. Последние 15 лег исследования молекулярных основ ФП были сфокусированы па трех основных направлениях: изучение структуры и функции ионных каналов; поиск мутаций, а также изучение особенностей экспрессии генов [Brugada R., 2005]. Определено понятие «ионного ремоделирования», как основы «электрического ремоделирования» предсердия при ФП — одного нз ведущих патофизиологических механизмов се развития и самоподдержания [Yue L., 1999; van der Velden II. M. W., 2000]. ФП, как на фоне структурного заболевания сердца, так и сама по себе нарушает архитектонику предсердия, приводя к его «структурному ремодели-ровашно» [Ausma J , 2000, 2003; Schoonderwoerd В. Л., 2005]. При изучении экспрессии генов при ФП было выявлено, что в основе этих процессов лежат структурные и функциональные изменения белков, участвующих в кальциевом обмене [Brundel B.J , 1999, Lai L P, 1999], формировании соединительной ткани [Goette А., 2000], межклеточном взаимодействии [van der Velden Н. М. W., 1998, 2000] и сигнальных системах [Arndt М„ 2002], последние обеспечивают динамическое взаимодействие между экстраклеточной и внутриклеточной средой.

Исследования, направленные на изучение молекулярных основ ремоделирования предсердия при ФП на основании анализа экспрессии генов в предсердии с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), на первом этапе строились по принципу тестирования гипотез участия отдельных групп генов в патогенезе заболевания [Dobrev D., 2001; Brundel В. J., 1999, 2001, 2002; Goette А., 2002]. В настоящее время для оценки регуляторных взаимосвязей при ФП появилась возможность мультигенного скрининга с помощью метода транскрипционных матриц, позволяющего одномоментно исследовать уровень экспрессии нескольких тысяч генов в одном образце ткани [Hess К. R., 2001; Panda S., 2003; Stratowa С., 2003J, что уже используется для изучения атеросклероза [Hiltunen М. 0.1999; Haley K.J., 2001], недостаточности кровообращения (НК) [Steenman М., 2003], кардиомиопатий [HvvangJ. J., 2002].

В связи с этим целью настоящего исследования явилось: определение уровня экспрессии генов в миокарде ушка правого предсердия (УПП) методом кДНК транскрипционных матриц для выявления генов, активность которых коррелирует с ФП.

1. Сформировать группы сравнения из образцов ткани УПП, полученных в ходе стандартного этапа хирургического вмешательства у пациентов со структурными заболеваниями сердца с постоянной или пароксизмальной формой ФП и СР, а также группы контроля, состоящей из аутоисийных образцов ткани УПП, полученных от лиц, не имеющих органических изменений сердечно-сосудистой системы по данным патолого-анатомического исследования.

Задачи исследования

2. Исследовать уровень экспрессии генов в каждом образце ткани УПП пациентов с ФП и СР и аутопсийных образцах методом кДНК транскрипционных матриц.

3. Осуществить выбор генов-кандидатов, коррелирующих с клиническими признаками (ритм сердца - пароксизмальная, постоянная форма ФП, СР; характер основного заболевания — ишемнческая болезнь сердца (ИБС), пороки сердца ревматической этиологии, дисплазия соединительной ткани) с применением методов математического анализа при обработке гибридизационных данных.

А. Определить соотношение уровней мРНК дифференциально экспрессирующих-ся генов методом сопряженной обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-Г1ЦР) для верификации полученных данных. 5. Сформулировать представление о возможном участии генов с измененным уровнем экспрессии, высоко коррелирующих с ФП, в молекулярных механизмах данного НРС у человека

Научная новизна

Для изучения экспрессии генов у больных с ФП применен метод кДНК транскрипционных матриц и проведен корреляционный анализ уровня мРНК в ткани УПП с клиническими признаками. Определены гены, экспрессия которых меняется при ФП. Высоко коррелирующие с ФП гены принадлежат к разным функциональным семействам: регуляторам транскрипции, передачи межклеточного и внутриклеточного сигнала, кальциевого гомеостаза, окислительного стресса, организации сократительного аппарата кардиомиоцнта, апоптоза, иммунного ответа. Выявленные различия в уровне экспрессии генов при ФП по сравнению с СР дают основания для построения гипотетической регуляториой цепи, индуцируемой ФГ1 и предрасполагающей к ее самоподдержанию. В эту цепь, помимо элементов, связанных с дезорганизацией сарколеммы и нарушением кальциевого гомеостаза, в качестве ключевых элементов могут входить впервые выявленные в данном исследовании дифференциально экспрессирующиеся при ФП гены — металлотионеин (МТ1/2), митохондриальная альдегиддегидрогена-за 2 (Л1.0П2), которые предопределяют высокий окислительный потенциал клеток; а также — сердечный и мышечный ЛИМ-доменные белки (СБЯРЗ, РНЬ2), чувствительные к окислительному потенциалу, участвующие в формировании ключевых элементов сарколеммы, и — транскрипционные факторы (БОХЗ, ЕОК.1), газ-подобный белок (11АР1 А), определяющие биосинтез и состояние сократительного аппарата кар-диомиоцитов.

Практическая значимость

Полученные результаты намечают пути поиска новых подходов к медикаментозному и, возможно, другим средствам противоаритмического лечения ФП. Предполагаемыми молекулярными мишенями могут явиться белки, принимающие участие в формировании соединительной ткани, воспалительном процессе, окислительном стрессе для предотвращения патологического структурного ремоделирования предсердия и снижения риска рецидивирования ФП.

Внедрение

Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу НИИ кардиологии им. А. Л. Мясникова и Института экспериментальной кардиологии ФГУ Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росмедтехно-логий.

Апробация диссертации состоялась 13 июня 2008 года па межотделенческой конференции Института клинической кардиологии им. Л. Л. Мясникова и Института экспериментальной кардиологии ФГУ Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росмедтехнологий.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Материалы диссертации доложены на: IV Российско-американском симпозиуме по проблемам нарушений ритма сердца (Санкт-Петербург, 2003 г.); Международном конгрессе но электрофизиологии и кардиостимуляции (Санкт-Петербург, 2004 г.) — доклад получил 1 премию на конкурсе молодых ученых; Международном конгрессе «Cardiostim 2004»(Пицца, Франция, 2004 г.); Росснйско-Казахской научно-практической конференции (Астана, 2004 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Перспективы развития кардиологии и внедрение новых методов диагностики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний» (Москва, 2004 г.): I Общероссийском Съезде, V ежегодной конференции общества специалистов по сердечной недостаточности (Москва, 2004 г.); Объединенном Московско-Берлинском Симпозиуме по Клинической Кардиологии (Москва, 2005 г.); Симпозиуме «Cell Signaling World 2006. Signal Transduction Pathways as therapeutic targets» (Люксембург, 2006 г.); Всемирном Конгрессе кардиологов 2008 г. (Буэнос-Айрес, Аргентина, 2008 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Прогресс кардиологии и снижение сердечно-сосудистой смертности» (Москва, 2008 г.).

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, 2 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка цитируемой литературы, который включает 275 источников. Работа изложена на /S<? страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 16 рисунков.

Материал и методы

Образцы ткани. Образцы ткани УПП были взяты у 52 пациентов (32 — с ФП и 20 -с CP) в ходе планового оперативного вмешательства. Взятие образца ткани УПП у пациентов проводилось при канюляции правого предсердия для подключения к аппарату искусственного кровообращения в ходе стандартного этапа операции — аорто -коронарного шунтирования или протезирования митрального клапана. Немедленно после взятия материала образцы ткани УПП погружались в жидкий азот, замораживались и хранились в холодильной камере при температуре -80° С до выделения РНК. Особенности техники канюляции определяют забор целостной ткани миокарда УПП, что подтверждено при проведении гистологического исследования. Срезы ткани УПП окрашивали гематоксилин-эозином и гистологические препараты изучались с помощью световой микроскопии. В исследование включены также 11 аутонсийных образцов ткани УПП, полученных не более чем через 4 часа от момента смерти лиц, погибших от несчастного случая, не имевших органических изменений сердечно-сосудистой системы по данным патолого-анатомнческого исследования. С целью нивелирования возможных погрешностей метода, для получения усредненных значений уровня экспрессии исследуемых генов, была создана дополнительная группа контроля — пули-рованная норма, которая состояла из аутопсийных образцов 68 УПП, полученных также от лиц, смерть которых наступила от несчастных случаев, без органической сер-

дечно-сосудистой патологии по данным вскрытия (52 мужчин и 16 женщин, в возрасте от 38 до 65 лет). Материал предоставлен Лабораторией генной инженерии Института экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК и судебно-медицннским моргом г. Москвы. Все исследования, связанные с образцами ткани, выполнялись на основании разрешения Этического комитета ФГУ РКНПК Росмедтехнологий.

Пациенты. До оперативного лечения обследование проводилось с применением комплекса лабораторных и инструментальных методов (ЭКГ-12, Холтеровское моик-торирование ЭКГ, эхокардиография, коронароангиография, ультразвуковое исследование экстракраниалышх артерий и щитовидной железы). У всех пациентов определяли уровень гормонов щитовидной железы, содержание сахара, холестерина и липидов в крови. Из 32 пациентов с ФП (возраст 41-68 лет, 18 мужчин и 14 женщин) 15 — с тяжелым или критическим митральным стенозом ревматической этиологии, 2-е недостаточностью митрального клапана III—IV степени, 7 — с дисплази-ей соединительной ткани с формированием митрального порока сердца — пролапсом митрального клапана с регургитацией III—IV" степени, 4 пациента были с доброкачественной внутрисердечной опухолью — миксомой. По данным анамнеза, результатам предшествующего обследования 9 больных с ревматическим пороком сердца имели клинические признаки НК, в связи с чем им на протяжении от 1 до 3 лет проводилась комплексная медикаментозная терапия, включающая мочегонные препараты, сердечные гликозиды, ингибиторы АПФ. У 6 больных ФП развилась на фоне ишемической болезни сердца (ИБС) не менее чем с 3-х сосудистым поражением коронарных артерий с тяжелой степенью стенозирования, с субтотальным стенозом, либо с окклюзией одной из артерий. Постинфарктный кардиосклероз диагностирован у 3 из них, гипертоническая болезнь с максимальными цифрами ЛД не более 160/100 мм. рт. ст. — у 2 больных. Пароксизмальная форма ФП наблюдалась у 18 из 32 больных. Частота рецидивирования варьировала от 1 раза в неделю до 16 раз в месяц, а продолжительность каждого приступа — от 1 часа до 2-х суток. Длительность анамнеза пароксиз-мальной ФП составляла от 2-х месяцев до 10 лет. У 14 из 32 больных документирована постоянная форма ФП длительностью от 1 года до 12 лет до оперативного лечения. С целью контроля частоты ритма им назначалась терапия ß-адреноблокаторами и сердечными гликозидами. Группа пациентов с СР сердца и отсутствием в анамнезе документированных НРС, в том числе ФП, состояла из 20 пациентов, 18 — мужского и 2 женского пола в возрасте от 40 до 69 лет. ИБС, не менее чем с 3-х сосудистым поражением коронарных артерий с тяжелой степенью стенозирования с субтотальным стенозом, либо с окклюзией одной из коронарных артерий была диагностирована у 16 из них, постинфарктный кардиосклероз имел место в 11 случаях. Анамнез ИБС с типичными приступами стенокардии составлял от 0.5 до 5 лет. Гипертоническая болезнь с АД не более 160/100 мм рт. ст. наблюдалась у 2 пациентов. В данную группу вошли также 4 пациента с пороками клапанов сердца, 2 из них — с тяжелым ревматическим митральным стенозом, 2-е дисплазией митрального клапана с развитием недостаточности III—IV- степени. Критериями исключения из исследования явились клинические признаки декомпенсации НК на момент оперативного лечения, изменения уровня гормонов щитовидной железы, злокачественная артериальная гипертензия, сахарный диабет, перенесенный инфаркт миокарда за 6 месяцев до оперативного лечения. Из предоперационной терапии исключался антиаритмический препарат III класса — амиодарон.

Для проведения гибридизационных экспериментов были сформированы группы в соответствии с клиническими данными (далее «признаки»): пол, основной диа-

гноз (ИБС, пороки сердца — ревматический митральный порок, дисплазия соединительной ткани с ПМК), отсутствие или наличие ФП, форма ФИ - пароксизмальная (пароксизм. ФП) или постоянная (пост. ФП), наличие НК.

Всего сформировано 12 групп, сопоставимых по полу и возрасту (табл. 1).

Таблица 1. Характеристика групп образцов для гибридизационных экспериментов с

ранжированием по клиническим признакам

Группа больных п Возраст Пол Ритм сердца ИБС Пороки сердца Ревматизм НК

G1 4 57±6,5 ж/-1 Пароксизм ФП/1 -/0 +/1 +/1 -/0

G2 2 580 м/1 Пароксизм ФП/1 +/1 +/1

G3 2 52,0±3,0 м/1 СР/0 -70 +/1 +/1 -/0

G4 4 54,0±6,0 м/1 Пост ФП/2 -70 +/1 +/1 +/1

G5 2 62,5+4,5 м/1 Пост ФП/2 -70 +/1 -/0

G6 3 55,7±7,1 м/1 Пост. ФП/2 -/0 +/1 +/1 +/2

G7 4 55,3±7,3 м/1 СР/0 +/1 -/0 -70 -70

G3 7 58,9±6,2 м/1 СР/0 + ПИ КС/2 -70

G9 9 33,0+15,0 м/1 СР/0 -V0 -70 -70

G10 2 59,0+3,0 м/1 Пароксизм ФП/1 -/0 +/1 -70 -70

G11 2 50,5+0,5 Ж/-1 Пароксизм ФП/1 -70 +/1 -J0 -70

G12 2 64,5±0,5 м/1 Пароксизм ФП/1 +/1 -10 -70 -/0

п — количество пациентов в группе +/--наличие или отсутствие клинического признака Цифры 0,1, -1,2 — обозначают ранг признака

Молекулярно-биологические методы исследования

Выделение РНК. Суммарную РНК из образцов ткани У П П выделяли стандартным фенол-хлороформ-гуанидинизотиоционатным методом и обрабатывали ДНКа-зой 1 («Roche Molecular Systems») в присутствии экзонуклеазы 1 («United States Bio-chemicals»). Качество РНК оценивали но соотношению интенсивности полос 28S и 18S рибосомных РНК после электрофореза в агарозном геле в денатурирующих условиях. Примесь геномной ДНК составляла не более 0.1%.

