Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Природные α-интерферон и антибактериальный пептидный комплекс: технология получения, новые лекарственные формы, оценка эффективности

Направахрукописи

ВОЛКОВА Лариса Владимировна

ПРИРОДНЫЕ а-ИНТЕРФЕРОН И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЙ ПЕПТИДНЫЙ КОМПЛЕКС: ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ, НОВЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ, ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ

14.00.36 Аллергология и иммунология 03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Пермь —2004

Диссертация выполнена в филиале ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО "Биомед"».

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Тимашева Ольга Анатольевна член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Попов Владимир Федорович

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Долгушин Илья Ильич Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Кеворков Николай Николаевич доктор медицинских наук, профессор Четвертных Виктор Алексеевич

Ведущая организация:

Ордена Трудового Красного Знамени Научно-исследовательский Институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи РАМН, г. Москва

Защита состоится « 2004 года в Уу_часов

на заседании диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс (3422) 446711.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета член-корреспондент РА Н

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Интерферон (ИФН) — важное звено в адаптационно-приспособительных механизмах макроорганизма и поддержании его гомеостаза (Ариненко и др., 1997; Шабалина и др., 1995; Ершов, 1996; 1998). Показано, что биологическая активность ИФН направлена против всех известных РНК- и ДНК-содержащих вирусов (Соловьев и др., 1981; Goodboum et al, 2000). ИФН, являясь продуктом экстренной реакции организма на патоген, продуцируется макрофагами или другими антиген-представляющими клетками уже при первом контакте с патогеном. При этом формирование устойчивости организма к инфекциям происходит через активацию клеточных реакций намного раньше формирования специфического иммунитета, связанного с антителами (Кузнецов, 1987; Ершов, 1996).

В процессе интерфероногенеза индуцированные патогеном лейкоциты, наряду с интерфероном, продуцируют широкий спектр цитокинов — медиаторов иммунного ответа (ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-15, ФНО-а, МИФ и ЛИФ), активирующих Т-лимфоциты (Медуницын и др., 1987; Акользина и др., 1996; Кузнецов, 1998).

Система интерферона представлена ИФН- и Однако, наиболее изучены иммунобиологические и клинические аспекты действия ИФН-а лейкоцитарного происхождения (Соловьев и др., 1981; Кузнецов, 1983, 1987). Именно этот вид ИФН — природный и рекомбинантный — до настоящего времени широко применяется в профилактических и терапевтических целях.

Природные препараты ИФН многокомпонентны и содержат все или, по крайней мере, большинство подтипов. Они не обладают антигенными свойствами и не вызывают сенсибилизации при длительном и многократном введении (Кузнецов, 2000).

В то время, как рекомбинантные интерфероны, являясь продуктами одного реконструированного гена, всегда однокомпонентны (Ершов, 1996, 1998), что обуславливает и соответствующий потенциал их терапевтической активности. Некоторые рекомбинантные ИФН при парэнтеральном введении могут вызывать образование специфических нейтрализующих антител, а также потенцировать различные осложнения (Lawrence, 1995; Fernander et al., 1996; Chung et al., 1997; HayaKawa et al., 1997; Zuber et al., 1997;Uberti-Foppa et al., IS

Разнообразие лекарственных форм лейкоцитарного ИФН-а очень важно для практики, учитывая особенности состояния иммунной системы больного и специфики заболевания (Кузнецов, 1996; Трофимова и др., 1997; Лобачев и др., 1999; Гапонюк и др., 2001; Волкова и др., 2002; Попов, 2002; МаНжгокауа & а1, 1992; РокаЬ & а1, 1995). Причем местное применение ИФН, когда оно возможно, всегда эффективнее системного. Препараты ИФН для местного применения позволяют локально или внутриорганно воздействовать на патологический процесс, мало влияя на кроветворение (Жерлакова и др., 1985; Тареева и др., 1997).

Основные продуценты природного интерферона-альфа — лейкоциты крови человека, количество которых для производственных целей лимитируется донорским сырьем (Соловьев и др., 1981; Кузнецов, 1983; 1996).

В этой связи решение вопросов оптимизации методов культивирования лейкоцитов для повышения выхода целевого продукта и разработки унифицированного эффективного метода получения природного ИФН для создания новых лекарственных форм представляется на сегодня весьма важным и актуальным для практического здравоохранения.

Эффективной лекарственной формой являются суппозитории с ИФН, способные оказывать как местный, так и системный лечебный эффект за счет выраженной всасывательной способности нижних отделов кишечника (Цагарейшвили и др., 1987; Покровский, 2001).

Известно, что при некоторых вирусных поражениях слизистых оболочек и кожи жидкие лекарственные формы ИФН не способны обеспечить поддержание необходимого уровня активации иммунных эффекторов в очаге инфекции. Наиболее приемлема для местного применения на открытых пораженных поверхностях кожи и слизистых мягкая лекарственная форма — интерфероновая мазь.

В последнее десятилетие отмечен интерес и к сублингвальному способу введения белковых препаратов, позволяющему специфической субстанции проникать в организм, минуя протеолитический барьер верхних отделов желудочно-кишечного тракта (Махлай и др., 1997; ИевсИтапп & а1, 1991). Отмечено, что сублингвальная или оральная формы ИФН при лечении вирусных инфекций слизистых оболочек ротовой полости усиливают местный противовирусный иммунитет (ШегИ-Рорра е^ а1, 1998).

В 80-х годах прошлого века был обнаружен феномен антибактериального действия препаратов природного лейкоцитарного

ИФН-а (Малеева и др., 1982; Печеркина и др., 1982; Коробов и др. 1985; 1988; Кузнецов, 1989; Korobov et al, 1988). По мнению указанных авторов эффект обусловлен присутствием в препаратах интерферона антибактериальных пептидов. Как известно, антибактериальные пептиды являются активными защитными компонентами иммунной системы (Green et al., 2000; Islam et al, 2001). В этой связи выделение антибактериального фактора, синтезируемого лейкоцитами, индуцированными вирусом — интерфероногеном, из продуктов интерфероногенеза, и изучение его физико- химических и биологических свойств представлялось нам перспективным в плане обоснования возможности применения в практике нового по своей природе антимикробного препарата.

Цель настоящего исследования — научно-методологическое обоснование и оптимизация способов получения природных -интерферона и антибактериального пептидного комплекса, создание новых лекарственных форм и оценка их терапевтической эффективности.

Основные задачи исследования

1. Разработать унифицированную реакторную технологию получения природного лейкоцитарного -интерферона с использованием в качестве интерфероногена очищенного и концентрированного вируса Сендай.

2. Изучить цитокинетическую активность продуктов интерфероногенеза, синтезируемых донорскими лейкоцитами под действием вируса Сендай.

3. Разработать способы приготовления усовершенствованных и новых лекарственных форм интерферона для местного применения (суппозитории, мазь, таблетки).

4. Оценить терапевтическую эффективность разработанных лекарственных форм интерферона в экспериментальных и клинических условиях.

5. Изучить закономерности синтеза антибактериального фактора, ассоциированного с процессом интерфероногенеза, разработать способ его выделения, очистки, концентрации и определить физико-химическую природу.

6. Оценить антибактериальное действие низкомолекулярного пептидного комплекса на условно-патогенные и патогенные микроорганизмы.

Положения, выносимые на защиту

1. Метод культивирования, очистки и концентрации вируса Сендай и его использование в качестве интерфероногена способствует повышению противовирусной активности ИФН и низкому содержанию ксеногенных белков в продуктах биосинтеза интерферона.

2. Интерферон, полученный по унифицированной реакторной технологии, является продуктивной основой для приготовления новых лекарственных форм природного -интерферона.

3. Новые лекарственные формы интерферона для местного применения (суппозитории, мазь, таблетки) обеспечивают биодоступность и длительное сохранение противовирусной активности специфической составляющей.

4. Результаты экспериментально-клинической оценки новых лекарственных форм природного -интерферона свидетельствуют о их высокой терапевтической эффективности.

5. Разработанный способ выделения, очистки и концентрации обеспечивает получение из продуктов биосинтеза интерферона препарата пептидной природы, обладающего антибактериальной активностью.

6. Низкомолекулярный пептидный комплекс, продуцируемый лейкоцитами человека в процессе интерфероногенеза, можно отнести к катионным пептидам, проявляющим антибактериальную активность в отношении не только тест-культур грамположительных микроорганизмов, но и представителей грамотрицательной флоры: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosae, а также уропатогенных культур микроорганизмов, изолированных от больных детей с инфекциями мочевой системы.

Научная новизна. Определены оптимальные условия реакторного культивирования лейкоцитов человека с использованием в качестве интерфероногена вируса Сендай. Разработана единая оптимизированная технология получения полуфабриката природного -интерферона как основы для создания различных лекарственных форм ИФН (суппозитории, мази, таблетки). Разработаны усовершенствованная лекарственная форма интерферона в суппозиториях (патент РФ №219330, приоритет от 25.09.1996) с высокой удельной противовирусной активностью и пролонгированным сроком годности, а также метод оценки противовирусной активности указанной лекарственной формы на основе экстрагирования ИФН из гидрофобных основ с помощью

гексана и 0,9%-ного раствора натрия хлорида при рН 7,0 (патент РФ №2123351, приоритет от 20.12.1998). Впервые разработан способ получения мази с интерфероном на дифильной основе, обеспечивающей сохранение специфической активности ИФН в течение одного года и его биодоступность при применении указанной лекарственной формы препарата (патент РФ № 2141819, приоритет от 15.07.1997), предложен метод оценки специфической активности ИФН, заключенного в дифильную мазевую основу (патент РФ №2148396, приоритет от 10.05.2000). Впервые разработан способ приготовления сублингвальной таблетки с ИФН, обеспечивающий высокую стабильность противовирусной активности и биодоступность специфической составляющей. Новизна полученных результатов подтверждена патентом РФ №2175554, приоритет от 30.03.1999. Результатами экспериментальных и клинических исследовании подтверждена терапевтическая эффективность новых лекарственных форм в виде суппозиториев, мази, таблеток, содержащих очищенный и концентрированный природный лейкоцитарный ИФН- Впервые разработан и предложен способ выделения низкомолекулярного пептидного комплекса из продуктов интерфероногенеза, обладающего антибактериальным действием, изучены его физико-химические свойства, определен аминокислотный состав (заявка на патент РФ №2003105421, приоритет от 25.02.2003). Оценено антибактериальное действие низкомолекулярного пептидного комплекса, синтез которого ассоциирован с процессом интерфероногенеза, на музейные культуры грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов: Staphylococcus aureus (ATCC 653 8-Р), Streptococcus faecalis (эталон ГИСК 389), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosae (ATCC 9027), Bacillus cereus (ATCC 8035), Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis. Впервые выявлено антибактериальное действие пептидного комплекса в отношении уропатогенных культур микроорганизмов родов Escherichia spp., Staphylococcus spp., Klebsiella spp. и Proteus spp., выделенных от больных детей с заболеваниями мочевой системы (свидетельство на интеллектуальный продукт ВНТИЦ № 73200400139, от 08.07.2004).

