Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Влияние гелий-неонового лазерного излучения на цитохимический статус нейтрофилов периферической крови при стрессе

На правах рукописи Порозова Светлана Геннадьевна

Влияние гелий-неонового лазерного излучения на цитохимический статус нейтрофилов периферической крови

гт-гчтг лтполла 1ШП

х х

16.00.02 - патология, онкология и морфология животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов -1998

Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории Саратовского государственного медицинского университета

Научный руководитель:

Академик АЕ, доктор медицинских наук, профессор Г.Е. Брилль

Официальные оппоненты:

Академик МАНВШ, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор В.Ф. Киричук

кандидат ветеринарных наук, доцент Б.М. Скорляков Ведущая организаций:

Саратовским государственный университет им. Ы.Р.ЧсрнышсБского

Защита состоится 18 декабря 1998 года в 11.30 ч на заседании диссертационного совета К 120.72.04 Института ветеринарной медицины и биотехнологии (аудитория кафедры патологической анатомии) Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова (410071, г.Саратов, ул. Соколовая, 335)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова

Автореферат разослан ноября 1998 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.в.т., доцент /

Салаутин В.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ) в настоящее время нашло применение практически во всех областях медицины при лечении широкого спектра заболеваний (Крюк

A.C. с соавт., 1986; Гордиенко В.И., Залесский В. H., 1989; Илларионов

B.Е., 1992; Павлова Т.Н.. 1993; Хомерики С.Г. с соавт., 1994; Кошелев В.Н. с соавт., 1994; Чернышева JI.A., М.А.Хан, 1995; Ларюшин А.И., Илларионов В.Е., 1997).

Положительный клинический эффект применения света гелий-неоновых лазеров (ГНЛ) при различных формах патологии позволяет предположить влияние НИЛИ на универсальные системы, реализующие разнообразные формы реагирования живого организма на воздействие патогенных факторов. Одной из таких форм ответа является активация

телчп тгат/ло лтл itTrnnTtitiv o опгтпчгл^гт««! лпллл^ чтлтт! ti t. * v naevimfí

«N V/ i»i * * W A 1 liui/v -J UU^Il 111 V l (IWIIVSWV'WI A VVl L/ll U1 Л

известных как общий адаптационный синдром (стресс-реакция) (Селье Г., 1960, 1979). Стресс является неспецифическим элементом патогенеза различных заболеваний и патологических процессов.

С этой точки зрения несомненный интерес представляет система полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ), роль которых не ограничивается только участием в фагоцитозе и обеспечении неспецифической резистентности организма. В настоящее время нейтрофильный гранулоцит рассматривается как универсальный эффектор гомеостаза (Маянский А.Н., 1989).

Гомеостаз клетки и характер ее ответа на различные эндогенные и экзогенные стимулы во многом определяют особенности функционирования рецепторных структур и внутриклеточных звеньев сопряжения (Бережная Н.М., 1988). В настоящее время известно, что нейтрофилы экспрессируют на своей мембране разнообразные рецепторы. В частности, нейтрофилы человека экспрессируют Нг и Н2 -рецепторы к гистамину (Gesprach С., Abita J., 1982; Selirnan В., Fletcher M., Gallin G., 1983), рецепторы к a- и ß-адренергическим веществам (Dulis B.H., Wilson J.B., 1980; Gerdes J., Stein H., 1980), к цитохрому В (Бережная Н.М., 1988), к Fc-фрагменту IgG и IgA (Flat H., Wright S., Unkeless J., 1982), в определенных условиях к IgM (Белоцкий С.М., СнастинаТ.И.,ДиковскаяЕ.С., 1985), к компонентам комплемента CRI, CR3 и CR4 (Fearon D., 1979; Alexander D., Fearon D., 1983; Dykman T. et al., 1983) и др.

Список заболеваний, в патогенезе которых нейтрофилы играют заметную роль, постоянно расширяется. Среди них инфаркт миокарда

(Клебанов Г.И. с соавт., 1987; Крейнина М.В. с соавт., 1989), профессиональные аллергодерматозы (Иванова JI.A. с соавт., 1987), лучевая болезнь (Чухловин А.Б., 1989), язвенная болезнь желудка (Успенский В.М. с соавт., 1989) и даже СПИД (Друх В.М., Земсков В.М., Воробьев A.A., 1992).

Биохимические изменения, обусловленные патологическим процессом в организме, находят свое отражение в метаболизме клеточных элементов крови, а с помощью цитохимических методов удается выявить ранние сдвиги в обменных процессах клетки. Поэтому большое количество работ посвящено изучению состояния цитохимического спектра нейтрофилов и его корреляции с выраженностью и динамикой патологических процессов (Нагоев Б.С., Шубич М.Г., 1979; ВишневецкиЙ Ф.Е. с соавт., 1981; Казимирко В.К., Пилиева Е.В., Флегонтов В.П., 1981; Суржикова Г.С., Ковалева Л.Г., Гольдберг Е.Д., 1984; Шардаков В.И., Минаков В.Н., 1984; Смиян И.С., Луговая О.И., 1985; Нагоев Б.С., 1988; Подильчак М Д., Терлецкая Л.М., 1988; Базелюк Л.Т., 1992). В качестве критерия тяжести заболевания рекомендуется определять фагоцитарные реакции, состояние киелородзазисимых и кисяородоезависимых процессов и нейтрофклах (НСТ-тест и содержание ЛКБ) (Витковский Ю.А., 1997).