Синтез меченой кДНК и гибридизация с транскрипционными матрицами. Меченая кДНК была синтезирована в реакции обратной транскрипции из 3 мкг предварительно денатурированной суммарной РНК в 20 мкл смеси, содержащей 50 мМ Трис-НС1 буфер, pH 8,3, 75 мМ KCl, 5 мМ MgCl2,2,5 мкМ случайные девятинуклеотидные праймеры («Биосан», Новосибирск), 500 мкМ каждый из дезоксинуклеозндтрифос-фатов (дГТФ, дЦТФ, дТТФ), 5мкМ дАТФ, 50 мкКи [а - 32Р] дАТФ (4000 Ки/ммоль, ФГУП «Институт реакторных материалов», Россия), 5мМ дитиотрейтол; 100 единиц обратной транскриптазы из вируса лейкемии мышей Молони (MMLV) («Техно-ген», Россия). Реакцию вели в течение 1 часа при температуре 37°С и останавливали добавлением 1 мкл 0,1 M ЭДТА, pH 8,0. Меченую кДНК после очистки гельфильтра-цией на сефадексе G-50 денатурировали и гибридизовали с мембранами (транскрипционными матрицами) фирмы Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) в растворе, содержащем 50%-ный формамид «Sigma», 6-кратный солевой раствор (SSPE), 5-крат-

ный раствор Денхардта, 0,2% додецилсульфат натрия, 2 мг/мл гепарина и 0,5 мг/мл денатурированной ДНК спермы сельди, при 42°С в течение ночи в гибридизацион-ной камере фирмы «Amersham Pharmacia Biotech» с предварительной инкубацией мембран в гибридизационном растворе в течение 1 часа. После гибридизации мембраны отмывали как рекомендовано фирмой-производителем, экспонировали с экраном в течение 3-7 суток, сканировали в системе Phosphorlmager SI (Molecular Dynamics, USA) и полученные изображения оцифровывали с помощью программы Atlasimage 2.01(Clontcch).

Математическая обработка гибридизационных данных

Нормирование. Полученные результаты собирали в общую базу данных отдельно для каждого типа мембран, после вычитания фона подвергали предварительной нормировке на усредненную величину интенсивности сигналов мало варьирующих генов, включая гены «домашнего хозяйства». Список генов для нормировки был получен путем исключения всех сигналов, уровень которых был ниже утроенной величины среднего значения фона, а также всех сигналов, уровень которых был выше утроенного значения медианы всех сигналов, превышающих утроенный средний фон. Полученные таким образом данные повторно нормировали путем наложения кривых линейной регрессии. Для этого строили зависимости логарифмированных значений интенсивности сигналов от каждого гена для одной произвольно выбранной мембраны против соответствующих сигналов для другой мембраны. Варьируемыми параметрами служили аддитивный и мультипликативный факторы регрессии, эквивалентные по физическому смыслу вариации среднего фона мембран и степени чувствительности регистрации интенсивности сигнала на разных мембранах. Оптимизацию коэффициентов регрессии проводили по методу наименьших квадратов. При повторных процедурах (итерациях) экспериментальные точки с отношением интенсивностей на сравниваемых мембранах более 2 (примерно 5% от общего числа) из рассмотрения исключались. Оптимизацию проводили с помощью процедуры Solver математических таблиц Excel (Microsoft). Нормировочные коэффициенты, вычисленные как геометрическое среднее, были использованы для нормирования всего набора данных. Список дифференциально экспрессирующихся генов составлялся на основании анализа диаграмм рассеяния при наложении кривых линейной регрессии логарифмов интенсивности всех без исключения сигналов на диагональ у=х.

Кластерный анализ. Двумерное иерархическое кластерировамие проводили с использованием программы Gene Cluster 3, результаты представляли с помощью программы Tree View. Для расчета меры несходства узлов дендрограмм использовалась корреляция по Пирсону и Эвклидово расстояние. Кроме того, использовались методы кластерировання с заданным, по переменным числом групп (k-mean), и метод самосогласованных матриц (SOM). Разные алгоритмы кластерировання приводили к одинаковым спискам включенных в кластер генов, хотя и с разной степенью связанности генов внутри кластера.

Выбор генов, коррелирующих с клиническим признаком. Нормированные и логарифмированные по основанию 2 данные подвергались корреляционному анализу после удаления из рассмотрения генов, у которых максимальные по всем экспериментам значения интенсивности не превышали удвоенного значения среднего фона эксперимента. Гены, выделенные с помощью данной процедуры в группы, ассоциированные (коррелированные и антикоррелированые) с клиническими признаками,

составляли основу списка генов-кандидатов. Отдельно для кластерированых и для дифференциально экспрессирующихся генов вычислялись коэффициенты корреляции по Спирману с рангами клинического признака. Для тех групп генов, для которых коэффициенты корреляции по абсолютной величине превышали 0,57 (р < 0,1 при числе степеней свободы 7) рассчитывались кривые линейной регрессии для усредненных значений логарифма интенсивности сигнала генов, входящих в один кластер. Статистическую значимость корреляции оценивали по Стыоденту.

Обратная транскрипция — полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР). 1,5 мкг суммарной РНК использовали для синтеза кДНК в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl буфер, pH 8,3, 75 мМ KCl, 5 мМ ¡VlgCl2, 50 пикомолеи случайных девятинуклеотидных праймеров, 10 мМ дитиотрейтол, 1мМ дНТФ (USB) и 50 единиц обратной транскрнптазы MMLV.

Реакцию вели в течение 1 часа при 37°С и останавливали инкубацией реакционной смеси при 95°С в течение 10 минут. Объем реакционной смеси доводили до 100 мкл добавлением буфера, содержащего 10 мМ трис-HCl ir 1 мМ ЭДТА. Амплификацию проводили в 15 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл кДНК (что соответствовало 15 нг исходной РНК), 10 мМ трис-HCl, pH 8,5,2 мМ MgCl2,50 мМ KCl, 10 мкг/мл желатины, 60 мМ хлорид тетраметиламмоння (Fluka Chemie), 200 мкМ дНТФ, по 1 мкМ прямого и обратного ген-специфических праймеров, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы (Biomaster, Москва), 1 мкг антител «Taq Starts» (Clontech). Программа амплификации: 94°С — 5 мин., 94°С — 30 сек., 60°С — 30 сек., 72°С — 40 сек (13-35 циклов). Ген-сне-цифические праймеры дизаинировали с использованием программы 01i99 (Техноген) с последующим анализом программами Fasta34 или Blast ункальности выбранных структур в базах данных Unigene к Genbank (табл. 2). Продукты ПЦР (5 мкл реакционной смеси) анализировали электрофорезом в 1,5% агарозном геле. Интенсивность люминесценции полос измеряли с помощью системы AlphalmagerTM (Alpha Innotech Corporation) и программного обеспечения ImageQuant (Molecular Dynamics, USA). Для количественной оценки экспрессии гена использовали калибровочную кривую серийно разведенного внешнего стандарта, представляющего собой продукт амплификации того же гена, синтезированный в экспоненциальной фазе реакции. Данные нормировались на среднюю арифметическую величину количества кДНК через все исследуемые образцы и усреднялись в пределах отдельных групп сравнения. Стандартное отклонение вычислялось с помощью программы Excel. Достоверность различий между отдельными группами сравнения анализировалась с использованием Манн-Уитнн U теста в программе Статистика 6. Значение р < 0,05 рассматривалось как статистически значимое.

Результаты исследования и их обсуждение

Используя возможность анализа большого числа генов с применением метода кДНК транскрипционных матриц, нами предпринята попытка построения транскрипционного профиля предсердий при ФП на фоне структурных заболеваний сердца. При проведении гистологического исследования миокарда УПП, полученного во время оперативного вмешательства, выявлена полная сохранность структуры миокарда, достаточная для гарантированного приготовления качественных препаратов РНК из извлекаемых таким способом тканей. Сравнительный анализ транскрипционного профиля в аутопсийных образцах из разных отделов сердца показал отсутствие различий между тканями УПП и предсердий. Полученные данные позволили полагать, что изменения в транскрипционном профиле УПП могутбыть характерны и для пред-

Таблица 2. Нуклеотидиая последовательность праймеров для ОТ-ПЦР анализа

Название гена Семейство генов Символ Номер в Ген-Банке Последовательность праймеров1 Номер цикла ПЦР Размер ПЦР продукта

Neuron-derived orphan receptor 1 Транскрипционный фактор NR4A3 (Nor1) NM_006981 NM_173198 NM_173200 F5'-GAGCCTGAACCTTGATATCCAAGCC R5'-CAGTTCTACCAGGGCAACCAGGAC 32 196

Basic helix-loop-helix protein Транскрипционный фактор BHLHB2 (DEC1) NM_003670 F5'-AAATTGCCGCACCGGCTCATCGAG R5'-TCGTGCTTGGCCAGATACTGAAGC 24 323

70-kDa heat shock protein 1 (intronless gene) Шаперон HSPA1А (HSP72) NM__005345 M11717 F5'-GGGCAAGCGGTCCGGATAACGG none R5'-TGTCGGCTCGGCTCTGAGATTGG 35 214

Zinc finger protein 36 (Tristetraproline) Регулятор времени жизни мРНК ZFP36 (ТГР) NM_003407 F5'-CATGGATCTGACTGCCATCTACGAG R5'-CTGCGGCCCTCCACTAGGCTG 30 198

chemokine (C-C motif) ligand 2 (Monocyte chemotactic protein 1) Цитокин CCL2 (МСР1) NM_002982 F5'-CAGTCACCTGCTGTTATAACTTCACC R5'-GGGGTAGAACTGTGGTTCAAGAGG 29 448

proteoglycan 4 Megakaryocyte stimulating factor Ростовой фактор PRG4 (MSF) NM_005807 F5'-GAGGTCATTATTTCTGGATGCTAAGTC R5'-GAAAGCGCTGCCACTATTTGTCCAG 26 247

Vascular endothelial growth factor Ростовой фактор VEGF NM_003376 M32977 F5'-GTGTGCCCACTGAGGAGTCCAAC R5'-GTCTGCGGATCTTGTACAAACAAATGC 28 271 199

BCL-2-related protein A1 Регулятор апоптоза BCL2A1 NM_004049 F5'-CCCGGATGTGGATACCTATAAGGAG R5'-GGCCGGTTTCACAATATGGAGTGTC 32 235 290

Stratifin/14-3-3 protein (intronless gene) 14-3-3 протеин SFN NM_006142 F5'-GAGACACAGAGTCCGGCATTGGTC R5'-ACCACGTTCTTATAGGCTACTGAGAG 36 224

Таблица 2. Нуклеотидиая последовательность праймероо для ОТ-ПЦР анализа

(продолжение)

Название гена Семейство генов Символ Номер в Ген-Банке Последовательность праймеров1 Номер цикла ПЦР Размер ПЦР продукта

Stanniocalcin Капьций- регулируемый гормон STC1 NM_003155 F5'-CCATTCGGAGGTGCTCCACTTTCC R5'-TCTCTGATTGTGCTGACTGTGTCTTC 30 211

c-jun proto oncogene/ (intronless gene) Транскрипционный фактор JUN (АР-1) NM_002228 F5'-CTGCAGGGTCCGCACTGATCCG R5'-GGGAGCGCAGGGTTAATTAAGATGC 29 190

Matrix metalloproteinase 14, membrane associated Матриксная металлопротеиназа ММР14 NM_00499 F5'-GAGTCTCCCAGAGGGTCATTCATG R5'-TCTCTACCCTCAACAAGATTAGATTCC 33 889

Transcriptional repressor protein yin & yang 1 Транскрипционный фактор YY1 NM_003403 F5'-GACCCTGGAGGGCGAGTTCTC R5'-CAGTTGTTTGGGATCTGAGAGGTC 29 190

Mitogen-activated prote/n kinase kinase 1 Протеинкиназа МАР2К1 МЕК, МАРКК1 NM_002755 F5'-GGAGTGTTCAGTCTGGAATTTCAAG R5'-ATCCTTTGTCACAGGTGAAATGCAC 29 317

Proteasome inhibitor hPI31 subumt Протеасомный ингибитор PSMF1 (hPI31) NM_006814 F5'-GCAGGACGCGCTCGTCTGCTTC R5'-TCCAAGTTCAGGGTCAAGTCTGCC 28 273

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase/ген домашнего хозяйства GAPD GAPDH NM_002046 F5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC R5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA 22 452

1 F - прямой праймер, R - обратный праймер

сердий в целом. В работах по изучению экспрессии генов с использованием интраопе-рациоиного материала миокарда предсердий пациентов с ФП на фоне структурного заболевания сердца в качестве групп сравнения использовались, как и в нашем исследовании, образцы миокарда пациентов со структурными заболеваниями сердца без ФП [Brundel B.J. 1999; GrammerJ. В., 2000; Mihm M.J., 2001]. В отличие от этих работ мы дополнительно сформировали группу контроля из аутопсийных образцов ткани предсердия, взятых от лиц без органических изменений сердечно-сосудистой системы по данным патолого-анатомического исследования. Возможность использования аутопсийного материала для анализа экспрессии генов с применением технологии транскрипционных матриц была показана ранее [SluimerJ. С., 2007]. Для анализа генной экспрессии были использованы кДНК транскрипционные матрицы AtlasTM cDNA Expression Arrays (нейлоновые мембраны) фирмы Clontech (USA): Cardiovascular (588 генов), Human 1.2 (1176 гснов), Human 1.2 II (1176 генов), Human 1.2 III (1176 генов) и Neurobiology (588 генов). Всего было исследовано 4700 генов, получено 88 профилей генной экспрессии, эксперименты были повторены в разных вариантах 2-3 раза.

