Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Аналитическая валидация и оценка применимости оптимизированного протокола фотометрического определения общей антиоксидантной активности в экспериментальной и клинической медицине

005012612

На правах рукописи

ШУШКОВА Ирина Геннадьевна

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ВАЛИДАЦИЯ И ОЦЕНКА ПРИМЕНИМОСТИ ОПТИМИЗИРОВАННОГО ПРОТОКОЛА ФОТОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 2 МДР 2012

Саратов-2012

005012612

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Островский Олег Владимирович.

Официальные оппоненты:

Луцевич Игорь Николаевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гигиены медико-профилактического факультета ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И.Разумовского Минздравсоцразвития России;

Бондарь Татьяна Петровна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой клинической лабораторной диагностики ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный университет».

Ведущая организация - Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ставропольская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита диссертации состоится 2012 г. в _часов на

заседании диссертационного совета Д 208.094.04 при ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И.Разумовского Минздравсоцразвития России по адресу: 410012, Саратов, ул. Большая Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И.Разумовского Минздравсоцразвития России.

Автореферат диссертации разослан «$> 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Музурова Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Выяснение важнейшей роли соотношения активации свободно-радикальных процессов и ограничивающей функции антиоксидантной системы в развитии клеточного повреждения привело к многочисленным, но не всегда успешным, попыткам применения специальных терапевтических приемов (Ланкин В.З., 2001; Qureshi G А., 2007; Меныцикова Е.Б., 2008; Miwa S.,2008; Moussa S.A., 2008; Sfrent-Comateanu R., 2008; Bondy S., 2010). Наиболее часто для коррекции подобных состояний используют лекарственные препараты с антиоксидантным действием (аскорбиновая кислота, мекеидол, витамины А, Е и др.). При этом одной из наиболее вероятных причин неэффективности антиоксидантной терапии эксперты называют отсутствие четких методических подходов для определения показаний к назначению препаратов, мониторингу эффективности лечения, общепринятой методологии титрования дозы (Beckman A.J., 2003; Sagar S.M., 2005; Lawenda B.D., 2008; Monfared S.,2009; Bansal D., 2Û11; Showel! M.G, 2011). Учитывая, что антиоксидантная терапия является разновидностью метаболической терапии, очевидна необходимость лабораторного теста для принятия решения о назначении препарата и достаточности интервенции. A.A. Кишкун (2007) предложил использовать для этого анализ общей антйоксидантной активности (ОАОА) сыворотки крови. К тому же, в отечественных нормативных документах (Приказ МЗ РФ № 64 от 21 февраля 2000 г.) рекомендовано определять антиокислительную способность крови (п. 4.15.4.) и общую антиоксидантную активность сыворотки, плазмы крови (п. 6.3.3.).

Однако несмотря на это, в клинической лабораторной практике анализ антиоксидантной активности сыворотки крови не получил широкого распространения. Это, прежде всего, связано с отсутствием рекомендованных к клиническому применению надежных методик и коммерчески доступных реагентов, поэтому разработка нового метода анализа ОАОА в биологических объектах является актуальной задачей клинической лабораторной диагностики.

В соответствии с требованиями лабораторной аналитики этот метод должен иметь понятный молекулярный механизм, быть валидированньщ для определенных биологических объектов, иметь аналитические и экономические характеристики, пригодные для практического применения (Долгов В.В.,2009; Малахов В.Н., 2010; Меньшиков В.В.,2010). За основу для разработки нового метода определения антиоксидантной активности в биологических жидкостях может быть выбрана процедура, описанная Пиллигрини с соавт. (1997) для анализа продуктов питания и фармацевтического сырья. Этот метод основан на способности различных веществ взаимодействовать с АБТС-катион-радикалом (АБТО+). Согласно требованиям надлежащей лабораторной практики при внедрении нового метода, он должен быть всесторонне изучен в строгом соответствии с отечественными и международными стандартами (USP 23, ICH, NCCLS, FDA, ISO, CLSI, EURACHEM, IUPAC, ГОСТ-ИСО-5725 и ГОСТ-ИСО-11843). Другим важным направлением исследований при внедрении нового метода в клиническую практику является изучение интерпретируемости

3

результатов измерения ОАОА в биологических объектах. Для этого в первую очередь требуется изучение внутри и межиндивидуальной биологической вариабельности результатов лабораторного теста и его способности реагировать на изменение измеряемого показателя (Долгов В.В.,1995; Меньшиков В.В.,1997; Фрейзер К.Г., 2010).

На основании вышеизложенного можно заключить, что на данный момент лабораторная диагностика нуждается в лабораторном тесте для определения антиоксидантной активности в биологических жидкостях, отвечающего современным требованиям лабораторной аналитики и обладающего достаточной интерпретируемостью, получаемых результатов.

Диссертация подготовлена и выполнена по плану НИР ВолгГМУ на кафедре теоретической биохимии с курсом клинической биохимии. Научное сотрудничество осуществлялось с НУЗ «Железнодорожная поликлиника №1» и ФГБУЗ "Волгоградский медицинский клинический центр ФМБА". Тема диссертации утверждена на заседании ученого совета ВолгГМУ. Работа выполнялась в рамках общего направления работы кафедры теоретической биохимии с курсом клинической биохимии.

Цель исследования

Целью исследования являлось проведение аналитической валидации и оценки применимости методов анализа общей антиоксидантной активности сыворотки крови и мочи в экспериментальной медицине и клинической лабораторной практике.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оптимизировать протокол фотометрического определения ОАОА сыворотки крови и мочи.

2. Провести кросс-валидацию двух методов анализа ОАОА - АБТС-теста и метода обесцвечивания АБТС,+ и оценить влияние веществ - компонентов биологических проб на результаты анализа ОАОА.

