Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Стандартизация лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов на содержание антиоксидантов амперометрическим методом.

На правах рукописи

Демченкова Елена Юрьевна

стандартизация лекарственного растительного сырья и фитопрепара тов на содержание антиоксидантов

амперош:трическим методом

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 2 ЯКВ 2012

Москва-2012

005007099

Диссертационная работа выполнена в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России

Научные руководители:

доктор медицинских, наук Миронов Александр Николаевич

кандидат фармацевтических наук Горошко Ольга Александровна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук,

профессор Садчикова Наталья Петровна

кандидат фармацевтических наук Шемерянкина Татьяна Борисовна

Ведущая организация: ГОУВПО «Казанский государственный медицинский университет Росздрава»

Защита состоится «23» января 2012г. в 14°° часов на заседании Диссертационного Совета Д 006.070.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН (117216, г. Москва, ул. Грина д.7) по адресу: 123056, г. Москва, ул. Красина, д.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке В МЛ АР по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина д.7.

Автореферат разослан «_»_20__г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.070.01,

доктор фармацевтических наук ' Громакова Алла Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Под влиянием на организм человека неблагоприятных экологических факторов, повышенных физических и эмоциональных нагрузок, а также при длительных заболеваниях и в процессе старения свободнорадикальное окисление в организме активизируется - развивается, так называемый, синдром переоксидации или окислительный стресс [Зенков Н.К., Панкин В.З., 2001].

При этом свободные радикалы оказывают повреждающее воздействие на мембраны клеток, в организме нарушаются процессы обмена веществ, накапливаются различные продукты промежуточного обмена. Такие сдвиги нарушают работу центральной нервной системы, иммунной системы, усугубляют воспалительные процессы в организме, способствуют образованию атеросклеротических бляшек в коронарных и мозговых сосудах и ускоряют старение организма [Бурлакова Е.Б., 1997]. Для замедления этих процессов целесообразно использовать лекарственные средства, обладающие антиоксидантньши свойствами. Однако необходимо контролируемое потребление антиоксидантов. Рекомендуемые уровни потребления антиоксидантов приняты в РФ в 2004 году [Оншценко Г.Г., 2004] и составляют 350-1300мг/сутки. У различных лекарственных средств и лекарственного растительного сырья существует большая вариабельность антиоксидангаой активности (АОА), а, следовательно, необходимо определять АОА каждого испытуемого лекарственного средства.

Антиоксиданты нашли широкое применение в фармацевтической промышленности и медицине в последнее время в составе биологически -активных добавок, косметических и лекарственных средств.' Сейчас большое' внимание уделяется средствам природного происхождения, таким как лекарственные растения и фитопрепараты, в которых содержатся такие известные антиоксиданты как флавоноиды, оксикоричные и фенолкарбоновые

кислоты, кумарины и другие. Рост подобной продукции на рынке предъявляет все более серьезные требования к сертификации товара. В настоящее время в нормативных документах РФ не существует единого показателя антиоксидантной активности подобных препаратов. Для проверки их качества используются длительные, трудоемкие, не всегда сопоставимые и неточные исследования, опирающиеся иногда на неаттестованные методики. Расчет содержания антиоксидантов проводится по разным стандартам.

Необходимость введения новых методик, обеспечивающих надежные результаты по определению суммарной антиоксидантной активности или суммарного содержания антиоксидантов (ССА) подобных препаратов и создание нормативной документации на данный метод, является актуальной задачей, от решения которой зависит качество, эффективность и безопасность предлагаемых на рынке продуктов. Также актуальным представляется проведение исследований по содержанию антиоксидантов относительно стандартов-антиоксидантов.

Одним из перспективных методов определения активности антиоксидантов являются электрохимические методы, обладающие высокой чувствительностью, возможностью анализировать как водные, так и неводные среды [Яшин Я.И., Черноусова Н.И., 2001]. В настоящей работе для решения вопросов по определению количественной оценке антиоксидантов предложен амперометрический метод, как весьма чувствительный к наличию в среде кислорода и его активных радикалов.

Цель исследования.

Оптимизировать методику амперометрического определения содержания антиоксидантов для оценки качества и стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов.

Задачи исследования.

1. Оптимизировать и валидировать методику амперометрического определения содержания антиоксидантов в лекарственном растительном сырье и в фитопрепаратах.

2. Провести изучение по корреляции содержащихся антиоксидантов (флавоноидов, органических кислот, окисляемых веществ) в исследуемом лекарственном растительном сырье (JIPC) и настоях.

3. Изучить сроки годности настоев из исследуемого ЛРС амперометрическим методом на суммарное содержание антиоксидантов.

4. Провести определения суммарного содержания антиоксидантов в гепатопротекторных фитопрепаратах.

5. Разработать проект ОФС на амперометрический метод определения антиоксидантов в ЛРС и в фитопрепаратах.

Научная новизна.

Предложена усовершенствованная методика определения содержания суммы антиоксидантов в ЛРС и фитопрепаратах.

Впервые проведена валидация методики амперометрического определения содержания суммы антиоксидантов в ЛРС, которая может быть использована для оценки качества лекарственного растительного сырья. Предложенный метод дополнит арсенал in vitro исследований на содержание антиоксидантов в объектах фармацевтической промышленности;

Дана оценка антиоксидантной активности ряда веществ природного происхождения. Установлено, что содержание антиоксидантов в исследуемых объектах уменьшается в ряду: фенилантрашшовая кислота - кофейная кислота - галловая кислота - кверцетин - аскорбиновая кислота.

Впервые определено содержание суммы антиоксидантов амперометрическим методом в водных извлечениях ЛРС - лист мяты, трава

репешка, цветки пижмы, цветки бессмертника, плоды расторопши, корневище аира, трава полыни горькой, столбики с рыльцами кукурузы. Выявлено наличие корреляции между содержанием суммы ангиоксидантов в водных извлечениях и содержанием в них основных групп веществ обладающих антиоксидантной активностью (флавоноидов и окисляемых веществ).

Впервые установлено ССА в настоях из исследуемого сырья и гепатопротекторных фитопрепаратах амперометрическим методом, а также влияние времени хранения настоев на суммарное содержание антиоксидантов.

Показана перспективность метода определения ССА для стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов.