Теоретическое и практическое значение работы состоит в определении закономерностей синтеза антибактериального фактора, ассоциированного с процессом интерфероногенеза, и подтверждении его пептидной природы. Методологически обоснованы биодоступность новых лекарственных форм природного лейкоцитарного -ИФН, способы их применения и терапевтическая

эффективность. Практическая значимость работы состоит в разработке эффективного масштабированного реакторного способа получения природного -интерферона с использованием предложенного метода очистки и концентрации вируса—интерфероногена Сендай. На основе усовершенствованного реакторного метода получения человеческого лейкоцитарного интерферона (ЧЛИ) разработаны способы приготовления новых лекарственных форм природного ИФН в виде суппозиториев, мази и таблеток. Экспериментально-клиническими исследованиями подтверждена их терапевтическая эффективность при различных инфекционных патологических состояниях (бактериальном вагинозе, герпесе).

На разработанные технологии получения препаратов ИФН оформлено 10 нормативно-технических документации, одобренных Ученым Советом ГИСК им. Л. А. Тарасевича МЗ РФ. Реакторный способ синтеза интерферона в суспензионной культуре донорских лейкоцитов, индуцированных вирусом Сендай, реализован при производстве препарата «Интерферон человеческий лейкоцитарный сухой» в филиале ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед». Предложенный способ получения препарата «Свеферон» — суппозитории интерферон человеческий лейкоцитарный» используется в производстве указанного препарата Пермским НПО «Биомед» с 2000 года. Препарат «Мазь с интерфероном» рекомендован Комитетом МИБП МЗ РФ к регистрации в Российской Федерации в качестве лекарственного средства для наружного применения (Протокол № 4 от 20.06.2002). Препарат «Интерферон таблетки» в настоящее время проходит завершающую стадию клинических испытаний (Разрешение на проведение клинических испытаний № 246 от 21.11.2003 г.).

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции, Пермь, 1993; П Международной конференции и I Съезде БААКИ, Витебск, 1998; П Международной конференции, посвященной 100-летию Пермского НПО «Биомед», Пермь, 1998; Международной научной конференции «Фармация в XXI веке: инновации и традиции», Санкт-Петербург, 1999; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических препаратов», посвященной 95-летию ФГУП «Иммунопрепарат», Уфа, 2000; V International Conference «Environmental Pollution — ICEP-2001», Волгоград — Пермь, 2001; научно- практической конференции «Интерферон. Вопросы теории и практики», Пермь, 2001; научной конференции

«Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», посвященной 95-летию ФГУП «Вирион», Томск, 2001; II Конференции иммунологов Урала, Пермь, 2002; на X Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2003; на 5-м Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Москва, 2003; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в 21 веке», Пермь, 2003; Международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней — прогресс и проблемы», Санкт-Петербург, 2003; II Московском международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2003; XI Российском научном Конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2004; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», посвященной 100-летию со дня основания Томского НПО «Вирион», Томск, 2004; Международной Российско- американской научно-практической конференции «Актуальные проблемы материнства и детства», Тула, 2004.

Диссертация апробирована на расширенном заседании Научно-технического совета филиала ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО "Биомед"» и расширенном заседании научной проблемной комиссии по аллергологии и иммунологии и микробиологии Института экологии и генетики микрорганизмов УрО РАН и рекомендована к защите.

По материалам диссертации опубликовано 52 статьи, в том числе в центральной печати — 7, патентов на изобретение РФ — 5, свидетельств на интеллектуальный продукт — 1.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ вакцин и сывороток филиала ФГУП «НПО "Микроген"» МЗ РФ «Пермское НПО "Биомед"» (№ госрегистрации тем 01.9.80.0.07827; 01.200.1.08831).

Объем и структура диссертации. Проведенные исследования выполнены под руководством и личном участии автора на базе лаборатории и отделения интерферона Пермского НПО «Биомед» МЗ РФ при содействии лаборатории биологически активных препаратов Пермского НПО «Биомед» МЗ РФ (зав. лаб.— к. б. н. Г. М. Сафонова), лаборатории биохимии микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (зав. лаб.— к. м. н., с. н. с. В. П. Коробов), кафедры инфекционных болезней ГОУ ВПО «111 МЛ МЗ

РФ» (зав. каф.— д. м. н, проф. Н. Н. Воробьёва), кафедры акушерства и гинекологии ГОУВПО «ПГМА МЗ РФ» (зав. каф.— д. м. н., проф. М. М. Падруль), кафедры детских болезней ГОУ ВПО «ПГМА МЗ РФ» (зав. каф.—д. м. н., проф. Н. И. Аверьянова).

Диссертация состоит из введения, обзора данных литературы, описания материалов и методов, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 305 страницах, включая 31 рисунок и 67 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 432 источника, из них 241 отечественных и 191 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизмы. В экспериментальных исследованиях использованы в качестве вирусов-индукторов интерфероногенеза: — вирус азиатской ложной чумы кур — болезни Ньюкасла, штамм «Н» вакцинный (ВБН); вирус парагриппа тип I гемадсорбирующий Д, штамм Сендай, Fushimi. Вирус везикулярного стоматита штамм «Индиана» применяли как вирус-индикатор.

Объектом исследования служили также культуры микроорганизмов из коллекции музейных штаммов отделений биологического контроля и бактериофагов филиала ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед»: Staphylococcus aureus (АТСС 6538-Р), Streptococcusfaecalis (эталон ГИСК 389), Escherichia coli (АТСС 25922), Pseudomonas aeruginosae (ATCC 9027), Bacillus cereus (АТСС 8035), Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis и уропатогенные культуры микроорганизмов родов Staphylococcusspp. и Escherichiaspp., a также бактерий родов Klebsiella spp., Proteus spp. и вида Pseudomonas aeruginosae, выделенные от больных детей в возрасте от 3 месяцев до 15 лет и любезно предоставленные аспирантом ПГМА П. В. Косаревой.

Штамм Staphylococcus epidermidis 33, полученный из коллекции ГИСК им. Л. А. Тарасевича, использовали в качестве референтного штамма для определения антибактериального действия пептидного комплекса, синтез которого ассоциирован с интерфероногенезом.

Методы культивирования. Культивирование вирусов, используемых как в качестве индукторов интерфероногенеза, так и в

качестве индикатора, проводили заражением 9-10 суточных куриных эмбрионов в хорион-аллантоисную оболочку. Определение противовирусной активности препаратов интерферона (лиофилизатов, растворов, мазей, суппозиториев и таблеток) проводили in vitro на культурах перевиваемых клеток линии СПЭВ, чувствительных к интерферону, по отношению к дозе индикатора — вируса везикулярного стоматита, равной 100 ТЦД50-

Определение антибактериальной активности пептида, синтезируемого в процессе интерфероногенеза, в отношении тестируемых штаммов (как в музейных, так и выделенных от больных) проводили микрометодом двукратных серийных разведений (Коробов, 1988). За условную единицу антибактериальной активности принимали обратную величину максимального разведения, при котором наблюдалось отсутствие роста тест-бактерий Staphylococcus epidermidis 33 при культивирования при температуре 37 °С в течение 16-18 ч. За минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) принимали самую низкую концентрацию пептида, которая вызывала полную задержку роста исследуемой культуры микрорганизмов (просветление бульона в сравнении с контролем). Для характеристики чувствительности тестируемых культур микроорганизмов к катионному пептидному комплексу определены функции распределения, результаты отображали графически.

Препараты интерферона. В качестве препаратов сравнения для определения противовирусной активности ИФН и оценки антибактериальной активности в препаратах интерферона использовали — «Интерферон лейкоцитарный человеческий сухой» для интраназального применения с противовирусной активностью 1000 ME в одной ампуле производства ФГУП «Пермское НПО «Биомед», ФГУП «Иммунопрепарат», г. Уфа, ФГУП «Вирион», г. Томск; «Лейкинферон» с противовирусной активностью в одной ампуле 10000 ME и «Человеческий лейкоцитарный интерферон для инъекций» с противовирусной активностью интерферона а-типа в одной ампуле 100000 ME производства НПФ «Интекор», г. Москва, а также «Реаферон» человеческий рекомбинантный-а с противовирусной активностью 1000000 ME в одной ампуле производства ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирская обл. и «Гриппферон» — капли в нос во флаконах по 5,0 мл с противовирусной активностью интерферона человеческого рекомбинантного а-2 не менее 10000 МЕ/мл производства «Фирн-М», Москва.

Физико-химические и иммунологические методы. Качественную оценку суппозиториев (внешний вид, время полной деформации, масса свечи), мази (внешний вид, однородность, масса содержимого упаковки), таблеток (внешний вид, распадаемость таблеток, прочность таблеток на истирание, сыпучесть таблеточной массы), а также контроль на отсутствие бактериальной и грибковой контаминации лекарственных форм, содержащих ИФН, проводили в соответствии с требованиями, изложенными в ГФ XI, вып. 2.

