Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Клеточная резистентность к интерферону

к---

А 0 ■

■У ' ■

А ^

РОССИЙСКАЯ АКАДЕИ1Я МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НШНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ. ШЕТИТУТ ЭШДБШ0Л01ИИ И ОДКРОЭДОШСДО ИМЕШ ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н.Ф.ГАМАЛЕИ

На правах рукописи

НАРОВЛЯШКИЙ Александр Наумович

КЛЕТОЧНАЯ РЕ31С ТЕНТНОСТЬ К ИНТЕРФЕРОНУ 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации нз соисканиэ ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в Научно-исследовательском Ордена Трудового Красного Знамени институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН

Научные консультанты:

академик РАЕН, член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Ф.И.Ершов

доктор медицинских наук, профессор Я.Е.Хесик

Официальные опгонзнты:

доктор медицинских наук

член-ксрреспокденх РАМН, доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

В.Г.Нзстереню

В.А.Шахламов З.Г.Кадагидзе

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт иммунологии Министерства -здравоохранения Российской Федерации

/Защита состоится в 7 а часов ка заседании Специализированного Совета - . Д 001.07.01 в Научно-гисследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им.Н.&.Гамалеи РАМН.(123098, Москва, ул.Гамальк, д.18).

С. диссертацией. юзшо ознакомиться в библиотеке НИИЗЫ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан " 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета • |

доктор медицинских наук Е.И.Коптелова

I. ОНЦАЯ ХАРАКТЕРНОТЖА РАБОТЫ

Актуальность щэоблемч. Интерфероны (ИФН) являются важнейшими цятохинами, посредством которых осуществляются межклеточные я гуморальные реакции, направленные па сохранение гомоостаза организма /Greaasr, 1977; 1379; Stewart II, 1379;1933; Borden, 1992 /, В настоящее время сложилось представязииа о системе ИФЙ как совокупности клеточных элементов, способных продуцировать разике виды KR, изменять' свое функциональное состояние при воздействии . Kill и тем самнм осуществлять менклеточше и гуморальные реакции, обеспечивающие сохранение гоыеостаза организма. Систем НФН таким образом является одним из основных факторов сохранения гокеостаза организма и его клеток. Нарушение реализации действия №5Н привода, и невозможности проявления его многочисленных эффектов (антивирусного, антипролифератизнсго, ишушмсдулирушщегй, радиопро-гективного и др,) и нарушению сложизаихся межклеточных взаимодействий / Habn, Levin, 1982; Coooia et al., 1985; Chany, 199C /., В [»стоящее время систему ИФК изучают главным образом в аспекте ее влияния на иммунитет, рассматривая ИФК как один из важных факторов регуляции иммунных реакций.

Дефекты системы ИФН приводят к нарушения функций иммунной ¡истемы и, как следствие, повышению риска развития тяжелых инфек-даонннх и онкологических заболеваний. На. клеточном уровне дефект ¡истеш ИФН влечет за собой снижение способности клеток щюдуци-хэвэть ИФН и отвечать на его действие специфическим образом. Да-ley.o не вез вида клетсх даже в пределах одной клеточной, по вуляцки иЗладэют одинаковой чувствительностью к.ИФК; наличие, кочувстви-■елышх клеток препятствует проявлении эффектов ШН /Jokiik,i963 /. Ъгда нарушение функции системы ИФН устойчиво достигает величины, лавливаемой современным методами, их определяют как КФН-дгфицит~ со состояние организма илу., его определенных клеточных популяций, дойными моделями. для исследования ИФН-дефицитных состояний на легочном уровне являются клеточные линии с различной чунствитель-остью к антивирусному и антяпрслифэративном} действию КФН /'chnny, iswa,' 1 эб8; Gres.'ser et al., 1974; Chen et al., 1981; Broa et 1., 1У83; 1535 /. Однако изучение ктеточноЗ резистенткост:: к $11, как к одному из факторов недостаточности систем:; ÍMfl, равно ак ti иричшш различной чувствительности клеток к Мм до сих пор о являлись предметом систематического изучзшя. Не ясно, лоад.-у,

проявляя сбои эффекты на однкх клетках организма, ИФН не. оказызае; действие на другие; почему на разные типы клеток ИФН действует по-разному, проявляя антивирусный, антитгрс лиферзтивяый, или иммуномо-дулирувдий эффекты. Не известно, различаются ли иатерфероновые сигналы, приводящие к развитиь антивирусного, актипролкферативног* или им«уномодулирующего эффектов ИФН или ке воз эти эффекты являются разными проявлениями одного сигнала. Недостаточно изучена .. роль рецепторов клеточной поверхности и других мембранных компонентов в чувствительности и резистентности клеток к ИФН. Не, выяснено, на каких этапах проведения интерферонового сигнала б клетке могут возникнуть дефекты, приводящие к частичной или полной невос приимчивоети к ИФН. Противоречивы сведения относительно хромосом-' mix механизмов резастантносги клеток к ИМ / Khesiu, 1989 /.

Между тэм, выявление, причин различной чувствительности клето: к ИФН змэет большое значение для понимания тонких механизмов регу ляц'_'и клеточных реакций. Практически, познание механизмов устойчн вести клеток к действ.™ разных типов ®Н может привести к создана; методов коррекции интерфэронсвых дэфкцитоя и б конечном.счете ока кётся эгажпым для разработки научно-оптимизированных методов интер фероготерадкк и там. самым коррекции иммунного ответа.

Цель и задачи исследование. .......

.. Целью настоящей.работы было установить механизмы клеточной 'чувствительности (резистентности) к интерферону и возможные сиосо бы коррекции клеточной резистентности для повышения эффективности интерферонотерапии.

Б ходе проведения исследований необходимо было решить саедую изие основный задачи: ...

1." Разработать, модели, клеточных систем, существенно различающихся . по чувствительности к ИФН.

2. Изучить на каких ц^лях особенности действия ИФН и шщукторог . ИМ!..

3. Еиягдаъ иикогенетичеекиа особенности в линиях клеток, различающихся по чувствительности к ИФН и индуцлбелъностя ИФН.

4. Изучить особэняооти клеточных ?/ембран, связанные с различиями . в чувствительности кдегок к ИФН.

5. Вылезть роль ;:ы.'кб1г?ороБ действия ИФН (ИДШ и подобных им фа* торов в оирсгД(ш^;<и: «vвствгтежьюси. клеток к ИФН.

6. Иссле.поьять юй;/л о кь-лич^я соо-тлюкая £се«ду способность кл*

ток продуцировать ИФН под действием индукторов и их чувствительностью к Шй.

, Определить способность ряда препаратов (индукторов ИФН, биологически активных ззществ и лекарственных препаратов), изменять, чувствительность клеток к ИФН и попытаться выделить препараты, способные повышать или поникать клеточную чувствительность к ИФН. .

Диссертационная работа является теоретическим исследованием, поставленные задачи реяаются путем изучения я анализа янтерфе-зниздуцированкых клеточных реакций при различных проявлениях кле-эчной чувствительности (резистентности) к ИФВам.

Научная новизна. Впервые проведено систематическое изучения • неточной резистентности к ИОН, как одного из факторов недоотаточ-эстп системы ИФН. Впервые разработаны модельные клеточные система 2СЛИЧПОГО происхождения, отличающиеся по чувствительности к анти-5русшму и антипролиферативнону действию ИФН. Проведена подробное эавкительное цитологическое, цитохимическое к цитогенетзческое ¡следование линий клеток, различающихся по чувствительности к ИФН. юрвыэ установлено, что. степень клеточной.чувствительности к ИФН-л. жхэ пропорциональна откошаиию средних.чисел хромосом 21 и 16. 1ерше показано,, что нечувствительность клеток J-4I к антиБкрус-

и антипролгареративному действию ИФН~с<. сопрянена. с. уменьшена частоты встречаемости хромосомы 21 и, как следствие, с стсут-гвием вксокоссецифическах клеточных рецепторов для ИФН.. Впервые жлзано,. что нечувствительность клеток к ИФН-ct солрякеш с повы-!Ш1км конститутивным.уровнем активности 2-5А синтогагы а цАМФ--за-1С.;:.'ой протедякипазы. Впервые продsне трирсвзр, что существует ¡к называемая "мнимая". резистентность клеток к ШК, обусловленная !д\.-кцпе2 в ¡тетках ИДИ. Показано, что ЗДЯ лвлязтея не изученным шее классом, макромолекул, участвующих в регуляции систем Ц и :угюс клеточких реакций. Предложена гипотеза о существовании, нс-iO::d ИСН, целого класса ингибиторов действия ИФП. Ползало, что «-.'.обработка ИЯЯ-чувствятелызос клеток IK-H зааряцает :>х от icitc--ксюскогс- действия естественных киллеров. Впервые ^охйзпно, что •е;;ойрзботка инторфэроком резистентных клеток певыеезг цито. о ¡гоиста активность естественных киллеров претив xcorow. .¿енс? (KM), :о::?'!0 ксказзго, что 'ЩИ охиопял? протек^шое дей^у-кс г z тсс-огссрохозамгсиу цитолизу, да;дотелг.етнуеч- о

личии у ВДИ и ммунорегуляторных свойств и позволяет рассматривать ИДИ также как один из ингибиторов регулирующего действия ИФН в от ношения цитотоксических ЕК. Впервые показано, что регулирующее действие ИДИ на КМ в реакции естественной цитотоксичности зависит от чувствительности клеток к антивирусному эффекту ИФБ. ИДИ функционируют как. ИФН, в определенной степени предохраняя КМ ИФН-ре-зистонтной линии от ЕХ-опосредовакного цитолиза. Впервые разработан новый интерфероно-вирусннй метод селекции гибридных клеток, и полученные гибрида предложены для изучения механизмов клеточной чувствительности к ИФН (а.с. & 1138412). Исследование полученных гибридных клеток показало, что чувствительность клеток к ИФН-у определяется, кроме генов хромосом 6 и 18, генами 21-й хромосомы человека» На новых моделях изучен вопрос о разобщении не только систем продукции ИФН и чувствительности клеток к ИФН, но также и систем клеточной чувствительности к антивирусному и антипролифера' тивноыу действию ИФН. Впервые показано, что способность ИФН препятствовать образованию синпластов при индукции слияния с шмощыз . цолиэтвлевгликоля зависит от. чувствительности клеток к ИФН. Доказана возможность нацравленного изменения,клеточной чувствительное те к ИФН с помощьш биологически активных соединений различного происхождения— ............... ...

Научно-практическая значимость- В результате проведения рабо-' хы было, сформулировано, новое. направление исследований интерферо-нов, а именно, изучение клеточной чувствительности (резистентности) к ИФЯ. Невосприимчивость клеток к ИФН,,как оказалось, многокомпонентна и тесно связана с дефектами функционирования КСГ и метаболических путей, по которым осуществляется действие ИФН. Отсюд! возникает необходимость целенаправленного изменения чувствительности клеток к ИФН. Эта проблема такке ставилась в этом исследовании.. Были разработаны методические подходы для скрининга веществ-корректоров системы ИФН и отобраны некоторые вещества, изменяющие чувствительность (резистентность) клеток к ИФН. Эти исследования . имеют не только теоретическое значение, но и представляются вашими для практики: выявление веществ-корректоров системы. ИФН может значительно повысить эффективность интерферонотерапии.

Разработанные клеточные модели, результаты, исследований и методические подходы используются в исследовательской работе при систематическом изучении механизмов образования и действия ИФН в

лабораториях КИИЭМ им.К.Ф.Гамалеи РАМН, Института, молекулярной биологии т.?. Б.А.Энгельгарде РАЧ, ЕЕИИ "Генетика", я в лаборатории Онкологической вирусологии ИШЕРМ, Вяльжуав, Франция.

Материалы диссертационной работы используются такге яри проведении циклов семинарских занятий с врачами по готзшению их квалификации в Отделе химиотерапии и хиетопрофилактики вирусных ин-. фекций НИИ гриппа и вирусных инфекций РАМН. На клинической базо отдела использованы методические подхода к определенно чувствительности к ИФН клеток-мишекей с целью оптимального подбора препаратов ИФН для лечения детей.

Выдвинутые нам теоретические положения вккьчен* в монографию "Система интерферона з гарче и патологии1, /1993/, использованы, в обзорах Ф.И.Ершова (TS80) и Я.Е.лйсина (1982, 1984, IS3S, 1988, 1990).

Результаты исследований а разработанные, методические подходы

защищены авторскими свидетельствами и патентами:

I. Способ получения гибридных клеток A.c. № II584I2. t-

3. Иммуномодулзрующее средство - Подано в Госкошзобретбяий;

. Л 4837954/Г4/1рлоритет от 29.06.90.

4, Противовирусное средство - Подано в.Госкомизобретений;

В 5004008/14,. приоритет от 01.Ю.9Г; получено положительное решение на. выдачу патента. . .

Настоящая работа выполнена в рамках Государственных программ: С.31 "Изучение.роли системы интерферовоз з норме и патологии и лс-лекулярно-биологичесгшх основ образования и действия интерфаронов" ("Иктерфероны"). и 0.74.05 'Разработать новые направления исследований генетического аппарата, биоматерколов к структур клетки, осуществляющих взгЕейиие проявления жизнедеятельности, и внедрять дсс-пигенкя молекулярной биологии и молекулярной генетики а народное хозяйство", и согласно планам НИР НИИЭМ мм.Н.Ф.Гамалеи РАМН и теш А133 "Изучезие на клеточных культурах и гибридах соматических клеток механизмов резистентности к интерферонам и путей ее проодо'чения", одобренной Экспертным советом по микробиологии, инфекционной иммунологии.

