Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Активированные кислородные метаболиты в регуляции Th1/Th2-зависимых патологических процессов

На правах рукописи

□□344832 1

ТКАЧЕВ Виктор Олегович

АКТИВИРОВАННЫЕ КИСЛОРОДНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ В РЕГУЛЯЦИИ ТЫ/ТЬ2-ЗАВИСИМЫХ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

14.00.16 - патологическая физиология 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 О ИТ 2003

Новосибирск— 2008

003448321

Работа выполнена в ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН (Новосибирск) и ГУ Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН (Новосибирск)

Научные руководители:

академик РАМН, профессор, доктор медицинских наук доктор биологических наук

Шкурупий Вячеслав Алексеевич Кудаева Ольга Тимофеевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

Меньшикова Елена Брониславовна

доктор медицинских наук, профессор

Останин Александр Анатольевич

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Новосибирск)

Защита состоится «|Л> 2008 г в /У часов на заседании

диссертационного совета Д 001.048.01 в ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН по адресу ул Академика Тимакова, 2, г. Новосибирск, 630117 тел/факс (8-383) 333-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН

Автореферат разослан «^f» _üUruc£)V2008 : Ученый секретарь диссертационного совета, д б.н Пальчикова H.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В начале 70-х годов прошлого столетия [Babior В.М, et al, 1973], было показано, что резкое увеличение потребления молекулярного кислорода фагоцитами (получившее название «дыхательного взрыва») связано с интенсивной внутриклеточной продукцией кислородных радикалов, которые обеспечивают защиту организма от инфекционных агентов Еще раньше была доказана важная роль активированных кислородных метаболитов (АКМ) в повреждении собственных тканей, например, при радиационных поражениях [Тарусов БН, 1957], что привело к формированию понятия окислительного стресса - состояния, сопровождающегося увеличением продукции в клетках АКМ (а также радикалов некислородной природы), и первоначально рассматривавшегося исключительно как деструктивное звено в механизме развития различных патологических состояний [Меньшикова Е Б и др 2006]

По современным представлениям, АКМ являются важными сигнальными молекулами, принимающими участие в регуляции разнообразных физиологических и патофизиологических процессов, включая такие фундаментальные как пролиферация, апоптоз и дифференцировка клеток, воспаление и регенерация тканей [Меньшикова Е Б и др 2006, Thannickal V J, Fanburg В L, 2000, Valko M, et al, 2007]

Установлено участие АКМ в регуляции функций иммунокомпетенгных клеток Особый интерес представляет их влияние на Thl/Th2-баланс в иммунной системе, который является базисным параметром регуляции иммунного ответа [Allen J Е, Maizels RM, 1997; О'Gor D et al, 2003] Сложившаяся концепция о существовании «классического» и «альтернативного» механизмов активации макрофагов, ведущих к их дифференцировке в М1-, либо в М2-клетки, соответственно, связывает особенности метаболизма активных форм кислорода и азота в макрофагах и дендритных клетках с ТЫ/ТЬ2-балансом в иммунной системе [Зенков НК и др, 2007, Morris SMJr, 1998, Mills С, et al, 2000; Mills CD, 2001] Активированные по классическому пути макрофаги (Ml), характеризующиеся высоким уровнем продукции оксида азота (NO) и низким уровнем активности аргиназы - другого ключевого фермента метаболизма L-аргинина, - обладают способностью стимулировать клеточный иммунный ответ (Thl-зависимый) Макрофаги, активированные по альтернативному пути (М2), характеризующиеся

противоположными особенностями метаболизма L-аргинина, стимулируют гуморальный иммунный ответ (ТЬ2-зависимый), а также процессы регенерации тканей

Однако накопленные к настоящему времени экспериментальные данные об участии АКМ в ТЫ/ТЬ2-девиации иммунного ответа имеют неполный и зачастую противоречивый характер Следует отметить, что изучение роли АКМ в регуляции иммунного ответа in vivo является достаточно сложной научной задачей, требующей выбора адекватной экспериментальной модели

Хроническая реакция трансплантат против хозяина (РТПХ) представляет собой иммунную реакцию, развивающуюся в результате трансплантации зрелых Т-лимфоцитов донора неспособному к их отторжению реципиенту в условиях их тканевой несовместимости [Шевелев А С, 1976] Хроническая РТПХ, индуцированная трансплантацией полуаллогенных лимфоидных клеток в системе DBA/2 (C57B16xDBA/2)Fl, может развиваться по двум вариантам, иммунопатологические особенности и проявления которых связаны с преимущественной активацией различных субпопуляций Т-клеток (ТЫ- и ТЬ2-звена иммунной системы) [Кудаева ОТ, и др, 1992, Колесникова О П., и др, 1999] Таким образом, РТПХ-индуцированные иммунопатологические состояния могут быть использованы как чрезвычайно удобные тест-системы для изучения влияния различных фармакологических и нефармакологических воздействий на процессы Th 1 /Th2-peгуляши иммунных процессов in vivo

Одной из актуальных задач современной фармакологии является создание новых селективных иммуномодуляторов, способных дифференцированно воздействовать на Thl- и ТЬ2-звенья иммунной системы Целенаправленное изменение метаболического состояния имму но ко миете нт ных клеток может являться новым подходом в терапии заболеваний, связанных с нарушением ТЬ1/ТЬ2-баланса Возможно, наиболее перспективной клеточной мишенью для такого иммуномодулирующего воздействия являются макрофаги, «дирижирующие» дифференцировкой Т-лимфоцигов

В соответствии с вышеизложенным, были сформулированы цель и задачи настоящей работы

Цель исследования. Целью работы было изучение роли активированных кислородных метаболитов в ТЫЛЪ2-регуляции иммунного ответа

Задачи исследования:

1. Изучить влияние соединений, обладающих оплозитным влиянием ш ТЫЛЪ2-баланс в организме (мурамилдипеггпща (МОР)и дегидроэлиандростерона сульфата (DHEA-S)) на продукцию активных форм кислорода клеткам! иммунной системы, а также продукцию оксида азота и активность арглназы в макрофагах ш vivo и ш vitro

2 Исследовать продукцию активированных кислородных метаболитов, а также активность аршназы при Thl- и Независимых иммунопатологических состояниях, индуцированных хронической РТПХ, в том числе при модуляции ее развития введением DHEA-S и MDP

3 Изучить влияние окисленных химическим путем декстранов различной молекулярной массы, а также наноразмерных липосомальных биосовместимых композиций (далее липосомальные композиции) на их основе на продукцию активированных кислородных метаболитов, а также активность аргиназы в иммунокомпетентных клетках

4 Оценить воздействие окисленных декстранов различной молекулярной массы на Thl/Th2-поляризацию иммунного ответа in vivo на модели хронической РТПХ

5 Исследовать влияние экзогенных про- и антиоксидангов (супероксидного радикала, перекиси водорода, супероксиддисмутазы и каталазы) на продукцию оксида азота и активность аршназы в макрофагах in vitro

Научная новизна работы. Впервые показано, что эндогенно продуцируемая макрофагами перекись водорода способствует поддержанию физиологического уровня аргиназной активности в этих клетках; удаление перекиси водорода каталазой приводит к ее снижению и, соответственно, к увеличению продукции оксида азота

Установлено, что при Thl- и ТЬ2-зависимых вариантах развития хронической РТПХ нейтрофилы периферической крови различаются по способности продуцировать супероксидный радикал Важным признаком ТЬ2-зависимого варианта хронической РТПХ является истощение «метаболических резервов» нейтрофилов, в связи с их неспособностью увеличивать продукцию АКМ в ответ на добавление стандартного стимулятора (продигиозана)

Получены данные ч о патогенетической связи классического и , альтернативного механизмов активации макрофагов с Thl- и Th2-зависимыми РТПХ-индуцированными иммунопатологическими состояниями

На модели хронической РТПХ показано изменение метаболического состояния иммунокомпетентных клеток фармакологическими агентами, модулирующими ТЫ/ТЬ2-баланс m vivo Введение MDP, обладающего способностью увеличивать продукцию активных форм кислорода и активировать макрофаги по альтернативному механизму, на начальных этапах развития хронической РТПХ сопровождается девиацией иммунного ответа сторону ТЬ2-зависмых процессов DHEA-S, обладающий противоположным действием на метаболизм АКМ и активирующий макрофаги по классическому пути, стимулирует Thl-зависимые иммунные реакции

Впервые показана способность окисленных декстранов с молекулярной массой 35 и 60 кДа а также наноразмерных липосомальных композиций на их основе активировать макрофаги по классическому пути Важным свойством окисленных декстранов является их способность активировать кислородный метаболизм лейкоцитов крови, сохраняя при этом «метаболические резервы» клеток

Теоретическая и практическая значимость работы.

