Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Клеточные и молекулярные механизмы иммуномодулирующей активности репродуктивных гормонов

На правах рукописи

/Я.

КУКЛИНА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

КЛЕТОЧНЫЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ РЕПРОДУКТИВНЫХ ГОРМОНОВ

14,00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2003

Работа выполнена в Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, г. Пермь

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

С. В. Ширшев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

ЛЖ Винницкий А.А. Михайлова А.А. Иванов

Ведущая организация: Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, г. Москва

Зашита состоится «_25_» июня 2003 г. в / ' часов на заседании диссертационного совета Д 208.017.01 в ГНЦ РФ -Институте иммунологии Федерального управления медико-биологических и экстремальных проблем при Минздраве России по адресу: 115478, Москва, Каширское ш., д. 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ -Института иммунологии Федерального управления медико-биологических и экстремальных проблем при Минздраве России

Автореферат разослан « - 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета С ■ '< доктор медицинских наук Л. С. Сеславина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Беременность в силу экспрессии плодом отцовских антигенов является феноменом естественной аллотрансплантаци и и требует эффективных регуляторных механизмов для предупреждения реакций иммунного отторжения. Известно, что материнская иммунная система способна распознавать фетальные антигены и реагировать на них (Ceppellini et aL, 1971; Ohama, Kajii, 1984; Hoskin, Murgita, 1989), причем за счет проникновения фетальных (Трунова, 1984; Heyborne et а!., 1994) и плапентарных (Donglas et aL 1959) клеток в кровоток матери эти реакции проявляются не только на локальном, но и на системном уровне, однако в норме они не имеют негативных последствий.

В объяснении причин толерантности матери к генетически чужеродному плолу длительное время преобладала гипотеза о системной иммуносупрессии во время беременности. Многочисленными исследованиями было показано угнетение в этот период как адаптивного (Shimomiya et al., 1991; Matthiesen et al., 1996), так и врожденного иммунитета (Baley, Schacter, 1985; Fougerolles, Baines, 1987; Krause et al.,-1987; Cai et al., 1994; Crouch et al, 1995), а также снижение проти во инфекционной резистентности организма (Wegmarin et al, 1993, Biedermann et aL, 1995; Krishnan et al., 1996), и до середины 80-х годов эти изменения рассматривались как необходимое условие благополучного развития беременности.

Впоследствии, однако, выяснилось, что взаимодействие между иммунной и репродуктивной системами не сводится к антаюнизму. Напротив, наличие иммунного ответа на фетальные антигены является условием успешной реализации процессов репродукции (Mowbray et al., 1985) В 1987 году на основе противоабортивнога эффекта аллоиммунизации родительскими лимфоцитами была выдвинута теория плацентарного иммунотрофизма, в соответствии с которой распознавание иммунекомпетентными клетками матери фетальных

J РОС И\ПИОНАЛЬПАЯ i>Wf> 1ИОП h \

{< tit rn>i.ypi

антигенов педет к продукции цитокииов, стимулирующих рост и функции плаценты (Wegmann, 1987). Эта теория также нашла многократкое экспериментальное подтверждение (Athanassakis, 1987; Armstrong, Chaouat, 1989; Wegmann et al., 1993; Chaouai et al„ 1995).

Согласно современным представлениям, изменения иммунной системы при беременности не ограничиваются тотальной супрессией -они гораздо сложнее и разнообразнее, и обеспечивают не только фетопротекцию, но и фетостимуляцню, а также уровень иммунореактивности организма, достаточный для эффективной противоинфекционноЙ защиты.

Изучение факторов и механизмов, ответственных за эти изменения, - актуальная проблема репродуктивной иммунологии, и важнейшим направлением в рамках данной проблемы является анализ роли репродуктивных гормонов в контроле процессов иммунитета.

Целью работы было исследование модулирующей активности гормонов беременности хор ионического гонадотропина, эстрадиола, прогестерона и их физиологических сочетаний п отношении основных эффекторов адаптивного и врожденного иммунитета, а также определение внутриклеточных механизмов действия гормонов. В соответствии с этой целью в работе решались следующие задачи:

1. Изучить влияние гормонов репродукции на тимический этап дифференцировки Т-лимфоцитов.

2. Оценить роль репродуктивных гормонов в контроле активации зрелых Т-лимфоцитов.

3. Изучить регуляторные эффекты репродуктивных гормонов в отношении нейтрофнлов.

4. Исследовать гормональную регуляцию активности Т-клеток на фоне аутодогичных нейтрофилов и наоборот, определить ответ

нейтрофилов на действие репродуктивных юрмонов в присутствии аутологичных Т-лимфоцитов. 5. Оценить внутриклеточные механизмы реализации гормональных эффектов с учетом основных мессенджерных систем клетки.

Научная новизна работы. Впервые изучены комбинированные иммуномодулирующие эффекты основных гормонов беременности -хорион ич ее ко го гонадотропина (ХГ), эстрадиола и прогестерона Показано участие репродуктивных гормонов в рефляции тимическою этапа дифференцировки Т-лимфоцитов. Изучены механизмы гормонального контроля продукции основных Тх1- и Тх2-цитокинов, определяющие изменение их баланса при беременности. Продемонстрирована разнонаправленная регуляция гормонами активности нейтрофилов в зависимости от типа стимуляции Выявлена способность репродуктивных гормонов регулировать апоптоз Т-лимфоцитов и нейтрофилов. Впервые проаналтированы молекулярные механизмы реализации иммуномодулирующих эффектов репродуктивных гормонов с учетом основных мессенджерных систем кле[ки, причем для стероидных гормонов сделана попытка дифференцировать геномные эффекты от негеномных.

Теоретическая и практическая значимость. Работа существенно расширяет представления о гормональном контроле иммунной системы при беременное! и, раскрывая новые клеточные и молекулярные механизмы иммуномодулирутощей активности репродуктивных гормонов. Продемонстрировано, в частности, что гормоны репродукции способны стимулировать Т-клеточное звено иммунитета па этапе тимической дифференцировки, что позволяет по-новому интерпретировать изменения, происходящие в тимусе во время

беременности. Показано, что апоптоз Т-лимфоците в и нейтрофилов чувствителен к действию репродуктивных гормонов и изменение его уровня может служить одним из способов гормональной регуляции активности этих клеток. Выявлена зависимость гормонального контроля нейтрофилов от уровня их активации. Определены основные внутриклеточные механизмы реализации эффектов ХГ, эстрадиола и прогестерона в Т-лимфоцитах и нейтрофилах, дающие достаточно четкое представление о путях гормональной регуляции функциональной активности этих клеток и позволяющие прогнозировать эффекты других гормонов и белков беременности на основе инициируемых ими внутриклеточных сигналов. Выявлены различия в эффектах, которые ХГ, эстрадиол и прогестерон проявляют индивидуально и в физиологических сочетаниях и показано, что в зависимости от дозы, типа клеток-мишеней и уровня их активации гормоны могут действовать аддитивно, в антагонизме, а также проявлять взаимные пермиссивные и/или сенсибилизирующие эффекты Выявлено изменение гормональной регуляции Т-лимфоцитов в присутствии аутологичных нейтрофилов и наоборот, показана способность Т-лимфоцитов модулировать ответ нейтрофилов на действие гормонов. Эти данные открывают новые перспективы в исследовании нейроэндокринного контроля иммунной системы.

Выявленные иммуномодулирующие эффекты ХГ, эстрадиола, прогестерона и их сочетаний могут иметь место не только при беременности, но и при различных физиологических и патологических состояниях, сопровождаемых эктопическим синтезом этих гормонов в организме или в случае терапии с использованием ХГ и женских половых стероидов. Они будут интересны и найдут применение в работе гинекологов, акушеров, эндокринологов, и других специалистов, работающих в данной области.

Положения, выносимые на защиту:

1. В физиологическом сочетании, соответствующем 1 триместру беременности, ХГ, эстрадной и прогестерон вызывают фенотнпическое и функциональное созревание интактных тимоцитов, а также усиливаю! дифференцировку этих клеток, индуцируемую тимическим эпителием.

2. Гормональная регуляция зрелых Т-лимфоцитов напрямую зависит от их активационного статуса. Гормоны усиливают спонтанную пролиферацию Т-клеток, но существенно снижают их пролиферативный ответ на митоген, хотя и несколько повышают численность активированных Т-клеток за счет угнетения их апоптоза. Физиологические сочетания ХГ и стероидных гормонов не изменяют продукцию Т-лимфоцитами ИФНу, но стимулируют синтез и секрецию ИЛ-4, приводя в конечном счете к сдвигу баланса секретируемых Тх1/Тх2-иитокинов в пользу Тх2-типа,

3 Эффекты репродуктивных гормонов в отношении нешрофилои проявляются только в сочетании доз, соответствующих Ш триместру беременности, и также определяются наличием и уровнем активации этих клеток - в спонтанном варианте или в случае слабой стимуляции гормоны повышают окислительный потенциал нейтрофилов, тогда как в условиях интенсивной стимуляции, напротив, снижают его Апоптоз нейтрофилов подавляется репродуктивными гормонами независимо от уровня клеточной активации.

4. Гормональная регуляция активности Т-лимфоцитов изменяется в присутствии ауто логичных нейтрофилов. В свою очередь, Т-лимфоциты модулируют ответ нейтрофилов на действие репродуктивных гормонов. Результатом такого взаимодействия может быть как отмена гормональных эффектов в совместной купьтуре, так и их усиление, в зависимости от дозы гормонов, типа клеток и конкретной функции.

5. Индивидуальные модулирующие эффекты ХГ и в Т-лимфоцитах, и в нейтрофнлах опосредуются с АМР-эа вис имы м сигналом, тогда как действие стероидных гормонов реализуется двумя путями - геномным и негеномным, первый из которых ведет, как правило, к ингибированию функций этих клеток, тогда как второй - к стимуляции. При этом негеномные эффекты эстрад иола и прогестерона в основном опосредуются кальцием. Гормональная комбинация в зависимости от дозы гормонов, типа клеток, уровня их дифференцировки и активации может не только нивелировать или полностью блокировать индивидуальные гормональные эффекты, но и, напротив, обеспечивать их проявление.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на следующих международных и всероссийских конференциях и конгрессах: Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды-98» (Москва, 1998); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 1998); 6-м Международном экспертном форуме по иммунотерапии и генной терапии (Флоренция, Италия, 1998); III Международном конгрессе по патофизиологии (Лахти, Финляндия, 1998); И Международном конгрессе по иммунологии (Стокгольм, Швеция, 2001); IV, V и VI Всероссийских научных конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург. 2000-2002).

По теме диссертации опубликовано 27 научных работ.

Структура н объем диссертации. Диссертация изложена на 236 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав экспериментальной части, заключения и выводов. Работа содержит 33 рисунка и 27 таблиц. Список литературы включает 423 источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Гормоны и ингибиторы. Гормоны использовали в концентрациях, соответствующих их уровням в периферической крови в I и III триместрах беременности: XT ("Profasi", Италия) — 100 и 10 ME/мл, эстрадиол ("Sigma", США) - 1,0 и 10 нг/мл, прогестерон ("Sigma") - 20 и 100 нг/мл. Сочетания доз гормонов соответствовали таковым при беременности: I триместр - ХГ 100 ME/мл + эстрадиол 1,0 нг/мл + прогестерон 20 нг/мл; 1П триместр - ХГ 10 ME/мл + эстрадиол 10 нг/мл + прогестерон 100 нг/мл.

Для анализа внутриклеточных механизмов реализации гормональных эффектов использовали следующие препараты: ингибитор протеинкиназы А (РКА) Н-89 ("ICN", США) в концентрации 1,0 мкг/мл, 6локатор кальциевых каналов верагтамил ("Knoll, AG", Германия) в концентрации 0,025 мг/мл. ингибитор инозитол-1 -монофосфатачы оксибутират лития (Таллинский химфармзавод, Эстония) - в концентрации 1,5 мг/мл Для дифференцирования геномных эффектов прогестерона от не:еномных использовали антагониа ядерных рецепторов RU-486 ("Sigma") в концентрации 50 мкМ Растворителем служил физиологический * раствор, RU-486 разводили в диметилсудьфоксиде и для данного препарата использовали соответствующий контроль с растворителем.

Объекты исследования. В работе использовали тимоциты детей 1-3 лет и фракционированные лейкоциты периферической крови небеременных женщин репродуктивного возраста, взятой в фолликулярную фазу менструального цикла. Для оценки дифференцировки тимопитов использовали линию тимических эпителиальных клеток (ТЭК) VTEC2.H/S, любезно предоставленную кандидатом биологических наук, ведущим научным сотрудником Н И. Шаровой (ГШ РФ - Институт иммунологии Федерального управления медико-биологических и экстремальных проблем при

МЗ РФ, г. Москва). Линия была получена путем трансформации эмбриональных ТЭК вирусом SV40.

Выделение клеток. Тимопиты выделяли из фрагментов детского тимуса, удаляемых в ходе сердечно-сосудистых операций (Российский кардиологический центр МЗ РФ, г. Москва) гомогенизацией с последующим фильтрованием гомогената через нейлоновую сетку для освобождения от фрагментов тимусной стромы. Полученная суспензия содержала 78-85% кортикальных (CD4CD8*) тимоцитов и использовалась в дальнейшей работе.

Мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) и нейтрофилы выделяли из гепаринизированной (25 МЕ/мл) венозной крови цеитрифугированием в двойном градиенте плотности фиколла-верографина ("Pharmacia", Швеция; "Спофа", Чехия). Плотности верхнего и нижнего градиентов составляли 1,077 и 1Д12 г/см3 соответственно. При этом с верхней интерфазы собирали МПК, а с нижней - нейтрофилы. Чистота выделения нейтрофилов при гистологической оценке составляла 97%, а жизнеспособность обеих субпопуляций, определяемая по исключению 0,1% трипанового синего, -98%.

Т-лимфоциты выделяли из МПК методом розеткообразования с эритроцитами барана (ЭБ), обработанными стабилизатором розеток бромидом аминоэтилизотиурония (АЭТ, "Sigma") в конечной концентрации 140 мМ. МПК в концентрации 3106 /мл после инкубации с равным объемом )%-ной суспензии АЭТ-ЭБ центрифугировали в градиенте плотности фиколла-верографина (р-1,077 г/см3). Т-лимфоциты, образующие розетки с 1Б, собирали на дне пробирки и освобождались от эритроцитов путем гемолиза (Левковитс, Пернис, 1983). Процедуру повторяли дважды. Чистота выделения оценивалась нммунофлуоресцентным методом по экспрессии Т-специфичной мембранной молекулы СГЛ и составляла 92-95% при жизнеспособности клеток, определяемой в тесте с 0,1% трипановым синим, - 96%.

Культивирование клеток. Тимоциты (5- 10е/ мл) и ТЭК (5-loV мл) культивировали по отдельности и совместно в течение 3-х суток при 37е и 5% С02 По окончании инкубации клетки отмывали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин и оценивали их фенотип (экспрессию CD3, коэкспрессиго CD4/CD8) и пролиферативный ответ на митоген (МО6/ мл, 72 часа). В ряде экспериментов тимоциты инкубировали аналогичным образом в присутствии супсрнатанюв 3-суточных культур самих тимоцитов, ТЭК и совместной культуры тимоцитов с ТЭК

Способ культивирования Т-лимфоцитов варьировал в зависимости от метода: для оценки апоптоза - 24 часа в концентрации 2 106/мл; для анализа пролиферации - 72 часа в концентрации 1 106/мл; для определения продукции цитокинов - 48 часов в концентрации 2 106/мл. В качестве стимулятора Т-лимфоцитов использовали фитогемаплюгинин (ФГА; "Sigma") в оптимальной концентрации 10 мк/мл, один или совместно с рекомбинантным интерлейкином 2 (ИЛ-2; "Sigma") в концентрации 10 нг/мл, монокловальные антитела (МкАт) к молекуле CD95 (Fas), индуцирующие апоптоз (любезно предоставлены доктором биологических наук A.B. Филатовым, ГНЦ РФ - Институт иммунологии Федерального управления медико-биологических и экстремальных проблем при МЗ РФ, г. Москва), а также активатор протеинкиназы С форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА; "Sigma") в концентрации 20 нг/мл совместно с кальциевым ионофором иономицином ("Sigma") в концентрации 1,5 мкМ. При оценке цитокиновой продукции в ряде экспериментов активация Т-лимфоцитов (ФМА + иономицин) проводилась на фоне рекомбинантных цитокинов - ИЛ-4 и ИФНу ("Цитокин", Россия).

Дпя оценки основных функций нейтрофилов использовали краткосрочную культуру: клетки (2*106/мл) инкубировали в течение часа, после чего определяли их фагоцитарную и окислительную активность. Продукцию нейтрофилами окиси азота (NO) оценивали в 6-ти часовой культуре (]-106/мл), а апоптоз - 24-х часовой культуре. В качестве стимуляторов использовали бактериальный лидополисахарид (ЛПС; "Sigma") в концентрации 100 нг/мл, зимозан A ("Sigma"),

опсонизированный сывороткой, в концентрации 5 мг/мл, частицы полистирольного латекса размером 1 мкм ("ДиаМ", Россия) в концентрации 2-108/мл, а также МкАт к молекуле CD95 (Fas), индуцирующие апоптоз.