Высокодифференцированная клеточная популяция ПЯЛ находится иод влиянием нейрогуморальной регуляции. Существует концепция, согласно которой система тканевых нейтрофилов выполняет посредническую роль между центральной нервной системой и соединительной тканью (Бахов Н.И., Александрова Л.З., Титов В.Н.,

t rtonv m________________ -_________« - -л w

i уоо). i cwicMiuaa шаль ииигемы н»прицшльных 1ринулоцит1>в с нервной и гуморальной регуляцией функций организма и наличие у нейтрофила рецепторов к "гормонам стресса" подразумевает включение этих полифункциональных клеток в процесс реализации стрессорного ответа организма.

Цель работы. Изучить влияние гелий-неонового лазерного облучения на цитохимический статус нейтрофилов периферической крови в условиях in vitro и при экспериментальном стрессе.

Задачи исследования:

1) изучить влияние излучения гелий-неонового лазера (Х=632,8 нм) на цитохимический профиль полиморфноядерных лейкоцитов при облучении крови в условиях in vitro;

2) исследовать особенности влияния низкоинтенсивного

лазфного излучения на метаболические параметры, знзиматическуго и бактерицидную активность нейтрофилов крови в зависимости от дозы и длительности лазерного воздействия;

3) определить характер ответной реакции метаболических, ферментативных и микробицидных систем нейтрофилов на стрессорное воздействие и проанализировать особенности влияния гелий-неонового лазерного облучения на нейтрофилы в зависимости от длительности действия стресс-фактора;

4) изучить влияние транскутанного гелий-неонового лазерного облучения на цитохимические показатели полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови на этапе запуска стресс-реакции.

Научная новизна. Показано, что облучение кропи светом ГНЛ в условиях in vitro оказывает воздействие на цитохимический профиль

UОитпл/Кя ГГЛО IX ЛлФЛ^АДш'Т! 71АЛГ!Т ТГЛОЛТЛПНМП f» rfi V"О

1IV XX Д. <4 ^/V Ж ич/t^V^VLVl 11VVII 1 Д V<J V J Ul/Xi VI1IMU1II /VU^/UIM W-^V • *-* i 1 VJ-/t>W w

проведен комплексный анализ изменений цитохимических параметров нейтрофилов под влиянием гелий-неонового лазерного облучения на различных моделях стресса. Выявлено модифицирующее и протекторное влияние лазерного воздействия на ряд показателей метаболизма, энзиматическои активности, состояние бактерицидных систем неитрофилов в условиях формирования стрессорного ответа. Впервые обнаружено модулирующее влияние транскутаиного облучения светом ГНЛ на метаболический ответ нейтрофилов в начальной стадии стрессорной реакции. Получены новые данные о влиянии лазерного света на клеточные механизмы неспецифической резистентности организма, что дополняет существующие представления о механизмах влияния НИЛИ на организм человека и животных.

Практическая значимость. Установленное в работе стимулирующее влияние света ГНЛ на метаболизм нейтрофилов при облучении цельной крови in vitro может быть использовано в клинической практике как дополнительное воздействие при любых экстракорпоральных манипуляциях с кровью. Дозозависимый характер фотоэффекта должен учитываться при вне- и внутрисосудистом низкоинтенсивном облучении крови и при разработке схем лазеротерапии. Выявленная в работе зависимость между метаболическими сдвигами в нейтрофилах и интенсивностью стрессорного воздействия позволяет рекомендовать исследование ряда цитохимических параметров ПЯЛ для оценки степени изменения гомеостаза при стрессе.

Апробация работы. Результаты диссертационного исследования доложены и обсуждены на научной конференции Центральной научно-исследовательской лаборатории Саратовского государственного медицинского университета (ноябрь 1995, июнь 1998), на заседании научного общества патологоанатомов (ноябрь 1995), на заседании объединенных обществ физиологов, патофизиологов, фармакологов и биохимиков СГМУ (сентябрь 1998). Фрагменты диссертации представлены на Международном Симпозиуме "Biomedical Optics Europe '93" (Budapest, Hungary, 1993), на Международном Конгрессе "Laser in Medicine and Surgery" (Munich, Germany, 1993), на 2-ой Всероссийской конференции "Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования органов, тканей, клеток человека и животных" (Саратов, 1993), на Всероссийском Симпозиуме "Лазерная и магнитная терапия в экспериментальных и клинических исследованиях" (Обнинск, 1993), на Всероссийской конференции "Физиология и патология перекисного окисления липидов, гемостаза и иммуногенеза" (Полтава, 1993), на Международной конференции "Новые достижения лазерной медицины" (Москва-С.-Петербург, 1993), на Третьей Международной конференции "Актуальные сопросы лазерной медицины к операционной эндоскопии" (Москва-Видное, 1994), на СВО'93 International Workshop "Cell and Biotissue Optics: Applications in Laser Diagnostics and Therapy" (Tvioskow-Nizhny Novgorod, 1994), на I съезде Международного Союза ассоциации патологоанатомов (Москва, 1995), на Международной конференции "Biomedical Optics" (San Jose, USA, 1995), на International Kongress "Laser in Medicine and Surgeiy" (München, 1995), на. Первом Российским Конгрессе по патофизиологии "Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы" (Москва, 1996), на IX Международной научно-практической конференции "Применение лазеров в медицине и биологии" (Ялта-Харьков, 1997).