Спектр цитокинов в препаратах ИФН определяли с помощью иммуноферментных тест-систем для количественного определения цитокинов ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, ФНО-а„ ИФН-у производства ООО «Цитокин», Санкт-Петербург.

Содержание овальбумина в препаратах интерферона определяли с помощью РНГА с использованием диагностикума эритроцитарного овальбуминового иммуноглобулинового производства ГП по производству бакпрепаратов МЗ РФ, Санкт-Петербург.

Состояние иммунной системы у больных бактериальным вагинозом оценивали по показателям интерферонового статуса, фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови (Каплин,1996), уровней лизоцима и иммуноглобулинов крови, а также влагалищного отделяемого (Mancini et al, 1965). У всех больных в динамике заболевания исследовали состояние системы интерферона по интерфероновой реакции лейкоцитов (ИРЛ) в усовершенствованном Ершовым Ф. И. (1996) варианте метода Соловьева В. Д. с соавт. (1970);

-ИФН определяли методом индукции фитогемагглютинином (ФГА).

Аминокислотный состав антибактериального пептидного комплекса изучали методом кислотного гидролиза с применением анализатора аминокислот марки Т 339 (Чехия). Молекулярная масса пептидного комплекса определена при помощи масс-спектрометрии на приборе Voyager-DE STR Biospectrometry Workstation. Оценку вирусологической безопасности полуфабрикатов ИФН и готовых лекарственных форм, а также качества синтезированного ИФН осуществляли по методикам ФС 42-3433-97 «Интерферон лейкоцитарный человеческий сухой». Определение общего белка в пептидном комплексе, а также в сыворотке крови экспериментальных животных проводили по методу Лоури в соответствии с ФС 42-3874-99 «Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов». Для оценки термостабильности пептидного комплекса, обладающего антибактериальным действием, готовили водные растворы пептида из

расчета по белку 1 мкг/мл, выдерживали их в кипящей водяной бане в течение 15, 30 и 60 минут, аналогичные образцы пептида замораживали при температуре минус 50 °С и выдерживали в этих условиях в течение 60 минут, 24 часов и 12 месяцев, а затем исследовали их активность. Определение осмотической резистентности эритроцитов в присутствии пептидного комплекса проводили в соответствии с рекомендациями Л. И. Идельсона (Меньшиков, 1987).

Доклиническая оценка новых лекарственных форм интерферона проведена в соответствии с требованиями Фармкомитета России, изложенными в РД 42-28-8-89 «Доклинические испытания новых иммунологических препаратов», РД 64-126-91 «Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств (ОЬР)»; «Правила доклинических исследований безопасности и эффективности фармакологических веществ» М., 2000. Изучение острой и хронической токсичности, местно-раздражающего действия, а также фармакокинетики разработанных лекарственных форм интерферона (суппозитории, мазь, таблетки) проводили на 32 кроликах породы Шиншилла весовой категории 2,0-3,5 кг. В качестве второй экспериментальной модели для изучения острой токсичности мази с интерфероном использовали 100 белых беспородных мышей массой 20-25 г. Местно-раздражающее действие мази с ИФН изучали на 18 морских свинках весовой категории 280-300 г. Общетоксическое действие мази с интерфероном исследовали на 30 нелинейных белых крысах массой 200-250 г.

Электрофоретическое определение белков сыворотки крови проводили у крыс и кроликов в процессе изучения хронической токсичности препаратов мази и таблетки с ИФН соответственно (Грабар идр, 1963).

Клинический раздел исследований. Проведено комплексное обследование 43 женщин с различными проявлениями бактериального вагиноза (БВ). Диагноз устанавливали на основании результатов кольпоскопических, цитологических и гистологических методов исследования. Лечение проводили в два этапа: на первом — все больные получали по одной таблетке Гиналгина интравагинально на ночь в течение 10 дней; на втором этапе — все женщины с БВ были разделены на две группы. Пациентки контрольной группы (18 человек) получали лактобактерин в свечах по 1 свече на ночь в течение 10 дней, опытная группа (20 человек) применяла «Свеферон», содержащий 40000 МЕ в одной свече по аналогичной схеме, как и «Лактобактерин в свечах».

Оценка терапевтической эффективности мази с интерфероном была проведена на 30 больных (25 женщин и 5 мужчин) герпетической инфекцией: у 20 больных инфекция была обусловлена вирусом простого герпеса, у 10 — вирусом ветряной оспы (опоясывающий герпес). Клинико-лабораторное обследование включало общий анализ мочи и крови, определение индекса овидности, а также клинических симптомов — наличие лихорадки, увеличение лимфоузлов, везикул, болей, зуда, жжения в местах локализации герпетических высыпаний.

Статистическая обработка результатов. Математическую обработку полученных данных осуществляли с использованием компьютерных программ Statistica for Windows (StatSoft, Inc., 1995), «Биостатистика для Windows и DOS IBM-PC». Достоверность различий (p) оценивали, используя ¿-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка методологических основ единой эффективной системы получения природного а-интерферона

Для решения данного вопроса на первом этапе исследований с целью получения маточного вируссодержащего материала аллантоисной жидкости с высоким содержанием вируса нами были проведены исследования по оптимизации условий культивирования вируса Сендай в куриных эмбрионах (КЭ). В модельных экспериментах было показано, что использование фосфатного буферного раствора при рН 7,3 в комплексе с сахарозой или лактозой в конечной концентрации 1 % для приготовления рабочего разведения маточного материала статистически достоверно способствовало большей продукции вируса Сендай в сравнении с разведением маточного материала 0,9% раствором натрия хлорида рН 7,3. Установлено, что оптимальной температурой для культивирования вируса Сендай является 37 °С.

Качество лекарственных форм препаратов ЧЛИ для местного применения зависит от того, насколько минимальным будет содержание ксеногенных белков и овальбумина, вносимых с вирусом-индуктором, с одной стороны, и, с другой стороны, насколько максимально выраженными будут его интерферониндуцирующие свойства (Кузнецов, 1991). В связи с этим нами были предприняты

эксперименты по получению вируса-интерфероногена с вышеперечисленными свойствами.

В процессе изучения условий оптимизации процессов очистки и концентрации вируса Сендай, используемого в качестве интерфероногена на стадии индуцирования донорских лейкоцитов, было проведено сравнительное изучение двух способов очистки и концентрации вируса, включающих дифференциальное центрифугирование, диа- и ультрафильтрацию. Оценку эффективности обоих методов проводили по показателям гемагглютинирующей активности, содержанию белка и удельной активности вируссодержащего материала.

Анализ полученных результатов показал, что сочетание диа-и ультрафильтрации вируссодержащей аллантоисной жидкости на установке «Сартакон-мини» с использованием фосфатного буферного раствора с рН 7,3 позволило получить очищенный вируссодержащий материал с инфекционным титром вируса Сендай 140800 ГАЕ/мл, содержанием белка в 2,17 меньшем по сравнению с исходным вируссодержащим материалом при отсутствии овальбумина.

Определение оптимальных параметров синтеза ИФН- с использованием концентрированного и очищенного вируса Сендай проводили в условиях реакторного суспензионного культивирования лейкоцитов крови человека с целью масштабирования технологического процесса для получения целевого продукта (табл. 1).

Предложенная нами продуктивная реакторная технология получения природного лейкоцитарного интерферона- основанная на индукции процесса интерфероногенеза лейкоцитами человека очищенным и концентрированным диа- и ультрафильтрацией вируса Сендай, обеспечивала выход целевого продукта с удельной противовирусной активностью, равной 2142,86 МЕ/мг, что сделало возможным его применение в качестве субстанции для создания новых лекарственных форм ИФН.

Оценка влияния способа биосинтеза на качественные показатели синтезированного лейкоцитарного интерферона

Удель-

Условия проведения биосинтеза Уровень противовирусной активности синтезированного ИФН,МЕ/мл Содержание белка, мг/мл ная проти-вови-русная активность ИФН, МЕ/мг белка Количество овальбумина (чувствительность тест-системы 0,03 мкг/мл) Суммарная активность ИФН с единицы оборудования, ME

Роллсрнос 5428,6*571,43 3,5 ±0,08 1564,43 0,04 ±0,004 27 142 850

Реакторное 6000,0 ± 755,9 2,8 ±0,10* 2142,86 0,01 ± 0,003* 216000000

Примечание. *—р < 0,05 по отношении к контролю.

Основываясь на данных о том, что индуцированные вирусом болезни Ньюкасла донорские лейкоциты продуцируют, кроме ИФН-а, и другие цитокины (Кузнецов и др., 2002) нами представлялось необходимым изучить спектр цитокинов в препаратах ЧЛИ, синтезируемых донорскими лейкоцитами, индуцированными концентрированным очищенным вирусом Сендай.

В этой связи нами было проведено изучение 5 серий препаратов ИФН, синтезированных по разработанной нами технологии, для определения в них цитокинового спектра с использованием соответствующих иммуноферментных тест-систем (табл. 2). Полученные результаты свидетельствовали о том, что ЧЛИ, синтезированный по модифицированной нами технологии, содержит в своем составе ряд наиболее активных цитокинов — ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-8, ФНОаДФН-у.

Анализ цитокинового профиля препаратов ИФН, индуцированных вирусом Сендай

Цктокнны Содержание цитокннов в препаратах ИФН, полученных реакторным способом при индукции интерфероногенем вирусом Сендай

ИФН-а 6000,0 ± 755,90 МЕ/мл

ИФН-у 45,8 ± 3,04 пг/мл

ИЛ-1 258,9 ± 25,95 пг/мл

ИЛ-4 54,9 ±5,27 пг/мл

ИЛ-8 176,9 ±61,48 пг/мл

ИЛ-10 менее 5 пг/мл

ФНО-а 19,0 ±2,22 пг/мл

Исходя из данных литературы (Кузнецов, 1998), можно было судить о том, что успех лечения интерфероном многих инфекционных заболеваний зависит от правильности выбора курса и лекарственной формы указанного препарата. Использование лекарственных форм ИФН местного применения позволяет воздействовать на входные ворота вирусной инфекции.