Во всех экспериментах лейкоциты инкубировали с гормонами в течение часа, после чего вносили стимулятор. При использовании ингибиторов клетки преинкубировали с ними в течение часа, вносили гормон, инкубировали еще час и отмывали перед внесением стимулятора.

В совместной культуре Т-лимфоциты (0,5-106/мл) н аутологичные или аллогенные нейтрофилы (1,5- 106/мл) использовали в соотношении 1:3, соответствующем таковому в периферической крови. Клетки вносили в пробу непосредственно или культивировали в трансвелл-системе ("Flow", CII1A), исключающей их прямой контакт.

Методы исследования. Экспрессию мембранных маркеров CD3, CD4, CD8, CD16, и CD95 определяли иммунофлуоресцентным методом с помощью соответствующих МкАТ, меченых

флуоресцеинизотиоцианатом (FTTC) или фикоэритрином (PE): LT3 FITC, I T4'FITC ("Сорбент", Россия), IC08-PE ("МедБиоСпектр", Россия), LNK16-FITC, LT95FITC ("Сорбент"), на проточном цитометре "FACSCalibur" ("Becton Dickinson", США), определяя процент клеток, несущих данный маркер. В случае двухцветного иммунофлуоресцентного анализа оба вида МкАТ вносили в пробу одновременно.

Про и нферативную активность тимоцитов и Т-лимфоцитов (1106/мл) оценивали по включению 3Н-тимидина, который вносили в культуру (37 кБк на лунку) за 18 часов до окончания культивирования (72 часа). Включение метки определяли на счетчике "Бета-2" (Россия) в диоксановом сцинтилляторе ЖС-108.

Апоптоз оценивали i штоф луориметрически м методом по уровню гиподиплоидных клеток в пробе. Для этого отмытые клетки (l-10s-l-106 на пробу) фиксировали 70% этанолом, окрашивали иодидом пропидия в

конечной концентрации 50 мкг/мл и анализировали на цитометре "FACSCalibur". Уровень апоптоза в су6популяциях CD4+- и CDS"- Т-лимфоцитов определяли двухцветным иммунофлуоресцентным методом с использованием соответствующих МкАт - LT4 FITC и LT8-F1TC ("Сорбент"). Апоптоз Т-клеток и нейтрофилов в совместной культуре также оценивали двухцветной иммунофлуореспенцией с помощью МкАт к Т-специфичной мембранной молекуле CD3 - LT3FITC ("Сорбент") и к маркеру нейтрофилов CD16 - LNK16-FTTC ("Сорбент").

Концентрацию ИЛ-4 и ИФНу в супернатантах Т-клеточной культуры определяли иммуноферментньш методом с помощью соответствующих наборов ("Цитокин", Россия) на многоканальном спектрофотометре "Antos HMIL III" ("Labtec Instruments", Австрия).

Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали но поглощению фор мал и визированных эритроцитов барана или частиц пол ист и рольного латекса ("ДиаМ"), анализируя с помощью светового микроскопа мазки, окрашенные по Романовскому-Гимзе. При этом определяли: 1) процент фагоцитоза - количество клеток, захвативших объекты фагоцитоза, на 100 подсчитанных фагоцитов, 2) фагоцитарный индекс - количество объектов фагоцитоза, которое в среднем приходится на одну фагоцитировавшую клетку

Окислительную активность нейтрофилов оценивали ио интенсивности люминол-зависимой хеми люминесценции клеточной культуры (Dahlgren, Stendahl, 1983) на биолюминометре БЛМ-8703М ("Наука", Россия). Люминол ("Sigma") использовали в концентрации 5-10"4 М, количество клеток составляло МО' на пробу.

Продукцию NO нейтрофилами оценивали по уровню NO;" (Anthony et al., 1992) в супернатантах 6-часовой культуры с помощью 0,4%-ного реактива Грисса (0,5% сульфаниловой кислоты, 0,05% а-нафтиламина) спектрофотометрическим методом. Пробы анализировали при длине волны 540 нм на многоканальном спектрофотометре "Anthos" Калибровочную кривую строили с использованием NaN02.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы "Excell" (версия 7.0 для Windows). При этом вычисляли среднюю арифметическую величину и ее стандартную ошибку. Поскольку выборочное распределение данных, как правило, было нормальным, достоверность различий между средними величинами оценивали с помощью f-критерия Стъюдента. В ряде случаев определяли коэффициент линейной корреляции (г).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

РОЛЬ РЕПРОДУКТИВНЫХ ГОРМОНОВ В КОНТРОЛЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И АКТИВАЦИИ Т-ЛИМФОЦИТОВ

Исследование гормональной регуляции Т-клеточного звена включало оценку тимического развития Т-лимфоцитов, а также анализ важнейших процессов, сопровождающих активацию зрелых периферических Т-клеток - пролиферации, апоптоза и продукции основных цитокинов, участвующих в поляризации иммунного ответа.

Влияние гормонов репродукции на днфференцировку тимоцитов

Тимическое развитие Т-клеток оценивалось с учетом как фенотипических, так и функциональных проявлений. Критерием фенотипического созревания тимоцитов служило повышение экспрессии мембранной молекулы CD3 и изменение коэкспрессии CD4/CD8, а свидетельством функционального созревания - усиление пролиферативного ответа клеток на митоген.

В монокультуре тимоцитов ХГ в высокой дозе (100 МЕ/мл), соответствующей I триместру беременное ги, вызывал фенотипические изменения, указывающие на днфференцировку этих клеток - повышение экспрессии CD3 (процент СОЗ+-клеток в культуре: контроль - 49,9 ± 3,37, ХГ 100 МЕ/мл - 59,2 ± 4,59; р < 0,05) и переход CD4*8+-тимоцитов в CD4+8 /С04"8+ клетки (табл. 1), однако на фоне стероидных гормонов эти изменения воспроизводились только в отношении экспрессии CD3 (процент СОЗ+-клеток в культуре: контроль - 49,9 ±

3,37, ХГ 100 МЕ/мл + эстрадиол 1,0 нг/мл ^ прогестерон 20 нг/мл {I триместр беременности) - 60,5 ± 3,36; р < 0,05).

Пролиферативный ответ тимоцитов на ФГА также возрастал после инкубации с высокой дозой ХГ, свидетельствуя о функциональном созревании клеток, причем в комбинации со стероидами этот эффект не выявлялся (рис. 1).

Интересно отметить, что численность жизнеспособных тимоцитов в исследуемой системе достоверно снижалась под действием ХГ (контроль-3,76 ± 0,349 ('106) клеток/мл, ХГ 100 МЕ/мл - 2,04 ± 0,454 (•106) клеток/мл; р < 0,05), так что гормон, возможно, вызывает избирательную элиминацию клеток, имитирующую их фенотипическое и функциональное созревание Данный эффект не умаляет роли ХГ в развитии тимоцитов, позволяя рассматривать его как фактор отбора наиболее перспективных для дальнейшего развития Т-клеточных клонов независимо от специфичности их антигенного рецептора.

Таблица 1

Феношпнческ-ие изменения в монокультуре тимоцитов иод действием репродуктивных гормонов

№ гр. Условия эксперимента Процент клеток

С1>4*8" cimV CD4 8 1 CD4 8"

1 Контроль 2,11 ±0,832 85,5 ± 0,886 7,09 ± 1,15 5,29 ± 1,01

2 ХГ 10 МЬ/мл 0,48 ±0,175 р(2-1) < ОМ 91,6 + 2,63 5,37 + 2,35 2,58 1 1.41 Р(2-1) < 0.05

J ХГ 100 МЕ/мл 3,37 ± 1,44 77,4 + 3,44 р(3-1) < 0.05 11,7 ± 2,11 7,47 ± 1,15

4 Эстрадиол 1,0 нг/мл 1,32+ 1.12 86,1 ± 2,14 7,32 ± 1,05 5.22+ 1,87 ' 5,41 ± 2,08

5 Эстрадиол 10 нг/мч 0,965 + 0,564 84,5 ± 0,857 9,17 ± 1,96

6 Прогестерон 20 иг/мл 1,01 ± 0,698 86,8 ± 0,880 7,78 t 1,54 4,38 1- 1,17

7 Прогестерон 100 нг/мл 0,502 ± 0,367 85,6 ± 1,00 8,84 ± 2,90 5,01 ± 3,03 !

8 ХГ 100 МЕ/мл+ эстрадиол 1,0 нг/мл + прогестерон 20 нг/мл (1 триместр) 1,05 + 0,627 83,8 ± 1,47 8,98 ± 2,05 _ 6,18 ± 1,45 1 1

9 ХГ 10 МЕ/мл + эстрадиол 10 нг/мл + прогестерон 100 нг/мл (III гримеетр) 0,792+ 0,44 183,9 h 0,959 1 9,85 ± 2,79 2,24 ± 0,689

Контроль ХГ ЮМЕ/мл ХГ100 МЕ/мп Эстрадиол 1,0 нг/мл Эстрад иол 10 нг/мл Прогестерон 20 нг/мп

Прогесгаром 100 нг/мл

ХГ 100 МЕ/мп + эстрадиол 1,0 нг/мл + прогестерон 20 нг/мл (I триместр)

ХГ 10 МЕ/мп + эстрадиол 10 нг/мл + прогестерон 100 нг/мл (111 триместр)

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Включение 3Н-тимидинэ. имл/мин (x10J)

Рис I Оролнферативиая активность ткмоцнтов, проинкубированных на фоне репродуктивных гормонов.

* - р < 0,05 (сопоставление с контролем)

Культивирование тимоцитов в присутствии тимических эпителиальных клеток сопровождалось их фенотипическим созреванием (табл 2), но не изменяло пролиферативного ответа клеток на ФГА (включение 3Н-тимидина: тимоциты - 2,70 ± 0,173 (-Ю1) имп/мин, тимопиты + ТЭК - 3,11 ± 0,30 (ТО3) имп/мин; р > 0,05), ХГ в совместной культуре достоверно усиливал фенотипические изменения, инициируемые ТЭК - повышение экспрессии СШ (процент СШ+-клеток: контроль - 77,6 ± 3,21, ХГ 100 МЕ/мл - 86,1 ± 4,39; р < 0,05), и изменение коэкспрессии молекул С04/С08 (табл, 2), но, в отличие от монокультуры, стимулировал преимущественное развитие СЕ>4"8+-клеток (табл, 2). Соответствующее сочетание ХГ со стероидами, характерное

для I триместра беременности, вызывало аналогичные фснотипичсскис изменения, причем переход СБ4+8^-тимоцн то в в С04"8+-клеткл обеспечивался, вероятно, как ХГ, так и прогестероном, который б данном случае обладал самостоятельным модулирующим действием (табл. 2). Перечисленные гормональные эффекты воспроизводились супернатантами совместной культуры тимоцитов + ТЭК (табл. 3), что указывает на их опосредование гуморальными факторами ТЭК или самих тимоцитов, продуцируемыми в присутствии ТЭК.

ФГА-индуцированная пролиферация тимоцитов также достоверно возрастала под действием супернатантов совместной культуры, инкубированной на фоне высокой дозы ХГ или соответствующей гормональной комбинации (рис. 2). Интересно отметить, что в аналогичных условиях отмечено и увеличение численности

Таблица 2

Влияние репродуктивных гормонов на фенотип тимоцитов, культивированных в присутствии ТЭК

№ гр. Условии эксперимента Процент клеток

С04-8 СШ+8+ СЭ4+8' ! С04"8+

1 Контроль 2,08 ± 0,879 68,5 ±4,13 10,9+1,99 1 17,5 ±5,28

2 ХГ 10 МЕ/мл 2 05 + 0,514 66 4 ± 4,25 58,0~±5,бГ р(3-1) < 0.01 ¡4,3-2) < 0.01 П 3 ± 2.36 "l2.oT2.6F 20,2 + 4 98

3 XI" 100 МЕ/мл 3,13 ± 1,44 р(3-1) <0.04 26,8 ± 6,78 р(3-1) < 0.01 р{3-2) < 0.05

4 Эс! радиол 1.0 лг/мл 1,52 ± 0,319 65,01 3,05 13,7 ± 3,33 19,9 ± 5,93 21,6 ± 3,80 р(5-1) < ОМ

5 Эстрадиол 10 иг/мл 2,13 ± 0,715 61,3 1 3,58 14,9 ± 3,24

6 Прогестерон 20 нг/мл 2,11 ± 0,968 60,7 ± 5,16 р<6-1) < 0.05 12,9 ± 2,30 24,3 ± 6,29 р(6-1) < 0.05

1 Прогестерон 100 нг/мч 3,20 ± 1,70 65,3+ 1,97 10,5 + 3,32 20,9 ^ 2,48

8 ХГ 100 МЕ/мл + эстрадиол 1,0 ш/мл + прогестерон 20 нг/мл (1 триместр) 1,75 ±0,466 56,7+ 2,93 р(8-1) < ао* р(8-4) < 0.01 13,8+ 2,86 27,7 ± 4,65 р(8-1) < 0.05 р(К-4) <0.05

9 ХГ 10 МЕ/мл + эстрадиол 10 кг/мл + прогестерон 100 нг/мл (Ш триместр) 2,16+ 0,547 63,7 ± 1,16 14,9 ± 2,19 р(9-1) < 0,05 19^ 1,88

Таблица 3.

Фенотип нческие изменения в тнмопнтах пои действием супериатантов совместной культуры тимоцитов + ТЭК, инкубированной на фоне ХГ н соответствующей комбинации ХГ со стероидными гормонами

№ Условия Процент клеток

гр. эксперимента С048' С04*8+ СВ4*8" СШ8+

1 Контроль 1,79 ±0,994 77,9 ± 5,56 5,42 ± 2,34 14,9 ± 6,32

2 ХГ 100 МЕ/мл 8,92 ±0,615 р(2-1) < 0,05 49,2 ± 4,41 р(2-1)<0.61 3,21 ± 0,105 38,7 ± 3,64 р(2-1) < 0.01

3 ХГ )00 МЕ/мл + эстрадиол 1,0 иг/мл + прогестерон 20 нг/мл (I триместр) 1,60 ± 0,754 61,2+ 6,78 р(3-1)<0.95 5,77 ± 1,96 31,6 ± 7,90 р<3-1) < 0.05

эпителиальных клеток в совместной культуре (рис. 3), так что гормон-зависимое усиление дифференцировки тимоцитов в присутствии тимического эпителия может реал изо вываться за счет индукции пролиферации эпителиальных клеток и/или повышения их секреторной активности.

В целом, из всех исследованных гормонов заметно регулировал развитие тимоцитов только ХГ, причем помимо проявления самостоятельных дифференцировочных эффектов в отношении СЭ4+8+-клеток гормон усиливал фенотипическое и индуцировал функциональное созревание тимоцитов под действием тимического эпителия. Все эффекты ХГ оказывал только в высокой физиологической дозе, характерной для I триместра беременности. Эстрадиол и прогестерон при совместном введении частично отменяли дифференцировочные эффекты ХГ в отношении интактных тимоцитов, но не препятствовали действию гонадотропина на ТЭК-зависимую дифференцировку этих клеток.

Согласно литературным данным, беременность сопровождается временной инволюцией тимуса, связанной со снижением его массы (НуИзш^аш е! а1., 1996) и клеточности (Р1шс ег а1., 1981; 8Мтогшуа е1 а1., 1991; К^ЬБодЬат е1 а1., 1996), с преимущественным истощением кортикального слоя (РЬисе1а1., 1981; 8Ытоттуа е1 а!., 1991; КцЬзтвЬат

i'o

? X

X x

« s

i 1

i 1 5

Ш

S ci s

i *

X I

с Ш

D контроль В гормон

тимоцитов ТЭК тимоцитов + ТЭК

суперватанты

«

Uti

ttt;

□ контроль В гормоны

тимоцитов ТЭК

супернатанты

тимоцигов + ТЭК

Рис 2 ФГА-иноуцкрованная пролиферация тимоцитов после инкубации с супериатантамн тимоцитов, 1ЭК и тимоцитов + ТЭК, культивированных иа фонеХГ 100 М£/мл (а) и соответствующей комбинации XI со стероидами (6 ).

* - р < 0.05 (сопоставление с контролем)

" -/! < 0,05 (сопоставление с соответствующим показателем для тимоцитов)

30 -,

х

5 7е! А I ч? ^ 1

0 о

| * 20-1 § I

1 К

1 I g g

у «

15 ■ 10 ■

5 -О

•È

контроль

Р

i

□ Монокультура ТЭК

И Совместная культура ТЭК+тимоциты

исходным уровень

ХГ100 МЕ/мл

комбинация гормонов (I триместр)

Рис 3 Влияние гормонов на численность жизнеспособных ТЭК в культуре.

* - р < 0,05 {сопоставление с контролем)

et al., 1996) за счет апоптоза тимоцитов (Shimomiya et al., 1991; Rijhsinghani et al., 1996). Выявленная в данной работе дифференцировочная активность репродуктивных гормонов позволяет предположить, что перечисленные изменения являются следствием не редукции тимуса, а, скорее, усиления дифференцировки кортикальных тимоцитов, и могут отражать делецию клонов, потенциально реактивных в отношении отцовских и/или фстальных антигенов. При этом важно подчеркнуть, что все эффекты гормоны оказывают в комбинации, характерной для I триместра беременности, а именно в этот период плод начинает экспрессировать антигены МНС, распознавание которых должно инициировать реакции иммунного отторжения (Трунова 1984; Sutton etal.f 1986).