Сравнительный анализ экспрессии генов в миокарде УПП пациентов с ФП при различной структурной патологии сердца и группой контроля, представленной аутопсшшыми образцами. Для идентификации генов, экспрессия которых нарушена при различной органической патологии сердца и ФП, как с пароксизмальиой, так и с постоянной ее формой, были сформированы группы сравнения. В группу ФП включены образцы ткани УПП от 12 пациентов с ФП со структурной патологией сердца (2-е диенлазией соединительной ткани с формированием митрального порока сердца — недостаточности митрального клапана III—IV ст., 4 — с доброкачественной вну-трисердечной опухолью миксомой, 3 — ИБС, 3 — с ревматическим митральным стенозом,). Среди них 8 мужчин и 4 женщины, в возрасте 58 ± 9 лет. Постоянная форма ФП зарегистрирована у 4, пароксизмальная — у 8 больных. Клинических признаков НК в анамнезе и на момент оперативного лечения диагностировано не было. Контрольную группу составили 11 единичных аутопсийных образцов и пулированная «норма» из 68 образцов ткани УПП от лиц без органических изменений сердечно-сосудистой системы. При сравнении картин экспрессии наблюдались отклонения в интенсивности сигналов отдельных генов, свидетельствующие об изменении уровня их экспрессии в группе ФП по сравнению с группой контроля.

Для каждой из разновидностей мембран и каждой серии экспериментов строились диаграммы разброса данных. На рис.1 представлена зависимость усредненных значений интенсивностей сигналов соответствующих генам у пациентов с ФГ1, от усредненных значений интенсивностей сигналов, соответствующих генам в контрольной группе. Значения для генов за пределами области, соответствующей двум стандартным отклонениям от средней величины интенсивности сигнала (отвечающей 95% доверительному интервалу случайного разброса данных) для каждого гена соответствующей группы, рассматриваются как дифференциально экспрессирующиеся.

Таким образом были детектированы 40 генов как диффференцнально экспрессирующиеся, средние интенсивности сигналов которых отличались в 1,5 раза и более между ФП и контрольной группами (р < 0,05, Манн-Уитни U тест). Для 29 из отобранных генов с максимальными различиями в уровне экспрессии по результатам гибридиза-ционного эксперимента с кДНК транскрипционными матрицами проведен ОТ-ПЦР анализ. С этой целью синтезированы праймеры, последовательность которых представлена в табл. 2.

10000

1000

100 :

10

/ / У / У /Л / /

/

у у'

i

100

¡ООО

10000

Усредненный уровень экспрессии в контрольной группе

Рис. 1. Зависимость усредненных значений интенсивности сигналов, соответствующих генам, у пациентов в группе ФП по сравнению с группой контроля

Результаты электрофореза 15 генов, показавших наибольшие различия между группой ФП и контролем, представлены на рис. 2. После денситометрии каждой полосы в программе 1гтищеОиапс данные были нормированы на интенсивность полосы стабильно экспрессируемого гена «домашнего хозяйства» ОЛРОП и усредненные для каждой из групп сравнения относительные уровни генной экспрессии представлены в виде гистограммы на рис. 3. Стандартные отклонения вычислялись с помощью Манн-Уитни теста. Уровень значимости различий (р) и кратность подавления экспрессии каждого гена в группе ФП по сравнению с контролем представлены на врезке рис. 3. Значительная (5-28-кратная) разница обнаружена в уровнях экспрессии генов: орфа-нового рецептора 1 из нейронов (N0111), транскрипционного фактора (ПКС1), белка из семейства ВС 1.2 (ВСЬ2А1) и мегакариоцит-стимулирующего фактора (МБР). Меньшие, но все же существенные изменения (в 1,9-2,8 раза) наблюдались для генов: белка 1 хемотаксиса из моноцитов (МСР1), 14-З-Зсигма или стратифина (8РЫ), стани-окальцина (8ТС1), трис-тетрапролина (ТТР), сосудистого эндотелиального ростового фактора ( УБвР) и транскрипционного фактора АР 1. При этом значения р для всех генов были меньше 0,05. Следует отметить, что результаты ОТ-ПЦР, которая является независимым верифицирующим методом, находятся в соответствии с гибридиза-циониыми данными. Для того чтобы распределить гены на основе аналогичности их экспрессии, определив группы с однонаправленными изменениями регуляции, а также найти соответствия между генами в исследуемых образцах и создать общую картину взаимозависимости между уровнем экспрессии генов и характеристикой образца,

Образцы УПП пациентов с ФП

Контрольные образцы

HSi'Al

MAl'KKl

Отрицательный контроль (без РНК)

ДНК-маркер молекулярного веса

(100 bp ladder)

НИИ

GAPDH

■ н

------ и

м

Рис. 2. Электрофореграммы ОТ-ПЦР-продуктов дифференциально экспрессирующихся генов при ФП

Рис. 3■ Относительная экспрессия генов в группах фибрилляции предсердий и контроля

было проведено двумерное иерархическое кластерирование ОТ-ПЦР данных в программе Cluster 3 с использованием стандартных статистических алгоритмов. Результаты кластерирования представлены на рис. 4 с использованием программы Tree View.

Полученные данные свидетельствуют о высокой достоверности различий между уровнем экспрессии генов в группе ФП на фоне структурных заболеваний сердца и группой контроля. Таким образом, как при постоянной, так и пароксизмальной форме ФП, независимо от этиологического фактора, происходят изменения уровня экспрессии генов, относящихся к транскрипционным, ростовым факторам, белкам, участвующим в регуляции различных сигнальных путей, иммунном ответе и апоптозе, а также к факторам, регулирующим время жизни белков. Выявление дифференциальной экспрессии генов, относящихся к выше перечисленным функциональным классам, в целом подтверждает имеющиеся представления о процессах, входящих в понятие «структурного ремоделирования» предсердий. Полученные результаты согласуются с данными работ по изучению генного профиля при ФП с применением транскрипционных матриц как на экспериментальных моделях [Lai L. Р., 2004]. так и на образцах миокарда предсердий человека [Ohki-Kaneda R., 2004], которые также продемонстрировали нарушение экспрессии представителей выявленных нами семейств генов.

Сравнительный анализ экспрессии генов в миокарде УПП в группах пациентов, различающихся по характеру ритма сердца и основного заболевания. Изменения экспрессии генов при ФП представляют собой результат сложной комбинации многих процессов, вызванных как собственно ФП, так и характером основного заболевания, различиями пола, лекарственной терапии и рядом других факторов. Поэтому использование аутопсийных образцов не решает в полной мере проблемы контроля при анализе генных транскриптов в образцах тканей при ФП. Чтобы приблизиться к решению этой проблемы, мы использовали корреляционный анализ результатов гибридизации с клиническими признаками исследуемых групп пациентов. С этой целью были сформированы однородные группы пациентов (табл. 1). Пять групп (1,2,10-12) включали образцы от пациентов с пароксизмальной формой ФП, три группы объединили образцы от пациентов с постоянной формой ФП (группы 4, 5 и 6). Образцы от пациентов с

Дендрограмма признаков

Контроль

|ТР°ЛЬ1 . ГфгП

[W^A filr^l

22£SZ2SSbZ

ifslílsgjl

О 0.25 0.5 0.75 1.0 Коэффициент корреляции

Рис. 4. Результаты иерархического кластерирования генов', анализированных методом ОТ-ПЦР

CP составили группы 3, 7 и 8. В отдельную группу вошли образцы от лиц, погибших в результате несчастного случая (группа 9). На рис. 5 представлена диаграмма рассеяния в двойных логарифмических координатах нормированных данных, полученных на мембранах Human 1.2 II, в виде зависимости интенсивности сигналов каждого гена на мембранах, соответствующих образцам групп с ФП от средней интенсивности сигналов на мембранах, соответствующих образцам групп с СР. За пределами области, ограниченной кривыми, соответствующими 95% доверительному интервалу вокруг диагонали у=х, или удвоенной величине стандартного отклонения от среднего значения интенсивности сигнала для каждого гена, располагаются гены, экспрессия которых достоверно отличается в сравниваемых группах образцов. Аналогичный анализ был проведен с использованием мембран Cardiovascular и Human 1.2. В общей сумме было обнаружено 47 дифференциально экспрессирующихся генов.

' Красная шкала соответствует повышенной, зеленая — пониженной экспрессии гена по отношению к среднему уровню экспрессии этого гена для всех образцов на всех мембранах. Цветные квадраты по горизонтали соответствуют генам, по вертикали - образцам. Дендрограмма слева группирует гены в две главные ветви, каждая из которых состоит из ряда более мелких ветвей, объединяющих высоко коррелирующие между собой гены (например, гены N0R1 и DEC1 с коэффициентом корреляции Пирсона0,78). Верхняя дендрограмма относится к образцам, которые отчетливо разделяются на две группы - ФП и контрольную.

Средняя интенсивность сигналов для групп пациентов с синусовым ритмом (33, 07, в8)

Рис. 5. Диаграмма рассеяния2 для мембраны Human 1.2 II

Все дифференциально экспрессирующиеся гены были подвергнуты корреляционному анализу с клиническими признаками (табл. 1). Корреляционный анализ с привлечением методов непараметрической статистики (гамма статистика, метод Кендалл-тау и метод Спирмана) привел к практически одинаковым результатам. Стабильность полученных корреляций проверялась путем последовательного исключения из анализа данных для любой одной из сравниваемых групп пациентов. В результате были выявлены независимые группы генов, коррелирующих с клиническими признаками, полом и аутопсийным контролем. Независимо вычислялись коэффициенты корреляции по Пирсону между каждым из дифференциально экспрессирующихся генов и тем из выбранных генов, активность которого была в наивысшей степени коррелирована с одним единственным признаком (г>0.8, р< 0.002). Это позволяло избежать ошибок, связанных с произвольностью ранжирования клинических признаков. В табл. 3 представлены результаты корреляционного анализа дифференциально экспрессирующихся генов, большая часть которых демонстрирует высокую положительную или отрицательную корреляцию с призна-

2 По оси абсцисс отложены средние интенсивности сигналов для групп пациентов с СР. По оси ординат — интенсивности сигналов для тех же генов для групп пациентов с ФП и контрольной группы. Все данные были нормированы по методу диагоналей. Кривые, огибающие диагональ, соответствуют 95% доверительному интервалу распределения случайного разброса данных.

Таблица 3. Результаты корреляционного анализа дифференциально экспрессирующихся генов

Код эксперимента Символ гена Название гена Абсолютная средняя величина сигнала Кратность изменения сигнала Коэффициент корреляции по Спирману, г Р

«ИБС» «ФП» «ПОЛ» «ИБС» «ФП» «ПОЛ»

Агг9Н2 сз белок комплемента 22 6 25 Í 0.60 0 03 -0 28 0.0410 04672 0 2320

АШ2Н1 CLU кластерин 39 0 1.5 i 0.66 -0.32 0.59 0.0092 0.1544 00198

Агг12Н2 МТ1/2 металлотионеин 76 9 38 4 0.69 -0.82 0 38 0.0060 0 0005 01099

Агг12Н2 PPYR1 рецептор нейропептида У 42 8 46 i 0.80 -0 49 0 25 0.0006 0 0500 0 2193

Агг9Н2 МТ1/2 металло тионеин 21.6 3.2 i 0 34 -0.95 0 25 0.1826 0.0000 0 2545

Агг9Н2 ALDH2 альдегид дегидрогеназа 2 139 1 7 i 0 21 -0.85 -014 0 2902 0.0015 0 3613

Агг9Н2 RAP1A РА5-лодобный белок 15.4 28 i 0 54 -0.84 0 43 0.0625 0.0017 01198

АГГ12Н2 МТ1/2 металлотионеин 76 9 38 i 0.69 -0.82 0.38 0.0060 0.0005 0.1099

АГГ12Н2 GNAL гуаниннуклеотид-связывающий белок 16 3 29 i 0 41 -0.75 0 02 0 0915 0.0020 0 4764

Агг9Н2 АРР белок амилоида А4 188 1 8 i 0.12 -0.66 -011 0 3744 0.0236 0 3874

Агг12Н1 ZFP36 тристетрапролин 146 9 60 i 0 52 -0.60 0 28 0.0402 0.0185 0.1866

АГГ12Н1 NR4A1 орфановый рецептор ТРЗ 47 7 42 i 0 46 -0.57 015 0 0655 0.0249 0 3244

АггЭН2 CYR61 индуктор ангиогенеза 10.9 2.1 i 0.48 -0.51 0.58 0.0915 0.0796 0.0485

Агг12Н1 EGR1 фактор транскрипции 1150 66 1 0 54 -0 50 017 0.0334 0.0490 0 3007

Агг12Н1 IGFBP2 ассоциат инсулин подобного фактора 32 6 21 t -0 01 0 51 -0 26 0.4935 0.0451 0 2040