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Облучение периферической крови светом гелий-неонового лазера с длиной волны 632,8 нм в условиях in vitro оказывает влияние на цитохимический статус полиморфноядерных лейкоцитов.

2) Влияние гелий-иеонового лазерного облучения на цитохимический статус нейтрофилов в условиях in vitro носит дозозависимый характер: 15-минутное воздействие оказывает стимулирующий эффект, 30-минутное - способствует формированию адаптивных метаболических реакций клетки.

3) Транскутанное гелий-неоновое лазерное облучение на фоне 15-минутного иммобилизационного стресса оказывает протекторное влияние на стресс-индуцированные изменения ферментативной активности и снижает степень угнетения антимикробного и цитотоксического потенциала нейтрофилов; а при 30-минутном стрессе - способствует снижению активности бактерицидных систем нейтрофилов.

4) Транскутанное облучение светом ГНЛ на этапе запуска стрессорной реакции оказывает выраженное модулирующее влияние на цитохимический профиль нейтрофилов, способствуя активации их бактерицидных систем, метаболизма и образованию биологически активных молекул, принимающих участие в формировании системного отклика на действие стрессорного фактора.

Публикации: По материалам диссертационного исследования опубликовано 17 работ, в том числе 6 - в зарубежной печати.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 191 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, содержащей описание материалов и методов исследований, двух глав, включающих результаты собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Указатель литературы включает 178 отечественных и 119 зарубежных источников. Работа содержит 25 таблиц и 27 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Эксперименты выполнены на 89 мышах-самцах линии СБА и 90 беспородных белых крысах-самцах массой 180-200 г. Во всех экспериментах использовали лазерную установку ЛГ-79 (Я.=632,8 нм). Для изучения влияния НИЛ И на цитохимические показатели нейтрофилов периферической крови были проведены исследования на 32 мышах с облучением крови in vitro. Кровь (2 мл), полученную после декапитации животных, смешивали с гепарином, помещали в стеклянный бюкс и облучали светом ГНЛ в течение 15 мин (плотность мощности - 3,8 мВт/см2). Контролем служила необлученная кровь тех же животных.

В экспериментах на крысах (п-40) кровь (2 мл), помещенная в стеклянную кювету (антикоагулянт - гепарин), подвергалась фотовоздействию в течение 15 и 30 минут (плотность мощности - 5

мВт/см2). Контролем служила кровь тех же животных, выдержанная в аналогичных условиях, но не подвергавшаяся облучению.

Эксперименты по изучению особенностей влияния транскутанного облучения животных светом ГНЛ на состояние нейтрофилов при стрессе были поставлены на 57 мышах. Для воспроизведения иммобилизационного стресса 50 животных подвергали жесткой фиксации на спине в течение 15 и 30 минут. Группе животных (25 мышей) на фоне иммобилизации проводилось облучение деиилированного участка кожи внутренней поверхности бедра над проекцией сосудистого пучка светом ГНЛ (плотность мощности - ¡9 мВт/см2) в те же временные промежутки. В качестве контроля служила кровь интактных мышей.

Для изучения действия гелий-неонового лазерного излучения на цитохимический профиль нейтрофилов периферической крови во время запуска стресс-реакции были выполнены эксперименты на 50 крысах. Все животные были разделены на 3 группы. Первую группу (контрольную) составили интактные животные. Животные второй группы подвергались воздействию кратковременного сочетанного иммобшшзационко-звукового стресса, который моделировали путей жесткой фиксации животных в положении на спине в течение 2 мкк при одновременном воздействии звукового раздражителя (120 дБ, 150500 Гц). Животные третьей группы одновременно со стрессорным воздействием подвергались транскутанному облучению светом ГНЛ (плотность мощности - 5 мВт/см2) депилированного участка области проекции сосудистого пучка на внутренней поверхности бедра. Сразу после завершения ei рессорного воздействия животных декапитировали и брали кровь для проведения цитохимических исследований. В качестве антикоагулянта использовали гепарин.

Для оценки метаболической, ферментативной активности и состояния микробицидных систем цитохимическими методами в нейтрофилах определелялись следующие показатели: содержание гликогена по J. McManus (1946); липидов по H.L. Sheehan, C.W. Story (1947); лизосомных катионных белков (ЛКБ) по В.Е.Пигаревскому (1975); активность АТФ-азы по М. Wachstein, Е. Meisel (1956); миелопероксидазы по R. Graham, М. Knoll (1967); сукцинатдегидрогиназы (СДГ) по Р.П.Нарциссову (1969); КСТ-тест в модификации Б.С.Нагоева (1978). В каждой серии экспериментов из контрольных и опытных проб крови готовили мазки и после соответствующей фиксации и окраски с помощью бинокулярного микроскопа ЛЮМАМ (ув. 15x40) изучали вышеперечисленные цитохимические параметры.