3. Оценить экономические и аналитические преимущества использования предлагаемого метода анализа ОАОА по сравнению с другими тестами, применяемыми для этой цели в клинической лабораторной диагностике.

4. Оценить возможность использования метода определения ОАОА для анализа образцов сыворотки крови лабораторных животных при моделировании процесса, сопровождающегося окислительным стрессом.

5. Определить применимость метода анализа ОАОА в клинической лабораторной практике для мониторинга состояния антиоксидантной системы у пациентов с сахарным диабетом (СД) 2-го типа в стадии декомпенсации.

6. Изучить возможность проведения мониторинга эффективности антиоксидантной терапии с использованием метода обесцвечивания АБТС,+.

Научная новизна работы

В результате проведенной работы был разработан оптимизированный протокол фотометрического определения ОАОА сыворотки крови и мочи с помощью метода обесцвечивания АБТС,+ и проведена процедура его валидации.

Впервые изучена популяционная вариабельность показателей ОАОА в сыворотке крови и моче. При этом выявлен двухмодальный характер распределения показателя в популяции условно здоровых людей.

Впервые изучена индивидуальная вариабельность. Показано, что она в моче в 3 раза выше, чем в сыворотке крови.

Впервые был проведен корреляционный анализ взаимосвязи результатов определения ОАОА методом обесцвечивания АБТС,+ с возрастом, полом, а также содержанием веществ, вносящих основной вклад в результаты анализа.

На группе здоровых добровольцев впервые показано, что ОАОА может быть повышена в результате действия антиоксидантного комплексного препарата «Лютеин Форте».

Научно-практическая значимость и внедрение результатов исследования:

На основании международных и отечественных правил, руководств, рекомендаций проведена кросс-валидация методов анализа ОАОА, в ходе которой разработан оптимизированный протокол фотометрического определения антиоксидантной активности биологических проб с помощью метода обесцвечивания АБТО+. Новый метод анализа ОАОА превосходит уже имеющиеся коммерчески доступные аналоги по своим аналитическим характеристикам, он не требует дорогостоящего оборудования, с его использованием можно достаточно быстро и с минимальными трудовыми затратами оценить антиоксидантный статус пациента.

Определены границы референтных интервалов ОАОА в сыворотке крови и моче у условно здоровых лиц, проживающих на территории Волгоградской области.

В соответствии с ГОСТом Р 53022.2-2008 были рассчитаны биологически обоснованные критерии точности метода обесцвечивания АБТО\ Показана возможность проведения рутинного внутрилабораторного контроля качества измерений.

Установлено референтное значение различий (КСУ), необходимое для использования метода в мониторинговых обследованиях при проведении терапии антиоксидантами в клинической практике.

На основании предложенного протокола метода обесцвечивания АБТС,+ могут быть созданы коммерческие наборы реагентов для определения ОАОА сыворотки крови и мочи.

Положения, выносимые на защиту:

1. Метод обесцвечивания АБТС,+ превосходит традиционно используемый АБТС-тест по своим аналитическими характеристикам: коэффициент чувствительности выше в 1,4 раза; предел обнаружения и определения ниже в 3 и 2,5 раза соответственно; воспоризводимость и сходимость лучше в 1,9-2,5 и 2-3,5 раза. Применение метода обесцвечивания АБТС«+ в клинической лабораторной практике позволяет снизить экономические затраты в 14,3 раза по сравнению с АБТС-тестом.

2. Установлено, что АБТС,+ в основном взаимодействует с низкомолекулярными компонентами биологических жидкостей - мочевой кислотой, цистеином, аскорбиновой кислотой, глутатионом и триптофаном. Их вклад составил около 70% при анализе сыворотки крови здоровых лиц.

3. Метод обесцвечивания АБТС,+ может быть использован в экспериментальной медицине для мониторинга развития окислительного стресса при моделировании хронической эндотоксемии у крыс наравне с классическим АБТС-тестом, а также анализом продуктов перекисного окисления липидов.

4. Применение метода обесцвечивания АБТС*+ позволяет оценить состояние антиоксидантной системы у больных СД 2-го типа в стадии декомпенсации и выявить лиц со сниженной ОАОА, а также рекомендовать и мониторировать антиоксидантную терапию.

Внедрение в практику

Отдельные положения и выводы нашли применение в учебном процессе для подготовки врачей клинической лабораторной диагностики на кафедре теоретической биохимии с курсом клинической биохимии ГБОУ ВПО «ВолгГМУ»; на кафедре клинической лабораторной диагностики ФПДО ГБОУ ВПО «СтГМА»; на кафедре клинической лабораторной диагностики с курсом медицинской техники и метрологии ГБОУ ВПО «СПбГМУ им. И.П.Павлова»; в исследовательской работе НИИ фармакологии ГБОУ ВПО ВолгГМУ и НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН.

Личный вклад автора в научное исследование

Автором непосредственно проведены все указанные в работе анализы с использованием метода обесцвечивания АБТО+, АБТС-теста, метода анализа железовосстанавливакчцей способности (FRAP), метода определения продуктов перекисного окисления липидов и других исследований; статистическая обработка и анализ полученного материала.