Полученные в экспериментах in vivo данные на модели хронической РТПХ свидетельствуют о наличии тесной взаимосвязи Thl/Th2-баланса в организме с метаболическим состоянием иммунокомпетентных клеток. При этом существует обратная зависимость между уровнем продукции N0, с одной стороны, и уровнем продукции активных форм кислорода в клетках иммунной системы (прежде всего, продукции супероксидного радикала NAD(P)H-0Kciifla30ñ), с другой Полученные результаты расширяют имеющиеся представления о роли АКМ в функционировании иммунной системы и о механизмах, обеспечивающих Thl/Th2-регуляцию иммунного ответа

Результаты работы обосновывают возможность создания фармакологических препаратов нового типа, предназначенных для иммунокоррекции различных патологических процессов, обусловленных нарушениями ТЫ/ТЬ2-баланса, путем целенаправленного воздействия на метаболическое состояние клеток иммунной системы

Экспериментально обнаруженная способность окисленных декстранов, а также наноразмерных гибридных липосомальных биосовместимых композиций, приготовленных на их основе, активировать макрофаги по классическом механизму позволяет

рекомендовать их для дальнейшего изучния в качестве перспективных иммуномодулирующих агентов

Основные положения, выносимые на защиту:

1 При активации макрофагов существует функциональный антагонизм между ферментными системами, обеспечивающими продукцию супероксидного радикала и оксида азота

2 Метаболическое состояние клеток иммунной системы, определяющее уровень продукции активных форм кислорода и оксида азота, является одним из регуляторов ТЫ/ТЪ2-баланса в организме

3 Окисленные декстраны, а также наноразмерные гибридные липосомальные биосовместимые композиции с ними, оказывают значимое модулирующее влияние на функции макрофагов, способствуя их активации по классическому механизму

Апробация работы Основные результаты работы были представлены на 7-й отчетной сессии ГУ НИ Института клинической иммунологии СО РАМН (2006 г), Иммунологическом форуме РААКИ (г Санкт-Петербург, 2007 г), Объединенном иммунологическом форуме РААКИ и РНОИ (г Санкт-Петербург, 2008 г), Сибирском физиологическом съезде (г Барнаул, 2008 г.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из них 6 статей в в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук. Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, описания материала и методов исследования, 7 глав с описанием результатов собственных исследований с их обсуждением, заключения, выводов и библиографического указателя Работа изложена на 149 страницах машинописного текста, иллюстрирована 38 рисунками и 13 таблицами Список литературы включает 405 источника (22 отечественных и 383 зарубежных).

Работа выполнена в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2912 годы» Госконтракт № 02.513 11 3183 с использованием оборудования Центра коллективного пользования СО РАМН

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Животные. В работе использовали мышей - гибридов первого поколения (С57В1/бхЕ)ВА/2)Р 1 (ВбБ2Р1), самок, мышей линий

DBA/2, самок, полученных из экспериментально-биологической клиники лабораторных животных СО РАМН (г Новосибирск), в возрасте 2-6 месяцев Животных содержали в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986)

Органы, клетки и ткани выделяли по стандартным методикам [Гольдберг Е Д и др , 1992]

Индукцию хронической реакции трансплантат против хозяина осуществляли у мышей путем переноса самкам (C57B16xDBA/2)Fl лимфоидных клеток родительской линии DBA/2 Клетки селезенки, выделенные ex tem poro, внутривенно вводили реципиентам в дозе 65x106 клеток двукратно с интервалом в 5 дней [Kimura M et al, 1987] В качестве контроля использовали интактных животных того же генотипа, пола, возраста, что и в опыте, а также животных, которым аналогичным образом переносили сингенные клетки О развитии ТЪ2-зависимого варианта хронической РТПХ судили по появлению стойкой протеинурии (более 3 мг/мл)

Количество белка в моче определяли немедленно после ее получения колориметрически с красителем Cumassi Blue на длине волны 570 rati Калибровочную кривую строили по BSA (100-1000 мкг/мл), результаты выражали в мг/мл

Супероксид-продуцируюшую способность нейтрофилов крови определяли в стандартном HCT-тесте, используя 10 мкл периферической крови В стимулированном тесте добавляли продигиозан в конечной концентрации 0,001% Результат выражали в процентах HCT-позитивных клеток

Для количественной оценки этого параметра в суспензии спленоцитов измеряли оптическую плотность (X = 570 нм) раствора формазана в диметилсульфоксвде после инкубации клеток с HCT [Amano D et al, 1975]

Измерение внутриклеточного содержания перекиси водорода проводили методом проточной цитометрии с использованием 2'7'-дихлорофлуоресцина диацетатом (DCFH DA) [Robinson JP et al, 2005] Измерение интенсивности флуоресценции проводили на приборе FACSCalibur (BD, США) Результат выражали в интенсивности флуоресценции проб.

Продукцию оксида азота оценивали по содержанию нитритов (в мкМ) в супернатантах двухсуточных клеточных культур макрофагов, используя реактив Грисса [Green L С et al, 1982]. Макрофаги предварительно стимулировали липополисахаридом (LPS Е Coli

штамм В5 055) в конечной концентрации 10 мкг/л или LPS в сочетании с ингерфероном-гамма (IFN-y), источником которого служил супернатант аллогенной смешанной культуры лимфоцитов

Активности аргиназы определяли по скорости образования мочевины из экзогенного L-аргинина с использованием а-изонитрозопропиофенона [Corraliza IМ et al, 1994]

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием непараметрическош критерия Манна-Уитни и коэффициента ранговой корреляции Спирмена Отличия между сравниваемыми величинами показателей считали статистически значимыми при р < 0,05 На рисунках статистически значимые различия между экспериментальной и контрольной группой отмечали знаком * (р < 0,05) и ** (р < 0,01), между экспериментальными группами - # (р < 0,05) и Ж (р < 0,01)

Результаты исследования и их обсуждение Использование хронической РТПХ в качестве модели для изучения роли АКМ в регуляции иммунного ответа in vivo

Реакция трансплантат против хозяина, индуцированная в полуаллогенной системе DBA/2 —► (C57B16xDBA/2)Fl развивается по хроническому типу в силу иммунологических особенностей мышей линии DBA/2 [Rus, 1995] Показано существование двух ее оппозитных вариантов, частота развития которых определяется, главным образом, ТЫ/ТЬ2-балансом в иммунной системе [Козлов В А, и др, 2002, Кудаева ОТ, и др, 2004] В настоящее время не известны критерии, позволяющие разделять эти варианты на ранних сроках после индукции хронической РТПХ, лишь через 2-3 месяца у мышей с ТЬ2-зависимым вариантом хронической РТПХ выявляют стойкую протеинурию, свидетельствующую о развитии аутоиммунного гломерулонефрита

В контроле аутоиммунное поражение почек было выявлено у 5060% мышей, a Thl-зависимый вариант развивался, соответственно, в 40-50% случаев При действии препаратов, сдвигающих Thl/Th2-баланс, это соотношение изменяется Так, введение DHEA-S приводит к доминированию Thl-, a MDP - ТЬ2-зависимого варианта хронической РТПХ [Кудаева О Т. и др, 2005]

Продукция супероксидного радикала в динамике хронической РТПХ и при ее модуляции DHEA-S и MDP

Активность продукции супероксидного радикала нейтрофилами крови на поздних сроках хронической РТПХ зависит от ее иммунопатологического варианта При Thl-варианте спонтанная и

активированная продигиозаном продукция супероксидного радикала не отличается от контроля. При Независимом варианте развития хронической РТПХ отмечено снижение спонтанной продукции супероксидного радикала в НСТ-тесте, а также отсутствие прироста продукции 02" в ответ на активирующий стимул (продигиозан) (Рис. 1). Это указывает на вовлечение в процесс продукции АКМ всех способных к этому нейгрофилов в результате действия избытка активирующих факторов (которыми, в данных условиях, могут быть аутоантитела и циркулирующие иммунные комплексы) на фоне возникающих дефектов супероксид-генерирующей системы лейкоцитов экспериментальных животных с аутоиммунным гломерулонефрит ом. Обнаруженные нарушения ферментативных систем, обеспечивающих продукцию супероксидного радикала мо1ут трактоваться как истощение «метаболических резервов» нейгрофилов вследствие избыточной активации метаболизма кислорода, которая происходит на ранних сроках после индукции хронической РТПХ.