При оценке результатов цитохимического исследования использовали принцип G. Astaldi и L. Verga (1957), основанный на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски. В каждом мазке крови подсчитывали 100 полиморфноядерных лейкоцитов. Результаты представляли в виде процента положительно реагирующих клеток (ПРК) (Золотницкая Р.П., 1987) и среднего цитохимического коэффициента (СЦК) по Kaplow L. (1955). Статистическую обработку результатов проводили на ЭВМ с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Изменение цитохимических показателей нейтрофилов под влиянием гелий-неоирвого лазерного облучения крови in vitro

С целью изучения влияния низкоинтенсивного гелий-неонового лазерного излучения на энзиматический статус, метаболический профиль и состояние бактерицидных систем нейтрофилов были поставлены эксперименты на мышах-самцах линии СВА. Облучение цельной крови мышей светом ГНЛ проводилось в условиях in vitro. Это позволило выявить прямое влияние лазерного излучения на цитохимический статус нейтрофилов, находящихся в естественном плазменно-клеточном окружении.

В результате проведенных исследований было установлено, что лазерное воздействие в течение 15 мин in vitro способствует снижению содержания внутриклеточного гликогена на 13% (р<0,05) при одновременном увеличении процента нейтрофилов, в которых гликоген выявляется цитохимически. Наблюдается заметное уменьшение содержания в лейкоцитах липидов, которые, являясь одним из энергетических субстратов клетки, интенсивно расходуются в процессах биологического окисления: СЦК уменьшается на 36% (р<0,001), ПРК -на 6% (р<0,001). Под влиянием лазерного облучения возрастает интенсивность энергопотребляющих процессов, о чем свидетельствует повышение активности АТФ-азы - СЦК увеличивается на 12% (р<0,02). Параллельно в лейкоцитах отмечается повышение активности СДГ: СЦК и ПРК возрастают на 16% (р<0,001) и 4% (р<0,02) соответственно. Последнее приводит к усилению процессов дегидрирования янтарной кислоты с образованием макроэршческих соединений. Гелий-неоновое лазерное облучение крови мышей in vitro в течение 15 мин вызывает значительные изменения не только метаболических реакций, но и

состояния бактерицидных систем нейтрофилов. Лазерное облучение крови вызывает резкую активацию кислороднезависимых бактерицидных свойств нейтрофилов, о чем можно судить по увеличению количества ЛКБ: СЦК увеличивается в 1,5раза(р<0,001), а ПРК - на 19% (р<0,001). Показателем стимуляции антимикробных свойств лейкоцитов является также повышение активности специфического фермента гранулоцитов - МП, о чем свидетельствует увеличение СЦК на 27% (р<0,001). О возрастании кислородзависимого цитотоксического потенциала лейкоцитов свидетельствует увеличение параметров НСТ-теста: СЦК - на 28% (р<0,01), а также ПРК - на 11% (р<0,01). Таким образом, нейтрофилы периферической крови являются высокореактивными клетками, реагирующими на кратковременное лазерное облучение крови в условиях in vitro активацией метаболизма и бактерицидных систем.

Следующая серия экспериментов с облучением крови светом ГНЛ in vitro была поставлена на крысах (рис.1).

% 160

fm

а -

■ Н .и

га*

1=3

%

Лилиды

ЛКБ

НСТ-ют

□ СЦК (15 мин) □СЦК (30 мин)

□ ПРК (15 мин)

□ ПРК (30 мин)

СДГ МП

Показателя

Примечание: * - р<0,05 относительно контроля 100 % - контроль

Рис. 1. Изменение цитохимических показателей нейтрофилов крови крыс при облучении светом ГНЛ in vitro в течение 15 и 30 минут.

В результате проведенных экспериментов установлено, что 15-минутное облучение крови крыс светом ГНЛ вызывает уменьшение запасов внутриклеточного гликогена, о чем свидетельствует снижение показателей СЦК - на 18% (р<0,05) и ПРК - на 7% (р<0,01). Насыщенность нейтрофилов внутриклеточными липидами также снижается на 11 % (р<0,02) при одновременном уменьшении ПРК. Резко повышается активность СДГ: показатель СЦК в группе с лазерным облучением составляет 141% (р<0,001) от уровня контроля, при этом ПРК увеличивается на 14% (р<0,001). Активность МП и АТФ-азы после 15-минутного облучения крови крыс светом ГНЛ in vitro остается неизменной. Почти в 1,5 раза (р<0,001) повышается содержание в клетке ЛКБ с одновременным увеличением ПРК на 17% (р<0,01). На фоне активации кислороднезависимых механизмов бактерицидности нейтрофила отмечено повышение показателей НСТ-теста: СЦК - на 20% (р<0:0!) н ПРК - ня 6% (п<П 05)