Наряду с усовершенствованием производства ИФН-а нами был проведен комплекс исследований по разработке методов получения новых лекарственных форм интерферона — суппозиториев, мази и таблетированной формы ИФН.

Совершенствование методов получения препарата «Свеферон» и оценка его терапевтической эффективности

Ранее нами был проведен цикл исследований по созданию свечей с ИФН, суппозиторной основой которых служил твердый кондитерский жир с эмульгатором Т-2 (Волкова, 1990), относящийся к липофильным жировым основам. Данная основа обладала рядом положительных свойств, имела температуру плавления 35-37 °С, устойчивость при хранении после стерилизации паром, однако срок годности препарата на данной основе составлял всего один год, что было обусловлено химической нестабильностью твердых жиров, выражавшейся в прогрессирующем перекисном окислении липидов, спустя год хранения.

В то же время, учитывая стабильность свойств ЧЛИ в течение двух лет в лиофилизированном состоянии, нами были предприняты исследования по изысканию липофильных основ со сроком годности

более 2 лет. Указанным требованиям отвечали основы марки «Витепсол», стабильность свойств которых составляла 3 года с момента выпуска.

Анализ результатов проведенных исследований показал, что из различных вариантов суппозиториев, приготовленных на основе витепсолов двух видов: Н-15 и ""-35, лучшими структурно-механическими свойствами обладали суппозитории, в которых витепсолы Н-15 и ""-35 были использованы в соотношении 1:1. Всего на основе альтернативного варианта было приготовлено 20 серий препарата «Свеферон». Сопоставительный анализ качественных показателей 5 серий препарата «Свеферон», изготовленных с использованием твердого кондитерского жира с эмульгатором Т-2 и 5 серий модифицированного варианта препарата на основах «Витепсол» Н-15 и ""-35 свидетельствовал о том, что последний вариант не только увеличивал срок хранения препарата, но и улучшал его внешний вид. По таким показателям, как время деформации и средняя масса свечей, статистически подтверждена достоверность различий (р<0,05) в пользу модифицированного варианта суппозиториев с ИФН, сохранявших исходные качественные характеристики в течение 27 мес. по сравнению с суппозиториями на основе твердого кондитерского жира с эмульгатором Т-2, срок годности которых был ограничен 15 месяцами.

Предлагаемое техническое решение было оформлено в виде «Производственного регламента на «Интерферон лейкоцитарный человеческий суппозитории — «Свеферон», утвержденного Ученым Советом ГИСК им. Л. А. Тарасевича ПР № 999-00 от 20.08.2000 г. и реализовано в условиях производства Пермского НПО «Биомед». Новизна метода приготовления суппозиториев с ИФН подтверждена патентом РФ № 2119330 «Свечи», приоритет от 25.09.1996 г.

Для оценки содержания ИФН в суппозиториях, необходимой для контроля готовой лекарственной формы, нами была усовершенствована методика определения противовирусной активности ИФН, применительно к свечам, изготовленным на основах «Витепсол». Сравнительный анализ водных растворителей (среда 199, вода очищенная) и жирорастворимых (эфир для наркоза и гексан) показал, что наиболее эффективным оказалось растворение суппозиториев в жирорастворимых растворителях с последующим экстрагированием ИФН 0,9%-ным раствором натрия хлорида. На «Способ определения содержания человеческого лейкоцитарного

интерферона в липофильных основах» получен патент РФ №2123351, приоритет от 16.11.95 г.

Известно об эффективности применения ИФН в комплексном лечении больных женщин с хроническими воспалительными процессами гениталий (Дубосарская и др., 1991). Однако клинических данных о применении суппозиториев, содержащих ИФН природного происхождения, в литературе мало. В этой связи нами была проведена оценка терапевтической эффективности суппозиторев с ИФН при лечении больных женщин с бактериальным вагинозом на этапе коррекции микрофлоры влагалища.

В качестве препарата сравнения был использован «Лактобактерин в свечах». У всех обследуемых проводили контроль состояния интерферонового статуса и фагоцитарной реакции нейтрофилов. По данным клинического наблюдения у больных отсутствовали побочные реакции при приеме препарата «Свеферон». Результаты сравнительного анализа ИФН-статуса (табл. 3) до и после антибактериальной терапии показал, что показатели а- и у-ИФН были равнозначны исходным значениям, при этом уровень сывороточного ИФН был снижен в два раза, что подтверждало наше предположение о возможном развитии бактериального вагиноза на фоне угнетения иммунологической реактивности организма. Принципиально важным для более полной характеристики состояния больных при БВ явилось изучение уровня ИФН во влагалищном секрете. Анализ полученных данных свидетельствовал о том, что в норме содержание ИФН в вагинальном секрете соответствовало показателям сывороточного интерферона крови. У больных БВ содержание ИФН и в крови и во влагалищном секрете в 10-20 раз превышало аналогичные показатели у здоровых женщин. После курса лечения препаратом «Свеферон» у больных БВ отмечена нормализация уровня сывороточного ИФН и во влагалищном секрете (р < 0,05). Определение уровня ИФН в вагинальном секрете может иметь, на наш взгляд, практическое значение, так как наличие или отсутствие его в вагинальном секрете согласуется с положительными или отрицательными результатами критериев Amsel.

Сравнительная клиническая оценка состояния женщин с БВ по данным критериев Amsel и уровня интерферона после лечения свечами с лактобактерином и интерфероном

Критерии оценки Контрольная группа (здоровые женщины (п = 15) Результаты клинической оценки состояния женщин с БВ после проведенного лечения

Свечами с лактобак-терныом (п-18) Свечами с интерфероном (и-20)

Выделения.

Гомогенные серозные 0 0 0

Белые хлопьевидные 0 3 0

Гиперемия слизистых 0 3 0

рН менее 4,5 15 15 20

рН более 4,5 0 3 0

«-» аминный тест 15 18 20

Уровень сывороточного ИФН (МЕ/мл) 0,5 ±0,24 4,8 ±0,93 1,4 ±0,29*

Уровень ИФН-а (МЕ/мл) 162,1 ±15,13 184,9 ±15,43 179,2 ±14,39

Уровень ИФН-у (МЕ/мл) 44,8 ±4,2 40,9 ± 3,48 48,1 ±3,67

Уровень ИФН в вагинальном секрете (МЕ/мл) 0 7,6 ±0,85 0

Примечание. *—р < 0,05 — относительно контрольной группы

Результаты сравнительных исследований показали, что активность фагоцитарной реакции нейтрофилов у больных, леченных эубиотиками, была достоверно ниже таковых у больных опытной группы (р > 0,05). Показатели фагоцитарной активности нейтрофилов крови и влагалищного секрета у женщин с БВ после применения «Свеферона» приближались к значениям фагоцитарной активности у здоровых женщин (табл. 4).

Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов и содержания лизоцима у здоровых женщин и женщин, страдающих бактериальным вагинозом до и после лечения

Исследуемые показатели Исследуемый материал Здоровые женщины (контроль) Больные с БВ до лечения После лечения

Антибиотиком «Ги-иалгин» Препаратом «Свеферон» Суппозиториями с лактобак-терином

Процент фагоцитоза кровь 67,1 ±1,47 29,7 ± 1,52 26,5 ±1,41 67,2 ±0,93* 52,4 ±1,57

влаг. секрет 40,4 ±1,02 17,7 ±1,03 15,4 ±1,02 41,4 ±0,89* 30,6 ±0,63

Фагоцитарное число кровь 1,2±0,04 0,7 ±0,02 0,5 ±0,02 1,2 ±0,03* 0,8 ±0,03

влаг. секрет 0,7 ±0,02 0,2 ±0,02 0,2 ±0,0! 0,7 ±0,02* 0,5 ±0,03

Фагоцитарный индекс кровь 1,8 ±0,05 2,5 ±0,02 2,3 ±0,02 1,8 ±0,05* 1,4 ±0,02

влаг. секрет 1,7 ±0,04 1,4±0,07** 1,3 ±0,03 1,7 ±0,04* ±0,09****

Лизоцим, у. е. кровь 0,6 ±0,01 0,5 ±0,01 0,5 ±0,02*** 0,6 ±0,04* 0,4 ±0,02

влаг. секрет 0,7 ±0,01 0,3 ±0,02 0,3 ±0,01 0,7±0,01*** 0,4 ±0,01

Примечание. •—р>0,05; **—р<0,05; ***—р<0,01 — отаосительно контрольной группы; ****—р < 0,05 относительно группы больных БВ, леченных препаратом «Свеферон».

Таким образом, на фоне применения препарата «Свеферон» отмечалась нормализация показателей фагоцитарной активности нейтрофилов крови и вагинального секрета. Полученные данные свидетельствовали о достоверном повышении активности лизоцима (р>0,01) на фоне применения «Свеферона» 0,7 ±0,01 у. е. и 0,4 ± 0,02 у. е. у больных, леченных суппозиториями с лактобактерином, однако, в крови оно было менее значительно, чем в вагинальном секрете (0,6 ± 0,04 у. е. и 0,4 ± 0,01 у. е. соответственно).

Создание оптимальной композиции мази с интерфероном, оценка безвредности и клинической эффективности

Отдельный раздел исследований был посвящен созданию лекарственной формы ИФН — мази. Создание мазевой лекарственной формы ИФН оправдано тем, что возможно нанесение активной

субстанции на входные ворота инфекции (слизистые носоглотки, полости рта).

Выбор состава мазевой основы важен для сохранения активности специфической составляющей в течение максимально возможного срока. В специальной серии экспериментов были изучены 10 композиций мазевых основ различной химической природы, включающие две гидрофильные (гидрат окиси алюминия, натрий КМЦ с глицерином), две липофильные (вазелин с ланолином; масло косточковое и ланолин) и шесть дифильных эмульсионных основ (вазелин в различных соотношениях с эмульгаторами Т-2 и МГД). Показано, что наиболее устойчивыми к воздействию различных физических условий (хранение при 8 и 22°С в течение 6 мес., центрифугирование со скоростью 1500 об/мин, термостатирование при 45 °С в течение часа) являлись дифильные и липофильные основы.