Большая часть работы провэдена автором самостоятольг"! или joemoctho со с.п.с. А.М.АчченкоБой, за что автор приносит ей иск-эдянш благодарность. Автор глубоко признателен за консультатяБ-

нуа помощь, окгзаннув чл.-корр.РАМН, проф. Ф.И.Ершовым к проф. Я.Е.Хесшшм - консультантами работы. Изучение активности ИФН-пвду-тхкроЕэн'гПо; ферментов проводилось совместно с А.В.Иткесом, К.Т.Тур-пае вш и М.Ф .Соловьевой; изучение мембран клеточной поверхности выполнялось совместно с А.Я.Стронгиным, С.И.Боруховым, Н.В.Клицу-новой и В.Б.Гостевой; исследование ИФН-ицэуциро ванных клеточных реакций гроводклось совместно с Л.Н.Поквдшевой,. Э.Г.Алимовым и С.БЛекнэЕим; получение и изучение ингибиторов действия ИФН выполнялось совместно с Б.В.Парфеновым и Т.Л.Тихоновой.

Атаобепия диссертация проведена на. обьединепной. научной конференции отдала интерферонов КЖЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН 25 июня . 1992 г. Основные полокения диссертационной работы доложены и об-сувдены на международных и всесоюзных конгрессах, симпозиумах и конферошшях, перечень которых приведен в конце автореферата.

^/бликация. Ко материалам диссертации опубликовано 50 печатных работ.

Об.-.ем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 261 странице мяишвоштсгого текста и состоит из введения, обзора литературы, ОжлЕнаощзго 5 глав), собственных исследований, изложенных в.8 главах, заключения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 58 таблицами и 41 рисунком.

■ _ Библиографический указатель включает 274 источника.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2,1. Материал и метода исследования

Клеткл и лх шхжсхогшение. Диплоидная культура кожпо-мышчкых фибробластоз змбриона человека (ДМ) штамм I.'-I9; получьн из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН. Культура клеток а&ог получека из карциномы яичника в 1362 г. /К,3.Добрынин и др., 196?/. Культура клеток.гипернефромы человека (Гй) получена в НИИЗМ нм.Н.й.Гамалея РЮТ /В.Я.Шевюзгик и др., 1985/. Культура клеток J -36 получена н IU55 г. из крови мужчины, больного подострой мо-ноцйтэрной лейкемюй / Osgood, Brooke, 1955 /. В СССР линия культивируется с 165? г. Суолиния J -41 получена в результате многократного воздействия, массивными дозами вируса Коксаки ВЗ на метет культуры J -36 /В.Д.Сояоньев и Н.Е.Гулевич, IS66/. Клон J -2

подучен в 1979 г. Н.Е.ХУлевич из сублинии MI путем клошгрова-1шя по метода' Уиск et el. (1955). Клон J -41 it получен в 1988 г. из субднши J -41 в результате обработки клеток высокими дозами реафзрона. Куль тура-клеток Н-9 выделена в США. / Popovic st si., 1'984/ при клонировании клеток шгг-70, которая была получена путем «рангфэряздаи Т-клеток донора вирусом KTLV-1 , Культура клеток МТ-4 вцделона в Япония при клонировании культуры клеток кит -73 / Kiernaa et al., 1980/. Культура клеток СЕМ получена в (Ж /Poley c-t al. , 1965/ из крови больного Т-клеточным лейкозом. Культура, клеток U937 получена из менонитов периферической крови человека, больного гистиоцит-арной лямфомой / Suadström, .Wilson, 1976/. Культура клеток MOLT4 получена в Японии / JOLkukawa ot al. ,195бДиз Г-клеток больного лимфолейкозом. Культура клеток К-562 - опухоле-зая линия эритромиелобластов, иолучатаая из плеврального выпота ?'ольннх миелолейкозом в стадии бластного криза и адаптированная к сультивироьэжго in vitro / Klein et al. , I97S/. Перевиваемая ли-шя мышиных клеток IÖ29 получена из кожно-мышечных фисЗроблаотов глет, но го эмбриона.. Перевиваемая линия клеток 1ЛЗВ получена, из омб-иона шяей С57В1 / О.С.Гудкиа и др., 1985/. Соршикыч культуры ибробластоэ 8-9-днзвных куриных эмбрионов получены из Института ярусологли им.Д.И.Ивановского РАМН. Для культивирования клеток спользовали среди 139, Rrai-1640, Кгла с двойным набором амияо-аслот производства Института полиомиелита я вирусных энцефалитов Шй и сыворотку эмбрнокоЕ крупного рогатого скота производства ШЭМ км.К.Ф.Гамалеи РАШ. - ...

Сокультивстование клеток выполняли в ионослое; з ряде эксае-тентов проводили смешанно? (суспензионные и могослойнке культу;) сскультивироваЕие. . .

Для полпенни клеток с пониженной чувствительность*) к ис-яьзовахи схему селекции с возрастающими дозами ИФН / Ewsata, 31/. Использовали гадкий препарат реаферона с исходной актив-етью I-3'IO7 МЕ/шг. ...

forpvon. использованные в работе: вирус везикулярного стома-га (БШ) штамм Индаана, с титром I07 ТЩ^о/мл ; вирус энцефало» жардита мютей (ВЭ'.К) штамм "Колумбия sk-CoI-sk " с титром ТО7 ЬгУ'.'^; зирус болезни. Кьвкасла (Ж!) с титром ХО&гцд.ф/м'г; ! Коксаки 33, штамм 0-1 с титром 1С8 ТЦД^/мл.

Интвтёерод;, Человеческий лейкоцитарной интерферон - HuLelFH/

ndv (ИФН-оС): рефарвне-лрепарат с активностью 4000 MS/мл, концентрированный препарат с активность» I'IO4 МЕ/мл, инъекционный препарат с активностью З'Ю® МЕ/мл. Человеческий фибробластный иптерфе-рон —. HuPibrFK/poly(rX)poij(rC) (ИФН-Jü) с активностью (2-10) ПО3 МЗ/ыл. Человеческий кммуязнй интерферон - Kuimiyir/SBA (ИФН-/) с активностью 1000 Ш/мл. Указанные препараты были любезно нам предоставлены проф.З.П.Кузнецозым и^ироф.И.Г.Балацциным.

Реаферон с активностью 10° MS/мл (ИФН-сС2) и гаымаферои с активностью I05 МЕ/мя (ИФК-У ) получены из Института иммунологии концерна "Биопрепарат".

Мышиный сывороточный ивьерферон с активностью 2000 Ед/ил получен из сыворотки крови ммией О.Н.Щох'ЛСеитовой и Е.Н.Мешксвой.

Свиной лейкоцитарный интерферон (С2Ш) с активностью Fio'? МЕ/мл: получен из Института иммунологии концерна "Биопрепарат".

Продукцию ИФН клеточными культурами определяли по индукций. синтеза. ИФК с помощью ЕБН (10-100 ТЦЦ^о/кл) или поли(рИ)поли(рЦ). I ьхгД'л.. Титры ИФН определяли на культурах диплоидных клеток человека/.В Д.Соловьев, Т,А.Бектемиров, 1Э81/. ..

Чувствительность клеток к действию т>азньех тисов ИФН определяли по АВ действию ИФН - по подавлению цитопатического действия и по пэдааяента репродукции вируса в этих клетках, и по АП действию ИФН - по подавления ьмтоткческой активности клеточкой культуры и по , подавлению включения °Н-тьыадика в ДНК клеток / Vuthods ic епиуло-logy, IS8I/.

■ • Скрининг вешэст-в на способность изменять чувствительность улаток к АВ, действию.КФН. 96-лукочнуа плату для культивирования засевает клетками соответствующей культуры (параллельно скрининг проводили на линиях клеток с различной чувствительностью г. ИФН). Через 24 часа после ооразоваша неполного монослоя среду сливали и в ханду-о лунку вносили испытуемый образец вещества в рабочей концентрации. Через 2-1 час. поело внесения исследуемого препарата проводила титрование ИФН. Параллельно проводили титрование индикаторного вируса (ВГС или БЭМК), титре ваше вируса проводила кзк с введенном исследуемого препарата, так и в контроле. Учет результатов осузпесгвлягги против .100 ТЯД^Дух индикаторного вируса. Результаты считали достоверными, если титр ИФН при введении испытуемого препарата изменялся в 4 и более раз.

Скрининг веществ на способность изменять чувствительно£ть теток к АЛ действию ИФН. Клетки высевали в 95-луночные платы, на горой день роста среду меняли и в лунки вносили исследуемый пре-Ф&т в рабочей концентрации. Через 24 час. после внесения прэпа-1та проводили титрование ИФН в трех параллельных радах лунок. 1ату помещали в С02-инкуоатор на 24 час. За 4 час до окончания льтивирования в кавду» лунку вносили раствор *%-тимидина (I Ки/ I; 50 мкКи/мл) в срзде nrui -1640 по 20 мкл/лунку. Клетки из каж~ й лунки осаждали на стекловолоконные фильтры с помощью установки рзестр (Dynatoch. , Дания). Уровень включения изоюпа измеряли. на та-спектрометрэ (Packard , США) после высушивания фильтров. Ре-гсьтаты считали достоверными при изменения величины включения вдина в ДНК клеток более чем на 20-25$.

Для морфологического исследования клетки скрашивали по Кай- . знвальд-Гкмза или фиксировали жидкостью Еуэпа и окрашивзли геме-ссшшном и эозином.

Для определения митотической активности клетки-в течение семи ¡Я ежедневно фиксировали, .окрашивали к заключали. в канадский . ьзам.. Подсчет числа ыитозов проводили в 4000 клеток культуры, ле чего определяли штотический индекс в промилле.

Втавление активности щелочной просФатпзн (I® 3.1.3.1) тгроЕода-по методу Гсмори / Pearss ,. I960/, или методом одновременного сочетания по Burstone /1962/ с модификациями, принятыми в ка--лаборатории. ....

Электронно-микроскопическое исследование.. В клетках исследо-\ активность щелочной фосфятазы по мзтоду Гомори (Са-Со метод; 14 инкубации 20 мин при 37°С) без обработки сульфидом натрия, ■ки дофиксировали ЭО мин 1% раствором четырехорси осмия на i М какодилатном буфере, заключали в Эпок 812. Срезы получали льтратоме IJQJ 111 , окрашивали ацетатом уранила и цитратом ца и исследовали в электронном микроскопе JEM ЮОВ. В другс'й . и экспериментов клетки обрабатывали лейкоцитарным (1000 МЕ/мл) мукши (200 МК/мл) ИФН. Через 24 час клеточный монослой фик-валз, обезвоживали и высушивали методом критической точки в hoiks фирмы "Balsera " (Лихтенштейн), напыляли золотом (толщи- • ашиенил 50 ни) и изучали в сканирующем электронном шкроско-Íitachi-40S - (Япония).

Определение активнос-ти 2' -51 о л и го а д е ш л з т с и нт е т а з к' (2-5А син-тетаза) проводили с помощью методов, описанных Johnaton, Тоггспсе, /1Э84/ с модификациями А.В.Игкесз и ссавт./1984, 1988/. Активность 2-5Íl сяктетазы выражали в молях ААВ, включенного в диыер 2-5А за 14 час инкубации в расчете на I мг белка клеточного лизата.

Активность нАШ-зависимой протеинкииаан определяли по включения в N-концевой фрагмент гистона Kj- специфический субстрат этого фермента. Активность ЕК Еырая.али в импульсах в I мин з расчете na I мт- бежа клеточного льзата.

Определение содержат« белка проводили либо ко связыванию с красителем Кумасси S-256, либо методем Лоури.

Ол-релаяение активности отлетококгдис^тазн (СОД) проводили до методу Niebifciai et al. Д&72/. Спектрофотометрироьашга выполпялз через 10 мин при 53о им на спектрофотометре "Specol Полученные

дачные унифицировали путем пересчета на 10® клеток. .....

- Определение пролтатаи клетками ингибитора дейстЕи.ч ИФН (ИДИ). Клетки индуцировали ЕЕН (100-1000 ТЦД50/кл) при 37°С л течение 24 час.. Остаточный вирус в культураньной среда, или в нздосадке инакм вкроЕали закислевяем до pH 2,2 с. дамощьв раствора FCI ь течение 4 сут и доведали pH среды до 7,2-7,4 раствором НаОН . В ряде экспериментов иидукщяо в клетках ИДИ осуществляли германий- иди.кремни! органическими соединениями (МОП), предоставленными.нам Ы.А.Игнате! ico, или сокультивированием с ксеногеннкмя клетками. Полученную вд кость, концентрировали путем ультрафальтрации в тонкоканальных ячв! ках аппарата 1CP-I0 ("Амикоп", Нидерланды) в стер;т.чьных условиях /В.В.Парфеноь к др., IS80/, Содержание ИФН в концентрате и ультра фильтрате определили титрованием в гшкрошхатах с диплоидными клеХ' ками человека дгл человеческого ИФН и с клетками I32S дда ышино го И55Н. Весь ИФН оставался б концентрате; ультрафильтрат не обладая противовирусной активность»! и содержал ИДИ. ЩИ б ультрафильт рате тктроьал" я культуре против сынохо иж человеческого лейкоцитарного ИФН, добавляя ультрафильтра! в равном количестве (1:1) к расгагровачаому в платах №Н и определяя противовирусную активность смеси /З.Д.Соловьев и др., 1981/.

Г-,10Г'Г.:в;г!ачк1 ооматическух клеток. Слияние клеток проводили как в суспензия, так я в монослое с помощью 50# раствора 13ЭГ тип 1550 или тип 1000 / Kennett, 19Ö1; ЫсКеагп, 1991; Gerhard, ".951 /

Для определения эффективности слияния клетки фиксировали спустя 4 час. после слияния и окрэвивали гематоксилчном. Просматривали по 200 клеток, в 4-х разных участках препарата и определяли количество слмпластов, количество ядер в симпластах, а также индекс многояде-рности (ИМ) и поликарионитарный индекс (И) /Я.Е.Хесип и др., 1974/. Селекцию клеточных гибридов.проводили о помощью интерфсроно-вирус-ного метода /А.Н.Наровляпсхяй, 1985/'. . .