Роль репродуктивных гормонов в контроле активации зрелых Т-

лимфоцитов

Стимуляция зрелых Т-клеток в норме сопровождается их пролиферацией и формированием эффекторных лимфоцитов. В случае неадекватной активации, происходящей в отсутствие костимулирующих сигналов, в клетке инициируется апоптоз. Поскольку пролиферация и апоптоз тесно взаимосвязаны и баланс между ними определяем численность Т-лимфоцитов и эффективность их ответа на антиген, анализ гормонального контроля Т-(снеточной активации требует изучения роли гормонов в регуляции обоих процессов.

Как видно из табл. 4, спонтанная пролиферация Т-клеток статистически значимо усиливалась низкой дозой эстраднола (1,0 нг/мл), характерной для I триместра, а также соответствующим сочетанием ее с ХГ и прогестероном. В то же время, в случае активации клеток ФГА все исследуемые гормоны (за исключением высокой дозы прогестерона, 100 нг/мл), как ПО отдельности, так и в сочетаниях, достоверно подавляли пролиферативный ответ лимфоцитов (табл. 4).

При исследовании внутриклеточных механизмов действия гормонов здесь и далее мы учитывали, что основным вторичным

Таблица 4

Влияние репроду ктивньсс гормонов на иролифератнвную активность Т-лимфоцитов периферической крови

№ Экспериментальное воздействие Включение 3Н-тнмндниа { КГ3), ими/мин (М ± т)

гр. еповтавиый вариант ФГА 10 икг/мл

1 Контроль 1,46 ±0,109 7,09 н 0,268

2 ХГ ЮМЕ/мл 1,58 ±0,132 3,34 i 0,969 р(2-1) < 0,01

3 ХГ 100 МЕ/мл 1,95 ) 0,333 3,07 ± 0,844 р(3-1) < 0.01

4 Эстрадиол 1,0 нг/мл 3,28 ± 0,476 p(4-i) < 0,01 3,56 ± 0,898 р(4-1) < 0.0!

5 Эстрадиол Юнг/мл 1,86 to,518 3,06 + 0,730 р(5-1) < 0.005

6 Прогестерон 20 нг/мл 1,32 ±0,228 4,41 ±0,964 Р<6-1) < 0,05

7 Прогестерон 100 нг/мл 1,7 И 0,239 5,97 ± 0,763

8 ХГ 100 МЬ/мл + эстрадиол !,0 нг/мл + прогестерон 20 нг/мл (I триместр) 2,12 ±0,194 p(S-l) < ОМ 2,33 ± 0,434 р(8-И < 0,001 | 1

9 ХГ 10 МВ/мл + эстрадиол 10 кг/мл + прогестерон 100 нг/мл (Ш фиместр) 2,11 ±0,316 3,28 + 0,662 | р(9-Ц < 0.01 I р(9-Н) <0 01 '

мессенджером, опосредующим действие ХГ и в тканях гонад (Clark ct al., 1976), и в некоторых лимфоидных клетках (Ширшев, 1997: К у клин а. 1999), является сАМР, тогда как для эстрадиола и прогестерона имеются два пути - геномный, через ядерные рецепторы, и негеномпый - через мембранные, причем в последнем случае основной механизм действия стероидов - повышение уровня цитоплазматического кальция и активация фосфоинозитидного обмена (Revelti et ai.. 1998) Соответственно, в работе использовали ингибиторы аденилатциклазного, кальциевого и фосфоинозитидного сигналов.

Антипро лиферативный эффект ХГ полностью или частично отменялся ингибитором сАМР-зависимой прегтеинкипазы (РКА) If-89, указывая на участие сАМР в его реализации (рис, 4, а). Механизмы угнетения пролиферативного ответа Т-лимфоцитов, опосредуемого

сАМР, хорошо известны и могут быть связаны как с РКА-зависимым ингибированием внутриклеточных ферментов, участвующих в активационном сигнале, так и с непосредственной транскрипционной регуляцией, нарушающей экспрессию гена ИЛ-2 (Granja et al., 1991; Bodor, Habener, 1998; Куклина, Ширшев, 2000).

Что касается эстраднола, его антипролиферативные эффекты полностью воспроизводились в присутствии блокатора кальциевых каналов L-типа верапамила (рис. 4, б), так что действие данного стероида на Т-клеточную пролиферацию не зависит от кальция и реализуется, очевидно, геномным путем, за счет блокады транскрипционной активности гена ИЛ-2 и/или иных факторов, участвующих в ответе клетки на митоген. В то же время, Са2+-зависимыЙ механизм может лежать в основе стимулирующих эффектов эстраднола, выявленных в спонтанном варианте.

Альтернативный исход Т-клеточной активации - апоптоз, регулировался гормонами иначе В случае стимуляции клеток ФГА совместно с ИЛ-2 ХГ в высокой физиологической дозе (100 МЕ/мл),

а) ю-,

о 9-

Ï И

у

5 7-

С

lej 15-

ь

Г

10 m

Контроль ХГ WME/мп ХГ 100 МЕ/мп гормона)

Контроль Эстрадиоп 1,0 Эстрадиол 10 (без гормона) нг/мл нг/кл

□ Контроль (6« ингибитора) а 1+891 Ьконтроль (без ингибитора) ЯВервпаммл!

Рис 4 Гормональная регуляция пролиферативного ответа Т-лимфоцитов на ФГА на фоне ингибиторов РКА (л) н кальциевых каналов L-тнпа (6). * - р < 0,05 (сопоставление с контролем без гормона) -р < 0,05 (сопоставление с контролем без ингибитора)

Таблица 5

Роль репродуктивных гормонов в регуляция алолтоза Т-лимфоцитоя периферической крови человека

1 1 Процент апоптотических клеток (М ± ш)

№ гр- Условия эксперимента Спонтанный вариант ФГА + ИЛ-2 ФГА + ИЛ-2 + акти~СШ>5 МкАт

1 Контроль 6,79 ± 1,01 21,1 ±3,13 60,8 + 4,19

2 ХГ 10 МЕ/мл 9,15 ±0,708 20,7 ±3,12 58,9 + 4,33

3 ХГ 100 МЕ/мл 8,35 ± 0,922 25,6 ± 2,89 р0-1)<в,61 56,3 + 4,19

4 Эстрадиол 1,0 нг/мл 7,13 + 0,808 22,2 ± 2,72 57,2 ± 3,39

5 Эстрадиол Юнг/мл 7,71 ± 1,24 22,8 ± 2,8 6 61,4 ±2,07

6 7 Прогестерон 20 нг/мл 6,89 ± 1,34 21,1 ±3,07 66,1 ±2,89

Прогестерон 100 нг/мл 7,11+0,539 21,6 ±3,25 51,3 ±5,26 р(7-1) < 0.05

8 ХП00 МР/мл + эстрадиол 1,0 нг/мл + прогестерон 20 нг/мл (1 триместр) 8,4410,916 14,7 ± 1,93 р(8~1) < 0.01 р(Я-З) <0.01 р(»-4) < 0.01 <0.01 56,7 ±6,14 [

9 ХГ 10 МЕ/мл + эстрадиол 10 нг/мл + прогестерон 100 нг/мл {11Г триместр) 7,09 ± 0,687 19,1 ±3,03 р(9-Щ < 6.65 49,7 ± 6,04 р(9-1) < 0.05 р(9-2) < 0.05

характерной для I триместра беременности, усиливал ало птоз, тогда как в сочетании с эстрадиолом и прогестероном, напротив, снижал его (габл 5), Анализ апонтотических изменений в разных Т-клеточных субпопуляциях показал, что стимулирующий эффект ХГ ограничивается СЕ>8+-клетками, тогда как ингибирующее действие соответствующей комбинации гормонов выявляется только в субпопуляции СП4+-Т-лимфоцитов (табл. б).

Проапоптотический эффект ХГ блокировался ингибитором РКА (процент апоптотических клеток в культуре: Н-89 - 9,85 ± 1,04; Н-89 + ХГ 100 МЕ/мл - 11,85 ± 1,29; р > 0,05), указывая на участие сАМР в его реализации В то же время, антиапоптотическое действие соответствующей комбинации ХГ со стероидными гормонами не изменялось в присутствии ингибиторов аденилатциклазного, кальциевого и фосфоинозитидного сигналов.

Таблица 6.

Роль репродуктивных гормонов в регуляции апоптота CD4+/CD8+ Т-клеток. стимулированных ФГА 4- ИЛ-2

№ гр. Условия эксперимента Процент апоптотнческих клеток в популяции

CD4+ сов*

1 Контроль 24,3 ± 2,82 16,2 ± 2,41

2 ХГ 10 МЕ/мл 24,2 ± 3,19 16,1 ± 2,33

3 ХГ 100 МЕ/мл 25,1 ± 3,52 21,5 ± 2,58 p(i-l) < 0.01 р(3-2) <0.01

4 Эстрадиол 1,0 нг/мл 24,1 ± 2,54 16,5+ 1,97

5 Эстрадной 10 нг/мл 24,3 ± 3,22 17,7 ± 2,63

6 Прогестерон 20 нг/мл 24,9 ± 2,96 17,6 ± 2,03

7 Прогестерон 100 яг/мл 24,6 ± 3,48 18,5+ 2,56

8 ХГ 100 МЕ/мл + эстрадиол 1,0 нг/мл + прогестерон 20 нг/мл (I триместр) 15,4 ± 2,55 p(S-l) < ОМ) р(8-3) < 0.01 p(»-i) <0.01 16,6 ± 0,951

9 ХГ 10 МЕ/мл + эстрадной 10 кг/мл + прогестерон 100 нг/мл (III триместр) 20,8 ± 2,71 p(9-S) < 0.05 17,1 ± 1,60

Экспрессия активированными Т-лимфоцитами мембранной молекулы СГ)95 регулировалась гормонами аналогично - повышалась под действием высокой дозы ХГ (процент СГ)95+-клеток в культуре: контроль - 62,0 ± 4,П, ХГ 100 МЕ/мл - 76,4 + 3,19; р < 0,05) и, напротив, снижалась на фоне соответствующей комбинации его с эстрадиолом и прогестероном (процент СЕ>95+-клеток в культуре; контроль - 62,0 ± 4,П, ХГ 100 МЕ/мл - 53,1 ± 1,17; р < 0,05). Достоверная корреляция между экспрессией СЕ>95 и апоптозом для высокой дозы ХГ (г = 0,94\,р< 0,05) указывает на ключевую роль этой молекулы в опосредовании ХГ-зависимой регуляции апоптоза.

В условиях направленной индукции апоптоза МкАт к СЕ>95 (аналогом Раз-лиганда) исследуемые гормоны выступали в качестве ингибиторов, причем достоверное угнетение вызывал только прогестерон в высокой дозе (100 нг/мл), а также соответствующее сочетание его с ХГ и эстрадиолом, характерное для III триместра беременности (табл. 5).

Таблица 7

Роль нейтрофилов в гормон-зависимой регуляции а полтора Т-лиифоцнтов

№ гр. Условия эксперимента Процент аполготических клеток (М ± m)

Контроль Комбинация гормонов (I триместр) Комбинация гормонов (III триместр)

1 Т-лимфошгш 7,17 ±0,703 9,34 ±0,761 7,71 ±0,823

2 Т-лимфоциты + ауто логичные нейтрофилы 18,5 ±2,39 р(2-1) < 0.05 8,29 ± 0,868* 11,9 ± 1,57

3 Т-лимфоциты + ауто лот чные нейтрофилы (трансвеял-сястема) 7,90 + 0,856 7,56 ± 0,861 9,58 ± 1,64

4 Т-лимфоциты + анти-С095 МкАт 60,8 ± 4, Î 9 р(4-1) < 0.05 56,7 ±6,14 49,7 ± 6,04*

5 Т-лимфоциты + аутологичные нейтрофилы + анти-С095 МкАт 52,1 ±2,10 50,0 ± 6,56 45,9 ± 2,67

* - р < 0,05 (сопоставление с контролем)

Учитывая важную роль нейтрофилов в контроле Т-клеточных функций, мы исследовали их участие в гормональной регуляции апоптоза Т-лимфоцитов. В результате было показано, что если в культуре интактных Т-клеток апоптоз практически не выявляется, он эффективно индуцируется ауто логичными нейтрофилами в совместной культуре (табл 7) При этом в трансвслл-системе, исключающей непосредственный контакт клеток, данный эффект отсутствовал (табл 7). Что касается действия репродуктивных гормонов в данных условиях, то апоптоз Т-лимфоцитов, индуцированный нейтрофилами, как и в случае ми тоге н ной активации, достоверно подавлялся гормональной комбинацией, соответствующей I триместру беременности (табл, 7). В то же время, в условиях стимуляции клеток антн-СГ)95 МкАт ингибирующий эффект комбинации гормонов (III триместр беременности), выявленный в монокультуре Т-лимфоцитов, не воспроизводился в присутствии нейтрофилов (табл. 7).

Таким образом, исследованные репродуктивные гормон ы эффективно контролируют как пролиферацию, так и активационный апоптоз Т-лимфоиитов, и характерное для беременности угнетение

пролиферативного ответа этих клеток на митогены и аллоантигены (5ацоптаа е1 а1., 1988; МаИЫезеп й а!., 1996), равно как и снижение уровня Т-клеточного апоптоза (НозЫшо1о еЬ а!., 2001), очевидно, в значительной степени определяются именно этими гормонами. Благодаря тонкой регуляции баланса между пролиферацией и апоптозом обеспечивается определенный уровень активации Т-лимфоцитов, оптимальный для разных периодов гестации.

Влияние гормонов на продукцию цятокинов Т-лимфоцитами периферической крови

Поскольку одним из важнейших событий в контроле иммунной системы при беременности является изменение баланса в развитии Тх1ЛГх2-лимфоцитов ((^м^ е1 а!., 1995; КпзЬпап ег а1., 1996), мы исследовали гормональную продукцию основных Т-клеточных цитокинов, участвующих в поляризации иммунного ответа - ИФНу и ИЛ-4.

Как видно из табл. 8, продукция ИФНу активированными Т-лимфоцитами статистически значимо подавлялась высокой дозой ХГ, однако в присутствии стероидных гормонов (I триместр) этот эффект не выявлялся. Прогестерон в высокой дозе, напротив, повышал уровень ИФНу в культуре, но соответствующая комбинация его с эстрадиолом и ХГ, характерная для П1 триместра беременности, также была неэффективна (табл. 8). В случае стимуляции Т-лимфоцитов на фоне рекомбинантного ИФНу (т.е. направленной индукции Тх 1 -ответа) ХГ, как и в предыдущем варианте, в высокой дозе подавлял продукцию этого цитокина, но в сочетании со стероидами (I триместр) не проявлял своего эффекта (табл. 8).

ИнгнбирующиЙ эффект ХГ не выявлялся на фоне блокады РКА (рис. 5, а), и, следовательно, опосредовался сАМР. Прогестерон-зависимая стимуляция синтеза ИФНу воспроизводилась как на фоне блокады кальциевых каналов, так и в присутствии антагониста ядерных рецепторов ТШ-486 (рис. 5, б), причем в последнем случае эффект

статистически значимо возрастал. Таким образом, в отношении синтеза ИФНу прогестерон, очевидно, реализует два оппозитлых эффекта: через ядерные рецепторы - ингибирующий, а через мембранные -стимулирующий.

В отличие от ИФНу, продукция Т-лимфоцитами ИЛ-4 повышалась независимо от дозы всеми исследованными гормонами и их сочетаниями (табл. 9). Тем не менее, в случае стимуляции клеток на фоне рекомбинантного ИЛ-4 (то есть преимущественной активации Тх2-ответа) продукция цитокина не изменялась под действием гормонов (табл. 9), вероятнее всего, вследствие его избыточности в данных условиях.

Таблица 8

Влияние репродуктивных гормонов на продукцию ИФНу активированными Т-нмфоцитамн периферической крови

№ гр. Условна эксперимента Уровень цитокни клеточной культу а в супервата нге ры, пкМ (М ± ш)

ФМА + нонойними ФМА (■ нономнцин + рИФН>

1 Контроль 172,4 ±30,16 2279 ±560,5

2 ХГ Ш МЕ/мл 188,8 ±32,23 2085 ± 608,3

3 ХГ 100 МЕ/мл 139,1 ±26,00 p(3-i)<aei 1513 ±503,2 р(3-1) < 0.01 р(3-2> < 0.01

4 Эетрадиол [,0 нг/мл 201,8 ±34,76 2196 ±623,9

5 Эстрадиол 10 нг/мл 186,4 ±30,15 2272 ±612,9

6 Прогестерон 20 нг/мл 215,8 ±34,53 2919 + 858,2

7 Прогестерон 100 нг/мл 227,7 ± 29,60 р(7-]> < 0.05 2256 ± 580,7 р{7-6)<0.05

S ХГ 100 МЕ/мл + эстрадиол 1,0 нг/мл прогестерон 20 нг/мл (1 триместр) 178,4 ±26,00 р(В-6) <0.01 2159 ±689,0 p(S-3)<0.05 р(8-6) < 0.05

9 ХГ 10 МЕ/мл + эстрадиол 10 нг/мл + прогестерон 100 нг/мл (Ш триместр) 174,2 ±41,66 2092 ± 540,2

и

£

400 350 300 250-2№ 150 100 50 0

Контроль (без ингибитора)

Н-89

□ Контроль(беэ гормона) Я Гормон

600 500 -400300 200 100 О

||

Контроль (без ингибитора)

Верапамил

^-486

I □ Контроль(беэ гормона) 0 Гормон

Рис 5 Механизмы гормональной регуляции продукции ИФН-гамма Т-лимфоии-тачи периферической крови: а-ХГ 100 МЕ/мл, б - прогестерон 100 нг/мл.

