Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Валидация количественных иммуноферментных тест-систем для контроля качества медицинских иммунобиологических препаратов

На правах рукописи

ДАВЛЕТБАЕВА Ляйсан Раисовна

ВАЛИДАЦИЯ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МЕДИЦИНСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

14.00.36 - «Аллергология и иммунология»

ООЗ162070

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа - 2007

003162070

Работа выполнена в филиале «Иммунопрепарат» Федерального государственного унитарного предприятия «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель - кандидат медицинских наук

Исрафилов Азамат Габдельахатович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Имельбаева Эльвира Аркамовна, кандидат фармацевтических наук Мухаметзянов Рустем Маратович

Ведущая организация - Федеральное государственное

учреждение науки «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им JIА Тарасевича» Роспотребнадзора

Защита состоится 13 ноября 2007 г в 14 часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002 124 01 при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан по адресу 450014, г Уфа, ул Новороссийская, 105

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке филиала «Иммунопрепарат» Федерального государственного унитарного предприятия «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу 450014, г. Уфа, ул Новороссийская, 105

Автореферат разослан «/С» /СУ 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Лукманова К А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В соответствии с современными требованиями производства лекарственных средств, изложенными в российских документах (ГОСТ Р 52249-04, МУ 3 3 2 1886-04 и СП 3 3 2 1288-03, приказ Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития от 29 01 2007 г № 01И-61/07), использование валидированных аналитических методов является обязательным как при разработке новых лекарственных средств, так и при их рутинном контроле Валидация аналитического метода — процесс демонстрации соответствия методики предполагаемому применению путем лабораторных исследований специфических характеристик Валидация аналитического метода проводится при внедрении новой методики, при изменении условий анализа лекарственных средств или при пересмотре их в дальнейшем

Среди аналитических методов контроля качества иммунобиологических препаратов одно из ведущих мест занимает наиболее сложный метод - иммуноферментный В отношении качественного иммуноферментного анализа (ИФА) валидация считается рутинной процедурой, однако в отношении количественного анализа она остается недостаточно разработанной [Шалепо К В., 2003] В частности, отсутствуют численные критерии и единый унифицированный документ

Овальбумин (ОА) является основным маркером присутствия остаточных количеств субстрата репродукции вирусов целого ряда вакцинных препаратов, предназначенных для профилактики гриппа, кори, краснухи, паротита, бешенства, желтой лихорадки [С1ю\у С, 2005, Сох IЕ , 2006] и считается одним из наиболее частых примесей, ответственных за развитие аллергических реакций при применении вакцин и препаратов лейкоцитарного интерферона В связи с этим, валидация иммуноферментного метода определения ОА в иммунобиологических препаратах является обязательным условием создания безопасных препаратов, а также удобной моделью разработки подходов к валидации количественных тест-систем Необходимость метода контроля ОА обусловлена тем, что он содержится в препарате «Гриппол», который включен в национальный календарь прививок, а препараты интерферона являются жизненно-необходимыми и часто используемыми в клинической практике лекарственными средствами Допустимое остаточное количество ОА в отечественной гриппозной вакцине составляет не более 100 нг/мл, однако этого количества достаточно, чтобы вызвать реакцию гиперчувствительности у лиц с аллергией к яичному белку Использование зарубежных тест-систем контроля содержания ОА в настоящее время неразрешено в связи с тем, что они не зарегистрированы в МЗ и СР РФ, а также из-за высокой стоимости

Другим, часто используемым методом ИФА, является определение антицитомегаловирусных антител (анти-ЦМВ АТ) в иммунобиологических препаратах С этой целью используются тест-системы ИФА, производимые отечественными и зарубежными фирмами для клинических лабораторий В связи с разработкой новых иммуноглобулиновых препаратов с высоким титром анти-ЦМВ А1 на базе филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ возникла необходимость оценки основных параметров валидации этих тест-систем

Вышеизложенное свидетельствует о необходимости оценки и повышения качества тест-систем, используемых для контроля иммунобиологических препаратов

Цель исследования

Оценка качества и определение параметров валидации иммуноферментных тест-систем для количественного определения овальбумина и антицитомегаловирусных антител в иммунобиологических препаратах

Задачи исследования

1 Определить валидационные характеристики тест-системы для определения овальбумина в медицинских иммунобиологических препаратах специфичность, диапазон, пределы обнаружения и определения, линейность

2 Определить показатели точности тест-системы для определения овальбумина в медицинских иммунобиологических препаратах правильность, повторяемость и внутрилабораторная воспроизводимость

3 Определить критические параметры иммуноферментной тест-системы для определения овальбумина в иммунобиологических препаратах.

4 Оценить параметры валидации тест-системы для определения антицитомегаловирусных антител по показателям линейности, пределов определения, меры прецизионности

Научная новизна

Впервые на модели иммунобиологических препаратов («Гриппол» и препараты человеческого лейкоцитарного интерферона) проведена валидация иммуноферментной тест-системы для количественного определения овальбумина

Новыми являются данные по валидации метода определения активности антицитомегаловирусных антител в препаратах иммуноглобулинов для внутривенного введения («Иммуновенин», «ЦМВ ИГ» — препарат иммуноглобулина человека против цитомегаловируса, «Цитотект», «Хумаглобин» и др ) с помощью тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-О» по основным характеристикам и показателям точности метода Показано, что данная тест-система может быть использована не только для тестирования плазмы крови больных и доноров, но и для контроля качества иммунобиологических препаратов

Впервые предложен оригинальный комплексный подход в определении пределов обнаружения и количественного определения аналита по ограничительным минимальным и максимальным критериям Предложено определение перекрестного реагирования антител на уровне предела количественного определения овальбумина

Научно-практическая значимость работы

Положительные результаты валидационных испытаний подтверждают применимость иммуноферментного метода для установления достоверного количественного содержания овальбумина в препарате «Гриппол» и человеческого лейкоцитарного интерферона Установлены критические параметры тест-системы для количественного определения овальбумина — правильность и специфичность, что позволяет повысить качество и надежность иммуноферментных тест-систем

Показана приемлемость использования тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-О» для определения антицитомегаловирусных антител в препаратах иммуноглобулинов для внутривенного введения Следовательно, данный метод может быть использован не только для отбора сырья с целью получения препарата, но и для количественной оценки специфической активности конечного препарата, а также для проведения сравнительного анализа различных препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения Это позволяет рекомендовать иммуноферментный метод определения содержания анти-ЦМВ АТ с помощью тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-О» в качестве референс-метода для количественного определения антител ТдО-класса к цитомегаловирусу в препаратах иммуноглобулинов методом параллельных линий в соответствии с требованиями Европейской фармакопеи

Использование валидированных количественных

иммуноферментных методов позволяет снять остроту проблемы стандартизации и контроля качества ряда выпускаемых медицинских иммунобиологических препаратов В теоретическом плане проведенные валидационные исследования расширяют знания в области валидации количественных иммуноферментных тест-систем Полученный фактический материал представляет несомненный интерес при валидации любых количественных иммуноферментных тест-систем Расширены подходы к валидации и оценке наиболее важного валидационного параметра -специфичности

Внедрение результатов исследования в практику На основании проведенных исследований разработаны и изданы методические указания «Валидация количественных иммуноферментных методов анализа иммунобиологических препаратов», которые внедрены в работу филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ Проведенные исследования позволили оптимизировать и стандартизовать иммуноферментную тест-систему для определения овальбумина в

иммунобиологических препаратах повысить ее чувствительность, линейность, прецизионность

Основные положения, выносимые на защиту

! Валидность иммуноферментного метода определения овальбумина в иммунобиологических препаратах позволяет использовать его в качестве референсного метода для определения содержания аллергенного компонента в иммунобиологических препаратах - «Гршшол» и препаратах человеческого лейкоцитарного интерферона

2 Количественное определение антител класса иммуноглобулина в к цитомегаловирусу с помощью рекомбинантной тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-О» рекомендовано в качестве метода контроля содержания антицитомегаловирусных антител в специфическом препарате антицитомегаловирусного иммуноглобулина и в неспецифических препаратах иммуноглобулинов для внутривенного введения