АггЭСаг GJA5 коннексин 40 32 0 20 t 0.18 0 53 -0 20 0 3216 0 0687 0 3041

АггЭСаг POD аполипопротеин Д 73 0 25 t 0 01 0 56 -013 0 4902 0 0566 0 3719

АггЭСаг NPPA натрийуретический фактор, предсердный 8718 22 t -0 29 0.57 -0 36 0 2237 00516 01696

Агг12Н2 SOX3 фактор транскрипции 294 34 t -0 35 0.63 013 01348 0.0127 0 3465

АггЭСаг COL1A1 коллаген 1 1137 26 t -0.58 0.63 -0.59 0.0478 0.0311 0 0433

Таблица 3. Результаты корреляционного анализа дифференциально экспрессирующихся генов (продолжение)

Код эксперимента Символ гена Название гена Абсолютная средняя величина сигнала Кратность изменения сигнала Коэффициент корреляции по Спирману, г P

«ИБС» «ФП» «пол» «ИБС» «ФП» «ПОЛ»

Агг9Н2 №РВ натрийуретический фактор, мозговой 82.7 28 т -0 52 0.64 0 22 0 0716 0.0281 0 2830

Агг12Н2 ВМХ тирозинкиназа,костномозговая 21 7 1 5 т -0 55 068 -0.53 0.0302 0.0073 0.0372

АггЭСаг ИРРВ натрийуретический фактор, мозговой 239 2 36 t -0.74 0.68 -0 05 0.0102 0.0195 0 4461

Агг12Н2 СА1_М1.3 кальмодулин-подобный бел ак 21.7 1.9 t ООО 0.69 -0.25 0.4969 0.0063 0.2146

Агг12Н2 РКШХ1 гомеодомен-содержащий белок 20 0 26 t -0 40 0.77 0 08 0 0974 0 0015 0 3991

АггЭСаг МУН7 миозин сердечной мышцы, тяжелая цепь, бета 771.7 24 t -0.15 0.77 -0.15 0 3498 0.0065 0 3530

Агг9Н2 СА1.МЗ кальмодулин 254 2.1 t -014 0.79 014 0 3564 0.0048 0 3562

АггЭСаг СЭГ^РЗ сердечный ЛИМ-доменный белок 148.1 3.7 t -0.40 0.80 0 07 01418 0.0042 0 4259

Агг9Н2 СЭЯРЗ сердечный ЛИМ-доменный белок 34.5 2.0 t -0 34 0.86 0 07 01822 0.0012 0 4289

Агг9Н2 А№32А лейциновый кислый ядерный белок 10.4 1 6 t -0.07 0 02 -0.80 0.4315 0 4799 0.0037

Агг9Н2 РРКС1 протеин киназа С, йота 96 1.7 t -0 07 0 27 -0.70 0 4259 02398 0.0163

Агг9Н2 эндотелиальный дифференцировочный маркер 96 1.4 t -0 58 0 30 -0.70 0.0475 0 2156 0.0169

Агг9Н2 Ш2 ЛИМ-доменный белок, мышечный 144 1.8 f 0 25 0 37 -0.64 0 2530 01583 0.0287

Агг9Н2 СКВ креатин киназа, В форма 32 4 1.9 i -0.09 -014 0.70 0.4054 0 3562 0.0167

Агг9Н2 СКМ креатин киназа, М форма 141.6 1.5 i 0.40 -0.35 0.81 0.1399 0.1788 0.0034

фон 45

Примечание Стрелки указывают направление изменения сигнала для каждого гена по отношению к синусовому ритму Полужирным шрифтом выделены значения коэффициентов корреляции г > 0,57 и р < 0,05

ком ФП и отсутствие корреляции или даже обратную корреляцию с другими признаками. Среди генов с высокой положительной корреляцией с ФП — гены, кодирующие ЛИМ-доменный белок сердечной мышцы (СБИРЗ), тяжелую бета-цепь миозина (МУП7), кальмодулин (СЛЬМЗ) и гомеодомен-содержащий белок (РКИ-ОХ1) (г>0,77, р<0,007). Отрицательную корреляцию с признаком ФН показывают гены, кодирующие металлотионеин (МТ1/2), митохондриальную альдегиддеги-дрогеназу 2 (ДШ112), гуаниннуклеотид-связывающий белок (СМЛЬ) и гая-подоб-ный белок (Яар1Л) (г<-0,75, р<0,002). Важно отметить, что гены, коррелирующие с ФП, не перекрываются с генами, корреллирующими с другими признаками и, н частости, проявляют выраженную обратную корреляцию с признаком ИБС (г=-0,80, р=0,002).

0Д316Х

=олз

нитм сердца

я" »одев

♦ МТ1Н, АШН2, НАР) А, СМА1_, АРР АНРРВ, РКПОХ1, САШЗ, МУН7, С5НРЗ

Рис. 6. Линейная регрессия среднего значения логарифма нормированной интенсивности сигналов генов3, коррелирующих (г > 0,7, р< 0.02) и антикоррелирующих (г< -0,7,р< 0.02) с ФП

3 Значения 0,1 и 2 по оси х соответствуют синусовому ритму, пароксизмальной и постоянной формам ФП, соответственно Уравнения и коэффициенты регрессии приведены на рисунке. Символы генов указаны внизу

Для того, чтобы оценить степень различии в уровне экспрессии генов при пароксизмальной и постоянной формах ФП по сравнению с CP, рассчитывались кривые линейной регрессии для усредненных значений логарифма интенсивности сигнала генов, для которых коэффициенты корреляции с ФГ1 по абсолютной величине превышали 0,7 (р < 0,02) (табл. 3). Усреднение производилось внутри групп образцов, соответствующих пароксизмальной форме ФП (группы 1 и 2), постоянной форме ФП (4, 5 и 6) и CP (3, 7, 8 и 9). Как видно из рис. 6, наблюдается усиление изменений в активности генов при переходе от пароксизмальной к постоянной форме ФП и примерно двухкратная разница в уровне экспрессии генов с положительной (г > 0,7) или отрицательной (г < -0.7) корреляцией при ФП по сравнению с СР.

С целыо определения независимым способом соответствия между уровнем экспрессии генов в исследуемых образцах и клиническими признаками было проведено двумерное иерархическое кластсрироваиис данных гибридизации. Анализу был подвергнут весь набор генов, уровень экспрессии которых хотя бы в одном эксперименте превышал удвоенное значение среднего фона эксперимента. Все сигналы были нормированы на среднее значение всех данных, включенных в анализ, логарифмированы по основанию 2 и центрированы. Центрирование производилось по обоим измерениям — по генам и по группам пациентов, так что средние значения логарифма интенсивности сигнала в каждой строчке и в каждом столбце таблицы перед кластерированием были равны нулю. Результаты кластернровання данных, полученных с использованием мембраны Human 1.2 II для 9 и 12 групп пациентов (табл. 1), представлены на рис. 7. Стабильность иерархического кластернровання проверялась путем последовательного исключения из анализа одной из групп пациентов. Наибольшие изменения в результирующих дендрограммах наблюдались прн исключении контрольной группы. Но и при этом топография дендрограммы пациентов не менялась. IIa дендрограмме пациентов (вверху) можно видеть, что тесно расположенные группы пациентов с ФП (G2, G5 и G6) кластерируются отдельно от всех других групп. Значительно отличается от всех и контрольная группа. Две группы пациентов женского пола с ФП также кластерируются отдельно. Кластерный анализ данных, полученных с использованием тех же мембран и 12 групп пациентов показывает ту же тенденцию к группированию образцов и генов, но деление по признаку пола отсутствует. В целом, картина экспрессии генов мозаична, что отражает многофакторную зависимость активности генов предсердия.

Полагают, что транскрипционная регуляция кардиомиоцитов находится в тесной взаимосвязи с их сократительной функцией, миокарднальным напряжением и кальциевым гомеостазом [McDonough Р. М., 1992; Kubisch С., 1993]. В группе генов, коррелирующих с ФП, обнаружен ген тяжелой цепи бета-миозина (MYH7) и ген белка, несущего богатый цистеином ЛИМ домен (CSRP3), которые отвечают за сборку и функционирование сократительного аппарата кардиомиоцита. Увеличение экспрессии этих генов при постоянной форме ФП у человека было показано ранее [Mihm М. J., 2001; Ohki R., 2005; Barth A. S., 2005]. Медленный бета-миозин — основной сократительный белок желудочков функционирует с гораздо меньшими энергетическими затратами, более экономично, хотя и более медленно, чем быстрый предсердный альфа-миозин [Narolska N. А., 2005]. Даже небольшой сдвиг в экспрессии миознно-вых изоформ в фнбриллирующем предсердии может внести существенные изменения в эффективность работы сердечной мышцы. Увеличение активности обнаруженных нами при ФП генов белков, несущих богатые цистеином ЛИМ домены, FHL1 и

10

< 1

0.1

II

[M t

. -e-S

, ft о о

KNU

cvk6J

С)

ill 0? At M 1.0

коэффициент корреляции

nrt[rr

•е- o. S o

[ЧРРВ l< и

r:sRPJ % :

:: j

SDC4 ;ЯВ

ALDH2 (ИИ

« Г" Г Н

ENG [ В

CVR61 к

В» lj и Is M) u

коэффициент корреляции

I мая

msasiaisa

siiiiiiiSiii

ЗШаззззШ

I

¡1

a

I

[J

ORil C3 a»®;

ALDH2 Нэ>ЬЛ2С2Л I SSi ANXN4

ГVH61

e,

K, NR-fAi

Рис. 7. Результаты двумерного полносвязанного клас.терирования данных' для мембраны Human 1.2 II в эксперименте с 9 и 12 группами пациентов

4 Названия групп пациентов - 2) указаны вверху, символы генов — справа от картины кластерирова-ния. Шкалы коэффициентов корреляции — для генов (внизу) и для групп пациентов (вверху) — отвечают корреляции для узлов дендрограммы, соответствующей либо генам (слева), либо пациентам (вверху). Цветовая (красно-зеленая) шкала соответствует логарифмированному и центрированному преобразованию интенсивности сигналов. Красная окраска соответствует усиленной экспрессии гена, зеленая — ослабленной экспрессии относительно среднего значения экспрессии по использованной выборке данных. А - репрезентативная картина кластерирования данных при исключении из рассмотрения контрольной группы. Б — результаты кластерирования данных с участием 9 групп пациентов (без исключения контрольной группы), В — результаты кластерирования данных независимого эксперимента с участием 12 групп пациентов. Выделенные крупным шрифтом символы генов указывают расположение узлов дендрограммы генов, с ними кластерирующихся.

CSRPi, FHL2 (андроген-рецентор зависимый) и CSRP3, которые участвуют в функционировании не только сократительного, но и транскрипционного аппарата клетки [Scholl F. Л., 2000], было продемонстрировано в клинических исследованиях и экспериментальных моделях [Kim, N. П., 2005; Barth Л. S., 2005]. Снижение уровня экспрессии генов, относящихся к семействам металлопротеипаз, выявленное в нашей работе в группе пациентов с ФП, предполагает их возможный вклад в дилатацшо предсердий и сократительную дисфункцию при ФП. Кроме того, у пациентов с ФП также выявлено повышение активности хорошо известных в клинических исследованиях генов натрийуретического фактора, предсердного и мозгового (NPPA и NPPB). В работе в группе пациентов с ФИ обнаружено повышение уровня мозгового натрийуретического пептида — BNP.

Кальций играет важную роль в активации транскрипции генов в сердце. Перегрузка кальцием кардиомиоцитов идентифицирована на ранних сроках ФП [Kneller J., 2002; Allessie M., 2002]. Частый предсердньш ритм приводит к прогрессивному повышению внутриклеточного уровня кальция, который снижает жизнеспособность клеток и индуцирует единый защитный патофизиологический путь. Его реализация включает снижение уровня кальциевых каналов на транскрипционном уровне, следствием чего является снижение кальциевого тока, снижение как входящего, так и выходящего калиевых токов. Это приводит к укорочению продолжительности потенциала действия н рефрактерного периода миокарда предсердий, индукции и поддержанию ФП по механизму « re-entry». В дальнейшем перегрузка клетки кальцием и снижение кальциевого обмена индуцирует миолизис в клетке, активирует фетальную генетическую программу, ведущую к структурному ремоделировашио, снижению сократительной функции (т. h. -«ошеломленный» миокард предсердия) и, как следствие, к стазу крови и тромбообразованию.