Наркологические исследования. Препараты для коркологического исследования го-гоеили по общепринятой У£тод7л;э /Mocrhsade. et al., 19Б0/ с модификациями, разработанными в нашей лаборатории. .

Для дкйференпиальной окраски хромосом использовали к -метод -/Dutrillaux, i.ejeune , 1971/; для выявления конститутивного готе-рохроматина использовали два варианта С-метода: метод с применением раствора.Ба(OK)g / Sumner , 1972/ и метод с применением раствора НаОК /Г.Ц.Леликова, ТЛ'.ЦветкоЕа, 1976/; для выявления ядрет-ковых организаторов использовали Ag-1 метод окраски / BIoq-д, Goodpasture , IS76/; дал дифференциации в метафазкых пластинках гибридных клеток хромосом человека и. мши использовали окраску красителем Хехст 33258 /Kozak et al. ,.1977/. .....

- - • Метод составления реконструированного хариотипз кульгурн клеток /С.М.Мамаева, 1984/ заключается в том,, что после, идентификации всех нормальных и маркерных хромосом определяли все фрагменты нормальных хромасом, входящие в состав маркеров. Для реконструкции кариотипа каждой клетки отдельные фрагменты маркерных хромосом располагал! на месте тех нормальных хромосом, из материала которых' они происходили. Далее результаты реконструкции отдельных клеток .суммировали для получения обобщенного реконструированного, кариотипа квдцой отдельной клеточной линии и изобразит схематически. Иодировать ИФН. Мономерную форму «№Н-с(А (10®М£/мг) кэткли со специфической, активностью 40-80 мкКи/иг белка с псмон^ы хлорамина Т по методу Aguet et al. /1984/.

Связывание ^Т-ПЗН-г/ А с- рецепторами клеточных мембран выполняли на экешзнехздиально растущей культуре до методу Aguet, Slanchard /1981/' с модификациями Yonehara et al. /1333/. Результаты экспериментов приведены на 10^ клеток. ' ■ Метод сценки цитоторсичаской ати-мянссти естественных, редь Для оценки цитотскскческой активности ЕК кспо. зозаяи радио-

метрический. метод Kashimo.to и Sudo /1971/ в модификации М.П.Рыковой и соавт./ISSI/. .Активность ЕК определяли в суспензии мононук-леарных.клеток (ШК), полученных из периферической. крови здоровых доноров. Для постановки цитстсксического теста (ЦТ) использовали линии клеток К-662, J-S6,- J-4I, №29, ЬСБ. Клетки использовали через .1-2 оут после нерэсева. Обработку человеческих КМ проводили реафероном в дозе 2000 ME/мл, мышиных КМ - мышиным сывороточным ИФН в дозе 100 Ед/мл в течение 24 час при 37°С с последующей отмывкой препаратов. Для изучения действия ИДИ та чувствительность КМ к Ж-опосредовшшому цитолизу ыыеиный сыворотсчнкй 1Ш1 в дозе 100 Дд/мл, ИДИ в дозе 8 ИйЕ/мл, а текке ИМ в комбинации с ИДИ вносили в культурз KII на 24 час при 37°С о последующей отмывкой . препаратов. Активность ЕС исследовали в широком диапазоне соотно-ценкй уффектор:мишень (Э:М) в экспериментальных системах от 100:1 до 6:1 /Ы.З.Саядов к др., IS84, 1388/. Счет зыраяали в числе ям- . пульсов в м>;н. В качестве меры актизности ЕК использовали цитоток-сическиЗ индекс (ЦИ):

тг/ - fr число имп; в отмтнсй лункеч . тг,пу v~ число имп. в контроле . ' ^

При.расчете ЦИ брали среднее число имл/мин. Индекс вариабельности (ИВ) показателей активности ЕК вычисляли как отношение максимального отклонения к среднему значению при данном соотношении Э:М. . . Замопаживзние клеток - проводили по методу Kennet /1983/. За-морзяивэли здоровые культуры клеток, находящиеся в середина логарифмической фазы роста.

. Статистическая обработка результатов. .Достоверность полученных данных оценивали по критерию Стьэцента. Результаты считали достоверными при Р < 0,01.

2.2. Результаты исследований и их обсуждение

2.2.Г. Проявления клеточной резистентности к ИФН

В конце 1970-х гг. было доказано /Gresaar, 1977; Сгезаег et si., 197S; Stewart TX,19V9 /, что плейотропное действие препаратов ИФН на клетки присуще самой молекуле ИФН, а не примесям, присутствующим в препарате. Однако, было не ясно, ьсе ли эффекты ИФН осуществляются параллельно, или же проявление одного эффекта И6Н не всегда со njc воздается другим. Отеот на атот вопрос был получен при исследовании различных ИРКЛ.

Ми начали исследования по этой тематике в 1977-78 гг.. на линиях клеток человека ¿-96 и <М1, которые» как било выявлено, различались по чувствительности к ИФН. Следует ответить, что. в ото время подобные исследования проводились еще лить в двух лабораториях на Мишиных линиях клеток: в лаборатории с.сьапу /слапу, у±2-па1.19б8 / из мышиных эмбриональных фибробластов была.вэделйна линия клеток мэтх ,. резистентная к АВ и АЛ действию ИФН; и в лаборатории 1.1}гвовег / Огеэяег вt а1., 1974 / ИЗ ЛИНИИ клеток. 1>12Х0.. была получена при культивирована с ИФН сублиния Ы21СЯ , резистентная к АВ и АЛ действии ИФН . К настоящему времени известно . много клеточных линий с различными вариантами. платочной чувствительности (резистентности) к разным типам ®Н.

Б своих исследованиях нам также удалось заявить и изучить целый ряд линий клеток, различающихся по. чувствительности к эффектам Щ?Н~о(. Полученные нами данные по уровню чувствительности разных линий клеток к гомологичному ИФН сведены в табл.1, в которой доказаны возможные варианты чувствительности клеток-к АВ и АЛ действия КФН-оС. Как видно из тэбл.1, линии клеток <Т-4Г, . -7-41 .. я Ь"337 на чувствительны к АВ и АЛ действию ИФН-о(. Линии перевиваемых клеток И-9, ИГ-4, М01Л? и МЗВ не . чувствительны к АВ действию ИФН. но чувствительны к АЛ действию.. Линии клеток . о-96, ГН,. М-19, СБН, 192Э гувствателькы ж АВ я АЛ действию КФН. Отсюда следует, что для колкой характеристики клеток необходимо порознь определять лх чувст-жтельшеть к АВ и АЛ эффектам ИФН, ибо эти эффекты в некоторых зидах клеток могут не совладать. Это свидетельствует о разобщении ?йханязмоз, приводящих, к проявлению АВ и АЛ действия ИФН.

При сравнении чувствительности клеток к ИФН с их способностью Продуцировать ИФН оказалось, что во всех изучениях нами линиях леток нечувствительность к ИФН со про воздалась их неспособностью интозкровать КФ К, тогда как чувствительные к РФН линия клеток ингйзировали ИФН при разных способах индукции (табл. 2). Эти результаты коррелируют с парэхлнлью полученными данными другчх аэ~ оров /згетга^ II, 1579; 1еЪ1вп, ОтЛепг, 19е2 /. Так, например, ЗЕесгйо, что линия клеток человека К-562 на продуцирует ШН и ре-кстентяа к КФН-о(2 человека /Со1оиоп.1с1 et а1., 1991 /'. Однако, о-видямоау, такое совпадении не является н^прзлонней закскомер-эстьа. Так, известно, что культура макрофагов перитокег- >ного

Таблица I.

Чувствительность клеточных культур к АБ и АД действию ИФН-о(

Культура клеток

Действие ИФН

Ж

АП

.7-56 д. +

ог-41 - -

- н.о.

.7—х1К - -

+

Гн +■ +

1.929 4- +

- +

Н-9 а.

МТ-4 - +

И937 - -

СЕМ + . +

" жат н'.о. +

+ клетки чувствительны к действию УШ - клетки нечувствительны к действии ИФН и.о. - иэ определяли

Таблша 2.

Продукция ИФН-сС^Ь перевиваемыми линиями клеток

Культура клеток

г.о „чу /И /по ли /П /

М-19 128 512

ГЫ 8 8

•Т-Э6 В <2

«Т-4.1 х) <2 с 2

х) <2 <2

Ь529 - 1024

шв X) <2 <2

х) линии клеток, не чувствительные к ИФН- с< ¡¡ь экссудата г/ышей С57В1/6 продуцирует в 10 раз больше ИФН при ипдук-

ВБН, чем макрофаги !.шшей EALB/c /Zawatzky , I98S/. Однако, рофаги мышей BAIB/с по сравнению с макрофагами мышей C57BI/6 ее чувствительны к АН действию экзогенного ИОН. Т.е. эти данные зывают на несовпадение ИФН-продуцирующей способности и чувстЕИ-ьности клеток к ИФН.

Лимфобластоидная линия клеток Namaiva интенсивно продуцирует , но совершенно к нему нечувствительна /Stewart II, 1979/. В то зремя линия клеток Daudi не продуцирует КФН, но высоко чувст-эльна к АЛ действию ИФН. Полученные из линии клеток Daudi кло-Dlfrj, DIPg, DIPg и др. / Dron et al. , 1983, 1985, 1986/ регентш к All действию ИФН и не продуцируют. ЮН. То есть разобще-групп сцепления генов, отвечающих за продукцию и чувствитель-■ь клеток, к ИФН, обеспечивает всевозможные варйанты взаимоотно-й и взаимозависимости состояний ®Н-продукции и И$Н-чувстви-ности клеток.

Кроме того, оказалось, что от чувствительности клеток к ИФН сит способность ИФН защищать КМ от цитотоксического действия Обработка ИФНом КМ человеческой линии ¿-96, чувствительных к приводит к снижению в 2,5-3 раза цитотоксической активности ротив этих ЮЛ (рис Л). Резистентные к ИФН КМ линии J -41 пос-бработки ®Ном становятся, наоборот, в 1,5-2,5.раса более чув-тельными к цитотоксическому действию ЕК (рис.1.2). Следсва-но, устойчивость, чувствительных и резистентных к ®Н челове-их ли1шй КМ в реакции ЩГ изменяется разнонаправленно после Зработки ИФН. При этом снижение лизиса клеток линии J -96 под гвием ВС совпадает с хорошо документированным протектизным эф-зм КФН в отношении опухолевых клеток-мишеней, чувствительных -опосредованному цитолизу: стандарт;шх культур К-562 /Powell I., 198Э/ и ЬЮЕГ-4 /Leiden et al. , IS89/. Обработка ИФНом КМ юй линии 1929, чувствительных к ИФН, приводит к-снижению в I раза цнготоксической активности этих КМ (рис.2.1). Резкстеа-к КФН КМ линии 1С В после обработки ИФНом также (в отличие от 53чзской линии J-41) стапоачтся в 1,5 раза менееЧуЕствитель-к цитотоксическому действию ЕК (рис.2.2). Следовательно, ус-хость чувствительных к резистентгагх к ИФН мышиных линий КМ в :ли ЕЦТ против человеческих ЕК изменяется сонапрзвлр'то после ;стки стих КМ пядюпаы К*Н. При этом как на К'.', чурсх^ительша

60

40

20

О

Рис. 1 . Изменение чувствительности клеток человеческих линий J-96 и J-41 к цитотехсическому действию ЕК после обработки КМ человеческим рекомбинантныы ИФН-а2 (Mit).

По оси абсцисс - соотношение Э:М, но оси ординат - ЦИ, %. Условные обозначении: 1 - КМ линии J-96 (п"Ц), 1 - КМ линии J-41 (п-4). О - контроль, « - КМ + ИФН

ВО

60

40

20

О

Рис. 1 . Изменение чувствительности клеток мышиных линий L-929 и МСВ х цятотоксичгско^у аействию ЕК после обработки КМ мышиным cusopi точным ИФН-a//? <M±t).

По оси абсцисс - соотношение Э:М, ао оси ординат - ЦИ, %. Условные обозначения- 1 - КМ линии L-929 (п=б), 2 - КМ линии МСВ (п= О кош-роль, « - КМ + ИФН.

6 12 25 50 100 6 12 25 50 100

е 12 25 5 С 100 6 12 25 50 100

с ИФН, так и в случае использования резистентных к УШ КМ, ИФН, в )тличле от его действия на человеческие клетки .1-95 к о -41, ока-швает пр9тектив:гое действие и повивает устойчивость КМ к ЕК-опос-хэдоватюыу цитолизу.

От чувствительности плеток к ИФН зависит способность ШН прз-лтствовать образовании симпластов при ивдукщш слияния клеток с отдаю ПЗГ < табл.3).

Таблица 3

Сшпластообразование в культурах клеток «г -95 я <1 -41 при обработке ПЭГ

Концентрация КФН-Л Ш/ил | Индекс многоядеп-| нэсти (ИМ) | Поликаниоцитарпый V индекс (ПИ)

| J -26 { <Т - 41 \ .т -96 1 3 —41

Контроль 44,5 22,4 91,1 58,3

300 30,0 24,6 72,3 58,8

3000 27,8 16,1 55,1 40,0

примечание: ИМ - доля количества клеток с двумя и.более ядрам! ■ от общего количества меток (в #);

Ш - доля количества ядер в клетках с двумя я бол^е ядрами от общего количества ядор (в й.