Апробация работы

Апробация диссертации состоялась на базе Волгоградского государственного медицинского университета 13 декабря 2011г. Материалы диссертации доложены на 64-й, 67-й и 68-й научных конференциях студентов и молодых ученых ВолГМУ «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2006, 2009, 2010); конференции «Молодежь и наука: итоги и перспективы YSRP 2007» (Саратов, 2007); 63-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2008); Молодежном научно-практическом симпозиуме «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия» (Волгоград, 2010); 56-й региональной конференции «Инновационные достижения фундаментальных и прикладных медицинских исследований в развитии здравоохранения Волгоградской области» (Волгоград, 2009); 111 Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, 2009); конференции «Проблемы биомедицинской науки

третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2010); VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 4 - в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, семи глав (обзор литературы; материалы и методы, 5 глав, описывающих результаты собственных исследований и их обсуждение), выводов, практических рекомендаций и приложения. Список литературы включает 27 отечественных и 182 зарубежных источника. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 18 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Дшайн исследования

В работе предложен новый метод клинической лабораторной диагностики антиоксидантного статуса человека-метод обесцвечивания АБТС,+. Так как данный тест ранее не использовался в клинической практике, то необходимо было провести его валидацию. Был разработан следующий протокол валидации:

1. Аналитическая валидация. На этом этапе были установлены основные аналитические характеристики метода обесцвечивания АБТС,+ и решен вопрос о преимуществах нового диагностического подхода по сравнению с уже существующими.

2. Оценка интерпретируемости результатов анализа ОАОА выполнена в два этапа:

Доклинический этап. В экспериментальной модели хронического воспаления, сопровождающегося развитием окислительного стресса, показана адекватность метода обесцвечивания АБТО" для мониторинга ОАОА при развитии патологического процесса.

Клинический этап. Этот раздел необходим для оценки применимости метода обесцвечивания АБТС,+ в клинической практике для решения вопроса о необходимости назначения антиоксидангных препаратов и мониторинга эффективности данной терапии. Здесь проведено обследование пациентов с заболеванием, сопровождающимся развитием окислительного стресса (сахарный диабет 2-го типа), и доказана применимость метода обесцвечивания АБТС»+ для мониторинга ОАОА при применении комплексного антиоксидантного препарата «Лютеин Форте».

Материалы и методы исследования

ОАОА оценивали с помощью классического АБТС-теста и нового метода обесцвечивания АБТС,+. АБТС-тест, предложенный Райс-Эванс с соавт. [Rice-Evans С., 1994], основан на способности метгемоглобина катализировать окисление АБТС в присутствии пероксида водорода с образованием катион-

радикала АБТО* В отличие от АБТС-теста при оценке ОАОА методом обесцвечивания АБТО+ вещества взаимодействуют с уже окисленным АБТС,+. На основании методики Пиллигрини с соавт. (1997) был разработан собственный оптимизированный протокол определения ОАОА с использованием метода обесцвечивания АБТО+.

В исследовании была проведена оценка следующих аналитических характеристик:

1. Определение веществ, влияющих на ОАОА биологических проб человека.

2. Исследование линейности и определение диапазона метода.

3. Установление воспроизводимости и сходимости метода.

4. Установление предела обнаружения и предела количественного

определения.

5. Изучение стабильности реактива.

Изучение влияния естественных метаболитов на результаты анализа ОАОА проводили, используя растворы веществ - компонентов биопроб, взятых в физиологически значимых концентрациях.

Для оценки сходимости и воспроизводимости руководствовались рекомендациями CLS1 document ЕР17, ISO 11843-2-2000,

При исследовании линейности метода и рабочего диапазона концентрации. руководствовались рекомендациями ICH Q2B Guidelines, 1996; IUPAC Technical Reports, 2002; CLSI document EP6-P, 2004. Для этого использовали растворы стандартного образца (галловая кислота) в 5 различных концентрациях.

Оценку пределов обнаружения проводили в соответствии с ГОСТ-Р-ИСО-11843-2-2007 для случая линейной калибровки и ISO 11843-3-2000.

Для определения величины предела надежного обнаружения использовали эмпирический подход, описанный в рекомендациях EURACHEM Guidance document, 1998.

Мы проанализировали стабильность рабочего реактива для метода обесцвечивания АБТС,+. Рабочий реактив хранили в защищенном от света месте при температуре +4 °С в течение 1 недели. Реагенты для проведения АБТС-теста хранили в защищенном от света месте при температуре +4 °С в течение 6 месяцев. Стабильность реактивов изучали, анализируя спектральные характеристики растворов реагентов.

Методика анализа ОАОА апробирована в экспериментальной модели хронической эндотоксемии у крыс. Работа выполнена на 15 крысах (8 крыс в контрольной группе и 7 в экспериментальной). Индукция хронической эндотоксемии у крыс проводилась липополисахаридом Salmonella typhimurium (LPS) согласно протоколу, предложенному К. Kawai (1993). Развитие воспалительного процесса определяли по СОЭ. Изменение окислительно-восстановительного баланса контролировали по содержанию маркеров окислительного повреждения макромолекул (содержание гидро- и липоперекисей методом с кселиноловым оранжевым (Ramos-Vasconcelos G.R., 2002), МДА по методу Л.И. Андреевой (1988), и оценивая функциональную активность

антиоксидантной системы с помощью анализа ОАОА, измеренную двумя методами - АБТС-тестом и методом обесцвечивания АБТС,+.

Для определения границ референтного интервала ОАОА были исследованы 157 образцов сыворотки условно здоровых добровольцев (79 мужчин в возрасте 18-54 года и 78 женщин - 18-72 года). Все участники исследования прошли плановое профилактическое медицинское обследование, на основании которого были признаны здоровыми. Любое острое и хроническое заболевание являлось критерием для исключения из группы.

При исследовании внутрииндивидуальной вариабельности обследовали 11 условно здоровых добровольцев. Образцы крови забирали с интервалом в 1 неделю в течение 3 недель.

