Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль редокс-чувствительной сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента в механизмах модулирования воспаления фенольными антиоксидантами

российская академия медицинских наук

сибирское отделение федеральное государственное бюджетное учреждение «научный центр клинической и экспериметальной медицины»

На правах рукописи

0420143GU.ii

ЛЕМЗА Анна Евгеньевна

РОЛЬ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ АНТИОКСИДАНТ-РЕСПОНСИВНОГО ЭЛЕМЕНТА В МЕХАНИЗМАХ МОДУЛИРОВАНИЯ ВОСПАЛЕНИЯ ФЕНОЛЬНЫМИ

АНТИОКСИДАНТАМИ

14.03.03 - патологическая физиология 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук Меньшикова Елена Брониславовна

Новосибирск, 2014

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AKR1 с2 альдокеторедуктаза 1С2 человека

ARE антиоксидант-респонсивный элемент

BSA бычий сывороточный альбумин

СОХ циклооксигеназа

DAPI 4',6-диамино-2-фенилиндол

DCF дихлорфлуоресцин

DiOCô 3,3-Дигексилоксакарбоцианин йодид

DMSO диметилсульфоксид

Е+ этидин

ELAM молекула адгезии лейкоцитов к эндотелию, Е-селектин

EpRE электрофил-респонсивный элемент

GCLC каталитическая субъединица глутаматцистеинлигазы

GCLM регуляторная субъединица глутаматцистеинлигазы

GR глутатионредуктаза

GSH восстановленная форма глутатиона

GSSG окисленная форма глутатиона

GST глутатион-Б-трансферазы

НО-1 гемоксигеназа-1

IFN интерферон

IL интерлейкин

1RES внутренний участок посадки рибосом

LPS липополисахарид

МТТ бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия

NES сигнал ядерного экспорта

NLS сигнал ядерной локализации

N0 оксид азота

NOS синтаза оксида азота

NQ01 NAD(P)H:xинoнoкcидopeдyктaзa

PBS фосфатно-солевой буфер

PI йодид пропидия

РМА форбол-12-миристат-13-ацетат

SOD супероксиддисмутаза

tBHQ трет-бутилгидрохинон

TNF фактор некроза опухолей

ТЯЕ сайт связывания АР-1

ТЯХ тиоредоксин

УСАМ молекула адгезии клеточного эндотелия

ХЯЕ ксенобиотик-респонсивный элемент

АКМ активированные кислородные метаболиты

мпо миелопероксидаза

пол перекисное окисление липидов

эпо эозинофильная пероксидаза

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................................6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................................11

1.1. Механизмы функционирования редокс-чувствительной системы антиоксидант-респонсивного элемента Keapl/Nrf2/ARE и ее роль в поддержании окислительно-восстановительного равновесия in vivo..............................................................................................11

1.1.1. Гены с ARE-контролируемой экспрессией..........................................................................11

1.1.2. Индукторы системы Кеар 1 /Nrf2/ARE..................................................................................13

1.1.3. Структура компонентов системы Кеар 1 /Nrf2/ARE.............................................................16

1.1.3.1. Структура ARE........................................................................................................................16

1.1.3.2. Структура Nrf2........................................................................................................................18

1.1.3.3. Структура Кеар 1.....................................................................................................................18

1.1.4. Механизмы активации системы Кеар 1 /Nrf2/ARE...............................................................19

1.1.5. Механизмы инактивации системы Keapl/Nrf2/ARE...........................................................30

1.2. Активированные кислородные метаболиты и их роль в развитии окислительного стресса и воспаления............................................................................................................................32

1.3. Роль системы Кеар 1 /Nrf2/ARE в воспалении......................................................................47

1.4. Синтез и исследование антиоксидантных и биологических свойств новых водорастворимых серосодержащих фенольных соединений...........................................................54

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ......................................................................................................57

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ........................................................................................66

3.1. Изучение влияния исследуемых фенольных антиоксидантов на жизнеспособность клеток в культуре..................................................................................................................................67