.. При обработке ИОН клеток 1 -96, .чувствительных к ИФН, ш наб-|долв. снижение сиыпластообразовакия, индуцированного ПЭГ: ИМ и ПИ ж обработке клеток ИФН был достоверно .чине, чем в контроле,. При ¡работке меток .т -41, резистентных к ИФН, мы не наблюдали наш-нпй в симпластообразованик при его индукции П?,Г: ИМ л Щ ко и?« нялись достоверно. И лишь при-увеличении концентрации К$Н до 00 К2/мя з этой культуре были отмечены изменения в показателях ыпластообразования.

Таким образом, от чувстште.тьности меток к ИФН зависит их тивпрусная, антипрслиферативная и ЖН-продуц1грующая*способностл, особность ИФН 'защищать КМ от цитотоксического действия ЕС (кмму-модулирующая способность), и способность препятствовать образо-нил симпластов при индукции слияния с помощью ПЭГ (антнсЕмпиас-эбразутс^гя способность).

2.2.2. Характеристика ШТ-чувствительных и ИФН-резистентяых клеточных линий. Выявление возможных механизмов клеточкой резистентности к ИФН.

А. Наркологический анализ

3 результате проведенного анализа был изучен кариотин линий клеток с различной чувствительностью к ЖН. Полученные данные .позволяют считать, что для линий клеток со сниженной чувствительностью к ИФН характерно пренде всего уменьшение модального числа хромосом 'по сравнению с чувствительными к «Я?Н линиями клеток (табл.4).

Таблица 4 '

Культура клеток 1 Модальное число хромосом

Чувствительные к ®Н *Т—96 60

линии клеток ГН СО

Линии клеток со снижен- ¿г-41 5?

ной чувствительностью Z-2 53

к ИФН

Сравнение абсолютного и относительного числа пптактных и маркерных хрсмоссы в линиях человеческих клеток с различной чувствительностью, к ИФН показызазт, что модальное число хромосом в линия: клеток со сниженной чувствительностью к ИФН уменьшено за счет ив-такгных хромосом (табл.5).

..........1 Таблица 5

Линии клеток, чуз--ствительше к ИэН Линии клеток со сниженной чувствительностью к Ш1

J -96 ГН J -41 J -2

' ¡Абсолютное Интактвые ; число 4Л,7 44,9 37,6 30,1

хромосомы ! * 75,7 76 68,7 56,а

{'Абсолютное Маркерные \ число 14,7 15,1 17,1 23,1

хромосош ! а ! р 24,3 24 31,3 43,4

Анализ частоты встречаемости иктактных хромосом, которые предположительно несут гены системы ИЗН (хромосеж 2, 5, 6, 9, 10, II, [2, 16, 18, 21) показал, что в линии клеток со сниженной чувстви-еелъностью к ИФК-о( уменьшено число хромосом 2, 9, II, 12 и 21. Пс-видкмому, число копиЗ этих хромосом в определенной мере соответст-ргует эффекту дозы гена, проявляемому названными культурами клеток з отнопении продукции ИФК-о( и чувствительности клеток к КШ- оС . 1ля аналнза этого феномена было необходимо провести более деталь-. шЗ сравнительный цитогенетический анализ линий клеток ГЯ и J -95, ¡увстЕктельных к 1Ш, и линий клеток -7-41 и 3-2, нечувствительных с УШ. В результате этой работы б ил составлен реконструированный -.арг.отяп клеточных линий. В табл.6 представлены суммарные данные ".наляза хромосом системы 1йН исследованных линий.'

. По данным литературы, гены, отвечающие за продукцию ИФН- и

скорее всех'о локализованы в хромосоме 9, а отвечающие за продукцию ИФН-у - в хромосоме 12 человека. Кроме того, к продукции ¡£>Н-|2> человека имеют тэкко отношение гены, локализованные в хромо-юмах 2 и 5; эти гены, возможно, являются регуляторными; не. исклю-:епо также,.что они детерминируют синтез еще неизвестных голипепти-;ов И$Н-/Ь .

По. нашим данным, способность перевиваемых линий клеток ГН и '-96 вырабатывать ¡®Н понижена: эти клетки продуцируют в 16.раз ¡еныве 1®Н при вирусной индукции, чем диплоидные клетки. В то т гремя линия клеток . продуцирует. еще меньше ИФН, чем культуры -95 и ГН. Пр;т сопоставлении числа хромосом 2, 5 и 9 г исслздован-нх каш культурах клеток мы подтвердили роль хромосом 2 и 9 и не одтвердали роль х]>омосомы 5 в образовать Щ>Н клетками человека, нпжение продукции 1Ш в клетках о-41 коррелирует с уменьшением редкого числа иптактшгх хромосом 2 (4-1,3) и с относительно мень-шл количеством материала плеч этой хромосомы в реконструированном ариотипе ( р-2 ч-З). Среднее число этих хромосом в клетках ГН авпо 2,1 л в клетках <3-96 - 2,5. При этом число плеч реконструл-оваюатс хромосом 2 раьно р-2, о-4 и р-4, <1-4, соответственно, хо указывает, что еншзние продукция ИФН в хглетглх пербаяраеккх инкй по сравнению с диплоидной культурой г/эу.ст быть спазгпо не олысо с перестройка!®, зотрэгесетовля! хромосом 2, схо.тглсо с пару-ен:;ем баланса гепол системы ¡Ш, заинтересованны:-: в пролегай

При этом еще большее снижение 'способности резистентных клеток продуцировать ИФН при вирусной индукции уже, возможно, связано с эффектом дозы гена. Подобные же тенденции прослеживаются при анализе материала хромосомы 9 и продукции ИФН в этих культурах клеток..Если встречаемость хромосом 9 в клетках ГН и 3 -96 равна 2,4 и 2,6 соответственно, то среднее число их в метках «т -41 равно 1,7. При • этом количество коротких плеч, где, как известно, локализованы гены синтеза (р 13-^ег для ®Н-с( и р.2Р^ег для ®Н-^0) в клетках ГН г «т -96 (р-4 и р-3соответственно), увеличено по сравнению с клетками культуры J -41. Надо отметить, что делеция короткого плеча хромосомы 9 в клетках ^ -41 произошла в зоне, приближенной к месту локализации гена продукции И2гН-о^. Относительно хромосомы 5 в настоящее время мы не шжем подтвердить.на нашем объекте предположение о ее причастности к продукции ЮН; в исследованных вамп культурах клеток мы но нашш существенных различий в содержании интактных хромосом, а при реконструкции выяснилось, что по совокупному материалу дошнных (ч ) плеч втой хромосомы все 4 линии глоток примерно одинаковы. Что касается материала коротких (р) шюч, то в клетках с более высокой индуцибелыюстью (ГН и о -96) его не больше, а меньше по сравнению с двумя другими культурами. .

. Как известно, чувствительность человеческих клеток к АВ дей--ствшо ИФН детерминирована генами хромосом 21 и 16 для ИФН-с/^в и хро;,«сом 6 и 18. для ИФН-^. Исследоваяныа нами клетки отличаются по чувствительности к АВ действию ИФН-с(:. клетки J -96 в 4 раза, клетки. о-41 в 62 раза, а линия клеток -2 в 31 раз менее чувствительна к И5Н по сравнению с клетками ГН.

. Число хромосом 16, несущих гены, регулирующие выработку АБС при действии ИФН, ео всех исследуемых клетках почти одинаково. Но в малочувствительны;: к ИФН клетках J -41 и Х-2 резко снижено число хромосом 21 (1,5=0,3 и 11=0,0 соответственно; р > I, ? >2 и р-0, ч~1), где локализованы гены, кодирующие рецепторы для ИФН- с(/(8 • Эти результаты согласуются с известными литературными денными /Хе-СИН Я.Е. и др., 1979;СЬапу , 1976; СЬапу et а1. , 1975/. Но в противоречии с ними оказались данные относительно чувствительных к. ИФН-об клеток ГН и -96. Имея почти одинаковое соотношение хромосом 21/16 (для 1"Н - 0,6 и для Л -96 - 0,5) клетки а-96 оказа-

Таблица 6

Суммарные данные анализа хромосом системы И5Ш исследованных линий

юмера !- i ГН j J -96 "Г ! J -41 1— " i J -2

зомосом ! А {в ! А i в j ! A i в i A; ! в

2 Р 3 2,1 4 2,5 2 1.3 2 0,9

q 4 4 3 3

5 р 2 2,1 6 1.9 7 1.8 7 1.8

q 3 4 4 3

6 р 3 1,9 3 1.8 3 1.6 2 0,9

q 2 2 2 .1

9 р 4 2,4 3 2,6 3 1.7 2 1.4

q 3 4 3 2

I Р 4 2,7 3 2,3 2 1.6 2 1,4

q 4 3 2 2

■2 р 4 3,5 3 2,3 2 1.8 2 1.2

q 4 3 2 2 »

Б р 3 2,4 3 2,8 3 2,8' 3 2,1

q 3 3 3 3

в Р 2 1,4 3 2,2 2 1,9 2 1,5

q 2 3 2 2

:l р 2 1,5 2 1,5 I 0,3 - 0,0

q 2 2 2 I

римпчанле: А - число копий коротких (р) и длинных (q ) плач хромосом после реконструкции; В - частота встречаемости иитактных1хромосом.

сь и 4 раза мзкэа чувстетеельчнл! ЕТ>Н-<<^&, чем клетки ГН. ичипу этих протлюрочкЗ мы cKToKinj связывать с различиями в ко— чсство коротких плеч хромосомы 5. где, возможно, локализован н-гегулятор репресссра АВЗ ( АУШ ). В клетках ГН количества ротких плеч хромосомы 5 равно 2, а з клетках J -95 равно 6. Lin. а /1975/, исследуя гибридные клетки грызун-чело лс-х, сообщили о зкшюЯ локализация в порога?« плача:: 5 г<?яг.-^гудri-

pa репрессии АБС при действии г;лî-а'..'р.

Признавая, как и названные авторы, превентивность и косвенность наших данных, мы должны отметить, что они, несомненно, подтверждают регуляторное участие генов короткого плеча хромосомы 5 в выработка ABS при действии ИФН-о^.

Относительно кодирования рецепторов для ИФН- ^ в настоящее время известка заинтересованность в этом процессе хромосом 6 и 18 / Khesia , IS89/. Наши данные подтверждают, что гены, отвечающие за чувствительность клеток к ИФН-Jf, могут быть локализованы в хромосоме 18, а относительно хромосомы 6 мы не можем представить, убедительных данных. Исследованные нами.линии клеток почти одинаково чувствительны к AB действию ИФН- ^. Средняя частота встречав мости хромосом 6 в исследуемых клетках изменяется от 1,9 в клетка ГН до 0,9 - в клетках J -2. При этом.количество коротких и длинны плеч этой хромосомы сильно варьируют. Наблюдается четкая корреляция между чувствительностью исследуемых клеток к ИФН-^f и числом хромосом 18, и отсутствие такой корреляции между чувствительность: к ИФН-^ и хромосомой 6. Интересно отметить, что чувствительность клеток к ИФН-у в клетках культуры J -96. несколько выше, чем в др; гих исследованных наш линиях клеток (ГН, J -41 и J -2). Хотя такое повышение и не считается достоверным, нам бы хотелось отметить, что. и. среднее число хромосом 18 также несколько выше, чем в других линиях клеток. Случайны ли эти совпадения или наблюдается - строгая корреляция чувствительности к ИФН-^ с числом хромосом 18 (эффект дозы гена), в которых локализованы гены чувствительности клеток к ИФН-у, покажут дальнейшие исследования.

Б. Исследования на гибридах соматических клеток

Одним из методических подходов анализа причин невосприимчивости клеток к ИФН является изучение чувствительности клеток к Ш1 на гибридах соматических клеток. В этом аспекте появилась возможность связать гены определенных хромосом человека с чувствительностью клеток к ИФН. Наличие и исчезновение определенных хромосомных локусов генома человека в соматических гибридах мышь-человек одновременно с появлением или исчезновением чувствительности клеток к ИФН служит основанием для картирования этой функции.

Для получения соматических гибридов наш был разработан новый интерфероно-влрусный метод направленной селекции. Способ селекции

гибридов осуществляли следующим образом.

Родительские клетки скрещивают, выращивают на питательной среде до формирования мокослоя, состоящего из смеси родительски.:: и гибридных клеток, удаляют из культуралышх флаконов клетки сначала одного родителя, а затем другого и культивируют оставшиеся клетки до образования колоний. Для скрещивания используют интерфероночув-•ствительныо клетки родительских линий. Удаление родительских клеток производят путем последовательной обработки сначала ЖН, специфическим для однохю вида родительских клеток, и заражения цито-цидным вирусом, элиминируя таким образом родительские клетки дру-. гого вида, и далее, после отмывания культуры, внесением в лее КФН, специфического для второго вида клеток, заражением цятоцкдгшм вирусом, который элиминирует родительские клетки первого вида, в результате чего сохраняются лишь гибридные клетки.

В последние годы в экспериментальной цитологии выдвинулась . проблема создания клеток с заранее заданными свойствами. Мы предположили, что при селекции гибридных клеток с помощью интерфероно-в:грус;юго метода, особенно на начальных этапах, давление отбора должно быть направлено на сохранение вариантов гибридных меток с 21-й хромосомой человека, которая несет гены для рецепторов человеческого ШН-с(. Без функционирования этих генов невозможно создать в клетках АБС для обеспечения выживания гибридов в условиях действия цитодядшго вируса.

. Для гибридизации использовали линию мышиных клеток 1329 и ДЗЯ,' итами .4-19, Селекцию гибридных клеток, проводили, с помощью реаферо-на со специфической активностью 10®МЕ/мл и вируса везшеулярного зтоматитз (БЕС) с титром К^ТЩ^д/мл. При проведении предварительных. экспериментов по оценке степени видоспецкфичйости различных ■ЭН, оказалось, что рзаферон обладает высокой видоспгцифичностыо и ;е титруется на клетках мышиного происхоздения.