I I слокт

I IСТУМ/Л

Контроль (п = 12)

РТПХ (п = 12) РТПХ + РНЕА-З (п = 15)

РТПХ (п = 12) РТПХ+ РНЕА-8 (п = 15)

2

2 недели

□

4 недели

Р **

#*

1

Контроль (п = 12) ТИ1 (п = 12) ТЪ2 (п = 9)

Рис. 1. Пэвдкция суперокадаого радиола нейтрофилами врови при разгичььк вариантах хронтесюй РТПХ

О 10 20 30 40 50 60 Процент НСТ-позшвных нейтрофилов

Рис. 2. Продукция супероксидного радикала нейтрофилами крови при модуляции хронической РТПХОНЕА-З

Курсовое введение БНЕА-З (четырехкратно в разовой дозе 38 мг/кг массы тела) в фазу индукции снижает спонтанную продукцию супероксидного радикала нейтрофилами, тогда как продигиозан-стимулированная продукция 02" не изменяется (Рис. 2).

При модуляции развития хронической РТПХ курсовым введением мурамилдипептида на ранних сроках реакции (двукратно, в дозе 1 мг/кг мгзссы тела) отмечена тенденция к увеличению, продукции супероксидного радикала нейтрофилами.

Полученные данные свидетельствуют, что метаболическая активация нейтрофилов на ранних сроках развития хронической РТПХ связана с поляризацией иммунных процессов в ТЫ-сторону.

Продукция оксида азота и активность аргиназы в перитонеальных макрофагах при хронической РТПХ

На ранних этапах развития хронической РТПХ уровень продукции оксида азота подвержен значительным колебаниям в зависимости от времени, прошедшего с момента начала индукции. Спустя 48 часов после первой и второй трансплантации лимфоидных клеток отмечено увеличение продукции N0. Активность аргиназы имела тенденцию к снижению во всех контрольных точках. Выявленная динамика изменений NO-синтазной и аргиназной активности макрофагов может быть связана с изменениями концентраций про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови в процессе развития хронической РТПХ [Garlisi C.G., et al., 1993, Rus V., et al., 1995].

Контроль (n = 8) Th1 (n = £

Th2 (n = 7)

Рис. 3. ЬРБЖп-с-тмулированная продукция оксида азота при ТН1- и ТЬ2-зависимом вариантах хронической РТПХ

1800 1600

Ш 1400 2

3 1200 го

X 1000 S

Го 800 J3

8 ™ 1 ™

2CD

KonipoJb(n = 8) Till (n-8) Tít2(n = 7)

Рис. 4. Активность аргиназы при ТМ- и 1Т|2-зависимом вариантах хронической РТПХ

При ТЫ-зависимом варианте развития хронической РТПХ отмечено увеличение ЬРЭЛРК-у-стимулированной продукции оксида азота перитонеальными макрофагами, что свидетельствует об их активации по классическому механизму (Рис. 3). При ТЬ2-зависимом РТПХ-индуцированном иммунопатологическом состоянии увеличивается активность аргиназы (Рис. 4), что характерно для альтернативно активированных макрофагов.

Использование в качестве объекта исследования перитонеальных макрофагов позволяет сделать вывод, что обнаруженные различия в метаболизме аргинина в иммунокомпетентных клетках носят системный, универсальный характер, и не могут быть обусловлены собственно наличием иммунного воспаления ткани почек при Инварианте хронической РТПХ Альтернативная активация макрофагов при этом может быть вызвана циркулирующими иммунными комплексами [Anderson С F, Mosser D М, 2002, Anderson С F , Mosser D М, 2002 (2)], образование которых характерно для ТЬ2-зависмого иммунопатологического варианта хронической РТПХ, при этом изменение функциональных свойств макрофагов усиливает гуморальные иммунные реакции, что приводит к увеличению продукции аутоантител и, следовательно, вносит значительный вклад в развитие аутоиммунного гломерулонефрига

Таким образом, активация макрофагов по классическому либо альтернативному механизмам играет важную роль в патогенезе Thl- и ТЬ2-зависимых патологических состояний, вызванных хронической РТПХ.

Влияние дегидроэпиандростерона сульфата и мурамиддипептида на продукцию активных форм кислорода клетками иммунной системы

Исходя из полученных данных об оппозитном влиянии DHEA-S и MDP на ТЬ1ЯЬ2-баланс в иммунной системе, представляло интерес оценить их влияние на продукцию активных форм кислорода m vitro и in vivo клетками иммунной системы ингактных мышей

Спустя 2 часа после введения экспериментальным животным DHEA-S снижает спонтанную продукцию супероксидного радикала нейтрофилами, а спустя 6 часов - клетками селезенки, среди которых основными продуцентами 02" в НСТ-тесте являются макрофаги Дегидроэпиандростерон не влияет на продукцию супероксидного радикала, стимулированную продигиозаном In vitro DHEA-S снижает внутриклеточную концентрацию перекиси водорода в перитонеальных макрофагах и спленоцигах (табл 1), что также свидетельствует об инактивации супероксид-генерирующих клеточных систем, поскольку в клетках иммунной системы большая часть Н202 образуется в результате дисмутации 0{ [Маянский АН, Маянский ДН, 1989, Меныцикова Е Б, и др, 2006] MDP in vivo усиливает продукцию супероксидного радикала нейтрофилами периферической крови, a m vitro увеличивает содержание Н202 в макрофагах и спленоцигах (см табл 1)

Таким образом, БНЕА-Б и МБР оказывают противоположное влияние на образование активных форм кислорода в различных типах клеток, участвующих в реализации иммунного ответа

Таблица 1

Влияние БНЕА-Б и МБР на внутриклеточное содержание перекиси водорода в перитонеальных макрофагах и спленоцитах (изменение интенсивности флуоресценции в процентах от соответствующего

Время инкубации с исследуемыми веществами Перигонеальные макрофага Спленощльг

DHEA-S 200 мкМ MDP 5 мкг/мл MDP 10 мкг/мл DHEA-S 200 мкМ MDP 5 мкг/мл MDP 10 мкг/мл

15 минут 98 177** 211** 82** 96 100

45 минут 72** 108 170** 75** 112 137**

Влияние дегидроэпиандростерона сульфата и мурамилдииептида на продукцию оксида азота и активность аргиназы в макрофагах

Поскольку ранее было показано, что Thl-зависимый иммунопатологический вариант хронической РТПХ сопровождается классической, а ТЬ2-зависимый вариант - альтернативной активацией макрофагов, было изучено влияние DHEA-S и MDP на продукцию оксида азота и активность аргиназы в макрофагах, связанную с механизмом их активации [Moms SM, et al, 1998, Munder M, et al, 1998]. Дегидроэпиандростерон сульфат m vivo увеличивает LPS-стимулированную продукцию оксида азота (Рис 5), a in vitro существенно ингибирует активность аргиназы (Рис 6)

Мурамилдипепгид in vitro увеличивает спонтанную продукцию оксида азота, вероятно, за счет взаимодействия с TLR-рецепторами и активации MAPKZNF-кВ-зависимых сигнальных путей [Weidemann В et al, 1997], тогда как in vivo обладает противоположным эффектом -увеличивает активность аргиназы в перитонеальных макрофагах (на 44%)

Таким образом, DHEA-S (in vitro и in vivo) и MDP (in vivo) способствуют активации макрофагов по классическому либо альтернативному механизмам, соответственно

Полученные данные свидетельствуют, что продуцируемые клетками иммунной системы АКМ, в частности супероксидный радикал и оксид азота, играют важную роль в регуляции Thl/Th2-

баланса в организме, что создает предпосылки к созданию новых типов иммуномодуляторов, селективно изменяющих метаболическое состояние иммунокомпетентных клеток. Мишенью такого терапевтического вмешательства могут являться макрофаги, обладающие мощными АКМ-генерирующими системами.

14»ЧЯ» 12 чэоов 24 часа (п = 8) (п=В| (п = 5)

Рис. 5. Влияние DHEASHaJinC-стомулироб прсц^щю NO in vivo

Щ 2Ю

№кгропь(п=8) DHBVS200wAvi

(п = 8)

Рис. 6. Влитие CHBVS reí аютиостъ аршназы ¡n viro

Влияние окисленных декстранов и наноразмерных липосомальных биосовместимых композиций на их основе на метаболическое состояние макрофагов

Декстраны являются природными соединениями полисахаридной природы, которые эффективно фагоцитируются макрофагами и длительно находятся в лизосомальном аппарате клеток, активируя их защитные функции [Шкурупий В.А., 2008]. Окисление молекул декстрана приводит к появлению диальдегидных групп. Это позволяет присоединять к ним различные соединения, в том числе лекарственные средства, что обусловливает их возможное применение в качестве биоактивных матриц-носителей фармпрепаратов [Шкурупий В.А., 2008]. Однако окисление декстранов, изменяющее их структуру, может приводить к изменению их биологических свойств. Исходя из этого, были исследованы влияния окисленных декстранов, а также наноразмерных липосомальных биосовместимых композиций на их основе на функциональную активность клеток иммунной системы.