Результаты сравнительных исследований позволили определить оптимальное соотношение компонентов эмульсионной основы: вазелин — 60 %, МГД и Т-2 от 2 до 5 %, дистиллированная вода до 30%. На «Мазь с интерфероном человеческим лейкоцитарным «Интерон» получен патент РФ № 2141819, приоритет от 27.11.1999 г.

Для оценки биодоступности ИФН в мази нами были проведены исследования по поиску универсального способа экстрагирования активного вещества из дифильных основ. С этой целью были изучены органические растворители: эфир, гексан и водные растворы: 0,9%-ный раствор натрия хлорида, вода очищенная, среда 199. В результате исследований было определено, что статистически достоверное высвобождение ИФН из эмульсионных основ достигалось с помощью водных растворителей, в частности, 0,9%-ным раствором натрия хлорида (р<0,05). На способ экстрагирования интерферона из дифильных мазевых основ получен патент РФ № 2148396, приоритет от 25.08.1998 г.

Результаты изучения стабильности ИФН в дифильных мазевых основах свидетельствовали о том, что предложенный нами способ приготовления мази с ИФН способствовал сохранению противовирусной активности ЧЛИ, включенного в мазевую основу, при температуре от 2 до 8 °С в течение не менее одного года.

При изучении биодоступности мази с ИФН in vivo было проведено сравнение нескольких способов введения мази: аппликации на слизистые прямой кишки, носовой полости и на кожу. Исследование динамики содержания ИФН в плазме крови кроликов при ректальном введении мази и аппликации на слизистую носоглотки (рис. 1), показало, что при ректальном введении ИФН обнаруживается в крови

ИФН МЕ/мл 500

Время (ч.)

Уровень интерферона в сыворотке крови кроликов при митраназальном введении мази с интерфероном

"»■"Уровень интерферона при ректальном введении мази с интерфероном

Рис. 1. Динамика уровня интерферона в сыворотке крови экспериментальных животных при введении мази с интерфероном различными способами.

при максимальной активности, равной 387,5 МЕ/мл, к третьему часу после введения, сохраняясь в плазме до 5 ч на том же уровне с последующим снижением до исходных показателей к 8 часу.

Изучение динамики всасывания ИФН из мази при интраназальном введении животным свидетельствовало о том, что максимальное количество ИФН определялось в плазме кроликов через 2 ч после введения, причем достаточно высокий уровень его сохранялся до 4-го часа, постепенно снижаясь до исходных данных к 5 ч.

В серии модельных экспериментов по изучению всасываемости ИФН из мази через кожные покровы морских свинок было констатировано наличие ИФН в биоптатах кожи уже через час, а через 2 ч регистрировали максимальное содержание ИФН (218,75 МЕ/мл) в коже.

Таким образом, полученные результаты показали хорошую всасываемость ИФН из дифильной мазевой основы и отсутствие местно-раздражающего действия у лабораторных животных.

В опытах на крысах при оценке общетоксического действия мази выявлено, что при ежедневном в течение месяца нанесении мази с ИФН экспериментальным животным в дозе, в 40 раз превышающей суточную терапевтическую дозу, рекомендуемую для человека, не было выявлено отрицательного воздействия на организм крыс, что выражалось в отсутствии патологических изменений гематологических и биохимических показателей. Гистологическое исследование органов и тканей крыс опытной и контрольной групп подтвердило отсутствие в них морфологических изменений под влиянием хронического воздействия препарата на организм экспериментальных животных.

Для оценки терапевтической эффективности препарата «Мазь с интерфероном» на базе Пермской, городской клинической инфекционной больницы № 1 было проведено клиническое обследование больных с герпетической инфекцией. Мазью, содержащей ЧЛИ с активностью 10000 МЕ/г, было пролечено 20 больных в возрасте от 24 до 53 лет с герпетическими поражениями различных участков кожи, которым на места поражения ежедневно 2 раза в течение 5 дней наносили мазь.

Данные клинического наблюдения свидетельствовали о том, что у больных, применявших мазь с ИФН, в сравнении с контрольной группой больных, пролеченных по общепринятой схеме, раньше исчезали местные проявления инфекции такие, как боль в области высыпаний — на 1,2 ± 0,2 дня, жжение — на 1,5 ± 0,1 дня, зуд — на 1,6 ±0,1 дня. Переносимость больными препарата была хорошей, побочные реакции не зарегистрированы. Ни у одного из пациентов не отмечено появления новых везикул в процессе лечения и рецидивов в ближайшие 3-4 недели после проведенного лечения. Анализ клинико-лабораторных показателей у больных опытной группы больных свидетельствовал о перспективности и целесообразности использования препарата «Мазь с интерфероном» в качестве средства лечения герпетической инфекции, вызванной вирусом простого герпеса.

Заключая этот раздел исследований, необходимо отметить, что на основании результатов доклинического и клинического изучения разработанная нами лекарственная форма «Мазь с интерфероном» была рекомендована Комитетом МИБП МЗ РФ к регистрации в Российской Федерации в качестве лекарственного средства для наружного применения (протокол № 4 от 20.06.2002 г.)

Разработка способа изготовления и оценка лекарственной эффективности сублингвальной таблетированной формы интерферона

В настоящее время особое внимание уделяют созданию препаратов для перорального применения (Маркорян и др., 1998; Каленик и др., 1999; Белявская, 2001). Таблетированные формы лекарственных средств имеют ряд преимуществ — точность дозирования, малый объем, удобство применения.

Исходя из этого, нами были проведены исследования по разработке оптимального состава таблетки, обеспечивающего длительный контакт специфической составляющей со слизистой полости рта. Все вспомогательные вещества, наполнители и их количества, используемые нами для изготовления таблеток, разрешены к медицинскому применению в России. Учитывая определенные требования, предъявляемые к таблеточной массе, а также необходимость подбора состава наполнителей, которые бы способствовали сохранению противовирусной активности вводимого в таблеточную массу ИФН, нами были проведены исследования по определению оптимальных соотношений составляющих компонентов. Анализ результатов исследования 5 вариантов различных составов таблеточной массы позволил определить оптимальный состав композиции: ИФН очищенный от низкомолекулярных (до 5кДа) и высокомолекулярных соединений (выше 300 кДа), гранулирование с помощью лактозы с 5 % поливинилпиралидона (ПВП), а также стеарат магния и аэросил. Данный состав обеспечивал более длительное растворение таблетки в полости рта в течение 8-9 мин. На «Оральный препарат интерферона в виде таблеток» получен патент № 2175554 приоритет от 30.03.1999 г.

Учитывая, что любая разрабатываемая технология лекарственных препаратов требует наличия способа количественного определения действующего вещества в лекарственной форме, нами был разработан метод оценки количества ИФН в таблетированной форме. В качестве экстрагентов ИФН из таблетки были апробированы водные растворители: питательная среда 199, стерильная очищенная вода, изотонический раствор натрия хлорида. Результаты сравнительных исследований показали, что наиболее полное высвобождение ИФН из таблеток происходит при его экстрагировании средой 199. Статистически достоверных различий не было зарегистрировано между расчетной активностью ИФН в таблетке (11710,0 ± 2244,00 МЕ/табл.) и определяемой в среде 199 после

обработки таблеток (9643,0 ± 2809,00 МЕ/табл.; р>0,05). Разработанный нами метод определения противовирусной активности ИФН в таблетках был включен в проект Фармакопейной статьи предприятия «Интерферон таблетки 4000 МЕ» (Экспертное заключение ГИСК им. Л. А. Тарасевича от 18.02.2003 г.).

Для оценки эффективности орального применения ИФН было проведено сравнительное исследование двух методов (рис. 2). Первый регламентированный метод оценки таблетированных форм препаратов включал предварительное измельчение и растворение таблетки, содержащей ИФН, в 0,7 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида с последующим сорбированием жидкости на губку, которую вводили в полость рта кроликов. Второй метод, предложенный нами, предусматривал помещение таблетки с ИФН в марлевый мешок, который с помощью зажима удерживали в полости рта животного.

ИФНМЕАШЛ700 600 500 400 300 200 100

0-1-----.-----------•

0 30 мин 1 ч. 2 ч. 3 ч. 4 ч. 5 ч. 6 ч. 7 ч. 8 ч.

Время наблюдения

- *■ Орально* введение растворенной таблетки ■ Оральное введение таблетки с интерфероном * Внутримышечное введете раствора интерферон«

Рис. 2. Динамика противовирусной активности интерферона в плазме крови кроликов при его оральном и внутримышечном ведении.

Контрольной группе вводили очищенный ИФН (субстанция для таблеток) внутримышечно.

Показано, что ИФН, введенный сублингвально в форме таблетки, хорошо проникал в капиллярную систему слизистой ротовой полости и в плазме крови животных обнаруживался уже через 1 ч после введения. Максимальное содержание ИФН, регистрируемое по уровню противовирусной активности, определяли через 2 ч после введения (450,0 ± 28,87 МЕ/мл) и в течение 6 ч, затем отмечено снижение до исходного уровня. Аналогичные результаты были получены при оральном введении растворенной таблетки с ИФН, а также ИФН, введенного внутримышечно.

Доклиническая оценка безопасности препарата ЧЛИ в таблетках включала определение острой и хронической токсичности. При оценке острой токсичности для мышей использовали четыре дозы: 160000 МЕ/кг, 280000 МЕ/кг, 600000 МЕ/кг, 1200000 МЕ/кг. Максимально токсическую дозу данного препарата для мышей выявить не удалось. Изучение хронической токсичности, проводимое при многократном введении в течение 1,5 мес. сублингвальной таблетки с ИФН кроликам в дозе, превышающей курсовую в 5,63 и 22,5 раз, показало отсутствие признаков интоксикации и изменений в поведении животных.