В работе были исследованы 50 образцов сыворотки крови больных СД 2-го типа (15 мужчин и 35 женщин в возрасте 45-85 лет) у которых был ранее верифицирован диагноз согласно критериям ВОЗ в течение 1-12 лет от начала заболевания. Среди обследованных у 13 пациентов был выявлен неосложненный СД 2-го, а у 37 - течение заболевания сопровождалось развитием сопутствующих патологий: диабетической нефропатией (7 человек); диабетической ретинопатией (9 человек); одновременно нефропатией и нейропатией (8 человек); нефропатией и ретинопатией (8 человек); нейропатией и ретинопатией (2 человека). Забор крови осуществляли при поступлении в стационар до проведения лечебных мероприятий, направленных на компенсацию СД 2-го.

Для оценки влияния антиоксидантного препарата на результаты анализа ОАОА сыворотки крови у здоровых добровольцев (п=7), все обследованные получали 2 раза в день, в течение 1 недели, по одной капсуле препарата Лютеин Форте (производитель «B-МИН», ТУ 9197-006-43298286-04), в состав которого входили следующие антиоксиданты: каротиноиды (лютеин, зеаксантин), витамины (А, Е, С), таурин, флавоноиды гинкго билоба. Забор крови осуществляли до и спустя 1 неделю после приема препарата.

Обработку результатов исследования проводили с использованием встроенных функций программы MC Excel (среднее значение, стандартное отклонение, стандартная ошибка, 95%-ный доверительный интервал, медиана, перцентили) и программы Stastitica 6,0 (StatSoft). Количественные показатели описывали в терминах медианы и 95%-ного доверительного интервала (95% ДИ). Достоверность различий между выборками несвязанных между собой данных оценивали по критерию Манна-Уитни. Гипотезу о существовании различий между выборками принимали при уровне р<0,05. При анализе выборок связанных данных использовали критерий Вилкоксона.

Результаты исследования

1.Оптимизированный протокол проведения метода обесцвечивания АБТС,+. АБТС,+ получали инкубацией 5 мл 7 мМ АБТС с 1 мл 14,7 мМ (NHUhSiOs при комнатной температуре в течение суток. Далее перед проведением анализа концентрированный раствор АБТС' ' разводили дистиллированной водой до оптической плотности A7i4=0,700±0,02 o.e. Осадок удаляли фильтрацией. Затем к 900 мкл разбавленного раствора АБТС,+ добавляли 50 мкл раствора образца.

9

Реакционную смесь инкубировали в течение 4 минут при комнатной температуре. Оптическую плотность измеряли при длине волны 734 нм. При исследовании ОАОА сыворотку крови и образец мочи разводили физиологическим раствором в 10 и 25 раз соответственно. Полученные результаты представлены в эквивалентных концентрациях стандартного вещества - галловой кислоты (GAE). Этот подход является общепринятым при исследовании ОАОА биологических проб другими методами (Wang С.С., 2004; Prior R.L., 2005; Apak R., 2008).

2. Вклад различных веществ в результаты анализа ОАОА. Было проведено разделение низко- и высокомолекулярных компонентов сыворотки крови условно здоровых лиц с помощью системы Микрокон 30 (производитель Millipore, Франция). Установлено, что наибольшее влияние на величину ОАОА сыворотки крови оказывают низкомолекулярные вещества (около 70% от величины ОАОА образца).

Анализ влияния отдельных компонентов биопроб человека показал, что АБТС,+ в основном взаимодействует с мочевой кислотой, цистеином, аскорбиновой кислотой, глутатионом и триптофаном. Аналогичные результаты были получены при изучении АБТС-теста.

Таким образом, метод обесцвечивания АБТС,+, также как и классический АБТС-тест, чувствителен к основным антиоксидантам сыворотки крови. Интерферирующими веществами при анализе образцов биологических проб являются мочевая кислота и белки сыворотки крови. По всей видимости, их вклад необходимо учитывать только при патологических состояниях, сопровождающихся гиперурикемией, гипо- и гиперпротеинемией.

3. Аналитические характеристики методов анализа ОАОА

Линейность. Оценку линейности проводили с помощью стандартного

образца галловой кислоты (рис.1 ).

А)

Б)

I

о

х 20 с

5 10

опытные данные

- линия тренда

- границы 95% ДИ

0,00 0,01 0,02 0,03 0,04

0.05 0,06 0,07 Концентрация, u M

S

§ 30 ? 25

R'vCifft2? jrrt.OOOÎ

■ опытные данные

-линия тренде

.....границы 95% ДИ

> <4^03,^4132.« 1 ?,ft7U7l»>*X+(4/Î208 7*1,2 5 J>4?) ЬГ'Ъ.ШП p<U (Hi-

fi ,00 0,01 0.02 0.03 0,04 0,05 0,«

0.07 0,08 0.09 0,10 Концентрация, мМ

Рисунок I. Диаграммы рассеяния и регрессионные прямые для зависимости степени обесцвечивания от концентрации галловой кислоты при анализе методом обесцвечивания АБТО+ (А) и АБТС-тестом (Б).

Примечание: Регрессионные прямые приведены с указанием границ 95%-ного доверительного интервала (ДИ).

I0

Для метода обесцвечивания АБТС*+ (рис,1А) в диапазоне концентраций от 0,005 до 0,07 мМ GAE не было выявлено существенных отклонений от линейности калибровочного графика (R'=0,9923). АБТС-тест (рис.)Б) был линеен в диапазоне от 0,04 до 0,1 мМ GAE (Rz=0,9807). Наличие линейной зависимости подтверждает равномерное распределение отклонения Y между положительными и отрицательными значениями для всех исследованных концентраций стандартного образца. Указанный диапазон концентраций гораздо ниже, чем референтные пределы ОАОА в сыворотке крови здоровых людей, поэтому перед анализом образцы сыворотки следует разбавлять в 10 раз для работы в линейном диапазоне концентраций.

Согласно уравнениям линейной регрессии, представленным на рисунке 1А и 1Б, можно заключить, что средний коэффициент чувствительности был выше у метода обесцвечивания АБТС'4" по сравнению с АБТС-тестом.