Двукратное увеличение дозы (30-минутное облучение светом ГНЛ крови крыс in vitro) способствует увеличению запасов гликогена и липидов в клетке (рис.1). Содержание внутриклеточного гликогена iiucjie лазерного воздействия увеличивается на 25% (р<0,01) при неизменном ПРК. Содержание липидов в нейтрофилах после лазерного облучения повышается на 27% (р<0,0!) при также неизменном количество реагирующих клеток. Процесс дегидрирования янтарной кислоты в цикле Кребса заметно активируется при 30-минутном лазерном облучении крови крыс: активность СДГ возрастает на 37% (р<0,001). Лазерное воздействие резко повышает активность МП: при неизменном 100-процентном количестве положительно реагирующих клеток значение СЦК увеличивается более, чем в 1,5 раза (р<0,001). Облучение светом ГНЛ крови крыс вызывает резкую активацию кислороднезависимых систем бактерицидности нейтрофилов, о чем свидетельствует увеличение как количества клеток, содержащих гранулы ЛКБ (на 24%, р<0,001), так и насыщенности нейтрофилов гранулами катионных белков (на 40%,р<0,001). После 30-мия облучения крови светом ГНЛ на 9% (р<0,05) снижается число клеток, дающих положительную реакцию на HCT, при неизменном СЦК. Следовательно, при увеличении дозы облучения характер метаболического отклика нейтрофилов заметно изменяется.

Таким образом, облучение крови светом ГНЛ in vitro оказывает влияние па метаболизм, ферментативную и бактерицидную активности нейтрофилов. Характер этих изменений зависит от режима лазерного воздействия и является дозозависимым.

2. Влияние гелий-неонового лазерного излучения на цитохимический профиль нейтрофилов периферической крови при стрессе

Исследования, проведенные на мышах-самцах, показали, что иммобилизационный стресс в течение 15 минут вызывает выраженное увеличение содержания в клетках гликогена: СЦК - на 37% (р<0,001), а ПРК - на 3% (р<0,01) (рис.2). Содержание липидов в нейтрофилах достоверно не изменяется, хотя имеется тенденция к снижению насыщенности клеток этим субстратом. Активность клеточных АТФ-аз снижается на 17%(р<0,01). При 15-минутной иммобилизации отмечается уменьшение процента СДГ-позитивных клеток на 18% (р<0,001) и снижение активности фермента на 28% (р<0,001). Стресс вызывает отчетливое угнетение как кислородзависимого, так и кислороднезависимого антимикробного потенциала нейтрофилов крови. Активность МП при стрессе выявляется во всех ПЯЛ крови мышей, но показатель СЦК при этом снижается на 7% (р<0,01) . Содержание ЛКБ в лейкоцитах при стрессе снижается на 16% (р<0,01). Стресс ингибирует активность мембранных кислородзависимых процсссоп, что выражается в спил-гспии параметров НСХ-тсста: IС -на 30% (р<0,001), а ПРК - на 22% (р<0,00!).

Таким образом,при 15-минутном иммобилизационном стрессе отмечается увеличение содержания в нейтрофилах крови гликогена, угнетение активности АТФ-азы и СДГ, снижение антимикробного потенциала и параметров спонтанного НСТ-теста.

Лазерное облучение на фоне 15-минутного стресса препятствует типичному для стресса повышению содержания гликогена: СЦК снижается на 32% (р<0,001) относительно стрессорного уровня и достигает значения контроля (р>0,2) (рис.2). Облучение вызывает снижение содержания липидов на 29% (р<0,001) относительно контроля. Лазерное воздействие препятствует стресс-индуцированному снижению активности СДГ: СЦК повышается относительно стресса на 30% (р<0,01), ПРК - ка 8% (р<0,01). В меньшей степени, чем при стрессс снижаются миелопероксидазная активность (р<0,05) и интенсивность мембранных кислородзависимых процессов, оцениваемых в НСТ-тесте (СЦК в НСТ-тесте составляет 78% (р<0,01) от уровня контроля против 71% (р<0,001) при стрессе).

Таким образом, транскутанное облучение светом ГНЛ на фоне 15-минутного иммобилизационного стресса способствует перераспределению энергетических субстратов, препятствует характерному для стресса ингибированию активности СДГ и снижает степень угнетения бактерицидного и цитотоксического потенциала ПЯЛ.

I

Еч

ПЫ.

» ^ 1.1

МП

ЛКБ

НСТ-теет

Гликоген Лилиды АТФ-аза СДГ

Показатели

* - р<0,05 относительно контроля.

! О КОНТРОЛЬ □СТРЕСС ПЛАЗЕР \ * . р<0,05 относительно Группы 'Ъргес"

Рис. 2. Влияние транскутанного облучения светом ГНЛ на изменение цитохимических показателей нейтрофилов крови мышей при 15-

ыири/тнли миип^нгтытяттин^М ттрсгр

В следующей серии исследований, проведенной на мышах-самцах, было обнаружено, что при 30-минутном иммобилизационном стрессе в нейтрофилах происходит накопление значительных запасов гликогена - СЦК увеличивается в 1,5 раза по сравнению с контролем (р<0,001) (рис.З). В тоже время насыщенность лейкоцитов липидами уменьшается на 18% (р<0,01). Резко (на 42%, р<0,01) повышается активность клеточных АТФ-аз с одновременным увеличением числа клеток с выявляемой активностью данного фермента (р<0,05). 30-минутный стресс сопровождается подавлением активности СДГ (СЦК - на 20%, р<0,001; ПРК - на 11%, р<0,001). Стрессорное воздействие вызывает угнетение мембранных кислородзависимых процессов в нейтрофилах, о чем свидетельствует снижение параметров спонтанного НСТ-теста: СЦК - на 18% (р<0,02), ПРК - на 13% <р<0,001).

