Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Система интерферонов i типа и nk-клеток при часто рецидивирующем простом герпесе

На правах рукописи

Карсонова Антонина Васильевна

СИСТЕМА ИНТЕРФЕРОНОВ I ТИПА И1ЧК-КЛЕТОК ПРИ ЧАСТО РЕЦИДИВИРУЮЩЕМ ПРОСТОМ ГЕРПЕСЕ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 3 ИЮЛ 2014

005550310

Москва 2014

005550310

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России

Научные руководители:

член-корреспондент РАН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских

наук, профессор Караулов Александр Викторович;

кандидат медицинских наук Пащенков Михаил Владимирович.

Официальные оппоненты:

Козлов Иван Генрихович — доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии педиатрического факультета ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России, вице-президент Российского научного общества иммунологов; Киселевский Михаил Валентинович — доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией клеточного иммунитета ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» РАН.

Ведущая организация:

ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова» РАН.

Защита состоится «16» сентября 2014 г. в 14-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.040.08 в ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России по адресу: 119992, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова по адресу: 117998, Москва, Нахимовский пр., д. 49 и на сайте Первого МГМУ им. И.М. Сеченова www.rnma.ru

Автореферат разослан

2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинский наук,

профессор Калюжин Олег Витальевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Простой герпес (ПГ) вызывается вирусами простого герпеса 1-го и 2-го типов (ВПГ-1 и ВПГ-2) и является значимой медико-социальной проблемой. Согласно клиническим рекомендациям стандартом фармакотерапии пациентов с рецидивирующими формами ПГ является эпизодическая или супрессивная терапия ациклическими нуклеозидами. Однако монотерапия противовирусными препаратами зачастую не позволяет добиться контроля над инфекцией. Высокая частота рецидивов и вторичный иммунодефицит, развивающийся вследствие длительной персистенции вируса, определяют необходимость патогенетического лечения, направленного на коррекцию дефектов иммунного ответа при часто рецидивирующих формах простого герпеса (ЧРПГ). На сегодняшний день в арсенале врача имеется широкий спектр препаратов иммуномодулирующей направленности, список которых постоянно пополняется. В последнее время в терапии ЧРПГ широко применяются препараты рекомбинантного интерферона-альфа (ИФН-а) и индукторы ИФН-а как с лечебной, так и с профилактической целью. Огромное количество публикаций посвящено применению препаратов данной группы в комплексной терапии ЧРПГ [Ophir J. et al. 1995, Тутушкина T.B. 2005, Хаитов P.M. 2005, Ершов Ф.И. 2008, Караулов А.В. 2008, Долгих Т.Н. 2010, Исаков В.А. 2013, Баринский И.Ф. 2013, Шульженко А.Е. 2013]. Однако именно назначение иммуномодулирующей терапии является наиболее сложным вопросом в терапии ЧРПГ. Этому способствует несовершенство современных подходов к методологии назначения иммунокорригирующей терапии, которая сегодня очень часто назначается эмпирически. Эмпирическое назначение провоцируется отсутствием иммунодиагностического комплекса, позволяющего оценивать вариабельность чувствительности пациента к этим препаратам в динамике клинического процесса, предусматривать индивидуальный подход к назначению иммуномодуляторов, оценивать индивидуальный характер выраженности вторичного иммунодефицита и его динамику на фоне назначенной иммунокорригирующей терапии.

Ключевыми факторами естественной противовирусной резистентности являются интерфероны I типа (ИФН I типа), которые обладают как прямым противовирусным, так и иммуномодулирующим действием. ВПГ-1 и ВПГ-2 являются мощными индукторами выработки ИФН I типа, в частности ИФН-а, мононуклеарными клетками (МНК) крови здоровых людей [Rong et al. 2003]. Основными продуцентами ИФН I типа среди МНК являются плазмацитоидные предендритные клетки, которые распознают ВПГ с помощью рецептора TLR9 [Lund et al. 2003, Rasmussen et al. 2007]. При ЧРПГ имеется дефицит выработки ИФН I

типа МНК крови [Kuo et al. 1990, Pica et al. 2010, Tsutsumi et al. 2009]. Более того, врожденный дефект генов, отвечающих за индукцию выработки ИФН I типа (UNC93B, TLR3) проявляется именно тяжелыми инфекциями, вызванными ВПГ [Casrouge et al. 2006, Zhang et al. 2007].

Однако иммунологическая недостаточность у пациентов с ЧРПГ может быть вызвана не только недостаточностью интерфероногенеза, но и снижением ответа иммунокомпетентных клеток на эти цитокины. Так, известно, что некоторые белки ВПГ могут ингибировать ответ ряда клеточных линий на ИФН-а [Mossman et al. 2000, Chee et al. 2004, Melchjorsen et al. 2006, Jonson et al. 2010]. В клетках, инфицированных ВПГ-1, ингибируется передача активационного сигнала от рецептора к ИФН-а/(3 в ядро, что приводит к подавлению ответа клеток на ИФН-а [Chee et al. 2004]. Эффект связан, в частности, с нарушением активации Jak/STAT-сигнального пути.

Одними из основных эффекторных клеток, противодействующих репликации ВПГ, являются NK-клетки. В экспериментах на лабораторных животных показано, что ранние стадии герпесвирусной инфекции могут контролироваться исключительно интерферонами, тогда как NK-клетки в сочетании с Т- и В-клетками необходимы для противодействия вирусу на более поздних стадиях инфекции [Vollstedt et al. 2004]. По данным ряда исследований, при ЧРПГ имеет место снижение цитотоксической активности и дегрануляции NK-клеток [Мезенцева М.В. и соавт. 2002, Муругин В.В. и соавт. 2010]. NK-клетки способны к цитолизу вирус-инфицированных клеток без предшествующей активации. Однако ИФН I типа, продуцируемые в ответ на инфекцию, резко повышают цитотоксичность NK-клеток, являясь мощными активаторами NK-клеток [Хаитов P.M. и соавт. 2010].

Учитывая снижение функциональной активности NK-клеток у пациентов с ЧРПГ, способность ВПГ ингибировать эффекты ИФН I типа in vitro, неэффективность интерферонотерапии у некоторых больных ЧРПГ, часто наблюдаемую во врачебной практике клинико-лабораторную диссоциацию, когда тяжёлое течение ПГ и высокая частота рецидивов сопровождаются высокими уровнями ИФН-а в интерфероновом статусе, мы предположили, что при ЧРПГ возможно угнетение ответа клеток иммунной системы, в частности NK-клеток, на ИФН I типа. Для оценки функциональной активности NK-клеток помимо стандартного метода - оценки NK-активности, использовали реакцию дегрануляции, функциональная значимость которой доказана предыдущими исследованиями [Alter et al. 2004, Муругин В.В. и соавт. 2010]. Способность ВПГ ингибировать эффекты ИФН I типа показана на модельных клеточных линиях (Vero, HeLa) in vitro, тогда как возможность сходных процессов у пациентов с ЧРПГ не исследована. На сегодняшний день становится очевидным, что при выборе вектора иммунокоррекции необходим персонализированный подход с учётом

вариабельности «чувствительности» целевого показателя иммунной системы пациента к потенциальному лечебному воздействию в динамике клинического процесса.

Цель работы: изучить влияние рекомбинантного ИФН-а на функциональную активность МК-клеток и экспрессию интерферон-индуцибельных генов с противовирусной функцией в сопоставлении с способностью к синтезу эндогенного ИФН-а при часто рецидивирующих формах ПГ. Задачи исследования:

1) Изучить влияние рекомбинантного ИФН-а на дегрануляцию МК-клеток у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и у здоровых доноров

2) Изучить влияние рекомбинантного ИФН-а на цитотоксическую активность ЫК-клеток у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и у здоровых доноров

3) Изучить экспрессию генов основных противовирусных белков ОА81 и Мх1, индуцибельных интерферонами I типа, у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и у здоровых доноров

4) Изучить особенности синтеза эндогенного ИФН-а у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ с различными вариантами изменения функциональной активности МК-клеток

5) Выявить возможные варианты иммунологических нарушений в системе интерферонов I типа и МК-клеток у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ

Научная новизна

Впервые изучено влияние предварительной суточной стимуляции рекомбинантным ИФН-а на дегрануляцию МК-клеток и на цитотоксическую активность МК-клеток как у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ, так и у здоровых доноров.