Практическое применение и внедрение результатов в практику. На основании проведенных исследований разработаны:

• методическое пособие для студентов фармацевтических факультетов медицинских вузов и фармацевтов по оценке результатов применения препаратов с антиоксидантным действием - «Исследование антиоксидантных свойств лекарственных препаратов» (Москва, 2009);

• впервые методика определения содержания суммы антиоксидантов в JIPC апробирована в лаборатории химико-фармацевтических препаратов №2 Испытательного центра экспертизы качества лекарственных средств ФГБУ НЦЭСМП и предложена для внедрения в производственный процесс как критерий контроля сырья (Акт апробации методики от 29.09.11.).

• предложенная методика может быть использована при скрининговых исследованиях для выявления перспективных групп JIPC для разработки новых лекарственных средств.

• показана возможность назначения настоев мяты листьев и репешка травы в качестве дополнительного источника антиоксидантов (о чем даны рекомендации в дополнение к инструкции по применению).

• разработан проект ОФС на амперометрический метод определения антиокеидантов в субстанциях, JIPC, и лекарственных средствах. Положения, выносимые на защиту.

1. Использование валидированой методики для определения качества и стандартизации растительного сырья и фитопрепаратов на суммарное содержание антиокеидантов. ,

2. Результаты изучения количественного содержания основных антиокеидантов (флавоноидов, органических кислот, окисляемых веществ) в исследуемом J1PC в сравнении с суммарным содержанием антиокеидантов ЛРС - лист мяты, трава репешка, цветки пижмы, цветки бессмертника, плоды расторопши, корневище аира, трава полыни горькой, столбики с рыльцами кукурузы.

3. Результаты исследований ССА в настоях ,из исследуемого ЛРС и изменение содержания CCA в процессе их хранения.

4. Результаты изучения содержания ССА в гепатопротекторных фитопрепаратах.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на научно-практической конференции «Клинико-фармакологические подходы в оптимизации фармакотерапии» (Москва, 2006), XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), II конгрессе Международного общества клинических фармакологов и фармацевтов стран СНГ (Москва, 2010) и научно-практической конференции (on-line) "Актуальные вопросы клинической фармакологии и фармации" (Москва, 2011). Связь задач исследования с проблемным планом. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой, и планом НИР ФГУ НЦЭСМП на 2006-2010 г. «Разработка новых подходов для оценки антиоксидантной активности лекарственных средств».

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Объем н структура диссертации.

Работа изложена на 103 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», выводов, списка литературы из 130 источников, (30 из которых на иностранных языках) и приложения.

Результаты эксперимента обобщены в таблицах, проиллюстрированы рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Исследования проводились на базе Центра клинической фармакологии ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применений» Росздравнадзора (ЦКФ ФГБУ «НЦ ЭСМП» Росздравнадзора).

Объектами исследования являлись:

1. Индивидуальные вещества - фенилантраниловая кислота (Fluka 78150), кофейная кислота (Fluka 60020), галловая кислота (Fluka 48630), кверцетина дигидрат (Sigma Q0125-10G), аскорбиновая кислота (ФС 42-021807).

2. Группа J1PC, используемая при заболеваниях печени и желчевыводящих путей: корневища аира, цветки бессмертника песчаного, рыльца кукурузы, лист мяты перечной, цветки пижмы обыкновенной, плоды расторопши пятнистой, трава репешка обыкновенного. Исследовали по 3 серии каждого JIPC. Все сырье было приобретено в торгово-розничной сети г.Москвы.

3. Фитопрепараты - силимар, гепабене, гепацинар, эссенциале форте, карсил, цинахолин, приобретенные в торгово-розничной сети г.Москвы.

Настои из исследуемого лекарственного растительного сырья изготовлены в соответствии с общей статьей "Настои и отвары" ГФ XI, вып.2, стр. 147-148. Для приготовления настоев использовали аптечное сырье соответствующее нормативной документации.

Реактивы, используемые в количественном анализе готовились по методикам, указанным в ГФ X и XI, вып.2.

Определение содержания органических кислот в исследуемых образцах проводилось по методикам: ГФ XI, вып.2, статья №38 "Плоды шиповника", стр. 294-296.

Определение содержания окисляемых (дубильных) веществ проводили по методике ГФ XI, вып.2, стр. 286.

Спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометре СФ-2000.

Определения суммарного содержания антиоксидантов проводились на антиоксидантном анализаторе «ЦветЯуза-01-АА» - ТУ МЕКВ. 414313.002 производства НПО «Химавтоматика» (Россия). Условия измерения были следующие: относительная влажность воздуха-от 30 до 80 %;

- температура окружающей среды - (25±10)0 С; напряжение переменного тока - 220В; частота переменного тока - 50 ГЦ; потенциал рабочего электрода - 1,3 В;

- скорость подачи этоента (р-р ортофосфорной кислоты 0,0022 моль/л) -1,2 мл/мин;

фоновый ток не выше 300 нА;

- механические воздействия, внешние электрические и магнитные поля, влияющие на работоспособность, должны быть исключены.

Для приготовления элюента, реактивов и всех аналитических проб использовалась бидистиллированная дегазированная вода.

Валидацшо метода и статистическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с рекомендациями «Руководства о валидации методик анализа лекарственных средств» 2009г., требованиями ГФ XI, вып. 1, с. 199-221 с использованием критерия Стьюдента, а также программного обеспечения «Статистика 6.О.».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ Оптимизация методики определения суммарного содержания антиоксидантов.

Из множества описанных в литературе методов [Ханов В.В., Рыжова Г.Л., Мальцева Е.В., 2004] определения антиоксидантной активности для проведения исследований в данной работе был выбран амперометрический метод, как наиболее экспрессный и имеющий ряд преимуществ:

• прибор зарегистрирован в Госреестре, методика измерения аттестована в соответствии с ГОСТ Р 8.563-96, ГОСТ Р ИСО 5725-2002;

• экспрессностъ анализа, время отдельного определения занимает несколько минут;

• предел обнаружения амперометрическим детектором полифенолов, флавоноидов на уровне нано-пикограммов (ТО"5 — 10"12 г). При таких (малых) концентрациях меньшая вероятность взаимного влияния разных антиоксидантов при их совместном присутствии, в частности, проявление синергизма;

• высокая точность и воспроизводимость, а также селективность определения всех соединений, способных к окислению, т.е. только антиоксидантов;

• для анализа не требуется большого количества химических реактивов (кроме стандартов), поэтому стоимость измерений низкая.