По мнению ряда авторов, наряду с многочисленными иммуномодулирующими эффектами, препараты ИФН оказывают стимулирующее влияние на фагоцитоз (Вахрамеева и др., 1988; Авдеева и др., 1990; Ярилин,1999). Исходя из этого, нами была проведена серия экспериментов по определению влияния новой лекарственной формы ИФН на фагоцитарную активность нейтрофилов в процессе длительного его введения, определение которой проводили по методу В. Н. Каплина (1996). Из данных, представленных в табл. 5, следует, что фагоцитарное число у кроликов, получавших таблетку с активностью 7500 ME составило 1,6 ± 0,08, у животных, получавших таблетку с активностью 30000 ME — 1,7 ±0,08, в контрольной группе животных — 1,1 ±0,04 (р < 0,05), фагоцитарный индекс — 2,5 ±0,07; 2,4 ± 0,07 и 2,2 ± 0,05 соответственно (р < 0,05); процент фагоцитоза — 63,4 ±2,73; 69,2 ±1,69 и 49,6 ±2,46 соответственно (р<0,05). Данный эффект подтверждал наличие у препарата иммуномодулирующего действия.

Изучение фармакокинетики ИФН на добровольцах после однократного приема препарата «Интерферон таблетки» подтвердило хорошее высвобождение ИФН из таблетированной формы и, как следствие, поступление его в капилляры слизистой полости рта, о чем

свидетельствовало повышение уровня противовирусной активности плазмы крови добровольцев и сохранение ИФН в плазме крови в течение 6 час. Определение уровня ИФН в моче у добровольцев показало, что ИФН выводится из организма через мочевыводящую систему, что согласуется с данными литературы о решающей роли почек в выведении ИФН из организма (Bacci Velio et al,l978).

Таблица 5

Фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови кроликов на фоне ежедневного в течение 1,5 мес. введения ИФН в таблетках

Фагоцитарная активность нейтрофилов Контрольная группа животных Опытные группы кроликов, получавших ежедневно таблетку с ИФН в течение 1,5 мес.

Таблетка с ИФН с противовирусной активностью 7500 МЕ/табл. Таблетка с ИФН с противовирусной активностью 30000 МЕЛгабл.

Фагоцитарное число 1,1 ±0,04 1,5 ±0,08* 1,7 ±0,08*

Фагоцитарный индекс 2,2 ±0,05 2,5 ±0,07* 2,5 ±0,07*

Процент фагоцитоза 49,6 ±2,46 63,4 ±2,73** 65,2 ±2,69*

Процент активных фагоцитов 32,4 ±1,86 43,6 ±3,06* 46,6 ±2.45*

Примечание. • —р < 0,05; ** —р < 0,01 по сравнению с контролем.

Исходя из позитивных данных доклинической оценки и результатов исследований, проведенных на добровольцах, нами было получено разрешение Комитета МИБП МЗ РФ и ГИСК им. Л. А. Тарасевича на проведение клинических исследований эффективности препарата «Интерферон таблетки» при лечении больных гриппом (протокол от 21.11.2003 г). В настоящее время клинические исследования препарата «Интерферон таблетки» находятся в завершающей стадии.

Выделение и физико-химическая оценка изолированного антибактериального низкомолекулярного пептидного комплекса, продуцируемого лейкоцитами человека, индуцированных вирусом Сендай

В последние годы значительно интенсифицировался поиск новых антибактериальных пептидов природного происхождения (Selstet, 1997; Novak et ah, 2000). Это связано с тем, что на фоне постоянно возрастающего количества антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов антибактериальные пептиды могут стать альтернативой традиционным антибиотикам (Sansonetti, 2000, Сидоренко, 2003). Показано, что в препаратах ЧЛИ, получаемых в настоящее время в соответствии с регламентированными методами синтеза, содержатся не только цитокины, но и фактор, обладающий антибактериальным действием (Кузнецов В. П. и др., 1982; Печеркина и др.,1982; Малеева и др., 1988; Коробов и др., 1989). Перед нами стояла задача определить условия продукции антибактериального фактора, ассоциированного с процессом интерфероногенеза, разработать метод выделения и оценить его физико-химические свойства, а также определить оптимальные параметры его очистки и концентрации. Изучение препаратов ИФН лейкоцитарного происхождения, выпускаемых в России, на присутствие антибактериального фактора показал, что уровень антибактериальной активности взаимосвязан с уровнем противовирусной активности препаратов, причем, чем выше противовирусная активность ИФН в силу качественной очистки, тем ниже его антибактериальная активность. Имела значение и природа ИФН, рекомбинантный ИФН ею не обладал.

Сравнительный анализ препаратов ИФН, полученных на различных стадиях технологического процесса, позволил сделать вывод, что достаточно высокий уровень активности антибактериального фактора обнаруживали в полуфабрикатах ЧЛИ (512-1024 МЕ/мл), полученных при обработке донорских лейкоцитов вирусами-индукторами ВБН и Сендай.

Как видно из данных рис. 3, продукция антибактериального фактора донорскими лейкоцитами, индуцированными вирусом Сендай, практически коррелирует со временем синтеза ИФН. Наиболее оптимальным сроком являлся 13-18 час от начала синтеза — время, в течение которого происходило накопление не только ЧЛИ с достаточным уровнем противовирусной активности, но и

Рис. 3. Динамика продукции фактора, обладающего антибактериальной активностью, и синтеза интерферона.

накапливалось оптимальное количество физиологически активных пептидов, обладающих антибактериальным действием.

Разработанный комплекс методов очистки и концентрации дал возможность получать из исходного пептида, содержащего 256 УЕ/мл, препарат с активностью 32000 УЕ/мл и содержанием хлоридов в 3,5 раза меньше, чем в изотоническом растворе хлорида натрия.

Результаты изучения физико-химических свойств выделенного антибактериального фактора показали его выраженную устойчивость к температурным воздействиям, так при кипячении от 5 мин. до 60 мин. его антибактериальные свойства не редуцировались.

Пептидная природа антибактериального фактора была подтверждена устойчивостью его к воздействию таких ферментов, как ДНК-аза и РНК-аза в течение 4-х часов при температуре 37 °С (табл. 6). Полная инактивация происходила при обработке проназой, в два раза активность его снижалась после обработки коллагеназой, в четыре раза — под влиянием трипсина и в 128 раз — под воздействием папаина.

Оценка влияния ферментов на антибактериальную активность фактора, синтез которого ассоциирован с интерфероногенезом

Использованные ферменты Антибактериальная активность фактора, УЕ/мл

До обработки После обработки

ДНК-аза 2048 2048

РНК-аза 2048 2048

Коллагеназа 2048 1024

Трипсин 2048 512

Папаин 2048 16

Проназа 2048 0

Определение молекулярной массы выделенного антибактериального фактора показало, что он является комплексом низкомолекулярных пептидов, представленным 5 пептидами с молекулярной массой от 1296,8 до 1673,11 Да (рис. 4).

В составе пептидного комплекса зарегистрировано 16 аминокислот, определяющих его свойства (рис. 5). Так, содержание изолейцина (6,2%), лейцина (7,0%), валина (6,2%), обеспечивает гидрофобные свойства антибактериальных пептидов, характеризующих их сродство к фосфолипидам бактериальных мембран, удельный вес которых суммарно составляет около 20 %, что, по-видимому, достаточно

Рис. 4. Масс-спектрограмма низкомолекулярного пептидного комплекса (серия 2).

Глутам ин 48,50 %

Рис. 5. Аминокислотный состав антибактериального фактора.

для обеспечения гидрофобных свойств пептидного комплекса. Количество же остатков аминокислот, несущих анионный заряд молекул пептида представлен только аспартатом — 1,98%, что значительно меньше общего содержания аминокислот, являющихся донорами катионных групп.

Полученные данные позволили нам предположить, что выделенный пептидный комплекс, продукция которого ассоциирована с интерфероногенезом, обладает суммарным положительным зарядом в сыворотке крови при слабощелочных значениях рН. Исследование пептидного комплекса методом электрофореза на ацетат-целлюлозных мембранах также свидетельствовало о катионных свойствах его молекул.

Изучение антибактериальных свойств пептидного комплекса, синтезируемого донорскими лейкоцитами под действием вируса Сендай — индуктора интерфероногенеза

Изучение спектра антибактериального действия пептидного комплекса в серии модельных экспериментов подтвердило его антимикробную активность в отношении некоторых культур грамположителъных и грамотрицательных микроорганизмов (табл. 7). В условиях унифицированного эксперимента с использованием равной

Чувствительность микроорганизмов к низкомолекулярному пептидному комплексу*, продуцируемому индуцированными лейкоцитами в процессе интерфероногенеза

Исследованные микроорганизмы Штамм Характеристика окраски по Граму % чувств. микроорганизмов

Escherihia coli АТСС 25922 - 63

Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р + 86,1

Staphylococcus epidermidis (референт. -штамм) 33 + 100

Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027 - 33,3

Bacillus cereus АТСС 8035 + 0

Streptococcus faecalis 389 + 5,6

Proteus mirabilis Выделен из раневого отделяемого - 0

Klebsiella pneumoniae Выделен от больного инфекционном энтеритом - 83,3

Примечание, в эксперименте использована серия 3 антибактериального пептидного комплекса с удельной активность 2,98 УЕ/мкг на 1 мл микробной взвеси.

концентрации микробной взвеси для всех изученных микроорганизмов (1,5х106 КОЕ/мл) показана высокая чувствительность к антибактериальному пептидному комплексу Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis, а из грамотрицательных Escherihia coli и Klebsiellapneumoniae.

Заключительным этапом работы явилось изучение влияния комплекса низкомолекулярных пептидов на микроорганизмы, выделенные из мочи детей с различной патологией мочевой системы. У больных хроническим пиелонефритом как правило высевали Staphylococcus aureus в 41,7 %; Escherihia coli 33,3 %, Proteus mirabilis и Klebsiella spp. в 25 % случаев. Ингибирующее действие пептидного комплекса на репродуктивную способность уринобактерий зарегистрировано в отношении всех видов микроорганизмов. Сравнительный анализ штаммов Staphylococcus spp., изолированных из мочи больных с различной патологией мочевой системы, показал наличие бактерицидного действия пептидного комплекса в концентрации 4096 УЕ/мл на все исследуемые штаммы этого

возбудителя. У представителей грамотрицательной флоры таких, как бактерии Klebsiella spp. и Escherihia coli отмечена чувствительность к данному пептидному комплексу в указанной концентрации в 86,67 % случаев. В то время как наибольший процент нечувствительных бактерий был отмечен у бактерий рода Proteus spp. — 38,5 %.