Не противоречат ранее проведенным исследованиям [Cardin S., 2007] наши данные о повышении при ФП активности генов кальциевого обмена — кальмодулин-подобных белков (CALM3, CALML3), а также генов внеклеточного матрикса — коллагена 1 и белка, связывающего инсулин-подобноый ростовой фактор (COL1A1, IGFBP2), хотя следует заметить, что в этом случае речь идет не столько о конкретных генах, сколько о представителях тех же семейств. Также нами была идентифицирована диерегуляция генов, принадлежащих к метаболическим классам, подтверждая нарушение биоэнергетической регуляции и повышенной энергетической потребности при ФП. Данный спектр изменений аналогичен ультраструктурной характеристике фетальных кардиомиоцитов или гибернирующего миокарда. Рядом авторов предложена концепция «клеточной адаптации через дедифференцировку при ФП» [Thijssen V. L J. L., 2001]. Фетальный клеточный фенотип предположительно является результатом выживания кардиомицнтов на фоне длительно существующего стресса, включая напряжение («stretch») н ишемию [Ausma J., 1998]. Среди генов со сниженной при ФП активностью в нашей работе впервые обнаружены гены мнтохондриальной альдегид деги-дрогеназы (ALDH2) и металлотионеина (МТ1, МТ2) — двух важнейших ферментов дезактивации системы окислительного стресса. Увеличение активности генов, усиливающих окислительные процессы, и ослабление экспрессии генов, кодирующих антиокислительные ферменты, было описано в миокарде УПП у пациентов с ФП [Kim Y. H., 2003]. Снижение активности гена ALDH2 приводит к накоплению ацеталь-дегида. Избыточное накопление ацетальдегида, в свою очередь, приводит к окислению и инактивации большинства цистеин содержащих метало-координирующих белков, в том числе ЛИМ-домен содержащих белков, ответственных за организацию Z-дисков

саркомер, и множества транскрипционных факторов, содержащих в структуре цинковые пальцы (Zn finger). К тем же последствиям, что и увеличение активной концентрации ацетальдегида приводит увеличение концентрации других известных форм активного кислорода: пероксинитрила, нитротирозина, сульфоксида, перекиси водорода и др. Окислительная модификация миофнбриллярных белков в миоцитах предсердий (в частности нитрование тирозиновых остатков) и, как следствие, потеря их функции показаны ранее при ФП [Mihm M. J., 2001]. Металлотионеин — небольшой белок, почти на 30% состоящий из цистеиновых остатков и повсеместно экспрессирующийся в норме на невысоком уровне. При любых повреждениях ткани происходит индукция разных изоформ этих генов [Chung R. S., 2007]. Помимо хорошо известных функций этого металл-связывающего белка, важного переносчика цинка, абсолютно необходимого для работы многих белков, обнаружено, что при его дефиците резко подавляется экспрессия Р311 [MiuraN., 2000, Paliwal S., 2004], некоего пока мало изученного гена, которому приписывается роль антифибротического агента. Значительное подавление экспрессии гена Р311 показано недавно на экспериментальной модели ФП [Cardin S., 2007]. Кроме ALDH2 и МТ, предохраняющих клетки от окислительного стресса, в наших экспериментах было обнаружено снижение активности гена RAP1 А, также влияющего на эффективность защиты клетки от окислительного стресса. RAP1А является конкурентным ингибитором активности белков семейства RAS-подобных малых ГТФаз (Racl, RhoA и др ), регуляторпых белков, управляющих системами построения внутриклеточного матрикса и сократительного аппарата и генерирующих активные формы кислорода через активацию NADPH оксидазы [Niu J., 2003]. Не менее важной представляется участие RAP1A в межклеточной коммуникации через щелевые контакты, играющие определяющую роль в электрической проводимости [Somekawa S., 2005]. Подавление экспрессии RAP1A может внести определенный вклад в нарушение координированного электрического возбуждения кардиомиоцитов при ФП. Наши результаты подтверждают, что при ФП может существовать и самоподдерживаться состояние окислительного стресса, одним из ключевых элементов которого, представляется существенное снижение активности металлотионеиновых генов. Следует обратить внимание на тот факт, что МТ является лигандом для мегалина (LRP2), одного из представителей семейства ЛНП — рецепторов [Klassen, 2004], которые обладают способностью интернализоваться, захватив с собой лиганд после взаимодействия с ним. Недавние исследования [Ambjorn, 2007] показали, что доставленный таким путем в нервные клетки МТ или его синтетические аналога, пептиды, индуцировали ней-ритный рост, регенерацию и выживание нейронов через активацию ERK, PKB/Akt и CREB. В связи с этим, по аналогии, можно наметить направления поиска новых путей и молекулярных мишеней при лечении ФП. Таким образом, мы полагаем, что данная работа позволяет наметить не только направления будущих исследований, касающихся молекулярных механизмов возникновения, поддержания и последствий ФП, но также открыть новые перспективы в разработке подходов к ее лечению.

В современные представления о ремоделировании предсердий при ФП укладываются выявленные нами изменения генов, принимающих участие в процессах кальциевого обмена, окислительного стресса, организации сократительного аппарата кардиомиоцита и формирования соединительной ткани, а также воспаления и тром-бообразования. Взаимосвязь всех компонентов ремоделирования предсердий - электрического, структурного и сократительного находит свое отражение в результатах измененной транскрипционной регуляции — первичного уровня регуляции единого патофизиологического каскада Полученные данные позволяют охарактеризовать

специфический спектр изменений на уровне мРНК, отражающий не только процессы ремоделирования, а также адаптационные механизмы к длительно существующему метаболическому стрессу при ФП в виде подавления предсердно-спецнфической транскрипционной активности. Вероятно, транскрипционные изменения, найденные в нашей работе, в большей мере представляют собой следствие, а не причину ФП. Однако, данные нарушения могут формировать субстрат ее поддержания, являясь аналогом пусковых механизмов, инициирующих ФП, которую расценивают как самоподдерживающееся заболевание - «наличие ФП потенцирует субстрат ее же возникновения» [\Vijffels М. С. Е. Е, 1995].

ВЫВОДЫ

1. Методом кДНК транскрипционных матриц обнаружены различия в уровне экспрессии 40 из 4700 исследованных генов в миокарде ушка правого предсердия у пациентовс фибрилляцией предсердий на фоне ИБС, ревматических пороковсерд-ца, дисплазии соединительной ткани с формированием митрального порока сердца по сравнению с группой контроля, представленной аутопси иными образцами, полученными от лиц, не имевших сердечно-сосудистых заболеваний по данным патолого-атомического исследования. Выявленные гены с измененной экспрессией принадлежат к семействам ростовых и транскрипционных факторов, белкам, участвующим в кальциевом обмене, апоптозе, иммунном ответе и могут влиять на многие сигнальные и метаболические пути и механизмы, общие для патофизиологии различных структурных заболевании сердца.

2. Методом полуколичественпой ОТ-ПЦР подтверждено достоверное различие (р<0.05) в уровне экспрессии 15 генов, а именно — сосудистого эндотелиально-го фактора роста (УЕСЕ), мегакарноцитстимулирующего фактора (МЯР), транскрипционного фактора (ЭЕС1), гена орфаиового рецептора (ЖЖ1), транскрипционного фактора (УУ), транскрипционного фактора (АР-1), регулятора апоптоза (ВСЬ2А1), тристетрапролина (ТТР), станиокальцина (БТС), стратифина (8ТР), матриксной металлопротеиназы 14 (ММР14), моноцитарного хемотаксического фактора (МСР1), киназы (МАРКК1), шаперона (Н8РА1), экспрессия которых значительно и синхронно понижена у пациентов с фибрилляцией предсердий на фоне структурного заболевания сердца по сравнению с группой лиц, не имевших сердечно-сосудистых заболеваний.

3. Сравнительный анализ профилей генной экспрессии с применением комплекса методов математического анализа в группах пациентов с постоянной и пароксиз-малыюй формами ФП и пациентов с синусовым ритмом сердца без НРС в анамнезе, выявил 17 дифференциально экспрессирующихся генов, активность которых высоко коррелировала с ФП. Положительная корреляция с ФП (г>0,77, р<0,007) выявлена для генов, кодирующих Л ИМ-доменный белок сердечной мышцы (С8М-РЗ), тяжелую бета-цепь миозина (МУН7), кальмодулин (САЬМЗ) и гомеодомен-содержащий белок (РКМОХ1). Гены, кодирующие металлотионеин (МТ1/2), митохондриальную альдегиддегидрогеназу 2 (АЬОИ2), гуаниннуклеотид-связы-вающий белок (ОМЛЬ) и газ-подобный белок (11ар1Л) проявили отрицательную корреляцию экспрессии с ФП (г<-0,75, р<0,002). Гены, экспрессия которых повышалась при ФП, проявляли пониженную экспрессию при ИБС (п=-0,80, р=0,0002) и наоборот. Коррелирующие с ФП гены принадлежат к разным функциональным категориям, включая организацию сократительного аппарата кардиомиоцита, каль-

циевый гомеостаз, регуляцию транскрипции и передачи сигнала, межклеточные взаимодействия и окислительный стресс.

4. Изменения активности высоко коррелирующих с ФП генов более выражены при постоянной по сравнению с пароксизмалыгой формой данного нарушения ритма сердца.

5. Результаты позволяют предполагать возможное участие выявленных дифференциально экспрессирующихся генов в молекулярных механизмах развития фибрилляции предсердий у человека. Сформулирована гипотеза о том, что совокупность наблюдаемых изменений в активности генов при ФП может быть обусловлена дисбалансом окислительно-восстановительного потенциала миоцитов предсердий с ключевой ролью в регуляции экспрессии генов металлотионеина и альдегиддеги-дрогеназы.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Харлап М. С., Тимофеева А. В., Горюнова Л. Е., Хаспеков Г. В., Скамров А. В., Васильев В. П., Галяутдинов Д. М., Дземешкевич С. Л., Акчурин Р. С., Голицын С. П., Биби-лашвили R Ш. Анализ экспрессии генов в миокарде ушка правого предсердия у пациентов с мерцательной аритмией с помощью метода транскрипционных матриц // Вестник Аритмологии 35, приложение А. — 2004. — Абстракт 25.

2. Харлап М. С., Тимофеева А. В, Горюнова Л. Е., Хаспеков Г. В., Васильев В II., Галяутдинов Д. М., Дземешкевич С. Л., Акчурин Р. С., Голицын С. П., Бибилаш-вили Р. Ш. cDNA microarray analysis in patients with atrial fibrillation // Europace supplemets. Vol.6, Suppl.l. - June 2004. - Abstract 225/1, p.178.

3. Харлап M. С., Тимофеева А. В., Горюнова Л. Е., Хаспеков Г. В., Васильев В. П., Галяутдинов Д. М., Дземешкевич С. Л., Акчурин Р. С., Голицын С. П., Бибилашвили P. III. Изучение экспрессии генов в миокарде ушка правого предсердия у пациентов с различными структурными заболеваниями сердца и мерцательной аритмией методом транскрипционных матриц // Тезисы XI Российского Конгресса «Человек и лекарство». — Москва, 19-23 апреля 2004 г. — Абстракт, стр. 589.

4. Дземешкевич С. Л., Раскин В. В., Королев С. В., Фролова Ю. В., Харлап М. С., Голицын С. П., Синицын В. Е., Акчурин Р. С. Фибрилляция и объем предсердия у больных с митральным пороком сердца: хирургическая тактика и техника // Анналы аритмологии №2, приложение. — 2005. Абстракт, стр.81.

5. Харлап М. С., Тимофеева А. В., Горюнова Л. Е., Хаспеков Г. В., Дземешкевич С. Л., Акчурин Р. С., Голицын С. П., Бибилашвили P. III. Atrial appendages transcriptional profile in atrial fibrillation patients with structural heart diseases // Symposium Cell Signaling World 2006. Signal Transduction Pathways as therapeutic targets. — Luxembourg, 25-28 января 2006. — Poster XI, 7, абстракт, стр 452.

6. Харлап M. С., Тимофеева А. В., Горюнова Л. Е., Хаспеков Г. В., Раскин В. В., Дземешкевич С. Л., Акчурин Р. С., Голицын С. II., Бибилашвили Р. Ш. Atrial appendages transcriptional profile in atrial fibrillation patients with structural heart diseases //Annals of New York Academy of Science. — 2006. — p. 205-217.

7. Харлап M. С., Горюнова Л. E., Смолянова Г. Г., Тимофеева А. В., Хаспеков Г. В., Раскин В. В., Дземешкевич С. Л., Акчурин Р. С., Голицын С. П., Бибилашвили P. LU. Анализ экспрессии генов в миокарде ушка правого предсердия у пациентов с фибрилляцией предсердий методом кДНК транскрипционных матриц // Кардиология 2008/9, том 48, стр. 34-42.

По последним рекомендациям Американского и Европейского общества кардиологов по лечению больных с фибрилляцией предсердий (ФП), основными направлениями в терапии являются: контроль частоты ритма сердца при постоянной форме ФП; предотвращение тромбоэмболических осложнений, восстановление и поддержание синусового ритма сердца [88]. Первые два успешно реализуются в большинстве случаев с помощью применения лекарственной терапии. Недостаточная эффективность мероприятий по предотвращению пароксизмов ФП и удержанию синусового ритма (CP) частично объясняется не совсем полным пониманием молекулярной патофизиологии этого заболевания [40].

Современные методы и подходы, используемые в молекулярной биологии и молекулярной генетике, позволяют получить новую информацию для изучения патогенетических механизмов возникновения различных заболеваний, в том числе и нарушений ритма сердца (НРС) [59, 64, 80]. Последние 15 лет исследования, посвященные анализу молекулярных основ ФП были сфокусированы на трех основных направлениях: клеточная электрофизиология, изучение функционирования ионных каналов; медицинская генетика и анализ экспрессии генов [40, 202,203, 256].

Изменения ионного транспорта в кардиомиоцитах, приводящие к нарушению формирования нормального потенциала действия (ПД), являются центральными в возникновении электрофизиологических предпосылок к ФП [29, 30,54]. Детальный функциональный анализ ионных токов, ответственных за нормальную и патологическую электрофизиологию сердца, стал возможен после идентификации молекулярной структуры ионных каналов [205]. Исследования проводились как на экспериментальных моделях [187, 271, 272], так и в клинике с использованием интраоперационного биопсийного материала предсердий [41-43, 99, 100]. Это позволило определить понятие ионногоремоделирования — основу электрического ремоделирования предсердия при ФП, как один из ведущих патофизиологических механизмов ее развития и самоподдержания [251, 272]. Доказательства обратимости электрического ремоделирования, полученные рядом авторов, позволяют сделать вывод о возможности предотвращения рецидивирования ФП [19, 29].

С помощью методов медицинской генетики в ряде случаев удалось идентифицировать гены, ответственные за ионные каналы, мутации в которых приводят к ФП [57, 77, 143, 268]. Но в большинстве случаев ФП является полигенным, мультифакторным заболеванием, что затрудняет поиск молекулярных причин, к ней приводящим [59].