Биологически активные вещества, обладающие антиоксидантными свойствами (флавоноиды, дубильные вещества, органические и аминокислоты,

фенолокислоты) легко окисляются на амперометрическом детекторе. При этом на электроде молекула превращается в заряженный радикал с выделением электрона и водорода в соответствии со следующими уравнениями:

вещество-О-Н—>вещество-0 + ё + Н+ (окисление при максимальном потенциале)

вещество-О-Н—>вещество-0 + Н (улавливание свободного радикала)

Обе реакции включают разрыв одной и той же связи О-Н, Н' состоит из ё + Н*. Образовавшиеся электроны вызывают ток в ячейке детектора, который соответствует общему содержанию антиоксидантов в анализируемой смеси, в пересчете на используемое количество (мг или мкг) стандартного вещества также антиоксиданта.

Необходимо отметить, что расчет полученных результатов проводится по калибровочному графику зависимости величины сигнала образца сравнения - стандартного вещества-антиоксиданта, от его концентрации, и выражается в единицах концентрации (мг/г). Поэтому согласно рекомендациям относительно терминов и определений антиоксидантов [Бурлакова Е.Б., Мисин В.М., Храпова Н.Г., Завьялов А.Ю., 2010] в данной работе определяется не антиоксидантная активность лекарственных средств, а суммарное содержание антиоксидантов, что выражается в величине, эквивалентной содержанию в них веществ обладающих антиоксидантой активностью.

В работе проведены сравнительные исследования водных растворов нескольких различных соединений по содержанию суммы антиоксидантов в пересчете на кверцетин (табл. 1).

Таблица 1

Сравнительная характеристика CCA стандартов-антиоксидантов

Наименование вещества ССА в пересчете на кверцетин, мг/г S пика при концентрации вещества 0,001 мг/мл Отношение ^обр/^кверц

Фенилантраниловая кислота 2283,5 1798,2245 2,31

Кофейная кислота 1410,74 973,5685 1,25

Галловая кислота 1277,8 926,2356 1,19

Кверцетин - 778,0676 1

Аскорбиновая кислота 613,37 425,9403 0,54

Из данных таблицы видно, что наибольшая величина ССА обнаружена у фенилантраниловой кислоты, а наименьшая у аскорбиновой кислоты. Такой порядок значений можно объяснить химическим строением исследуемых вешеств, который достигается за счет легко подвижного атома водорода одной или нескольких фенольных групп в составе молекулы. Наибольшей эффективностью обладают так называемые «стерически затрудненные фенолы», в ароматическое ядро которых введены пространственно крупные заместители в соседние с ОН-группой положения (фенилантраниловая кислота).

Валидацш методики

Проведена валидационная оценка методики количественного определения содержания антиоксидантов по показателям: специфичность, линейность и аналитическая область методики, правильность, воспроизводимость.

Специфичность заключается в том, что все исследуемые объекты содержащие антиоксиданты вызывают скачок импульса тока при попадании на электрохимический детектор, как это показано на рисунке выходных кривых (рис. 1). Метод применим как для индивидуальных соединений, так и для многокомпонентных смесей (ЛРС, фитопрепараты).

Рис. 1. Дифференциальные кривые определения содержания антиоксидантов в растворе галловой кислоты.

Для каждого из исследуемых моновеществ - стандартов получены линейные зависимости величины тока в интервале от 0,2 мг/л до 4 мг/л в растворе, вида у=ах+Ь, где у - величина сигнала, х - концентрация антиоксидантов. Линейная зависимость характеризуется коэффициентом корреляции от 0,996 (аскорбиновая кислота) до 1,0 (кофейная кислота).

Воспроизводимость методики охарактеризована степенью совпадения результатов индивидуальных определений исследуемых субстанций в 10 независимых повторностях. Метрологические характеристики методики определения содержания антиоксидантов в субстанциях пересчете на кверцетин приведены в таблице 2.

Таблица 2

Метрологические характеристики определения содержания антиоксидантов в субстанциях (п=10, Р=95%, Р<0,05).

Исследуемые вещества Хер 8 АХср Е,%

Фенилантраниловая кислота 2283,5 5462,44 73,9083 59,14 2,5

Кофейная кислота 1410,74 2641,562 51,3961 41,12 2,9

Галловая кислота 1274,5 21,8986 4,6796 3.74 0,31

Аскорбиновая кислота 613,37 525,0842 22,9147 18,33 3,0

Представленные данные свидетельствуют о хорошем воспроизведении результатов. Относительная ошибка единичного измерения не превышает 3%.

Определение содержания суммы антиоксидантов в исследуемом

лекарственном растительном сырье.

Для исследования лекарственного растительного сырья была оптимизирована методика путем подбора условий на этапе пробоподготовки, позволяющая оценить содержание суммы антиоксидантов в сырье.

Методика

5 г измельченного до 2 мм сырья помещали в коническую колбу и прибавляли 50 мл дистиллированной воды с учетом коэффициента водопоглощения сырья. Колбу нагревали на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Далее извлечение охлаждали и фильтровали через бумажный фильтр «синяя лента» в мерную колбу 50 мл и если надо, доводили водой до метки.

Поскольку настоящая методика предназначена для измерения содержания суммы антиоксидантов (АО) в диапазоне 0,2-4,0 мг/мл, а площадь получаемого пика не должна превышать 2000, то перед измерением пробу необходимо разбавлять. Экспериментально была подобрана кратность разведения экстрактов: для бессмертника песчаного определена необходимость разбавления в 1000 раз; для полыни горькой - разбавление в 100 раз; пижмы обыкновенной - в 1000 раз; аира болотного - в 100 раз; расторопши пятнистой - в 100 раз; репешка обыкновенного - в 1000 раз; мяты перечной - в 1000 раз; столбиков с рыльцами кукурузы - в 100 раз.

Таким образом, мы добились того, что сигнал полученного рабочего раствора укладывался в область определения калибровочного графика.

Проводили по 5 последовательных измерений сигналов (площади выходной кривой). За результат принимали среднее арифметическое значение из 5 измерений (стандартное квадратическое отклонение не более 5%).