Влияние окисленных декстранов на продукцию супероксидного радикала нейтрофилами in vivo. Окисленные декстраны с молекулярными массами 35 (OxDex-35) и 60 кДа (OxDex-60) вводили внутрибрюшинно интактным мышам (C57B16xDBA/2)Fl в дозе 50 мг/мышь в виде 10% водных растворов. Установлено, что спустя 8

часов после введения окисленные декстраны усиливают спонтанную и стимулированную продигиозаном продукцию супероксидного радикала нейтрофилами периферической крови в НСТ-тесте (табл 2)

Таблица 2

Показатели спонтанного/стимулированного продигиозаном НСТ-теста у мышей BDF1 после введения окисленных декстранов in vivo_

Время после введения препаратов Группы животных

Физ раствор OxDex-35 OxDex-60

2 часа 24,8/41,5 26/43,6 28/46

8 часов 28,5/37 40,2*/60,5* 49,б*/61*

24 часа 32,2/45 27,6/34,6 29,4/40,4

48 часов 30,5/41,7 30,8/44,2 34,6/44,6

Увеличение продигиозан-стимулированной продукции АКМ на фоне предварительной активации нейтрофилов окисленными декстранами свидетельствует о сохранении «метаболических резервов» лейкоцитов, то есть об активации метаболических путей, направленных на поддержание субстратного обеспечения АКМ-генерирующих систем клеток Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что внутрибрюшинное введение окисленных декстранов различной молекулярной массы приводит к системным изменениям в организме В то же время продукция 02" спленоцигами не стимулируется окисленными декстранами в аналогичных условиях

Влияние окисленных декстранов и липосомальных композиций на продукцию оксида азота и активность аргиназы в макрофагах in vitro. Поскольку декстраны обладают особой тропностью к клеткам системы мононуклеарных фагоцитов и способны их активировать, представляло интерес исследовать их влияние на метаболизм L-аргинина в макрофагах в условиях in vitro В опытах in vitro окисленные декстраны добавляли к культурам перитонеальных макрофагов, выделенных от интакгных мышей (C57B16xDBA/2)Fl, в нетоксичных конечных концентрациях 0,16 и 0,25 г/л [Шкурупий В А и др, 2008]

В условиях in vitro OxDex-35 в дозе 0,25 г/л достоверно увеличивает LPS-стимулированную продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами, повышая ее в 3,5 раза OxDex-60 in vitro не изменяет LPS-стимулированную продукцию оксида азота и снижает на 20% LPS/lFN-у-стимулированную продукцию NO, что

может быть обусловлено активацией супероксид-генерирующих ферментативных систем. В тех же условиях окисленные декстраны вне зависимости от их молекулярной массы снижают активность макрофагальной аргиназы (Рис. 7).

Культивирование макрофагов в присутствии липосомальных композиций, приготовленных на основе окисленных декстранов, увеличивает спонтанную продукцию оксида азота клетками (Рис. 8).

I-1 1.61/Л

Кснтрспь Ofe-Ээ oc&f® (п = §1 (n = Q $1 = 9

Ftoc 7. &мячгес№1слетэКдаорансв на aavEHOcib aprmabiin vitro

Ю R О ° h-

1.5.

s

x 4-

u:

s

J 3.

л 0

CL

£ 2.

о

=r

; 1-

I I0.16nh ■Я 0,25 г/л

n/d

n/d

Кэнгропь ФХ QxCex-35 ОхОах-бО (n = S) (n = 6) (n = 8) (n = 8) FVic. 8. Влияние наносомальных ферм снисленных денстрансв на слопанную гродущию сксцоэ азота in vitro

Также липосомальная форма OxDex-35 в концентрации 0,25 г/л усиливает LPS-стимулированную продукцию (на 27%), а липосомальная форма OxDex-бО в концентрации 0,16 г/л усиливает ЬРЗЛШ-у-стимулированную продукцию оксида азота (на 58%). Фосфатидилхолин, используемый для приготовления композиций, на синтез N0 не влияет. Включенные в нанолипосомы окисленные декстраны различной молекулярной массы, равно как и суспензия фосфотидилхолина, не изменяют активность аргиназы в перигонеальных макрофагах при культивировании клеток с указанными соединениями в течение 24 и 48 часов.

Таким образом, эффект окисленных декстранов in vitro существенно зависит от их молекулярной массы, а включение их в наноразмерные липосомальные композиции заметно изменяет их активность. Подводя итог, можно отметить, что исследуемые производные декстранов, в целом, способствуют активации макрофагов по классическому механизму. Это указывает на то, что использование окисленных декстранов в качестве биоактивных

матриц-носителей лекарственных средств или же в качестве самостоятельных фармакологических агентов может иметь широкие перспективы в терапии ряда заболеваний различной природы, связанных с нарушением процессов иммунорегуляции Включение окисленных декстранов в состав липосом может изменить их фармакокинетические свойства, повысив их тропность к клеткам системы мононуклеарных фагоцитов, что чрезвычайно важно для адресной доставки фармакологических агентов в очаг воспаления, с сохранением в целом их активирующего влияния на макрофаги

Влияние окисленных декстранов на Thl /Т112-поляризацию иммунного ответа на модели хронической РТПХ in vivo. Вышеописанные эффекты окисленных декстранов позволяют предполагать у них наличие иммуномодулирующих свойств, в частности, способности оказывать влияние на ТЫЯЬ2-поляризацию иммунного ответа in vivo Однако на модели хронической РТПХ было установлено, что декстраны, вводимые экспериментальным животным в фазе индукции (двукратно, в суммарной дозе 100 мг/мышь), не приводят к изменению частоты развития ее Thl- и ТЬ2-зависимых иммунопатологических вариантов

Влияние окисленных декстранов и липосомальных композиций с ними на продукцию оксида азота и активность аргиназы в макрофагах in vivo. Поскольку отсутствие ожидаемых иммуномодулирующих эффектов окисленных декстранов in vivo противоречит их способности активировать макрофаги m vitro, было исследовано их влияние на макрофаги интактных животных in vivo Спустя 24 часа после введения окисленных декстранов с молекулярными массами 35 и 60 кДа отмечали пик продукции оксида азота макрофагами, которая при этом возрастает до уровня, достигаемого активацией NO-синтазы макрофагов сочетанием LPS и IFN-y (Рис 9) OxDex-35 при этом является более эффективным активатором продукции NO in vivo по сравнению с OxDex-60. Введение окисленных декстранов экспериментальным животным также увеличивает продукцию оксида азота, стимулированную LPS в сочетании с IFN-y

Таким образом, выявленные m vitro эффекты окисленных декстранов на продукцию оксида азота сохраняются и в условиях m vivo, но было установлено, что их влияние на активность аргиназы существенно разнится в зависимости от условий эксперимента OxDex-35 на активность этого фермента in vivo не влияет, тогда как OxDex-60 более чем троекратно увеличивает ее спустя 48 часов после введения препарата

i 35. g 30-P 25-

K 20 •

S 15-

Контроль OxDex-35 OxDex-60 (n = (S) (n = 8) (n - 8)

Рис. 9. Влияние окисленных декстранов на ЛПС-стимулированную продукцию оксида азота ¡n vivo

Полученные данные указывают на то, что m vivo влияние окисленных декстранов на макрофаги зависит от каких-то еще неизученных факторов, и это до определенной степени объясняет видимое отсутствие их эффекта на ТЫ/ТЬ2-поляризацию иммунного ответа в описанном выше эксперименте.

Влияние экзогенных про- и антиоксидантов на продукцию оксида азота и активность аргиназы в макрофагах

Для изучения связи окислительно-восстановительного клеточного баланса с активностью альтернативных путей метаболизма L-аргинина были исследованы влияния экзогенных про- и антиоксидантов на продукцию оксида азота и активность аргиназы в перигонеальных макрофагах интактных мышей линии (C57B16xDBA/2)Fl in vitro.

В качестве источника супероксидного радикала была использована система феназинметосульфат/восстановленный никотинамиддинуклеотид (PMS/NADH) [Van Noorden С.J., Butcher R.G., 1989; Rao U.M., 1989]. Было установлено, что увеличение продукции супероксидного радикала в результате дву- и трехкратного добавления к культуре макрофагальных клеток PMS/NADH снижает содержание нитритов в супернатантах клеточных культур (на 46 и 39%, соответственно), при этом активность аргиназы практически не изменяется. Супероксиддисмутаза (SOD), удаляющая 02- из среды, но параллельно повышающая уровень Н202, в дозе 500 Ед/мл, напротив, увеличивает содержание нитритов в супернатантах (на 56% по сравнению с контролем), не вл^ияя на активность аргиназы.