Исследования, направленные на изучение молекулярных основ ремоде-лирования предсердия при ФП на основании анализа экспрессии генов в предсердии с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), на первом этапе строились по принципу тестирования гипотез участия отдельных групп генов в патогенезе заболевания [41-44, 74, 75, 97-100]. ФП как на фоне структурного заболевания сердца, так и сама по себе нарушает архитехтонику предсердия, приводя к его структурному ремоделированию, что показано в экспериментальных моделях на животных [15, 17, 215]. При изучении экспрессии генов при ФП было выявлено, что в основе этих процессов лежат структурные и функциональные изменения белков, участвующих в кальциевом обмене [41, 141], формировании соединительной ткани [50, 96, 97], межклеточном взаимодействии [250, 252,253] и сигнальных системах [13]. Последние обеспечивают динамическое взаимодействие между экстраклеточной и внутриклеточной средой. Сигнальные молекулярные пути вовлечены в регуляцию экспрессии генов на разных уровнях (транскрипции, трансляции, посттрансляционных процессов), а такжевклеточнойпролиферации,гипертрофии,миграции, дифференцировке и апоптозе.

Для возможной оценки регуляторных взаимосвязей при ФП важным является комплексный одномоментный анализ большого количества генов в одном образце ткани. В последние годы это стало возможным в связи с появлением метода транскрипционных матриц [110, 198], которые уже применяются для изучения различных, в том числе и сердечно-сосудистых заболеваний [20, 31,107,112,115-117, 236]. В связи с этим:

Цель исследования: определение уровня экспрессии генов в миокарде ушка правого предсердия (УПП) методом кДНК транскрипционных матриц для выявления генов, активность которых коррелирует с ФП.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Сформировать группы сравнения из образцов ткани УПП, полученных в ходе стандартного этапа хирургического вмешательства у пациентов со структурными заболеваниями сердца с постоянной или пароксизмальной формой ФП и CP, а также группы контроля, состоящие из аутопсийных образцов ткани УПП, полученных от лиц, не имеющих патологии сердечно-сосудистой системы по данным патолого-анатомического исследования, для проведения гибридиза-ционных экспериментов.

2. Исследовать уровень экспрессии генов в каждом образце ткани УПП пациентов с ФП и CP и аутопсийных образцах методом кДНК транскрипционных матриц.

3. Осуществить выбор генов, уровень экспрессии которых коррелирует с клиническими признаками (ритм сердца — пароксизмальная, постоянная форма ФП, CP; характер основного заболевания — ише-мическая болезнь сердца (ИБС), пороки сердца ревматической этиологии, дисплазия соединительной ткани) с применением методов математического анализа при обработке гибридизационных данных.

4. Определить соотношение уровней представленности мРНК для дифференциально экспрессирующихся генов методом сопряженной обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции для верификации полученных данных.

5. Сформулировать представление о возможном участии генов с измененным уровнем экспрессии, высоко коррелирующих с ФП, в молекулярных механизмах данного HP С у человека.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Для изучения экспрессии генов у больных с ФП применен метод кДНК транскрипционных матриц и проведен корреляционный анализ уровня мРНК в ткани УПП с клиническими признаками. Определены гены, экспрессия которых меняется при ФП. Высоко коррелирующие с ФП гены принадлежат к разным функциональным семействам: регуляторам транскрипции, передачи межклеточного и внутриклеточного сигнала, кальциевого гомеостаза, окислительного стресса, организации сократительного аппарата кардиомиоцита, апоптоза, иммунного ответа. Выявленные различия в уровне экспрессии генов при ФП по сравнению с CP дают основания для построения гипотетической регуляторной цепи, индуцируемой ФП и предрасполагающей к ее самоподдержанию. В эту цепь, помимо элементов, связанных с дезорганизацией сарколеммы и нарушением кальциевого гомеостаза, в качестве ключевых элементов могут входить впервые выявленные в данном исследовании дифференциально экспрессирующиеся при ФП гены — металлотионеин (МТ1/2), митохондриальная альдегидде-гидрогеназа 2 (ALDH2), которые предопределяют высокий окислительный потенциал клеток; а также — сердечный и мышечный ЛИМ-доменные белки (С5КРЗ,РНЬ2),чувствительныекокислительному потенциалу,участвующие в формировании ключевых элементов сарколеммы, и — транскрипционные факторы (SOX3, EGR1), ras-подобный белок (RAP1A), определяющие биосинтез и состояние сократительного аппарата кардиомиоцитов.

выводы

1. Методом кДНК транскрипционных матриц обнаружены различия в уровне экспрессии 40 из 4700 исследованных генов в миокарде ушка правого предсердия у пациентов с фибрилляцией предсердий на фоне ИБС, ревматических пороков сердца, дисплазии соединительной ткани с формированием митрального порока сердца по сравнению с группой контроля, представленной аутопсийными образцами, полученными от лиц, не имевших сердечно-сосудистых заболеваний по данным патолого-атомического исследования. Выявленные гены с измененной экспрессией принадлежат к семействам ростовых и транскрипционных факторов, белкам, участвующим в кальциевом обмене, апоптозе, иммунном ответе и могут влиять на многие сигнальные и метаболические пути и механизмы, общие для патофизиологии различных структурных заболеваний сердца.

2. Методом полу количественной ОТ-ПДР подтверждено достоверное различие (р < 0,05) в уровне экспрессии 15 генов, а именно: сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF); мегакариоцитстиму-лирующего фактора (MSF); транскрипционного фактора (DEC 1); гена орфанового рецептора (NOR1); транскрипционного фактора (YY); транскрипционного фактора (АР-1); регулятора апоптоза (BCL2A1); тристетрапролина (ТТР); станиокальцина (STC); стратифина (STF); матриксной металлопротеиназы 14 (ММР14); моноцитарного хемо-таксического фактора (МСР1); киназы (МАРКК1); шаперона (HSPA1), — экспрессия которых значительно и синхронно понижена у пациентов с фибрилляцией предсердий на фоне структурного заболевания сердца по сравнению с группой лиц, не имевших сердечнососудистых заболеваний.

3. Сравнительный анализ профилей генной экспрессии с применением комплекса методов математического анализа в группах пациентов с постоянной и пароксизмальной формами ФП и пациентов с синусовым ритмом сердца без НРС в анамнезе, выявил 17 дифференциально экспрессирующихся генов, активность которых высоко коррелировала с ФП. Положительная корреляция с ФП (г > 0,77; р < 0,007) выявлена для генов, кодирующих ЛИМ-доменный белок сердечной мышцы (CSRP3), тяжелую бета-цепь миозина (MYH7), кальмодулин (CALM3) и гомеодомен-содержащий белок (PKNOX1). Гены, кодирующие металлотионеин (МТ1/2), митохондриальную альдегид-дегидрогеназу 2 (ALDH2), гуаниннуклеотид-связывающий белок (GNAL) и ras-подобный белок (RaplA) проявили отрицательную корреляцию экспрессии с ФП (г < -0,75; р < 0,002). Гены, экспрессия которых повышалась при ФП, проявляли пониженную экспрессию при ИБС (г = -0,80; р - 0,0002) и наоборот. Коррелирующие с ФП гены принадлежат к разным функциональным категориям, включая организацию сократительного аппарата кардиомиоцита, кальциевый гомеостаз,регуляциютранскрипцииипередачисигнала,межклеточные взаимодействия и окислительный стресс.

4. Изменения активности высоко коррелирующих с ФП генов более выражены при постоянной по сравнению с пароксизмальной формой данного нарушения ритма сердца.

5. Результаты позволяют предполагать возможное участие выявленных дифференциально экспрессирующихся генов в молекулярных механизмах развития фибрилляции предсердий у человека. Сформулирована гипотеза о том, что совокупность наблюдаемых изменений в активности генов при ФП может быть обусловлена дисбалансом окислительно-восстановительного потенциала миоцитов предсердий с ключевой ролью в регуляции экспрессии генов металлотионеина и альдегиддегидрогеназы.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Полученные результаты намечают пути поиска новых подходов к медикаментозному и, возможно, другим средствам противоаритмического лечения ФП. Предполагаемыми молекулярными мишенями могут явиться белки, принимающие участие в формировании соединительной ткани, воспалительном процессе, окислительном стрессе для предотвращения патологического структурного ремоделирования предсердия и снижения риска рецидивирования ФП.

Полученные результаты намечают пути поиска новых подходов к медикаментозному и, возможно, другим средствам противоаритмического лечения ФП. Предполагаемыми молекулярными мишенями могут явиться металтио-неиновые белки для предотвращения патологического структурного ремоделирования предсердия и снижения риска рецидивирования ФП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Работы последнего десятилетия позволили существенно расширить представления об электрофизиологических и молекулярных механизмах развития и поддержания ФП [187, 215, 227]. При ФП нарушается архитектоника предсердия, происходят сложные изменения в структуре и электрофизиологии клеток, получившие название «структурного и электрического ремоделирования» [И, 263].

Известно, что ФП, в том числе индуцированная в модельных системах на животных, приводит к дезорганизации саркомеров кардиомиоцитов и ослаблению сократительной функции предсердий. Гистологические исследования миокарда предсердия у больных ФП и в экспериментальных моделях, позволили надежно проследить те изменения, которые происходят в кардиомиоцитах при установлении постоянной формы ФП и при восстановлении CP [8,15,18,164]. Основные процессы связаны с разрушением нормальной структуры саркомеров, сарколеммы, Z-дисков и нарушением контактасмитохондриями,ядромивнешнеймембранойклетки.Пространство между саркомерами и ядром заполняется гликогеном. Более глубокие повреждения, связанные с изменением строения гетерохроматина в ядре и деформацией митохондрий, возможно, являются необратимыми и приводят к апоптозу поврежденной клетки. Известны многие факторы, такие, как дисфункция ионных каналов, белков кальциевого гомеостаза, дезорганизация экстраклеточного матрикса, фиброз, воспаление, окислительный стресс, в той или иной мере участвующие в нарушении молекулярных механизмов клетки при ФП [37].

Споявлениемметодов,позволяющиханализироватьэкспрессиюмножества генов одновременно, попытки использования технологии транскрипционных матриц для поиска генов, экспрессия которых может быть ответственна или, по крайней мере, коррелирована с ФП, предпринимались неоднократно [21, 51, 55, 90, 133, 134, 144, 145, 191, 192]. В работах, где применялись жесткие методы отбора дифференциально экспрессирующихся генов, списки таких генов заметно различаются, частично из-за различного набора анализируемых генов, отличий в характере структурного заболевания сердца и различного способа анализа результатов скрининга генов. Однако, могут быть подчеркнуты общие черты — корреляция с ФП обнаружена у различных представителей, но одних и тех же семейств генов, демонстрируя при этом одинаковую направленность в изменении экспрессии; не обнаружено корреляции экспрессии генов, полиморфизм которых связан с семейными формами ФП.

Последние достижения молекулярно-биологических технологий сделали возможным изучение изменений уровня мРНК одновременно тысяч генов в одном образце ткани [117, 238]. Используя возможность анализа большого числа генов с применением метода кДНК транскрипционных матриц, в данном исследовании выполнена серия экспериментов, направленных на выявление генов-кандидатов, экспрессия которых коррелирует с ФП с высокой вероятностью, на определение их роли в процессах ремоделирования предсердий при ФП на фоне структурных заболеваний сердца.

Прежде чем приступить к изучению транскрипционного профиля при ФП было проведено гистологическое исследование образцов ткани УПП, полученных во время оперативного вмешательства. Гистологический анализ показал полную сохранность структуры миокарда, достаточную для гарантированного приготовления качественных препаратов РНК из извлекаемых таким способом тканей. В Лаборатории генной инженерии ИЭК РКНПК Росмедтехнологий накоплен богатый опыт по приготовлению высококачественных препаратов РНК как из аутопсийных, так pi из образцов тканей, полученных во время хирургических вмешательств. Критерии качества РНК, включающие соотношение 28S и 18S рибосомных РНК и уровень примеси геномной ДНК, применяются в лаборатории при выделении РНК из любого источника. Кроме того, было проведено специальное исследование по оценке пределов качества препаратов РНК, необходимых для получения адекватных результатов при оценке уровня представленности мРНК в клетке [231].

В литературе нет сведений об экспрессии генов в различных отделах сердца. Впервые в Лаборатории генной инженерии ИЭК РКНПК Росмедтехнологий был проведен сравнительный анализ генного профиля в аутопсийных образцах миокарда различных отделов сердца человека с целью корректной трактовки информации, получаемой при исследовании экспрессии генов на образцах УПП. Было показано, что профили генной экспрессии существенно различаются в отделах сердца, однако различий между тканями ушек предсердий и самих предсердий не было найдено. Эти данные дают основание полагать, что изменения в транскрипционном профиле УПП могут быть характерны и для предсердий. Таким образом, было предоставлено доказательство правомочности использования образцов ткани УПП в качестве объекта исследования при ФП.