Впервые использован комплексный подход к оценке системы интерферонов I типа и МК-клеток, заключающийся в одновременной оценке как восприимчивости к рекомбинантному ИФН-а мононуклеарных клеток в целом (на основании изменения экспрессии интерферон-индуцибельных генов) и ЫК-клеток в частности (по изменению функциональной активности), так и способности к вирус-индуцированному синтезу собственного ИФН-а у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и у здоровых доноров.

Впервые предпринята попытка установления факта ингибирования ИФН-сигналинга вирусом простого герпеса посредством оценки изменения экспрессии интерферон-индуцибельных генов не на модельных клеточных линиях, а на мононуклеарных клетках, полученных от реальных пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и от здоровых доноров.

Впервые идентифицировано два возможных варианта иммунологических нарушений в системе «ИФН I типа / ЫК-клетка». Теоретическая и практическая значимость работы

Разработан комплексный подход к оценке иммунологических нарушений в системе «ИФН I типа / ЫК-клетка». С использованием данного иммунодиагностического комплекса идентифицировано два варианта иммунологических нарушений в системе «ИФН I типа / ЫК-клетка», что позволит применять индивидуальный, иммунодиагностически обоснованный подход к назначению иммунокорригирующей терапии, в особенности препаратами рекомбинантного ИФН-а или индукторами ИФН. Установлено дозозависимое увеличение функциональной активности ЫК-клеток под влиянием рекомбинантного ИФН-а, что подтверждает целесообразность применения иммуномодуляторов группы препаратов рекомбинантного ИФН-а или индукторов ИФН при часто рецидивирующих формах ПГ. Основные положения, выносимые на защиту:

1) Пациенты с часто рецидивирующими формами ПГ представляют собой гетерогенную группу по особенностям изменения функциональной активности ЫК-клеток в ответ на рекомбинантный ИФН-а и по способности их мононуклеарных клеток синтезировать ИФН-а в ответ на вирусные индукторы.

2) У больных с часто рецидивирующими формами ПГ экспрессия генов ИФН-индуцибельных противовирусных белков ОА81 и Мх1 не нарушена.

3) При часто рецидивирующих формах ПГ выявлены два преобладающих типа функционального состояния системы «ИФН I типа / N К-клетка», что требует дифференцированного подхода к иммуномодулирующей терапии: при рецидиве ПГ у одних пациентов ответ ЫК-клеток на рекомбинантный ИФН-а и синтез этого цитокина мононуклеарными клетками снижены, у других -функциональная активность ЫК-клеток при рецидиве полностью восстанавливается, а синтез ИФН-а не нарушен.

Практическое внедрение полученных результатов

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при подготовке курсантов-слушателей на кафедре клинической иммунологии и аллергологии факультета послевузовского профессионального образования врачей ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России и используются в иммунодиагностической практике в лаборатории клинической иммунологии Федерального Государственного Бюджетного учреждения «Государственный Научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства. Апробация работы

Апробация диссертационной работы состоялась 18 июля 2013 года на научно-практической конференции кафедры клинической иммунологии и аллергологии

факультета послевузовского профессионального образования врачей ГЪОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XII Международном конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» 11-13 марта 2013 года, Москва; на Объединенном иммунологическом Форуме 5-9 июля 2013 года в Нижнем Новгороде; на Конгрессе Европейской академии клинической иммунологии и аллергологии и всемирной организации аллергии (EAACI-WAO) 20-26 июня 2013года в Милане, Италия. Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 оригинальные статьи в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК. Соответствие паспорту научной специальности

В работе выявлены особенности иммунологических нарушений в системе «ИФН I типа / NK-клетка» у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ, требующих дифференцированного подхода к назначению иммуномодулирующей терапии, что соответствует областям исследования «Изучение строения, функционирования иммунной системы и механизмов иммунной защиты», «Изучение патогенеза иммунодефицитных состояний», «Разработка и усовершенствование методов диагностики, лечения и профилактики иммунопатологических процессов», указанным в паспорте специальности научных работников 14.03.09 — клиническая иммунология, аллергология (по номенклатуре специальностей 2012 года). Структура и объём диссертации

Диссертационная работа изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Содержание работы иллюстрировано 14 рисунками и 13 таблицами. Список литературы включает 71 отечественную и 226 зарубежных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Пациенты и доноры. В исследовании приняли участие 50 пациентов с верифицированным диагнозом «Herpes simplex», обратившихся на кафедру клинической иммунологии и аллергологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова, находящихся на амбулаторном и стационарном лечении в отделении иммунотерапии и аллергологии ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» (зав. отделением проф., д.м.н. Шульженко А.Е.) и проходящих иммунодиагностическое обследование в лаборатории клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии » (зав. лабораторией проф., д.м.н. Пинегнн Б.В) в период с марта 2011 по февраль 2012 года. Критериями включения в группу были: 1) наличие 6 и более обострений ПГ в год (часто рецидивирующий ПГ); 2) отсутствие других

инфекционных заболеваний или активных воспалительных процессов на момент исследования. В группу вошли 9 мужчин (18%) и 41 женщина (82%) в возрасте от 19 до 80 лет. Медиана (10-й - 90-й процентили) возраста в группе пациентов составили 44 (29 - 63) года. Анамнез заболевания у большинства пациентов (п=33 / 81,6%) составил более 10 лет, у 8 пациентов (16,3%) - от 5 до 10 лет, 8 человек (16,3%) страдали ЧРПГ от 2 до 4 лет. 32 пациента имели генитальный герпес, а именно: у 26 пациентов наблюдалась истинно генитальная локализация, в 6 случаях имела место глютеальная локализация. 10 пациентов имели орофациальную локализацию процесса, а именно: в 1 случае назолабиальная локализация, в 1 случае стоматит и в 8 случаях лабиальная локализация. 7 пациентов имели сочетанную локализацию, а именно сочетание генитального и орофациального герпеса. При обострении все пациенты получали противовирусную терапию (ацикловир-акри, валтрекс). Контрольную группу составили 32 здоровых донора в возрасте от 22 до 75 лет. Медиана (10-й - 90-й процентили) возраста в группе доноров составили 35 (22 -59,4) года. Критериями включения в группу контроля были: 1) отсутствие явлений ПГ в течение как минимум последнего года; 2) отсутствие острых инфекций в течение как минимум 1 месяца до момента взятия крови 3) отсутствие хронических воспалительных и аутоиммунных заболеваний.

Забор крови и выделение мононуклеарных клеток (МНК). Забор крови (15 мл) осуществляли из периферической вены в стерильные пробирки фирмы Sarstedt (Германия), содержащие литий-гепарин. МНК выделяли на градиенте плотности фиколл-верографина. Жизнеспособность МНК после окраски трипановым синим составляла не менее 98%.

Культивнрованне клеток К562. Клетки К562 вели в ПКС, пассировали каждые 2—3 суток. Для опыта использовали клетки на вторые сутки после пересева. Стимуляция МНК рекомбинантным интерфероном-альфа2Ь (ИФН-а2Ь). Выделенные МНК культивировали в полипропиленовых пробирках (2х106/мл/пробирку, объём 1,5 мл) в присутствии рекомбинантного человеческого ИФН-а2Ь (Invitrogen, Великобритания) в концентрации 10, 100 и 1000 Ед/мл в течение 24 ч в СОг-инкубаторе (5% СОг, 37°С). Контрольную аликвоту клеток культивировали без ИФН-а. Через 24 ч МНК отмывали и ресуспендировали в ПКС для исследования дегрануляции NK-клеток и NK-активности. Для индукции генов OAS1 и Мх1 МНК культивировали в пробирках 1,5 мл типа эппендорф (0,5x106/мл/пробирку, объём 0,5 мл) в присутствии рекомбинантного человеческого ИФН-а2Ь (Invitrogen, Великобритания) в концентрации 1, 10 и 100 Ед/мл в течение 3 ч в СОг-инкубаторе (5% СОг, 37°С). Контрольную аликвоту клеток культивировали без ИФН-а. По истечении времени инкубации осадок ресуспендировали и лизировали добавлением 500 мкл TRI Reagent. Лизированные МНК хранили при -70грС.