3 Провалидированные отечественные иммуноферментные тест-системы соответствуют требованиям зарубежных нормативных документов по таким критериям, как чувствительность, линейность, воспроизводимость

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на ряде научных форумов Всероссийской научной конференции «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке разработка, производство и применение» (Уфа, 2005), Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2006), научной конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической аллергологии и иммунологии» (Оренбург, 2006), научной конференции «Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека» (Челябинск, 2006), научно-практической конференции «Вакцинология - 2006 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики и лечения инфекционных заболеваний» (Москва, 2006), межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Омск, 2007)

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ (протокол от 19 09 2007 г № 4) и на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002 124 01 при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан (протокол от 04 10 2007 г № 64)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано девять научных работ, в том числе одна в рецензируемом журнале

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах, содержит 33 таблицы и 16 рисунков Она состоит из введения, обзора литературы (одна глава), собственных исследований (две главы), заключения, выводов и практических рекомендаций Список литературы включает 130 источников (38 отечественных и 92 зарубежных)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исследования валидности тест-систем для количественного определения OA и анти-ЦМВ AT были проведены с использованием

«Иммуноферментной тест-системы для количественного определения овальбумина» (филиал «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ),

«Chicken Egg Ovalbumin Elisa Kit» («Biotrend», USA), «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G» (НПО «Диагностические системы», г Н Новгород)

Тест-система для определения OA в иммунобиологических препаратах состоит из планшета с сорбированными антителами к OA, положительного и отрицательного контроля, коньюгата, субстрата и стоп-реагента Принципом метода является неконкурентное связывание сорбированных антител с OA с последующей фотометрической детекцией активности фермента, конъюгированного с антителами второго порядка

Определение анти-ЦМВ AT в препаратах проводилось по стандартной методике, рекомендованной фирмой — производителем тест-систем «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G»

Материалами для исследования явились производственные серии препарата человеческого лейкоцитарного интерферона (№№ 23 - 48), «Гриппола» (№№ 43 - 64), Хумаглобин («А/О Хуман», Венгрия), Октагам («Octapharma», Швейцария), Интраглобин («Biotest Pharma», ФРГ), Цитотект («Biotest Pharma», ФРГ), Gamimune N («Miles Biological», США), Иммуновенин (филиал «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ), ЦМВ ИГ - препарат иммуноглобулина человека против цитомегаловируса (филиал «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ), ВПГ ИГ - иммуноглобулин против вируса простого герпеса (филиал «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ)

В качестве стандартов были использованы лиофилизированный стандартный образец овальбумина (СО OA), приготовленный на основе стабилизаторов - 2,25 % глицин с 5,0 % мальтозой, отраслевой стандартный образец противоцитомегаловирусных антител человека — ОСО 42-28-371-03 IgG анти-ЦМВ (филиал «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗРФ)

Для изучения перекрестное™ OA использовали бычий сывороточный альбумин (БСА), лошадиный сывороточный альбумин (JICA), человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) производства фирмы «Sigma», (США)

Оценку содержания овальбумина и анти-ЦМВ AT в иммунобиологических препаратах проводили иммуноферментным методом, с применением термостатитруемого шейкера («Элми», Латвия), вошера («ИММЕДТЕХ», Дубка), спектрофотометра «Multiskan Ascent» (Thermo Electron) Пробы вносили полуавтоматическими дозаторами фирмы «Eppendorf», прошедшими метрологический контроль

Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием компьютерной программы «STATISTICA 6 О»

Для анализа параллельности и линейности кривых препаратов по отношению к калибровочной кривой OA, оценки активности анти-ЦМВ AT использовали программу «Паралайн», разработанную главным метрологом ГПИИСКМБП им Л А Тарасевича доктором биологических наук В Г Петуховым,

Валидация аналитических методов проводилась в соответствии с требованиями международных организаций - ICH (1996), IUP АС (2002), ЕС (2000), АОАС (2002), EURACHEM (1998), EDA (2005), VICH (1998) и Европейской (ЕР, 2004), Американской (USP 28, 2004), Японской (IP 14, 2001) фармакопей

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Валидация количественной иммуноферментной тест-системы для определения овальбумина в иммунобиологических препаратах

На начальных этапах исследований нами был проведен анализ специфичности и селективности исследуемой тест-системы С этой целью проводили изучение перекрестное™ OA с близкими по структуре антигенами В качестве перекрестно-реагирующих антигенов использовали бычий, человеческий, лошадиный альбумины Проводили исследования оптической плотности (ОП) в трех лунках планшета для каждой концентрации белка (трипликаты)

Для более точной характеристики специфичности нами был проведен анализ полученных результатов с использованием метода параллельных линий («Паралайн»), который позволяет оценить перекрестность исследуемых соединений по калибровочным графикам их растворов в исследуемых концентрациях (рисунок 1)

Из рисунка 1 видно, что в исследуемых концентрациях перекрестно-реагирующие соединения не имеют ни линейности, ни параллельности в сравнении с СО OA, что свидетельствует о невозможности оценки специфичности тест-системы методом параллельных линий Поэтому мы

использовали два иных подхода исследования специфичности собственно перекрестность и селективность, позволяющие осуществить комплексную оценку специфичности по углу наклона и в определенной точке кривой

• - овальбумин, ▲ - лошадиный альбумин, ■ - бычий альбумин Рисунок 1 - Сравнение калибровочных графиков овальбумина и перекрестно-реагирующих соединений

Для каждого перекрестно-реагирующего соединения и ОА строили графики зависимости ОП от концентрации и рассчитывали процент перекрестности по формуле ю 1л , где СЕ. - перекрестность %,

СК = 1С ы Ш0 %

1С оа - концентрация овальбумина на середине калибровочной кривой, 1С ы - концентрация перекрестно-реагирующего соединения, которое на 50 % ингибирует максимальный сигнал овальбумина [Балк-лотЛ: А, Носк В , 1996]

В связи с тем, что общепринятый метод изучения СК при 50-процентном связывании, предназначенный в основном для анализа основного или активного соединения, оказался неприменимым из-за низких значений ОП перекрестно-реагирующих соединений, СК рассчитывали для уровня концентрации ОА, близкой к пределу количественного определения.

Для обнаружения матрикс-эффекта вычислили индекс селективности по формуле _ , где ТБ - индекс селективности, ьап ~ чувствительность

метода (наклон калибровочной функции), Ьы - наклон независимо

полученного отклика для потенциального интерферента, полученного в линейном диапазоне оптических плотностей овальбумина [ШРАС, 2002]

Полученные данные отражены в таблице 1 Из таблицы 1 видно, что в исследуемой тест-системе не выявлено выраженной перекрестной реакции ни с одним из анализируемых перекрестно-реагирующих соединений, что свидетельствует о ее высокой специфичности

Таблица 1 - Показатели специфичности иммуноферментной тест-

системы для определения овальбумина

Перекрестно-реагирующие соединения Перекрестность, % Индекс селективности, ед

БСА 0,135±0,073 5,50±0,02

ЛСА 0,205±0Д09 7,80±0,04

ЧСА 0,090±0,035 9,70±0,25

Критерий Не > 1 % на пределе определения Не менее 5

Следует отметить, что зарубежные тест-системы «Chicken Ovalbumin ELISA Kit» («ADI», USA), «Ovalbumin ELISA Kit» («Swenska Diagnostics», Poland) допускают перекрестность до 16 % с родственными альбуминами Индекс селективности для изученных нами видов альбумина составил более 5,5 ед, что свидетельствует о высокой селективности данной тест-системы по отношению к овальбумину

Правильность иммуноферментной тест-системы для определения овальбумина

Для исследования правильности нами были использованы модельные смеси, приготовленные путем добавления известного количества овальбумина к матриксу препарата на уровне трех концентраций в трех повторностях Данные образцы анализировали иммуноферментный методом и рассчитывали процент восстановления как отношение полученного при анализе количества вещества к известному добавленному Результаты расчета процента восстановления для параметра правильности приведены в таблице 2