Методика определения CCA аттестована с использованием стандарта кверцетина. Мы провели расчет CCA в водных извлечениях сырья по нескольким стандартам: кверцетин, галловая, кофейная, фенилантраниловая,

аскорбиновая кислоты, различающиеся по антиоксидантной активности. Выбор таких стандартов объективен, поскольку все исследуемое ЛРС содержит перечисленные вещества в тех или иных количествах [Головкин Б.Н., Руденская Р.Н., Трофимова И.А., Шретер А.И., 2001].

В табл.3 представлены данные о содержание суммы антиоксидантов в растительном сырье в пересчете на такие стандарты-антиоксиданты как: кверцетин, галловая, кофейная, фенилантраниловая, аскорбиновая кислоты.

Таблица 3

ССА сырья в пересчёте на различные стандарты

ЛРС На кверцетин мг/г На галловую к-ту, мг/г На аскорби новую к-ту, мг/г На кофейную к-ту, мг/г На фенилант раниловую к-ту, мг/г

Мяты перечной лист 15,9б±0,28 8,09±0,27 22,47±0,7 6 8,7±0,29 4,7±0,16

Репешка обыкновенного трава 11,09±0,25 б,32±0,23 16,62±0,61 6,45±0,23 3,39±0,12

Пижмы цветки 4,55±0,22 3,9±0,12 8,7б±0,27 3,40±0,10 1,84±0,06

Бессмертника песчаного цветки 3,06±0,14 1,34±0,03 4,01±0,10 1,5±0,04 0,84±0,02

Полыни горькой трава 2,91±0,08 1,29±0,02 3,83±0,18 1,48±0,04 0,80±0,02

Расторопши плоды 2,25±0,09 1,04±0,01 3,01±0,05 1,17±0,02 0,63±0,01

Кукуруза столбики с рыльцами 1,57±0,04 0,79±0,04 2,21±0,11 0,86±0,04 0,46±0,02

Аира корневище 0,33±0,02 0,35±0,01 0,72±0,03 0,28±0,01 0,15±0,007

В результате исследований выявлено, что сравнительно высоким антиоксидантным потенциалом обладают трава репешка и лист мяты.

Показано также, что использование других стандартов для расчета ССА в ЛРС и фитопрепаратах практически не изменяет соотношения между

величинами, хотя и дает другие значения. При этом, чем сильнее антиоксидант стандарт, тем меньше значение ССА в изучаемом объекте.

В дальнейшем для определения содержания антиоксидантов предлагается в качестве стандарта использовать галловую кислоту (Fluka 48630), поскольку она, в отличие от кверцетина, хорошо растворяется в воде и дает легко приготовляемые стабильные растворы.

Определение содержания основных групп антиоксидантов в лекарственном растительном сырье.

Существует распространенное мнение, что антиоксидантная активность зависит от содержания тех или иных биологически активных веществ -антиоксидантов [Рябинина Е.И., Зотова Е.Е., Ветрова E.H., Пономарева Н.И., 2011]. Это говорит о том, что при положительной корреляции действующих веществ и суммарного содержания антиоксидантов, последний показатель может использоваться как самостоятельный объективный критерий оценки качества сырья при скрининговых исследованиях лекарственных растений.

В связи с этим в исследуемом сырье были определены три основные группы биологически активных веществ (БАВ), согласно литературным данным, обладающие антиоксидантной активностью: сумма флавоноидов в пересчете на рутин, сумма свободных органических кислот в пересчете на яблочную кислоту и окисляемые вещества в пересчете на танин.

Для того чтобы выявить общие подходы к пониманию вклада действующих веществ в антиоксидантные свойства сырья, было решено в данном исследовании не определять отдельные специфические для каждого растения БАВ.

Определение содержания суммы флавоноидов. Флавоноиды являются мощными антиоксидантами. Они блокируют свободные радикалы в биологических системах, ингибируют перекисное окисление липидов и обладают различной физиологической активностью. Флавоноиды многих растений сочетают в себе гепатопротекторные и антиоксидантные свойства

(расторопша, береза, бессмертник и др.). Поэтому для изучения вклада БАВ-антиоксидантов в анти оксид ангные свойства исследуемого ЛРС мы определяем содержание в нем суммы флавоноидов.

Определение содержания окисляемых веществ. Наличие окисляемых веществ, таких как полифенолы, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества, таниды, производные эллаговой, протокатеховой, галловой кислот, лейкоантоцианидины и др. характерно для всех видов исследуемого сырья. Они хорошо растворяются в воде и являются действующими веществами настоев и других фитопрепаратов, приготавливаемых на основе исследуемого ЛРС.

Определение содержания органических кислот. В лекарственных растениях содержится широкий набор органических кислот, таких как яблочная, лимонная, щавелевая, аскорбиновая, галловая, кофейная и др.

Они также хорошо переходят в водные извлечения, обладают широким спектром фармакологического действия - противовоспалительным, желчегонным, антиоксидаитным и вносят существенный вклад в фармакологическую активность.

Результаты определения БАВ в сырье представлены в табл. 4.

Таблица 4

Содержание биологически активных веществ в ЛРС

Наименование сырья Содержание суммы флавоноидов, % Содержание окисляемых веществ, % Содержание органических кислот, %

Мяты перечной лист 1,89±0,С15 6,01±0,24 2,74±0,10

Репешка обыкновенного трава 1,60±0,04 5,76±0,19 2,12±0,08

Пижмы цветки 0,78±0,03 4,11±0,11 3,51±0,14

Бессмертника песчаного цветки 0,71±0,02 0,87±0,07 2,01±0,08

Полыни горькой трава 0,67±0,008 0,81±0,06 1,25±0,04

Расторогапи плоды 0,37±0,03 0,77±0,07 0,42±0,004

Кукурузы столбики с 0,26±0,006 0,57±0,02 2,30±0,09

рыльцами

Аира корневища 0,063±0,007 0,48±0,0б 1,17±0,05

Полученные данные показывают, что содержание биологически активных веществ в растениях варьируется в широких пределах. Так, наибольшее содержание флавоноидов отмечается в листьях мяты, траве репеппса, цветках пижмы; наибольшее количество окисляемых веществ - в траве репешка, листьях мяты, цветках пижмы, наибольшее количество органических кислот - в цветках пижмы, листьях мяты.

Метрологические характеристики определения содержания антиоксидантов в лекарственном растительном сырье в пересчете на кверцетин представлены в таблице 5.

Таблица 5

Метрологические характеристики определения содержания антиоксидантов в ЛРС (п=10, Р=95%, Р<0,05).