Исследование дегрануляции NK-клеток. Дегрануляцию NK-клеток оценивали методом проточной цитометрии по экстернализации лизосомального маркера CD 107а. Использовали методику Alter et al. (2004) в модификации Муругина В.В. (2011). В 96-луночные круглодонные планшеты вносили: FITC-меченные антитела к CD 107а (клон Н4АЗ, BD Pharmingen, США; конечное разведение 1/200) и МНК (5x105 клеток на лунку). В качестве индукторов дегрануляции NK-клеток использовали рецептор-зависимый стимул — клетки К562 (5х105 клеток на лунку, соотношение эффектор:мишень = 1:1). В лунку отрицательного контроля вместо индукторов дегрануляции добавляли равный объем ИКС. Для контроля окраски на CD107a в еще одну контрольную лунку не добавляли антитела к CD107a. Планшет инкубировали 4 ч в СОг-инкубаторе (5% СО2, 37°С). Затем клетки окрашивали FITC-меченными антителами к CD3 и РС7-меченными антителами к CD56 (Beckman Coulter, США) для идентификации NK-клеток. Образцы анализировали на проточном цитометре Cytomics FC500 с программным обеспечением СХР (все Beckman Coulter). NK-клетки идентифицировали как CD3XD56* лимфоциты. Рассчитывали процент CD107a+ NK-клеток по отношению ко всем NK-клеткам и ко всем МНК. Показатель «дегрануляция NK-клеток» рассчитывали по формуле: Дегрануляция NK-клеток = [% CD107a+ NK-клеток в присутствии k562] - [% CD107a+ NK-клеток в отсутствии индукторов дегрануляции] Исследование NK-активности. NK-активность МНК исследовали методом проточной цитометрии по киллингу клеток-мишеней К562, меченных CFSE (5-,6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинимидиловый эфир, Molecular Probes, США). Для мечения клетки К562 (107/мл в ФСБ) инкубировали с CFSE (0,6 мкМ) в течение 10 мин в темноте при 37°С. МНК добавляли к клеткам-мишеням в соотношении эффектор - мишень 50:1. Для контроля спонтанной гибели клеток-мишеней использовали лунки, куда вместо МНК добавляли ПКС. Клетки инкубировали 4 ч в СОг-инкубаторе (5% СОг, 37°С), после чего окрашивали пропидий-йодидом (PI, Sigma, конечная концентрация 1 мкг/мл, 10 мин при КТ в темноте). Пробы анализировали на проточном цитометре Cytomics FC500; определяли процент погибших мишеней (PI++CFSE+ событий) по отношению ко всем CFSE+ событиям. Процент киллинга рассчитывали по формуле:

% погибших мишеней в опыте — % спонтанной гибели

% киллинга = - х 100%

100% — % спонтанной гибели Оценка уровней ИФН-а в супернатантах стимулированных вирусом клеток методом иммуноферментного анализа (интерфероновый статус). В плоскодонные планшеты вносили МНК из расчёта 105 на лунку на 200 мкл ПКС. В качестве индукторов ИФН добавляли ВПГ-1 (107вирионов/мл), ВПГ-2 (105вирионов/мл) и вирус болезни Ньюкасла (ВБН) по 10 мкл, 10 мкл и 8 мкл соответственно. Планшет инкубировали в течении 24 часов в СОг-инкубаторе (5%

С02, 37°С). Контрольную аликвоту клеток культивировали без индукторов. По истечении времени инкубации уровень ИФН-а в супернатантах стимулированных клеток оценивали, используя иммуноферментную тест-систему для количественного определения ИФН-а человека ООО "Цитокин" (г. Санкт-Петербург, РФ). Выделение РНК. РНК выделяли с помощью триреагента (TRIReagent) на градиенте плотности хлороформа, отмывали в изопропаноле, затем в 75% этаноле. Осадок растворяли в 20 мкл RNase-free воды (MilliQ). Из каждого образца РНК отбирали по 2 мкл в для гель-электрофореза и спектрофотометрии соответственно. Остаток РНК немедленно замораживали при -70 С.

Спектрофотометрии. Измеряли абсорбцию образцов на длинах волн 260 и 280 нм (А260 и А280), используя соответствующую программу на спектрофотометре. Нормальным считали соотношение А260/А280 1.7-2.0. Значения ниже 1.7 указывали на контаминацию белком (а следовательно и РНКазой), значения выше 2.0 - на деградацию РНК. Исходя из того, что образец РНК с концентрацией 40 мкг/мл дает А2бо = 1, концентрацию РНК (в мкг/мл) рассчитывали по формуле:

Сисх. образца = А260 * 4 [мкг/мкл] Гель-электрофорез. Электрофорез проводили при напряжении 80-100 В 20 мин. Электрофоретическую картину оценивали на УФ-трансиллюминаторе. РНК хорошего качества содержала 2 полосы, соответствующие 18S и 28S рРНК. Реже выявлялась полоса 5S рРНК. Интенсивность полос — 5S < 18S < 28S, скорость миграции — 5S > 18S > 28S.

Обратная транскрипция ОТ проводили, используя набор «RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit #kl621» («Fermentas Life Sciences») согласно инструкции производителя.

ПЦР в реальном времени Использовали прибор для проведения ПЦР с детекцией результатов амплификации в режиме реального времени «7300 Real Time PCR System» («Applied Biosystems», США). Во всех лунках устанавливали детектор TaqMan MGB. ПЦР ставили в объёме 20 мкл по следующей программе: 1 цикл -50°С 2', 95°С 10', 45 циклов - 95°С 15', 60°С Г. Условия реакции: реакционный объём 20 мкл, температура крышки 104 гр.С. В качестве контрольного гена «домашнего хозяйства» использовали ген актина В. Относительную концентрацию субстрата (R) рассчитывали по формуле:

ß __ 2 ((CtAcîB стимулированный — CtActB контрольный)-(С1генХ стимулированный — CteenXконтрольный))

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ SPSS 11.5 для Windows и Microsoft Excel 2003. Данные представляли как медиана (10-й — 90-й процентиль), кроме пунктов оговоренных отдельно. Две группы сравнивали при помощи непараметрического U-теста Манна—Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для выявления возможных иммунологических нарушений в системе NK-клетка / ИФН I типа мы использовали комплексный подход, в котором оценивали одновременно как влияние рекомбинантного ИФН-а на функциональную активность NK-клеток и экспрессию ИФН-индуцибельных генов с противовирусной функцией, так и способность МНК к синтезу собственного ИФН-а в ответ на вирусные индукторы.

Оценка влияния ИФН-а на дегрануляцию NK-клеток у здоровых доноров.