Таблица 2 - Процент восстановления для правильности

иммуноферментной тест-системы для определения овальбумина

Ожидаемая концентрация OA, нг/мл Добавленное содержание СО OA, нг/мл Измеренная концентрация OA, нг/мл % восстановления

12 12 13,43±0,35 111,9

6 6 5,28±0,19 88,0

3 3 2,57±0,94 85,7

Допустимый % восстановления (ЕигасИет, 1998) 40 -120

Требуемый критерий восстановления для биоаналитических методов (ИБР 28) 85-115

Если вести расчеты по «концентрационному тесту» из таблицы «Оценка правильности в зависимости от концентрации активного компонента в анализируемом образце» (ЕигасЬет), то при среднем содержании примеси овальбумина в образцах процент восстановления допускается в пределах 40—120 процентов Но, с учетом того, что мы должны выставить более

и

жесткие требования для исследуемых параметров потенциально опасного аллергенного соединения OA, мы выбрали более жесткий критерий допустимый отклик в пределах 85—115 процентов

Сравнение стандартного образца тест-системы «Chicken Egg Ovalbumin Elisa Kit» фирмы «Biotrend» (США) и отечественного СО овальбумина показало, что полученные значения концентраций существенно различаются (рисунок 2)

• - зарубежный стандарт, ■ - отечественный стандартный образец

Рисунок 2 - Сравнение зарубежного и отечественного стандартов

овальбумина

Это может говорить о том, что правильность является критическим параметром для отечественной тест-системы Поэтому, данный параметр необходимо вынести в ряд параметров валидации, требующих регулярного контроля при повторных валидационных операциях (ревалидации)

Интервал иммуноферментной тест-системы для определения овальбумина

Для определения интервала, в котором значения оптической плотности в зависимости от концентрации будут соответствовать линейному диапазону калибровочной кривой, мы выбрали следующие уровни концентраций.

область ожидаемых нижних пределов определения - 0,1 и 0,5 нг/мл,

80 % - 40 нг/мл;

100 % - 50 нг/мл,

120 % - 60 нг/мл,

150 % -75 нг/мл, принимая за 100 % номинальное содержание овальбумина в интерфероне,

± 20 % над основным диапазоном (концентрации 90,0 и 0,4 нг/мл)

100 нг/мл - ожидаемая высокая концентрация или нормируемое содержание овальбумина в препарате «Гриппол»

Приготовленные растворы были проанализированы иммуноферментным методом По полученным данным построили графики зависимости ОП от концентраций овальбумина (рисунок 3)

, _ г*®: .----*.«•. ' !

" 2,2

'*" 2 0

<•*>■•■ -се'

* V! I'?.

Ж ^

is;:' 'Сг

!

О®

J,

• 02 , , « , , -■-■.. .

- Л.-20' 0 20 - ЭД ' 40'. . 80 _ i» ,100 Щ ив

1 - .. ■ = „ , С, ИГ/МЛ * :: - ' *** f ■ - "

Рисунок 3 - График зависимости оптической плотности от концентрации овальбумина

Из рисунка 3 видно, что концентрации ОА от 25 до 100 нг/мл находятся в области плато, т е дальнейшее увеличение концентрации не приводит к пропорциональному возрастанию оптической плотности Однако, для ИФА максимальное значение ОП должно быть в диапазоне от 1,7 до 2,0 ед в области плато [Crowther JR, 2002]. С учетом этого требования значения концентраций ОА от 25 нг/мл и выше не могут войти в область диапазона калибровочной кривой, и по графику видно, что концентрации выше 25 нг/мл, выполненные без разведения, существенно занижают истинное содержание потенциально опасного компонента иммунобиологических препаратов - овальбумина

Поэтому мы раститровали СО ОА на четыре разведения ниже и исследовали полный диапазон калибровочной кривой тест-системы для определения овальбумина (рисунок 4) Для имму но ферментных методов рекомендуются как минимум четыре точки концентраций, которые должны ложиться на прямую линию [ICH, 1996]

Из рисунка 4 видно, что на данной кривой как минимум пять точек укладываются в диапазон исследования линейности тест-системы для определения ОА, те требование линейности по числу точек на кривой выполнено С учетом современных требований, при разработке и оптимизации количественных иммуноферментных тест-систем рекомендуется, чтобы линейный диапазон либо соответствовал, либо был ниже нормируемого уровня анализируемого вещества в препаратах.

- ,. % " '"•»' «вМг1«!1(», , • . ...

&

% А''' " :

'' 00

| «

<84.

-о.«

-- - Ш

Рисунок 4 - Диапазон калибровочной кривой тест-системы для определения овальбумина

Однако, чем чувствительнее тест-система, тем более сжат линейный диапазон, поэтому находят компромисс между чувствительностью и шириной диапазона, добиваясь соблюдения, соответственно двух принципов менее 0,1 нормируемого уровня ОА для количественного предела определения и не < 4 точек на линейной области аналитической методики.

Линейный диапазон, включающий концентрации от 0,5 до 12 нг/мл, находится в пределах допустимой нормы и ожидаемых концентраций ОА в препаратах интерферона и «Грипполе», с учетом разведения проб Для подтверждения возможности использования метода параллельных линий для оценки количественного содержания ОА нами исследовалась линейность и параллельность кривых разведения препарата «Гриппол» и стандартного образца предприятия овальбумина (рисунок 5)

|—РЯД1 —»-Ряд4 «.....Ряд5[

■ - «Гриппол», • -овальбумин

Рисунок 5 - Кривые раститровок препарата «Гриппол» и стандартного образца овальбумина

Линейность и параллельность раститровок препарата «Гриппол» и овальбумина говорят о том, что выбранные стабилизаторы для кандидата ОСО OA (глицин с мальтозой) соответствуют матриксу препарата «Гриппол», что служит основанием и для отбора данного кандидата СО OA для валидации иммуноферментной тест-системы и возможности количественной оценки содержания OA в препарате «Гриппол»

Валидация линейности иммуноферментной тест-системы для определения овальбумина

Для изучения линейности анализировали образцы с концентрациями определяемого вещества, охватывающими изученный диапазон Данные оптической плотности в диапазоне концентраций OA от 0,0 до 12,5 нг/мл, даже без логарифмирования показали хорошую линейную зависимость (рисунок 6) с высоким коэффициентом корреляции (г = 0,999, р<0,001, п=7)

„ 1 ,* -*. - i ^а12'\'= .13988+. ,12483* Varl ( j, 4» ~ .,« ... J »

-i" " 41 J;"!,CDuaajlon-r.=",99?27;. ; - jr.- t"*

■*.*w> " **" ■ - —- - - - -

* !>

* 13s

¡M

¡o .

0

. "

ч "'i®'6' К :

1 jSi-L

^ ' * 0,2

0 --■ — . ------ . ,--,- ...» г

-2 0. - -1 .. „J, 6*' _>' , 10 - t „|12, " . 14-

-«>■«■ - S ' " "ч*** "Сг~НЙМ11- - Г|»ч95 ^confidence ' • I

Рисунок 6 - Калибровочный график тест-системы для определения овальбумина

Во многих анализах для оценки линейности используют критерий корреляции (г) Считается, что если г > 0,990, то регрессионная модель отвечает критерию линейности (АОАС, ЕС) Однако только один коэффициент корреляции не способен адекватно демонстрировать линейность, даже когда данные показывают признак линейности [Smgtoroj Т, 2006]

Согласно рекомендациям ведущих зарубежных организаций по валидации аналитических методов [Draft Guidance - FDA, CDER, CBER, 2000] для оценки степени линейности должны быть рассчитаны и учтены все показатели линейности коэффициент корреляции - г, перекрывание оси

У(интерсепт) - а, наклон регрессионной линии - Ь, остаточная сумма отклонений (остатки, residual)