Перекись водорода, добавляемая к клеточным культурам однократно, в концентрации 100 нМ усиливает продукцию оксида азота. Активность аргиназы под влиянием экзогенной перекиси

водорода в исследованных концентрациях (10 нМ - 1 мкМ) не изменяется. В то же время, каталаза (Cat) дозозависимо снижает активность аргиназы в макрофагах (Рис. 10) и параллельно увеличивает продукцию N0 (Рис. 11).

_ 25- *

н S

о. ,с ь- 15-s

X

к

§-10. со

CL X

X

о

О J—-1-—,—-,-—.—-1-—.

кштрсаъ са боим са юоим (п=8) уп=10) (п=10)

FVic. 10. Втяниеютэтэы(Са) на прсруиую спад азота in vitro

1000-

а

ш

,2. em

г

та

с 600

Q. (0

£ 4ГО

<->

О

I

5 £ 200-

<

0-1—-1-.—-,---1-—.

кьмрсгъ ca so им ca тооим (n=a (n=iO) (n=io)

FVic. 11. Brasme кагапазы (Ca) на активность эршнаы вмафофажт\Ао

Полученные данные позволяют сделать вывод, что супероксидный радикал сам по себе не влияет на активность NO-синтазы и аргиназы в перитонеальных макрофагах мышей, снижение содержания нитритов в супернатанте клеток может быть обусловлено образованием пероксинитрита в результате взаимодействия NO с 0{. В то же время, влияние клеточных систем, обеспечивающих продукцию супероксидного радикала на пути метаболизма L-аргинина в макрофагах могут быть опосредованы основным метаболитом 02" -перекисью водорода, эндогенная продукция которой в клетках является физиологическим механизмом регуляции аргиназной (и, следовательно, NO-синтазной) активности.

Таким образом, in vitro показано наличие обратной взаимосвязи между активностью супероксид- генерирующих ферментативных систем и продукцией оксида азота в макрофагах.

ВЫВОДЫ

]. Активные формы кислорода и оксид азота оказывают оппозитное влияние на ТЫ/ТЬ2-баланс при развитии РТПХ-индуцированных иммунопатологических состояний. Увеличение продукции супероксидного радикала и перекиси водорода способствует Th2-поляризации иммунного ответа, тогда как увеличение продукции

оксида азота макрофагами совпадает с их Thl-поляризующим эффектом

2. Активности аргиназы и NO-синтазы в перитонеальных макрофагах мышей зависят от внутриклеточной концентрации перекиси водорода, уменьшение содержания которой под влиянием экзогенной каталазы снижает аргиназную активность и увеличивает продукцию оксида азота Снижение уровня N0 в клетках под влиянием экзогенно продуцируемого супероксидного радикала не сопровождается активацией аргиназы, что свидетельствует в пользу ускоренной трансформации образующегося оксида азота в пероксинитрит

3 Мурамилдипептид и дегидроэпиандростерон сульфат оказывают разнонаправленное влияние на активность АКМ-генерирующих систем и метаболизм L-аргинина в иммунокомпетентных клетках интактных животных Мурамилдипептид увеличивает продукцию активных форм кислорода и активность аргиназы, тогда как дегидроэпиандростерон сульфат снижает продукцию активных форм кислорода и усиливает синтез оксида азота

4 Развитие Thl-зависимого иммунопатологического варианта хронической РТПХ характеризуется активацией макрофагов по классическому механизму (с высоким уровнем продукции NO), а ТЬ2-зависимого варианта - альтернативной активацией макрофагов (с повышенной активностью аргиназы).

5 Наблюдаемая на ранних этапах развития хронической РТПХ активация кислородного метаболизма нейтрофилов крови способствует формированию ТЬ2-зависимого патологического состояния, что подтверждается в опытах in vivo Thl-голяризующим эффектом DHEA-S, снижающего продукцию супероксидного радикала лейкоцитами экспериментальных животных

6 Окисленные декстраны с молекулярной массой 35 и 60 кДа увеличивают продукцию супероксидного радикала нейтрофилами периферической крови in vivo

7. Окисленные декстраны, а также наноразмерные липосомальные биосовместимые композиции, приготовленные на основе этих полисахаридов, активируют макрофаги по классическому механизму в опытах in vitro, что указывает на возможность их использования в качестве иммуномодуляторов

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Уровень аутоантител к ДНК и метаболическая активность полиморфно-ядерных лейкоцитов в динамике хронической реакции трансплантат против хозяина / В.О Ткачев, ЕВ Ненашева, Е В Гойман, Н Н Вольский, О Т Кудаева, О П Колесникова // Иммунология -2006 -Т 27, №2 - С 98-101

2 Показатели гемопоэза в динамике развития хронической реакции трансплантат против хозяина /ВО Ткачев, Е В Гойман, А П Лыков, О Т Кудаева, О П Колесникова // Иммунология - 2006 -Т 26, № 3 - С 168-171

3 Ткачев В О Показатели гемопоэза в динамике развития хронической реакции трансплантат против хозяина /ВО Ткачев // Студент и научно-технический прогресс Материалы XLIV международной научной конференции молодых ученых, секты Биология - Новосибирск, 2006 - С 113-114

4 Ткачев В О Показатели развития аутоиммунного процесса в динамике развития хронической реакции трансплантат против хозяина /ВО Ткачев // Студент и научно-технический прогресс Материалы XLIV международной научной конференции молодых ученых, секция Медицина - Новосибирск, 2006 - С 16.

5 Ткачев В О Состояние кислородного метаболизма нейтрофилов крови характеризует особенности течения хронической РТПХ / В О Ткачев // Ломоносов - 2006 Сборник тезисов XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. - М, 2006 - С 527-528

6 Ткачев В О Состояние кислородного метаболизма нейтрофилов крови характеризует особенности течения хронической РТПХ / В О Ткачев, Н Н Вольский // Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека, от эксперимента к клинике Материалы 7-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН -Новосибирск, 2006. - С 90-94

7 Ткачев В О Патогенез хронической реакции «трансплантат против хозяина» роль активных форм кислорода /ВО Ткачев // Студент и научно-технический прогресс. Материалы XLV международной тучной конференции, секция Биология - Новосибирск, 2007 - С 167-168

8. Су пресс ирующее влияние дегидроэпиандростерона в условиях in vivo и in vitro на продукцию активированных кислородных метаболитов иммунокомпетентными клеткам мыши / ОМ Перминова, В О Ткачев, В В Сенюков, О Т Кудаева, Н Н

Вольский // Бюллетень Сибирского отделения РАМН - 2007 -№2 - С 19-22.

9 Ангиоксидантный эффект дегадроэпиандростерона сульфата и его влияние на ТЫ/ТЬ2-баланс в опытах in vivo / Н Н Вольский, О.Т. Кудаева, О М Перминова, В.О. Ткачев, Е В Гойман, В В. Сенюков, Т А Обут, В.А Козлов // Иммунология - 2007 - Т 28, №3 -С 134-138

10. Роль активных форм кислорода в ТЬ1/ТЬ2-поляризации иммунного ответа /ВО Ткачев, О.М Перминова, Н Н Вольский, О Т Кудаева, В А Козлов // Медицинская иммунология - 2007 -Т 9, №2-3 -С 165-166

11 Ткачев В О Альтернативные варианты активации макрофагов при экспериментальных Thl- и ТЬ2-зависимых иммунопатологических состояниях / ВО. Ткачев // Вестник Российской академии медицинских наук - 2008 - № 6 (Прил 1) - С 435-436

12 Влияние дегадроэпиандростерона на продукцию оксида азота и активность аргиназы в макрофагах мыши /ВО Ткачев, Н Н. Вольский, О Т Кудаева, О.П Колесникова // VI Сибирский физиологический съезд Тезисы докладов - Барнаул, 2008 - Т 1 -С 231

13 Альтернативные пути активации макрофагов при хронической РТПХ / ВО Ткачев, ОМ Перминова, НН Вольский, ОТ. Кудаева, ОП Колесникова, В.А Козлов // Российский иммунологический журнал - 2008 - Т. 2(11), № 2-3 - С 239

14. Влияние окисленных декстранов на NO-синтазную и аргиназную активность макрофагов мышей /ВО Ткачев, О П Колесникова, А В Троицкий, В А Шкурупий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины -2008 - Т. 145, №7 - С 91-94.

15. Продукция активных кислородных метаболитов при хронической реакции «трансплантат против хозяина», связь с Thl/Th2-поляризацией /ВО Ткачев, Н Н Вольский, О Т Кудаева, В О Козлов//Иммунология -2008 - Т 29, № 4 - С 209-212.