Сходимость и воспроизводимость. Анализ воспроизводимости/сходимости проводили, используя образцы эталонного вещества с высоким и низким уровнями ОАОА и образца биологической пробы человека (мочи), стабильного при хранении. Коэффициент внутрисерийной вариации (CV,n!ra assay) для метода обесцвечивания АБТС,+ составил 1,9-2,8% и для АБСТ-теста-4,6-8,8%. Воспроизводимость была также выше у метода обесцвечивания АБТС,+ по сравнению с АБТС-тестом (CV,ota| был равен 3,4-6,1% и 8-13,4%, соответственно).

Предел обнаружения и предел количественного определения. В соответствии ГОСТ-Р-ИСО-11843-2-2007 предел обнаружения для метода обесцвечивания АБТС»" составил 1,40 мкМ эквивалентных концентраций галловой кислоты (GAE), в то время как для АБТС-теста - 9,14 мкМ GAE. Минимальная надежно обнаруживаемая концентрация оказалась равной 12 мкМ GAE и 30 мкМ GAE для метода обесцвечивания АБТС,+ и АБТС-теста соответственно.

Стабильность рабочего реактива. Анализ стабильности реактивов для методов изучения ОАОА показал, что все реактивы для проведения АБТС-теста стабильны в течение 2-6 месяцев, в то время как рабочий раствор АБТС-', необходимый для метода обесцвечивания, рекомендуется использовать в течение одной рабочей смены. С другой стороны, его приготовление требует минимальных трудовых затрат, по сравнению с реактивами для АБТС-теста.

4. Себестоимость методов анализа ОАОА

Расчет величин себестоимости одного анализа каждым из методов исследования ОАОА проводили в соответствии с приложением 13-го приказа № 380 Минздрава России. Полученные результаты расчетов для методов анализа ОАОА, используемых в научных публикациях, представлены в таблиц 1. Было установлено, что наиболее экономически обоснованным является метод обесцвечивания АБТС,+.

Таблица 1

Величины себестоимости анализов ОАОА различными методами

Метод Себестоимость одного анализа, руб. Доступность готовых наборов в России

АБТС-тест 375,498 + :

ORACfl 169,759 -

FRAP 59,341 -

CUPRAC 407,62 +

Метод обесцвечивания АБТС,+ 27,881 -

Примечание: СЖАСи. - оценка способности абсорбировать радикалы кислорода с флуоресцеином; СиРИАС- анализ антиоксидантной способности по восстановлению меди.

5.Проведение внутрилабораторного контроля качества

Для проведения внутрилабораторного контроля качества анализа ОАОА в соответствии с приказом Ш РФ от 26.05.2003 г., № 220, и ГОСТом Р 53022.3-2008 были установлены биологически обоснованные критерии точности методов анализа (табл.2).

На полученые результаты расчетов необходимо ориентироваться при проведении внутрилабораторного контроля качества результатов измерений ОАОА.

Оценка параметров точности метода обесцвечивания АБ'ГС,+ и АБТС-теста, полученных в нашей лаборатории, показала, что результаты анализа ОАОА, полученные двумя методами, отвечают установленым выше критериям. При этом, большей правильностью обладает метод обесцвечивания АБТС,+, для которого значение смещения составило 3,7-4,9%, в то время как для АБТС-теста величина отклонения от истиного значения была несколько выше — 7,4-8,5%.

Анализ карт Леви-Дженнингса показал, что отклонений результатов измерений за контрольный передел обнаружено не было.

Таблица 2

Биологически обоснованные критерии точности методов анализа ОАОА

Метод анализа ОАОА Целевые значения, % Предельно допустимые значения, %

CV В CVio Вю CV20 В20

Метод обесцвечивания АБТС*+ 7,1 3,6 9,7 8,0 9,0 6,7

АБТС-тест 13,7 7,0 18,8 15,4 17,2 13,0

6. Оценка применимости метода анализа ОАОА в экспериментальной медицине. При хронической эндотоксемии у крыс типичные проявления воспалительного процесса (СОЭ) развивались медленно, в течение месяца. Более выраженные изменения наблюдались при исследовании маркеров окислительного

стресса. Все лабораторные показатели изменялись достоверно к концу 4-й недели по сравнению с их исходным значением (р<0,05 по Вмлкоксону). Содержание гидро- и липоперекисей, первичных продуктов окислительной модификации липидов достоверно увеличивалось к 4-й неделе на 60,8% по сравнению с контрольной группой. Аналогичным образом изменялась концентрация таких конечных продуктов перекисного окисления липидов, как ТБК-реактивные вещества. Можно заключить, что LPS токсин при длительном введении вызывал типичную воспалительную реакцию, сопровождающуюся выраженной лероксидацмей.

Однако наиболее ранним маркером окислительного стресса у крыс с хронической эндотоксемией оказалась ОАОА плазмы крови, измеренная методом обесцвечивания АБТС,+(рис.2). В отличие от всех остальных показателей, она достоверно снижалась уже к концу второй недели эксперимента. К 4-й неделе ОАОА плазмы крови, определенная методом обесцвечивания АБТС,+, статистически значимо уменьшалась на 47,92% по сравнению с контрольной группой. Аналогичные достоверные изменения показателя ОАОА, измеренной АБТС-тестом, были обнаружены только к концу 4-й недели после введения эндотоксина. Можно заключить, что способность реагировать на изменения измеряемого параметра (responsiveness) у метода обесцвечивания лучше, чем у АБТС-теста.