Значимость реакции дегрануляции в оценке функциональной активности NK-клеток показана в исследованиях Alter et al. 2004, Муругина и соавт. 2010. Под дегрануляцией NK-клеток понимается процент NK-клеток, дегранулирующих в присутствии МНС-негативных клеток-мишеней k562 (%CD107a+CD3"CD56+ клеток). Данных об уровне дегрануляции NK-клеток у здоровых лиц в литературе крайне мало. В исследовании Муругина и соавт. 2010 выявлено снижение NK-дегрануляции у пожилых людей, однако в дизайне исследования проводилось сравнение показателей в возрастной группе старше 65 лет по сравнению с группой младше 40 лет и выявлено статистически значимое снижение в первой группе по сравнению со второй. Возрастная группа от 40 до 65 лет исследована не была. Следует отметить, что возрастная группа от 40 до 65 лет преобладает среди пациентов с ЧРГТГ, включённых в наше исследование. В связи с этим для корректной оценки влияния ИФН-а на дегрануляцию NK-клеток, на первом этапе нами изучена исходная (неактивированная) дегрануляция NK-клеток у здоровых лиц в разных возрастных подгруппах, включая ранее не изученную - от 40 до 65 лет. Данные нашего исследования подтверждают факт снижения дегрануляции NK-клеток с возрастом и существенно дополняют знания о дегрануляции NK-клеток здоровых лиц, а именно: тенденция к снижению анализируемого показателя у здоровых людей отмечается уже после 30-35 лет (рис. 1).

Рисунок 1. Исходная (неактивированная) к562-индуцированная дегрануляция клеток (% СБ Ю7а СиЗ С056+ клеток) у здоровых доноров

Примечание: вертикальной и горизонтальной пунктирными линиями отмечены медианы возраста и дегрануляции 1^К-клеток соответственно в группе доноров

15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80

возраст, лет

Тогда мы разделили группу здоровых лиц на две возрастные подгруппы по медиане возраста. Медиана возраста в группе здоровых доноров, включённых в исследование, составила 35лет. Показатели дегрануляции ЫК-клеток во второй возрастной подгруппе (>35лет) достоверно более чем в 3 раза снижены, по сравнению с аналогичными показателями в первой возрастной (<35 лет) подгруппе (рис.2).

40

I $35

I Ж 30 25 20 15 10 5 0

йй О

z V

< 35лет >35 лет все

Рисунок 2. Зависимость исходной (неактивированной) к562-индуцированной дегрануляции NK-клеток (% CD 107a+CD3"CD56+ клеток) от возраста у здоровых доноров

Примечание:**р<0,001 по сравнению с возрастной подгруппой «<35лет» в тесте Манна-Уитни; представлены диаграммы boxplot вида [min-25p-Me-75р-тах];

На втором этапе мы оценили влияние ИФН-а на к562-индуцированную дегрануляцию NK-клеток у здоровых доноров. Суточная стимуляция in vitro рекомбинантным ИФН-а в трёх различных концентрациях (10, 100 и 1000 Ед/мл) приводила к дозозависимому увеличению процента дегранулирующих NK-клеток, однако каждый из ИФН-стимулированных показателей, также как и исходный, имел тенденцию к снижению после 30-35 лет (рис.3)

-ИФН,0 Ед/мл (1)

--ИФН, 10 Ед/мл (2)

---ИФН, 100 Ед/мл (3)

-ИФН, 1000 Ед/мл (4)

45 50 55 возраст, лет

Рисунок 3. Влияние ИФН-а на к562-индуцированную дегрануляцию NK-клеток (% CD107a+CD3~CD56+) у здоровых доноров

Примечание: пунктирной линией показана медиана исходного уровня к562-индуцированной дегрануляции NK-клеток, линией пунктир с точкой - медиана уровня к562-индуцированной дегрануляции NK-клеток под влиянием максимальной из используемых концентраций ИФН (1000 Ед/мл)

При сравнении ИФН-стимулированных показателей к-562-индуцированной дегрануляции ЫК-клеток в подгруппах «после 35 лет» и «до 35 лет» оказалось, что здоровые доноры после 35 лет имеют достоверно более низкие ИФН-стимулированные показатели, чем здоровые доноры до 35 лет при той же концентрации ИФН-а. Однако итоговый «эффект» суточной стимуляции ИФН-а, т.е. разница между МК-дегрануляцией под влиянием максимальной концентрации ИФН-а 1000 Ед/мл и исходной ЫК-дегрануляцией (для краткости обозначим этот показатель как «Д[1000-0]») в обеих группах не имел статистически значимых отличий и составил около 20 % (таблица 1). Таким образом, достоверно более низкие ИФН-стимулированные показатели в подгруппе старше 35 лет по сравнению с подгруппой младше 35 лет обусловлены низкими исходными нестимулированными показателями. В нашем исследовании при оценке влияния ИФН-а на N К-дегрануляцию наблюдается «лимит» действия цитокина в виде 20% увеличения ИФН-стимулированного параметра в независимости от исходного нестимулированного. Другими словами, ответ на цитокин в абсолютных цифрах с возрастом не меняется, с возрастом падает исходный показатель, а следовательно и ИФН-стимулированный показатель в итоге оказывается «низким».

Таблица 1. Особенности влияния ИФН-а на к-562-индуцированную дегрануляцию 1ЧК-клсток (% СР 107;ГСТ)3"СТ)5б' клеток) у здоровых лиц двух возрастных подгрупп

NK-дегрануляция Возраст

<35 лет (п=17) >35 лет(п=15) Все (п=32)

Исходная (без ИФН) 25,7 (9,8-33,3) 8,0** (3,4-17,2) 13,5(4,3-29,7)

+ ИФН-а, 0 Ед/мл 34,9(16,1-50,5) 17,5** (6,8-33,0) 26 (7,9-46,8)

+ ИФН-а, 100 Ед/мл 41 (22,4-54,9) 22,2** (11,8-37,7) 31,2 (12,5-50,4)

+ ИФН-а, 1000 Ед/мл 44,8(24,6-60,1) 27** (14,1-40) 32,9(15,1-56,8)

А [1000-0],% 20,2(12,9-31) 18,9(10,1-22,9) 19 (10,5-28,7)

Примечание: ** р<0,001 по сравнению с аналогичным показателем другой возрастной группы в тесте Манна-Уитни;

Оценка влияния ИФН-а на дегрануляцию NK-клеток у пациентов с ЧРПГ.

Учитывая выявленную у здоровых доноров зависимость исходного процента дегранулирующих NK-клеток от возраста и зависимость ИФН-стимулированных показателей от исходных нестимулированных показателей, для корректной оценки влияния суточной стимуляции рекомбинантным ИФН-а in vitro на дегрануляцию NK-клеток у пациентов мы разделили группу наблюдения на две возрастные подгруппы по медиане возраста в группе пациентов с ЧРПГ(44 года): «44 года и моложе» и «45 лет и старше».

Самые высокие показатели исходной (нестимулированной) дегрануляции NK-клеток наблюдались в подгруппе здоровых доноров «44 года и моложе». Медиана данного показателя составила 22,2 %. В остальных анализируемых подгруппах

показатель дегрануляции МК-клеток был достоверно вдвое снижен по сравнению с «молодыми» донорами. Так, медиана в подгруппе пациентов с ЧРПГ «44 года и моложе» составила 11,1% и 11,4% в обострении и в ремиссию соответственно, в подгруппе пациентов с ЧРПГ «45 лет и старше» 11,3% и 11,6% в обострении и в ремиссию соответственно, в подгруппе здоровых доноров «45 лет и старше» 11,2% (рис.4).

г? 35-,

ю

о 25

о 20т

15 -10 -5 -0 -

О

о

11,1

■

11,4

11,3

О

о

ЧРПГ <44, обострение

ЧРПГ £44, ремиссия

ЧРПГ £45, обострение

ЧРПГ >45, Доноры >45 Доноры <44 ремиссия

Рисунок 4. Исходная (неактивированная) к5б2-индуцированная дегрануляция NK-клеток (%CD107a+CD3"CD56+) у пациентов с ЧРПГ двух возрастных подгрупп

Примечание: *р<0,05 по сравнению с подгруппой доноров < 44 лет; столбики гистограммы отражают медианы соответствующих подгрупп, планки погрешностей -10-й и 90-й процентили.