Наименование ЛРС Хер Б2 8 АХср Е,%

Мяты перечной лист 15,96 0,12463 0,35300 0,28 1,8

Репешка обыкновенного трава 11,09 0,10373 0,32208 0,25 2,3

Пижмы цветки 4,55 0,02391 0,154629 0,12 2,7

Бессмертника песчаного цветки 3,06 0,008667 0,093095 0,07 2,4

Полыни горькой трава 2,91 0,01218 0,11039 0,08 3,0

Расторопши плоды 2,25 0,00392 0,06261 0,05 2,2

Кукурузы столбики с рыльцами 1,57 0,002337 0,048339 0,04 2,4

Аира корневища 0,33 0,000144 0,012007 0,009 3,0

Из представленных данных видно, что ошибка определения не превышает 3,0%.

Поскольку объекты исследования представляют собой довольно

сложные по химическому составу системы, то проблемой практического

использования антиоксидантов растительного происхождения является их количественная оценка, которая реализуется за счет суммарного содержания и действия восстановителей различной природы. При этом необходимо учитывать возможность их взаимного влияния (синергизм, антагонизм). В связи с этим интересным представлялось провести корреляционную оценку содержания БАВ и антиоксидантов в исследуемом ЛРС.

Определение корреляционной зависимости ССА и содержания БАВ антиоксидантов в исследуемом сырье.

При анализе полученных данных обнаружено, что прослеживается положительная корреляция между показателем ССА лекарственного растительного сырья и содержанием окисляемых веществ (r=0,94, р<0,05), а также суммой флавоноидов (г=0,97, р<0,05). Кривые полученных зависимостей представлены на рис. 2 и 3.

3 |

О 5 10 15 20

ССА, мг/г

Рис. 2. Зависимость содержания антиоксидантов от содержания флавоноидов в ЛРС.

10CCA,IM/r lS ю|

„ _J

Рис. 3. Зависимость содержагом антиоксидантов от содержания окисляемых веществ в JIPC.

Для аппроксимации экспериментальных данных был использован метод наименьших квадратов, с вычислением коэффициента корреляции Пирсона (г) (табл.6).

Таблица 6

Матрица коэффициентов корреляции между ССА ЛРС и содержанием суммы флавоиоидов

Характеристики корреляции Числовые значения

Коэффициент корреляции Пирсона 0,9752

Стандартная ошибка Б. 0,00098

9,8558

Уровень значимости 0,0002

НО (5%) отклонена

Таблица 7

Матрица коэффициентов корреляции между ССА ЛРС и содержанием окисляемых веществ

Характеристики корреляции Числовые значения

Коэффициент корреляции Пирсона 0,9445

Стандартная ошибка И 0,0216

6,4294

Уровень значимости 0,0014

НО (5%) отклонена

Содержание же органических кислот выраженной корреляции с ССА не имеют. Вероятно, они проявляют себя в качестве синергистов по отношению к полифенольным соединениям.

Величина содержания суммы антиоксидантов является интегральным показателем качества лекарственных средств растительного происхождения и может быть использована для скрининговых исследований, а в дальнейшем их стандартизации. Суммарная величина содержания антиоксидантов также является комплексным показателем, характеризующим общее содержание действующих веществ различных классов в извлечении из лекарственного растительного сырья.

Введение теста на антиоксидантную эффективность лекарственного растительного сырья по показателю «суммарное содержание антиоксидантов» лекарственных растений в нормативную документацию позволит:

• Проводить скршшнговые исследования растений с целью расширения номенклатуры лекарственного растительного сырья.

• Экспрессно и интегрально проводить оценку качества используемого лекарственного растительного сырья и препаратов на его основе.

• Устанавливать сроки хранения JIPC и фитопрепаратов.

• Составлять точную весовую композицию многокомпонентного препарата на основе лекарственного растительного сырья с заданной антиокислительной активностью.

• Расширить показания к применению для препаратов на основе лекарственного растительного сырья.

Определение содержания суммы антиоксидантов в настоях из исследуемого сырья.

Настои наиболее широко используемая лекарственная форма из лекарственного растительного сырья, они просты в приготовлении, их каждый может приготовить в домашних условиях. Поэтому мы сочли целесообразным установить величину ССА в настоях из исследуемого JIPC (табл. 8).

Для введения в прибор настои также определяли степень разбавления до необходимой концентрации, укладывающейся в диапазон калибровочного графика. Настои бессмертника песчаного, пижмы обыкновенной, репешка обыкновенного и мяты перечной разбавляли в 100 раз; настои полыни горькой, аира болотного, расторопши пятнистой, столбиков с рыльцами кукурузы - в 10 раз.

Таблица 8

Расчет ССА настоев на различные стандарты _

ЛРС На кверцетнн мг/мл На галловую к-ту мг/мл На аскорби новую к-ту мг/мл На кофейную к-ту мг/мл На фенилант ранило-вую к-ту, мг\мл

Мяты перечной лист 2,38±0,05 1,25±0,02 3,35±0,1 1,30±0,09 0,7±0,04

Репешка обыкновенного трава 2,11±0,04 1,05±0,03 3,16±0,61 1,22±0,23 0,64±0,02

Пижмы цветки 0,85±0.03 0,73±0,03 1,63±0,07 0,60±0,02 0,35±0,01

Бессмертника песчаного цветки 0,61±0,02 0,2б±0,007 0,79±0,004 0,30±0,001 0,17±0,005

Полыни горькой трава 0,59±0,02 0,26±0,08 0,76±0,01 0,29±0,001 0,16±0,008

Расторопши плоды 0,52±0,015 0,24±0,007 0,69±0,02 0,27±0,008 0,14±0,005

Кукурузы столбики с рыльцами 0,36±0,01 0,18 ±0,007 0,51±0,02 0,21±0,007 0,12±0,004

Аира корневища 0,23±0,01 0,21±0,007 0,51±0,02 0,19±0,001 0,13±0,007

Как показывают результаты исследований, суммарное содержание антиоксидантов в настоях составляет около 10% от ССА в ЛРС. Однако порядок величин относительно ЛРС сохраняется, и наибольшее ССА определяется также в настоях листьев мяты и травы репешка.

