Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Активаторы плазминогена урокиназного (uPA) и тканевого (tPA) типов и их ингибитор (PAl-1) в опухолях и при гиперпластических процессах щитовидной железы

На правах рукописи

ХАРИТИДИ Татьяна Юрьевна

АКТИВАТОРЫ ПЛАЗМИНОГЕНА УРОКИНАЗНОГО (иРА) И ТКАНЕВОГО (1РА) ТИПОВ И ИХ ИНГИБИТОР (РАМ) В ОПУХОЛЯХ И ПРИ ГИПЕРПЛАСТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

(14.00.14 - онкология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2002

Работа выполнена в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (директор - член-корреспондент РАМН, профессор М.И.Давыдов)

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, профессор Н.Е.Кушлинский доктор медицинских наук, профессор И.А.Казанцева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л.Б.Горбачева доктор медицинских наук, профессор А.Н.Махсон

Ведущее учреждение: Российский научный центр рентгенорадиологии Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «Я/ » А/¿2 ~Р 2002 г. в «__» часов на

заседании диссертационного совета (К.001.017.01,) Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе. 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российское онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН

Автореферат разослан _» 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Ю.А. Барсуков

/>СЪЗ. 4SZ -з О

</г#. Z6 - ъ о

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Согласно современным данным литературы частота случайно выявленного рака щитовидной железы (РЩЖ) при лечении эутиреоидного узлового зоба составляет 0,4-27,0%, а при диффузном токсическом зобе - 0,5-21,5% (А.Л.Акинечев и соавт., 1998). Примерно в 50% случаев у больных РЩЖ устанавливается ошибочный диагноз. При этом почти у 60% больных выявляется РЩЖ в III или IV стадиях заболевания (И.С.Агеев, 1992). В связи с этим большое внимание уделяется: разработке новых методов обследования пациентов с целью своевременной диагностики РЩЖ; широкому использованию молекулярных маркеров в оценке биологического поведения узловых новообразований в щитовидной железе, особенно, в случаях высокого риска их малигнизации; изучению процессов инвазии и метастазирования. Последнее связано с тем, что основными проявлениями профессии опухолевого процесса считается способность раковых клеток проникать в прилежащие ткани, повреждая их, а также перемещаться с током крови или лимфы в отдаленные органы и ткани, давать начало новым очагам опухолевого роста (Murray P. et al., 1988).

Особое место в этой проблеме занимает система активации плазминогена -многокомпонентный каскад протеолитических реакций, участвующий в разрушении базальной мембраны и внеклеточного матрикса, окружающих опухоль, что способствует образованию регионарных и отдаленных метастазов (Ellis V. et al., 1991; Graeff Н. et al., 1992). Центральную роль в этих процессах играют сериновые протеазы - активаторы плазминогена урокиназного (иРА) и тканевого (tPA) типов (Andreasen P.A. et al., 1990). Стало известно, что иРА участвует в процессах деградации межклеточного вещества соединительной ткани, a tPA участвует в тромбофибринолизе (Mignatti P. et al., 1993; Pollanen J. et al., 1987). При этом, активность uPA может подавляться двумя специфическими ингибиторами РАМ и PAI-2 (Andreasen P.A. et al., 1990; Ginsburg D. et al., 1986; Kruithof E.K.O. et al., 1986). По данным некоторых авторов роль ингибиторов, в частности, РАМ (Eaton D.L. et al., 1984), может

сводиться не только к подавлению метастазирования и инвазии (через торможение активации плазминогена и всего следующего протеолитического каскада), но и к распространению опухолевого процесса (защита опухолевых клеток от протеолиза) (ИеШу Б. е1 а1., 1992; Е.С.Герштейн и соавт., 1999). Поэтому высокий уровень ингибитора РАМ может служить неблагоприятным прогностическим фактором, а высокие концентрации иРА в некоторых опухолях считают неблагоприятным признаком общей и безрецидивной выживаемости. Высокие значения 1РА, наоборот, коррелируют с лучшей общей и безрецидивной выживаемостью, о чем свидетельствуют ряд работ, доказывающих прогностическое значение активаторов и ингибиторов активаторов плазминогена в опухолях различных локализаций (РоекепБ ^А. еХ а1., 1992, 1996).