С целью определения вышеперечисленных критериев оценки линейности проводили регрессионный анализ данных иммуноферментного анализа, что позволяет оценить не только неизвестные параметры, а также исследовать значимость регрессии и адекватность построенной модели исходным данным. Нами были рассчитаны коэффициенты корреляции и регрессии, а также статистической значимости для различных серий иммуноферментных тест-систем для определения овальбумина (таблица 3)

Таблица 3 - Результаты регрессионного анализа различных серий иммуноферментной тест-системы для определения овальбумина

Критерии оценки линейности Серии тест-системы для определения ОА

3-1 (п=7) 3-2 (п=7) 3-3 (п=7) 3-4 (п=7)

г 0,999 0,999 0,998 0,994

Стандартная ошибка регрессии 0,017 0,028 0,029 0,044

Интерсепт (а) - 0,599 -0,744 -0,847 -0,599

Стандартная ошибка интерсепта 0,011 0,018 0,019 0,042

Ъ (угол наклона) 0,706 0,865 0,704 0,708

Б - критерий 2921,000 df = 1 и 4 1504,703 df = 1 и4 964,546 df = 1 и 4 229,708 df = 1 иЗ

р(уровень значимости) 0,00001 0,000003 0,000006 0,0007

Стандартная ошибка оценки, являющаяся мерой рассеяния наблюдаемых значений относительно регрессионной прямой, для тест-систем не более 0,045 Поэтому отклонения от линейности оказались незначимыми и достоверность модели не вызывает сомнений Статистически значимое F -это критерий достоверности регрессии Значения F-критерия при числе степеней свободы 1 и 4 ниже, чем F табличное, что при уровне значимости р < 0,05 показывает, что построенная регрессия высоко значима В уравнении линейной регрессии полученное значение у - интерсепта (а = 0,140) было в пределах 10 % отклика концентрации примеси [Green JM, 1996] Наклон регрессионной линии и его вариация дают математическую степень линейности Значение коэффициента регрессии Ъ тест-систем для определения ОА составляет не ниже 0,704, т е соответствует требованиям (должно быть > 0,7) Это показывает, что угол наклона тест-системы близок к единице

Для оценки линейности регрессии также использовали анализ остатков Остатки в графической форме оказались неравномерно разбросаны

относительно прямой, что визуально характеризует адекватность регрессионной модели.

Пределы обнаружения и количественного определения им мун о фермента ой тест-системы для определения овал ьбу мина

Мы сопоставили несколько способов нахождения пределов определения, и считаем более правильным следующий подход: сначала используется классический способ нахождения предела обнаружения по «шуму» уши фону (КН, АОАС, ШРАС), т.е. определяется максимальное значение ОП, надежно отличающееся от шума. На втором этапе, основываясь на номинальном содержании ОА в препаратах, использовали критерий, согласно которому предел количественного определения должен быть в 5-10 раз ниже нормируемого уровня анализируемого вещества в иммунобиологических препаратах. На заключительном этапе мы по характеристикам кривой - углу наклона и стандартному отклонению от линии регрессии (расчетный метод - ЮН, 1996) уточняем значение, которое не должно быть меньше значений базовых пределов определения и не больше двух верхних критических уровней. Согласно приведенным выше методам, мы разработали следующую схему выбора критериев для пределов определения, опираясь на номинальное содержание ОА в препарате человеческого лейкоцитарного интерферона {рисунок 7),

щ зэо ш юэо ю 1/ю ш 1/5

Критерии для иО и из

Рисунок 7 - Требуемые критерии для пределов обнаружения (ЬБ) и количественного определения (Ьр) тест-системы для определения

овальбумина

1,0 и Ц^ ЮЭО — значения нижних пределов обнаружения и количественной) определения, вычисленные «шумовым» методом;

1X3 1/Ю - верхний идеальный критический уровень, те концентрация О А (10 нг/мл), которая в десять раз ниже нормируемого уровня ОА в препарате,

Ь<3 1/5 - верхний допустимый критический уровень, соответствует концентрации 5 нг/мл, которая в пять раз ниже нормируемого уровня ОА в препарате человеческого лейкоцитарного интерферона

За предел обнаружения по «шумовому» методу принимают то значение, которое выше среднего значения матрикса (или плацебо) на 3 стандартных отклонения

Среднее значение матрикса (ОП) + 3 ББ - предел обнаружения (1ЛЭ) Для предела количественного определения применяется уровень десяти стандартных отклонений среднее значение матрикса (ОП) + 10 8Б = предел количественного определения (Ь<3)

Исследования серий тест-систем показали, что предел обнаружения ОА составляет 0,132 нг/мл, количественного определения -0,569 нг/мл (таблица 4)

Таблица 4 — Значения пределов обнаружения и количественного определения овальбумина различных серий тест-системы _

Серии тест-систем Среднее значение ОП матрикса СУ, % IX), нг/мл 1X2, нг/мл

3-1 0,065 (п=9) 0,0036 5,5 0,199 0,523

3-2 0,059 (п=9) 0,0026 7,7 0,155 0,562

3-3 0,056 (п=9) 0,0049 8,8 0,122 0,575

3-4 0,052 (п=9) 0,0038 7,3 0,087 0,510

3-5 0,052 (п=9) 0,0052 3,7 0,096 0,562

Среднее (ЗШ ББ) 0,132±0,083 0,546±0,064

Критерий не менее 0,132 не менее 0,546

Согласно расчетному методу пределы вычисляются по следующим 3 351)

формулам ВЬ1СН ЗР = —-, где БЬ (ЬлШ о!" с^есйоп) - предел

Ь

обнаружения, ББ - стандартное отклонение, Ъ - наклон калибровочной кривой,

10 СП

QL„„ = —-, где QL (limit of quantitation) - предел количественного

■w ivii it/i t

b

определения, SD - стандартное отклонение, Ъ - наклон калибровочной кривой

Мы рассчитывали пределы, используя SD интерсепта регрессионной линии Результаты приведены в таблице 5.

Таблица 5 - Пределы обнаружения и количественного определения овальбумина расчетным методом_

Серии тест-систем для определения ОА

Показатели 3-2 (п=5) 3-3 (п=5) 3-4 (п=5) 3-5 (п=5) Среднее (X±t SD)

SD (стандартная ошибка регрессии) 0,045 0,047 0,045 0,044 0,045±0,125

Ъ (угол наклона) 0,865 0,704 0,707 0,708 0,746±0,220

LD 0,207 0,219 0,210 0,205 0,210±0,021

LQ 0,679 0,680 0,636 0,621 0,654±0,083

Предел обнаружения, вычисленный данным способом, составил 0,210, предел количественного определения - 0,654 нг/мл По схеме определения критериев, с учетом номинального содержания ОА в препарате, предел количественного определения — 5 нг/мл Таким образом, пределы, найденные расчетным методом, выше значений шумовых пределов обнаружения и количественного определения, и ниже верхнего идеального критического уровня

Прецизионность

Повторяемость тест-системы для определения ОА нами была изучена во всем диапазоне калибровочной кривой при трех повторностях трех уровней концентрации овальбумина Коэффициенты вариации были вычислены путем расчета стандартных отклонений с учетом средних значений концентрации овальбумина. Данные повторяемости иммуно-ферментной тест-системы для определения ОА приведены в таблице 6

Таблица 6 - Повторяемость иммуноферментной тест-системы

для определения овальбумина

Оптическая плотность С0а, нг/мл Среднее значение С0а> нг/мл СУ,%

0,969 6,75 6,8 0,05 0,7

0,964 6,82

0,966 6,84

0,538 2,98 3,32 0,29 . 8,9

0,624 3,54

0,622 3,43

0,311 1,35 1,38 0,03 2,2

0,314 1,37

0,320 1,41

Среднее значение СУ, % 3,9

Критерий (АОАС, 1998) 10,0

Близость повторяемости (при наихудшем случае - 8,9 %) к верхней границе допустимого критерия - 10,0 %, потребовала отнесения данной характеристики к критическим параметрам тест-системы

При изучении воспроизводимости мы решили ограничиться внутрилабораторной воспроизводимостью или промежуточной точностью Промежуточная точность была рассчитана для трех случаев в пределах одной лаборатории через каждую неделю Данные коэффициента вариации и стандартных отклонений для внутрилабораторной воспроизводимости приведены в таблице 7