Таким образом, при использовании экспериментальной модели хронической эндотоксемии у крыс была показана адекватность применения нового метода обесцвечивания АБТС-+ для мониторинга состояния антиоксидантной системы при развитии воспалительного процесса. Результаты анализа ОАОА, полученные методом обесцвечивания АБТС,+. согласуются с данными других лабораторных тестов, которые, по литературным данным, традиционно используются в качестве маркеров окислительного стресса.

j

В- £110

й £100

S fc ,

1 70

5

w

- Макс

TSY.

Ср.Знач 25%

2 недели

контрольная группа

4 недели

Рисунок 2. Динамика изменений величины ОАОА, определенной методом обесцвечивания АБТО+, у группы с хронической эндотоксемией по отношению к показателям контрольной группы.

Доклинические исследования метода обесцвечивания АЬ'ТО* показали, что новый диагностический подход превосходит существующие лабораторные тесты по своим аналитическим характеристикам, требует минимальных трудовых и экономических затрат, чувствителен к низкомолекулярным антиоксидантам сыворотки крови и способен реагировать на изменения измеряемого параметра.

7. Оценка применимости метода анализа ОАОА в клинической лабораторной практике

Определение границ референтных интервалов величины ОАОА у здоровых лиц. При анализе ОАОА образцов сыворотки крови условно здоровых лиц методом обесцвечивания АБТС*4 были обнаружены отклонения одномодулыюго распределения от нормального. Статистически значимые различия показателей антирадикальных свойств сыворотки между мужчинами и женщинами обнаружены не были (табл.3).

Было установлено, что величина ОАОА, измеренная методом обесцвечивания АБТС,+, не коррелирует с возрастом, содержанием общего белка и мочевой кислоты.

Таблица 3

Значение региональных референтных величин показателей ОАОА (мМ GAE), измеренной методом обесцвечивания АБТС,+ в сыворотке крови __условно здоровых лиц __

X Ме а 2,5% П 97,5% П

Мужчины (п=79) 0,476 0,461 0,0981 0,3385 0,6867

Женщины (п=78) 0,447 0,450 0,0841 0,3120 0,6309

Все вместе (п=Т57) 0,462 0,452 0,0926 0,3207 0,6486

Примечание: X - среднее знамение; Ме - медиана; о - стандартное отклонение; П -лерцеятиль.

Биологическая вариабельность показателей ОАОА сыворотки крови. Согласно полученным данным, при оценке антиоксидантных свойств сыворотки крови метод обесцвечивания АБТС,Ф характеризовался гораздо более низкой аналитической и внутрииндивидульной вариабельностями, но межиндивидуальная вариабельность показателя была несколько выше, по сравнению с классическим АБТС-тестом (табл.4). Оба метода были приемлемы, так как коэффициент индивидуальности (II) составил больше 0,6 ед.

Таблица 4

Биологическая вариабельность показателей антиоксидантной _активности образцов сыворотки крови__

CVa, % cv„„, % CVM„, % Сообщая» % II

Метод обесцвечивания АБТС,+ 2,5 14,2 20,1 14,4 0,72

АБТС-тест 4,9 27,4 15,6 27,8 1,78

Низкие внутрииндивидуальная и аналитическая вариабельности показателя ОАОА сыворотки крови делают предпочтительным использование метода обесцвечивания АБТС,+ для проведения мониторинговых исследований по сравнению с АБТС-тестом.

ОАОА образцов мочи, измеренная методом обесцвечивания АБТО+ и АБТС-тестом, характеризуется большой биологической вариабельностью (CV„„>42%; CVM„>140%) по сравнению с сывороткой крови. При этом индекс индивидуальности для образцов мочи был ниже 0,6, что косвенно свидетельствует о низкой диагностической значимости измерения ОАОА мочи, поэтому применение неинвазивной диагностики состояния антиоксидантного статуса организма, по всей видимости, на данный момент не представляется возможным.

Изменение ОАОА у пациентов, страдающих СД 2-го типа в стадии декомпенсации. Нами были протестированы образцы сыворотки от 50 пациентов, страдающих СД 2-го типа, полученных на момент госпитализации этих лиц в связи с декомпенсацией СД 2-го. При анализе образцов сывороток больных СД 2-го типа ОАОА оказалась достоверно ниже по сравнению со здоровыми (р=0,000015, по Манну-Уитни) и составила 0,226-0,493 мМ GAE. Действительно, анализируя частоту встречаемости величин показателя ОАОА сыворотки у больных СД 2-го типа, мы обнаружили, что величина ОАОА смещена в сторону более низких значений показателя по сравнению со здоровыми (рис.3).

-]-1-!-<-1-1-[-1-1-5-1-

0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

Значения ОАОА, мМ

Рисунок 3. Распределение обследованных лиц по величине ОАОА.

Зависимость значения ОАОА от частоты ее встречаемости в выборке показана в следующем уравнении:

.У'2тгоу; у2тг(т1(;; 2'1 ^

где Р1 р2 - доля лиц со значением ОАОА ¡^¿ст,2 и соответственно;

Иь Ц:- максимум кривой плотности распределения; сгГ, <3г- дисперсия.

Анализ уравнений регрессий показал, что у здоровых лиц и больных СД 2-го можно выделить две отдельные группы обследованных, внутри которых распределение показателя ОАОА соответствует Гаусову распределению. В здоровой популяции у 88,7% значение показателя колеблется в пределах 0,43 8±0,074 мМ GAE; у остальных 11,3% величина ОАОА была существенно выше и составила 0,617±0,032 мМ GAE. Анализ распределения пациентов с СД 2-го по величине ОАОА показал, что примерно в 50% случаев значение ОАОА близко к величине, установленной для здоровых лиц (0,438±0,074 мМ GAE). Но у остальных больных СД 2-го наблюдается низкое значение ОАОА - 0,281±0,04 мМ GAE, не характерное для здоровой популяции, поэтому, по всей видимости, при проведении терапии пациентам с СД 2-го необходимо применять дифференцированный подход к назначению антиоксидантных препаратов.