* - р < 0,05 (сопоставление с контролем без гормона) ** -р < 0,05 (сопоставление с контролем без ингибитора)

Таблица 9

Влияние репродуктивных гормонов на продукцию ИЛ-4 активнрованными Т-лимфоцитами периферической крови

Уровень цитокина в супернатанте

клеточной культу ры, пкМ (М ± ш)

Ж 1_гр. Условия эксперимента ФМА + иономнцин ФМА + нономицнн + рИ Л-4

1 Контроль 9,37 ± 2,05 15,5 ±6,И

2 ХГ ЮМЕ/мл 22,2 ± 4,41 р(2-1)<0.01 43,4 + 22,1

3 ХГ 100 МЕ/мл 19,2 ±4,60 р(3-1) <0.05 195,1 + 105,1

4 Эстрадиол 1,0 нг/мл 15,8+1,64 р(4-1) < 0.01 9,96 1 6,00

5 Эстрад иол Юнг/мл 20,1 ± 3,24 р(5-1) < 0.01 17,5 ±6,14

6 Прогестерон 20 нг/мл 15,7 ±3,38 18,1 ±9,45

7 Прогестерон 100 нг/мл 19,9 ±4,29 р(7-1)-0.05 20,3 ± 4,36

8 ХГ 100 МЕ/мл + эстрадиол 1,0 нг/мл + прогестерон 20 нг/мл (1 триместр) 20,5 ± 3,66 р(Й-1) <0.05 24,5 ± 7,97

9 ХГ 10 МЕ/мл f эстрадиол 10 нг/мл + прогестерон 100 нг/мл (III триместр) 18,5 + 3,66 р(9-1) < 0.05 11,2 ±5,46

£ с

я ?

X с

1 о

I

о о.

□ Контроль (без ингибитора)

ан-еэ

Коктроль{6еэ ХГ10МЕ/мл ХГ100МЕ/мп гормона)

1 30

Я

2 25

о.

£

| 20

«1 15

1

£ 10

£ 5 $

а о

>

<9

□ Контроль (без ингибитора)

15 Верапамил

Контропь(без Эстрадиол 1,0 ЭстрадиолЮ гормона) нг/мл нг/мл

15 £

£ &

30 25 20

«1 15

е ю

£

В)

□ Контроль (без ингибитора)

□ Верапамил

ЯР!1М86

Контроль(без Прогестерон 20 Прогестерон 100 гормона) нг/мл нг/мл

Рис. б. Механизмы гормональной регуляции продукции ШМ Т-лнмфоцитами периферической крови: а - ХГ, б - эстрадиол, в - прогестерон.

* - р < 0,05 (сопоставление с контролем бет гормона)

При этом стимулирующий эффект XI' также опосредовался РКА (рис. 6). Что касается действия стероидов, эстрадно л-завис и мая стимуляция секреции ИЛ-4 не зависела от кальция и реализовалась, по-видимому, геномным путем, в то время как стимулирующее действие прогестерона отменялось на фоне блокады как кальциевых каналов, так и ядерных рецепторов (рис. 6), так что в его реализации участвуют и геномный, и негеномный механизмы.

В целом, исследованные репродуктивные гормоны способны регулировать практически все основные этапы развития и функционирования Т-лимфоцитов. Эффекты XI' в Т-клетках, как правило, опосредуются сАМР, тогда как действие эстрадиола и прогестерона может реализовываться двумя путями - геномным, через ядерные рецепторы, и негеномным, через мембранные. При этом геномные эффекты стероидов в основном являются ингибирующими, а негеномные - стимулирующими (рис. 7). В физиологических сочетаниях, соответствующих разным периодам беременности, индивидуальные гормональные эффекты не изменяются (ФГА- индуцированная пролиферация, продукция ИЛ-4,), нивелируются (активационный апоптоз СВ8+-клеток, продукция ИФНу) или, напротив, проявляются только в присутствии других гормонов (активационный апоптоз С1>Г-Т-лимфоцитов).

Результатом совместного действия ХГ и стероидов является усиление дифференцировки и повышение пролиферации интактных Т-клеток. В то же время, в случае стимуляции гормоны вызывают угнетение лролиферативной активности этих клеток и одновременное переключение иммунного ответа в направлении реакций, реализуемых Т-хелперами 2 типа. Перечисленные изменения играют, возможно, определенную роль в обеспечении фетопротективного и фетотрофического эффектов. Однако для материнского организма такая регуляция влечет за собой снижение иммунорезистентности, особенно в отношении патогенов, ответ на которые требует активации клеточноопосредованных реакций.

пролиферация

Рис 7 Потенциальные механизмы регуляции активировал пых Т-лимфоцнтов репродуктивными гормонами.

Е? - эстрадиол, ЕЯ - рецептор для эстрагшола ядерный, ЕЯт - рецептор для эстрадиола мембранный, Е.-2 - антерлейкин 2, 1Ь-211 - рецептор для 11,-2, Рт -прогестерон, РЯ - рецептор для прогестерона ядерный, РЯш - рецептор для прогестерона мембранный, Я -рецептор дня ХГ, ТЫ,ТЬ2 -Т-хелперы 1 и 2 типов Сплошные линии - активация, прерывистые - ивгнбнроваяне,

ГОРМОНЫ РЕПРОДУКЦИИ В РЕГУЛЯЦИИ

ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ

Наряду с изменением адаптивного иммунитета, снижение защитных свойств организма в период гестации может быть связано с регуляцией неспецифических механизмов резистентности, в частности, со снижением активности основных ее эффекторов, нейтрофилов.

Изучение влияния репродуктивных гормонов на функции нейтрофилов в рамках данной работы включало оценку фагоцитарной активности клеток и продукции активных кислородных метаболитов (АКМ). Учитывая, что внутриклеточные сигналы с разных мембранных рецепторов различны и, следовательно, могут иметь разную чувствительность к гормональной регуляции, в качестве стимуляторов использовали четыре объекта - латексные частицы, формалин изированные эритроциты барана, ЛПС и опсонизированный зимозан Кроме того, поскольку нейтрофилы - короткожнвущие клетки и их численность в значительной степени определяет интенсивность нейтрофил-зависимых реакций, в работе наряду с функциональной активностью оценивался апоптоз этих клеток.

Влияние репродуктивных гормонов на фагоцитарную активность

нейтрофилов

Анализ гормональной регуляции нейтрофилыгого фагоцитоза выявил его зависимость от типа фагоцитируемого объекта. Поглощение латексных частиц стимулировалось как ХГ в низкой дозе (10 МЕ/мл), так и физиологическими сочетаниями стероидных гормонов, причем повышались и процент фагоцитирующих клеток, и их индивидуальная поглотительная активность, однако при совместном действии ХГ и стероидов этот эффект не выявлялся (табл. 10).

Фагоцитоз формалинизированных эритроцитов барана регулировался гормонами иначе: ХГ в высокой дозе (100 МЕ/мл) вызывал статистически значимое снижение доли фагоцитирующих клеток в культуре (процент фагоцитоза: контроль - 50,2 ±1,76,

Таблица 10

Влияние репродуктивных гормонов на фагоцитоз латексяьи частиц нейтрофилами человека

J6 Экспериментальное Показатели фагоцитоза (М±ш)

Ф- воздействие Процент фагоцитоза Фагоцитарный индекс

1 Контроль 48,1 + 6,48 3,35 ±0,635

2 ХГ 10 МЕ/мл 56,2 ± 7,84 p(2-l)<ö.0S 3,90 ± 0,727 p(2-l)<i).0S

3 ХГ 100 МЕ/мл 48,5 + 7,83 3,35 ± 0,625

4 Эстрадиол 1,0 кг/мл 52,5 ±8,11 2,86 ±0,531

5 Эстрадиол 10 нг/мл 46,7 ± 7,68 3,7910,851

6 Прогестерон 20 нг/мл 51,5 ±7,27 4.14 + 0,976

7 Прогестерон 100 нг/мл 46,3 ± 8,56 4,08 + 0,931

8 ХГ 100 МЕ/мл эстрадиол 1,0 нг/мл + прогестерон 20 яг/мл (I триместр) 52,8 ± 8,71 4,46 ±0,852

9 ХГ 10МЕ/мл + эстрадно» Юнг/мл + прогестерон 100 нг/мл (III триместр) 55,5 ± 9,94 4,56 ± 1,11

10 Эстрадиол 1,0 нг/мл + прогестерон 20 нг/мл (I триместр) 59,3 ±8,56 p(l0-l)<ä.0S 5,17 ± 1,13 p(J0-i)<0,05

11 Эстрадиол 10 нг/мл + прогестерон 100 нг/мл (III триместр) 62,1 ± 8,46 p(il-l)<0,0S 4,70 ± 1,12

ХГ 100 МЕ/мл - 42,5 ± 0,76; р < 0,05), хотя индивидуальная поглотительная активность клеток при этом не изменялась (индекс фагоцитоза: контроль - 1,99 ±0,388, ХГ 100 МЕ/мл - 1,95 ± 0,439, р > 0,05). Эстрадиол не обладал самостоятельным модулирующим действием в данной системе, но в низкой дозе (1,0 нг/мл) отменял супрессивное действие ХГ (процент фагоцитоза; контроль - 50,2 ± 1,76, ХГ 100 МЕ/мл + эстрадиол 1,0 нг/мл-51,9 ± 4,20; р > 0,05), а в высокой - напротив, обеспечивал его проявление (процент фагоцитоза: контроль -50,2 ±1,76, ХГ 10 МЕ/мл + эстрадиол 10 нг/мл-41,0 ± 2,99; р < 0,05).

Таким образом, фагоцитоз и латексных частиц, и формалинизированных эритроцитов барана, чувствителен к действию репродуктивных гормонов, однако разная направленность и дозовая зависимость гормональных эффектов свидетельствуют о том, чго поглощение этих объектов опосредуется разными механизмами. В итоге же, несмотря на достоверные эффекты отдельных гормонов, физиологические сочетания стероидов с ХГ, как правило, не изменяют показателей нейтроф ильного фагоцитоза, и наблюдаемое при беременности усиление фагоцитарной активности нейтрофилов (Barriga et ah, 1994), по-видимому, нельзя отнести на счет исследуемых гормонов.

Гормон-зависимая регуляция окислительной активности нейтрофнлов

Продукция А КМ является важнейшим механизмом бактерицидности нейтрофилов, обеспечивающим уничтожение и деструкцию патогена. В то же время, избыточное высвобождение АКМ во внеклеточную среду в случае неадекватной активации является одной из причин повреждения собственных тканей в очаге воспаления (Белова, 1997).

В работе наряду с интегральной продукцией АКМ, которая оценивалась по интенсивности люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) клеточной культуры определялась и выработка нейтрофилами окиси азота (N0), выступающей не только как окислитель, но и как активный регулятор тонуса сосудов и процессов тромбообразования (Меньшикова, Зекков, 1997.

Анализ спонтанной продукции АКМ не выявил самостоятельной модулирующей активности отдельных гормонов, однако гормональная комбинация, характерная для III 1риместра, достоверно повышала этот показатель (Табл 11). Поскольку аналогичный эффект вызывало и соответствующее сочетание эстрадиола и прогестерона, он обеспечивался, очевидно, именно стероидами, которые при совместном действии оказывали взаимные потенцирующие эффекты.

Таблица П.

Роль репродуктивных гормонов в регуляция окислительной активности Вейтрафилов

Jfi гр. Условия эксперимента Интенсивность J1JXJI, имп/с (М ± ш)

Спонтанный вариант Стимулированный вариант, 20-я мин

Латексные частицы Опсоншнр-й зимоздн

1 Контроль 2388 ± 599,5 7932 ±1751 53560 t10152

2 ХГ 10 МЕ/мл 2337 ± 436,5 8811 ±2261 47538 i 9252 p(2-l)<0.0S

3 ХГ 100 МЕ/мл 2257 i 592,3 8015± 1434 45017±10257 p(J-i) < 0.01

4 Эстрадной 1,0 нг/мл 2205 ± 455,7 8223 ± 1585 55947±10538

5 Эстрадиол Юнг/мл 2256 ±539,6 8532 ± 1922 48066 + 8982

6 Прогестерон 20 яг/мл 2682 ± 499,8 8975 ±2159 61768±10163 р(6-1) <0.01

7 Прогестерон 100 нг/мл 3048 ±856,0 9355 ±2141 р(7-}) <0.05 46919 ±7147

8 ХГ 100 МЕ/мл + эстрадиол 1,0 нг/мл + прогестерон 20 нг/мл (1 триместр) 2215 ±366,7 8389 + 1722 50764 + 9251

9 ХГ 10 МЕ/мл + эстрадиол 10 нг/мл + прогестерон 100 нг/мл (Ш триместр) 3517 + 664,4 р(9-1) < 0.01 р(9-2) < 0.01 р(9-5) < 0.01 p(9-g) <0.05 9947 ±2187 р(9-1) < 0.05 36829 + 6299 р(9-!) <0.01 р{9-2) < 0.01 p<9-S) <0.05 р(9-7)<0.05 р(Ы)<0.05

10 Эстрадиол 1,0 ш/мл + прогестерон 20 иг/мл (1 триместр) 2191 + 408,5 7788 L1140 52658 ± 8655

11 Эстраднол 10 нг/мл + прогестерон 100 нг/мл (III триместр) 3795 ±971,1 р(!1'!)<в.01 pfll-S) <6.05 р(11-7) <0,05 Ы11-10) <0.05 8149± 1249 47474 1 8643 р(11-9) <0.05 р(Н-Ю) < 0,05

В случае латексной стимуляции интенсивность J13XJI нейтрофилов достоверно усиливалась высокой дозой прогестерона (100 иг/мл) и соответствующей комбинацией его с эстрадиолом и ХГ, характерной для III триместра (табл. 11). Действие гормональной комбинации в данном случае, очевидно, обеспечивалось преимущественно прогестероном.

Продукция АКМ, стимулированная опсонизированным зимозаном, регулировалась гормонами иначе — она угнеталась обеими дозами ХГ, но

стимулировалась низкой дозой прогестерона (табл И). Комбинация гормонов, соответствующая I триместру беременности, не вызывала изменений, что объясняется, по-видимому, взаимным нивелированием разнонаправленных эффектов ХГ и прогестерона. В то же время, гормональная комбинация, характерная для 1П триместра, достоверно снижала интенсивность JI3XJT нейтрофилов.

Таким образом, гормональная регуляция окислительной активности нейтрофилов зависела от активационного статуса клетки' в спонтанном варианте и в случае слабой стимуляции (латексными частицами) репродуктивные гормоны усиливали продукцию АКМ, а при интенсивной стимуляции (опсонизированным зимозаном) - напротив, подавляли ее. Все эффекты гормоны проявляли в комбинации, характерной для III [риместра, и ингибнрующее действие данной комбинации обеспечивалось ХГ, а стимулирующее половыми стероидами.

Литературные данные по регуляции окислительной активности нейтрофилов во время беременности весьма противоречивы. С одной стороны, показано, что в этот период окислительный потенциал клеток повышен, причем данный эффект наблюдается только в III триместре (Selvaraj et al., 1982). С другой стороны, имеются работы, в которых отмечается его снижение при беременности (Krause et а!.. 1987: Crouch et al., 1995). наиболее выраженное также в III триместре (Crouch et al, 1995). Полученные данные позволяют объяснить эти противоречия, приписав их разным способам стимуляции клеток.

Анализ некоторых внутриклеточных механизмов действия гормонов показал, что ХГ-зависимое угнетение окислительной активности, стимулированной зимозаном, отменялось на фоне ингибитора РКА (табл. 12), что вполне закономерно, поскольку известно, что РКА через различные внутриклеточные ферменты способна ингибировать NADPH-оксидазу в нейтрофилах (Mitsuyama et al., 1993; Mahomed et al., 1998). Блокатор Са2+-каналов L-ntna верапамил обладал

самостоятельным супрессивным эффектом в отношении как спонтанной, так и стимулированной продукции ЛКМ. При этом повышающий эффект прогестерона на окислительную активность нейтрофилов, стимулированную и латексными частицами, и опсонизированным эимозаном, на фоне верапамила не просто отменялся, а изменялся на противоположный (табл. 12). Поскольку эффекты гормонов оценивались в краткосрочной культуре, исключающей реализацию геномных механизмов, они опосредовались, по-видимому, мембранными рецепторами, сигналы с которых аналогичны активационному и связаны с мобилизацией фосфоинозитидного обмена и повышением уровня Са'+ в цитоплазме (ВеМеп е1 а1., 1998). Этим, очевидно, и объясняется зависимость стимулирующих эффектов прогестерона от кальция, а также антагонизм в действии ХГ и стероидов на окислительную активность нейтрофилов.

Таблица 12.