Список сокращений

АКМ - активированные кислородные метаболиты НСТ - нгаросиний тетразолий РТПХ - реакция трансплантат против хозяина Cat - каталаза

DHEA-S - дегидроэпиадростерон сульфат

IFN-y - интерферон-гамма

LPS - липополисахарид

MDP - мурамиддипептвд

N0 - оксид азота

OxDex-35 - окисленный декстран с молекулярной массой 35 кДа OxDex-60 - окисленный декстран с молекулярной массой 60 кДа SOD - супероксиддисмутаза

Соискатель _ Ткачев В О

Подписано в печать 28.09.08. Тираж 100 экз. Заказ 321/08. Отпечатано ПКЦ "Полиграфика". Новосибирск, ул. акад. Лаврентьева, 6, оф.5. Тел. (383) 335-65-45.

В начале 70-х годов прошлого столетия [Babior В.М., et al., 1973], было показано, что резкое увеличение потребления молекулярного кислорода фагоцитами (получившее название «дыхательного взрыва») связано с интенсивной внутриклеточной продукцией кислородных радикалов, которые обеспечивают защиту организма от инфекционных агентов. Еще раньше была доказана важная роль АКМ в повреждении собственных тканей, например, при радиационных поражениях [Тарусов Б.Н., 1957], что привело к формированию понятия окислительного стресса - состояния, сопровождающегося увеличением продукции в клетках АКМ (а также радикалов некислородной природы), и первоначально рассматривавшегося исключительно как деструктивное звено в механизме развития различных патологических состояний [Меныцикова Е.Б и др. 2006].

По современным представлениям, АКМ являются важными сигнальными молекулами, принимающими участие в регуляции разнообразных физиологических и патофизиологических процессов, включая такие фундаментальные как пролиферация, апоптоз и дифференцировка клеток, воспаление и регенерация тканей [Меныцикова Е.Б и др. 2006; Thannickal V.J., Fanburg B.L., 2000; Valko М., et al., 2007].

Установлено участие АКМ в регуляции функций иммунокомпетентных клеток. Особый интерес представляет их влияние на ТЫ/ТИ2-баланс в иммунной системе, который является базисным параметром регуляции иммунного ответа [Allen J.E., Maizels R.M., 1997; O'Gor D. et al., 2003]. Сложившаяся концепция о существовании «классического» и «альтернативного» механизмов активации макрофагов, ведущих к их диффереицировке в М1-, либо в М2-клетки, соответственно, связывает особенности метаболизма активных форм кислорода и азота в макрофагах и дендритных клетках с ТЫ/ТЬ2-балансом в иммунной системе [Зенков Н.К. и др., 2007; Moms S.M.Jr, 1998; Mills С., et al., 2000; Mills C.D., 2001]. Активированные по классическому пути макрофаги (Ml), характеризующиеся высоким уровнем продукции оксида азота (NO) и низким уровнем активности аргиназы - другого ключевого фермента метаболизма L-аргинина, - обладают способностью стимулировать клеточный иммунный ответ (Thl-зависимый). Макрофаги, активированные по альтернативному пути (М2), характеризующиеся противоположными особенностями метаболизма L-аргинина, стимулируют гуморальный иммунный ответ (ТЬ2-завнсимый), а также процессы регенерации тканей.

Однако накопленные к настоящему времени экспериментальные данные об участии АКМ в ТЫ/Т112-девиации иммунного ответа имеют неполный и зачастую противоречивый характер. Следует отметить, что изучение роли АКМ в регуляции иммунного ответа in vivo является достаточно сложной научной задачей, требующей выбора адекватной экспериментальной модели.

Хроническая реакция трансплантат против хозяина (РТПХ) представляет собой иммунную реакцию, развивающуюся в результате трансплантации зрелых Т-лимфоцитов донора неспособному к их отторжению реципиенту в условиях их тканевой несовместимости [Шевелев A.C., 1976]. Хроническая РТПХ, индуцированная трансплантацией полуаллогенных лимфоидных клеток в системе DBA/2 —> (C57B16xDBA/2)Fl, можег развиваться по двум вариантам, иммунопатологические особенности и проявления которых связаны с преимущественной активацией различных субпопуляций Т-клеток (Thl- и ТЬ2-звена иммунной системы) [Козлов В.А. и др., 2001; Кудаева О.Т. и др., 2004; 2005]. Таким образом, РТПХ-индуцированные иммунопатологические состояния могут быть использованы как чрезвычайно удобные тест-системы для изучения влияния различных фармакологических и иефармакологическнх воздействий на процессы ТЫ/Т112-регуляции иммунных реакций in vivo.

Одной из актуальных задач современной фармакологии является создание новых селективных иммуномодуляторов, способных дифференцированно воздействовать на Thl-и ТЬ2-звенья иммунной системы. Целенаправленное изменение метаболического состояния иммунокомпетентных клеток может являться новым подходом в терапии заболеваний, связанных с нарушением ТЫЛЪ2-баланса. Возможно, наиболее перспективной клеточной мишенью для такого иммуномодулирующего воздействия являются макрофаги, «дирижирующие» дифференцировкой Т-лимфоцитов.

В соответствии с вышеизложенным, были сформулированы цель и задачи настоящей работы.

Цель и задачи исследования

Целью работы было изучение роли активированных кислородных метаболитов в ТЫ/ТЬ2-регуляции иммунного ответа.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние соединений, обладающих оппозитным влиянием на Thl/Th2-баланс в организме (мурамилдипептида (MDP)ii дегидроэпиандростерона сульфата (DHEA-S)) на продукцию активных форм кислорода клетками иммунной системы, а также продукцию оксида азота и активность аргиназы в макрофагах in vivo и in vitro.

2. Исследовать продукцию активированных кислородных метаболитов, а также активность аргиназы при Thl- и ТЬ2-зависимых иммунопатологических состояниях, индуцированных хронической РТПХ, в том числе при модуляции ее развития введением DHEA-S и MDP.

3. Изучить влияние окисленных химическим путем декстранов различной молекулярной массы, а также наноразмерных липосомальпых биосовместимых композиций (далее - липосомальные композиции) на их основе на продукцию активированных кислородных метаболитов, а также активность аргиназы в иммунокомпетентных клетках.

4. Оценить воздействие окисленных декстранов различной молекулярной массы на ТЫ/ТЪ2-поляризацию иммунного ответа in vivo на модели хронической РТПХ.

5. Исследовать влияние экзогенных про- и антиоксидантов (супероксидного радикала, перекиси водорода, супероксиддисмутазы и каталазы) на продукцию оксида азота и активность аргиназы в макрофагах in vitro.

Научная новизна работы

Впервые показано, что эндогенно продуцируемая макрофагами перекись водорода способствует поддержанию физиологического уровня аргиназной активности в этих клетках; удаление перекисп водорода каталазой приводит к ее снижению и, соответственно, к увеличению продукции оксида азота.

Установлено, что при Thl- и Th2-зависимых вариантах развития хронической РТПХ нейтрофилы периферической крови различаются по способности продуцировать супероксидиый радикал. Важным признаком ТЬ2-зависимого варианта хронической РТПХ является истощение «метаболических резервов» нейтрофилов, в связи с их неспособностью увеличивать продукцию АКМ в ответ на добавление стандартного стимулятора (продигиозана).

Получены данные о патогенетической связи классического и альтернативного механизмов активации макрофагов с Thl- и ТЬ2-завпсимыми РТПХ-индуцированными иммунопатологическими состояниями.

На модели хронической РТПХ показано изменение метаболического состояния иммунокомпетентных клеток фармакологическими агентами, модулирующими Thl/Th2-баланс in vivo. Введение MDP, обладающего способностью увеличивать продукцию активных форм кислорода и активировать макрофаги по альтернативному механизму, на начальных этапах развития хронической РТПХ сопровождается девиацией нммунного ответа сторону ТЬ2-зависмых процессов. DHEA-S, обладающий противоположным действием на метаболизм АКМ и активирующий макрофаги по классическому пути, стимулирует Th 1-зависимые иммунные реакции.

Впервые показана способность окисленных декстранов с молекулярной массой 35 и 60 кДа, а также наноразмерных липосомальных композиций на их основе активировать макрофаги по классическому пути. Важным свойством окисленных декстранов является их способность активировать кислородный метаболизм лейкоцитов крови, сохраняя при этом «метаболические резервы» клеток.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в экспериментах in vivo данные на модели хронической РТПХ свидетельствуют о наличии тесной взаимосвязи ТЫ/Т112-баланса в организме с метаболическим состоянием иммунокомпетентных клеток. При этом существует обратная зависимость между уровнем продукции N0, с одной стороны, и уровнем продукции активных форм кислорода в клетках иммунной системы (прежде всего, продукции супероксидного радикала NADPH-оксидазой), с другой. Полученные результаты расширяют имеющиеся представления о роли АКМ в функционировании иммунной системы и о механизмах, обеспечивающих Thl/Th2-регуляцию иммунного ответа.