Таким образом, для 30-минутного иммобилизационного стресса характерно преимущественное использование липидов в процессах внутриклеточных превращений, сопровождающееся

активацией энергопотребляющих процессов на фоне угнетения митохондриального окисления и мембранных НАДФН-зависимых систем.

У

и и

* (

I1

а—п

м

г

п.

ТГ1

гт

м 1 п

I I;" "

Гликоген липид;

<0.(1? птп

| П^питрО^ П ТАЗВ? Р^О.05 ст:?с-с.!тет1ы;о :<о~т"о~я

I -и! ■■ п............. .. - 1 4 - р<"0,05 агносг;гел^!-"о группы "стресс"

Рис. 3. Влияние транскутанного облучения светом ГНЛ на изменение цитохимических показателей нейтрофилов крови мышей при 30-минутном иммобилизационном стрессе.

Лазерное облучение на фоне 30-минутной иммобилизации сопровождается повышением содержания гликогена в нейтрофилах, но в значительно меньшей степени, чем при стрессе: СЦК составляет 126% (р<0,001) от уровня контроля против 154% (р<0,001)при стрессе (рис.З). При этом на фоне облучения менее значительно, чем при только стрессе снижается уровень липидов в ПЯЛ - различия с контролем становятся не достоверными (р>0,2). Лазерное воздействие не оказывает существенного влияния на характерные для стресса изменения ферментативной активности нейтрофилов и параметров НСТ-теста. Однако, отмечается снижение бактерицидной активности нейтрофилов, что проявляется в уменьшении показателя СЦК для МП (на 9% относительно контроля, р<0,001) и ЛКБ (на 16% относительно контроля, р<0,001).

Таким образом, транскутанное облучение светом ГНЛ на фоне

30-минутного иммобилизационного стресса оказывает модифицирующее влияние на характерные для стресса данной длительности цитохимические показатели нейтрофилов, препятствуя стресс-индуцированному повышению уровня гликогена и вызывая угнетение показателей бактерицидной активности клетки.

Далее было изучено влияние транскутанного лазерного облучения на цитохимический профиль нейтрофилов крови на этапе запуска стресс-реакции. Показано, что 2-минутный стресс характеризуется изменением большинства изучаемых показателей (рис.4). Так, при стрессе в нейтрофилах отмечается увеличение содержания внутриклеточного гликогена на 13% (р<0,02). Активность АТФ-азы при стрессе повышается на 7% (р<0,02). При этом кратковременный стресс сопровождается угнетением активности СДГ, о чем свидетельствует уменьшение показателя СЦК на 13% (р<0,001). Стрессорное воздействие вызывает угнетение как кислородзависимых, так и кислороднезависимых микробицидных систем нейтрофилов. Так, активность МП снижается на 13% (р<0,001), а содержание в нейтрофилах ЛКБ уменьшается на 17% (р<0,001) с одновременным спияжпвш числа ЛКБ-позитквных клеток на 5% (р<0,001). Стрессорное воздействие способствует значительной активации мембранных кислородзависимых процессов, что проявляется повышением параметров НСТ-теста: СЦК - на 29% (р<0,001), ПРК- на I!% (р<0,01).

Таким образом, для кратковременного комбинированного стресса характерны: накопление в нейтрофилах гликогена, угнетение СДГ-азной активности и бактерицидных систем, повышение АТФ-азной активности и активация мембранных кислородзависимых процессов.

Лазерного воздействие на фоне кратковременного стресса препятствует стресс-индуцированному повышению содержания в нейтрофилах гликогена, о чем свидетельствует уменьшение СЦК на 19% (р<0,01) относительно стресса до значения, сопоставимого с уровнем контроля (р>0,05) (рис.4). Облучение способствует снижению содержания липидов в нейтрофилах на 25% (р<0,001) относительно стресса и на 19% (р<0,01) относительно контроля. Облучение светом ГНЛ предотвращает вызванное стрессом угнетение активности СДГ и МП, что проявляется повышением активности указанных ферментов относительно стресса на 9% (р<0,01) для СДГ и на 13% (р<0,001) для МП до значений, достоверно не отличимых от контроля (р>0,05 и р>0,1 соответственно). Лазерное воздействие вызывает снижение содержания в клетках ЛКБ, но в значительно меньшей степени, чем при стрессе: СЦК уменьшается на 8% (р<0,01) относительно контроля, в то время

как при стрессе на 27% (р<0,001). При облучении отмечается заметное повышение параметров НСТ-теста: СЦК - на 41% (р<0,001), ПРК - на 16% (р<0,001) относительно контроля, что больше уровня, типичного для стресса на 9% (р<0,01) и 5% (р<0,05) соответственно.

Таким образом, транскутанное облучение животных светом ГНЛ на фоне 2-минутного иммобилизационно-звукового стресса предотвращает характерные для стресса повышение содержания гликогена и ингибирование активности СДГ и МП с расходованием липидов, повышением стресс-индуцированного снижения содержания ЛКБ и активацией в большей степени, чем при стрессе, мембранных кислородзависимых процессов.