Изменения в экспрессии генов при ФП, как правило, представляют собой результат сложной комбинации многих процессов, вызванных как собственно ФП, так и характером основного заболевания. Существует трудность определенияпринадлежностивыявленныхизмененийктомуилииномузвену молекулярных механизмов, приводящих именно к развитию и поддержанию ФП на фоне сочетанного повреждения миокарда. Разница этиологических факторов, формы и продолжительности ФП, возрастные и половые различия, лекарственные препараты вносят свой вклад в характер экспрессии генов. В связи с этим сложно определить вклад собственно ФП в многофакторный процесс ремоделирования предсердий, найти убедительные доказательства, являются ли изменения уровня экспрессии генов причиной возникновения ФП, либо отражением нарушенной физиологической адаптации, или компенсаторным механизмом в ответ на развившееся нарушение функции и структуры предсердия. Поэтому при анализе генных транскриптов в тканях пациентов с ФП существенной проблемой становится проблема контроля. Мы попытались подойти к решению этой проблемы, используя корреляционный анализ результатов гибридизации с клиническими данными исследуемых групп пациентов. Кроме того, в качестве группы контроля мы использовали аутопсийные образцы ткани УПП, полученные от лиц без структурной патологии сердечно-сосудистой системы по данным патолого-анатомического исследования, что являлось отличием нашей работы от имеющихся, в которых использовались только образцы УПП, полученные интраоперациоино от пациентов со структурными заболеваниями сердца с CP, без НРС в анамнезе [41, 44, 99, 168]. Возможность использования аутопсийного материала для анализа экспрессии генов показана в ряде исследований,вкоторыхприменяласьтехнологиятранскрипционныхматриц. При сравнении образцов, взятых интраоперациоино, и аутопсийных, на фоне одного и того же заболевания выявлено, что профили экспрессии генов были сходными [162,232]. Имеются немногочисленные экспериментальные и клинические работы, свидетельствующие о том, что наличие структурной патологии сердца само по себе ведет к изменению экспрессии генов в миокарде [21, 220]. В нашей работе получены значимые различия в уровне экспрессии ряда генов в миокарде УПП у всех больных как с ФП, так и с CP, при наличии структурного заболевания сердца (ИБС, ревматический порок сердца, врожденная аномалия соединительной ткани, миксома левого предсердия) по сравнению с аутопсийным контролем, представленным образцами УПП от лиц без сердечно-сосудистой патологии. Подобного сравнительного анализа на образцах миокарда у человека с использованием метода кДНК транскрипционных матриц ранее выполнено не было. Наша работа показала, что как при хронической, так и пароксизмальной форме ФП, независимо от этиологического фактора, происходят изменения уровня экспрессии 40 из 4700 анализируемых генов по сравнению с аутопсийным контролем. По результатам методов кДНК транскрипционных матриц, ОТ-ПЦР, корреляционного и кластерного анализа отобраны 15 наиболее репрезентативных генов. Уровень их экспрессии был значительно подавлен у больных ФП с органической патологией сердца по сравнению с аутопсийным контролем. Выявленные гены относятся к транскрипционным, ростовым факторам, белкам, участвующим в регуляции различных сигнальных путей, иммунном ответе, апоптозе и к факторам, регулирующим время жизни белков. Это уже хорошо известные гены: кодирующие сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), ядерный орфановый рецептор NOR1 (NR4A3), транскрипционные факторы DEC1 (BHLHB2) и EGR1, тристетрапролин ТТР (ZFP36), цитокин МСР1 (CCL2). Обнаружена также группа из 8 генов, активность которых отрицательно коррелировала с группой аутопсийного контроля, т.е. подавлена в группе контроля по сравнению с экспрессией у пациентов с ФП, имеющих сердечную патологию. Это гены эндоглина (ENG), фактора фон Виллебранда (VWF), глютатион-8-трансферазы (GSTT1), протеин фосфатазы 1 (РРР1СА), тяжелой цепи ферритина (FTH1), экстраклеточной супероксиддисмутазы 3 (SOD3), натрийуретических факторов, предсердного (NPPA) и мозгового (NPPB).

Интерпретация этих данных, конечно, требует дополнительных исследований, однако нельзя исключить, что в выявленных группах могут оказаться гены, нарушение регуляции которых непосредственно связано с патофизиологическими процессами при ФП. Полученные данные согласуются с результатами имеющихся работ по изучению молекулярных механизмов ФП с применением транскрипционных матриц как на экспериментальных моделях [144], так и на образцах миокарда предсердий человека [191], в которых также продемонстрирован измененный уровень экспрессии обнаруженных нами семейств генов при ФП, хотя их других представителей.

В современные представления о ремоделировании предсердий при ФП укладываются выявленные нами изменения генов, принимающих участие в процессах кальциевого обмена, окислительного стресса, организации сократительного аппарата кардиомиоцита и формирования соединительной ткани, а также воспаления и тромбообразования. Взаимосвязь всех компонентов ремоделирования предсердий — электрического, структурного и сократительного, — находит свое отражение в результатах измененной транскрипционной регуляции — первичного уровня регуляции единого патофизиологического каскада.

Интересной находкой нам представилось выявленное у больных с ФП на фоне структурных заболеваний сердца снижение уровня мРНК экспрессии транскрипционного фактора — гена DEC1. Недавно предложено рассмотрение патогенеза ряда заболеваний с позиции изменений в циркадной системе на молекулярном уровне [156, 224]. Данная система была найдена как в центральной нервной системе, так и в периферических органах и тканях. Она состоит из нескольких взаимосвязанных саморегулирующихся транскрипционных и трансляционных петель обратной связи, имеющих как позитивные, так и негативные элементы. Показано, что DEC1 является сильным негативным элементом в циркадной системе, регуляция которого осуществляется через протеиновый комплекс CLOCK / BMAL [114].

В клинике на протяжении многих лет обсуждаются вопросы, связанные с вариабельностью ритма сердца, в том числе и при ФП [5].Нарушения регуляции циркадной системы характерны для сердечных аритмий. Цикличность появления симптоматики, проявление тех или иных симптомов в определенное время суток, стереотипы поведенческих реакций хорошо известны врачам при ряде заболеваний. Нейрогенный фактор, вегетативная регуляция в конечном итоге имеют молекулярные пути реализации, многие из которых на сегодняшний день не до конца идентифицированы. Поскольку транскрипция — первичный уровень регуляции, роль транскрипционных факторов, включая ядерные рецепторы, «clock», т.е. «часовые» гены, крайне важна для анализа развития изменений в патогенезе ФП, как и при любом другом патологическом процессе. Среди многих вопросов, являющихся предметом изучения патофизиологических механизмов структурного ремоделирования при ФП, роль «часовых» генов в генезе аритмии, значение ядерных рецепторов в молекулярных механизмах ФП и взаимосвязь сигнальных путей, вовлеченных в процессы ремоделирования, на наш взгляд, требует дальнейшего изучения.

При ФП перегрузка кальцием кардиомиоцитов идентифицирована на ранних сроках присутствия данного НРС [11]. Частый предсердный ритм приводит к прогрессивному повышению внутриклеточного уровня кальция, который снижает жизнеспособность клеток и индуцирует единый защитный патофизиологический путь. Его реализация включает снижение уровня кальциевых каналов на транскрипционном уровне, следствием чего является снижение кальциевого тока, снижение как входящего, так и выходящего калиевых токов. Это приводит к укорочению продолжительности ПД pi рефрактерногопериодамиокардапредсердий,индукциииподдержанииФПпо механизму «re-entry». В дальнейшем перегрузка клетки кальцием и снижение кальциевого обмена индуцирует миолизис в клетке, активирует фетальную генетическую программу, ведущую к структурному ремоделированию, снижению сократительной функции (т.н. «ошеломленный» миокард предсердия) и, как следствие, к стазу крови и тромбообразованию. Снижение уровня экспрессии генов, таких как STC — станиокальцин, STF — стратифин, участвующих в кальциевом обмене мы обнаружили у пациентов с ФП на фоне структурного заболевания сердца.

STC1 — станиокальцин-кальций — регулируемый гормон, играющий важнуюрольвкальциевомобмене.Онобратимоингибируеттрансмембранный перенос ионов кальция через L-тип кальциевых каналов [166,225,226].

Анализируя наши результаты, свидетельствующие о подавлении на транскрипционном уровне некоторых кальций-зависимых молекулярных путей, включая кальцийнейрин, МАРК — киназы, при постоянной форме ФП и, принимая во внимание центральную роль кальция в регуляции экспрессии генов [35], возможно предположить, что снижение экспрессии генов при длительно существующей ФП является следствием нарушения кальциевого гомеостаза и пространственно-временных характеристик кальциевых токов. Причем как при пароксизмальной, так и при постоянной форме ФП обнаружены однотипные изменения.

Помимо того, что STC1 — станиокальцин играет определенную роль в кальциевом обмене, возможен другой механизм его участия в структурном ремоделировании предсердий при ФП — это модулирование иммунно-воспалительного ответа [127].Он потенцирует хемокинез и уменьшает хемотаксический ответ на МСР1.

Мы обнаружили ещё два гена со сниженным уровнем экспрессии при ФП, принимающих участие в ряде процессов аутоиммунного ответа. Это ТТР, белок цинковых пальцев — тристетрапролин, белок, содержащий цинковые пальцы (домены, обеспечивающие связь с нуклеиновыми кислотами), основной регулятор биосинтеза фактора некроза опухоли [81]. На транскрипционном уровне регуляция ТТР осуществляется с помощью ростового фактора TGF-p, профибротического цитокина, повышение уровня экспрессии которого при ФП обнаружил Barth А. с соавторами [21,190].

В группе больных ФП выявлено 2,8-кратное снижение уровня МСР-1 — моноцитарного хемотаксического белка 1, которому принадлежит роль как в процессах иммунного ответа, так и в апоптозе [127].

Апоптоз — это запрограммированный процесс, с помощью которого многоклеточный организм эффективно избавляется от определенного числа клеток. В сердце с помощью апоптоза осуществляется постнатальный морфогенез. В апоптоз вовлечены множество механизмов, приводящих как к его индукции так и его ингибированию [51, 119, 176]. Установлено, что как физиологический, так и патофизиологический апоптоз регулируется протеинами из семейства Вс1-2. Вс12А — антиапоптотический протеин, — может потенциировать гибель клеток путем взаимодействия с белком Nurr77 из субсемейства NGF4A. Это реализуется в случае внутримитохондриальной локализации Nurr77 и приводит к конформационным изменениям Вс12, которые превращают этот белок из протекторного в разрушительный. Именно этот протеин обнаружил существенные изменения в группе больных с ФП по сравнению с группой контроля. Сходные данные были получены и другими авторами, которые применяли метод ОТ-ПЦР и метод к-ДНК транскрипционных матриц с целью скрининга генов при ФП у человека [8, 134]. Ген BCL2A1 предохраняет клетки от апоптоза, вызываемого активными радикалами кислорода, так что потеря этого протектора может иметь негативные последствия для кардиомиоцитов [111, 134], что позволило предположить вовлечение апоптотических процессов в ремоделирование предсердий при ФП. Подтверждением данного заключения может служить также выявленное нами при ФП резкое (28-кратное) снижение уровня экспрессии Neuron derived orphan receptor 1 (NOR1) из семейства стероид-тиреоидных ядерных рецепторов, который также принимает участие в апоптозе, как показано в ряде исследований [60].

3-5-кратное снижение уровня экспрессии у больных ФП обнаружено для гена из другого семейства — Стратифина, который является белком, вовлеченным в процесс апоптоза через киназный каскад [69,147]. Имеются убедительные доказательства того, что дало основание определить апоптоз, как характерный процесс при ФП, а именно анализ ДНК, выделенной из ткани предсердия при постоянной форме ФП, который выявил ее частичную фрагментацию. Наличие апоптоза в предсердиях пациентов с ФП может быть интерпретировано и как причина, и как следствие самого НРС. Показано, что апоптоз является частью патофизиологических механизмов при различных сердечно-сосудистых заболеваниях, в частности при кардиомиопатиях.

Одним из объяснений выраженного подавления транскрипционного процесса при ФП, выявленное у всех пациентов как с пароксизмальной, так и с постоянной формой ФП, и, следовательно, снижение синтеза протеинов может быть компенсаторная реакция организма на повышенную метаболическую потребность предсердий при фибрилляции. С целью экономии энергии происходит снижение количества синтезируемых протеинов до минимально необходимого, так же, как и при хронической ишемии [171].

Нами были идентифицирована дисрегуляция генов, принадлежащих к метаболическим классам, подтверждая нарушение биоэнергетической регуляции и повышенной энергетической потребности при ФП. Данный спектр изменений аналогичен ультраструктурной характеристике фетальных кардиомиоцитов или гибернирующего миокарда. Рядом авторов предложена концепция «клеточной адаптации через дедифференцировку при ФП» [242, 243]. Фетальный клеточный фенотип предположительно является результатом выживания кардиомицитов на фоне длительно существующего стресса, включая напряжение (stretch) и ишемию [16].

Заслуживает внимание факт, что обнаруженное в нашем исследовании снижение уровня экспрессии генов Bcl2A, STC1, SFN, MSF, VEGF при ФП у больных без клинических признаков НК, описано у пациентов с сердечной недостаточностью [244]. Кроме того, активность хорошо изученных генов натрийуретического фактора, предсердного и мозгового NPPA и NPPB, была повышена в УПП в группе пациентов с ФП, что было показано ранее другими авторами [249].

Данные факты могут быть расценены как проявления нарушенной сократительной функции миокарда предсердий при фибрилляции, и, возможно, являться теми предпосылками, которые закладывают молекулярные основы развития сердечной недостаточности у больных ФП.

Снижение уровня экспрессии генов, относящихся к семействам киназ, металлопротеиназ, выявленное в нашей работе в группе пациентов с ФП, также предполагает их возможный вклад в сократительную дисфункцию и дилатацию предсердий при данном НРС. Показано, что при ФП происходит перестройка миокарда предсердий в виде «вентрикулизации». Это связано с тем, что миокард желудочков кроме функции сократительной помпы имеет различия в нейроэндокринной регуляции. В настоящее время выявлено, что при ФП происходит перепрограммирование основных регуляторных программ в предсердиях на желудочковые. Высказывалось предположение, что данные изменения являются результатом повышения внутрипредсердного давления, сходного с изменениями в постнатальном развитии. Измененный уровень экспрессии матриксных металлопротеиназ был показан при исследовании структурно-ремоделированных предсердий при фибрилляции. В этих исследованиях протеины ADAM 10 и ADAM 15 показали повышенный уровень экспрессии [13].