Несмотря на то, что активаторы и ингибиторы активаторов плазминогена являются объектом многих исследований, в литературе представлены единичные работы относительно их роли при раке и гиперпластических процессах щитовидной железы.

Цепь настоящего исследования - сравнительная оценка показателей активности активаторов плазминогена урокиназного (иРА) и тканевого ^РА) типов и их ингибитора (РА1-1) при раке, аденоме и гиперпластических процессах щитовидной железы с учетом основных морфологических характеристик заболевания.

Задачи исследования

1. Провести сравнительное изучение содержания активаторов плазминогена урокиназного (иРА) и тканевого ((РА) типов, а также ингибитора активаторов плазминогена 1 типа (РАМ) в цитозолях злокачественных опухолей, доброкачественных новообразований и при гиперпластических процессах щитовидной железы.

2. Сопоставить уровни 1РА, иРА и РАМ в злокачественных опухолях; доброкачественных новообразованиях и гиперпластических процессах

щитовидной железы с учетом основных морфологических и клинических особенностей заболевания.

3. Оценить взаимосвязь показателей 1РА, иРА и РА1-1 в опухоли у больных различными морфологическими вариантами рака щитовидной железы.

Научная новизна. Впервые в отечественной литературе проведено сравнительное определение содержания активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типов (иРА, 1РА) и их ингибитора типа 1 (РА1-1) в цитозольной фракции злокачественных опухолей, доброкачественных новообразований и гиперпластических процессов щитовидной железы.

На основании лабораторных и клинических исследований выявлена взаимосвязь между экспрессией активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типов (иРА и 1РА) и их ингибитора 1 типа (РАМ) в цитозольной фракции злокачественных опухолей щитовидной железы.

Показано, что в аденомах и при гиперпластических заболеваниях щитовидной железы экспрессируется меньше иРА и РАМ и больше (РА, по сравнению со злокачественными опухолями.

Выявлено повышение уровня РАМ при медуллярном раке щитовидной железы в отличие от других гистологических вариантов рака.

Установлена взаимосвязь содержания иРА в злокачественных опухолях щитовидной железы со стадией заболевания и вовлеченностью регионарных лимфатических узлов.

Практическая значимость исследования. Работа представляет не только теоретический интерес для анализа роли активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типов (иРА и 1РА) и их ингибитора типа 1 (РАМ) в процессах инвазии и метастазирования злокачественных опухолей щитовидной железы, но имеет значение для оценки степени риска малнпшзации узловых образований и гиперпластическнх процессов в этом органе.

Кроме того, представленные данные исследования открывают перспективу создания новых лекарственных средств, влияющих на экспрессию иРА, 1РА н

PAI-1 в опухолях, с целью ингибирования процессов инвазии и метастазирования при раке щитовидной железы.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы эндокринологии» (16-18 мая 2000 г., Пермь); IV Российской онкологической конференции (21-23 ноября 2000 г., Москва); научно-практической конференции «Современные подходы к диагностике и лечению злокачественных новообразований» (7 декабря 2000 г., Москва); первой Московской городской научно-практической молодежной конференции «Медицина на пороге XXI века. Актуальные проблемы и вопросы» (22 февраля 2001 г., Москва); VIII Российском национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (2-6 апреля 2001 г., Москва); II Российской конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (24-28 апреля 2001 г., Москва).

Материалы диссертации доложены на совместной научной конференции сотрудников лаборатории клинической биохимии, хирургических отделений диагностики опухолей, опухолей головы и шеи, верхних дыхательно-пищеварительных путей, отдела патологической анатомии опухолей человека, отделения изучения новых противоопухолевых лекарств НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, 20 декабря 2001 г.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, собственные данные исследования и их обсуждение, заключение, выводы и список цитируемой литературы (105 наименований). Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы и 14 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая характеристика обследованных больных

В основу исследования положено изучение содержания активаторов плазминогена (uPA, tPA) и их ингибитора (PAI-1) в ткани щитовидной железы у больных раком, доброкачественными новообразованиями и