В результате такой селекции•нами первоначально был получен 51 . слен гибридных клеток мыт—человек. Два клона оказались неякзяеепо-•об\ипщ 7 клонов погибли при нервом пересеве, и 6 - па втором пас-:аже. Оетавшеся 36 клонов прошли от I до 6 пассажей, заморожены и гранятся в геадком азоте. Часть полученных клонов сохранила способ-гость вырабатывать АЮ в ответ на действие человеческого ®Н. Яти :лоек были подвергнуты онтогенетическому анализу. При окраске хро-юсем клеток одного из клоноз флуоресцентным красителем Хехст

25.

3325В мы выявили маленькую акроцентрическую хромосому,. которая не давала свечения в области центромеры. При анализе метафазных пластинок вышеуказанного клона с шмошыз Я - метода дифференциальной окраски была обнаружена 21-я хромосома человека.

Таким образом мы получили клон гибридных клеток Ш-51/8-1, в котором наряду с полным набором хромосом мышиных клеток Ь 929 обнаруживается хромосома 21 человека, несущая ген(ы) дая рецепторов человеческого ®Н. Указанный метод позволяет направленно выделять, соматические гибриды, в состав генома которых входят 21-я хромосома человека. Этим методом мы еде раз подтвердили тесную связь чувствительности к ШН клеток, человека с генами хромосомы 21. -

. Из всех изученных клонов только 6 (Ш51/Ю; ГК51/МА1; Ш51/4; Ш51/10АЗ; ГЛ51/8-1; 17,51/8-2) сохранили способность вырабатывать АН? при дейстнии Ж&Н-сч. Четыре из этих клонов мы проверили на способность вырабатывать АЗС при действии ИФН-^ . Данные титрования представлены в таблице 7.

. Таблица 7

Чувствительность клояоп мыггь-челоЕек к ИФК-гб и ИФН-$

Название клона | Титр. И«Н-с(. | 1 Ед/мл ) ? ! Тмтр ЙФН-* Ед/мл Чувствительность клеток к

ИФН- •! ИФН- X

ГО51/8-1 320 0 +

Ш51/3-2 5120 1С + +

Ш51/ЮА1 2000 0 + - '

ГК51/10 400 0 + --

. Как видно из таблицы, только один хз клонов, а именно ГЛ51/3-2. оказался одновременно чувствителен к человеческим ИФН-сб к ИФН-^ .

Кдон 1151/8-л был подвергнут длительному пассированию для определения возможности элиминации хромосомы 21 и утраты чувствительность клеток к КФН-с* . Через 16 пассажей указанный клон потерял чувствительность клеток к ИФН. Цитогенстический анализ показал отсутствие хромосома 21 в кариотияе клеток клона.

Несмотря на то, что гены, кодирующие рецепторы для ИФН-/ локализованы в длинных плечах хромосомы 6 и (или) 18, накапливаются

ханные, согласно которым хромосома 2I тоже необходима для клеточ-юго ответа на ИФН-^ ./ ^¿ш; еЪ а1. , 1987; Ьгг^ег et а1. , 1989/. ! помощью кптер^ероно-ЕирусЕого метода сзлекции мы выделили ряд слонов мышь-человек, чувствительных к КФН-с(. человека к несущих . фомосому 21. При анализе этих клонов мы выявили один - ГИ5Т/8-2,. юторый оказался чувствительным к человека: последний зяцп-

:ал гибридные клетки от цнтопатического действия ВВС. Несмотря на ложность и предварительность такого рода исследований, нам представляется, что эти дашше могут указывать на существование з штатах клона Ш51/8-2, кроме 21-й хромосомы, ве идентифицированного, ими хромосомного материала клеток человека, в котором расположен гены, по-видимому, определяющие совместно с генами.хромосомы 21 увствителькость клетсчпто: гибрядол к КФН-^ человека. Таким обра-ом, этими исследованиями мы указали на роль генов хромосомы 21 эловека в механизмах, обеспечивающих рецепция ИРНов разшх типов летками человека. Также здесь была продемонстрирована возможность зучекия механизмов клеточной резистентности к ЙФН с испояьзова-гем гибридов соматических клеток.

В. Мембраны клеточной поверхности и высокоспецифическяе рецепторы

Поскольку различия 5 реакциях клэтск при обработка ШН могуг иь связаны также с особенностями сигналов, поступающих с мембран теток, нами было предпринято изучение состояния клеточных мембран чувствительных и резксг-ентных к ИФН вдетках после их обработки Я!.. Используя сканирующую электронную микроскопию, нам удалось гявить, что посла обработки ИФН-оС чувствительна: к ИФН клеток . •96 происходит отчетливое уменьшэние количества и длины иикровор-[нок прн- сохранении относительно равпомершго характера их расп-деленля; в резистентных клетках <-т -41 изменения клеточкой говер-юсти на выявлялись. . Поскольку действие ИФН на клзткн инициируется его сьяуывзки -со специфическими рецепторами датоплазмытичвской мембраны, <5ц-исследовано число рецепторов и харектермстихя их связывания с в культурах клеток ¿-96 и <т-4"1.

Полученные данные' суммировзли^на рис.3. Для определения уров- ■ неспецифкческого связывания была использована куль-

Рис. 3 Кривые насыщения клеток после 2.5 пас. инкубации с [1251]-ИФН-аА при 21°С.

Каждая точка представляет среднее значение трех экспериментов. По оса абсцисс - концентрация введенного [l2iI]-ИФН-аА в МЕ/мл х 103. По оси орданкт - ['^1)-ИФН-сА, слязаишайся с клетками в имп/мик х !03.

Условнее обозначения: □ - J-9£>, О - J-41, V - ФКЭ.

тура фибропластов.куриного, эмбриона (ФКЗ), резистентная к действи человеческого ИФН. Насыщение клеток J-S6 ( I) -ИФН-с{А в условия кксперимента наблюдается при 860 МЕ/мл ИФН, в то время как го характеру связывания ИФН клетки J -41 не отличались от культуры ЕСЭ Из этого следует, что клетки J -41, по-видимому, лишены шсокоспе цифичгских для ИФН-оС рецепторов.

Таким образом, резистентность сублинии J -41 к ИФН~о( ,. по-, видимому, связана в первую очередь с отсутствием високоспецифичес' чих рецепторов для ИФН-cL

Г. ИнтерфероЕ-иццуц-ибельные ферменты

После Бззллюдейсиия ИФН с рецепторами клетки происходит индукция ряда ферментов - ¿>-5А оинтэтазы н цА!Ф-зависимой ПК /Bevel et еХ., 1960; Johnston, Tcrrence,1484 /. Увеличение активности

этих ферментов принято связывать с АВ и АП действием ИФН /LebXen, Content i 1982/. 2-5А синтетаза, находясь в комплексе с дсРНК, по-лимеризует АТФ в олигоаденилаты (2-5А), которые активируют специфическую рибонуклеазу, РНК-езуЬ . Такая активация приводит к усилению процессов распада мРНК в клетке и как следствие к снижению скорости клеточного размножения п подавлению вирусной инфекции. Ми попытались выяснить, различается ли активация этих ферментов в клетках с различной чувствительностью к ИФН (табл.3). Как видно из таблицы, индукцию 2-5А синтетазы ИФНом можно вызвать в чувствительных к ИФН линиях клеток M-I9, ¿-96, 1929. В резистентных к ИФН линиях клеток J -41, J-2, ШВ яри действии ИФН нэ происходило индукции 2-5А синтетазы. Следует отметить, что исходная конститутивная активность 2-5А синтетазы в культуре J-4I в.2,5, а в культуре J -2 примерно в 3 раза выше, чем в клетках J -96. В резистентной к ИФН линии клеток МЗВ исходный уровень активности 2-5А синтетазы примерно в 5 рзз выше, чем в клетках 1929. Возможно, что утрата чувствительности к ИФН названными вше клетками сопроподдается ростом активности этого фермента до значений, которые в исходной культуре достигаются только в присутствии индуктора. Мы провели также определение цАШ-зависимоЙ ПК в культуре клеток J -96 и ее сублиниях J-4I и J-2 (табл.9). Показано, что в резистентных суб-липиях J-4I и . J-2 активность аШ&-зависимой Ж примерно в 3 раза выше, чем в чувствительной культуре J-96. Здесь прослеживается корреляция в изменении уровней активности цАМБ-завиоимой ПК И.2-5А синтетазы в чувствительных и резистентных к ИФН линиях клеток. Ранее на культуре ЮТ ЗТЗ / Itliea et al. ,1985/ было показано, что при выходе клеток в период 60 происходит одновременное и непрерывное нарастание активности 2-5А синтетазы и ПК. Возможно, что повышенная активность 2-5А синтетазы, наблюдаемая в нечувствительных к KSH клетках, связана с индукцией данного фермента за счет пАШ-за-висимого фосфорилирования. Тогда невозможность индукции 2-5А синтетазы ИФНом в ИФН-с(. резистентных клетках может быть также обусловлена высоким исходным уровнем активности данного фермента; т.е. ивдукция этого фермента уже произошла и его дальнейшая активзция не монет привести к усилению наблюдаемого эффекта. Такое объяснение является, безусловнр, гипотетическим.

Таким образом, изучение ряда ИРКЛ позволило установить, что

Таблица 8

Активность 2'-5'-олигоаденилагсинтетазы в клеточных культурах при действии интерферона

Культура ¡Активность 2-5А сиьтетаз»_нмоль/мг/14 час

клеток ! конттоль ! Ье XPN ! Rs IPN-o(2

' M-I9 1,2 36,5

гн 9,1 8,1 -

J-96 1.6 7,9 8,2

J -41 3,5 5,7 4,0

■ -J-2 4,6 6,2 5,0

1.929 2,1 6,1 -

ШВ 10,1 12,9 -

Таблица 9

Активность цАШ-зашсимой протэинкинаьы в культурах человеческих клеток, чувстзительшх ( J-96 ) и резистентных ( J-41, J-2 ) к ИФН

---1-—т-1 . ........

. Культура } Включение ^т? ) Относительная

меток j имц/шц/100 мкг белка j активность

1,0

з,ь

2,9

Примечание: * 1000 имцДшы/IGO мкг белка соответствует 1,7 кшль АТР

нечувствительность клэток к ИФН мокет быть связана с гоне<"гаескпмк изменениям! в к&риотипе (уменьшение числа 21-х хромосом стация ь гене ИФНРец), ц как следствие с исчезновением высскоспецифа-чес;^х рецепторов дли ИФН или нарушением в структуре ИФКРец, нарушением проведения ИФН-сигнала к изменениями в клеточное метаболизме .

2.2.3. Роль ингибиторов действия ИФН в нечувствительности клетск к Ж?Н

Чувствительность клеток к КФН в известной морз монет опреде-

J - 96 .Т-41

5960 21040 17300

ляться но только генами ИФНРец, расположенными в хромосома 21, но и генами, ивдуцируемтя при действии ИФН - так называемыми ИФН-сти-мулпровэнными генами (ИСГ). Колебания в чувствительности клеток к ИФН такяе зависят от физиологического состоялся, определяемого условиями культивирования п от ряда иных фенотишзчвсккх факторов.

. Ряд вирусов индуцирует выработку так нззнваемых ентагошстов . ИФН, которыо препятствуют выработке АЮ поело обработки клеток ИФН. В натнвных препаратах ИЗН были обнаружены вещества о молекулярной массой менее. 10 КД, которш являлись антагонистами противовирусного действия КФН, не влияющими на его продукцию. Эти вещестг-а были, названы ингибиторами.действия ИМ (ИДИ) /В.И.Марченко и др.. 1975; В.Д.Соловьев ц др., 1931/.

. , РТе1£ог а1. /1939/ пош.г-рлц тесную связь резистэнтности почечной карциномы к АЛ действии 7Ш не о числом клеточных поверхностных рецепторов для И5Н- с(., а с экспрессией в этих клетках поверхностного антигена ер160. СЫшу а!../1939/ последовали антагонист №Н - сарколеккш: болок 60-65 КД, который агглютинирует клетки и имеет аффшштет я простым сахарам. Сарколехстин подавляет ' синтез 2-5А синтотазы п цЛ!.!3-зависимой протеинкиназы, что приводит> ; к восстановлению физиологического статуса клеткя. посла действия И2Н и,, по-видимому, обусловливает временную невосприимчивость к АВ п АП действию И5Н. Нага'был выявлен еще один путь развития резистентности к И5Н. [¿I проворили зозшянссть иццукцки ИДИ в различных спс?"!.т;г: при сокультзЕтроЕашш. клеток, при добавлешшв качестве, ица,. ИДИ вирусов (ЕБК, ВВЗ), цра добавлении некоторых герма-нийэрганических соединенвй (которые былп Ьам предоставлены М.А.Иг-натенко). Полученные дзпныэ представлены в таблицо 10.

Продукция ИДИ в различных системах: нлеткв + аддуктор

Клетки + индуктор

24 час

Тита ИДИ \Ш/ыл 1-

I

72 час

ШВ + ЕБН ШВ + ВВС ШВ +■ ЮП-83 И937 + ШП-33 ШВ + Н9

8-16 16-32

8 16

Как видно из таблицы, ИДИ, выделенные из культуральнсй среды клеток ШВьНЭ, имели титр 32 ИИЕ/мл, титр ИДИ при обработке клеток ВВС или ■ ВЕК находился з пределах S-I6 УШ/im. Среди германийорга-нкч.еских соединений - МОП-II, МЭП-80 и ЮП-83 только ШП-83 обладает способностью индуцировать ИДИ в клетках ÎCB и 0937, нечувствительных к ЙФН. ИДИ появлялись в культуралькой среде лишь через 72 час индукции. Следует отметить, что в экспериментах по индукции ИДИ мы использовали в качестве обрабатываемых клеток как чувствительные (MI9, J -36, ГН, Н9, Ь92Э, лимфоциты человека), так и нечувствительные к ИФН клетки (ХВ и U937). При Еццукщзи ИДИ секре-' тировалась лиеь е последних. Не .было стмечено индукции ИДИ через 96 час после введения индуктора.