Таким образом, используя новый метод исследования ОАОА мы показали, что, основываясь на результатах анализа ОАОА сыворотки крови методом обесцвечивания АБТС,+, среди больных СД 2-го типа можно выделить лиц с низким уровнем ОАОА. По-видимому, этим пациентам необходимо проводить фармакологическую коррекцию антиоксидантными препаратами.

Использование ОАОА для мониторинга за эффективностью антиоксидантной терапии. В соответствии с ГОСТом Р 53022.3-2008 для точной оценки значимости различия между результатами двух последовательных измерений аналитов у одного и того же пациента рассчитали коэффициент критической разницы (RCV, референтное различие значений). Для метода обесцвечивания АБТС,+ он составил 33,7%, а для АБТС-теста 64,9% . Мы оценили возможность использования RCV на конкретном практическом примере. В течение 1 недели группа здоровых добровольцев получала антиоксидантный комплексный препарат «Лютеин Форте» (ТУ 9197-006-43298286-04). Дозировка и способ применения соответствовали рекомендациям производителя. Мы оценили ОАОА образцов сыворотки крови методом обесцвечивания АБТС,+, полученных до приема препарата и после одной недели его применения (рис.4).

При использовании метода обесцвечивания АБТС,+ ОАОА повышалась у всех обследованных (р=0,018, по критерию Вилкоксона), но изменение показателя превосходило значение RCV для данного метода лишь в 29% случаев. Возможно, это связано с недостаточной продолжительностью приема препарата. В рекомендациях производителя длительность проведения терапии составляет 1 месяц. Применение АБТС-теста при анализе этих же образцов не позволило выявить статистически значимых различий величины ОАОА сыворотки крови до и после приема препарата «Лютеин Форте» (р=1, по критерию Вилкоксона). Это может быть объяснено худшей способностью АБТС-теста реагировать на изменения измеряемого параметра, которая уже была обнаружена в экспериментах на животных.

s <

x О

2 Ä I О

3 «

О

* • * -Метод обесцвечивания АБТС-катион-радикала - АБТС-тест

• * • RCV „ „=33,7%

• • • : * • исходные значения

* * *

Рисунок 4. Влияние

Обследуемые

препарата «Лютеин Форте» на

обесцвечивания АВТО* и АБТС-тестом.

ОАОА, измеренную методом

Тот факт, что препарат в наибольшей степени влиял на ОАОА у обследуемых добровольцев с более низкими исходными показателями, позволяет предположить существование зависимости эффективности антиоксидантной терапии от исходной величины ОАОА. Корреляционный анализ выявил статистически значимую отрицательную взаимосвязь между индексом ЯСУ и исходным значением ОАОА (рис.5).

Исходное знамение ОАОА, мМ GAE

Рисунок 5. Зависимость эффекта препарата «Лютеин Форте» от исходного уровня ОАОА.

Таким образом, метод обесцвечивания АБТС*+ оказался предпочтительнее как при выявлении пациентов с недостаточностью антиоксидантной системы, так и при проведении мониторинга эффективности антиоксидантной терапии по сравнению с АБТС-тсстом. Необходимо отметить, что обнаружена отрицательная

взаимосвязь между эффектом антиоксидантного препарата и величиной исходного значения ОАОА.

Выводы

1. Обоснован метод анализа ОАОА, основанный на способности взаимодействовать с АБТС,+, который превосходит по своим аналитическим характеристикам классический АБТС-тест и может быть использован в клинической и экспериментальной медицине.

2. Метод обесцвечивания АБТС,+, так же как и АБТС-тест, оказался чувствителен к воздействию низкомолекулярных компонентов биологической пробы: их вклад при анализе сыворотки крови методом обесцвечивания АБТС*+ составляет 58,63%-77,35%; АБТС-тестом 72,02%-87,02%. Установлено, что основными низкомолекулярными компонентами, влияющими на величину ОАОА, являются мочевая кислота, цистеин, аскорбиновая кислота, глутатион, триптофан.

3. Метод обесцвечивания АБТС,+ оказался лучше по своим аналитическим характеристикам по сравнению с АБТС-тестом: коэффициент чувствительности -843,65643±15,53536 мМ и 603,84132±17,67079 мМ галловой кислоты соответственно; диапазон линейной зависимости оптической плотности от концентрации галловой кислоты 0,005-0,07 мМ и 0,04-0,1 мМ; воспроизводимость - 3,44-4,5% и 8-13,35%; сходимость 1,91-2,84% и 4,55-7,32%; минимальная обнаруживаемая концентрация - 0,001399 мМ и 0,009135 мМ галловой кислоты.

4. Доказана адекватность метода обесцвечивания АБТС,+ для мониторинга за состоянием антиоксидантной системы при развитии окислительного стресса у крыс в модели хронической ТРБ-индуцированной эндотоксемии. Использование метода обесцвечивания АБТС,+ позволило выявить наиболее ранние изменения состояния антиоксидантной системы при данной патологии,

5. У больных СД 2-го типа в стадии декомпенсации в 48% случаев ОАОА, измеренная методом обесцвечивания АБТС,+, была ниже референтных значений.

6. ОАОА сыворотки крови, оцениваемая методом обесцвечивания АБТС,+, корректируется антиоксидантным препаратом Лютеин Форте.

7. Метод обесцвечивания АБТС,+ не трудоемок, хорошо воспроизводим, чувствителен, требует меньших экономических затрат по сравнению с другими методами анализа ОАОА и может быть использован в клинической лабораторной практике для мониторинга эффективности антиоксидантной терапии.