Результаты работы обосновывают возможность создания фармакологических препаратов нового типа, предназначенных для иммунокоррекции различных патологических процессов, обусловленных нарушениями ТЬ1/ТЬ2-баланса, путем целенаправленного воздействия на метаболическое состояние клеток иммунной системы.

Экспериментально обнаруженная способность окисленных декстранов, а также наноразмерных гибридных липосомальных биосовместимых композиций, приготовленных на их основе, активировать макрофаги по классическом механизму позволяет рекомендовать их для дальнейшего изучения в качестве перспективных иммуномодулирующих агентов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При активации макрофагов существует функциональный антагонизм между ферментными системами, обеспечивающими продукцию супероксидного радикала и оксида азота.

2. Метаболическое состояние клеток иммунной системы, определяющее уровень продукции активных форм кислорода и оксида азота, является одним из регуляторов Thl/Th2-баланса в организме.

3. Окисленные декстраны, а также наноразмерные гибридные липосомальные биосовместимые композиции с ними, оказывают значимое модулирующее влияние на функции макрофагов, способствуя их активации по классическому механизму.

Работа выполнена в лаборатории цитологии и клеточных культур отдела общей патологии ГУ НЦКЭМ СО РАМН (рук. д.б.и. Архипов С.А.) и лаборатории экспериментальной иммунотерапии отдела экспериментальной иммунологии ГУ НИИ КИ СО РАМН (рук. д.м.н. Колесникова О.П.).

ВЫВОДЫ

1. Активные формы кислорода и оксид азота оказывают оппозитное влияние на Thl/Th2-6anaiic в иммунной системе. Увеличение продукции супероксидного радикала и перекиси водорода способствует ТЬ2-поляризации иммунного ответа, тогда как увеличение продукции оксида азота макрофагами совпадает с их Thl -поляризующим эффектом.

2. Уровень активности аргиназы и NO-синтазы в перитонеальных макрофагах мышей зависит от внутриклеточной концентрации перекиси водорода, уменьшение содержания которой под влиянием экзогенной каталазы снижает аргиназную активность и увеличивает продукцию оксида азота. Снижение уровня N0 в клетках под влиянием экзогенно продуцируемого супер оксидного радикала не сопровождается активацией аргиназы, что свидетельствует в пользу ускоренной трансформации образующегося оксида азота в пероксинитрнт.

3. Мурамилдипептид и дегидроэпиандростерон сульфат оказывают разнонаправленное влияние на активность АКМ-генерирующих систем и метаболизм L-аргинина в иммунокомпетентных клетках интактных животных. Мурамилдипептид увеличивает продукцию активных форм кислорода и активность аргиназы, тогда как дегидроэпиандростерон сульфат снижает продукцию активных форм кислорода и усиливает синтез оксида азота.

4. Развитие Thl-зависимого иммунопатологического варианта хронической РТПХ характеризуется активацией макрофагов по классическому механизму (с высоким уровнем продукции N0), а ТЬ2-зависимого варианта — альтернативной активацией макрофагов (с повышенной активностью аргиназы).

5. Наблюдаемая на ранних этапах развития хронической РТПХ метаболическая активация нейгрофилов крови способствует формированию ТЬ2-зависимого иммунопатологического состояния, что подтверждается в опытах in vivo Thl-полярпзующим эффектом DHEA-S, который снижает продукцию супероксидного радикала лейкоцитами экспериментальных животных.

6. Окисленные декстраны с молекулярной массой 35 и 60 кДа увеличивают продукцию супероксидного радикала нейтрофилами периферической крови in vivo.

7. Окисленные декстраны, а также наноразмерные липосомальные биосовместимые композиции, приготовленные на основе этих полисахаридов, активируют макрофаги по классическому механизму в опытах in vitro и in vivo, что указывает на возможность их использования в качестве иммуномодуляторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предпринятое исследование имело своей целью установить наличие взаимосвязи между метаболическим статусом клеток иммунной системы и молекулярно-клеточными механизмами, определяющими Thl/Th2-баланс и, соответственно, пути развития иммунных реакций в организме. Основываясь на имеющихся литературных данных, было предположено, что одним из главных факторов, обусловливающих развитие иммунного ответа по ТЫ-, либо по Т112-зависимому вариант}' при различных физиологических и патологических состояниях, может быть уровень активности клеточных ферментативных систем, продуцирующих различные типы АКМ. которые, как сегодня известно, играют роль низкомолекулярных эндогенных регуляторов клеточной активности. Проверка этого предположения была осуществлена с помощью различных экспериментальных подходов, главным компонентом которых было использование (в качестве удобной тест-системы) модели хронической РТПХ, позволяющей оценивать влияние применяемых экспериментальных воздействий на сдвиги ТЫ/ТЬ2-соотношения в условиях in vivo. [Козлов В.А. и др., 2002; Кудаева О.Т. и др., 2004; 2005]

Полученные в работе результаты убедительно доказывают гипотезу об участии активированных кислородных метаболитов в регуляции ТЫ/ТЬ2-баланса в иммунной системе.

Во-первых, было установлено, что ранние этапы развития хронической РТПХ характеризуются существенной метаболической активацией нейтрофилов периферической крови, свидетельствующей о повышенной продукции ими АКМ. При этом разделение животных в экспериментальных группах на два оппозитных варианта клинического течения РТПХ сопровождалось закономерными изменениями кислородного метаболизма нейтрофилов в более поздние сроки: у мышей с развитием Till-зависимого варианта РТПХ уровень продукции Ог не отличался от соответствующего контроля, в то время как у животных с развившимся аутоиммунным гломерулонефритом (Th2-зависимый вариант) этот параметр был достоверно снижен. При этом у мышей с развившимся ТЬ2-зависимым вариантом РТПХ обращает на себя внимание отсутствие реакции нейтрофилов в ответ на добавление активирующего стимула (продигиозана) на фоне исходно низких значений показателей спонтанного НСТ-теста. Данный факт указывает на вовлечение в процесс всех способных к этому нейтрофилов за счет действия избытка стимулирующих факторов, которыми в условиях развития аутоиммунного пммунокомплексного гломерулонефрита у таких животных могут являться аутоантитела и иммунные комплексы, на фоне возникающих дефектов супероксид-генерирутощей ферментной системы. Подобные нарушения могут быть трактоваться как истощение метаболических резервов» лейкоцитов за счет чрезмерной активации кислородного метаболизма клеток на ранних сроках после индукции хронической РТПХ. Особенности продукции супероксидного радикала нейтрофилами крови при ТЬ2-зависимом варианте хронической РТПХ могут сами по себе и пе оказывать влияние на поляризацию иммунного ответа в данной модели и лишь указывать на аналогичные изменения АКМ-геперирующих систем других типов иммунокомпетентных клеток, например, лимфоцитов и макрофагов, являясь, таким образом, маркером хронического окислительного стресса. Полученные результаты хорошо согласуются с литературными данными, свидетельствующими, что повышенная продукция активных форм кислорода лимфоцитами способствует приобретению ими функциональных черт ТЬ2-клеток, а макрофагами — увеличением их способности стимулировать ТЬ2-опосредованный иммунный ответ.[Mills C.D. et al., 2000; Murata Y. et al., 2002; King M.R. et al., 2006]

Во-вторых, на модели РТПХ-индуцированных иммунопатологических состояний показано, что иммуномодуляторные свойства дегидроэпиандростерона сульфата и мурамилдипептида, обладающих способностями направлять иммунные реакции в Thl- и ТЬ2-сторону, соответственно, связаны с их влиянием на продукцию АКМ клетками иммунной системы. Активация кислородного метаболизма лейкоцитов крови на ранних сроках после индукции способствует развитию ТЬ2-зависимого варианта хронической РТПХ, тогда как фармакологическое ингибирование синтеза активных форм кислорода в этот период, напротив, увеличивает долю экспериментальных животных с Thl-зависимым вариантом исследуемого иммунопатологического состояния. Поскольку именно на данном этапе хронической РТПХ происходит выбор пути ее развития по иммунопатологическим вариантам, определяемый активацией Thl- либо Th2-звеньев иммунной спстмы, логично предположить, что изменение продукции активных форм кислорода по-разному сказывается на активации различных субпопуляции Т-лимфоцитов, что суммарно выражается в изменении ТЬ1/ТЬ2-баланса.