Особо следует отметить неравнозначность чувствительности к пептидному комплексу уропатогенной микрофлоры, выделенной от больных с различными клиническими формами патологии мочевой системы (рис. 6). Для подавления роста уропато генных микроорганизмов, выделенных из мочи больных пиелонефритом и сочетанными формами поражения мочевого тракта, в ряде случаев недостаточно было максимальной концентрации препарата, равной 8000 УЕ/мл, что свидетельствовало в пользу того, что уропатогенные микроорганизмы, способны вызывать поражения верхних отделов мочевой системы, более вирулентны, нежели бактерии, вызвавшие воспаления слизистой мочевого пузыря.

Рис. 6. Функции распределения чувствительности к антибактериальному пептидному комплексу уропатогенов, выделенных от больных с различными нозологическими формами поражения мочевой системы.

Таким образом, нами впервые был выделен пептидный комплекс, синтезируемый индуцированными донорскими лейкоцитами в процессе интерфероногенеза, обладающий антибактериальным действием. Разработанные нами методы выделения, очистки и концентрации антибактериального препарата из продуктов синтеза интерферона в дальнейшем могут служить основой для получения перспективных комплексных препаратов ИФН, обладающих не только противовирусным, но и антибактериальным действием.

По материалам исследований оформлена заявка на патент «Антибактериальный препарат» №200315421, приоритет от 5.02.2003 г.

В заключение необходимо подчеркнуть, что разработанные новые лекарственные формы ИФН характеризовались выраженной терапевтической эффективностью при лечении различных нозологических форм вирусных инфекций. Предложенный метод выделения, очистки и концентрирования пептидного комплекса, обладающего антибактериальной активностью, перспективен для создания комплексных с природным лейкоцитарным ИФН препаратов на основе ресурсосберегающей технологии.

ВЫВОДЫ

1. Оптимизированный метод очистки и концентрации вируса Сендай применительно к условиям крупномасштабного производства интерферона, позволил получать вирусную суспензию с удельной активностью до 140800 ГАЕ на мг белка аллантоисной жидкости.

2. Реакторный метод суспензионного культивирования лейкоцитов, индуцированных очищенным и концентрированным вирусом Сендай, при двухэтапном синтезе интерферона способствовал повышению выхода лейкоцитарного интерферона на 37 %, получению целевого продукта со сниженным содержанием ксеногенных белков до 2,8мг/мл при отсутствии овальбумина, обеспечивая его высокое качество и возможность использования в виде субстанции при разработке новых лекарственных форм (суппозитории, мазь, таблетки), а также обеспечивал технико-экономический эффект в пределах 310 тыс. рублей в год.

3. Установлена зависимость уровня содержания цитокинов в препаратах интерферона от применяемой технологии получения

человеческого лейкоцитарного интерферона. Показано, что в процессе очистки и последующего лиофильного высушивания интерферона в составе препарата выявлялся спектр цитокинов, в частности, ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-8,ФИО-а, ИФН?.

4. Усовершенствованная технология получения суппозиториев с интерфероном на гидрофобной основе позволила увеличить срок годности препарата с 12 мес. до 27 мес. Разработан и предложен метод определения активности интерферона в суппозиториях с применением сочетанного экстрагирования его гексаном и 0,9% раствором натрия хлорида.

5. Показана эффективность использования усовершенствованного препарата «Свеферон» для полноценной коррекции микробиоценоза влагалища у женщин с бактериальным вагинозом. Выявлено стимулирующее действие препарата на локальные факторы резистентности влагалища.

6. Разработана мазевая лекарственная форма интерферона на дифильной эмульсионной основе, включающая поверхностно активные вещества: 5% моноглицеридов дистиллированных и 5% эмульгатора твердого Т-2, 60 % вазелина и 30 % дистиллированной воды, обеспечивающих биодоступность специфической составляющей и стабильность качественных показателей.

7. Результатами клинико-лабораторных исследований подтверждена эффективность мази с интерфероном при лечении больных герпетической инфекцией, обусловленной вирусом простого герпеса и герпеса-зостер. Показано, что клиническая симптоматика, характерная для проявления острой герпетической инфекции, редуцируется в среднем на 1,5-2 дня раньше, по сравнению с общепринятой терапией.

8. Разработан способ получения сублингвальной таблетированной формы интерферона, обеспечивающей длительный контакт действующего начала со слизистой полости рта. Результатами доклинического исследования подтверждена безвредность лекарственной формы и отсутствие местно-раздражающего действия. Показана биодоступность и сохранение в течение шести часов высокого уровня содержания интерферона в плазме крови экспериментальных животных. Установлено, что длительное введение интерферона в таблетках в количествах, превышающих в 5,6 и 22,5 раза курсовую дозу, не только не оказывало угнетающего влияния на фагоцитоз, но и стимулировало фагоцитарную активность нейтрофилов у экспериментальных животных.

9. Показано, что с процессом интерфероногенеза во времени и по количественным показателям ассоциирована экспрессия вирусиндуцированнвми лейкоцитами антибактериального фактора. Максимальная концентрация его, как и интерферона, регистрировалась к 13-18 часам от начала процесса интерфероногенеза. Разработан и предложен метод выделения, очистки и концентрации антибактериального фактора, основанный на гельфильтрации с последующим замораживанием и оттаиванием, обеспечивающий получение препарата с удельной антибактериальной активностью 114695,34 УЕ/мг.

10. Определено, что антибактериальный фактор представляет собой комплекс низкомолекулярных пептидов, состоящих из 5 пептидов с молекулярной массой от 1296,8 до 1673,11 Да. Аминокислотный спектр пептидного комплекса представлен 16 аминокислотами, в том числе, изолейцином, лейцином, валином, определяющими его катионную природу.

11. Показано, что выделенный очищенный и концентрированный низкомолекулярный пептидный комплекс подавляет in vitro рост тест-культур Staphylococcus aureus (АТСС 6538-Р), Streptococcusfaecalis (эталон ГИСК 389), Escherichia coli (АТСС 25922), Pseudomonas aeruginosae (АТСС 9027), Bacillus cereus (АТСС 8035), Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis в концентрации 4096УЕ/мл, проявляя максимальную антибактериальную активность в отношении Staphylococcus aureus (грам+) и Klebsiellapneumoniae (грам -).

12. Определены бактериостатический и бактериоцидный эффект низкомолекулярного пептидного комплекса в отношении уропатогенной микрофлоры, выделенной от больных с инфекциями мочевой системы. Максимальная чувствительность к пептидному комплексу зарегистрирована у урокультур микроорганизмов рода Staphylococcus и Klebsiella. Показано, что для 100 % подавления роста микроорганизмов, высеваемых из мочи больных циститами, достаточно концентрации пептидного комплекса, равной 4096 УЕ/мл.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Петров В. Ф., Волкова Л. В., Кузнецов В. П. Создание суппозиториев ректальных для лечения вирусных заболеваний//Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики: Тез. докл. Всероссийской научно-практической конф. Пермь, 1993.— С. 99-100.

2. Петров В.Ф., Юшков В. В., Волкова Л. В., Кузнецов В. П. Фармакокинетика интерферона при ректальном пути введения // Там же.—С. 101-1023.

3. Юшков В. В., Петров В. Ф., Юшкова Т. А., Волкова Л. В. Критерии оценки аллергенности интерферона в свечах // Там же.— С. 141-1424.

4. Волкова Л. В., Молохова Е. И., Петров В. Ф. Разработка технологии и использование в клинике мягких лекарственных форм нативного интерферона // Клиничекая аллергология и иммунология: Тез. докл. Междунар. конф., Минск, 1998.—С. 239-240.

5. Волкова Л. В., Молохова Е. И., Петров В. Ф., Сафонова Г. М. Поиск стабилизирующих факторов мазевой композиции с интерфероном // Современная вакцинология: Тез. докл. Междунар. конф. Пермь, 1998.—С. 213.

6. Пархоменко Т. Г., Петров В. Ф., Волкова Л. В., Казьянин А. В. Усовершенствование технологии производства интерферона. Новые лекарственные формы интерферона // Там же.— С. 160-161.

7. Волкова Л. В., Петров В. Ф., Сафонова Г. М., Молохова Е. И. Способ определения противовирусной активности интерферона в мягких лекарственных формах: Патент на изобретение РФ № 2123351 от 1998 г. Приоритет от 16.11.1995.

8. Волкова Л. В., Петров В. Ф., Сафонова Г. М., Кузнецов В. П. Свечи. Патент на изобретение РФ №2119330 от 1998. Приоритет от 25.09.1996.

9. Волкова Л. В., Петров В. Ф., Шарыгина Е. В., Кривоногова М. А., Галаутдинова Н. Ф. Поиск оптимального состава мази с интерфероном // Фармация в XXI веке: инновации и традиции: Тез. докл. Междунар. конф., Санкт-Петербург, 1999.— С. 51.10.

10. Волкова Л. В., Петров В. Ф. Мазь с интерфероном человеческим лейкоцитарным «Интерон»: Патент на изобретение РФ № 2141819 от 1999 г. Приоритет от 15.07.1997.

11. Молохова Е. И., Волкова Л. В. Технологические аспекты создания мягких лекарственных форм лейкоцитарного а-интерферона // Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Матер. Всероссийской научной конф., Уфа, 2000.— С.173-175.

12. Волкова Л. В., Петров В. Ф. Способ определения активного вещества в дифильных мазевых основах: Патент на изобретение РФ № 2148396 от 2000 г. Приоритет от 25.08.1998.

П.Пархоменко Т.Г., Николаева A.M., Волкова Л.В. Препараты из крови человека//Фармацевтическое обозрение.— №19 (144).— 2000.—С. 14-16.