В группе больных со структурными заболеваниями сердца и ФП нами обнаружен сниженный уровень экспрессии ММР14 —матриксной металлопротеиназы 14 по сравнению с группой контроля. Матриксные металлопротеиназы представляют собой ферменты —цинк-связывающие эндопептидазы, которые расщепляют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, принимающие участие как в процессе нормального, так и патологического ремоделирования. Снижение экспрессии матриксной металлопротеиназы может отражать ремоделирование внеклеточного матрикса и нарушение сократительной функции миокарда предсердий при ФП. Кроме этого, выявленное в группе ФП снижение уровня экспрессии таких генов, как ростовые факторы также может быть следствием контрактильной дисфункции, присущей ФП, с формированием фенотипа атриопатии. В ряду структурных изменений при ФП фиброз и клеточная гипертрофия, как адаптационный ответ, является наиболее частой гистологической характеристикой. Выявленное у больных с ФП изменение экспрессии генов МКР4, MSF ассоциировано с формированием фибротических изменений.

МКР4 — белок, относящийся к классу фосфатаз и регулирующий субсемейство протеиновых фосфатаз, участвующих в клеточной диффе-ренцировке и пролиферации. МКР4 взаимодействует с экстраклеточными сигнал-регулируемыми киназами ERK, которые вовлечены в формирование соединительной ткани в миокарде человека. МКР4 участвует в процессах фосфорилирования Erk. Есть работа, посвященная изучению функции и уровня экспрессии как мРНК, так и белков, относящихся к этому семейству, в которой предполагается их роль в структурном ремоделировании в миокарде предсердий при ФП у человека [97].

MSF — мегакариоцит стимулирующий фактор, известный как протеогли-кан 4, продемонстрировал сниженный уровень экспрессии в группе ФП на фойе структурного заболевания миокарда по сравнению с контрольной группой. Протеогликаны являются компонентами экстрацеллюлярного матрикса, поверхностной мембраны и соединительной ткани. Они принимают участие в клеточной пролиферации, межклеточных контактах, могут способствовать развитию гипертрофии. Кроме того, они принимают участие в процессах тромбообразования.

В последнее время уточняются механизмы развития тромбоэмболических осложнений при ФП [53,88,95], в частности роль фактора фон Виллебранда. В некоторых клинических исследованиях, посвященных этому вопросу, показано, что изменение уровня р-селектина, фибриногена, фактора фон Виллебранда в крови, регистрируется у пациентов с ФП. Причем, повышение данных показателей происходит уже при пароксизмальной форме ФП [155]. В нашей работе обнаружено повышение экспрессии гена фактора фон Виллебранда у больных со структурными заболеваниями сердца как с пароксизмальной, так и с постоянной формой ФП по сравнению с группой аутопсийного контроля. Однако, данный результат не позволяет однозначно расценивать повышение экспрессии гена фон Виллебранда как признак, специфичный для ФП, поскольку сходные изменения обнаруживаются при структурных заболеваниях сердца независимо от сердечного ритма.

В следующих сериях экспериментов мы постарались выявить гены-кандидаты, экспрессия которых коррелирует с ФП с высокой вероятностью, путем сравнения профилей генной экспрессии в ткани УПП от пациентов с постоянной и пароксизмальной формами ФП и пациентов с CP, без нарушения ритма в анамнезе. С этой целью для каждой серии последующих экспериментов формировались однородные группы образцов ткани УПП в соответствии с клиническими признаками, а именно: возраст, пол, ритм сердца, CP, пароксизмальная или постоянная форма ФП, характер основного заболевания — ИБС с наличием или отсутствием ПИКС, ревматические пороки сердца, дисплазия соединительной ткани с развитием митрального порока сердца, наличие или отсутствие НК. Для гибридизационных экспериментов использовались кДНК транскрипционные матрицы различных типов, в общей сложности было исследовано 2940 генов.

При отборе с 95% достоверностью корреляционный анализ выявил 4 группы генов, одна из которых включает 13 генов с повышенной или пониженной активностью при ФП.

Другую большую группу составили 18 генов, активность которых ассоциирована с контрольными образцами. Также была выявлена корреляция 3-х генов с признаком «пола» и 2-х генов — с признаком «ИБС». При таком жестком отборе с 95% достоверностью корреляции активности дифференциально экспрессирующихся генов с другими клиническими признаками выявлено не было. Используя метод транскрипционных матриц для анализа экспрессии генов в образцах УПП от пациентов с пароксизмальной и постоянной формами ФП и пациентов с синусовым ритмом, нам удалось обнаружить, что изменение экспрессии ряда генов при ФП в ту или иную сторону имеет определенную динамику и заметно уже на стадии пароксизмальной формы ФП.

Следует подчеркнуть, что изменения в активности генов были более выражены при постоянной, чем при пароксизмальной форме ФП, и наблюдалась примерно двукратная разница в уровне экспрессии генов с положительной или отрицательной корреляцией при ФП по сравнению с СР. Кроме того, гены, экспрессия которых повышалась при ФП, проявляли пониженную экспрессию при ИБС и наоборот.

Выявлена высокая положительная корреляция экспрессии генов, кодирующих ЛИМ-доменный белок сердечной мышцы (CSRP3), тяжелую бета-цепь миозина (MYH7), кальмодулин (CALM3) и гомеодомен-содержащий белок (PKNOX1) с ФП (г>0,77, р<0,007). Напротив, гены, кодирующие металлотионеин (МТ1/2), митохондриальную альдегиддегидрогеназу 2 (ALDH2), гуаниннуклеотид-связывающий белок (GNAL) и ras-подобный белок (RaplA) проявили отрицательную корреляцию экспрессии с ФП (г <-0,75, р<0,002).

В группе генов, положительно коррелирующих с ФП, нами обнаружен ген тяжелой цепи бета-миозина (MYH7) и ген белка, несущего цистеин-богатый ЛИМ домен (CSRP3), которые отвечают за сборку и функционирование сократительного аппарата кардиомиоцита. Увеличение экспрессии этих генов при постоянной форме ФП было показано у человека [21, 168, 192]. Медленный бета-миозин, основной сократительный белок желудочков, функционирует с гораздо меньшими энергетическими затратами, более экономично, хотя и более медленно, чем быстрый предсердный альфа-миозин, как было показано ранее [180]. Так что, далее небольшой сдвиг в экспрессии миозиновых изоформ в фибриллирующем предсердии может внести существенные изменения в эффективность работы сердечной мышцы.

Увеличение активности генов белков, несущих цистеин-богатые ЛИМ-домены, FHL1 и CSRP1, FHL2 (андроген-рецептор зависимый) и CSRP3, которые участвуют в функционировании не только сократительного, но и транскрипционного аппарата клетки [214], было продемонстрировано в клинических исследованиях и на экспериментальных моделях [21,134].

Не противоречат ранее проведенным исследованиям [51] и наши данные о повышении при ФП активности генов межклеточных контактов (коннексин GJA5), внеклеточного матрикса (COL1A1, IGFBP2) и кальциевого обмена (CALM3, CALML3), хотя следует заметить, что в этом случае речь идет не столько о конкретных генах, сколько о представителях тех же семейств.

Среди генов со сниженной при ФП активностью нами впервые обнаружены гены митохондриалыюй альдегид дегидрогеназы (ALDH2) и метал-лотионеина (МТ1/2) — двух важнейших ферментов дезактивации системы окислительного стресса. Увеличение активности генов, усиливающих окислительные процессы, и ослабление экспрессии генов, кодирующих антиокислительные ферменты, было описано в миокарде УПП от пациентов с ФП [133]. Снижение активности гена ALDH2 приводит к накоплению ацетальдегида. Избыточное накопление ацетальдегида, в свою очередь, приводит к окислению и инактивации большинства цистеин содержащих металло-координирующих белков, в том числе ЛИМ-домен содержащих белков, ответственных за организацию Z-дисков саркомеров, и множества транскрипционных факторов, содержащих в структуре цинковые пальцы (Zn-finger). К тем же последствиям, что и увеличение активной концентрации ацетальдегида приводит накопление других известных форм активного кислорода: пероксинитрил а, нитротирозина, сульфоксида, перекиси водорода и др. Как результат такого накопления происходит активное нитрование тирозиновых остатков в белках сократительного аппарата миоцитов при ФП, что уже было показано при исследовании ФП другими авторами [168].

Заметим, что ген ALDH2 интересен еще и тем, что именно он обеспечивает биодоступность, т. е. опосредует биотрансформацию нитроглицерина [58, 240].Всвязисэтимпредставляетсянеобходимымуточнитьфармакодинамику нитроглицерина и его любых производных, а также лекарств, содержащих аргинин, учитывая возможность потенциирования окислительного стресса кардиомиоцитов при их использовании у больных ФП.

Металлотионеин (МТ1, МТ2, МТЗ) — небольшой белок, почти на 30% состоящий из цистеиновых остатков и повсеместно экспрессирующийся в норме на невысоком уровне. При любых повреждениях ткани: механических, химических или температурных, — происходит индукция этих генов и эффективность их индукции например в глиальной ткани коррелирует, с восстановлением функции мозга при травмах [62]. Помимо хорошо известных функций этого металл-связывающего белка, важного переносчика цинка, абсолютно необходимого для работы многих разных белков, обнаружено, что при его дефиците резко подавляется экспрессия некоего малоизученного гена Р311, которому приписывается роль антифибротического агента [170]. Уменьшение экспрессии Р311 приводит к активации всей цепи регуляторных процессов, связанных с переходом TGFb из латентной формы в активную [196]. Значительное подавление экспрессии гена Р311 показано недавно на экспериментальной модели ФП [55].

Представляется целесообразным обратить внимание на тот факт, что МТ является лигандом для мегалина (LRP2), одного из представителей семейства ЛНП — рецепторов [136], которые обладают способностью интернализоваться, захватив с собой лиганд после взаимодействия с ним. Недавние исследования [12] показали, что доставленные таким путем в нервные клетки МТ или его синтетические аналоги, пептиды, индуцировали нейритный рост, регенерацию и выживание нейронов через активацию ERK, PKB/Akt и CREB. В связи с этим, по аналогии, можно наметить направления поиска новых путей и молекулярных мишеней при лечении ФП.

Кроме ALDH2 и МТ, предохраняющих клетки от окислительного стресса, в наших экспериментах было обнаружено снижение активности гена RAP1 А, также влияющего на эффективность защиты клетки от окислительного стресса. RAP1A является конкурентным ингибитором активности белков семейства RAS-подобных малых ГТФаз (RAC1, RHOA и др.), регуляторных белков, управляющих системами построения внутриклеточного матрикса и сократительного аппарата и генерирующих активные формы кислорода через активацию NADPH оксидазы [189].

Не менее важной представляется участие гена RAP1A в межклеточной коммуникации через щелевые контакты, играющие определяющую роль в электрической проводимости [234]. Подавление экспрессии гена RAP1A может внести определенный вклад в нарушение координированного электрического возбуждения кардиомиоцитов при ФП.

В итоге наши результаты приводят к предположению, что при ФП может существовать и самоподдерживаться состояние окислительного стресса, одним из ключевых элементов которого представляется существенное снижение активности металлотионеиновых генов. Наэто косвенно указывают также экспериментальные данные, полученные на модели обратимой ФП [270].

Если приведенные рассуждения правильны, то можно сделать ряд заключений о возможных новых путях профилактики и лечения ФП, даже при отсутствии знаний о способах увеличения активности металлотионеиновых генов, хотя именно это представляется наиболее перспективным.

Методы для ослабления активности прооксидантных ферментов и усиления антиоксидантных уже сегодня известны и являются предметом клинических исследований. Это, например, применение препаратов из группы статинов, ингибирующих 3-hydroxyl-3-methylglutaryl coenzyme А (HMG-CoA) reductase; а также липофильных производных фосфатов аскорбиновой кислоты, эффективно доставляющих аскорбат в клетки.

Такие эффекты статинов как: антиоксидантный, противовоспалительный, нейромодулирующий,антипролиферативный,мембрано-стабилизирующий, уже послужили основанием для проведения клинических исследований, направленных на определение целесообразности использования этих средств с целыо предотвращения развития ФП, в частности, после операций на сердце [199, 235].

Также ведутся клинические исследования по применению таких антиок-сидантов как витамины С и Е с целыо уменьшения риска развития послеоперационных пароксизмов ФП. [52,207,208]

Альтернативными средствами лечения ФП могут также стать генно-инженерные препараты зрелой формы TGFb или пепдидомиметики, способные конкурировать с LAP пептидом латентного TGFb и, возможно, другие.

Таким образом, мы полагаем, что данная работа позволяет наметить не только направления будущих исследований, касающихся молекулярных механизмов возникновения, поддержания и последствий ФП, но также открыть новые перспективы в разработке подходов к ее лечению.

Полученные данные позволяют охарактеризовать специфический спектр изменений на уровне мРНК, отражающий не только процессы ремоделирования, а таюке адаптационные механизмы к длительно существующему метаболическому стрессу при ФП в виде подавления предсердно-специфической транскрипционной активности. Вероятно, транскрипционные изменения, найденные в нашей работе, в большей мере представляют собой следствие, а не причину ФП. Однако, данные нарушения могут формировать субстрат ее поддержания, являясь аналогом пусковых механизмов, инициирующих ФП, которую расценивают как самоподдерживающееся заболевание — «наличие ФП потенцирует субстрат ее же возникновения» [263].