гиперпластическими процессами этого органа. Обследовано 146 больных с различными заболеваниями щитовидной железы: 129 женщин и 17 мужчин (88,4 и 11,6% соответственно). Из 129 больных женщин 63 (48,8%) пациентки были в постменапаузальном периоде, 66 (51,2%) - в репродуктивном возрасте. Больные находились на обследовании и лечении в хирургических отделениях опухолей головы и шеи, верхних дыхательно-пищеварительных путей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, в отделении хирургической эндокринологии МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского и отделении хирургической эндокринологии ГКБ № 33 г. Москвы за период январь 1998 г. - ноябрь 2001 г.

Клинический диагноз у всех больных подтвержден данными морфологического исследования удаленного препарата в соответствии с гистологической классификацией опухолей щитовидной железы ВОЗ (Женева, 1989). РЩЖ выявлен у 44 пациентов в возрасте 20-73 года; аденома щитовидной железы (АЩЖ, 18 больных, возраст 26-68 лет); узловой коллоидный зоб с признаками аденоматоза (УКЗ с признаками аденоматоза, 19 больных, возраст 17-72 года); УКЗ без признаков аденоматоза (43 больных, возраст 15-72 года); диффузный токсический зоб с признаками аденоматоза (ДТЗ с признаками аденоматоза, 9 больных, возраст 30-65 лет); ДТЗ без признаков аденоматоза (13 больных, возраст 17-57 лет). К аденоматозным пролифератам относили небольшие (средний диаметр 2-3 мм) очаги пролиферации тиреоидного эпителия, выявляемые на фоне УЗК и ДТЗ. Которые визуально отличались от окружающей ткани железы и обычно имели солидное или микрофолликулярное строение. Отнести данные образования к аденомам не позволяло отсутствие капсулы (И.А.Казанцева и соавт., 2001). Больные РЩЖ в зависимости от гистологического строения опухоли были разделены на 3 подгруппы: 1 - 27 больных папиллярным РЩЖ в возрасте 25-73 года; 2 - 13 больных фолликулярным РЩЖ в возрасте 20-73 года; 3-4 больных медуллярным РЩЖ в возрасте 37-69 лет. Высокодифференцировапные РЩЖ выявлены в 29 (66,0%) наблюдениях; умеренно дифференцированные - в 14 (31,8%) и низкодифференцированные - в 1 (2,2%). По типу роста злокачественные

опухоли распределялись следующим образом: 22 (50%) - солитарные и 22 (50%) - многофокусные. Размеры опухолей варьировали от 1,2 до 10,0 см. В зависимости от размера опухоли, нами выделено три группы: 1 - размер опухоли <2,5 см (17 удаленных опухолей); 2 - размер опухоли < 5,0см (21 опухоль). 3 -размер опухоли > 5,0 см (6 опухолей).

Распределение больных РЩЖ с учетом стадии заболевания: в I стадии (TiN0M0; T2N0Mo до 45 лет) было 8 больных; во II стадии (T2N0M0 более 45 лет; T3N0M0) - 18; в III стадии (T4N0M0; Т любое N|M0) - 15; в IV стадии (Т любое, N любое, М|, низкодифференцированный рак) - 3 больных (Международная классификация злокачественных опухолей; 5 издание, 1998 г., Санкт-Петербург).

Больным выполнены следующие виды хирургических вмешательств: тиреоидэктомия - 47 (32%); субтотальная резекция щитовидной железы - 56 (38%); гемитиреоидэктомия с фасциально-футлярным иссечением клетчатки шеи - 33 (23%); гемитиреоидэктомия с резекцией перешейка - 10 (7%).