Молекулярные механизмы регуляции окислительной активности нейтрофилов репродуктивными гормонами

№ Условия Интенсивность люминесценции клеточной культуры, имп/с (М + т)

гр. эксперимента Спонтанный Стимулированный вариант, 20-я мин

вариант Латексные частицы Опсоиизир-й ШМ031Н

1 Контроль 3999 ±1482 9606 ±3913 61508 ± 13994

2 Н-89 3846 ±1337 9054 ± 3606 60405 ±12712

3 Н-89+ ХГ ЮМЕ/мл 3662 ±1282 9899 + 4598 64253 ±17100

4 Н-89 + ХГ 100 МЕ/мл 3479±1156 12891 ±5597 61777± 13273

5 Верапамил 274,0 + 58,92 р(5-1) < 0.0$ 277,8 ± 19,15 р(5-1)<0.0$ 733,7 ±77,14 р(5-1)<0,05

6 Верапамил + Прогестерон 20 яг/мл 183,3 ±10,91 217,0 + 22,59 348,5+68,37 р(6-5)<0.05

7 Верапамил + Прогестерон 100 иг/мл 182,8 ±26,17 222,8 + 20,42 р(7-5)<0.05 346,5 + 78,81 р(7-5)<вЖ

Таблица 13.

Голь Т-лимфоцитов в гормон-зависимой регуляции окислительной акшяности нейтрофилов

Интенсивность JI3X.II, им о/с (М ± Di)

№ гр. Условия эксперимента Контроль Комбинация гормонов (I триместр) Комбинация гормонов (1П триместр)

Спонтанный вариант

! Нейтрофилы 3179± 1138 2524 ±418,3 4691±1134*

2 Т-лимфоциш 405,2 ± 38,57 419,0 + 111,9 391 6± 75,07

3 Нейтрофилы + аутологичные Т-лимфоциты 3277 ± 684,9 3262 ±721,7 3976 ± 793,5*

Стимуляция латексными частицами (20 мин)

4 Нейтрофилы 10393 ±3362 П 195 ±2724 13274 + 3939

5 Т-лимфоциты 699,0 ±90,19 588,8 ± 90,90 669,2 ± 83,52

6 Нейтрофилы + аутологичные Т-лимфоциты 8187 ± 3048 р(6-4) < 0.05 7269±1750 9511 ±3702

Ст имуляцкя опсонизированным зимозаиом (20 мин)

7 Нейтрофилы 75869±16025 76019 + 9891 50212 ±9367*

8 Т-лимфоциты 5143 ± 1143 4554 ± 620,9 4871 ±1356

9 Нейтрофилы + аутологичные Т-лимфоциты 851581 15903 р(9-7)<0.05 64409 ± 7237 55854 ±7132*

* - р < 0,05 (сопоставление с контролем)

Учитывая важную роль Т-лимфоцитов в контроле функций нейтрофилов (Zhang et ah, 1992) и чувствительность обеих клеточных популяций к действию репродуктивных гормонов, мы исследовали гормональную регуляцию окислительной акпивности нейтрофилов на фоне аутологичных Т-клеток. Как видно из табл. 13, гормон-зависимое повышение спонтанной продукции АКМ воспроизводилось в присутствии Т-лимфоцитов. В стимулированном варианте ингибирующий эффект гормональной комбинации (ill триместр) при действии оп сон из иро ванною зимозана также воспроизводился, тогда

а) Контроль

ХГ 10 МЕ/мл ХГ 100 МЕ/мл Эстрадиол 1,0 нг/мл Эстрадиол 10 нг/мл Прогестерон 20 нг/мл Прогестерон 100 нг/мл ХГ 100 МЕ/мл + Эстрадиол 1,0 нг/мл ХГ 100 МЕ/мл + Прогестерон 20 нг/мл ХГ 10 МЕ/мл + Эстрадиол 10 нг/мл ХГ 10 МЕ/мл + Прогестерон 100 нг/мл

нягвЕн

вввввгвввв-

1АШЛЛЦ

-ч *

0 5 10 15 20 25 30 35 40 Концентрация N0-. в супернатанте, мкМ

ТТТГТТТ^ч

ч *

б) Контроль

ХГ 10 МЕ/мл ХГ 100 МЕ/мл Эстрадиол 1,0 нг/мл Эстрадиол 10 иг/мл Прогестерон 20 нг/мл Прогестерон 100 нг/мл ХГ 100 МЕ/мл + Эстрадиол 1,0 нг/мл ХГ 100 МЕ/мл + Прогестерон 20 нг/мл ХГ 10 МЕ/мл + Эстрадиол 10 нг/мл ХГ 10 МЕ/мл + Прогестерон 100 нг/мл

I г < »

0 10 20 30 40 50 60 Концентрация Ы02 в супернатанте, мкМ

Рис 8 Влияние репродуктивных гормонов на спонтанную (а) и зимозан-стииулировянную (6) продукцию нейтрофиламн окиси азота.

* - р < 0.05 (в сопостамевии с контролем)

р < 0,05 (в сопоставлении с соответствующем показателем для ХГ) - р < 0,05 (в сопоставления с соответствующим показателем для эстраднола)

как повышающий эффект в случае стимуляции клеток латексными частицами отменялся (табл 13), так что in vivo Т-лимфоциты могут нивелировать действие репродуктивных гормонов на окислительную активность нейтрофилов.

Продукция нейтрофилами окиси азота также эффективно регулировалась репродуктивными i ормонами. Как видно из рис. 8, спонтанная продукция NO достоверно повышалась высокими дозами эстрадиола и прогестерона, но если эффект эстрадиола отменялся на фоне XI, то прогестерона - нет. В случае стимуляции клеток опсонизированным зимозаном продукция N0 подавлялась низкой дозой ХГ, но усиливалась высокой дозой эстрадиола, а их комбинация, характерная для III триместра беременности, не обладала модулирующим эффектом {рис. 8). Прогестерон в обеих использованных дозах повышал продукцию N0 стимулированными нейтрофилами, однако на фоне ХГ эти эффекты не проявлялись (рис. 8)

Таким образом, ХГ и стероидные гормоны оказывают оппозитное действие на синтез нейтрофилами N0: ХГ подавляет ее, а стероиды стимулируют В результате совместного действия гормонов спонтанная продукция N0 усиливается сочетанием гормонов, соответствующим III триместру, тогда как стимулированная остается без изменений.

Усиление спонтанной продукции N0, по-видимому, играет преимущественно регуляторную роль и может приводить к снижению адгезии и хемотаксиса гранулоцитов (Меньшикова, Зенков, 1997), ингибированию агрегации тромбоцитов и пролиферации лимфоцитов (Белова, 1997).

Роль репродуктивных гормонов в регуляции апогггоза нейтрофилов

Апоптоз нейтрофилов и их последующая элиминация мононуклеарными фагоцитами является важным процессом, регулирующим численность этих клеток и эффекшвность нейтрофил-зависимых реакций организма (Savill etat., 1989; Thompson, 1995).

Таблица 14.

Роль репродуктивных гормонов в регуляция апоптоза нейтрофилов человека

Jft гр. Условия эксперимента Процент апоптотячески* клеток (М ± ш)

Спонтанный вариант ЛПС ФГА + ИЛ-2 + аяти-С095 МкАт

1 Контроль 32,1 ±4,43 26,6 ±3,44* 79,1 ±3,32*

2 ХГ 10 МЕЛил 41,7 ±6,51 р(2-1) < 0.05 28,7 ± 3,58 63,1 ±2,81 р(2-1)<0.05

3 ХГ 100 МЕ/мл 31,7 ±4,42 28,2 ±4,59 53,4 ± 3,67 р(3-1}<0.01 р(3-2) < 0.05

4 Эстрадиол 1,0 нг/мл 34,6 ± 5,06 31,5 + 3,88 55,2 ±2,56 р(4-1) < 0. в]

5 Эстрадиол 10 нг/мл 31,7 + 4,91 31,2 ±4,62 55,3 + 2,82 р(5-1) < 0.0J

I Прогестерон 20 нг/мл 29,9 ±5,10 30,8 ±4.98 61,6 ± 1.38 P(6-ll<0.OS

Прогестерон 100 нг/мл 31,1 t 3,43 28,7 ' 5,34 51,1 ) 4,13 р(7-1) <0,005 р(7-6) < 0.0i

8 ХГ ¡00 МЁ/мл + эстрадиол 1,0 нг/мл + прогестерон 20 нг/мл (I триместр) 29,7 + 4,98 28,7 t 5,11 48,4 ±4,41 p(S-l) < 0.05 p(S-4) < 0.05 р(8-6)<0.0 5

9 ХГ 10 МЕ/мл + эстрадиол 10 нг/мл А прогестерон 100 нг/мл (Ш триместр) 25,8 ± 3,00 р(9-1) < 0.0J р(9-2) < 0.01 22,4 ± 3,42 р(9-1) < 0.05 р(9-2) < 0.01 49,8 ± 9,61 р(9-1) <0 01

* - р< 0,05 (сопоставление со спонтанным вариантом)

Исследование гормональной регуляции спонтанного аполтоза нейтрофилов показало, что ХГ в низкой физиологической концентрации (10 ME/мл), характерной для III триместра беременности, статистически значимо усиливает его, тогда как соответствующее сочетание ХГ с эстрадиолом и прогестероном, напротив, вызывает снижение этого показателя (табл. 14). Стимулирующий эффект ХГ отменялся ингибитором РКА (рис. 9), что указывает на сАМР-зависимый механизм его реализации. В то же время, гормон-опосредованное угнетение алоптоза не зависело от активности РКА, но отменялось ингибитором инозитол-1-монофосфатазы оксибутиратом лития и блокатором Са2+-каналов L-типа верапамилом (рис 9). Более того, на фоне блокады

кальциевых каналов ингибируюгций эффект комбинации гормонов изменялся на стимулирующий (рис 9).

В случае активации меток ЛПС ни один из гормонов не обладал самостоятельным модулирующим эффектом, но их физиологическое сочетание, характерное для 1П триместра беременности, достоверно подавляло апоптоз ЛПС-стимулированных нейтрофилов (табл. 14). Ингибирующий эффект комбинации гормонов в отличие от спонтанного варианта воспроизводился на фоне верапамила (процент апоптотнческих клеток: верапамил 24,0 + 4,08%; верапамил + гормоны 18,3 ± 3,72%; р < 0,05) и оксибутирата лития (процент апоптотических клеток: оксибугират лития 28,3 + 2,78%; оксибутират лития + гормоггы ! 6,9 ± 2,14%; р < 0,05) В условиях индукции апоптоза МкАт к СЭ95 все исследованные гормоны и их физиологические сочетания ингнбировали его, причем у ХГ и прогестерона эти эффекты были дозозависимыми и максимально выраженными для высокой дозы (табл. 14).

Контроль

Н-89

1111111111IIIII ЕЛ 11111111119311

||||1шш111111111111111111111111111111!11111шшп:

Верапамил

Лития оксибутират

20 30 40 50

Процент апоптотичесхих клеток

Рис 9 Молекулярные механизмы гормональной регуляции спонтанного апоптоза нейтрофилов.

1 - контроль без гормона, 2 - ХГ 10 МЕ/мл, 3 - ХГ 10 МЕ/мл + эстрадная )0 пг/мл + прогестерон ЮОйгУмл ¿Ш 1риместр беременности). * - р < 0,05 {сопоставление с контролем без гормона) ** р < 0,05 (сопоставление е соотяетстауюашм контролем без ингибитора).

Таблица 15.

Роль Т-.шмфоцитов s гормон-зависимой регуляции апоптоза нейтрофилов

Процент anomrотеческих клеток (М ± ш)

Jft Условия эксперимента Контроль Комбинация Комбинация

гр. гормонов (I триместр) гормонов (Ш триместр)

1 Нейтрофи.ты 32,1 ±4,43 29,7 ± 4,98 25,8 ± 3,00*

2 Нейтрофилы + аутологичные Т-лимфоциты 34,7 i 2,47 32,4 ± 2,49 8,81 ±2,03* р(2-1) <0.01

3 Нейтрофилы + аутологичные Т- лимфоциты (трансвелл-сисгема) 31.9 ± 1,74 27,8 ± 3,76 13,3 + 3,02* р(3-1\ < 0.01

4 Нейтрофилы + анти-С095 МкАт 79,1 ±3,32 48,4 ±4,41* 49,8 ±9,61*

5 Нейтрофилы + аутологичные Т-лимфмшты + aHTH-CD95 МкАт 68,6 ± 1,87 р(5-1) <0.05 43,1 ±4.95 20,9 ± 5,45* р(5-2) < 0.05

* -р< 0,05 (сопоставление с контролем)

Моделируя условия in vivo, мы исследовали роль Т-клеток в гормон-зависимой регуляции нейтрофильного апоптоза. Как видно из табл. 15, в присутствии аутологичных Т-лимфоцитов уровень спонтанного апоптоза нейтрофнлов практически не изменялся При этом ингибирующий эффект комбинации гормонов, соответствующей Ш триместру беременности, сохранялся и был гораздо более выражен. Данный эффект воспроизводился и в трансвелл-системе (табл. 15), указывая на его опосредование гуморальными факторами Т-клеток или самих нейтрофилов в совместной культуре.

Анти -CD9 5-МкАт-ин ду цированный апоптоз нейтрофилов существенно снижался в присутствии аутологичных Т-лимфоцитов (табл 15). Ингибирующее действие физиологических сочетаний гормонов сохранялось, но, в отличие от монокультуры нейтрофилов, было дозозависимым и значительно более выраженным для комбинации гормонов, соответствующей Ш триместру беременности (табл. Í 5).

Таким образом, функциональная активность нейтрофилов эффективно регулируется репродуктивными гормонами, и одним из механизмов такой регуляции является контроль апоптоза этих клеток. Эффекты ХГ в нейтрофилах, как правило, ингибируюнгие и опосредуются сАМР, тогда как действие стероидных гормонов.

продукция активных кислородных метаболитов

фагоцитоз латексных частиц

фагоцитоз эритроцитов барана

Нейтрофил

продукция N0

Рис. 10 Возможные механизмы регуляции активности нейтрофнлов репродуктивными гормонами,

Е1 - эстрапиол, £]*т - рецептор для эстрадиола мембранный, КОЗ - >Ю-синтаза, Рг - прогестерон, РНт - рецептор для прогестерона мембранный, Я - рецептор для ХГ,

Сплошные линии - активация, прерывистые - ингнбирование

напротив, стимулирующее и реализуется негеномным путем, в основном та счет активации кальциевого сигнала (рис. 10). Аналогично Т-лимфоцитам, индивидуальные гормональные эффекты в нейтрофилах при совместном действии сохраняются (окислительный ответ на латекс, анти-С1>95-индуцированный апоптоз), нивелируются (латексный фагоцитоз, окислительный ответ на зимозан, продукция окиси азота) и даже изменяются на противоположные (спонтанный апоптоз), или же проявляются только в сочетании (спонтанная окислительная активность, апоптоз ЛПС-стимулнрованных клеток). Конечный эффект зависит oí дозы гормонов, а также наличия и уровня клеточной активации.

Суммируя полученные данные, можно предполагать, что в отсутствие патогена или в случае слабой стимуляции комбинированное действие ХГ и стероидных гормонов in vivo будет приводить к повышению численности и активности как Т-лимфоцитов (за счет усиления их тимическоЙ дифференцировки и повышения спонтанной пролиферации), так и нейтрофилов (за счет блокады апоптоза и повышения окислительного потенциала). В условиях интенсивной стимуляции гормоны, напротив, выступают в основном в роли негативных регуляторов, существенно подавляя пролифератианый ответ Т-лимфоцитов и снижая окислительную активность нейтрофилов, но при этом переключают иммунный ответ в направлении реакций, реализуемых Т-хелперами 2 типа.

Перечисленные эффекты могут играть роль в предупреждении антифетальных иммунных реакций, в частности, Т-зависимых реакций иммунного отторжения или деструкции плацентарных тканей кислородными метаболитами нейтрофилов, а также в обеспечении фетотрофического действия - за счет повышения синтеза Тх2-цитокинов и инициации Тх2-зависимого гуморального иммунного ответа.

В то же время, для материнского организма такая регуляция связана с изменением иммунорезистентности, которое проявляется в угнетении неспецифических защитных реакций, а также снижении клеточноопосредованного (Txl-зависимого) иммунитета и одновременной стимуляции гуморального (Тх2-зависимого) звена.

выводы

1. Хорионический гонадотролин, эстрадиол и прогестерон в сочетании физиологических доз, соответствующих I триместру беременности, обладают днфференцировочной активностью в отношении интактных дубль-позитивных тимоцитов, а также усиливают дифференцировку этих клеток, индуцированную тимическим эпителием. Самостоятельное действие оказывает только гонадотрошш, тогда как стероидные гормоны не изменяют или незначительно нивелируют его эффекты.

2. Гормоны оказывают разнонаправленное действие на пролиферативную активность Т-лимфоцитов периферической крови в зависимости от уровня клеточной активации: усиливают спонтанную пролиферацию, но сущсствещю подавляют пролиферативный ответ активированных Г-клеток. Стимулирующий эффект обеспечивается эстрадиол ом, а супрессивный - в равной степени всеми тремя гормонами.

3. В сочетании доз, соответствующих I триместру беременности, хорионический гонадотролин, эстрадиол и прогестерон подавляют активационный апоптоз CD4\ но не CD8+ Т-лимфоцитов, Угнетение Т-клеточного апоптоза сопровождается снижением экспрессии Т-лимфоцитами мембранной молекулы CD95. Апоптоз Т-лимфоцитов, индуцированный моноклональными антителами к CD95, также подавляется гормональной комбинацией, соответствующей III триместру беременности. Супрессивный эффект в данном случае обеспечивается прогестероном.