Показатели исходной (нестимулированной) дегрануляции NK-клеток у пациентов с ЧРПГ были достоверно сниженным по сравнению со здоровыми донорами только в возрастной подгруппе «44 года и моложе», причем дефицит исходного процента дегранулирующих NK-клеток наблюдался как в фазу обострения, так и в фазу ремиссии. Во второй возрастной подгруппе (45 и старше) статистически значимых различий по данному показателю между пациентами с ЧРПГ и здоровыми донорами не наблюдалось. В единственной в РФ работе по изучению дегрануляции NK-клеток у пациентов с ЧРПГ [Муругин и соавт. 2010] был сделан вывод о дефиците дегрануляции NK-клеток у пациентов с ЧРПГ. Однако в упомянутой работе возраст пациентов и доноров, включённых в исследование, был существенно моложе (медиана возраста 27 и 32,5 соответственно), чем в настоящем исследовании (35 и 44 соответственно). Полученные данные позволяют существенно расширить знания о дегрануляции NK-клеток у пациентов с ЧРПГ, а именно: пациенты «44 года и моложе» имеют примерно вдвое сниженные показатели NK-дегрануляции, чем их ровесники без данной патологии, тогда как после 45 лет процент NK-дегрануляции у пациентов и у доноров сравниваются за счёт снижения данного показателя у последних.

Суточная стимуляция рекомбинантным ИФН-а in vitro в трёх используемых концентрациях (10, 100 и ЮООЕд/мл) приводила к дозозависимому увеличению процента NK-клеток, дегранулирующих в присутствии клеток-мишеней к562 (% CD107a+CD3"CD56+ клеток). Как и в случае со здоровыми донорами, у пациентов с

ЧРПГ показатель увеличивался в целом по группе также на 20% (в подгруппе «молодых» доноров дегрануляция увеличилась с 22,2% до 43%, в подгруппе «пожилых» доноров с 11,2 до 31,4%, в подгруппе «молодых» пациентов с 11,1% и 11,4% до 33,3% и 28,4% в фазы обострения и ремиссии соответственно, в подгруппе «пожилых» пациентов с 11,3% и 11,6% до 28,9% и 29,4% в фазы обострения и ремиссии соответственно. При оценке влияния суточной стимуляции ИФН-а на дегрануляцию МК-к леток у пациентов с ЧРПГ в возрастной подгруппе «44 года и моложе» каждый из ИФН-стимулированных показателей был достоверно снижен по сравнению с аналогичным показателем у здоровых доноров той же возрастной группы, в то время как в возрастной подгруппе «45 лет и старше» каждый из ИФН-стимулированных показателей был сопоставим с таковым у здоровых доноров той же возрастной подгруппы (таблица 2).

Таблица 2. Влияние ИФН-а иа к-562-индуцированную дегрануляцию 1ЧК-клеток у пациентов с ЧРПГ двух возрастных подгрупп

Группа Дегрануляция ЫК-клеток (% СО107а+СОЗСЮ56+), %

ИФН-а, 0 Ед/мл ИФН-а, 10 Ед/мл ИФН-а, 100 Ед/мл ИФН-а, 1000 Ед/мл

Все ЧРПГ, обострение (п=38) 11,1 (4,1-25,1) 21,4 (9,8-38,9) 26,3 (12,2-44,5) 29,5 (14,1-45,1)

ЧРПГ, ремиссия (п=33) 11,4 (6,6-25,2) 20,8 (12,6-41,8) 25,3 (16,9-47,9) 28,6 (19,2-50,3)

Доноры (п=32) 13,8 (4,3-29,6) 26,6 (7,9-46,4) 31,8 (12,5-50,1) 33 (15,3-56,7)

<44 ЧРПГ, обострение (п=15) 11,1* (4,6-22,7) 24,3* (9,9-37,5) 27,8* (13,7-44,3) 33,3* (15,1-46,7)

ЧРПГ, ремиссия (п=22) 11,4* _(5,5-21,1) 20,3* (13,9-36,6) 26,2* (17,2-39,2) 28,4* (18,6-46,6)

Доноры (п=19) 22,2 (6,0-32,6) 34,6 (11,0-48,2) 40,7 (14,8-53,7) 43,0 (18,1-58,5)

>45 ЧРПГ, обострение (п=23) 11,3 (3,8-28,1) 19,9 (10,5-40,4) 25,5 (11,8-45) 28,9 (15-45,3)

ЧРПГ, ремиссия (п=11) 11,6 (7,6-27,4) 21,7 (9,3-50,2) 25,2 (16,7-55,6) 29,4 (19,1-59,1)

Доноры (п=13) 11,2 (3,0-25,7) 22,6 (6,3-35,6) 24,8 (11,5-43,6) 31,4 (14,0-45)

Примечание: *р< 0,05 по сравнению с донорами в тесте Манна-Уитни

Оценивая кривые зависимости процента дегранулирующих ЫК-клеток от стимулирующей концентрации ИФН-а, мы обратили внимание, что у части пациентов форма данной кривой имеет тенденцию к раннему выходу на плато после концентрации в 10 Ед/мл. Другими словами, у части пациентов дальнейшее увеличение стимулирующей концентрации ИФН-а от 10 до 1 ООО Ед/мл не вызывало существенного прироста процента дегранулирующих N К-клеток. Для

объективизации отмеченного явления разницу между процентом дегранулирующих №С-клеток под влиянием максимальной и минимальной из используемых концентраций ИФН-а мы обозначили как «Д [1000-10]». Показатель «А [1000-10]» сильно варьировал. Тогда вариант ответа ЫК-клеток на стимуляцию ИФН- а в виде такого низкого прироста процента дегранулирующих ЫК-клеток, который не встречался в «эталонной» подгруппе доноров «44 года и моложе» мы обозначили как тип ответа В. Остальных пациентов с вариантом ответа МК-клеток на цитокин, который встречается у «молодых» доноров, мы обозначили как тип ответа А. Представляется интересным тот факт, что тип ответа В встречался и у пациентов «44 года и моложе», и у пациентов «45 лет и старше», причём доля пациентов с вышеописанным особым типом ответа в обеих возрастных группах составила около 1/3 (32% и 33% соответственно). Если принять во внимание возможность наличия данной особенности не как возрастной, а обусловленной преходящим дефектом в противовирусной защите, то представляется логичным объединить всех пациентов с типом ответа В из обеих возрастных подгрупп в подгруппу «тип В», а с типом ответа А - в подгруппу «тип А» (рис.5).

■ ♦ - Доноры (5)

3

Рисунок 5. Идентификация двух функциональных типов ИФН-а-активированных ]ЧК-клеток на основании дозозависимого увеличения к-562-индуцированной дегрануляции под влиянием ИФН-а

Примечание: *р<0,001 по сравнению с донорами и по сравнению с аналогичным показателем при типе А; Ьохр1оГ вида [тт-25р-Ме-75р-тах]; пунктирной линией отмечен уровень минимального значения в «эталонной» подгруппе доноров «<44 лет»;

В полученной графической зависимости можно наблюдать, что при определённых условиях у одних пациентов возможно добиться увеличения данного параметра функциональной активности МК-клеток до уровня здоровых доноров, чего ни при каких условиях невозможно добиться у пациентов другой подгруппы. Характеристика влияния ИФН-а на дегрануляцию двух функциональных типов ЫК-

клеток представлена в таблице 3.