Биохимические методы исследования

Получение и обработка тканей. Кусочки ткани массой 300-500 мг непосредственно после операции доставляли на льду в лабораторию и сразу же подвергали гомогенизации. Перед гомогенизацией ткань тщательно очищали от участков некроза и жира, взвешивали, а затем измельчали ножницами и растирали в жидком азоте. Полученный порошок переносили в центрифужные пробирки, помещенные в ледяную баню, и добавляли TED-буфер (10 мМ трис-НС1, 1,5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ дитиотрейтол; рН 7,4), содержащий 10% глицерина (по объему), из расчета 1,0 мл буфера на 100 мг ткани. Тщательно перемешивали гомогенат и центрифугировали 30 мин при 105.000xg и 4°С (центрифуга Optima ТМ TLC, Beckman, США). Удалив при необходимости липидный слой, надосадочную жидкость (цитозоль) использовали для определения концентрации белка, а аликвоты по 0,5 мл замораживали в полиэтиленовых пробирках и хранили при -70° С до определения концентрации компонентов системы активации плазминогена (не более 1 месяца).

Иммуноферментное определение (ELISA) содержания uPA, PAI-1 1 tPA в цитозольной фракции ткани. Проводили с использованием «боров реактивов, разработанных в лаборатории проф. T.Benraad'a (Ниймеген, 1идсрланды; Grebenschikov V. et al., 1997). При окончательных расчетах /читывали десятикратное разведение цитозолей и выражали концентрации шализируемых белков в нг/мг цитозольного белка. Определение концентрации збщего белка в пробах цитозоля проводили по методу Лоури.

Статистический анализ полученных данных. Использовали как мраметрические, так и непараметрические критерии. Для определения 1араметрической или непараметрической выборки применяли критерии <Солмагорова-Смирнова, Лиллифурша, Шапиро-Вилкса. В случае нормально ^определенных данных достоверность отличия средних определяли с помощью методов дисперсионного анализа: F-критерий, критерий Стыодента. корреляции вычисляли по методу Пирсона. При неподчинении данных сритериям гауссовского распределения использовали непараметрические сритерии, а именно: тесты Крускал-Уоллнса и Уилкоксона, критерий Даннета и фитерий ранговой корреляции Спирмена. Кроме корреляционного проводили регрессионный анализа данных. Во всех случаях различия считали 1остоверными при уровне вероятности больше 95% (р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнение концентраций uPA, tPA и PAI-1 в зависимости от слинико-морфологических особенностей УКЗ с признаками зденоматоза. Обследовано 19 больных УКЗ с аденоматозом (табл.1). В данной группе выявлена корреляционная зависимость между концентрациями lPA и PAI-1 (г=0,49; р=0,03). Уровни uPA, tPA и РАМ не зависели от возраста зольных, длительности заболевания, особенностей гистологического строения, менструальной функции. Достоверные отличия обнаружены только для PAI-1 лежу группами больных с различным размером УКЗ с аденоматозом.

Таблица 1.

Сравнение концентраций иРА, 1РА н РА1-1 в зависимости от клннико-морфологнческнх особенностей УКЗ с признаками аденоматоза

Клипико-морфологнческие Число иРА 1РА РАМ 1

показатели больных [нг/мг белка) ;иг/мг белка) нг/мг белка)

УКЗ с адсноматозом 19 0,2610,07* 3,36±0,8 0,6410,17*

(0,00-1,42) (0,00-1,42) (0,00-2,66)

1. Менструальная функция:

а) сохранена 10 0,33±0,13 2,6±0,58 0,54±0,20

(0,06-1,42) (0,16-5,34) (0,13-2,28)

б) постменопауза 8 0,15+0,07 4,0211,76 0,67±0,31

(0,00-0,63) (0,00-15,34) (0,00-2,66)

2. Длительность заболевания:

а) от 0 до 1 лет 8 0,21±0,08 2,8610,86 0,8310,31

(0,00-0,63) (0,00-5,78) (0,00-2,66)

б) от 1 до 5 лет б 0,38±0,21 5,33±2,06 0,6110,34

(0,12-1,42) (1,86-15,34) (0,13-2,28)

в) более 5 лет 5 0,2010,08 1,78±0,77 0,3610,12

(0,00-0,45) (0,31-4,57) (0,00-0,67)

3. Размер пораженной ткяни:

а) <2,5 см 9 0,27+0,14 4,40±1,54 0,9210,33

(0,00-1,42) (0,00-15,35) (0,00-2,66)