Гликоген Липиды АТФ-аза СДГ МП Показатели

ЛКБ НСТ-тест

- р<0,05 относительно КОНТРОЛЯ □ КОНТРОЛЬ QCTPECC ОЛАЗЕР + .р<0,05 отаоситеш,но группы "стресс"

Рис. 4. Влияние транскутанного облучения светом ГНЛ на цитохимические показатели нейтрофилов крови крыс при кратковременном иммобилизационно-звуковом стрессе.

Резюмируя полученные данные в целом, можно заключить, что нейтрофилы периферической крови являются высокореактивными клетками, быстро откликающимися на лазерное облучение крови в условиях in vitro, а также на транскутанное облучение в условиях целостного организма. Сам факт реакции нейтрофилов на лазерное облучение цельной крови в условиях in vitro свидетельствует о наличии первичных акцепторов лазерной энергии либо в самих нейтрофилах, либо в других форменных элементах или плазме крови. Полученные нами данные дают основания предполагать, что одним их возможных акцепторов энергии излучения ГШ! в ПЯЛ является фермент НЛДФН-оксидаза, редокс-центром которой является цитохром bsss, содержащий в своей структуре порфириновый элемент, способный поглощать свет с длиной волны 632,8 нм. Действительно, одной из ранних реакций ПЯЛ на облучение является активация мембранных кислород-зависимых процессов с образованием продуктов, вызывающих восстановление кктрсскксго тетразолия, рсгистаруемых ь HCT-recie. Интересным моментом, установленным в работе является возможность модификации метаболизма и функции нейтрофилов не только при непосредственном облучении крови, но также и при транскутанком облучении in vivo, в условиях измененной реактивности организма при развитии стрессорной реакции.При этом облучение животных светом ГНЛ предотвращает развитие ряда индуцированных стрессом изменений ферментативной и бактерицидной активности нейтрофилов. С другой стороны, вызванное лазерным облучением изменение метаболизма клетки на этапе запуска стресс-реакции сопровождается выработкой биологически активных субстанций (активные формы кислорода и свободные радикалы), которые, освобождаясь из клетки в окружающую среду, могут выполнять триггерную роль, способствуя активации нейро-гумсралькых механизмов, участвующих в формировании системного отклика на действие стрессорного фактора, т.е. запуску механизмов общего адаптационного синдрома.

ВЫВОДЫ

1. Нейтрофилы периферической крови являются высокореактивными клетками, быстро откликающимися на воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения. Облучение крови животных светом гелий-неонового лазера в условиях in vitro вызывает изменение содержания энергетических субстратов, энзиматической активности и состояния кислородзависимых и кислороднезависимых бактерицидных систем в полиморфноядерных лейкоцитах.

2. Влияние гелий-неонового лазерного излучения на нейтрофилы носит дозозависимый характер: 15-минутное облучение крови in vitro вызывает стимуляцию метаболизма гликогена и липидов, повышение активности СДГ, увеличение содержания ЛКБ и активацию кислородзависимых процессов в мембранах нейтрофилов; 30-минутное облучение сопровождается увеличением уровня энергетических субстратов и ЛКБ, повышением активности СДР и мислопсроксидя¡эы в нейтрофилах на фоне уменьшения числа НСТ-позитивных клеток.

3. Транскутанное гелий-неоновое лазерное облучение животных на этапе запуска стрессорного ответа (2-минутный стресс) вызывает активацию метаболизма гликогена и липидов в лейкоцитах, препятствует стрсссорному изменению активности АТФ-аз, СДГ и МП, способствует мобилизации стресс-реализующих систем за счет стимуляции образования активных форм кислорода б мембранах нейтрофилов.

4. Транскутанное гелий-неоновое лазерное облучение животных на фоне 15-минутного иммобилизационного стресса оказывает модифицирующее влияние на развитие стрессорных изменений цитохимического профиля нейтрофилов, способствуя перераспределению энергетических субстратов, препятствуя типичному для стресса снижению активности СДГ и уменьшая степень индуцированного стрессом угнетения мембранных кислородзависимых процессов и антимикробного потенциала полиморфноядерных лейкоцитов.

5. Транскутанное гелий-неоновое лазерное облучение животных на фоне 30-минутного иммобилизационного стресса уменьшает степень вызываемых стрессом изменений содержания энергетических субстратов в клетке, однако, вызывает снижение активности МП и уровня ЛКБ в нейтрофилах.

6. Стимуляция кислородзависимых процессов б мембранах нейтрофилов, закономерно выявляемая при кратковременном облучении светом гелий-неонового лазера, является аргументом в пользу гипотезы о фотоакцепторной роли НАДФН-оксидазы.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Цитохимический профиль полиморфноядерных лейкоцитов при облучении крови гелий-неоновым лазером in vitro П Низкоинтенсивные лазеры в эксперименте и клинике /Под ред. Г.Е.Брилля. - Саратов.: Изд-во СГМУ, 1992. - С. 20-23 (Соавт.: Брилль Г.Е., Григорьев С.Н., Романова Т.П.).