Таблица 7 - Промежуточная точность иммуноферментной тест-системы для определения овальбумина___

Временной интервал, нед Среднее значение Соа, нг/мл 8Б СУ, %

первая неделя вторая неделя третья неделя

С0а, нг/мл Соа, нг/мл Соа, нг/мл

6,68 6,23 6,89 6,60 0,34 5,11

3,51 3,61 2,74 3,29 0,48 14,50

1,09 1,33 1,59 1,34 0,25 18,70

Среднее значение СУ, % 12,80

Критерий (БОА, СБЕК., 2001) 20,00

Близость промежуточной точности (при наихудшем случае - 18,7 %) к верхней границе допустимого критерия - 20 %, потребовала отнесения данной характеристики к критическим параметрам тест-системы Для всех изученных серий иммуноферментной тест-системы для определения ОА можно видеть, что повторяемость имеет значение коэффициента вариации ниже промежуточной точности

Валидация иммуноферментной тест-системы для определения содержания антицитомегаловирусных антител в препаратах иммуноглобулина для внутривенного введения по основным параметрам

Иммуноферментная тест-система «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-О» является практически единственной в РФ стандартизованной методикой, использующей ОСО 42-28-371-03 анти-ЦМВ, разработанный на основе международного стандарта Института Пауля Эрлиха (Германия) филиалом «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ В связи с разработкой антицитомегаловирусного иммуноглобулина отечественного производства и необходимостью сравнения с зарегистрированными в РФ зарубежными препаратами специфических иммуноглобулинов возникла необходимость использования валидированной методики При валидации тест-системы, предназначенной для определения активного вещества, в отличие от тест-системы для определения примесного соединения, были применены более жесткие критерии оценки валидационных параметров Исходя из данных удельной активности аффинно-очищенных антител - 0,52 РЕ/мг (Патент РФ N 2157240) была определена ориентировочная концентрация антицитомегаловирусных антител в препаратах для расчетов правильности и точности

При проведении валидации тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-О» практически были применены те же подходы и методы проведения валидационных процедур, которые применялись к тест-системе для определения овальбумина Исключением явился подход к исследованию предела количественного определения Для изучения предела количественного определения был применен более объективный метод определения нижней валидируемой концентрации с точностью 10 %, с использованием вычисленных данных по сравнению с реальными данными (ЕшасЬеш, 1998)

• Анализируют 6 образцов с уменьшающимися концентрациями

аналита в трех повторностях,

• Рассчитывают коэффициент вариации и строят 1рафик зависимости

СУ (%) от концентрации

С учетом данного подхода методика должна количественно определять содержание антицитомегаловирусных антител в области максимального разведения, соответствующего коэффициенту вариации не

более 10 процентов Результаты оценки предела определения приведены в таблице 8

Таблица 8 - Значения коэффициентов вариации в зависимости от содержания антицитомегаловирусных антител

Содержание анти-ЦМВ АТ, тРЕ/мл Оптическая плотность В490 СУ, %

определения среднее значение

150 2, 376 2,377 1,5

2,412

2,342

75 1,420 1,443 1,7

1,442

1,467

37,5 0, 740 0,744 1,6

0, 758

0, 735

18,75 0,455 0,455 1,8

0,463

0,447

9,375 0, 266 0,266 2,6

0, 273

0, 259

4,687 0, 157 0,141 И

0, 126

0, 139

По результатам оценки предела количественного определения можно заключить предел количественного определения для иммуноферментной тест-системы ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-О составляет 3,9 тРЕ/мл анти-ЦМВ АТ, что соответствует коэффициенту вариации 10 %

Полученные результаты по оценке основных параметров валидации приведены в таблице 9

Данные нашего исследования правильности измерения активности анти-ЦМВ-АТ в специфическом препарате против цитомегаловирусных антител с помощью тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-О» показали, что приемлемым критерием для процента восстановления стал выход равный 90-110 процентам

Таблица 9 - Данные валидации иммуноферментной тест-

системы «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-С»

Параметры валидации Пределы, тРЕ/мл г (при р<0,05) Прецизионность, CV% Выход (X±SD), (Recovery), %

Результаты Ы>-2,3 - 3,9 0,998 80- 2,04 100-0,78 120-1,20 93,30 ± 1,14

Критерии 1Ю - не более 3,0 - не более 5,0 не менее 0,990 (АОАС, ЕС) не более 2,8 % (Eurachem, 1998) Допустимый средний отклик 90-107 % (Eurachem, 1998)

Полученные результаты показали приемлемость использования рекомбинантной тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-в» для определения анти-ЦМВ-АТ в препаратах, в связи с чем можно расширить применение данной тест-системы не только для количественного определения антител класса ^О к цитомегаловирусу в сыворотках доноров, но и для исследования активности препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения, что желательно отразить в инструкции по применению тест-системы

ВЫВОДЫ

1 Валидационные испытания иммуноферментной тест-системы для определения овальбумина (филиал «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ) показали соответствие валидационных параметров принятым количественным критериям по специфичности -перекрестность от 0,090 до 0,205, что < 1,0 %, индекс селективности от 5,5 до 9,7, что > 5,0, по линейности (т = 0,998, что > 0,990, Ъ = 0,86, что > 0,7, Р < Б табл), по пределу количественного определения -0,654 нг/мл, что < 5 нг/мл (9-кратный запас прочности), по диапазону (5-точечный, что > 4), от 0, 654 до 12,00 нг/мл, что < 50 и 100 нг/мл -нормируемого уровня овальбумина в препаратах, по правильности -% восстановления 85,7-111,9 % (норма в пределах 85-115 %), по повторяемости - коэффициент вариации 0,7, 8,9, 2,2, что < 10 %) Это позволяет использовать данную тест-систему в качестве референс-метода для оценки количественного содержания овальбумина в препаратах человеческого лейкоцитарного интерферона и «Грипполе»

2 Выявлены следующие критические параметры иммуноферментной тест-системы для определения овальбумина повторяемость в области концентраций, близких к пределам определения - около 8,9 %, что < 10 %, промежуточная точность - 18,7 %, что < 20 %,

восстановление для правильности 85,7-111,9 % (норма в пределах 85-115 %), что требует внесения их в обязательный перечень параметров валидации для регулярного контроля при повторных валидационных операциях

3 Для изучения перекрестности при очень низких значениях перекрестности - менее 1 % предложен более чувствительный метод исследования на уровне концентраций овальбумина, близких к пределу количественного определения

4 Проведенная валидация иммуноферментной тест-системы для определения антицитомегаловирусных антител («Диагностические системы», г Нижний Новгород) показала соответствие ее параметров принятым количественным критериям приемлемости по пределам обнаружения, количественного определения, по линейности г = 0,998, что > 0,990), по прецизионности - 2,0 %, что не более 2,8 %, по правильности - процент восстановления 93,30 % (норма в пределах 90-107 %) Это позволяет использовать данную тест-систему в качестве референс-метода для оценки количественного содержания овальбумина антицитомегаловирусных антител в препаратах иммуноглобулина для внутривенного введения

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1 Исрафилов А Г , Давлетбаева Л Р , Туйгунов М М Корреляционная зависимость авидности и титра антицитомегаловирусных антител в препаратах внутривенных иммуноглобулинов // Иммунитет и болезни от теории к терапии тезисы международного конгресса - Москва, 2005 -С 45

2 Давлетбаева Л Р, Исрафилов А Г, Нигматуллин Р Р , Хабибуллина В В , Хафизова Р Н Валидация аналитических методов исследования // Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке разработка, производство и применение сборник трудов Всероссийской конференции - Уфа, 2005 - С 34-47

3 Давлетбаева Л Р , Положенцев С И, Исрафилов А Г , Туйгунов М М , Нигматуллин Р Р , Васильева И П, Загидуллин Н В , Бобкова Е В Сравнительный анализ международных требований к параметрам валидации аналитических методик // Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека материалы научной конференции - Челябинск, 2006 - С 12-19