Изменение содержания суммы антиоксидаптов при храпении настоев

Настои, как правило, используют свежеприготовленными. Однако допускается их хранение в холодильнике в течение суток. Мы провели сравнительный анализ содержания суммы АО в настоях во время хранения через 2 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 24 ч хранения в холодильнике (табл. 9).

Таблица 9

Изменение ССА в зависимости от сроков хранения настоев

Наименование сырья ССА настоев, мг/мл

Через 2 ч храиення Через 4 ч хранения Через 6 ч хранения Через 8 ч хранения Через 24 ч хранения

Мяты перечной лист 2,37 2,35 2,28 1,97 1,03

Репешка обыкновенного трава 2,11 2,11 2,0 1,78 0,99

Пижмы цветки 0,83 0,81 0.78 0,57 0,39

Бессмертника песчаного цветки 0,59 0,56 0,46 0,34 0,25

Полыни горькой трава 0,55 0,55 0,54 0,53 0,24

Расторопши плоды 0,51 0,50 0,49 0,47 0,31

Кукурузы столбики с рыльцами 0,34 0,33 0,33 0,29 0,10

Аира корневища 0,22 0,21 0,21 0,17 0,11

Полученные результаты показывают, что значительное снижение ССА, около 50%, происходит через 24 ч хранения настоев. На протяжении 6 часов хранения ССА снижается незначительно, а через 8 ч хранения уменьшается примерно на 20%. Поэтому рекомендуется принимать настои свежеприготовленные, или хранящиеся не более 6 часов в условиях холодильника. Таким образом, используя показатель ССА возможно определять сроки хранения JIPC и фитопрепаратов.

Содержание суммы антиоксидантов в гепатопротекторных фитопрепаратах.

Известно, что при перекисном окислении липидов страдают мембраны гепатоцитов, следовательно, гепатопротекторным свойством могут обладать такие препараты, которые предотвращают окислительное повреждение мембран. То есть препараты должны содержать достаточное количество антиоксидантов для того чтобы обладать также и гепатопротекторным действием.

Мы провели исследование суммарного содержания антиоксидантов в пересчете на кверцетин в некоторых фитопрепаратах используемых для лечения заболеваний печени (табл. 10).

Исследуемые препараты растворяли в тех растворителях, в которых они лучше растворялись в течение 40 мин с использованием магнитной мешалки. Таблетки силимар, гепабене, карсил растирали в ступке, навеску 0,5 г растворяли в 50% этаноле и разбавляли соответственно в 1000, 1000 и 125 раз. Навеску содержимого капсул гепацинар и бонджигар растворяли в воде и разбавляли в 100 раз, а эссенциале форте растворяли в 70% этаноле с разбавлением в 500 раз. Цинахолин разбавляли водой в 1000 раз.

Таблица 10

Суммарное содержание антиоксидантов в гепатопротекторных фитопрепаратов

Лекарственное средство Основные действующие компоненты ССА, мг/г

Силимар Сухой экстракт плодов расторопши 138,10±5,5

Гепабене Экстракт плодов расторопши, экстракт дымянки лекарственной 60,00±2,4

Гепацинар Экстракт артишока 31,93±1,3

Эссенциале форте Эссенциальные фосфолипиды сои 31,63±1,1

Карсил Экстракт плодов расторопши 19,44±0,7

Бонджигар Смесь экстрактов: вербезина белая, пиккориза курроа, паслен черный, цикорий обыкновенный, солодка голая, тамарикс гребенщик, редька посевная, барбарис остистый, расторопша пятнистая, сферантус индийский, берхавия раскидистая. 10,54±0,4

Плоды расторопши Плоды расторопши 2,25 ±0,09

Цинахолин Экстракт артишока 1,35±0,06

Лекарственные препараты, и сшшмар и карсил, из плодов расторопши пятнистой, содержат сумму флаволишанов и применяются при токсических поражениях печени, остром и хроническом гепатите, циррозе печени. Однако наибольшее содержание ССА отмечается у силимара.

Согласно литературным данным флаволигнаны (сшшбины) обладают антиоксидантным действием, и содержание суммы силибинов А и В в препаратах расторопши различается. Поэтому можно предположить, что антиоксидантная активность препаратов также будет различной. Разность содержания силибинов в процентах представлена в виде ряда препаратов, с уменьшающимся их содержанием: Силимар (6,26%) > Гепабене (2,72%) > Карсил (1,93%) > плоды расторопши (0,65%).

Результаты наших исследований также показывают, что суммарное содержание антиоксидантов уменьшается в ряду фитопрепаратов расторопши: Силимар > Гепабене > Карсил > плоды расторопши и коррелируют с содержанием суммы силибинов (табл. 11). Это говорит о том, что флаволигнаны расторопши, в частности сшшбины, играют значительную роль в антиоксидантной активности лекарственных средств на основе расторопши.

Таблица 11

Матрица коэффициентов корреляции между ССА фитопрепаратов и содержанием суммы силибинов

Характеристики корреляции Числовые значения

Коэффициент корреляции Пирсона 0,9862

Стандартная ошибка Я 0,0136

1 8,4437

Уровень значимости 0,0137

НО (5%) отклонена

Из препаратов артишока большее значение ССА имеет гепацинар. Хотя значительно уступает силимару. Эссенциале форте имеет невысокое значение ССА вероятно потому, что исследовались водные растворы препаратов, а основными действующими веществами эссенциале являются липофильные вещества. Комплексный препарат бонджигар, однако, имеет невысокое содержание антиоксидантов.

Следует отметить, что водные извлечения из плодов расторопши имеют низкое значение ССА по сравнению с сшпшаром (сухой экстракт плодов расторопши). Следовательно, плоды расторопши целесообразно использовать не как сырье для приготовления настоев ex tempore, а как источник для получения сухого экстракта и лекарственных средств.

Таким образом, амперометрический метод определения суммарного содержания антиоксидантов имеет корреляционную зависимость от содержания действующих веществ, обладающих антиоксидантной активностью, и может использоваться как экспрессный метод для оценки качества и стандартизации лекарственных средств.

ВЫВОДЫ

1. Оптимизирована и валидирована методика амперометрического определения суммарного содержания антиоксидантов в лекарственном растительном сырье и в фитопрепаратах, что позволяет проводить оценку их

качества и стандартизацию по данному показателю. Для расчета содержания антиоксидантов предложен антиоксидант-стандарт - галловая кислота.