2) Влияние иммобилизационного стресса на энзиматический статус ПЯЛ периферической крови П 2-я Всеросс. конф. ВрНОАГЭ "Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования органов, тканей, клеток человека и животных",- Саратов, 1993, ч.2. - С. 71 (Соавт.: Брилль Г.Е., Григорьев С.Н., Романова Т.П.).

3) Влияние транскутанного лазерного облучения на метаболизм нейтрофилов периферической крови при стрессе// Всеросс. симпозиум "Лазерная и магнитная терапия в экспериментальных и клинических исследованиях". - Обнинск, 1993. - Ч. 1. - С. 14-15 (Соавт.: Брилль Г.Е., Григорьев С.Н., Романова Т.П.).

4) Изменение метаболизма нейтрофилов на ранних этапах запуска стрессоряой реакции // "Физиология и патология перекисного окисления липидов. гемостаза и иммуногенеза". - Полтава, 1993. - С. 18 (Соавт.: Брилль Г.Е., Григорьев С.Н., Романова Т.П.).

5) Особенности изменений метаболизма нейтрофилов под влиянием лазерного облучения при стрессе // Междунар. конф. "Новые достижения лазерной медицины". - Москва- С.Петербург, 1993. - С. 252253 (Соавт.: Брилль Г.Е., Григорьев С.Н., Романова Т.П.).

6) Участис форменных злс?«снто5 крови в формирований системного отклика на действие НИЛИ //Матер. Третьей Междунар. конф. "Актуальные вопросы лазерной медицины и операционной эндоскопии". - Москва-Видное, 1994. - С. 416-417 (Соавт.: Брилль Г.Е., Григорьев С.Н., Романова Т.П., Прошина О.В., Жигалина В.Н., Филимоновская Л.С., Золотарева Т.М.).

7) Исследование влияния гелий-неонового лазерного излучения на цитохимический профиль лейкоцитов цельной крови in vitro // 56-я науч. конф. молодых ученых и студентов СГМУ. - Саратов, 1995. - С.156-157 (Соавт.: Ашанина Г.А.).

8) Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на метаболизм нейтрофилов при стрессе // Известия АН. Серия физическая. - 1995. - Т. 59, № 6. - С. 175-178 (Соавт.: Брилль Г.Е., Григорьев С.Н., Романова Т.П.).

9) Сравнительный анализ метаболических показателей

нейтрофилов в динамике стресса //1 Съезд Междунар. союза ассоциаций патологоанатомов. - Москва, 1995, - С. 137 (Соавт.: Романова Т.П., Брилль Г.Е., Григорьев С.Н.).

10) Изменение цитохимических показателей нейтрофилов при стрессепод влиянием гелий-неонового лазерного облучения // Первый Российский Конгресс по патофизиологии "Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы (экспериментальные и клинические аспекты)". - Москва, 1996. - С. 216 (Соавт.: Романова Т.П., Брилль Г.Е.)

11) Лазерная модификация стрессорного ответа //IX Междунар. научно- практическая конф. "Применение лазеров в медицине и биологии". - Ялта-Харьков, 1997. - С. 10-12 (Соавт.: Брилль Г.Е., Романова Т.П., Прошина О.В.).

12) Effect of transcutaneous laser irradiation on neutrophils rvtnrhMnirni г*я?*яго1М'рг£ in immobilization stress // International Congress "Laser in Medicine and Surgery". - Munchen, 1993. - Vol.9, №.2. - P. 144 (Co-authors: Brill G.E., Grigoriev S.N., Romanova T.P.).

13) Effect of laser irradiation on neutrophils metabolism in stress / / Medical Applications of Lasers /Proc. SPIE. - 1993. - Vol. 2086. - P. 312318 (Co-authors: Brill G.E., Grigoriev S.N., Romanova T.P.).

14) Effect of iaser irradiation on neutrophils metabolism in stress / /International Symposium on Biomedical Optics Europc'93,- Budapest, Hungary, 1993. - P. 79 (Co-authors: Brill G.E., Grigoriev S.N., Romanova T.P.).

15) The reaction of blood formed elements on transcutaneous laser irradiation in short- term stress // Proc. SPIE. CBO'93 International Workshop "Cell and Biotissue Optics: Applications in Laser Diagnostics and Therapy". - Moscow-Nizhny Novgorod, 1994. - Vol. 2100. - P. 292-301 (Co-authors: Brill G.E., Filimonovskaya L.S., Grigoriev S.N., Proshina O.V., Romanova T.P., Zhigalina V.N., Zolotaijova T.M.).

16) Effect of transcutaneous lazer irradiation on polymorphonuclear leucocytes in stress // International Kongress "Laser in Medicine and Surgery". - Munchen, 1995. - Vol. 11, № 2. - P. 106 (Co-authors: Brill G.E., Romanova T.P., Grigoriev S.N.).

17) Formation of secondary messengers by blood formed elements in low power laser irradiation // Proc. SPIE. "Progress in Biomedical Optics. Laser - Tissue Interaction VI". - 1995. - Vol. 2391. - P.601-608 (Co-authors: Brill G.E., Proshina O.V., Zhigalina V.N., Filimonovskaya L.S., Romanova T.P., Zolotaijova T.M.).