В-третьих, обнаружены закономерные изменения продукции NO (одного из важнейших физиологических регуляторов деятельности иммунной системы, причисляемых к классу АКМ) перитонеальными макрофагами как в ходе спонтанно развивающейся хронической РТПХ, так и при модуляции ее течения фармакологическими агентами. Как Thl-, так и ТЬ2-зависимые варианты развития этой патологии сопровождаются такими сдвигами метаболизма аргинина в макрофагах, которые свидетельствуют об активации этих клеток по классическому или альтернативному механизму, соответственно.

На ранних сроках развития хронической РТПХ уровень продукции оксида азота подвержен значительным колебаниям в зависимости от времени, прошедшего с момента трансплантации полуаллогенных лимфоидных клеток. Увеличение активности NO-синтазы отмечено спустя 48 часов после первого и второго переноса лимфоцитов, тогда как в более отдаленном периоде продукция оксида азота имеет тенденцию к снижению по сравнению с показателями, характерными для интактных животных. Можно отметить, что уровень продукции NO изменяется в соответствии с колебаниями содержания провоспалительных цитокинов в сыворотке экспериментальных животных, известными из литературы. На поздних сроках Thl-зависимый вариант хронической РТПХ характеризуется активацией макрофагов по классическому механизму, что сопровождается увеличением активности NO-синтазы и, соответственно, продукции оксида азота. При ТЬ2-зависимом варианте хронической РТПХ, в свою очередь, преобладают альтернативно активированные макрофаги с низкой способностью синтезировать NO и высокой активностью аргиназы. Факторами, приводящими к активации макрофагов по альтернативному пути в этом случае, могут быть противовоспалительные цитокины и(или) циркулирующие иммунные комплексы, образование которых характерно для ТЬ2-зависмого иммунопатологического варианта хронической РТПХ [Anderson C.F., Mosser D.M., 2002 а; 2002 Ь]. При этом изменение функциональных свойств макрофагов усиливает гуморальные иммунные реакции, что приводит к увеличению продукции аутоантител и, следовательно, вносит значительный вклад в развитие аутоиммунного гломерулонефрита.

DHEA-S способствует классической активации макрофагов в условиях in vitro (ингибируя аргиназу) и in vivo (активируя NO-синтазу), что может лежать в основе его Thl-поляризующего действия. Мурамилдипептид in vivo активирует макрофаги по альтераитивному механизму, хотя в условиях in vitro он, действуя через TLR-рецепторы [Weidemann В. et al., 1997], увеличивает продукцию оксида азота. Отличие эффектов мурамилдипептида на метаболическое состояние макрофагов в зависимости от условий эксперимента может быть связано с тем, что в условиях in vivo его действие реализуется через индукцию синтеза противовоспалительных цитокинов, в частности IL-4, IL-10 и IL-13, Т-лимфоцитами. Следует отметить, что согласно литературным данным клеточными мишенями иммунорегуляторного действия MDP могут являться как макрофаги, так и В- и Т-клетки [Watson J, Whitlock С., 1978; Lowy I. et al., 1980; Souvannavong V. et al., 1983]. Тем не менее, вне зависимости от механизма своего действия, мурамилдипептид, альтернативно активируя макрофаги, способствует поляризации иммунных реакций в ТЬ2-сторону в исследованной нами модели.

Обращает внимание, что влияние MDP и DIIEA-S на баланс активностей N0-сиитазы и аргиназы в макрофагах экспериментальных животных хорошо согласуется с их про- и антиоксидантным действием, соответственно. Способность дегидроэпиандростерона in vitro снижать активность аргиназы в клетках может быть связана с его ннгибирующим влиянием на супероксид-генерирующие системы, что приводит к достаточно стойкому снижению внутриклеточной концентрации перекиси водорода, которая в физиологических условиях участвует в регуляции метаболизма аргинина в иммунокомпетентных клетках, поддерживая некоторый «стационарный» уровень аргиназной активности. MDP вызывает увеличение продукции супероксидого радикала с последующим увеличением внутриклеточного содержания перекиси водорода в макрофагах, что приводит к активации аргиназы. Этим может быть объяснен тот факт, что активация NO-синтазы под влиянием мурамилдипептида не ведет к изменению аргиназной акивности, поскольку ингибирование аргиназы промежуточными продуктами реакции образования оксида азота нивелируется активацией этого фермента за счет увеличения внутриклеточной концентрации Н2О2.

Еще одной попыткой оценить возможности фармакологического воздействия на метаболизм АКМ в клетках иммунной системы и связанные с ним процессы регуляции ТЫ/ТЪ2-баланса было изучение влияния окисленных декстранов и конструируемых на их основе препаратов на изучаемые параметры.

Исследование биологических свойств окисленных декстранов выявило их активирующее влияние на кислородный метаболизм нейтрофилов периферической крови in vivo. При этом окисленные полисахариды с разными молекулярными массами в условиях их внутрибрюшинного введения иптактным животным увеличивают как спонтанную, так и стимулированную продигиозаном продукцию супероксидного радикала, что свидетельствует о сохранении «метаболических резервов» клеток.

В условиях in vitro окисленные декстраны, а также липосомальные наноразмерные биосовместимые композиции на их основе активируют макрофаги, выделенные из интактных животных, по классическому механизму. Отмечена тенденция к увеличению LPS-стимулированной продукции оксида азота под влиянием окисленных декстранов, при этом модифицированный полисахарид с меньшей молекулярной массой (35 кДа) сильнее активирует NO-синтазу по сравнению с высокомолекулярным декстраном (60 кДа). Липосомальные формы оксиленных декстранов увеличивают спонтанную продукцию N0, не оказывая влияния на продукцию оксида азота, стимулированную липополисахаридом или липополисахаридом в сочетании с интерфероном-гамма. Окисленные декстраны при культивировании с макрофагами in vitro приводят к снижению активности аргиназы, тогда как их лииосомальные формы таким эффектом не обладают, что может быть связано с известной способностью фосфатидилхолнна, использующегося при изготовлении липосом, увеличивать аргиназную активность. Таким образом, включение окисленных декстранов в липосомальные частицы существенно изменяет их свойства, которые не сводятся к сумме свойств компонентов исследованных наноразмерных композиций, однако при этом в целом сохраняется их активирующее влияние макрофаги. Способность окисленных декстранов активировать макрофаги по классическому механизму in vitro позволяет предположить у них способности изменять ТЬ1/ТЬ2-баланс в иммунной системе, что было экспериментально проверено на модели хронической РТПХ. Однако было установлено, что введение водных растворов окисленных декстранов на этапе индукции (двукратно, через 24 часа после первой и второй трансплантации лимфоидных клеток в суммарной дозе 100 мг/мышь) не приводит к изменению частот развития Thl- и ТЬ2-зависимого вариантов хронической РТПХ. Полученные данные свидетельствуют, что в условиях данного эксперимента окисленные декстраны не оказывают видимого влияния на процессы Thl/Th2-девиации иммунного ответа.

Поскольку отсутствие ожидаемых иммуномодулирующих эффектов окисленных декстранов на модели хронической РТПХ противоречит их способности активировать макрофаги по классическому механизму in vitro, было исследовано их влияние на макрофаги интактных животных in vivo. Спустя 24 часа после введения окисленных декстранов с молекулярными массами 35 и 60 кДа отмечали пик продукции оксида азота макрофагами, которая при этом возрастает до уровня, достигаемого активацией N0-синтазы макрофагов сочетанием LPS и IFN-y. Введение окисленных декстранов экспериментальным животным также увеличивает продукцию оксида азота, стимулированную LPS в сочетании с IFN-y. Таким образом, выявленные in vitro эффекты окисленных декстранов на продукцию оксида азота сохраняются и в условиях in vivo, но было установлено, что их влияние на активность аргиназы существенно зависит от молекулярной массы. Окисленный декстран с молекулярной массой 35 кДа на активность этого фермента in vivo не влияет, тогда как высокомолекулярный декстран (60 кДа) более чем троекратно увеличивает ее спустя 48 часов после введения препарата. Полученные результаты указывают на то, что влияние окисленных декстранов на макрофаги in vivo является сложным процессом с множеством факторов, что до определенной степени объясняет видимое отсутствие их эффекта на ТЫ/ТЬ2-поляризацию иммунного ответа в описанном выше эксперименте.

В своей совокупности полученные данные свидетельствуют о важной роли АКМ, продуцируемых клетками иммунной системы, в регуляции патофизиологических процессов, развитие которых существенно зависит от ТЫ/ТЪ2-оаланса в организме, и подтверждают перспективность дальнейших исследований в этой области.