3.2. Изучение способности исследуемых фенольных антиоксидантов индуцировать ARE-зависимые ферменты в культуре клеток.............................................................................................73

3.3. Изучение влияния исследуемых фенольных антиоксидантов на способность модулировать развитие острого локального воспаления in vivo (модель 1)...................................78

3.4. Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 индуцировать систему антиоксидант-респонсивного элемента..............................................................................................81

3.4.1. Изучение влияния фенольного антиоксиданта ТС-13 на содержание глутатиона и активность глутатионредуктазы..........................................................................................................81

3.4.2. Изучение влияния фенольного антиоксиданта ТС-13 на активацию транскрипционного фактора Nrf2..........................................................................................................................................82

3.5. Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 модулировать развитие острого системного асептического воспаления in vivo (модель 2)..................................................89

3.6. Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 модулировать развитие острого системного септического воспаления in vivo (модель 3)....................................................92

3.7. Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 модулировать развитие хронического воспаления.....................................................................................................................94

3.7.1. Обострение хронического воспаления (модель 4)..............................................................94

3.7.2. Неспецифическое аутоиммунное воспаление суставов (полиартрит; модель 5).............96

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................................................................102

ВЫВОДЫ.............................................................................................................................................109

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................111

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Одним из неотъемлемых признаков воспалительной реакции является активация фагоцитирующих клеток, микробицидную функцию которых обусловливают генерируемые ими активированные кислородные метаболиты, сдвигающие окислительно-восстановительное равновесие клеток в сторону прооксидантов, что приводит к развитию окислительного стресса и может способствовать повреждению окружающих тканей. Наряду с этим большинство исследователей считает активированные кислородные метаболиты важными регуляторами клеточных процессов и ключевым элементом изменения программ дифференцировки, пролиферации и апоптоза клеток [Briine В. et al., 2013], в том числе посредством изменения активности редокс-чувствительных транскрипционных факторов [Ляхович В.В. и др., 2006].

Особое место среди редокс-чувствительных систем клетки занимает сигнальный путь Keapl/Nrf2, активирующий экспрессию генов за счет взаимодействия транскрипционного фактора Nrf2 с z/wc-регуляторным антиоксидант-респонсивным элементом (ARE). Главным назначением регуляторной системы Keapl/Nrf2/ARE является поддержание внутреннего гомеостаза при апоптоз-индуцирующих, проканцерогенных и стрессовых воздействиях [Ляхович В.В. и др., 2006; Турпаев К.Т., 2013]. Исследования, проведенные на нокаутных по Nrf2 животных, выявляют важность ARE в процессах воспаления, канцерогенеза, фиброза, а также защиты от различных стрессовых воздействий [Меныцикова Е.Б и др., 2010]. Так, у мышей с выключенным геном Nrf2 более выражен воспалительный ответ на различные стимулы [Ma Q. et al., 2006], кроме того, Nrf2 способствует разрешению острых воспалительных процессов, препятствуя их переходу в хроническую форму [Reddy N.M. et al., 2009]. Биологическая важность ARE определяется тем, что от его активности зависит функционирование многих других редокс-чувствительных элементов, в том числе транскрипционных факторов NF-кВ и АР-1, регулирующих развитие воспалительного процесса [Hayes J.D. et al., 2010; Wakabayashi N. et al., 2010], поэтому сигнальная система Keapl/Nrf2/ARE считается перспективной мишенью при разработке новых противовоспалительных препаратов [Hybertson В.М. et al., 2011].