4 Давлетбаева Л Р , Исрафилов А Г, Положенцев С И , Нигматуллин Р Р Валидация аналитических методов исследования Валидация

количественного иммуноферментного анализа // Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий . материалы Международной научной конференции - Томск, 2006. — С 362—365

5 Давлетбаева Л Р , Патракова А 3 , Исрафилов А Г, Туйгунов М М, Магазов РШ Метод параллельных линий в определении активности антител к цитомегаловирусу в препаратах внутривенных иммуноглобулинов// Там же —С 365-366 '

6 Давлетбаева Л Р , Воронин С С , Кувшинова Т.В , Нигматуллин Р Р , Исрафилов АГ, Туйгунов ММ Валидация параметров пригодности хроматографической системы на примере определения молекулярных параметров альбумина и внутривенного иммуноглобулина // Актуальные вопросы фундаментальной и клинической аллергологии и иммунологии материалы V конференции иммунологов Урала - Оренбург, 2006 - С. 156-157

7 Давлетбаева Л Р , Исрафилов А Г, Положенцев С И., Воронин С С, Нигматуллин Р Р Оценка критериев приемлемости хроматографической системы для определения молекулярных параметров внутривенного иммуноглобулина // Вакцинология 2006 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней материалы Всероссийской научно-практической конференции -Москва, 2006 - С 38.

8 Исрафилов А.Г, Давлетбаева Л.Р., Магазов Р Ш, Патракова А 3 , Туйгунов М М Определение активности антител к цитомегаловирусу в препаратах внутривенных иммуноглобулинов отечественного и зарубежного производства методом параллельных линий // Вестник РАМН -2007 -№ 1 - С 26-28

9 Давлетбаева Л Р, Тулькубаева Р Р, Шемчук 3 Р, Ибрагимова А И Оценка линейности регрессионной модели данных иммуноферментной тест-системы для определения овальбумина // Дни иммунологии в Сибири материалы межрегиональной научно-практической конференции - Омск, 2007 - С 330-332

Давлетбаева Ляйсан Раисовна

ВАЛИДАЦИЯ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МЕДИЦИНСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ответственный за выпуск М X Шарафутдинов

Подписано в печать 10 10 07 г Бум офсетная Формат 60x84 1/16 Гарнитура «Times New Roman Суг» Огп на ризографе Уел печ л 1,43 Уч-изд л 1,47 Тираж 100 экз Заказ № 1617

РИО ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, филиал «Иммунопрепарат» 450014, г Уфа, ул Новороссийская, 105, тел (347) 229-92-86

Актуальность проблемы

В соответствии с современными требованиями производства лекарственных средств, изложенными в российских документах (ГОСТ Р 52249-04, МУ 3.3.2.1886-04 и СП 3.3.2.1288-03, Приказ Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития от 29.01.2007 г. № 01И-61/07), использование валидированных аналитических методов является обязательным как при разработке новых лекарственных средств, так и при их рутинном контроле. Валидация аналитического метода - процесс демонстрации соответствия методики предполагаемому применению путем лабораторных исследований специфических характеристик. Валидация аналитического метода проводится при внедрении новой методики, изменении условий анализа лекарственных средств или пересмотре их в дальнейшем.

Среди аналитических методов контроля качества иммунобиологических препаратов одно из ведущих мест занимает иммуноферментный анализ (ИФА). В отношении качественного ИФА валидация считается рутинной процедурой, однако в отношении количественного анализа она остается недостаточно разработанной [Шалепо К.В., 2003].

Овальбумин (OA) является основным маркером присутствия остаточных количеств субстрата репродукции вирусов целого ряда вакцинных препаратов, предназначенных для профилактики гриппа, кори, краснухи, паротита, бешенства, желтой лихорадки [Chow W.C., 2005; Сох J.E., 2006], и считается примесью, ответственной за развитие аллергических реакций при применении вакцин и препаратов лейкоцитарного интерферона. В связи с этим валидация метода иммуноферментного определения OA в иммунобиологических препаратах является обязательным условием создания безопасных препаратов, а также удобной моделью разработки подходов к валидации количественных тест-систем. Необходимость повышения качества метода количественного контроля содержания OA обусловлена тем, что он содержится в препарате «Гриппол», который включен в национальный календарь прививок, а препараты интерферона являются жизненно-необходимыми и часто используемыми в клинической практике лекарственными средствами. Допустимое остаточное количество OA в отечественной гриппозной вакцине составляет не более 50 нг/дозу, однако этого количества достаточно, чтобы вызвать реакцию гиперчувствительности у лиц с аллергией к яичному белку [James J.M. et al., 1995]. Использование зарубежных тест-систем контроля содержания OA в настоящее время не рекомендовано в связи с тем, что они не зарегистрированы в РФ, а также из-за высокой стоимости.

Метод ИФА используется для определения антител класса IgG к цитомегаловирусу (IgG-AT к ЦМВ) в препаратах иммуноглобулинов. С этой целью применяются тест-системы ИФА, производимые отечественными и зарубежными фирмами для клинических лабораторий. Разработка новых иммуноглобулиновых препаратов с высоким содержанием IgG-AT к ЦМВ на базе филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ и необходимость оценки их специфической активности с помощью метода ИФА потребовала исследования основных параметров валидации этих тест-систем.

Цель исследования

Оценка качества и определение параметров валидации иммуноферментных тест-систем для количественного определения овальбумина и IgG-антител к цитомегаловирусу в иммунобиологических препаратах.

Задачи исследования

1 Определить валидационные характеристики иммуноферментной тест-системы для выявления овальбумина: специфичность, диапазон калибровочных концентраций, пределы обнаружения и определения, линейность.

2 Определить показатели точности иммуноферментной тест-системы для выявления овальбумина: правильность, повторяемость и внутрисерийная воспроизводимость.

3 Оценить параметры валидации иммуноферментной тест-системы для определения IgG-антител к цитомегаловирусу по показателям линейности, пределов определения, мер прецизионности.

4 Разработать практические рекомендации по валидации количественных иммуноферментных тест-систем для контроля качества медицинских иммунобиологических препаратов.

Научная новизна

Впервые на модели иммунобиологических препаратов (вакцина «Гриппол» и препараты человеческого лейкоцитарного интерферона) разработаны параметры валидации иммуноферментной тест-системы для количественного определения овальбумина.

Новыми являются данные по валидации иммуноферментного метода определения антител класса IgG к цитомегаловирусу при определении специфической активности препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения («Иммуновенин», «ЦМВ ИГ» - препарат иммуноглобулина человека против цитомегаловируса, «Цитотект», «Хумаглобин» и др.). Показано, что тест-система «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G» может быть использована не только для тестирования плазмы крови больных и доноров, но и для контроля качества специфической активности иммуноглобулиновых препаратов.

Определены пределы обнаружения и количественного определения аналита по ограничительным минимальным и максимальным критериям. Проведена оценка перекрестного реагирования антител на уровне предела количественного определения овальбумина.

Научно-практическая значимость работы

Положительные результаты валидационных испытаний являются доказательной основой применения метода иммуноферментного анализа для количественного определения OA в вакцине «Гриппол» и препаратах человеческого лейкоцитарного интерферона. Установлены критические параметры тест-системы для количественного определения OA -правильность и прецизионность, позволяющие при их регулярном контроле сохранять надежность метода.

Показана приемлемость использования тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G» для определения IgG-AT к ЦМВ в препаратах иммуноглобулинов для внутривенного введения. Данный метод может быть использован не только для отбора сырья с целью получения препарата, но и для количественной оценки специфической активности конечного препарата, а также для проведения сравнительного анализа различных препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения. Это позволяет рекомендовать метод иммуноферментного анализа содержания IgG-AT к ЦМВ с помощью тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G» в качестве референс-метода для количественного определения антител IgG-класса к цитомегаловирусу в препаратах иммуноглобулинов методом параллельных линий в соответствии с требованиями Европейской фармакопеи.