По-видимому, выделение индивидуальных ИДИ, их очистка, конструирование с помощью методов рекомбпнаятных ДНК генов для ИДИ и изучение их регуляции монет привести.к созданию новой группы пре-' паратсв - регуляторов активности ЙФН. Нами была проверена способность ИДИ регулировать активность ЕХ человека* Как было сказано в кие и в соответствии с хорошо документированным эффектом И5Н на КМ, чувствительные к действию KHK в реакции ЕЦТ, КЖ сншгал в 2,2 раза (Р 'С 0,05) лизис КМ 1929 при инкубации последних с МНК человека, обладающими Ж-актпвнсстьв (рис.4). Обработка КМ ИДИ не изменяла цитотокскчшсть ЕК, что наблюдалось и при действии на КМ комбинации ИФН с ИДИ. Следовательно, ИДИ, активность которых определяется в отношения ЛВ эффекта УШ, отменяют протективное действие последнего на КМ линии &S29,. обладающие выраженной чувствительностью к йЗН и ЕК-опосредованкому цитолизу, .что свидетельствует о наличии у ИДИ иммуноругуляторных свойств. При использовании з 'качестве КМ клеток резистентной к AB действию ИФН линии LEB от-ме)ш протективного э(£фек?а ®Н в реакции EUT при обработке КМ ИДИ зарегистрировать не удалось. Как показано на рис.5, ИФН, ЦДИ, а такно комбинация ИФН о ИДИ обладали однонаправленным действием на чувствительность КМ Ж В к ЕК-опссредс ванному цитолизу.' Во всех трех случаях отмечалось снижение активности ЕК, соответственно в 1,7 (Р < 0,05h в 2,1 (F <0,05) и Е 1,9 (Г < 0,05) раза.

Следовательно, ИДИ, вырабатываемые в ответ на индукцию И5Н, обладают выраженными регуляторкыш свойствами в отношении активности ЕК ь условиях предварительной обработки ими 1Ш. Регулирующее

К 1 2 3

Рис. 4. Действие ИФН (1), ИДИ (2) и их комбинации (?) на чуисгвк-тельность KM LgI9 к ЕК-опосредоваиному цитолизу (ЦИ <%), M±t). Соотношение Э:М - 100:1. По осв ординат - ЦИ, %.

К - контроль, штриховка - р<0.05 по сравнению с контролем.

К ,1 2 3

Рис. 5. Действие ИФН (I), ИДИ (2) и их комбинация (3) наЧувстви-тельпость КМ МСВ к ЕК опосредованному цитолизу !ЦИ(%>, M±t). Соотношение Э:М - 100:1. .. По оси ординат - ЦИ, %.

К - контроль, штрихрвка - р<0.05 по сравнению с контролем.

- действие ИДИ на КМ в реакции ЕЦТ зависит от их чувствительности к. АВ эффекту ИФН. ИДИ функционируют как .регулятор действия ИФН и отменяют протективное действие ИФН на клетки высокочувствительной к нему линии Ь929, и функционируют как ИФН, в определенной степени предохраняя КМ резистентной к ИФН линии ШВ от ЕК~спооредова иного цитолиза. При этом обе исследованные лиши КМ обладают высокой чувствительностью к лизису в реакции ЕЦТ.

2.2.4. Коррекция чувствительности клеток к интерферону

Р хода изучения клеточной резистентности к ®Н постоянно возникал вопрос о возможности коррекции клеточной чувствительности к ИФН при различных нарушениях системы ИФН. Оказалось, что существует простой способ повышения клеточной чувствительности к КФН с помощью обработки клеток высокими концентрациями ИФН-с(. Такого эффекта добились Dron et al. /1986/, которые обрабатывали нечувствительные к ЮТ клоны клеток Дауди высокими концентрациями ИФН. В отличие от клонов, используемых для этой цели Dron ot al. /1986/, наши клотки J-4I практически т имели, высокоспецифических рецепторов для ИФН-о(. Как видно из табл.11, нечувствительность .клеток J -41 к ИФН может быть преодолена при обработке клеток ИФН, концентрация которого в 128 раз выше концентрации, необходимой для . выработки ЛЕС в чувствительных к ИФН диплоидных клетках человека.

. Таблица II Преодоление нечувствительности клеток к ИФН концентрированными препаратами интерферона

Культу-pa клеток Титр ИФН Ед/мл ¡Минимальное -»-количество ¡КФН, необходи-;мое для выра-¡ботки АБС ¡(в относ.ед.) Число высоко-специфических рецепторов для ИФН на клетку

Катив- ¡Кокцент-ный ¡рирован-ИФН ■ ;ный } ИФН ¡Ипъекци-ИФН 1

М-1'9 256 8192 РЮ6 I не опр.

J-96 32 1024 . 1,25'Ю5 8 210+90

J- 41 2 64 8,0« J.0S 128 0.

Эти данные свидетельствуют о существовании альтернативных механизмов включения ИФН-спецнфических клеточных реакпий, минующих вксо-косшцифическио клеточные рецепторы для ИФН. Вполне возможно, что

этот эффект связан с пиноцитозом низкоаффинннх рецепторов для ИФН.

Ещо один способ коррекции ИФН-резистентнссти был указан ?leig-chmann and Pleischmann /1989/, которые преодолевали резистентность к АЛ действию КФН-сС с помощью предобработки шинной меланомы BI6, а также клеток меланомы человека ИФН Y' ¿BT°Pb[ предполагают, что ИФН-J' можно использовать, чтобы предотвратить или реверсировать чувствительность опухолевых клеток к ИФН в клинической практике. Кроме того, lewis et al. /1989/ удалось с покорю комбинированной обработки УШ~р> и - у клеток Ltk-aart- , нечувствительных к АЕ действии ИФН-/1 и - у порознь, преодолеть их резистентность к АВ действия ИФН. Этот эффект удавалось осуществить при использовании да^е низких концентраций обоих типов ИФН. Б НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи М;А.Игнатанко получила германийорганическое соединение, которое индуцировало УШ-jf и обладало выраженной и'.муномодулирукщей активностью. Обрабатывая этим соединением клетки J -41, мы смогли преодолеть их резистентность к АВ действию ИФН-(Х,. Предобработка клеток препаратом ШП-05 повышала чувствительность клеток М-1Э к И5Н-о( в 8 раз и клеток J -41 - з 4 раза. ПЬ-еэдимоку, при действии германлйорганического соединения - индуктора КФН-^ , :сак и при,, действии самого ИФН-JÍ, происходит активация дополнительных групп генов и индуцируется синтез белков, хомплементируетих дефектность метаболических путей для ИФН-с(, что. и обусловливает выработку клетками ABC в ответ на действие ИФН.

Основываясь па проведенных исследованиях, мы провели первичный скрининг среда препаратов-ивдукторов ИФН, чтобы попытаться вы-ясгшть их возможность изменять клеточную чувствительность к ИФН.. В табл.12 представлены данные изучения препаратов различного про-нсховдешя, которые изменяли клеточную чувствительность к АВ действию ИФН-oi.

Таким образом, в результате были отобраны соединения, способные повышать чувствительность клеток к ИФН-G^ (кагоцел, ларифак» ридостин, ШП-35), а также понижать чувотгительнесть клеток к ИФН С ME—2, ЮП-76) вплоть до полной резистннтнг.сти (МОП-79),

Таблица 12

Изменение клеточной чувствительности к АВ действию ИФН-<С с помощью препаратов различного происхоздения

Препарат | .'Концентрация 1 мкг/мл — -- Изменение клеточной чувствительности к ИФН повышение + | понижение - ! по отношению ! к контролю Культура клеток

Кагоцел 250 + ' 26 1.929, ЬСВ

Рагосин 250 + 2 .1-96

Ларифан 100 + 16-250 «Г-96, J -41

Ридостин 100 + 32 .г-96

Полигуацил 1-100 + 4 «-96

МОН-35 . I + 4-8 К-19, ^96^-41

Г,£-2 Г-ЮО - 4-16 М-19, ,7-96 „7-41

М0П-76 1-10 - 4-8 1,929

МОП-79 100 — клетки приобретают 1,929

резистентность к ИФН -

МОП-83 1-100 - 2-4 И-19, ¿-96

РР 200 - 8 ог-эб

+ 4 а-4Г

Дх 200 - 32 а-96

+ 4 о-41

2.2.5. Возможные механизмы клеточной резистентности к ИФН

Изучение клеточной резистентности к ИФН тесно связано с исследованиями механизмов действия ИФН. Аномалии или дефекты в сети ИФН-ивдуцированных метаболических путей приводят к возникновении различных проявлений клеточной нечувствительности к ИФН. Тем не менее, в настоящее время становится ясным, что чувствительность клеток к ИФН определяется тремя основными компонентами: I) компонентами генома клетки, отвечающими за кодирование рецепторов и многообразных клеточных реакций при действии ИФН; 2) целостность« метаболических путей, индуцируемых при действии ИФН; 3) наличием в клеточных мембранах рецепторов для ИФКов и возможностью их нормального функционирования. Мы попытались представить известные в

шстоящее время данные по взаимодействию различных компонентов слетки при действии ИФН на рис.6.

Функционирование зысокоспецвфических рецепторов для ИФН определяется геном (генами) ШНРец. Отсутствиз генов КФНРец, или нару-¡ение в сястоме передачи информации с генов КФНРец до синтеза де-япштизного рецепторного оелка может привести к невозможности вы-окоспеяифического взаимодействия молекул ИФН с рецепторами. Сни-:&1жэ чувствительности клеток к КФй в этом случае мояет быть свя-апо как со снижением числа внсокоспецифичесшх рс-цептороз для ®Н а клетку, так и с нарушением специфического взаимодействия и нэ-озмсеносты) дальнейшей передачи ИФН-сигнала на шлсележащие струк-уры. В исследованных нами КФН-резистентных клетках Д-41 вксоко-я'йцнфаческие рецепторы для ИФН-о(. отсутствуют вследствие нарушена в количестве и структуры хромосомы 21, гены которой кодируют оцепторньй белок для ИФН з клеточной мембране. По современным редставяениям невозможность проведения сигнала с рецепторов мскет ять такзе связана с отсутствием высоко аффинного взаимодействия элекул ИФН с рецепторами, нарушением в образовании и накоплении тгзяд-реценторксго комплекса в окаймленных яжах и нарушением прс-»'' зссов интернализацим ИФЕ-рецепторного комплекса. Однако, пока не зон вхслад каудого из названных вше лроцеееоз в генерирование :гнала. После формирования ИФН-рецепторного комплекса и его акти-5ции генерируемый сигнал поступает на постоянно присутс.твусдгй в ¡топяазме в латентной фор?« так называемый КФН-етимулироБгтгкй ¡нный фактор - ИС1Ф /тап^гисЬ! ег аХ. , 1991; зи^к вt а! ,1591; .Пег et за. , 1991/, который активизируется (на-схеме обозначе-| звездочкой) и направляется в ядро, где связывается с К'ЗН-стиьу-;рованны».и регулирующими элекеш-ами - »'03. Бсзнжковехше дефектов I любом из указанных этапов приведет практически к полной нечув-вителькоо.ти клеток к эффектам данного типа М>Н. Так, например, ко белок Е1А аденовируса 5-го типа полностью ингкбирувт активацию сеятюго фактора КСП> /' Сагу а*, аХ. , 1991/, что приводзт к суп-ссии ивдуюши транскрипции ИСГ. Активация ИСЭ ПрЯВОДЕТ к иедук" и транскрипции ИСГ. Как видно из схем« на рис .6, индукция ЙОГ кводит к формированию целой сета реакций, обеспечивающих много-рвзше эффекты ИФН. Стации, приводящие к дефектам того шш . . ого ИСГ или элиминация одного, нескольких или большинства ИСГ иводкт, естественно, к той иней степани резистентности юсе-

Рис 6. Возможные механизмы клеточной резисгентссти к интерферону (схема).

ток к действию ИФН. По-видимому, на этом этапе возможны различные варианты.комплементации данного дефекта через сеть метаболических путей (дсРНК-зависимые и независимые пути, метаболизм триглицери-дов, фосфолшшдов, глиголипидов к кирных кислст) II тем самым, в какой-то степени, компенсации или "сокрытию" данного типа клеточной нечувствительности к ИФН.