4. Сочетания физиологических доз хорионического гонадотропина, эстрадиола и прогестерона, соответствующие как I, так и III триместрам беременности, не влияют на продукцию Т-лимфоцитами ИФНу, но стимулируют синтез и секрецию клетками ИЛ-4. Стимулирующий эффект гормональных комбинаций обеспечивается в равной степени всеми тремя гормонами.

5. Фагоцитарная активность нейтрофилов не изменяется на фоне физиологических сочетаний хорионического гонадотропина со

стероидными гормонами несмотря на достоверные модулирующие эффекты отдельных гормонов,

6. Гормональная регуляция окислительного потенциала нейтрофилов зависит от наличия и уровня клеточной активации: в спонтанном варианте или в случае слабой стимуляции (латексными частицами) гормоны в физиологическом сочетании, соответствующем III триместру беременности, усиливают продукцию кислородных метаболитов, тогда как в условиях интенсивной стимуляции клеток (опсонизированным зимозаном), напротив, снижают ее. Стимулирующий эффект при этом обеспечивается стероидными гормонами, а ингибиругоший - хорионическим гонадотропином.

7. В сочетании доз, соответствующих III триместру, гормоны подавляют апоптоз интактных и стимулированных липополисахаридом нейтрофилов. Апоптоз, индуцированный моноклон ал ьными антителами к CD95, ингибируется всеми исследованными гормонами и их сочетаниями.

8. При совместном действии хорионический гонадотропин, эстрадиол и прогестерон в зависимости дозы, типа клеток-мишеней, уровня их дифференцировки и активации, могут проявлять взаимные аддитивные, антагонистические или сенсибилизирующие эффекты.

9. Нейтрофилы модулируют ответ Т-лимфоцитов на действие репродуктивных гормонов. В свою очередь, Т-лимфоциты изменяют чувствительность нейтрофилов к гормональной регуляции, причем результатом таких изменений может быть как отмена, так и, напротив, усиление гормональных эффектов.

Ю.Иммуномодулирующее действие хорионического гонадотропина как в 1-лимфоцитах, так и в иейтрофилах связано с активацией сАМР-зависимого сигнала. Стероидные гормоны реализуют свои эффекты в этих клетках двумя путями - геномным и негеномным, причем первый, как правило, ведет к ингибированию, а второй - к стимуляции, и конечный результат определяется соотношением этих механизмов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Куклина Е.М, Ширшев C.B., Шарова Н.И., Ярилин A.A. Роль хорионического гонадотропина в онтогенезе тимуса и ди фферен цировке тнмоцнтов. Материалы Международной конференции "Проблемы загрязнения окружающей среды-98" (12-18 сентября 1998 г., Москва). М., 1998. с. 60.

2. Ширшев C.B., Куклина Е.М. Гормон-зависимая регуляция неспецифической резистентности организма, опосредуемая нейтрофилами. Материалы Международной конференции "Проблемы загрязнения окружающей среды-98" (12-18 сентября Î998 г., Москва). М., 1998, с. 87.

3. Заморина С.А., Куклина Е.М., Ширшев С В. Роль циклооксигеназы в реализации иммуномодулирукмцего действия хорионического гонадотропина Материалы Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (21-25 сентября 1998 г., Пущи но). Пушино, 1998. с. 20-22.

4. Куклина Е М., Ширшев C.B. Влияние хорионического гонадотропина на уровень сАМР в Т-лимфонитах периферической крови человека. Материалы Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (21-25 сентября 1998 г., Пущино). Пущино, 1998. с 237-238.

5 Куклина Е.М , Ширшев C.B. Молекулярные механизмы регуляции функций нейтрофилов хорионическим гонадотропином. Russian Journal of immunology, 1999, v. 4, suppl 1, p. 102.

6. Кеворков H.H., Шилов Ю.И., Бахметьев Б.А., Ширшев C.B., Куклина Е M., Сидоров Д.В., Заморина С.А., Лихачева Н.С., Груздева Е.А., Харитонова A.B. Гормональная регуляция функций фагоцитирующих клеток. Russian Journal of Immunology, 1999, v. 4, suppl. 1, p. 316.

7. Куклина E.M., Ширшев C.B., Шарова Н.И., Ярнлин A.A. Роль хорионического гонадотропина в дифференцировке тимоцитов человека. Онтогенез, 1999, т. 30, № 5, с.341-345.

8 Ку клина ЕМ., Ширшев C.B. Модуляция функциональной активности нейтрофилов хорионическим гонадотропином. Цитология,

1999, т. 41, № 6, с. 316-320.

9. Ширшев C.B., Куклина Е.М. Репродуктивные гормоны как регуляторы окислительной активности нейтрофилов. Аллергология и иммунология, 2000, т. 1, № 2, с. 122.

10. Куклина Е.М., Ширшев C.B. Регуляция активности NO-синтазы нейтрофилов хорионическим гонадотропином. Аллергология и иммунология, 2000, т. 1, № 2, с. 183.

11. Куклина Е.М., Ширшев C.B. Регуляция активности нейтрофилов хорионическим гонадотропином. Роль циклооксигеназы Медицинская иммунология, 2000, т. 2, Хе 2, с. 132.

12. Куклина Е.М., Ширшев C.B. сАМР-зависимая сигнальная трансдукция в контроле активации Т-лимфоцитов. Биохимия, 2000, т. 65, №6, с. 741-752.

13. Ширшев C.B., Куклина Е.М. Роль эстрадиола в гонад отрошш-зависимой регуляции функций нейтрофилов. Доклады Академии наук,

2000, т 375, с. 218-220.

14. Ширшев C.B., Бахметьев Б.А., Кеворков H.H., Куклина F.M., Заморина С.А., Лихачева Н.С., Агафонова AB. Гормональная регуляция фагоцитирующих клеток. Медицинская иммунология, 2001, т. 3, № 2, с. 137.

15. Куклина Е.М., Ширшев C.B. Механизмы антипролиферативного действия хорионического гонадотропина. Роль циклооксигеназы нейтрофилов. Медицинская иммунология, 2001, т. 3, № 2, с. 253.

16. Куклина Е.М., Ширшев C.B. Роль фактора транскрипции NFAT в иммунном ответе. Биохимия, 2001, т. 66, № 5, с. 581-591.

17. Куклина Е.М., Ширшев C.B. Особенности ответа нейтрофилов на хорионический гонадотропин, связанные с полом и фазой менструального цикла. Физиология человека, 2001, т. 27, № 2, с 247252.

18. Ширшев С.В., Куклина Е.М. Роль сАМР и циклооксигеназы нейтрофилов в гонадогропинзависимой регуляция пролнферативной активности Т-лимфоцитов. Биохимия, 2001, т. 66, № 9. с. 1221-1226.

19. Куклина R.M., Ширшев С.В. Роль репродуктивных гормонов в регуляции апоптоза миелоидных клеток периферической крови. Медицинская иммунология. 2002, т. 4, № 2, с. 279.

20. Ширшев С.В., Куклина Е.М. Гормоны репродукции в регуляции апоптоза и пролиферативной активности Т-лимфоцитов. Доклады Академии наук, 2002, т. 383, с, 79-82.

21. Куклина Е.М., Ширшев С.В., Шарова Н.И., Ярилин А.А. Гормоны репродукции в контроле дифференцировки тимоцитов. Иммунология Урала, 2002, № 1 (2), с. 80.

22. Ширшев С.В., Куклина Е.М. Роль репродуктивных гормонов в регуляции апоптоза Т-лимфоцитов. Иммунология Урала, 2002, № 1 (2), с. 85.

23 Куклина Е.М,, Ширшев СВ., Шарова Н.И., Ярилин А.А. Влияние хорионического гонадогропина на дифференцировку тимоцитов в присутствии эпителиальных клеток тимуса. Онтогенез, 2003, т. 34, № 1. с. 36-42.

24. Kuklina Е.М., Sharova N.I., Shirshev S.V., Yarilin A.A. Effecb of human chorionic gonadotropin on the thymocyte differentiation; involving of al-thymo'iin. 6th International expert forum of immunotherapy and gene therapy (May 6-8,1998, Florence, Italy). Florence, 1998. A025.

25. Shirshev S.V., Kuklina E.M. Effects of chorionic gonadotropin on the functional activity of human neutrophils 6th International expert forum of immunotherapy and gene therapy (May 6-8, 1998, Florence, Italy), Florence, 1998. A026.

26. Kuklina E.M., Shirshev S.V. Effects of chorionic gonadotropin on the respiratory burst of human neutrophils. Physiological Medicine. 1998, v, 6, № 1001, p. 70.

27 Shirshev S.V., Kuklina E.M, Neutrophil-dependent mechanisms of the antiproliferative activity of human chorionic gonadotropin. Scand. J. Immunol., 2001, v. 54, suppl. 1, p. 111,

I

I

I

Лицензия ПД-11-0002 от 15 12.99

Подписано в печать 23.04.2003. Тираж 100 экз формат 60X84/16 Усл. печ. л. 3,00. Заказ № 428/2003. Набор компьютерный

Отпечатано на ризографе в отделе Электронных издательских систем ОЦНИТ Пермского государственного технического университета 614600, г. Пермь, Комсомольский пр., 29а, к.113,т(3422) 198-033

РНБ Русский фонд

РНБ Русский фонд

m ^

35560

Актуальность проблемы. Беременность в силу экспрессии плодом отцовских антигенов является феноменом естественной аллотрансплантации и требует эффективных регуляторных механизмов для предупреждения реакций иммунного отторжения. Известно, что материнская иммунная система способна распознавать фетальные антигены и реагировать на них [90, 178, 288], причем за счет проникновения фетальных [18, 173] и плацентарных [119] клеток в кровоток матери эти реакции проявляются не только на локальном, но и на системном уровне, однако в норме они не имеют негативных последствий.

В объяснении причин толерантности матери к генетически чужеродному плоду длительное время преобладала гипотеза о системной иммуносупрессии во время беременности. Многочисленными исследованиями было показано угнетение в этот период как адаптивного [245, 353], так и врожденного иммунитета [54, 85, 110, 141, 202], а также снижение противоинфекционной резистентности организма [70, 204, 413], и до середины 80-х годов эти изменения рассматривались как необходимое условие благополучного развития беременности.

Впоследствии, однако, выяснилось, что взаимодействие между иммунной и репродуктивной системами не сводится к антагонизму. Напротив, наличие иммунного ответа на фетальные антигены является условием успешной реализации процессов репродукции [273]. В 1987 году на основе противоабортивного эффекта аллоиммунизации родительскими лимфоцитами была выдвинута теория плацентарного иммунотрофизма, в соответствии с которой распознавание иммунокомпетентными клетками матери фетальных антигенов ведет к продукции цитокинов, стимулирующих рост и функции плаценты [411]. Эта теория также нашла многократное экспериментальное подтверждение [48, 49, 95, 413].

Согласно современным представлениям, изменения иммунной системы при беременности не ограничиваются тотальной супрессией - они гораздо сложнее и разнообразнее, и обеспечивают не только фетопротекцию, но и фетостимуляцию, а также уровень иммунореактивности организма, достаточный для эффективной противоинфекционной защиты.

Изучение факторов и механизмов, ответственных за эти изменения, - актуальная проблема репродуктивной иммунологии, и важнейшим направлением исследований в рамках данной проблемы является анализ роли репродуктивных гормонов в контроле процессов иммунитета.

Целью работы было исследование модулирующей активности гормонов беременности хорионического гонадотропина, эстрадиола, прогестерона и их физиологических сочетаний в отношении основных эффекторов адаптивного и врожденного иммунитета, а также определение внутриклеточных механизмов действия гормонов.

В соответствии с этой целью в работе решались следующие задачи: 1. Изучить влияние гормонов репродукции на тимический этап дифференцировки Т-лимфоцитов.

2. Оценить роль репродуктивных гормонов в контроле активации зрелых Т-лимфоцитов.

3. Изучить регуляторные эффекты репродуктивных гормонов в отношении нейтрофилов.

4. Исследовать гормональную регуляцию активности Т-клеток на фоне аутологичных нейтрофилов и наоборот, определить ответ нейтрофилов на действие репродуктивных гормонов в присутствии аутологичных Т-лимфоцитов.

5. Оценить внутриклеточные механизмы реализации гормональных эффектов с учетом основных мессенджерных систем клетки.

Научная новизна работы. Впервые изучены комбинированные иммуномодулирующие эффекты основных гормонов беременности - хорионического гонадотропина (ХГ), эстрадиола и прогестерона. Показано участие репродуктивных гормонов в регуляции тимического этапа дифференцировки Т-лимфоцитов. Изучены механизмы гормонального контроля продукции основных Txl- и Тх2-цитокинов, определяющие изменение их баланса при беременности. Продемонстрирована разнонаправленная регуляция гормонами активности нейтрофилов в зависимости от типа стимуляции. Выявлена способность репродуктивных гормонов регулировать апоптоз Т-лимфоцитов и нейтрофилов. Впервые проанализированы молекулярные механизмы реализации иммуномодулирующих эффектов репродуктивных гормонов с учетом основных мессенджерных систем клетки, причем для стероидных гормонов сделана попытка дифференцировать геномные эффекты от негеномных.

Теоретическая и практическая значимость. Работа существенно расширяет представления о гормональном контроле иммунной системы при беременности, раскрывая новые клеточные и молекулярные механизмы иммуномодулирующей активности репродуктивных гормонов. Продемонстрировано, в частности, что гормоны репродукции способны стимулировать Т-клеточное звено иммунитета на этапе тимической дифференцировки, что позволяет по-новому интерпретировать изменения, происходящие в тимусе во время беременности. Показано, что апоптоз Т-лимфоцитов и нейтрофилов чувствителен к действию репродуктивных гормонов и изменение его уровня может служить одним из способов гормональной регуляции активности этих клеток. Выявлена зависимость гормонального контроля нейтрофилов от уровня их активации. Определены основные внутриклеточные механизмы реализации эффектов ХГ, эстрадиола и прогестерона в Т-лимфоцитах и нейтрофилах, дающие достаточно четкое представление о путях гормональной регуляции функциональной активности этих клеток и позволяющие прогнозировать эффекты других гормонов и белков беременности на основе инициируемых ими внутриклеточных сигналов. Выявлены различия в эффектах, которые ХГ, эстрадиол и прогестерон проявляют индивидуально и в физиологических сочетаниях и показано, что в зависимости от дозы, типа клеток-мишеней и уровня их активации гормоны могут действовать аддитивно, в антагонизме, а также проявлять взаимные пермиссивные и/или сенсибилизирующие эффекты. Выявлено изменение гормональной регуляции Т-лимфоцитов в присутствии аутологичных нейтрофилов и наоборот, показана способность Т-лимфоцитов модулировать ответ нейтрофилов на действие гормонов. Эти данные открывают новые перспективы в исследовании нейроэндокринного контроля иммунной системы.

Выявленные иммуномодулирующие эффекты ХГ, эстрадиола, прогестерона и их сочетаний могут иметь место не только при беременности, но и при различных физиологических и патологических состояниях, сопровождаемых эктопическим синтезом этих гормонов в организме или в случае терапии с использованием ХГ и женских половых стероидов. Они будут интересны и найдут применение в работе гинекологов, акушеров, эндокринологов, и других специалистов, работающих в данной области.

Положения, выносимые на защиту:

1. В физиологическом сочетании, соответствующем I триместру беременности, ХГ, эстрадиол и прогестерон вызывают фенотипическое и функциональное созревание интактных тимоцитов, а также усиливают дифференцировку этих клеток, индуцируемую тимическим эпителием.

2. Гормональная регуляция зрелых Т-лимфоцитов напрямую зависит от их активационного статуса. Гормоны усиливают спонтанную пролиферацию Т-клеток, но существенно снижают их пролиферативный ответ на митоген, хотя и несколько повышают численность активированных Т-клеток за счет угнетения их апоптоза. Физиологические сочетания ХГ и стероидных гормонов не изменяют продукцию Т-лимфоцитами

ИФНу, но стимулируют синтез и секрецию ИЛ-4, приводя в конечном счете к сдвигу баланса секретируемых Тх1/Тх2-цитокинов в пользу Тх2-типа.

3. Эффекты репродуктивных гормонов в отношении нейтрофилов проявляются только в сочетании доз, соответствующих III триместру беременности, и также определяются наличием и уровнем активации этих клеток - в спонтанном варианте или в случае слабой стимуляции гормоны повышают окислительный потенциал нейтрофилов, тогда как в условиях интенсивной стимуляции, напротив, снижают его. Апоптоз нейтрофилов подавляется репродуктивными гормонами независимо от уровня клеточной активации.

4. Гормональная регуляция активности Т-лимфоцитов изменяется в присутствии аутологичных нейтрофилов. В свою очередь, Т-лимфоциты модулируют ответ нейтрофилов на действие репродуктивных гормонов. Результатом такого взаимодействия может быть как отмена гормональных эффектов в совместной культуре, так и их усиление, в зависимости от дозы гормонов, типа клеток и конкретной функции.