2. Наибольшее содержание суммы антиоксидантов, флавоноидов и окисляемых веществ отмечается у листьев мяты и травы репешка, поэтому их целесообразно включать в растительные сборы и БАДы обладающие антиоксидантным действием как дополнительные источники антиоксидантов.

3. Установлено, что суммарное содержание антиоксидантов у всех видов исследуемого сырья коррелирует с содержанием основных групп обладающих антиоксидантной активностью - суммой флавоноидов, окисляемыми веществами. Это дает возможность использовать показатель суммарного содержания антиоксидантов как экспрессный критерий оценки качества сырья.

4. Среди исследованных настоев JIPC наибольшее суммарное содержание антиоксидантов обнаруживается в настоях мяты и репешка. Однако это содержание уменьшается вдвое по прохождении 24 ч в настоях всех видов исследуемого сырья, что дает возможность использовать этот метод для установления сроков хранения настоев из ЛРС и фитопрепаратов.

5. Проведен анализ суммарного содержания антиоксидантов в некоторых фитопрепаратах гепатопротекторного действия. Наибольшее значение ССА наблюдается у препаратов расторопши «Силимар» и «Гепабене». Выявлена положительная корреляция между ССА и содержанием суммы флаволигнанов в препаратах расторопши.

6. Разработан проект ОФС «Определение содержания антиоксидантов амперометрическим методом».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Демченкова Е.Ю., Мустафина Х.Х. Значение определения антиоксидантной

активности // Материалы научно-практической конференции «Клинико-фармакологические подходы в оптимизации фармакотерапии» - 3 марта 2006г. Москва-С. 41.

2. Пахомов В.П., Яшин Я.И., Чеча O.A., Демченкова Е.Ю., Мустафина Х.Х. Антиоксидантная активность лекарственных препаратов и лекарственного растительного сырья // XIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» Сборник материалов конгресса (тезисы докладов) - 3-7 апреля 2006г Москва - С. 245.

3. Макаров В.Г., Макарова М.Н., Смирнов Л.Д., Буданов C.B., Пахомов В.П.,

Онацкий Н.М., Демченкова Е.Ю. Методические указания по изучению антиоксидантной активности фармакологических веществ // Ведомости НЦ ЭСМП. -2007, № 2 - С. 96-103.

4. Кукес В.Г., Юргель E.H., Раменская Г.В., Щих Е.В., Буданов C.B., Демченкова Е.Ю. и др. Исследование антиоксидантных свойств лекарственных препаратов // Методическое пособие. 2009. Москва - 33 с.

5. Демченкова Е.Ю., Пахомов В.П. Определение антноксидантной активности лекарственных средств, бадов и лекарственного сырья // Научный журнал «Биомедицина». №5. 2010г. Москва - С. 76-78.

6. Пахомов В.П., Демченкова Е.Ю. О фитопрепаратах // Научный журнал

«Биомедицина». №5. 2010г. Москва - С. 114-115.

7. Демченкова Е.Ю., Миронов А.Н., Кукес В.Г., Горошко O.A., Чеча O.A.

Содержание суммы антиоксндантов в гепатопротекторных фитопрепаратах // Научный журнал «Биомедицина». Лs k • 2011г. Москва. - С.

Подписано в печать. 21.12.2011 г. Бумага «Снегурочка». Формат 60x84/16. Гарнитура «Times New Roman» Печать, ризографическая Усл.печ.л. 1,5 .Тираж 100 . Заказ 159

ООО «Угрешская типография» т. 700-13-40, 700-06-66 111621, Москва, ул. Оренбургская, 15,

Актуальность темы.

Под влиянием на организм человека неблагоприятных экологических факторов, повышенных физических и эмоциональных нагрузок, а также при длительных заболеваниях и в процессе старения свободнорадикальное окисление в организме активизируется - развивается, так называемый, синдром переоксидации или окислительный стресс [1].

При этом свободные радикалы оказывают повреждающее воздействие на мембраны клеток, в организме нарушаются процессы обмена веществ, накапливаются различные продукты промежуточного обмена. Такие сдвиги нарушают работу центральной нервной системы, иммунной системы, усугубляют воспалительные процессы в организме, способствуют образованию атеросклеротических бляшек в коронарных и мозговых сосудах и ускоряют старение организма [2]. Для замедления этих процессов целесообразно использовать лекарственные средства, обладающие антиоксидантными свойствами. Однако необходимо контролируемое потребление антиоксидантов. Рекомендуемые уровни потребления антиоксидантов приняты в РФ в 2004 году и составляют 350-1300мг/сутки. У различных лекарственных средств и лекарственного растительного сырья существует большая вариабельность антиоксидантной активности (АОА), а, следовательно, необходимо определять АОА каждого испытуемого лекарственного средства.

Антиоксиданты нашли широкое применение в фармацевтической промышленности и медицине в последнее время в составе биологически -активных добавок, косметических и лекарственных средств. Сейчас большое внимание уделяется средствам природного происхождения, таким как лекарственные растения и фитопрепараты, в которых содержатся такие известные антиоксиданты как флавоноиды, оксикоричные и фенолкарбоновые кислоты, кумарины и другие. Рост подобной продукции на рынке предъявляет все более серьезные требования к сертификации товара. В настоящее время в нормативных документах РФ не существует единого показателя антиоксидантной активности подобных препаратов. Для проверки их качества используются длительные, трудоемкие, не всегда сопоставимые и неточные исследования, опирающиеся иногда на неаттестованные методики. Расчет содержания антиоксидантов проводится по разным стандартам.

Необходимость введения новых методик, обеспечивающих надежные результаты по определению суммарной антиоксидантной активности или суммарного содержания антиоксидантов (ССА) подобных препаратов и создание нормативной документации на данный метод, является актуальной задачей, от решения которой зависит качество, эффективность и безопасность предлагаемых на рынке продуктов. Также актуальным представляется проведение исследований по содержанию антиоксидантов относительно стандартов-антиоксидантов.

Одним из перспективных методов определения активности антиоксидантов являются электрохимические методы, обладающие высокой чувствительностью, возможностью анализировать как водные, так и неводные среды [3]. В настоящей работе для решения вопросов по определению количественной оценке антиоксидантов предложен амперометрический метод, как весьма чувствительный к наличию в среде кислорода и его активных радикалов.

Цель исследования.

Оптимизировать методику амперометрического определения содержания антиоксидантов для оценки качества и стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов.