Однако, клеточная невосприимчивость к ИФН мояет возникать не только вследствие тех или иных дефектов метаболизма. Известно, что существуют так называемно ингибиторы действия ИФН (ИДИ) /В.И.Марченко И др., 1975; ТЬасохе , 1976; ЦЬапу-Рошя1ег вЪ а1. , 1990/. > Следовательно, должны существовать гонб, кодирующие, подобно генам ИФН-¿1, целое семейство ИДИ. Как ;.-лдно на предложенной схеме Дрио.6), приложение действия таю..х ЩЩ может быть в достаточной мере разнообразным (на схеме - 1, и, Ш, П, У). И на каждом из этих участков ИДИ могут обеспечивать различные механизмы клеточной невосприимчивости к ИФН и, следовательно, тонкую регуляцию клеточных реакций. Выявленные ингибиторы, как было сказано выше, отменяют клеточную чувствительность к АВ действию ИФН .., однако сохраняют АЛ эффект ИФН. По-видимому, эффект этих ИДИ связан о этапом,.--обозначенном на схеме как С; на. этом этапе, по-видимому, прерывается транскрипция генов, экспрессия которых обеспечивает защиту клеток от вирусной инфекции. Известней антагонист ИФН - сарколек-тин / Оюну , 1990/ по нашей схеме действует, по-видимому, на этапе П и Ш и. отменяет не только АВ, но и АЛ эффект ИФК й переводит клетку из фазы 60 в фазу активного синтеза (3 ). „ Представленная схема обеспечивает основу для_ понимания возможных мехапизмов коррекции клеточной, чувствительности к ИФН. Снижение чувствительности клеток к ИФН обеспечивают препараты, подавляющие экспрессию ИСГ, блокирующие метаболические пути, активируемые после экспрессии ИСГ, а также препараты,. нарушающие матричную функцию генов ИФНРец, препятствующие связыванию ИФН о Еысокоспеци-фяческими рецепторами и проведению ИФН-сигнала до ИСЭ. Такую функцию выполняют, как уже говорилось кие, различные НЩ1, а также, возможно, германийорганические соединения ЮП-76, МОП-79, МЕ-2 я др., которые могут обладать способностью блокировать функцию ИСГ. Подобный эффект был достигнут ТЧогисс! et «а. /1991/, которые использовали гемин для специфической ингибищш АБС, индуцированного' ИФН-с^/р. По данным названных авторов, после обработки клеток ге-

миком не определялась эктиепость ПК57К и 2-5А синтетазы, что свидетель CTEJT3T о влиянии гемина нз функциональную экспрессию ИСГ. Такого же эффекта добились Sichu et al. /1991/ с помощью получен-ього из грибов препарата брефелдина А. Этот препарат также блокировал активность ЕК67К и 2-5А синтетазы и, следовательно, влиял на блокирование клеточного метаболизма на стадиях, указанных на схеме стрелками 1У-У.

Другой аспект приложения проблемы коррекции клеточной чувствительности к №2Н связан с индуцируемым теми или иными препарате!«; увеличением чувствительности клеток к эффектам КФК. Использованные препараты М0П-Б5, кагопел, ларифан являются индукторами Ш1 я вместе с тем увеличивает клеточную чувствительность к АВ эффзктэы ИФН-v-([i> Нам представляется, что такоо увеличение клеточной пувот-зитедъдасти к ИФН может быть связано как с облегчением.проведения ИФН-скгнала до МПЭ, так и о усилением транскрипции ИСГ.. Пстошма-ция аВ дейс-теия ИШ наблюдаюсь также Pouillart et al. /1391/, которые использовали мураметид (препарат является иммупомодулятором и относится к группе мурагшшептидов) для повышения чувствительности клеток к А13 и АЛ действию ИФЕ. Повышение клеточной чувствительности к ИФН, по-видимому, может быть связано и с генами-усилителями действия ИФН, что не противоречит предлагаемой схеыэ. Pins /1991/ считает, что экспрессия генов И01Ф может обеспечивать "бесперебойный-механизм облегчения" приобретения клетками АБС, индуцируемого с помощью ИСГ без участия ИФН.

Такое предположение не липово основания, поскольку активация ИСГФ сама по себе без участия ИФН должна привести к экспрессии ИСГ и запуску ИФН-индуцпрованкых клеточных реакций.

Наконец, необходимо отметить, что повышение чувствительности клеток K íSH или восстановление утраченной клеточной чувствительности к ИФН может также обеспечиваться связыванием ИДИ иле подавлением экспрессии генов ИДИ.

В заключение хотелось бы еще раз напомнить, что далеко ко все вида клеток, даже в пределах одной клеточкой популяции, обладают-одинаковой чувствительностью к МП. Наличие нечувствительных клеток a определенно'': с.тепот преплте-тщет проявлен™ разнообразных (антивирусного, антипролиферат^вногл, иммудомодуллруъае.т'о, радго--протективного и др.) эффектов К5К* Нарушение клеточной рецепции Kï>K, аномалии з биохимических реакциях, опосредующих специфическое

действие ИФН, или нарушение экспрессии некоторых ИСГ может лечь в основу невосприимчивости данной популяции клеток к тому или иноцу эффекту ИФН. По сей день остаются неясными многие аспекты резистентности клеток к ИФН. Мэзду тем, выявление причин резистентности клзток к ИФН имеет большое значение для понимания тонких меха газ--шв регуляции клеточных реакций.

ВЫВОДЫ

1. Перевиваемые-линии клеток значительно варьируют по чувствительности к антивирусному п снтйнродифпрагавному действию интерферона у. могут быть подразделены на: а) высокочувствительные линии; б) линии со сниженной чувствительностью; в) линий' с япзкой

"чувствительностью; г) линии клеток, полностью нечувствительнее к интерферон; д) линии клеток с избирательной чувствительностью либо к агсгипролифорвтивному, либо к антивирусному действию интерферона. Примером таких линий-в наших исследованиях являются: а) !.:-19, ГН; б) J-96, СЕЛ, 1923; в) J-4I, J-2; г) J-4IR, U937; д) Н9, L1T4, 1,'ОЬТ , ШВ. - .

Механизмы проявления антивирусного и антипролиферативного действия интерферона в разных клеточных линиях могут различать" . ся.

2. Один из генов, определяющих чувствительность клеток человека к альфа-интерферону (ген ИФЕРец), галализован в длинном плече . хромосомы 21 человека,. что доказано с помощью, нового разработанного автором кптерфероно-вирусЕЩ'о метода селекции гибрид. них клеток,

3. Патогенетическими методами подтверздено участие генов хромосом 9 и 12 в продукции клетками ИФН-с*. и - у соответственно, генов хромосом 21 и 18 в чувствительности меток к ЖШ-сх. к » соответственно, генов хромосом 2, 5, II, 12 и 16 - в регуляхни

. системы ®Н.

4. В резистентной к ИФН-еС я^кчи клеток человека .7-41 отсутствуют ькоокосяецкфическиэ рецептора для ИФН-С. человека. Однако, указанная линия клеток становится чувствительной к V№II— оС человек при ее jобработке высокими ( > 1000 MS/глл) кошентрпциями ИФН. Предполагается существование альтернативных меха:-жз№в включения КФН-специфических клеточных реакций, минуя йнсокоспйцифи~ ■

ческие клеточные рецепторы для ИФН.

5. С феноменом клеточной резистентности к ИФН связаны исходный конститутивный уровень активности 2'-5'олигоаденилатсинтетазы и гиШ^-завксииои протеинкиназы, а также способность этих ферментов активироваться в клетках при действии ИФН.

Высокий конститутивны? уровень активности 2'-5'олигоадеш1-латсшггетазп наблюдается как е чувствительных, так и в резистентных к КФН-с( клеточных линиях. В обоих случаях обработка клеток ИФЯ не влечет за собой дальнейшее нарастание активности этого фермента. Следовательно, реализация аффектов ИФН-сС.может . осуществляться, минуя систому 2'-5'олигоадеш!латсинтетазы.

6. Подтверждена способность ИФН-сХ. защищать ИФН-чувствительные клетки человека от цитотоксичоского действия естественных киллеров. Отмечено отсутствие ьротектквного действия ИФН- к лизису естественными киллераш ИФ1;-резиотентиых клеток-мишеней: обработка ИФН-о( резистентных клеток повышает цитстохсическую активность естественных киллеров против клеток-мишеней.

7. В резистентных к ИФН-сИ метках с помощью вирусов, ксекогенных клеток и германийорганических соединений возшнка индукция ингибиторов действия ИФН. Ингибиторы действия ИФН отменяют антивирусный и иммунодадулатрующий эффект ИФН и обладает собственным анткмитотическим я антипролзгферативным эффектом, йиасте с тем, ингибиторы действия ИФН обладают выраженными иммунорегуляторны-ми свойствами в отношении активности естественных киллеров в условиях предварительной обработки ими клеток-мишеней. Регулирующее действие ингибиторов действия ИФН на клетки-мишени в реакции естественной цитотскскчности связано с чувствительностью клеток

' к антивирусному действию ИФН. Предполагается существование се. мейства ингибиторов действия ИФН.

8. В линиях клеток как чувствительных, так и резистентных к ИФН оказалось принципиально возможным целенаправленно изменять клеточную чувствительность или резистентность к ИФН с помощью различных воздействий (интерферонами разных типов, интерлейкинами, индукторами ИФН, ингибиторами действия ИФН, герма кийорггничес--ким* соединениями, соединениями изопренсидного ряда, сокультн-вировапием с ксенсгеннымя клетками).

5. Из числа биологически активных соединений, влияющих на функции

системы ИФН препараты кггопел, ларифап, ридсстян, 1.ЮП-35 способны повышать, а .препараты МЕ-2, M0II-76, ЮП-79 - понижать . . чувствительность клеток к ИФН.

). Предложена рабочая схема участия различных компонентов клетки в резистентности к ИФН; эта схема может служить основой для . понимания тонких механизмов регуляции клеточных регкций, связанных с системой ИФН.

Материалы диссертации доложены на: , Всесоюзном симпозиума "Защитные механизмы естественного, приобретенного к постваишкального противовирусного иммунитета", Ленинград, IS78.

71-ом мегрегионэльном симпозиуме социалистических стран по интерферону» Львов, 1980.

Ш-ей Всесоюзной конференции по лг то лепта клетки, Москва, 1932» УШ-м региональном симпозиуме социалистических стран г.о интерферону, Добсгоко» 1984.

Всесоюзной конференции "Итоги и перспективы теоретических и практических.(клинических) исследований по проблеме интерферо-. на", Тбилиси, 1985, ....

Еаучко-црактическей конференции "Эяидемислогия, диагностика и профилактика вирусных инфекций", Свердловск, IS85. Московском обществе испытателей природы, Москва, 1385. Московском обществе цитологов, Москва, I98S, 1390. П-м Всесоюзном симпозиума по "Биологии клетки в культуре", Ленинград, 1987. |.П-й Всесоюзной конференция по инфекционной иммунологии, Сара-тон, 1987.

:.ХУ-й Всесоюзной конференции по патологии клетки, Москва, 1387. !.Х-м региональном симпозиуме социалистических стран по интерферону, ¡Ориала» IS8S. (.Международной конференции по интерферону, Ленинград, 1990, :.УШ-м международном конгрессе по вирусологии, Берлин, 19S0. |.10-й конференции Европейской федерации иммунологических об. аесгз, Эдинбург, I9S0.

^.Пленуме проблемных комиссий "Теоретическая м прикладная знфек-ционная иммунология" и "Медицинская микробиология1', Киев, 1990.

17. Конференциях международного общества исследователей интерфе-

. рона: Сан-Франциско, 1990; Ницца, I99Ï; Торонто, 1992.

16. Конференциях НЖЭМ им.К.Ф.Гамалеи РАМН, 1984, 1935, 1937, IS38, 1990, 1992.

' . СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПШИКОВАННШС ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иьучснпе индуцированного интерфероном антивирусного состояния с хромосомным набором культур клеток человека/Соловьев Е.Д., Хэсин Я.Е., Гулевич К.Е., Амчеккова A.M., Наровлянский А.Н., Стонова "..С., Покидышева Д.Н., Гринберг К.К., Кухаренко В.И./

. Доклады АН СССР,- 1Э78.-Т.243, Л 4.- C.I069-I07I.

2. Значение дозы гена хромосомы 2 для.продукции интерферона куль-rypava клеток человека /Соловьев В.Д., Хесин Я.Е.: Амчопкова A.M., Гулевич Н.Е., ПарсвлянскиЁ.А.Н., Покидншева Л.Н., Стско-

. ва Н.С.// Доклады АН СССР.- I973.-Ï.242, № 6.-C.I4I5-I4I6.

3. Связь особенностей хромосомного, набора культур клеток человеке с продукцией и антивирусным.действием интерферона /Хесин Я.Е., Гулбвич Н.Е., Алленкова A.M., Стонова Н.С., Покидыиева.Д.Н.,

. Наровлянокгй А.H«// Вопросы вирусологии,- 1979.-М 4.-C.35S-3SÍ

4. Хбсин Я.Е.4 Амчеккова A.M., 1^глевпч К.Е., Наровлянский А.Н. Генетические механизмы образования и действия человеческого яноерферопа //У1 мездунар.сиьш.сод.стран по интерферону.- Тез.

. докл.-Льюв.-1980.-С.50.. . ' . .

С-. Гулзвич Н,Е., Амченкова A.M., Наровлянский А.Н., Хесин Я.Е. Характеристика клонов, выделенных из резистентной к вирусам Коксакк В линии человеческих кяеток//Матер.З-го объединен.

■ съезда гигиен., имадунсл.,.мккробиол. л инфекционистов Казахс-

. тана.-Тез.докл.- Алма-Ата.-1980.- C.I00-I0I.

6» Comparative cytogenetic study oí a contiguous human call lino mid its subline susceptible and rosiatarit, respectively, to Coxsackie B3 virus /fflieein. ^e-E., ArjcherJcova A.M., Gulnvich У.В., Stonova U.S., Hwûvlyar.slry А.N.// Acta virol.- 19<31--

.. 7.25, N. 1.- P.19-24. •

7. Хесин Я.Е.,. Лмчеккова А.И., Г/левкч U.E., Наровлянский А.Н.

¡ Генстжеские механизм;; образования и действия человеческого

. иитерфзрска // -галоггя.- • 193!.- £ 3.-С.7*3-78.

8. Хесин Я.Е., Амченкоьл A.M., Гулсвкч Н.В., Наровлянский А.Н.

Цитогекетичес кие аспекты чувствительности клеток человека к интерферону я некоторым вирусам //3-я Всесопз.конф. по патоло-. гии клетки.- М.- 1932.- С.175.