Валидация количественного метода иммуноферментного анализа является основой стандартизации и контроля активности ряда выпускаемых медицинских иммунобиологических препаратов. В теоретическом плане проведенные исследования расширяют знания в области валидации количественных иммуноферментных тест-систем. Расширены подходы к валидации и оценке наиболее важного валидационного параметра -специфичности иммуноферментной тест-системы для количественного определения овальбумина.

Внедрение результатов исследования в практику

На основании проведенных исследований разработаны и изданы методические указания «Валидация количественных иммуноферментных тест-систем для контроля качества медицинских иммунобиологических препаратов» (Уфа, 2007), которые внедрены в работу филиала «Иммунопрепарат» Федерального государственного унитарного предприятия «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Проведенные исследования позволили оптимизировать и стандартизовать иммуноферментную тест-систему для количественного определения овальбумина в иммунобиологических препаратах.

Основные положения, выносимые на защиту

1 Валидность метода иммуноферментного анализа для определения овальбумина в иммунобиологических препаратах позволяет использовать его в качестве референсного метода для оценки содержания овальбумина в вакцине «Гриппол» и препаратов человеческого лейкоцитарного интерферона.

2 Количественное определение иммуноглобулинов класса G к цитомегаловирусу с помощью рекомбинантной тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G» рекомендовано в качестве метода контроля специфической активности препаратов иммуноглобулинов из плазмы крови человека по содержанию IgG антител к цитомегаловирусу.

3 Провалидированные отечественные иммуноферментные тест-системы для количественного определения овальбумина и IgG-антител к цитомегаловирусу по чувствительности, линейности, специфичности соответствуют требованиям нормативных документов по валидации аналитических методов исследований.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на ряде научных форумов: Всероссийской научной конференции «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение» (Уфа, 2005); Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2006); научной конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической аллергологии и иммунологии» (Оренбург, 2006); научной конференции «Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека» (Челябинск, 2006); научно-практической конференции «Вакцинология - 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики и лечения инфекционных заболеваний» (Москва, 2006); межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Омск, 2007).

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ (протокол от 19.09.2007 г. № 4) и на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.124.01 при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан (протокол от 04.10.2007 г. № 64).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано девять научных работ, в том числе одна в ведущем рецензируемом журнале, рекомендованном Высшей аттестационной комиссией (ВАК) Министерства образования и науки Российской Федерации.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 111 страницах, содержит 25 таблиц и 12 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы (одна глава), собственных исследований (две главы), заключения и выводов. Список литературы включает 140 источников (54 отечественных и 86 зарубежных).

ВЫВОДЫ

1 Иммуноферментная тест-система для количественного определения овальбумина в иммунобиологических препаратах, разработанная в филиале «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, по результатам валидации имеет следующие характеристики: чувствительность по пределу обнаружения - не более 0,230 нг/мл, по пределу количественного определения - не более 0,740 нг/мл; специфичность по перекрестности - от 0,090 до 0,205 %, по индексу селективности - от 1 5,5 до 9,7 единиц; диапазон линейности калибровочного графика - от 0,654 до 12,000 нг/мл, с коэффициентом корреляции не менее 0,998.

2 Валидационные испытания иммуноферментной тест-системы для количественного определения овальбумина показали соответствие валидационных параметров изученной тест-системы количественным критериям, принятым в международной практике валидации. Показатели точности иммуноферментной тест-системы для количественного определения овальбумина составляют: повторяемость в области концентраций, близких к пределам определения - 8,9 %, промежуточная точность - 18,7 %; правильность - от 85,7 до 111,9 % восстановления, что требует внесения их в обязательный перечень параметров валидации для регулярного контроля серий тест-системы при повторных валидационных операциях.

3 Проведенная валидация иммуноферментной тест-системы для определения антител к цитомегаловирусу («Диагностические системы», г. Нижний Новгород) в препаратах иммуноглобулинов человека для внутривенного введения показала соответствие ее параметров принятым количественным критериям приемлемости: пределы обнаружения и количественного определения IgG-антител к цитомегаловирусу составляют 2,3 и 3,9 mPE/мл соответственно; коэффициент корреляции для линейности - 0,998; прецизионность - 2,0 %;. правильность -93,30 % восстановления.

4 Проведенная оценка качества и определение параметров валидации количественных иммуноферментных тест-систем показали их соответствие критериям, регламентированным действующими нормативными документами, что является основанием для их применения в контроле качества медицинских иммунобиологических препаратов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Валидация - это экспериментально обоснованное доказательство пригодности данной аналитической методики для получения результатов, имеющих достаточную точность и прецизионность. Она является важнейшей частью контроля качества лекарственных препаратов, включая иммунобиологические.

Иммуноферментный анализ является одним из высокочувствительных методов лабораторной диагностики, используемых для качественного и количественного определении различных веществ в медицинских иммунобиологических препаратах.

В связи с этим совершенствование качества тест-систем для ИФА определения содержания примесей в МИБП является необходимым условием обеспечения безопасности их применения.

Исходя из этого, нами была проведена оценка качества и определение параметров валидации иммуноферментных тест-систем для количественного определения овальбумина и IgG-антител к цитомегаловирусу в иммунобиологических препаратах.

Овальбумин является примесью в вакцинных препаратах, ответственной за развитие аллергических реакций при вакцинации. Применение для проведения контроля качества вакцинных препаратов надежных ИФА тест-систем для определения OA позволит предупредить развитие серьезных поствакцинальных осложнений.

Оценка качества ИФА-тест-систем для определения IgG антител к цитомегаловирусу в препаратах иммуноглобулинов для внутривенного введения необходима для производства препаратов с высокой биологической активностью.

Для реализации поставленной цели нами были исследованы характеристики «Иммуноферментной тест-системы для количественного определения овальбумина» (филиал «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО

Микроген» МЗ РФ) и тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G» (НПО «Диагностические системы», г. Н. Новгород).

На начальных этапах исследований по валидации количественной иммуноферментной тест-системы для количественного определения овальбумина в иммунобиологических, препаратах нами был проведен анализ специфичности и селективности исследуемой тест-системы. С этой целью проводили изучение перекрестности OA с близкими по структуре антигенами [Егоров A.M., 1991]. В качестве перекрестно-реагирующих, антигенов использовали бычий, человеческий и лошадиный альбумины. Проводили исследования оптической плотности (ОП) в трех лунках планшета для каждой концентрации белка (трипликаты). Для более точной характеристики специфичности нами был проведен анализ полученных результатов с использованием метода параллельных линий («Паралайн»), который позволяет оценить перекрестность исследуемых соединений по калибровочным графикам их растворов в исследуемых концентрациях.

По полученным данным, перекрестно-реагирующие соединения в исследуемых концентрациях в тест-системе для определения OA не проявляли ни линейности, ни параллельности в сравнении с СО OA, что; свидетельствовало о специфичности изучаемой тест-системы.

Далее нами были определены показатели специфичности тест-системы по оценке собственно перекрестности и селективности. По полученным для каждого перекрестно-реагирующего соединения и OA данным строили графики зависимости ОП от концентрации и рассчитывали процент перекрестности (CR). В связи с тем, что общепринятый метод изучения CR при 50-процентном связывании антигена и антител, предназначенный в основном для анализа основного или активного соединения, оказался неприменимым из-за низких значений ОП для перекрестно-реагирующих соединений, CR рассчитывали для уровня концентрации OA, близкой к пределу количественного определения.

Установленные нами показатели перекрестности для различных белков составили менее 1%, что характеризует высокую специфичность изученной тест-системы. Индекс селективности для различных альбуминов, по нашим данным, составил более 5,5 ед., что свидетельствует о высокой селективности данной тест-системы по отношению к овальбумину.