Таблица 3. Влияние ИФН-а на дегрануляцию Р1К-клеток (%С0107а+С1)З С056+) пациентов с ЧРПГ типов А и В_______

ИФН-а, Ед/мл Тип А (п=50) Тип В (п=21) Доноры(п=32)

обострение (п=27) ремиссия (п=23) обострение (п=11) ремиссия (п=10)

МК-дегрануляция 0 11,3 (6-24,6) 11,5 (6,3-24,6) 6,4 (2,6-29,5) 11,4 (3,1-26,7) 13,8 (4,3-29,6)

10 21,4 (12,8-38,1) 20,3 (11,8-38,9) 12,7 (7,7-40,8) 21,1 (7,6-47,4) 26,6 (7,9-46,4)

100 26,5 (16,4-44,3) 27,5 (16,9-44,4) 15,1* (9,3-44,4) 23,1* (7,8-50,6) 31,8 (12,5-50,1)

1000 30,2 (18,9-44,9) 32,1 (19,8-49,9) 15,6* (8,7-44,6) 23,9* (10,7-51,2) 33 (15,3-56,7)

Д[ 1000-10], % 8,2 (4,6-14,1) 9,8 (5,3-13,4) 2,6* (1,0-3,9) 2,9* (2,3-3,9) 8,5 (3,5-12,9)

Примечание: * р<0,001 по сравнению с группой доноров и по сравнению с типом А (тест Манна- Уитн и)

Оценка влияния ИФН-а на цитотоксическую активность 1ЧК-клеток (Реактивность) у здоровых доноров и у пациентов с ЧРПГ. К настоящему моменту накопленные в литературе данные весьма противоречивы и не позволяют сформировать единое мнение об уровне цитотоксической активности МК-клеток при ЧРПГ. В настоящем исследовании исходные (нестимулированные) показатели цитотоксичности МК-клеток у пациентов с ЧРПГ в фазу ремиссии и в фазу обострения достоверно не отличались от аналогичных показателей здоровых доноров. Суточная стимуляции ИФН-а мононуклеарных клеток пациентов приводила к увеличению цитотоксичности ЫК-клеток в фазу ремиссии, однако каждый из ИФН-стимулированных показателей у пациентов с ЧРПГ был достоверно ниже, чем аналогичный показатель при соответствующей концентрации у здоровых доноров, причём данное явление отмечалось при всех трёх используемых концентрациях (10, 100 и 1000 Ед). В фазе обострения статистически значимых различий по влиянию ИФН-а на цитотоксичность МК-клеток не выявлено (таблица 4).

Таблица 4. Влияние ИФН-а на цитотоксическую активность РЖ-клеток пациентов с ЧРПГ

ИФН-а, Ед/мл МК-активность МНК

ЧРПГ, обострение ЧРПГ, ремиссия Доноры

0 23,8 (4,2-56,9) 20,0 (3,3-65) 25,6(12,1-68,2)

10 42,7 (6,3-75,1) 28,7*(6,6-73,4) 58 (14,5-73,4)

100 52,9(11,1-80,0) 36,1*(10,9-72,3) 54,8 (28,1-77,8)

1000 54,8 (12,1-81,6) 36,7**0 1,6-77,3) 55 (28,2-80,8)

Примечание: *р< 0,05 ** р<0,01 по сравнению с донорами в тесте Манна-Уитни

Однако, при проведении анализа влияния ИФН-а на цитотоксичность МК-клеток в двух выделенных раннее подгруппах на основании ИФН-активированной дегрануляции 1ЧК-клеток (тип А и тип В) мы обнаружили, что две выделенные подгруппы пациентов с ЧРПГ имеют принципиальные отличия по параметрам цитотоксичности ЫК-клеток и их изменению под влиянием ИФН-а в различные фазы клинического процесса. Пациенты с типом А в фазу ремиссии по показателям исходной ЫК-активности достоверно не отличались от здоровых доноров, в то время как ИФН-стимулированные показатели МК-активности были достоверно снижены по сравнению с группой здоровых доноров, причём данное явление наблюдалось при всех трёх используемых концентрациях ИФН-а. Другими словами, в фазу ремиссии пациенты с типом А имеют дефицит ответа ГЖ-клеток на ИФН-а. В фазу обострения ИФН-стимулированные показатели МК-активности пациентов данной подгруппы повышались и не имели статистически значимых отличий от здоровых доноров. Напротив, пациенты с типом В в фазу ремиссии ни по исходным, ни по ИФН-стимулированным показателям МК-активности не имели статистически значимых отличий от доноров, в то время как фаза обострения характеризовалась выраженным дефицитом функций ЫК-клеток, а именно втрое сниженной по сравнению со здоровыми донорами исходной N «-активностью, а также почти в 2,5 раз сниженными ИФН-стимулированными показателями МК-активности при каждой из используемых концентраций. Более того, использование даже максимальной концентрации в 1000 Ед/мл едва позволяло добиться хотя бы уровня исходной МК-активности здоровых доноров (таблица 5).

Таблица 5. Влияние ИФН-а на цнтотокснческую активность Р}К-клеток пациентов с ЧРПГ типов А и В

ЫК-активность МНК

Тип / стадия ИФН-а, Ед/мл

0 10 100 1000

А обострение 24,2 (5,8-77,5) 41,9 (8-77,2) 54,1 (13,3-78,4) 55,1 (14,6-82,5)

ремиссия 20 (2,5-58,3) 28*(4,6-63,3) 36,1*(7,2-70,9) 36,7*(10,9-70,1)

В обострение 8* (3,3-50,6) 7,3*(8,4-73,5) 19,7*(4,6-79,9) 24,7**(8,7-81,3)

ремиссия 16,2 (3,9-74,2) 27,9(12,5-81,9) 26,7 (12,5-79,2) 31,5 (12-82,7)

Доноры 24,9 (10,8-68,2) 58(22,1-74,1) 54,8(31,7-77,8) 66,5 (37,2-81,0)

Примечание: *р<0,05; **р<0,01 по сравнению донорами в тесте Манна-Уитни

Оценка особенностей синтеза ИФН-а мононуклеарными клетками крови в ответ на вирусные индукторы у пациентов с различными вариантами ответа 1ЧК-клеток на стимуляцию рекомбинантным ИФН-а. В литературе задокументированы явления сниженного а-интерфероногенеза мононуклеарными клетками крови пациентов с ЧРПГ. Однако в клинической практике часто наблюдается клинико-лабораторное расхождение между сохранной и часто

повышенной (по сравнению с здоровыми лицами) продукцией ИФН-а МНК и в то же время тяжёлым течением ЧРПГ. В нашем исследовании пациенты с ЧРПГ как в фазу обострения, так и в фазу ремиссии по способности мононуклеарных клеток к синтезу ИФН-а в ответ на суточную стимуляцию такими вирусными индукторами, как вирус простого герпеса 1 типа (ВПГ-1), вирус простого герпеса 2 типа (ВПГ-2), а также стандартно используемый в качестве индуктора вирус болезни Ньюкасла (ВБН), не имели достоверных отличий по сравнению с контрольной донорской группой ни по одному из используемых индукторов (таблица 6).

Таблица 6. Синтез ИФН-а мононуклеарными клетками крови пациентов с ЧРПГ и здоровых доноров в ответ стимуляцию вирусными иидукторамн_

Индуктор Пациенты с ЧРПГ (п=44) Контроль(п-32)

Обострение Ремиссия

Нет 2,3±0,8 0 (0-8,4) 1,9±0,7 0(0-7,2) 0,9±0,3 0(0-3)

ВПГ-1 184,3±38,1 122 (3,6-477,1) 186,5±34,5 140,5 (20,9-440,7) 194,6±33,9 128,5 (9,2-531,1)

ВПГ-2 128,6±26,3 82,5 (5,2-314,3) 119,7±25 76,5 (19-374,7) 116,2±20,6 89 (7-329)

ВБН 233,8±36,1 152(35,4-549,8) 177,4±27,1 127,5 (40,5-398,5) 209,1±26,5 167(59-416)

Примечание: для каждого га индукторов результаты представлены как Меап±8Е— первая строчка, Ме (10р-90р) -вторая строчка.

Мы проанализировали способность МНК крови пациентов к синтезу ИФН-а в зависимости от выявленного ранее типа ответа N К-клеток на стимуляцию рекомбинантным ИФН-а и получили следующие данные. У пациентов с ответом 1ЧК-клеток на рекомбинантный ИФН-а типа А способность МНК крови к синтезу ИФН-а в ответ вирусные индукторы была сопоставима с таковой у здоровых доноров как в стадию клинической ремиссии, так и при обострении. Напротив, пациенты с ответом на рекомбинантный ИФН-а типа В имели принципиальные отличия от показателей здоровых доноров, причём данные показатели изменялись и в зависимости от стадии клинического процесса, а именно: стадия обострения характеризовалась достоверно сниженным по сравнению с донорами синтезом ИФН-а в ответ на индукторы ВПГ-1 и ВБН и достоверно повышенным по сравнению с донорами спонтанным синтезом ИФН-а. В стадию ремиссии эти пациенты, напротив, не только не имели сниженной способности к интерфероногенезу, но имели тенденцию к повышению данной способности по сравнению с группой контроля и типом А, достигающей статистически значимой разницы в ответ на индуктор ВПГ-2. При типе В стадия обострения по сравнению с ремиссией характеризовалась падением способности МНК крови к синтезу ИФН-а в ответ на на ВПГ-1 в 5 раз, на ВПГ-2 в 3 раза, на ВБН в 2,3 раза (таблица 7).