Практические рекомендации

1. Для оценки ОАОА сыворотки крови в лабораторной практике рекомендуется применять метод, основанный на определении обесцвечивания АБТС,+; в качестве стандартного образца можно использовать образцы галловой кислоты.

2. На основании предложенного протокола метода обесцвечивания АБТС,+ целесообразно создание коммерческого набора для определения ОАОА сыворотки крови и мочи.

3. Разработанный протокол, включающий исследования по лабораторной аналитике и клинической интерпретируемости полученных данных, можно

использовать для валидации любого нового метода в клинической лабораторной диагностике.

4. Использование метода обесцвечивания АБТС,+ как более простого, технологичного и чувствительного рекомендуется для применения в целях мониторинга при проведении терапии антиоксидантными препаратами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шушкова, И.Г. Влияние низкомолекулярных метаболитов на общую антиоксидантную активность биологических проб/ И.Г. Шушкова, A.B. Коваленко// «Молодежь и наука: итоги и перспективы»: Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - Саратов, 2007.-С.85-86.

2. Время-зависимые эффекты веществ различной химической природы в модельной системе окисления ABTS/ И.Г. Шушкова, В.Г. Зайцев, О.В. Островский, A.B. Коваленко // Материалы 63-й региональной конференции по фармации и фармакологии.-Пятигорск, 2008.-С.238.

3. Применение ABTS-теста для оценки антиоксидантной активности крови/ A.A. Пилипко, И.Г. Шушкова, В.Г. Зайцев, О.В. Островский // Клиническая лабораторная диагностика.-2008.-№ 9.-С.66.

4. Современные подходы к оценке антиоксидантного статуса в клшшко-лабораторнои диагностике/ Н.В. Дегтярева, И.Г. Шушкова, В.Г. Зайцев, О.В. Островский // Клиническая лабораторная диагиостнка.-2008.—№ 9.-С.59.

5. Антирадикальная активность сыворотки крови человека, измеренная модифицированным тестом обесцвечивания ABTS®-KaTnon-радикала/ И.Г. Шушкова, Л.Г. Синицина, В.Г. Зайцев, О.В. Островский// Кубанский научный медицинский вестник.-2009.-№ 9.-С.159-161.

6. Подбор оптимальных условий для определения общей антиоксидантной активности в сыворотке и плазме человека с помощью ABTS -теста/ A.A. Пилипко, Н.В. Дегтярева, М.А. Верченко, И.Г. ШушковаИ «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины»: Материалы 67-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием.-Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2009.-С.52.

7. Шушкова, И.Г. Оптимизация одновременного определения антиоксидантной и антирадикальной активности веществ/ И.Г. Шушкова, О.Н. Линенко, В.Г. Зайцев// «Аналитика России»: Материалы III Всероссийской конференции по аналитической химии - Краснодар, 2009.-С.174.

8. Шушкова, И.Г. Перспективы определения антиоксидантной активности биологических проб человека в клинической лабораторной практике/ И.Г. Шушкова, В.Г. Зайцев, A.B. Коваленко // Инновационные достижения фундаментальных и прикладных медицинских исследований в развитии здравоохранения Волгоградской области: Сб. науч. трудов/ под ред. В.И. Петрова - Волгоград, 2009.-С.253-256.

9. Шушкова, И.Г. Безалкогольные растительные напитки как источники фенольных антиоксидантов в питании человека/ Е.А. Няхина, И.Г. Шушкова, В.Г.

19

Зайцев // Биоантиоксидант: Материалы VIII Международной конференции. М.: РУДН, 2010.-С.340-341.

10. Шушкова, И.Г. Выбор метода анализа антиоксидантной активности сыворотки крови, перспективного для дальнейшего внедрения в клиническую лабораторную практику/ И.Г. Шушкова // «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины»: Материалы 68-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием, посвященной 75-летию ВолГМУ.-Волгоград, 2010.-С.ЗЗ.

11. Шушкова, И.Г. Выбор перспективного метода анализа общей антиоксидантной активности в сыворотке крови человека/ И.Г. Шушкова// Медицинский академический журнал.-2010.-Том10, №5.-С.113.

12. Шушкова, И.Г. Проблемы валидации методов определения общей антиоксидантной активности в биологических жидкостях человека/ И.Г. Шушкова, В.Г. Зайцев, О.В. Островский//Кислород и антиоксиданты.-2010.~№2-С.105-106.

13. Определение общей антиоксидантной активности в крови больных сахарным диабетом/ И.Г. Шушкова, В.Г. Зайцев, Г.П. Дудченко, О.В. Островский// Клиническая лабораторная диагностика.-2011.-Л"» 10.-С.42.

АБТС-+ ОАОА

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

С*+ - АБТС-катион-радикал

В

сд

NCCLS

FRAP

GAE

1СН

CLSI CV

CUPRAC

IFCC

LPS ORAC RCV USP

ISO IUPAC

общая антиоксидантная активность сахарный диабет

смещение, относительное отклонение от истинного значения

Clinical laboratory and standards institute коэффициент вариации

анализ антиоксидантной способности по восстановлению меди

анализ железовосстанавливающей способности эквивалентные концентрации галловой кислоты International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use International federation of clinical chemistry and laboratory medicine

International organization for standardization International union of pure and applied chemistry National committee of clinical laboratory standards липополисахарид Salmonella typhimurium оценка способности абсорбировать радикалы кислорода референтное различие значений United States pharmacopoeia

Подписано в печать 15.02.12 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Усл.-печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № ,2*5"»

Отпечатано с готового оригинал-макета.

Волгоградский государственный медицинский университет 400131, Волгоград, площадь Павших борцов, 1.

Издательство ВолгГМУ 400006, Волгоград, ул. Дзержинского, 45.