5. Индивидуальные модулирующие эффекты ХГ и в Т-лимфоцитах, и в нейтрофилах опосредуются сАМР-зависимым сигналом, тогда как действие стероидных гормонов реализуется двумя путями -геномным и негеномным, первый из которых ведет, как правило, к ингибированию функций этих клеток, тогда как второй - к стимуляции. При этом негеномные эффекты эстрадиола и прогестерона в основном опосредуются кальцием. Гормональная комбинация в зависимости от дозы гормонов, типа клеток, уровня их дифференцировки и активации может не только нивелировать или полностью блокировать индивидуальные гормональные эффекты, но и, напротив, обеспечивать их проявление.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на следующих международных и всероссийских конференциях и конгрессах: Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды-98» (Москва, 1998); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 1998); 6-м Международном экспертном форуме по иммунотерапии и генной терапии (Флоренция, Италия, 1998); III Международном конгрессе по патофизиологии (Лахти, Финляндия, 1998); 11 Международном конгрессе по иммунологии (Стокгольм, Швеция, 2001); IV, V и VI Всероссийских научных конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург. 2000-2002).

По теме диссертации опубликовано 27 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 236 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав экспериментальной части, заключения и выводов. Работа содержит 33 рисунка и 27 таблиц. Список литературы включает 423 источника.

ВЫВОДЫ

1. Хорионический гонадотропин, эстрадиол и прогестерон в сочетании физиологических доз, соответствующих I триместру беременности, обладают дифференцировочной активностью в отношении интактных дубль-позитивных тимоцитов, а также усиливают дифференцировку этих клеток, индуцированную тимическим эпителием. Самостоятельное действие оказывает только хорионический гонадотропин, тогда как стероидные гормоны не изменяют или незначительно нивелируют его эффекты.

2. Гормоны оказывают разнонаправленное действие на пролиферативную активность Т-лимфоцитов периферической крови в зависимости от уровня клеточной активации: усиливают спонтанную пролиферацию, но существенно подавляют пролиферативный ответ активированных Т-клеток. Стимулирующий эффект обеспечивается эстрадиолом, а супрессивный - в равной степени всеми тремя гормонами.

3. В сочетании доз, соответствующих I триместру беременности, хорионический гонадотропин, эстрадиол и прогестерон подавляют активационный апоптоз CD4+, но не CD8+ Т-лимфоцитов. Угнетение Т-клеточного апоптоза сопровождается снижением экспрессии Т-лимфоцитами мембранной молекулы CD95. Апоптоз Т-лимфоцитов, индуцированный моноклональными антителами к CD95, также подавляется гормональной комбинацией, соответствующей III триместру беременности. Супрессивный эффект в данном случае обеспечивается прогестероном.

4. Сочетания физиологических доз хорионического гонадотропина, эстрадиола и прогестерона, соответствующие как I, так и III триместрам беременности, не влияют на продукцию Т-лимфоцитами ИФНу, но стимулируют синтез и секрецию клетками ИЛ-4. Стимулирующий эффект гормональных комбинаций обеспечивается в равной степени всеми тремя гормонами.

5. Фагоцитарная активность нейтрофилов не изменяется на фоне физиологических сочетаний хорионического гонадотропина со стероидными гормонами несмотря на достоверные модулирующие эффекты отдельных гормонов.

6. Гормональная регуляция окислительного потенциала нейтрофилов зависит от наличия и уровня клеточной активации: в спонтанном варианте или в случае слабой стимуляции стимуляции (латексными частицами) гормоны в физиологическом сочетании, соответствующем III триместру беременности, усиливают продукцию кислородных метаболитов, тогда как в условиях интенсивной стимуляции клеток (опсонизированным зимозаном), напротив, снижают ее. Стимулирующий эффект при этом обеспечивается стероидными гормонами, а ингибирующий - хорионическим гонадотропином.

7. В сочетании доз, соответствующих III триместру, гормоны подавляют апоптоз интактных и стимулированных липополисахаридом нейтрофилов. Апоптоз, индуцированный моноклональными антителами к CD95, ингибируется всеми исследованными гормонами и их сочетаниями.

8. При совместном действии хорионический гонадотропин, эстрадиол и прогестерон в зависимости дозы, типа клеток-мишеней, уровня их дифференцировки и активации, могут проявлять взаимные аддитивные, антагонистические или сенсибилизирующие эффекты.

9. Нейтрофилы модулируют ответ Т-лимфоцитов на действие репродуктивных гормонов. В свою очередь, Т-лимфоциты изменяют чувствительность нейтрофилов к гормональной регуляции, причем результатом таких изменений может быть как отмена, так и, напротив, усиление гормональных эффектов.

Ю.Иммуномодулирующее действие хорионического гонадотропина как в Т-лимфоцитах, так и в нейтрофилах связано с активацией сАМР-зависимого сигнала. Стероидные гормоны реализуют свои эффекты в этих клетках двумя путями - геномным и негеномным, причем первый, как правило, ведет к ингибированию, а второй - к стимуляции, и конечный результат определяется соотношением этих механизмов.

Заключение

Иммунная система во время беременности претерпевает существенную перестройку, которая, с одной стороны, необходима для предупреждения реакций отторжения генетически чужеродного (полуаллогенного) плода, а с другой - является причиной нарушения противоинфекционной защиты организма в этот период. Исследование факторов и механизмов, ответственных за такую перестройку, является одной из основных проблем репродуктивной иммунологии. В рамках настоящей работы изучена модулирующая активность трех важнейших репродуктивных гормонов -хорионического гонадотропина, эстрадиола и прогестерона, - в отношении основных эффекторов адаптивного (Т-лимфоциты) и врожденного (нейтрофилы) иммунитета. При этом сделана попытка моделирования гормонального фона, характерного для разных триместров беременности, с использованием физиологических сочетаний перечисленных гормонов.

Анализ регуляции Т-клеточного звена иммунитета включал наряду с оценкой активности зрелых Т-лимфоцитов изучение тимического этапа их дифференцировки, ключевого в формировании основных субпопуляций этих клеток. В результате было показано, что гормоны репродукции в сочетании, соответствующем I триместру беременности эффективно стимулируют созревание внутритимусных Т-клеточных предшественников (тимоцитов), действуя при этом как напрямую, так и через тимический эпителий, в основном за счет повышения его секреторной активности. Дифференцировочный эффект данной гормональной комбинации обеспечивался ХГ, тогда как эстрадиол и прогестерон, не обладая самостоятельным модулирующим действием, при совместном введении частично отменяли эффекты ХГ в отношении интактных тимоцитов, но не препятствовали стимулирующему действию гонадотропина на дифференцировку этих клеток, индуцированную эпителием тимуса.

Следует отметить, что дифференцировочная активность репродуктивных гормонов в отношении тимоцитов показана впервые и позволяет по-новому взглянуть на изменения, происходящие в тимусе при беременности. Многочисленными исследованиями отмечено снижение в этот период массы и клеточности тимуса [103, 329, 353] с преимущественным истощением кортикального слоя за счет апоптоза кортикальных тимоцитов [103, 329, 305, 353]. Все эти изменения до сих пор интерпретировались как атрофические, тогда как они могут быть следствием не атрофии, а, напротив, стимуляции дифференцировочных процессов, которые в норме сопровождаются массированным апоптозом кортикальных тимоцитов в ходе клональной селекции. Целью таких процессов является, возможно, делеция Т-клеточных клонов, потенциально реактивных в отношении отцовских или фетальных антигенов. В пользу данного предположения говорит и то факт, что дифференцировочную активность исследуемые гормоны проявляют только в комбинации, характерной для I триместра беременности, а именно в конце первого триместра начинается экспрессия плодом антигенов МНС [349, 371], распознавание которых инициирует реакции иммунного отторжения. Впрочем, учитывая способность женских половых стероидов, в частности, эстрадиола вызывать снижение массы и клеточности тимуса [149, 330], не влияя на дифференцировку кортикальных тимоцитов, возможно, в период беременности в тимусе параллельно идет два противоположных процесса -дифференцировочный и атрофический, имеющие одинаковое проявлление на морфологическом уровне.

Функции зрелых Т-лимфоцитов также эффективно регулировались репродуктивными гормонами, причем характер и направленность гормональных эффектов зависела от активационного статуса клетки. Спонтанная пролиферация Т-лимфоцитов усиливалась на фоне сочетания гормонов, соответствующего I триместру беременности, тогда как пролиферативный ответ Т-клеток на митоген существенно угнетался гормональными комбинациями, характерными как для I, так и для III триместров. При этом и ХГ, и оба стероидных гормона вносили вклад в данный процесс, обладая самостоятельными супрессивными эффектами. Альтернативный процесс Т-клеточной активации, апоптоз, также подавлялся репродуктивными гормонами, но только в комбинации, соответствующей I триместру беременности, и только в популяции CD4+-Т-лимфоцитов. Тот факт, что при наличии сильного антиапоптотического эффекта ингибирование пролиферативного ответа было наименее выражено, позволяет говорить о некоторой реципрокности в гормональной регуляции пролиферации и апоптоза Т-лимфоцитов.

Известно, что в период беременности пролиферативный ответ Т-клеток на митогены и аллоантигены существенно снижен, более того, показано, что это снижение обеспечивается сывороточными факторами [245, 334], в том числе и исследуемыми репродуктивными гормонами [165, 174, 327, 373]. Данные по регуляции апоптоза Т-лимфоцитов в этот период не столь многочисленны, но также демонстрируют снижение этого показателя [177], которое, в соответствии с полученными результатами, возможно, ограничивается субпопуляцией CD4+-T-клеток.

Анализ продукции клетками основных Txl- (ИФНу) и Тх2- (ИЛ-4) цитокинов также выявил модулирующие эффекты репродуктивных гормонов. В физиологических сочетаниях, соответствующих как I, так и III триместрам беременности, гормоны не влияли на уровень ИФНу в культуре, но в то же время повышали концентрацию ИЛ-4, причем все три гормона, обладая самостоятельными модулирующими эффектами, вносили вклад в стимуляцию синтеза и секреции ИЛ-4. Результатом такой регуляции был существенный сдвиг баланса в пользу цитокинов Тх2-типа.

Изменение соотношения Тх1/Тх2-цитокинов в настоящее время рассматривается как один из основных механизмов регуляции иммунной системы при беременности. Эти изменения показаны как in vivo [203], так и in vitro, на лимфоцитах периферической крови беременных [243, 401]. При этом отсутствие указанных изменений или их меньшая выраженность, как правило, ассоциированы с патологиями беременности - спонтанными абортами или преждевременными родами [243, 381]. Полученные нами результаты указывают на ключевую роль ХГ, эстрадиола и прогестерона в контроле цитокиновой продукции при беременности и обеспечении сдвига баланса Тх1/Тх2-цитокинов.

Таким образом, исследуемые репродуктивные гормоны способны контролировать перестройку иммунной системы при беременности как на стадии тимического созревания Т-лимфоцитов, так и на уровне активации зрелых Т-клеток (рис. 31). Действие гормонов не сводится к тотальной иммуносупрессии, а, напротив, является стимулирующим в отношении как дифференцировки тимоцитов, так и некоторых функций зрелых Т-клеток, в частности, их спонтанной пролиферации и продукции Тх2-цитокинов. Снижение уровня апоптоза С04+-Т-лимфоцитов под действием гормонов также можно рассматривать как позитивную регуляцию Т-клеточного звена.

Представления о том, что иммунная и репродуктивная система действуют в антагонизме и подавление иммунных реакций является необходимым условием благополучного развития беременности, давно отошли в прошлое. Еще в 1987 году на основе противоабортивного эффекта аллоиммунизации родительскими лимфоидными клетками у мышей была выдвинута гипотеза плацентарной иммунотрофики, согласно которой распознавание материнскими Т-клетками аллоантигенов фетоплацентарной единицы приводит к их активации и продукции цитокинов, усиливающих рост и функции плаценты [410-412]. Позже, с открытием двух типов Т-хелперов, продуцирующих разные наборы цитокинов и обеспечивающих таким образом преимущественную стимуляцию клеточноопосредованных (Txl-зависимых) или гуморальных (Тх2-зависимых) имунных реакций, выяснилось, что основная роль в этом процессе наряду с общими гемопоэтическими цитокинами, ИЛ-3 и ГМ-КСФ [48, 49], принадлежит цитокинам Тх2-типа, в частности, ИЛ-10 [95, 413], тогда как повышение уровня Txl-цитокинов (ИФНу, ФНОа) напротив, приводит к гибели плода [94].

Возвращаясь к полученным данным, можно сказать, что в отсутствие активации совместное действие ХГ, эстрадиола и прогестерона должно приводить к повышению численности периферических Т-лимфоцитов как за счет усиления их дифференцировки, так и за счет повышения пролиферативной активности интактных Т-клеток. Благодаря этим изменениям, возможно, обеспечивается повышенный фоновый уровень продукции Тх2-цитокинов, оказывающих трофическое действие на плаценту и плод. В то же время, в условиях стимуляции Т-лимфоцитов гормоны существенно подавляют пролиферацию этих клеток. Тотальное снижение пролиферации необходимо, по-видимому, для предупреждения антифетальных иммунных реакций, а за счет увеличения доли Т-хелперов (CD4+) и сдвига баланса секретируемых цитокинов в пользу Тх2-типа при этом, вероятно, обеспечивается не только фетопротективный, но и фетотрофический эффект. Однако для материнского организма эти изменения связаны с изменением иммунорезистентности, которое проявляется в угнетении клеточноопосредованного (Txl-зависимого) иммунитета и некоторой стимуляции гуморального (Тх2-зависимого) звена [203].

АДАПТИВНЫЙ ИММУНИТЕТ

ВРОЖДЕННЫЙ ИММУНИТЕТ

Тимоциты Дифференцировка пролиферация интактные апоптоз л н S а пролиферация о ■е- S S ч апоптоз н активированные S о 1 g ИЛ-4

5fi в В * &Е с В ИФНу окислительная ктивность интактные латекса •в-to о а л яс Н тз эритроцитов барана 1 W о -8-S Р латекс 9 о ё активированные опсонизиро-ванный зимозан Я О 1 н 85 »

Рис. 33. Гормоны репродукци в регуляции функциональной активности Т-лимфоцитов и нейтрфилов

Наряду с изменением адаптивного иммунитета, снижение защитных свойств организма в период гестации может быть связано с регуляцией неспецифических механизмов резистентности, в частности, со снижением активности основных эффекторов неспецифической защиты, нейтрофилов. А учитывая активное участие этих клеток в трансплантациионном иммунитете и процессах ремоделирования тканей, регуляция их функциональной активности репродуктивными гормонами приобретает особое значение.

Как показали исследования, ХГ, эстрадиол и прогестерон в сочетании, соответствующем III триместру беременности, снижают апоптоз нейтрофилов, что позволяет рассматривать их в качестве важнейших факторов, обусловливающих выживание этих клеток в конце беременности [404].

Фагоцитарная активность нейтрофилов несмотря на достоверные эффекты отдельных гормонов не изменялась на фоне их физиологических сочетаний, тогда как гормональная регуляция окислительного потенциала зависела от наличия и способа стимуляции клеток: в спонтанном варианте или в случае слабой активации латексными частицами эффекты гормонов были стимулирующими, а при интенсивной активации опсонизированным зимозаном - напротив, ингибирующими. Все эффекты гормоны оказывали в сочетании, соответствующем III триместру, причем стимулирующее действие гормональной комбинации обеспечивалось стероидами, тогда как ингибирующее - главным образом ХГ.

Особого внимания заслуживает регуляция продукции нейтрофилами окиси азота, которая стимулировалась гормонами в спонтанном варианте, но не изменялась в случае стимуляции. Учитывая незначительный эффект гормонов на спонтанную продукцию окиси азота, можно предполагать, что NO в данном случае играет исключительно регуляторную роль: она может вызывать снижение адгезии и хемотаксиса гранулоцитов, ингибирование агрегации тромбоцитов и пролиферации лимфоцитов [2], подавление активности 5-липоксигеназы и НАДФН-оксидазы макрофагов [14]. Таким образом, гормон-зависимая стимуляция NO-синтазы интактных нейтрофилов обеспечивает подавление функций лейкоцитов, а также, по-видимому, служит механизмом предупреждения спонтанных абортов, причиной которых во втором триместре беременности чаще всего является тромбообразование

7].

В целом, в отсутствие патогена или в случае слабой стимуляции благодаря совместному действию ХГ, эстрадиола и прогестерона численность нейтрофилов и уровень их активации, по-видимому, возрастают в III триместре беременности. В то же время, в условиях ответа на патоген окислительный потенциал нейтрофилов существенно снижается, хотя численность этих клеток и в этом случае несколько увеличивается за счет угнетения их апоптоза (рис. 31).

Обсуждая физиологическое значение данных эффектов следует, очевидно, учитывать, что нейтрофилы наряду с основной функцией - обеспечением неспецифической защиты организма, играют важную роль в трансплантационном иммунитете [Olszewski 1996], а также принимают непосредственное участие в процессах репродукции - инфильтрация этими клетками шейки матки и секреция гранулярных ферментов, в первую очередь коллагеназы и эластазы, являются необходимым условием цервикальной дилатации и инициации родов [406, 418].

Повышение численности нейтрофилов именно в III триместре, а также незначительное возрастание их активности, возможно, необходимо для обеспечения достаточного уровня секреции протеаз, расщепляющих экстраклеточный матрикс и участвующих в ремоделировании соединительной ткани [406, 418]. Незначительное увеличение при этом окислительной активности нейтрофилов, по-видимому, не является губительным для плода или же действие кислородных радикалов нейтрализуется какими-то факторами. Кроме того, повышение фонового уровня активации нейтрофилов при беременности может служить механизмом, компенсирующим угнетение адаптивного иммунитета в этот период. В то же время, подавление окислительного ответа нейтрофилов на интенсивную стимуляцию необходимо, по-видимому, для предупреждения деструкции плацентарных тканей кислородными метаболитами и инициации отторжения плода [82], хотя и является одной из причин снижения антимикробной резистентности материнского организма.