Таблица 7. Особенности синтеза ИФН-а МНК крови в ответ на стимуляцию вирусными индукторамн в зависимости от типа ответа 1ЧК-клеток на рекомбннантный ИФН-а_

ИФН-а, пг/мл

Индуктор Тип А Тип В Доноры

Обострение Ремиссия Обострение Ремиссия

Нет 0(0-2) 0(0-7) 6,5(0-24)* 0(0-9) 0(0-3)

0,7±0,3 1,8±0,8 8,3±2,8 2,3±1,3 0,9±0,3

145,5 129 63* 303 128,5

ВПГ-1 (7,2-502,8) (15,7-380,4) (2-171) (112-445) (9,2-531,1)

206±44,3 160,4±36,7 76±27,6 290,8±79,4 194,6±33,9

100 65 64 189,5* 89

ВПГ-2 (11,2-350,4) (16,7-249,5) (0-77) (79-390) (7-329)

144±30,6 96,6±24,2 51,4±14 212±67,6 116,2±20,6

168 126,5 88,5* 202 167

ВБН (41-573) (43,6-357,9) (4-271) (18-475) (59-416)

267,9±43,5 158,3±31 110,1±28 225±54,5 209,1±26,5

Примечание: *р<0,05 по сравнению с донорами в тесте Манна-Уитни; для каждого из индукторов в первой строке данные представлены в виде Ме (10р-90р), во второй строке - в виде Меап±БЕ

Оценка экспрессии генов интерферон-индуцибельных противовирусных белков ОА81 и Мх1 у пациентов с ЧРПГ и у здоровых доноров. На данном этапе мы исследовали экспрессию генов интерферон-индуцибельных противовирусных белков ОАБ1 и Мх1 после стимуляции мононуклеарных клеток крови пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и здоровых доноров рекомбинантным ИФН-а. Известно, что некоторые продукты вируса простого герпеса могут ингибировать ответ клеток на ИФН-а путём блокировки передачи сигнала от рецептора к ИФН-а/р в ядро клетки, что было показано на модельных клеточных линиях. Эффект связан, в частности, с нарушением активации 1ак/8ТАТ-сигнального пути. Оценивая ответ мононуклеарных клеток на действие ИФН-а по повышению экспрессии мРНК интерферон-индуцибельных генов с противовирусной функцией ОА81 и Мх1, мы обнаружили дозозависимое увеличение экспрессии в ответ на увеличение концентрации рекомбинантного ИФН-а с 1 до 100 Ед/мл, причём уровень мРНК противовирусных белков ОА81 и Мх1 у пациентов с ЧРПГ и у здоровых доноров не имел достоверных различий при всех используемых концентрациях (таблица 8). Анализ экспрессии противовирусных белков ОА81 и Мх1 в выделенных подгруппах А и В не выявил статистически значимых различий в уровни мРНК данных противовирусных белков у пациентов с типом ответа А и типом ответа В. Таким образом, в нашем исследовании не выявлено подтверждения явления блокировки проведения сигнала от рецепторов к ИФН- а/р в ядро мононуклеарных клеток пациентов с ЧРПГ, наблюдаемое в опытах на клеточных

линиях in vitro. Пациенты с ЧРПГ в нашем исследовании обладали сохранной способностью к синтезу изучаемых противовирусных белков.

Таблица 8. Влияние ИФН-а на уровень мРНК ИФН-индуцибельных генов OAS1 и Мх1

Относительная экспрессия

Ген ИФН-а, Ед/мл Доноры п=15 ЧРПГ, обострение п=13 ЧРПГ, ремиссия п=15

1 50,6 (0,6-169,2) 33,9(11,4-182,2) 40,1 (15,6-145,5)

OAS1 10 45,1 (4,8-153,8) 48 (15,4-100,1) 56,6(17,3-298,4)

100 66,3 (2,4-157,6) 44,8 (10,2-232,3) 81,7(18,7-210,3)

1 101,8(1,1-385,1) 54,0(21,5-285,5) 79,5 (38,3-263,3)

Мх1 10 90,7 (6,7-401,7) 89,6 (28,9-232,2) 87,6 (35,3-690,4)

100 173,0 (3,8-472,5) 118,6 (24,4-503,7) 147,0 (48,4-457,8)

В нашем исследовании изучена система ИФН I типа и ЫК-ютеток при часто рецидивирующих формах ПГ и выявлена гетерогенность среди иммунологических нарушений в данной системе. На основании анализа полученных результатов представляется логичным выделить два варианта функционального состояния системы «ИФН I типа / N К-клетка»: А и В. Схематически иммунодиагностические картины двух выделенных нами вариантов функционального состояния системы «ИФН I типа / ЫК-клетка» при часто рецидивирующих формах ПГ показана в таблице 9.

Вышеописанные выявленные иммунологические нарушения позволяют предположить различные варианты патогенеза рецидивирования у этих двух групп пациентов в соответствии с гипотезами рецидивирования ПГ, высказанными Яошпап В. Патогенез рецидивирования у пациентов с типом В функционального состояния системы «ИФН I типа / ГЖ-клетка» возможно объяснить с позиции существующей «динамической гипотезы», которая предусматривает постоянную репликацию и выброс из ганглия ВПГ. Достигая по нерву кожи, ВПГ вызывает микрофокусы инфекции, сдерживаемые механизмами защиты, что предупреждает рецидивы. Описанный механизм рецидивирования отражается в иммунодиагностической картине в виде повышенного в стадию ремиссии синтеза ИФН-а в ответ на индукторы ВПГ-1 и ВПГ-2, нормальными показателями ЫК-активности и нормальной чувствительностью ЫК-клеток к действию рекомбинантного ИФН- а. В стадию обострения у данных пациентов с «повышенным интерфероногенезом в ремиссию» отмечалось резкое падение всех перечисленных выше показателей в 2-4 раза. Другими словами, вероятной причиной рецидивирования при данном типе может являться истощение «иммунного ответа» вследствие длительной стимуляции постоянно реплицирующимся вирусом. Исходя

из вышеизложенного, у пациентов данной подгруппы для предупреждения рецидивов возможно предположить потенциальную эффективность противовирусной терапии в супрессивном режиме. Назначение иммуномодулирующей терапии дискутабельно, поскольку с одной стороны при постоянной вирусной нагрузке необходима иммуномодулирующая поддержка, однако не приведёт ли это к ещё более скорому истощению и не спровоцирует ли это скорый рецидив при описанном варианте патогенеза?