14. Волкова Л. В., Шарыгина Е. В., Тюрева Т. А., Сафонова Г. М., Молохова Е. И. Фармакокинетика мази «Интерон» // Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы: Матер. научно-практической конф., Пермь.— 2000.— С. 145.

15. Волкова Л. В., Пучнин В. С, Петров В. Ф. Оральный препарат интерферона в виде таблеток: Патент на изобретение РФ № 2175554 от 2001 г. Приоритет от 30.03.1999.

16. Казьянин А. В., Волкова Л. В. Опыт производственного выпуска интерферона человеческого лейкоцитарного в ПНПО «Биомед»// Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Тез. докл., Томск.—2001.—С. 22-23.

П.Волкова Л. В., Галаутдинова Н. Ф., Пархоменко Т. Г., Казьянин А. В. Опыт использования вируса Сендай в условиях крупномасштабного производства интерферона//Там же.— С. 30-32.

18. Волкова Л. В., Пестерева С. А., Тюрева Т. А. Сравнительная динамика противовирусной активности интерферона при различных способах его введения // Там же.— С. 32-34.

19. Падруль М. М., Волкова Л. В., Олина А. А. Применение препарата «Свеферон» в комплексном лечении бактериального вагиноза // Там же.— С. 38-40.

20. Волкова Л. В., Сафонова Г.М., Пестерева С. А., Перевозчикова Е. Н., Бизяева Н. Ю. Влияние мази с интерфероном на модель раневой инфекции у животных // Там же. — С. 40-42.

21. Волкова Л. В., Тюрева Т. А. Влияние упаковочного материала на хранение мази с интерфероном // Там же.— С. 119-121.

22. Волкова Л. В. Сравнительное изучение динамики противовирусной активности интерферона в плазме кроликов при ректальном и внутривенном введении // Указатель депонированных рукописей по медицине и здравоохранению ГЦНМБ.— №293-В2002 от 12.02.2002.

23. Volkova L. V., Ustinova О. Ju. Application of tabloid human leukocyte inerferon to treat children with secondar immunosuppresive state that territories with ecological risk//International Conference «Environmental Pollution ICEP — 2001», 18-25 September 2001, Volgograd — Perm, Russia.

24. Волкова Л. В., Кузнецов В. П. Современные лекарственные формы интерферона и их клинические свойства//Антибиотики и химиотерапия.— 2002. — Т. 47, №11. — С. 30-37.

25. Волкова Л. В., Косарева П. В. Структура уропатогенной микрофлоры на современном этапе//Указатель депонированных рукописей по медицине и здравоохранению ГЦНМБ.— № Д-27214 от 1.11.2002.

26. Волкова Л. В., Окишев М. А., Воробьева Н. Н., Кузнецов В. Ф., Ланин Д. В., Орлова Н. Г., Эйхнер Э. Э. Клинико-иммунологический статус у больных при лечении препаратом «Интерферон таблетки 4000 МЕ»//Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии: Тез. докл. 5-го Конгресса Российской Ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ), Москва.— 2002.— С. 246.

27. Волкова Л. В., Окишев М. А., Воробьева Н. Н., Эйхнер Э. Э. Показатели системы интерферона у больных гриппом на фоне лечения интерфероном в таблетках // Иммунология Урала.— Пермь, 2002.—№1(2).—С. 31-32.

28. Волкова Л. В., Косарева П. В., Аверьянова Н. Н. Антимикробное действие низкомолекулярного катионного пептидного комплекса, синтезированного в процессе интерфероногенеза//Человек и лекарство: Тез. докл. X Российского национального конгресса, Москва, 2003.—С. 591.

29. Волкова Л. В., Пестерева С. А. О возможности получения новой лекарственной формы природного интерферона в виде таблеток // Там же.— Москва, 2003.— С. 703.

30.Воробьева Н.Н., Волкова Л.В., Эйхнер Э.Э., Рысинская Т.К., Мвшкина О. К., Сумливая О. Н., Мерзлова Н. Б. Эффективность мази с человеческим лейкоцитарным интерфероном при герпетической инфекции // Там же.— Москва, 2003.— С. 143.

31.Волкова Л.В., Казьянин А.В., Пучнин B.C. Технологические аспекты разработки таблетированной формы интерферона // Объединенный медицинский журнал.—2003.— № 1 (4).—С. 73-77.

32. Волкова Л. В., Олина А. А., Падруль М. М., Пестерева С. А. Состояние системы интерферона у женщин с бактериальным вагинозом при использовании препарата «Свеферон» // Ликвидация и элиминация инфекционных болезней — прогресс и проблемы: Тез. докл. Междунар. конгресса Санкт-Петербург, 2003.— С. 155.

33. Волкова Л. В., Косарева П. В., Аверьянова Н. И., Полюдова Т. В., Лемкина Л. М. Антибактериальное действие низкомолекулярного катионного комплекса из лейкоцитов человека // Там же. — С. 155.

34. Волкова Л. В., Косарева П. В., Пестерева С. А. Влияние низкомолекулярного катионного пептидного комплекса на патогенные и условно-патогенные микроорганизмы//Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке: Матер. Всероссийской научн. конф., Пермь, 2003.— С. 297-299.

35. Волкова Л. В., Воробьева Н. Н., Эйхнер Э. Э. Лечение герпетической инфекции мазью с человеческим лейкоцитарным интерфероном // Там же.— С. 299-301.

36. Волкова Л. В., Сафонова Г. М., Пестерева С. А. Итоги доклинических испытаний новой лекарственной формы интерферона//Там же.— С. 302-305.

37. Волкова Л. В. Технология сублингвальных таблеток с интерфероном и оценка их качества // Там же. — С. 305-307.

38. Волкова Л. В., Коробов В. П. Антибактериальный препарат. Приоритет от 25.02.2003, № 2003105421.

39. Волкова Л. В., Казьянин А. В., Тимашева О. А. К вопросу о продукции антибактериального фактора, ассоциированного с интерфероногенезом//Биотехнология: состояние и перспективы

развития: Матер. П Московского международного Конгресса, Москва, 2003.—Ч. 1 — С. 116-117.

40. Волкова Л. В., Казьянин А. В., Тимашева О. А. Оптимизация технологии синтеза лейкоцитарного интерферона//Там же.— Ч. 1.—С. 117.

41. Аверьянова Н. И., Косарева П. В., Волкова Л. В., Денисова А. В. Антибиотикорезистентность уропатогенной микрофлоры, выделенной от больных с инфекциями мочевой системы // Человек и лекарство: Тез. докл. XI Российского национального конгресса, Москва.—2004.—С. 56.

42. Волкова Л. В., Бахметьев Б. А., Пестерева С. А., Ожерельева Е. Е. Цитокиновый профиль природных препаратов интерферона //Там же.—С. 864.

43. Волкова Л. В. Лекарственные формы интерферона//Там же.— С. 774.

44. Гуляева Н. И., Волкова Л. В., Березина Е. А., Ожерельева Е. Е., Мелехин СВ., Пестерева С.А. Влияние антибактериального фактора интерферона на структурные преобразования лимфоидной ткани внутренних органов у экспериментальных животных // Журн. «Фундаментальные исследования».— 2004.—№ 2.— С. 49-51.

45. Волкова Л. В., Косарева П. В., Аверьянова Н. И. Катионные пептиды как основа создания антибактериальных препаратов//Пермский медицинский журнал.— 2004.— №2.— С. 139-143.

46. Волкова Л. В., Пестерева С. А. Биодоступность новой лекарственной формы интерферона//Пермский медицинский журнал.— 2004.— № 3. — С. 74-78.

47. Волкова Л. В. Физико-химическая характеристика низкомолекулярного пептидного комплекса, ассоциированного с интерфероногенезом // Сибирский медицинский журнал.— 2004.— Т. 19, №2. — С. 53-55.

48. Волкова Л. В. Биотехнологические аспекты лекарственных форм природного интерферона//Сибирский медицинский журнал.— 2004, — Т. 19, № 2. — С. 51-53.

49. Волкова Л. В., Казьянин А. В., Косарева П. В., Пестерева С. А., Гуляева Н. И., Ожерельева Е. Е., Березина Е. А., Мелехин С. В., Аверьянова Н. И. Антибактериальное и иммуномодулирующее действия пептидного комплекса, ассоциированного с

интерфероногенезом в опытах in vitro и в доклинических экспериментах // Пермский медицинский журнал.— 2004.— № 4.— С. 74-82.

50. Волкова Л. В., Косарева В. П., Платова Л. А., Аверьянова Н. И. Теоретическое обоснование антибактериального действия ассоциированного с процессом интерфероногенеза пептидного комплекса// Сибирский медицинский журнал.— 2004.— Т. 19, №3. — С. 82-85.

51. Косарева П. В., Волкова Л. В., Аверьянова Н. И. Чувствительность урокультур бактерий к катионному пептидному комплексу, ассоциированному с процессом интерфероногенеза//Актуальные проблемы охраны материнства и детства: Матер. Междунар. российско-американской научно-практ. конф., Тула.— 2004.— С.97-99.

52. Чувительность урокультур бактерий Escherichia, Staphulococcus, Klebsiella и Proteus к ассоциированному с интерфероногенезом пептидному комплексу//Свидетельство на интеллектуальный продукт ВНТИЦ № 73200400139 от 08.07.2004 г.

ВОЛКОВА Лариса Владимировна

ПРИРОДНЫЕ а-ИНТЕРФЕРОН И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЙ ПЕПТИДНЫЙ КОМПЛЕКС: ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ, НОВЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ, ОЦЕНКА

ЭФФЕКТИВНОСТИ

Автореферат

Подписано в печать 22.11.2004. Формат 60 х84/16. Усл. печ. л. 3,0. Тираж 100 экз. _Набор компьютерный. Заказ № 907/2004_

Отпечатано на ризографе в отделе Электронных издательских систем ОЦНИТ Пермского государственного технического университета 614600, г. Пермь, Комсомольский пр., 29а, к.113, т.(3422) 198-033

12578 6