В целом, ХГ, эстрадиол и прогестерон способны эффективно изменять как специфические, так и неспецифические защитные реакции организма. Благодаря сбалансированному действию этих гормонов, по-видимому, реализуется общая стратегия регуляции, результатом которой является предупреждение антифетальных иммунных реакций, но в то же время обеспечивается достаточный уровень антимикробной резистентности материнского организма.

Отдельно хотелось бы остановиться на вопросе о соотношении индивидуальных и комбинированных эффектов репродуктивных гормонов, и несмотря на их разнообразие попытаться выявить в действии гормонов какие-то закономерности.

На основании полученных данных можно выделить как минимум четыре типа взаимной гормональной регуляции.

Первый тип - это ситуация, при которой индивидуальные эффекты ХГ или стероидных гормонов не изменяются при их совместном действии. Так регулируется дифференцировка тимоцитов в присутствии тимического эпителия (достоверные эффекты - ХГ 100 МЕ/мл и I триместр беременности, стимуляция), спонтанная пролиферация (эстрадиол 10 нг/мл и III триместр, стимуляция) и анти-С095-зависимый апоптоз (прогестерон 100 нг/мл и III триместр, угнетение) Т-лимфоцитов, а также люминесцентный ответ нейтрофилов на латекс (прогестерон 100 нг/мл и III триместр, стимуляция). Вероятнее всего, в данном случае эффект гормональной комбинации обеспечивается соответствующим гормоном. К этому же типу регуляции можно отнести и влияние гормонов на ФГА-индуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов (угнетение), продукцию ИЛ-4 (стимуляция) и aHTH-CD95-зависимый апоптоз нейтрофилов (угнетение), при которой модулирующей активностью обладают практически все гормоны и их сочетания. Тем не менее, следует отметить, что эффекты гормональных комбинаций в данном случае, как правило, сопоставимы с индивидуальными гормональными эффектами, так что при совместном внесении гормоны или ослабляют действие друг друга, или один из гормонов первым реализует свой эффект, и к действию других клетка уже нечувствительна. Как видно из перечисленных данных, этот тип регуляции нельзя приписать какому-то одному гормону, типу клеток, уровню их активации или какой-то определенной клеточной функции.

Второй и наиболее часто встречаемый тип регуляции -нивелирование или полная отмена индивидуальных эффектов гормонов при их совместном действии. Он относится к действию гормонов на дифференцировку интактных тимоцитов (ХГ 100 МЕ/мл - стимуляция, I триместр - нет эффекта), активационный апоптоз С08+-Т-лимфоцитов (ХГ 100 МЕ/мл - стимуляция, I триместр - нет эффекта), продукцию ИФНу (ХГ 100 МЕ/мл -угнетение, I триместр - нет эффекта; прогестерон 100 нг/мл -стимуляция, III триместр - нет эффекта), нейтрофильный фагоцитоз латексных частиц (ХГ 100 МЕ/мл - стимуляция; комбинация стероидов, I и III триместры, - стимуляция; комбинация ХГ со стероидами, I и III триместры, - нет эффекта), люминесцентный ответ на зимозан (ХГ 100 МЕ/мл - угнетение, I триместр - нет эффекта), стимулированную продукцию нейтрофилами окиси азота (ХГ 10 МЕ/мл - угнетение, эстрадиол 10 нг/мл, обе дозы прогестерона - стимуляция; стероиды с ХГ - нет эффекта). Следует отметить, что практически во всех перечисленных случаях самостоятельным модулирующим действием обладал только один гормон, тогда как другие были неэффективны, так что объяснить отсутствие эффекта соответствующей гормональной комбинации взаимным гашением индивидуальных гормональных сигналов нельзя. Никаких закономерностей, связанных с определенным типом клеток, их активационным статусом или конкретной функцией здесь также не прослеживается, однако в механизмах взаимной гормональной регуляции, пожалуй, есть система: в подавляющем большинстве случаев стероидные гормоны при совместном действии отменяют модулирующие эффекты ХГ. Обратная регуляция, то есть отмена действия стероидов гонадотропином, показана только в двух тестах, но при этом отмечена как для эстрадиола (синтез NO, нейтрофилы), так и для прогестерона (синтез NO, нейтрофилы; синтез ИФНу, Т-лимфоциты). Нивелирование эффектов ХГ в присутствии стероидов может реализовываться как минимум двумя механизмами — за счет регуляции стероидными гормонами плотности и аффинности рецепторов для ХГ на клеточной мембране или перекрывания гормональных сигналов на внутриклеточном уровне. Обе версии имеют свое подтверждение, хотя следует сразу оговориться, что поскольку речь идет о репродуктивных гормонах, данные по их взаимной регуляции получены в основном для традиционных мишеней - тканей гонад. Показано, в частности, что прогестерон на генетическом уровне подавляет экспрессию рецептора для ХГ (ЛГ/ХГ-Р) в клетках Лейдига [124]. Для эстрадиола такого эффекта не выявлено, но он не исключен. Что касается взаимодействия гормональных сигналов на внутриклеточном уровне, можно предложить следующую схему развития событий: как показано в данной работе, подавляющее большинство эффектов ХГ и в Т-лимфоцитах, и в нейтрофилах реализуется за счет активации аденилатциклазы и повышения уровня сАМР в цитоплазме, тогда как негеномные эффекты стероидных гормонов, как правило, связаны с активацией кальциевого и фосфоинозитидного сигналов [67, 326], а сАМР-зависимая и кальциевая система в иммунокомпетентных клетках действуют в антагонизме [12, 100] и их взаимная активация вероятнее всего приведет к нивелированию или отмене индивидуальных гормональных эффектов. Именно за счет перекрывания гормональных сигналов реализуется, очевидно, и ХГ-зависимая отмена модулирующих эффектов эстрадиола и прогестерона. Полученные данные согласуются с показанным ранее антагонизмом в действии ХГ и эстрадиола на процессы кооперации Т- и В-лимфоцитов в условиях сингенного переноса у мышей, при котором эстрадиол отменял иммуносупрессивный эффект высокой дозы гонадотропина [194].

Третий тип взаимной гормональной регуляции - наличие модулирующего действия комбинации ХГ и стероидных гормонов при отсутствии индивидуальных гормональных эффектов. Таким образом регулируется активационный апоптоз CD4+-T-лимфоцитов (достоверный эффект - III триместр, угнетение), спонтанная окислительная активность нейтрофилов (III триместр, стимуляция) и апоптоз этих клеток в условиях стимуляции ЛПС (III триместр, угнетение). Наиболее вероятный механизм данной регуляции -пермиссивные или сенсибилизирующие эффекты как ХГ в отношении стероидов, так и стероидов в отношении ХГ. Известно, в частности, что ХГ стимулирует синтез и экспрессию рецепторов для прогестерона клетками гранулезы [122, 300] и таким образом может повышать (или обеспечивать) их чувствительность к данному гормону, а эстрадиол, в свою очередь, в зависимости от дозы способен как нивелировать, так и усиливать эффекты ХГ в лютеоцитах [158].

Отдельно следует отметить ситуацию, при которой выявлено достоверное модулирующее действие комбинации стероидных гормонов при отсутствии самостоятельных эффектов эстрадиола и прогестерона. Такой тип гормональной регуляции характерен только для нейтрофилов и относится к фагоцитозу латексных частиц (достоверные эффекты - комбинации стероидов, соответствующие как I, так и III триместрам беременности, стимуляция), а также к спонтанной окислительной активности этих клеток (III триместр, стимуляция). Поскольку стимулирующие эффекты стероидов в отношении нейтрофилов, как показано в данной работе, реализуются, негеномным путем и связаны в основном с активацией кальциевого сигнала, в данном случае скорее всего имеет место синергизм или просто аддитивное действие этих гормонов, при котором индивидуальные гормональные сигналы слишком слабы, но их суммирование обеспечивает проявление достоверного эффекта. Не исключена и взаимная регуляция стероидов на уровне экспрессии гормональных рецепторов. Так, показано, что эстрадиол способен индуцировать экспрессию прогестероновых рецепторов в матке, примируя ее таким образом к действию прогестерона [388].

И наконец, четвертый тип регуляции, который выявлен только для спонтанного апоптоза нейтрофилов, - изменение стимулирующего эффекта ХГ (10 МЕ/мл) на ингибирующий в присутствии стероидов (III триместр, угнетение). Объяснить этот эффект на основе имеющихся литературных данных сложно, однако надо отметить, что ранее уже была показана способность эстрадиола изменять иммуномодулирующие эффекты ХГ на противоположные

9]

Таким образом, при совместном действии ХГ, эстрадиол и прогестерон могут в зависимости от целого ряда факторов проявлять взаимные аддитивные, синергичные, сенсибилизирующие или антагонистические эффекты.

Обращает на себя внимание и тот факт, что действие репродуктивных гормонов на Т-лимфоциты изменяется на фоне аутологичных нейтрофилов, в частности, в совместной культуре не воспроизводится антиапоптотический эффект гормональной комбинации, соотвествующей III триместру, в отношении анти-СD95-МкАт-стимулированных Т-клеток. Т-лимфоциты, в свою очередь, также модулируют эффекты репродуктивных гормонов в нейтрофилах. Так, гормон-зависимое усиление люминесцентного ответа нейтрофилов на латексную стимуляцию (III триместр) не выявляется в присутствии аутологичных Т-клеток. В то же время, антиапоптотический эффект данной гормональной комбинации в отношении нейтрофилов статистически значимо возрастает в совместной культуре. К сожалению, этих данных слишком мало для поиска каких-то закономерностей, однако их необходимо учитывать при интерпретации и сопоставлении результатов, полученных, скажем, на фракционированных клетках и цельной крови.

Еще один вопрос, который следует обсудить - молекулярные механизмы действия гормонов. Анализ полученных данных показывает, что практически все выявленные эффекты гонадотропина как в Т-лимфоцитах, так и в нейтрофилах, реализуются за счет активации сАМР-зависимого сигнала: таким путем осуществляется угнетение пролиферативного ответа лимфоцитов на ФГА, усиление активационного апоптоза этих клеток, регуляция продукции ИЛ-4 (стимуляция) и ИФНу (угнетение), подавление люминесцентного ответа нейтрофилов на зимозан и усиление их спонтанного апоптоза. В этой связи важно отметить, что ранее нами было показано сАМР-повышающее действие низкой дозы ХГ в нейтрофилах и высокой дозы - в Т-лимфоцитах [11], а также в Т-спленоцитах мышей [28], причем повышение концентрации цАМФ в этих клетках сопровождалось снижением их функциональной активности [28, 29]. Участие сАМР в опосредовнии супрессивных эффектов ХГ вполне закономерно, поскольку активационный и сАМР-зависимый сигнал и в Т-лимфоцитах [12], и в нейтрофилах [82, 235, 261, 277] находятся в антагонизме (рис. 32, 33). Разная направленность сАМР-зависимого действия ХГ на продукцию Тх1 (ИФНу)- и Тх2 (ИЛ-4)-цитокинов также объяснима и может быть связана как с дивергенцией антигенного сигнала в разных Т-хелперных субпопуляциях [12], так

ХГ

Рис. 32. Механизмы регуляции активированных Т-лимфоцитов репродуктивными гормонами.

Е2 - эстрадиол, ER - рецептор для эстрадиола ядерный, ERm - рецептор для эстрадиола мембранный, IL-2 — интерлейкин 2, IL-2R - рецептор для IL-2, Рк - прогестерон, PR - рецептор для прогестерона ядерный, PRm - рецептор для прогестерона мембранный, R - рецептор для ХГ.

Сплошные линии - активация, прерывистые - ингибирование. и с оппозитной регуляцией Тх1/Тх2-цитокиновых генов одними и теми же транскрипционными факторами, в первую очередь NFAT [195, 210, 372]. Что касается проапоптотических эффектов ХГ в обеих клеточных популяциях, то их зависимость от сАМР объяснить трудно, поскольку и в активированных Т-лимфоцитах [316], и в нейтрофилах [301] сАМР-повышающий сигнал связан с угнетением апоптоза. Скорее всего, эти эффекты являются следствием не прямого действия гормонов, а опосредуются какими-то гуморальными факторами, продуцируемыми клетками в ответ на действие ХГ.

Данные по молекулярным механизмам иммуномодулирующих эффектов стероидных гормонов не столь однозначны и при их интерпретации необходимо учитывать, что реализация этих эффектов может осуществляться двумя путями - геномным и негеномным. Геномный механизм предполагает участие ядерных (точнее - цитоплазматических) рецепторов, которые при связывании с гормоном транслоцируются в ядро и, действуя как транскрипционные факторы, регулируют экспрессию различных генов. Это классический механизм действия стероидных гормонов. В Т-лимфоцитах показана экспрессия ядерных рецепторов как для эстрадиола [339, 370], так и для прогестерона [77, 310]. Для нейтрофилов таких данных пока нет, вероятнее всего потому, что эти клетки не рассматриваются обычно как мишень для модуляции женскими половыми стероидами. Негеномные эффекты стероидов реализуются через мембранные рецепторы и связаны в основном с повышением Са в цитоплазме и активацией фосфоинозитидного предукция активных кислородных метаблитов

ХГ продукнн» N0

Нейтрофил

Рис. 33. Механизмы регуляции активности нейтрофилов репродуктивными гормонами.

Ег - эстрадиол, ERm - рецептор для эстрадиола мембранный, IL-2 - интерлейкин 2, IL-2R -рецептор для IL-2, NOS - NO-синтаза, Рг - прогестерон, PRm - рецептор для прогестерона мембранный. R - рецептор для ХГ.

Сплошные линии - активация, прерывистые - кнгибирование. обмена [67, 123, 326]. Этот механизм действия стероидных гормонов открыт сравнительно недавно и широко представлен в репродуктивных тканях [326]. На Т-лимфоцитах экспрессия таких рецепторов косвенно подтверждена и для эстрадиола [67], и для прогестерона [99, 123]. На нейтрофилах мембранных рецепторов для стероидов не выявлено, однако нет и данных, исключающих экспрессию таких рецепторов. Уже сам факт, что эстрадиол и прогестерон в краткосрочной культуре, не предусматривающей реализацию геномных эффектов, способны регулировать активность нейтрофилов, свидетельствует о наличии соответствующих мембранных рецепторов на этих клетках.

Известно, что активация как Т-лимфоцитов [12], так и нейтрофилов [136, 147] связана в первую очередь с мобилизацией кальциевого и фосфоинозитидного обменов. Сигналы, инициируемые стероидами в этих клетках через мембранные рецепторы, таким образом, аналогичны активационным. С этой точки зрения вполне закономерно, что эстрадиол повышает спонтанную пролиферацию Т-лимфоцитов. Пролиферативный ответ Т-клеток на митоген, правда, подавляется гормоном, но этот эффект не зависит от кальция и реализуется, по-видимому, геномным путем. Стимуляция синтеза IL-4 стероидными гормонами также не зависит от кальция и связана скорее всего с повышением его экспрессии на транскрипционном уровне. В то же время, прогестерон-зависимая регуляция синтеза IFNy в соответствии с данными ингибиторного анализа реализуется на двух уровнях, геномном и негеномном, причем геномный путь ведет к ингибированию, а негеномный (Са зависимый) - к стимуляции, и именно соотношение между ними определяет конечный эффект гормона (рис. 32).

В краткосрочной культуре нейтрофилов геномный путь реализации сигнала исключен и единственный возможный механизм непосредственного действия стероидов на эти клетки - через мембранные рецепторы (рис. 33). А сигналы с мембранных рецепторов для стероидных гормонов, как указывалось ранее, аналогичны активационному. Именно этим, по-видимому, и объясняется, что практически все индивидуальные эффекты эстрадиола и прогестерона, равно как и их комбинаций в нейтрофилах - стимулирующие: гормоны повышают фагоцитарную активность этих клеток (комбинация эстрадиола с прогестероном), окислительный ответ на зимозан (прогестерон) и латекс (прогестерон и его комбинация с эстрадиолом), а также синтез нейтрофилами окиси азота (эстрадиол, прогестерон).

Таким образом, эффекты стероидных гормонов в иммунокомпетентных клетках реализуются как на геномном, так и на негеномном уровнях, причем геномные эффекты обоих стероидов, как правило, ингибирующие, тогда как негеномные все без исключения - стимулирующие.

Завершая разговор о механизмах гормональной регуляции, хотелось бы еще раз подчеркнуть, все исследованные гормоны обладают выраженной иммуномодулирующей активностью. Характер и направленность их действия определяются целым рядом факторов - дозой самих гормонов, типом клеток-мишенией, уровнем их дифференцировки, а также наличием и способом активации. И что самое важное - по отдельности гормоны ведут себя не так, как в сочетании, причем гормональная комбинация в зависимости от перечисленных выше факторов может как нивелировать индивидуальные эффекты гормонов, так и, напротив, обеспечивать их проявление. Поэтому перспектива такого рода исследований - в

А моделировании гормонального и цитокинового фона, характерного для беременности. Только такой подход позволит вплотную приблизиться к пониманию механизмов эндокринного контроля иммунных реакций в этот период.