б) < 5,0 см 8 0,30+0,06 2,81±0,62 0,4610,05"

2 (0,06-0,63) (0,16-4,86) (0,2-0,7)

в) > 5,0 см 0,0510,05 0,8310,52 0,0910,09"

(0,00-0,10) (0,31-1,36) (0,00-0,19)

4. Тип роста УКЗ:

а) солнтарпын 9 0,32±0,15 3,02±0,73 0,7910,33

(0,00-1,42) (0,00-5,78) (0,00-2,66)

б) многофокусным 10 0,20±0,04 3,66±1,40 0,5110,14

(0,00-0,45) (0,31-15,35) (0,00-1,4)

Примечание: * - корреляция (г=0,49; р=0,03) между уровнями иРА и РАМ; ♦♦-для РАМ р(б-в) <0,01.

Сравнение концентраций иРА, 1РА и РА1-1 в зависимости от клинико-морфологических характеристик УКЗ без аденоматоза.

Данная группа сравнения состояла из 43 больных. Концентрация иРА варьировала от 0 до 1,36 нг/мг белка (в среднем 0,26±0,04, медиана - 0,17 нг/мг белка), 1РА в количестве от 0 до 11,18 нг/мг белка (в среднем 2,33±0,34, медиана - 1,97 нг/мг белка) и РА1-1 в количестве от 0 до 4,61 нг/мг белка (в среднем 0,74±0,15, медиана - 0,31 нг/мг белка) во всех образцах. В этой группе больных выявлена высокая корреляционная зависимость концентраций иРА и РАМ с

большой степенью достоверности (г=0,65; р=0,0001) (рис.1). Сравнение показателей uPA, tPA и PAI-1 с учетом клинико-морфологических показателей выявило, что содержание uPA, tPA и PAI-1 не зависело от возраста больных, длительности заболевания, а также типа роста УКЗ (во всех группах сравнения р>0,05; табл.2). Концентрация PAI-1 была достоверно ниже у больных в репродуктивном возрасте (р<0,05; табл.2). Также достоверные отличия выявлены в уровне tPA межу группами больных с различным размером УКЗ без признаков аденоматоза (р<0,03). По данным литературы повышение концентрации tPA считается благоприятным прогностическим признаком при некоторых видах новообразований (Е.С.Герштейн и соавт., 1999; Ruppert С. et al., 1997; Но С.Н. et al., 1999).

UfA vs. PAt(Ca«>ral*« MD d«t»tlor>) PAI - .19408 * 2.141 1 - UPA Cefi«l*tlon- г- .0 1611

0.2 О.«» О.© 0.8 UPA

Рис.1. Линейное уравнение регрессии, с 95% доверительной границей между концентрацией иРА и РА1-1 в группе больных УКЗ без признаков аденоматоза.

0.7

о.О о.в

о.э 0.2 0,1 о.о

UPA V», PAI(C*f*w)«e MD ¿«leilon) PAI - -.ОЭЭ2 ♦ 2,1522 " UPA С err* I «tien: i — ,воэ4в

O.OO О.Ю 0.1A UPA

Рис.2. Линейное уравнение регрессии, с 95% доверительной границей между концентрацией иРА и РАМ в группе больных диффузным токсическим зобом с признаками аденоматоза.

Таблица 2.

Сравнение концентраций иРА, 1РА и РАН п зависимости от клинико-морфологических особенностей УКЗ без признаков аденоматоза_

Показатели Число иРА 1РА РАМ

больных (нг/мг белка) (нг/мг белка) нг/мг белка)

УКЗ без признаков аденоматоза 43 0,26±0,04* 2,33+0,34 0,7410,15*

(0,00-1,36) (0,00-11,18) (0,00-4,61)

1. Менструальная функция:

а)сохранена 18 0,21 ±0,071 2,2110,55 0,9910,27**

(0,06-1,36) (0,15-11,18) (0,06-1,58)

б) постменопауза 20 0,30±0,06 4,0211,76 0,6710,31**

(0,00-0,92) (0,00-15,34) (0,07-4,61)

2. Длительность заболевания:

а) от 0 до 1 лет 23 0,22±0,05 2,5710,45 0,7910,23

(0,00-0,92) (0,77-11,18) (0,07-4,61)

б) от 1 до 5 лет 10 0,22±0,05 1,4310,39 0,4110,10

10 (0,06-0,56) (0,00-3,54) (0,13-1,05)

в) более 5 лет 0,39±0,14 2,6810,96 0,9710,33

(0,07-1,36) (0,23-9,38) (0,00-2,58)

3. Размер новообразования:

а) <2,5 см 15 0,25±0,09 2,0610,36 0,6210,17

(0,00-1,36) (0,00-5,01) (0,12-2,46)

б) <5,0 см 20 0,2510,05 1,83+0,23*** 0,7510,25

8 (0,00-0,92) (0,15-4,21) (0,07-4,61)

в) > 5,0 см 0,32+0,10 4,1011,54*** 0,9810,4

(0,07-0,86) (0,23-11,18) (0,00-2,58)

4. Тип роста УКЗ:

а) солитарный 19 0,24±0,06 2,6610,52 0,6510,24

(0,00-0,92) (0,77-11,18) (0,07-4,61)

б) многофокуснын 24 0,28+0,06 2,0810,46 0,8110,19

(0,00-1,36) (0,00-9,38) (0,00-2,90)

Примечание: * - корреляция (г=0,65; р=0,0001) между уровнями иРА и РАМ; ** - для РАМ р(а-б) < 0,05; *** - 1РА для р(б-в) < 0,03.

Сравнение концентраций иРА, 1РА и РАИ в зависимости от клинико-морфологических особенностей ДТЗ с аденоматозом.

Группу больных ДТЗ с признаками аденоматоза составили 9 больных. Концентрации иРА варьировали от 0 до 0,24 нг/мг белка (в среднем 0,13±0,03, медиана - 0,11 нг/мг белка), 1РА - от 1,46 до 4,03 нг/мг белка (в среднем 2,75+0,27, медиана - 2,70 нг/мг белка) и РА1-1 - от 0 до 0,63 нг/мг белка (в среднем 0,24±0,07, медиана - 0,31 нг/мг белка). В этой группе больных обнаружена высокая корреляционная зависимость между концентрациями иРА и РАН (г=0,80, р=0,009) (рис.2). Сравнение концентраций иРА, 1РА и РАМ с

учетом клинико-морфологических показателей выявило, что содержание иРА, 1РА и РА1-1 не зависело от возраста, длительности заболевания, размера измененной ткани, а также менструальной функции больных (во всех группах сравнения р>0,05).

Сравнение концентраций иРА, 1РА и РАМ в зависимости от клинико-морфологических особенностей ДТЗ без аденоматоза. В

группу с ДТЗ без признаков аденоматоза вошли 13 больных, концентрации иРА варьировали от 0 до 0,46 нг/мг белка (в среднем 0,15±0,03, медиана - 0,12 нг/мг белка), 1РА - от 0,01 до 9,30 нг/мг белка (в среднем 3,01 ±0,68, медиана - 2,52 нг/мг белка) и РА1-1 - от 0,01 до 1,55 нг/мг белка (в среднем 0,44+0,12, медиана - 0,24 нг/мг белка), соответственно. В этой группе больных ДТЗ без признаков аденоматоза выявили корреляционную зависимость между концентрациями иРА и 1РА (г=0,57; р=0,04).

Сравнение концентраций иРА, (РА н РА1-1 с учетом клинико-морфологических показателей обнаружило, что содержание иРА, 1РА и РА1-1 не зависело от возраста, длительности заболевания, размера пораженной ткани, а также менструальной функции (во всех группах сравнения р>0,05).