Таблица 9. Варианты иммунологических нарушений в системе «ИФН I типа / 1ЧК-клетка» при ЧРПГ и выбор тактики иммунокоррекции__

Тип А иммунологических нарушений в системе «ИФН I типа / МК-клетка» Тип В иммунологических нарушений в системе «ИФН I типа / клетка»

Обострение Ремиссия Обострение Ремиссия

Синтез эндогенного ИФН-а спонтанный N N т N

в ответ на вирусные индукторы N N III Г

Исходная функциональная активность ЫК-клеток N N ш N

Влияние рекомбинантного ИФН-а на функциональную активность ИК-клеток («Чувствительность» N К-клеток к ИФН-а) N II и» N

Точка приложения для индукторов ИФН / препаратов ИФН-а в рамках системы «ЫК-клетка / ИФН I типа» + +

Вероятный патогенез рецидивирования по Кхмгтап Статическая гипотеза Динамическая гипотеза

Патогенез рецидивирования у пациентов с типом А функционального состояния системы «ИФН I типа / N К-клетка» возможно объяснить с позиции существующей «статической гипотезы», при которой вирус герпеса находится в клетках паравертебрального сенсорного ганглия в интегрированном или свободном непродуктивном состоянии, что отражается в иммунодиагностической картине в виде «спокойных» показателей интерфероногенеза, нормальной ЫК-активности и снижении чувствительности ЫК-клеток к ИФН-а, что не проявляет себя клинически в виду отсутствия вирусной нагрузки (вирус находится в интегрированном состоянии в ганглии). Под влиянием «пускового» фактора вирус активируется и перемещается из ганглия по аксону периферического нерва в эпителиальные клетки,

где реплицируется, что требует увеличения цитотоксичности МК-клеток, но снижение чувствительности МК-клеток к ИФН-а не позволяет достичь адекватного увеличения цитотоксичности МК-клеток. Как следствие, клинически имеет место рецидив. Исходя из вышеизложенного, у пациентов данной подгруппы возможно предположить потенциальную эффективность противовирусной терапии в эпизодическом режиме и применение иммуномодулирующей терапии для скорейшего купирования рецидива (индукторы ИФН-а, препараты ИФН-а), поскольку чувствительность N К-клеток к ИФН в обострении восстанавливается.

В ходе проведённого исследования установлено дозозависимое увеличение функциональной активности N К-клеток под влиянием ИФН-а и не подтверждён факт ингибировании ИФН-сигналинга у пациентов с ЧРПГ, что подтверждает целесообразность применения иммуномодуляторов группы ИФН-а / индукторов ИФН при данном заболевании, однако необходимо учитывать оптимальные точки приложения для данных препаратов в динамике клинического процесса, поскольку пациенты с ЧРПГ представляют собой гетерогенную группу по показателям в системе «ИФН I типа / МК-клетка». На основании выявленных в ходе экспериментов особенностей изменения функциональной активности МК-клеток в ответ на рекомбинантный ИФН-а у пациентов с ЧРПГ в сопоставлении с способностью их мононуклеарных клеток синтезировать собственный ИФН-а в ответ на вирусные индукторы, мы выделили два преобладающих типа функционального состояния системы «ИФН I типа / ЫК-клетка», что требует персонализированного подхода к иммуномодулирующей терапии.

ВЫВОДЫ

1) С помощью реакции дегрануляции выявлено 2 типа функционального состояния >1К-клеток: тип А, идентичный донорам, и тип В, характеризующийся отсутствием дозозависимого усиления дегрануляции ЛК-клеток под влиянием ИФН-а.

2) В стадию ремиссии цитотоксическая активность МК-клеток типа А снижена, но при обострении быстро возвращается к норме под влиянием ИФН-а. В стадию ремиссии цитотоксическая активность МК-клеток типа В в норме, но при обострении резко снижается и не нарастает под влиянием ИФН-а.

3) Экспрессия интерферон-индуцибельных генов, кодирующих ОА81 и Мх1, у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ не имеет достоверных отличий от таковой у доноров.

4) Пациенты, имеющие тип А функционального состояния МК-клеток, характеризуются сохранным альфа-интерфероногенезом в ответ на вирусные

индукторы. Пациенты с типом В функционального состояния NK-клеток имеют особенности в синтезе эндогенного ИФН-а: в стадию ремиссии вирус-индуцированный альфа-интерфероногенез повышен, а при обострении заболевания снижен.

5) На основании проведённых экспериментов при часто рецидивирующем ГГГ в системе «ИФН I типа / NK-клетка» выявлено наличие двух вариантов иммунологических нарушений, что требует дифференцированного подхода к ведению пациентов, особенно пациентов с типом В, характеризующимся глубоким иммунодефицитом в системе «ИФН I типа / NK-клетка».

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При выборе вектора иммунокоррекции при часто рецидивирующих формах ПГ необходим персонализированный подход. При назначении иммуномодулирующей в терапии часто рецидивирующих форм ПГ, например, препаратами рекомбинантного ИФН-а или индукторами ИФН, целесообразно определять тип иммунологических нарушений в системе «ИФН I типа / NK-клетка» (тип А или тип В). Методологически тип нарушений в системе «ИФН I типа / NK-клетка» удобно определять постановкой теста дегрануляции ИФН-а-активированных NK-клеток с использованием нарастающих концентраций ИФН-а . Тип А и тип В имеют существенные отличия в степени влияния ИФН-а на функциональную активность NK-клеток («чувствительности» NK-клеток к действию ИФН-а) в динамике клинического процесса, что целесообразно учитывать при определении оптимальных точек приложения для данных препаратов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Карсонова A.B., Зуйкова И.Н., Шульженко А.Е., Караулов A.B., Пащенков М.В. Влияние интерферона-альфа на цитотоксичность NK-клеток у больных часто рецидивирующим герпесом // Иммунология. - 2013. - т.34. - №3. - с. 155-158

2) Карсонова A.B., Шульженко А.Е., Караулов А.В.Функциональные типы ответа NK-клеток на действие интерферона альфа у пациентов с часто рецидивирующим простым герпесом // Цптокины и воспаление. -2013. - т. 12. -№1-2. -с.52-57

3) Карсонова A.B., Шульженко А.Е., Караулов A.B. Иммунодиагностика нарушений в системе "ИФН-альфа / NK-клетка" у пациентов с часто рецидивирующим простым герпесом // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2014. - № 3. - с.27-34

4) Karsonova A., Shulzhenko A., Karaulov A. Types of NK cells responses to interferonalpha in patient with recurrent herpes simplex // Allergy. - v.68 (Suppl. 97). - p.340-

341 (материалы «EAACI-WAO Congress 2014» 20-26 июня 2013года, Милан)

5) Караулов A.B., Карсонова A.B., Шульженко А.Е. Персонализированный подход к иммунодиагностике нарушений в системе "ИФН-альфа / NK-клетка" у пациентов с часто рецидивирующим простым герпесом // Российский иммунологический журнал. - 2013. - т.7(16). - №2-3. - с. 199 (материалы «Иммунологического форума - 2013» 5-9 июля 2013, Н.Новгород)

6) Карсонова A.B., Шульженко А.Е., Караулов A.B. Особенности функциональной активности NK-клеток у больных с часто рецидивирующим простым герпесом // Российский аллергологический журнал. - 2013. - №2(ч.2). - с.130-131 (материалы XII Международного конгресса РААКИ «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» 11-13 марта 2013 года, Москва)

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВБН - вирус болезни Ньюкасла

ВПГ-1 - вирус простого герпеса 1 типа

ВПГ-2 - вирус простого герпеса 2 типа

ИФН - интерферон

ИФН-а - интерферон-альфа

МАТ - моноклональные антитела

МНК - мононуклеарные клетки

ОТ - обратная транскрипция

ПГ - простой герпес

ПКС - полная культуральная среда

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомальная рибонуклеиновая кислота

ЧРПГ - часто рецидивирующая форма простого герпеса

FITC - флюоресцеина изотиоционат (fluorescein isothiocynate)

JAK - Янус киназа (Janus kinase)

Mxl - ген белка 1 устойчивости к миксовирусам

МхА - белок 1 устойчивости к миксовирусам

NK - естественные киллеры

РС5 - фикоэритрин-цианин 5(phycoerythrin-cyanin 5) РС7 - фикоэритрин-цианин 7(phycoerythrin-cyanin 7) OAS1 - олигоаденилатсинтетаза 1

STAT - сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции (signal transducer and activator of transcription)

Подписано в печать: 24.06.14 Заказ № 2406 Тираж: 100 экз. Типография «ОБП-Принт» ИНН 7715893757 107078, г.Москва, Мясницкий пр-д, д. 2/1 (495) 777 33 14 www.obp-print.ru