Для исследования правильности иммуноферментной тест-системы для определения OA нами были использованы модельные системы, приготовленные путем добавления известного количества OA к матриксу препарата на уровне трех концентраций в трех повторностях. Данные образцы анализировали иммуноферментным методом, с использованием тест-системы для определения OA, и рассчитывали процент восстановления как отношение полученной при анализе концентрации вещества к заданной. Полученные данные выявили показатели процента восстановления для различных концентраций (от 3,0 до 12,0 нг/мл) в пределах от 85,7 до 11,9. Полученные результаты соответствовали требованиям USP 25 для биоаналитических методов, регламентирующим предел допустимого отклика от 85 до 115 процентов.

Для определения интервала, в котором значения ОП в зависимости от концентрации OA будут соответствовать линейному диапазону, были выбраны уровни концентраций в пределах ± 20 % от значений показателей основного диапазона (0,1 - 100 нг/мл) для «Гриппола» и (0,1 - 50 нг/мл) препаратов человеческого лейкоцитарного интерферона. Линейная зависимость ОП от концентрации OA в анализируемой иммуноферментной тест-системе отмечалась от 0,0 до 12,0 нг/мл. При концентрации OA, равной 25 нг/мл и выше, на графике наблюдалось плато кривой, что свидетельствует о том, что данные концентрации не должны входить в область диапазона калибровочной кривой.

Для оценки возможности применения данной иммуноферментной тест-системы для анализа содержания OA в иммунобиологических препаратах, а также для изучения характеристик разрабатываемого кандидата в СО OA филиал «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ), нами был использован метод параллельных линий, анализ линейности и параллельности кривых зависимости ОП от концентрации препарата «Гриппол», содержащего OA, и анализируемого стандарта овальбумина.

Между построенными кривыми зависимости ОП от концентрации OA в препарате «Гриппол» и СО OA, полученными с помощью программы «Паралайн», наблюдалась линейность и параллельность. Эти данные свидетельствовали о том, что по составу матрикса СО OA и препарат «Гриппол» сходны, и данный кандидат СО OA в ОСО OA может использоваться при валидации иммуноферментной тест-системы, предназначенной для количественной оценки содержания OA в препарате «Гриппол».

Для изучения линейности калибровочного графика тест-системы были проанализированы образцы с концентрациями определяемого вещества, охватывающими установленный нами диапазон для калибровочного графика (0,5 - 12,0 нг/мл).

Линейная зависимость ОП от концентрации OA обнаруживалась с высокой степенью корреляции (г = 0,999, р < 0,001), в пределах установленного диапазона.

С целью определения критериев линейности зависимости ОП от концентрации OA в диапазоне калибровочного графика нами был проведен регрессионный анализ данных иммуноферментного анализа. Стандартная ошибка оценки, являющаяся мерой рассеяния наблюдаемых значений относительно регрессионной прямой, для тест-системы определения OA не превышала 0,045 ед. Эти данные свидетельствовали о том, что отклонения значений от линейности зависимости показателей ОП от концентрации OA являлись незначимыми, а использованная модель - достоверной.

Значения F-критерия для достоверности регрессии при числе степеней свободы, равном 1 и 4, были ниже, чем регламентированные значения для оценки значимости регрессии при р < 0,05. Эти данные отражали отсутствие различий между изученными дисперсиями и характеризовали линейность зависимости ОП от концентрации овальбумина. Полученные значения коэффициента регрессии (Ь, угол наклона) в ИФА превышали 0,700 ед., т.е. находились в пределах от 0,7 до 1,2 ед. [Vogelgesang J., 1998], что является показателем достаточной чувствительности тест-системы для определения овальбумина.

Для подтверждения линейности регрессии нами был использован также анализ остатков в линейной модели их зависимости от предсказанных значений. Остатки, отраженные в графической форме, оказались неравномерно разбросанными относительно прямой, что характеризует адекватность выбранной регрессионной модели зависимости ОП от концентрации овальбумина.

Для нахождения пределов определения OA нами было использовано несколько методов: 1) классический способ нахождения предела обнаружения по «шуму» или фону [Долгов В.В., 2004]; 2) определение пределов с учетом номинального содержания OA в препаратах: по пределу количественного определения, который должен быть в 5-10 раз ниже нормируемого уровня анализируемого вещества в иммунобиологических препаратах [Huber W., 2003]; 3) по углу наклона кривой зависимости ОП от концентрации OA и стандартному отклонению от линии регрессии (расчетный метод - ICH, 1996).

Минимальный предел обнаружения OA по «шумовому» методу составил 0,132 нг/мл, а предел количественного определения - 0,546 нг/мл; по углу наклона кривой зависимости ОП от концентрации OA предел обнаружения составил 0,210 нг/мл, а предел количественного определения -0,654 нг/мл; с учетом номинального содержания OA, предел его количественного определения составил 5 и 10 нг/мл. В связи с этим для более достоверного определения OA в иммунобиологических препаратах необходимо использовать иммуноферментные тест-системы с пределом обнаружения до 0,210 нг/мл и пределом количественного определения до 0,654 нг/мл.

Для оценки прецизионности тест-системы для количественного определения OA проводили определение ее показателей в два этапа: на первом этапе проводили оценку повторяемости (сходимости); на втором -внутрисерийной воспроизводимости (промежуточной точности). На каждом этапе исследований использовали три уровня концентрации СО OA (высокий, средний, низкий) в трипликатах. На основании полученных результатов определяли средние значения для каждой концентрации, показатели дисперсии (SD) и коэффициента вариации (CV %).

Результаты исследований повторяемости показали, что значения CV % для всех серий концентраций СО OA были ниже 10 %, что соответствует требованиям отечественных авторов к коэффициенту вариации для результатов повторяемости [Таранов А.Г., 2002].

В исследованиях внутрисерийной воспроизводимости значения CV % были ниже 20 %, что отвечает требованиям [FDA, CDER, 2001] к примесным соединениям в фармацевтических препаратах.

При валидации тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G», предназначенной для определения активного вещества, в отличие от тест-системы для определения примесного соединения, были применены более жесткие критерии оценки валидационных параметров. Исходя из данных удельной активности аффинно-очищенных антител - 0,52 РЕ/мг (патент РФ № 2157240), была определена ориентировочная концентрация антицитомегаловирусных антител в препаратах для расчетов правильности и точности.

При проведении валидации тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G» были применены те же подходы и методы проведения валидационных процедур, которые применялись к тест-системе для определения овальбумина. Исключением явился подход к исследованию предела количественного определения. Для изучения предела количественного определения был применен более объективный метод определения нижней валидируемой концентрации с точностью 10 %, с использованием вычисленных данных по сравнению с реальными данными [Eurachem, 1998].

По полученным результатам было установлено, что предел количественного определения можно заключить о том, что предел количественного определения для иммуноферментной тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G» составлял 3,9 mPE/мл IgG-AT к ЦМВ, что соответствует коэффициенту вариации 10 процентов.

Полученные данные измерения активности специфических IgG-антител против цитомегаловируса с помощью тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G» показали, что приемлемым критерием для процента восстановления следует считать выход, равный 90-110 процентам. Показатель повторяемости (CV %) для изучаемой тест-системы составил менее 2,8 %, пределы обнаружения - 2,3 mPE/мл, количественного определения - 3,9 шРЕ/мл.

Полученные результаты показали приемлемость использования тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G» для определения IgG-AT к ЦМВ в препаратах специфических иммуноглобулинов для внутривенного введения.

Учитывая, что тест-система «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G» предназначена для определения концентрации специфических IgG-антител в сыворотке крови человека (доноров), полученные нами результаты позволяют расширить применение данной тест-системы и для исследования активности препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения по концентрации специфических IgG-антител против цитомегаловируса.

Таким образом, нами была проведена оценка качества и определение параметров валидации иммуноферментных тест-систем для количественного определения овальбумина и IgG-антител к цитомегаловирусу в иммунобиологических препаратах. Нами установлены основные валидационные характеристики и критерии параметров для изучаемых иммуноферментных тест-систем.

Полученные результаты показали соответствие качества и параметров валидации изученных тест-систем критериям, регламентированным нормативными документами по валидации аналитических методов, что позволяет применять их в контроле качества вакцины «Гриппол», человеческого лейкоцитарного интерферона и иммуноглобулинов для внутривенного введения.

94