Сравнение концентраций иРА, ¡РА и РАМ с учетом клинико-морфологических особенностей АЩЖ. При исследовании цитозолей из 18 АЩЖ обнаружили следующее: иРА выявлен в 17 опухолях (94%) в количестве от 0,004 до 0,26 нг/мг белка (в среднем 0,14±0,02, медиана - 0,13 нг/мг белка); 1РА обнаружен в количестве от 0,58 до 4,34 нг/мг белка (в среднем 2,09±0,27, медиана - 1,79 нг/мг белка) и РАМ - в концентрации от 0,08 до 2,20 нг/мг белка (в среднем 0,60+0,12, медиана - 0,49 нг/мг белка) во всех образцах. Достоверной корреляции между уровнями иРА, 1РА, РАМ в АЩЖ не наблюдали. Кроме того, содержание иРА, 1РА и РАМ не зависело от возраста больных, длительности заболевания, размера аденомы, а также типа ее роста (во всех группах сравнения р>0,05; табл.3).

Таблица 3.

Сравнение концентраций иРА, (РА н РА1-1 в зависимости

от клнннко-морфологнчсскнх особенностей АЩЖ_

Клшшко-морфологнчсскне показатели Число больных иРА (нг/мг белка) 1РА (нг/мг белка) РАМ (пг/мг белка)

АЩЖ 18 0,14±0,02 (0,00-0,26) 2,08±0,27 (0,58-4,34) 0,6010,12 (0,08-2,20)

1. Менструальная функция: а) сохранена б) постменопауза 10 6 0,13+0,02 (0,005-0,26) 0,15+0,03 (0,11-0,23) 2,20±0,25 (1,22-3,71) 1,97±0,26 (0,66-4,34) 0,4310,11* (0,14-0,99) 0,9510,09* (0,08-0,99)

2. Длительность заболевания: а) от 0 до 2 лет б) от 2 до 5 лет в) более 5 лет 8 8 2 0,16±0,02 (0,12-0,23) 0,13+0,03 (0,005-0,26) 0,15+0,08 (0,06-0,23) 2,18±0,43 (0,76-4,34) 2,30+0,37 (0,66-3,71) 0,90±0,32 (0,58-1,22) 0,7410,23 (0,16-0,20) 0,5210,13 (0,08-1,09) 0,3410,01 (0,33-0,35)

3. Размер АЩЖ: а) <2,5 см б) <5,0 см в) > 5,0 см 5 9 4 0,15+0,04 (0,005-0,26) 0,13±0,03 (0,04-0,25) 0,17+0,03 (0,12-0,23) 2,25+0,54 (0,76-3,71) 1,66+0,23 (0,66-3,20) 2,85±0,80 (0,58-4,34) 0,4810,12 (0,08-0,85) 0,6510,21 (2,20-0,63) 0,6510,23 (0,16-1,09)

4. Тип роста АЩЖ: а) солнтарнын б) шногофокуснын 13 5 0,15+0,02 (0,005-0,26) 0,13±0,04 (0,04-0,23) 2,14+0,34 (0,58-4,34) 1,95+0,38 (1,22-3,42) 0,6210,16 (0,08-2,20) 0,5510,15 (0,24-1,09)

Примечание: * -для РАМ р(1-2) < 0,005.

Достоверными оказались только различия в показателях РА1-1 между группами больных в постменопаузе и с сохраненной менструальной функцией. Концентрация РА1-1 была достоверно ниже у больных в репродуктивном возрасте (р<0,05; табл.3).

Сравнение концентраций иРА, 1РА и РАМ с учетом клинико-морфологических особенностей РЩЖ. При анализе цитозолей 44 опухолей больных РЩЖ, обнаружили: иРА в количестве от 0,003 до 4,30 нг/мг

белка (в среднем 0,78±0,1 5, медиана - 0,34, нг/мг белка) в опухолях 43 больных (98%); 1РА - в количестве от 0,06 до 5,98 нг/мг белка (в среднем 1,52±0,23, медиана - 1,52, нг/мг белка) и РАМ в количестве от 0,05 до 7,61 нг/мг белка (в среднем 1,15+0,21, медиана - 0,74, нг/мг белка) во всех образцах (табл.4).

Таблица 4.