В научной литературе описан широкий спектр различных индукторов транскрипции генов, регулируемых ARE [Xiao Н. Parkin K.L., 2006; Garbin U. et al., 2009], прежде всего это фенолы и хиноны, акцепторы Михаэля, серо- и селенсодержащие соединения. Большое внимание при исследовании новых индукторов ARE уделяется зависимости индуцирующей способности от структуры соединений: для фенолов существенно расположение ОН-групп [Prestera Т. et al., 1993; Magesh S. et al., 2012] и степень их экранирования орто-заместителями [Takabe W. et al., 2006], для серо- и селен-содержащих соединений показана высокая активность

диатомарной структуры -S-S- или -Se-Se- [Xiao Н. et al., 2006]. Кроме того, важен вопрос биодоступности антиоксидантов, многие из которых липофильны. В отличие от гидрофильных веществ, жирорастворимые соединения при прохождении через желудочно-кишечный тракт взаимодействуют с желчными кислотами и их солями, кроме того, их всасывание в кишечнике происходит путём пассивного транспорта и зависит от наличия жиров в диете, что усложняет подбор дозировки и интервалов приёма, тогда как гидрофильные вещества усваиваются путём активного транспорта. Для жирорастворимых соединений даже с доказанной высокой антиоксидантной активностью ведутся поиски водорастворимых аналогов или форм с целью повышения биодоступности [Yu Н., 2011; Neves A.R. et al., 2013; Xiao Y. et al., 2013].

Ранее в системах in vitro была всесторонне изучена антирадикальная и антиоксидантная активность серосодержащих водорастворимых фенольных соединений, синтезированных в НИИ химии антиоксидантов ФГБОУ ВПО "Новосибирский государственный педагогический университет" и представляющих собой полностью или частично экранированные трет-бутильными группами монофенолы с пара-пропильным заместителем сульфонатным или тиосульфонатным заместителем [Просенко А.Е. и др., 2001]. Антиоксидантный эффект соединений прямо зависел от степени экранирования ОН-группы и наличия атома двухвалентной серы в пара-пропильном заместителе. При этом если такая структурная зависимость чётко прослеживалась в случае простых бесклеточных и неферментативных систем, то при переходе к более сложным, в том числе клеточным и ферментативным тест-системам, связь структуры и активности соединения становилась менее однозначной, что, в частности, объяснялось их непрямым действием на регуляторную систему Keapl/Nrf2/ARE [Зенков Н.К. и др., 2007].

В соответствии с изложенным выше была сформулирована цель работы - изучить противовоспалительную активность новых синтетических водорастворимых фенольных антиоксидантов и исследовать ее возможную связь со способностью соединений индуцировать редокс-чувствительную сигнальную систему антиоксидант-респонсивного элемента Keapl/Nrf2/ARE.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи.

1. Изучить влияние структурно подобных фенольных антиоксидантов на жизнеспособность моноцито/макрофагоподобных клеток линии U937 in vitro.

2. Изучить особенности и специфичность активации антиоксидантных ферментов и ферментов второй фазы метаболизма ксенобиотиков, контролируемых антиоксидант-респонсивным элементом, in vitro с помощью 5 синтетических водорастворимых структурно подобных фенольных антиоксидантов с выявлением наиболее эффективного соединения.

3. В условиях целого организма на модели острого локального воспаления путем скрининга 10

синтетических водорастворимых структурно подобных фенольных антиоксидантов выявить соединение с наиболее выраженным противовоспалительным действием.

4. Исследовать способность наиболее активного соединения индуцировать систему антиоксидант-респонсивного элемента in vitro, изучив его влияние на внутриклеточное распределение транскрипционного фактора Nrf2 в макрофагоподобных клетках линии J774 и фибробластах линии FLECH.

5. Изучить влияние наиболее активного соединения на развитие и течение воспалительного процесса на моделях острого воспаления (внутривенное введение зимозановых частиц, эндотоксиновый шок).

6. Изучить влияние наиболее активного соединения на развитие воспалительного процесса на моделях хронического воспаления ("воздушный мешок", коллаген-индуцированный артрит). Научная новизна работы

На клетках линии U937 показано, что все соединения нового ряда структурно зависимых водорастворимых монофенольных серосодержащих антиоксидантов малотоксичны, за исключением селенсо держащего аналога, а 3-(3'-трет-бутил-4'-

гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (ТС-13) в малых концентрациях увеличивает жизнеспособность клеток как в нормальных условиях, так и при индукции окислительного стресса за счёт ингибирования апоптоза.