Э. Чем обусловлено антипролиферативкое (антитуморкое) действие препаратов лейкоцитарного человеческого интерферона /Амченкова A.M., Наровлянский А.Н., ¡¡¡лома Л.В., Кузнецов В.П., Хесин Я.Е. //Иммунология вирусных и микоплазмзнных инфекций.- Труды ИЭМИБ. - Т.15,- Алма-Ата,- 1933.- С.5-9. К Наровяянскгй А.Н., Амчонхова A.M. Применение методов чонз и н для одновременного выявления районов ядрышкоsoi•о организатора и индивидуализации хромосом в перевиваемых культурах человечес-. хшх клеток //Цитология.- I&85.- № 10.- 0.1204-1207. . Генетические механизмы системы человеческого интерферона как фактора поддержания клеточного гомеостаза /Хесин Я.Е., Амченкова A.M., Наровлянский А.Н., Гулевкч K.F., Воронина Ф.В.// . Весгн-АШ СССР-- 1934.- J6 I.- C.80-S4.

. Зависимость актипролиферативного действия интерферона от степени очистки препарата /Хесин Я.Е., Амченкова A.M., Нароатякский А.Н. и др.//Бюлл.экопер.биол. и мед.- 1984- №. 5.-С.610-5Г2. . Активность СОД-1 и число длинных плеч хромосомы 21 (2Iq ) в культурах человеческих клеток, чувствитзльнкх к резистентных к интерферону и вирусам Коксаки КЗ /Хесин Я.Е.» Соловьева М.Ф., Наровлянская.С.Е.Наровлянский А.Н., Амченкова A.M., Поккды-изЕа JI.Н., Баландин 'Л.Г.//Молекул.генетика, мкксобиол. и виру-сол.- 1984.- JS 4,- С.33-36.

Наровлянский А.Н., Амченкова A.M., Щеглозитова О.Н., Хесик Я.Е. Способ получения гибридных меток //Йидтг.изобр.- 1935,- J5 5.~ C.7V\-A.C. £ П38412.

И&роглянский А Л!. г Амчсяковя A.M., Шегло.битовг С.Н», Хесик Я.Е. Выделение гибридов соматических клеток с помощью специфического интерфероко-вирузного могода селекция //Вопр.ьирусол,-1985.- й 2.- С.244-250.

Продукция ингибиторов действия интерферона клегочныкк линиями, ■чувствительными и дечузстзитслькыта к нротивоЕй^тускому действию интерферона /Хесин Я.Е., Парфенов Е.В., Амченкова A.M., Наровлянский А.Н., Ткач Т.А.//Вопр.вирусол.- 1985. — й 5,-С.584-586.' . . -

Наровлянский А.Н., Амченкова A.M.. Щегловитова О.Н., Хескн Я.Е.;

Интерфероно-вирусный метод се легаши гибридов соматических клеток //йнтерферон-35.- Тбилиси.- 1Э85.- С.68-69.- . .

18. Амчеякова A.M., НэроЕлянокий А.Н., Парфенов В.В., Хесин Я.Е. Влияние ингибиторов действия интерферона на митоткческуа ак-

. тквпость клеточных культур //Вопр.вирусол.-1985.-й 6.-С.743-74!

19.' Наровлянский А.Н. Исследование механизмов действия интерферона //Молекулярная и клеточная регуляция инфекционного иммунитета.' Сб. КИИЭЫ им.Е.Ф.Гамалеи.- M.- 1935.- 0.75-81.

20. Наровлянский А.Н., Амчонкова A.M., Хесин Я.Е. Использование гибридов соматических клеток для изучения механизмов действия человеческого интерферона //Цитология.- IS87.- № 3.- C.IC95.

21. Наровлянсклй А.II., Амченкова A.M., Покидипева Л.Н. Подавление развития антивирусного состояния метками, резистентными к.кь-терфэрону //2-я ВсесоЕЗН.конф. по инфекционной иммунологии.-

. Тез.докл.- M.- J987.- С.82-83. . .

22» Амченкоьа A.M., Парфенов В.В., Наровлянский А.Н., Ткач Т.А. Антипролифераткзное действие свиного лейкоцитарного интерферона и . ингибитора действия интерферона ¿n vivo. //Вопр. внрусол.-. 1987.- Jé 5.- 0,574-576.

23. Клеточные рецепторы для интерферона человека /Хесин Я.Е., Вороника Ф.Е., Наровлянский А.Н., Амченксва A.M., Алимов Э.Г.//4-Я

.. Всесоюзн.конф. по патологии клетки.- Тбз.докл.-М.-1987.~С.96.

24. Кариологическая характеристика новой перевиваемой линии клеток гипернефромы человека (ГН)/Алимов Э.Г., Наровлянский А.Н., Ам-че'кова Л.г.1., Шапошникова Г.М., Снегирева А.Е., Хесин Я.Е.//

. Цитология м Генетика.- 1987.« Л 6.- С.441-446.

25. Действие реафзрона ка гультуру.перевиваемых клеток человека/ . Амче}Ж0Еа A.M., Наровлянский А.Н., Покидышеьа Л.Н., Воронина

£.£., Хесин Я.Е.//Волр.шрусол.- 1988.- ¡k 2.- С.247-250. .

26. Хесин Я.Е.; Наровлянский А.Н., Амченкова A.M., Алимов Э.Г, Мн-тегферон-специфические рецепторы клеточной поверхности //1С—i": регион.симп.соц.стран по иктерферо ну.-Тез.докл.-Мссква-Ряга.-

. 1988.- С.123-124.

27. Антиирэлифаративкая активность олиюмерных форм рекомбинантко-

инторфьропа-сч /Хесин Я.Е...Воронина Ф.В., НароБляиокий . A.IL, Алимов З.Г., Ашеяхоьа A.M.//Там ко, С. 122-123. 23. Инд/кцпя кнтетаерон-опеш^чсс.ккх ферментов в культурах клеток, чувствительных к резистентных к интерферону /Наровлянский А.Н.,

Турпаев К.Т., Амченкова A.M., Иткес А.В., Алимов Э.Г., Северин Б.С., Хесин Я.Е.//Молекул.генетика, микробиол, и вирусол.- . 1938.- № 2.- С.34--39.

29. Наровлянский А.К., Амченкова A.M., Покидытгева Л.К., Хесин Я.Е. Способность нечувствительных к интерферону клеток препятствовать развитии антивирусного состояния //Вопр.взрусол.- 1988.-£ 3.- С.051-354.

30. Кктерферэк-споцифические клеточные рецепторы в культурах человеческих клеток, различавшихся но чувствительности к альфа-интерферону /Наровлянский А.К., АмченкоЕа A.M., Борухов С.И., Алимов З.Г., Стронгин А.Я., Хесин Я.Е.//Молекул.генетика, мик~ робиол. и вчрусол.,- 1989.- й 7.- С.30-41. '

31. Германийорганические соединения как индукторы иммунного интерферона /Амчеккова A.M., Игнатекко М.А., Хесин Я.Е., Кузнецов В.П., Наровлянский А.Н. и др.//Интерферон-в9.~ Сб. НИЖМ им.

. Н.Ф.Гамалея.- М.- 1989.- С.35-3?.

32. Наровлянский А.Н., Амченкова A.M., Хесин Я.Б. Интерферон-спе-, пифические рецепторы клеточной.поверхности //Там ze, С.58-64.

33. Наровлянский А.Н., Амченкова A.M., Хесин Я.Е..Выделение гиб- . ридных клеток с заранее заданными свойствами.с помощью иктер-

. фэроно-вяруского метода селекции //Там же, С.115-117.

34. Чекнев С.Б., Наровлянский А.Н., Амченкова A.M., Сорокин А.Н. Реверсирование цитстоксической активности естественных киллеров против модифицированных, интерфероном клеток-мишеней //Док. лады АН СССР.- 1990.- Т.315.- К 5.- С.1270-1274.

35. Еетг group оf. germanluiaorganic IFli-inducerri / "¿orsbov , Ila-го71уапзку A.M., Amehankova A.M., Ы.А. et al.// Till th International Congress of Virology.- Abstracts.-

. 1990.- P.63.

36. KK activity toward interferon treated terse* cell with different susceptibility to alpha interferon / Hftrovlyanijky A.E. s CheknsT 3.B., .tachenkova A.M., Ehesin Ya.E., Yershov P.I.//

. Ibid.- ?.337.

Г?^ Production of IPIT action antagonists by IFH-unsusceptible cell lines /Karovlyansky A.H., Amchenkova A.M., Parfenov Т. V., l-ik-. honova T.A., Kheain Ya.E., Yershov P.I.// Ibid.- Р.ЗЗО.

8. Cellular interferon resistance /liarovlyansiy A.IT., Anchenkova A.U., AlinoT E.G., Khesin Ya.E., Yershov P.I.//Ibid,-?.339.

ЙЭ. llhft action of interferon on differently sensitive to its target cell in reaction of natural cytotoxicity / Cheknev S.B., Ktirovlyaasky A.S., AMchenkova A.M., Khecin 2a.S., Yorahov P.I. //European Federation of Immunological Societies, 10tb Meeting - Abstract«.- Edinburgh.- 1990»- J.15-25«

4G. Goraanimorgaiiic 3aima-interferon and inhibitor of interferon action inducers / Yershov F.X., Uarovlyansky A.U., ¿псЬепкэтг. A.M., l'azulakhcva E.B., IgnaienJco EJ-JL., Ehesin Ya.E. //Ibid.-P. 15-43.

41. Коррекция клеточной чувствительности к интерферону гермашйср-гэничеокиш соединениями Да^оменский А.Н., Амченкова АЛ.'., . Алимов Э.Г., Игнагенхо М.А., Геенн Я.Е., Ершов ¿.И. //Современные аспекты применения иктерфероиов и других иммуяомодуля-

. торов - Сб.научных трудов.- 1930.- С.04-65.

42. Активность естественных киллеров человека цротив клетск-шше-ней, обладающих различной чувствительностью к.интерферону / Чекнев С.Б., Наровлянский А.Б.. Амченкова A.M., Сорокин А.Ь, Хесив Я.Е., Ершов Ф.И.//Волл.окспер.бЕол. и мед.-1990.-& 10.. С.406-409.

43. Исследование мембран клеточной поверхность в линиях человеческих клеток с различной чувствительностью к интерферону /Наровлянский А.Н., Амченкова. А.И., Алимов Э.Г., Гостева Е.В., Кли-

. цунова Н.Б., Хесин Я.Е.//Вопр.вирусол,- 1991.- J» I.- С.48-53.

44. НаровлякскиЙ А.Н. Клеточная резистентность к интерферону // . Биологические науки.- IS9I.- В 9,- С.5-25.

45. Чекнев С,Е., Наровлянский А.Н., Амченкова АоМ., Ершов $.И. Ингибитор .действия интерферона в регуляции активности естественных киллеров чело во ка//Ею лл. s ко по р. бк о л. и мэд.-1991.- В 10.-C.S95-397.

46. Correction of cell sensitivity to interferon / Ilarovlyaasky A.K., Auchenkove. A.M., Alimov B.C., Kheain Ya.B., TsrshoY P.I-// J.Interferon Kea.- 1991.- 7.11.- Suppl.1.- P.221.

4Резистентность клеток к интерферону и путь ее преодоления / Наровлянский А.К., А:л.&икова A.M., Алимов Э.Г., ИокЕЯгшева I.E., Ч?.ччев С.Б., Л'есип Я.Е., Ершов Ф.И.// Интерфорок-92,-

1 Сб.научных трудов.« П.- 1992.- С.53-69.

48. Рэзясоаиггэеть клеток к шперферсяу, обуыюитоал-эя тъбито-

рами действия интерферона /Амченхова A.M.,.Наровлянский А.П., Парфенов В.В., Тихонова Т.А., Поквдшева Л.Я., Игкатенко М.А., . Хесин Я.Е., Ершов Ф.И.//Том же, С.69-74.

49. Biological activity of inhibitorз of interferon action / JJa-rovlyanoky A.It., Amebenkova t..K., Parfenov 7.V., Cbeknar 3.B., Xheain Ть.Е.. Tershov УЛ»// J.Intorieron Rea.- 1Э92.- Y.12.-Suppl.1.-

50, Cboknav S.B., NaroTlyansVy A.H-, Amcheakova A.M. Diffarenee and aimilasity in action of interieroa ard. of ita inhibitor cn the natural killer (ЯК) cell activity // Ibid., ?.203.

СПИСОК. СОКРАЩЕН!®

АВ антивирусный (эффект)

АН! антивирусное состояние

АЛ антипролифератпвный (эффект)

2-5А синтетаза 2"-5'олигоаденилатсннтетаза.

Ш1 вирус болезни Ньюкасла

• ВЕС вирус везикулярного стоматита

ВЭМК вирус знцефзломЕОКсфдита

ДЗЯ диплоидные фибробласты человека

ЕК естественные киллеры

£ЦТ естественная цнтотоксичность

ИДИ ингибиторы действия интерферона

ИИЕ интерферон-икгибирующие единицы

КМ индекс многоядерности

ИРКЛ интерферон-резистентные клеточные линии

ИСГ интерфсрон-стимулированныо 1'ены

ИСШ интерферон-стимулированный генный фактор

ИСЭ интерферон-стимулированные элементы

И5Н. интерферон

ИФНРец интерферсн-рецэдторы

КМ клетки-мишени

КРС крупный рогатый скот

МЕ м&вдунгродкые единицы

ЬЕК моюнуклеарные клетки

ПК протеинкиназа

Ш полькариоцитарный индекс

ПЭГ полиэтилентликоль

ПЩ тканевая цитопатогенная доза

цАШ циклический аденозикшнофосфат

ЦИ цитс/токсический индекс

ЦТ цитотоксический тест

Э:К отношение эффектор-мтрнь