Задачи исследования.

1. Оптимизировать и валидировать методику амперометрического определения содержания антиоксидантов в лекарственном растительном сырье и в фитопрепаратах.

2. Провести изучение по корреляции содержащихся антиоксидантов (флавоноидов, органических кислот, окисляемых веществ) и суммарного содержания антиоксидантов в исследуемом лекарственном растительном сырье (JIPC).

3. Изучить сроки годности настоев из исследуемого JIPC амперометрическим методом на суммарное содержание антиоксидантов.

4. Провести определения суммарного содержания антиоксидантов в гепатопротекторных фитопрепаратах.

5. Разработать проект ОФС на амперометрический метод определения антиоксидантов в JIPC и в фитопрепаратах.

Научная новизна.

Предложена усовершенствованная методика определения содержания суммы антиоксидантов в JIPC и фитопрепаратах.

Впервые проведена валидация методики ампером етрического определения содержания суммы антиоксидантов в JIPC, которая может быть использована для оценки качества лекарственного растительного сырья. Предложенный метод дополнит арсенал in vitro исследований на содержание антиоксидантов в объектах фармацевтической промышленности;

Дана оценка антиоксидантной активности ряда веществ природного происхождения. Установлено, что содержание антиоксидантов в исследуемых объектах уменьшается в ряду: фенилантраниловая кислота - кофейная кислота - галловая кислота - кверцетин - аскорбиновая кислота.

Впервые определено содержание суммы антиоксидантов амперометрическим методом в водных извлечениях JIPC - лист мяты, трава репешка, цветки пижмы, цветки бессмертника, плоды расторопши, корневище аира, трава полыни горькой, столбики с рыльцами кукурузы. Выявлено наличие корреляции между содержанием суммы антиоксидантов в водных извлечениях и содержанием в них основных групп веществ обладающих антиоксидантной активностью (флавоноидов и окисляемых веществ).

Впервые установлено ССА в настоях из исследуемого сырья и гепатопротекторных фитопрепаратах амперометрическим методом, а также влияние времени хранения настоев на суммарное содержание антиоксидантов.

Показана перспективность метода определения ССА для стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов.

Практическое применение и внедрение результатов в практику. На основании проведенных исследований разработаны:

• методическое пособие для студентов фармацевтических факультетов медицинских вузов и фармацевтов по оценке результатов применения препаратов с антиоксидантным действием - «Исследование антиоксидантных свойств лекарственных препаратов» (Москва, 2009);

• впервые методика определения содержания суммы антиоксидантов в JIPC апробирована в лаборатории химико-фармацевтических препаратов №2 Испытательного центра экспертизы качества лекарственных средств ФГБУ НЦЭСМП и предложена для внедрения в производственный процесс как критерий контроля сырья (Акт апробации методики от 29.09.11.).

• предложенная методика может быть использована при скрининговых исследованиях для выявления перспективных групп JIPC для разработки новых лекарственных средств.

• показана возможность назначения настоев мяты листьев и репешка травы в качестве дополнительного источника антиоксидантов (о чем даны рекомендации в дополнение к инструкции по применению).

• разработан проект ОФС на амперометрический метод определения антиоксидантов в субстанциях, JIPC и лекарственных средствах. Положения, выносимые на защиту.

1. Использование валидированой методики для определения качества и стандартизации растительного сырья и фитопрепаратов на суммарное содержание антиоксидантов.

2. Результаты изучения количественного содержания основных антиоксидантов (флавоноидов, органических кислот, окисляемых веществ) в исследуемом J1PC в сравнении с суммарным содержанием антиоксидантов ЛРС - лист мяты, трава репешка, цветки пижмы, цветки бессмертника, плоды расторопши, корневище аира, трава полыни горькой, столбики с рыльцами кукурузы.

3. Результаты исследований ССА в настоях из исследуемого JIPC и изменение содержания ССА в процессе их хранения.

4. Результаты изучения содержания ССА в гепатопротекторных фитопрепаратах.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на научно-практической конференции «Клинико-фармакологические подходы в оптимизации фармакотерапии» (Москва, 2006), XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), II конгрессе Международного общества клинических фармакологов и фармацевтов стран СНГ (Москва, 2010) и научно-практической конференции (on-line) "Актуальные вопросы клинической фармакологии и фармации" (Москва, 2011).

Связь задач исследования с проблемным планом. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом НИР ФГУ НЦЭСМП на 2006-2010 г. «Разработка новых подходов для оценки антиоксидантной активности лекарственных средств». Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», выводов, списка литературы из 139 источников, (47 из которых на иностранных языках) и приложений.

Результаты эксперимента обобщены в 26 таблицах, проиллюстрированы 11 рисунками.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Оптимизирована и валидирована методика амперометрического определения суммарного содержания антиоксидантов в субстанциях, лекарственном растительном сырье и фитопрепаратах, что позволяет проводить оценку их качества и стандартизацию по данному показателю. Для расчета содержания антиоксидантов предложен антиоксидант-стандарт - галловая кислота.

2. Наибольшее содержание суммы антиоксидантов, флавоноидов и окисляемых веществ отмечается у листьев мяты и травы репешка, поэтому их целесообразно включать в растительные сборы и БАДы антиоксидантного действия как дополнительные источники антиоксидантов.

3. Установлено, что суммарное содержание антиоксидантов у всех видов исследуемого сырья коррелирует с содержанием основных групп обладающих антиоксидантной активностью - суммой флавоноидов, окисляемыми веществами. Это дает возможность использовать показатель суммарного содержания антиоксидантов как экспрессный критерий оценки качества сырья.

4. Среди исследованных настоев ЛРС наибольшее суммарное содержание антиоксидантов обнаруживается в настоях мяты и репешка. Однако это содержание уменьшается вдвое по прохождении 24 ч в настоях всех видов исследуемого сырья, что дает возможность использовать этот метод для установления сроков хранения настоев из JIPC и фитопрепаратов.

5. Проведен анализ суммарного содержания антиоксидантов в некоторых фитопрепаратах гепатопротекторного действия. Наибольшее значение ССА наблюдается у препаратов расторопши «Силимар» и «Гепабене». Выявлена положительная корреляция между ССА и содержанием суммы флаволигнанов в препаратах расторопши.

6. Разработан проект ОФС «Определение содержания антиоксидантов амперометрическим методом».