На клетках линии U937 показана способность новых синтетических монофенольных антиоксидантов активировать контролируемые антиоксидант-респонсивным элементом ферменты ЫАО(Р)Н:хиноноксидоредуктазу 1 и глутатион-Б-трансфераз, выявлена зависимость индуцирующего эффекта от структуры соединений: для реализации биологической активности исследуемых соединений важно присутствие в структуре пара-алкильного заместителя атома двухвалентной серы и степень экранирования ОН-группы. Наибольшим эффектом обладает ТС-13, для которого на клеточных линиях J774 и FLECH получено прямое доказательство способности активировать редокс-чувствительную сигнальную систему Keapl/Nr£2/ARE, а именно дозозависимая индукция транслокации транскрипционного фактора Nrf2 из цитоплазмы в ядро.

Впервые на модели острого каррагинан-индуцированного локального воспаления у крыс выявлена зависимость между химической структурой водорастворимых монофенольных серосодержащих антиоксидантов и способностью ингибировать развитие отёка лапы, максимальная противовоспалительная активность показана для ТС-13. Установлено, что ТС-13 обладает выраженным протективным действием в отношении острого системного воспаления, способствуя угнетению генерации гранулоцитами крови активированных кислородных метаболитов. Однако применение ТС-13 при моделировании хронического воспаления

(индуцированный гетерологичным коллагеном полиартрит) и его обострения (модель "воздушного мешка") способствовало снижению выраженности клинических признаков воспалительной реакции лишь на ранних стадиях, в то время как на более поздних стадиях его эффект проявлялся лишь в уменьшении активности и снижении праймированности к наработке активированных кислородных метаболитов нейтрофилов и моноцитов.

Использование ТС-13 как индуктора сигнальной системы Кеар 1 /№ О/АЫЕ впервые показало, что ее активация обладает выраженным протективным действием в отношении проявлений острого, но не хронического воспаления.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты исследования существенно дополняют представления о механизмах патогенеза воспалительных процессов данными об участии в них редокс-чувствительной сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента Кеар1/№£2/АКЕ.

Полученные в ходе исследования структурно зависимого ряда водорастворимых монофенольных антиоксидантов данные позволяют рекомендовать 3-(3 '-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (ТС-13) в качестве перспективного средства дополнительной терапии состояний, связанных с избыточной активацией фагоцитирующих клеток, благодаря выявленному значимому противовоспалительному действию в отношении острых воспалительных процессов в сочетании с высокой скоростью развития этого эффекта. При этом результаты настоящего исследования свидетельствуют о необходимости дифференцированного подхода к противовоспалительной терапии с учётом фазы, стадии и степени выраженности процесса, в том числе в связи с большей эффективностью индукторов редокс-чувствительной системы Кеар 1 /№12/АЛЕ на ранних этапах развития воспаления. Положения, выносимые на защиту

1. Синтетические водорастворимые структурно подобные фенольные антиоксиданты способны индуцировать редокс-чувствительную сигнальную систему антиоксидант-респонсивного элемента Кеар 1 /№£2/АИЕ, выраженность эффекта зависит от химической структуры соединений. Наибольшую активность среди исследованных соединений проявляет частично экранированный 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (ТС-13).

2. Эффективный индуктор сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента ТС-13 обладает наиболее выраженной противовоспалительной активностью на модели острого локального воспаления по сравнению с другими исследованными структурно подобными соединениями.

3. Противовоспалительное действие эффективного индуктора сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента ТС-13 более выражено в отношении острых, чем хронических иммуноопосредованных воспалительных процессов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены на Шестой международной крымской конференция "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии" (Украина, Судак, 2010), VIII международной конференции "Биоантиоксидант" (Россия, Москва, 2010), 17-й Ежегодной конференции общества свободнорадикальной б