Содержание uPA, tPA и PAI-1 в зависимости клшшко-морфологическнх показателей у больных РЩЖ

Возраст (годы) Число больных иРЛ (нг/мг белка) IPA (нг/мг белка) РЛМ (нг/мг белка)

20-40 11 0.55 ± 0.24 (0.0-2,18) 0,89 ± 0,23 (0,06-2,82) 1,28 ±0,48 (0,05-4,99)

41-55 12 0,83±0,18 (0,03-4,30) 1,78±0,44 (0,14-5,98) 1,16+0,26 (0,16-7,61)

56-73 21 0,87 ±0,27 (0,11-1,88) 1,7 ±0,39 (0,19-4,77) 1,08 ±0,34 (0,04-2,98)

Длительность заболевания

От 0 до 1 года 16 0,81 +0,26 (0,02-3,75) 1,40 ±0,36 (0,06-5,32) 1,28 ±0,47 (0,05-7,61)

От 1 до 2 лет 8 0,87 ±0.35 (0,03-2,18) 1,87 ±0,64 (0,35-5,98) 1,44 ±0,59 (0,16-4,99)

От 2 до 5 лет 11 0.39 + 0.14 (0.09-1.68) 1,47 ±0,41 (0,27-4,77) 1,07 ±0,25 (0,17-3,10)

Более 5 лет 9 1,13 + 0,45 (0,12-4,31) 1,48 ±0,61 (0,24-5,11) 0,78 + 0,14 (0,3-1,36)

Состояние менструальной функции

Репродуктивный возраст 18 0,59+0,15 (0,03-4,30) 0,97±0,16* (0,24-5,97) 1,02+0,23 (0,16-1,61)

Постменопауза 21 0,89+0,27 (0,08-2,18) 2,03±0,40** (0,19-2,82) 1,16+0,35 (0,04-3,10)

Примечание: P*vs** < 0,05.

Выявлена достоверная положительная корреляция (г=0,41; р=0,005) между уровнями uPA и tPA в РЩЖ. Исследование системы активации плазминогена в опухолях щитовидной железы, в зависимости от клинико-морфологических показателей обнаружило, что содержание uPA, tPA и PAI-1 не зависело от возраста и длительности заболевания (во всех группах сравнения р>0,05) (табл.4). Данный факт подтверждается исследованиями при других новообразованиях (Kinder D.H. et al., 1993; Duffy M.J. et al., 1988).

Таблица 5.

Концентрации иРА, 1РА и РА1-1 в цитозолях больных РЩЖ с учетом стадии заболевания н отдельных показателей системы TNM_

Клшшко- Показатели

морфологические Число иРА 1РА РАМ

параметры больных (нг/мг белка) (нг/мг белка) (нг/мг белка)

Рак щитовидной 44 0,7810,15* 1,52±0,23* 1,15+0,21

железы (0,02-4,3) (0,06-0,12) (0,05-7,6)

1. По стадиям:

I 8 0,18+0,16** 0,61 ±0,05** 0,7210,33

(0,02-0,43) (0,06-1,12) (0,05-2,97)

II 18 0,49+0,11** 1,6510,32** 0,7310,17**

15 (0,03-1,68) (0,24-5,98) (0,05-3,07)

III 1,14±0,3** 1,48±0,43 1,91±0,51**

3 (0,03-3,75) (0,14-5,32) (0,41-7,.61)

IV 2,37±0,99** 3,3911,28** 1,0±0,21

(1,04-4,31) (0,88-5,11) (0,73-1,41)

2. По размеру опухоли

а) <2,5 см 0,56±0,14*** 1,3510,27 0,7910,17

17 (0,09-1,68) (0,22-4,19) (0,17-2,97)

б) <5,0 см 0,71+0,21 1,25+0,28*** 1,28±0,37

21 (0,02-3,75) (0„06-5,32) (0,05-7,61)

в) > 5,0 см 1,64±0,66*** 2,94±1,07*** 1,7510,67

6 (0,25-4,31) (0,14-5,98) (0,73-4,99)

3. Вовлеченность

регионарных

лимфоузлов: »»»»

a)N0 33 0,61+0,14 1,68+0,27 0,93+0,14

(0,03-3,75) (0,22-5,98) (0,05-3,10)

б) N,.2 И 1,29±0,4 1,04±0,43 1,8410,72

(0,02-4,31) (0,06-5,11) (0,05-7,61)

Примечание: * - корреляция (г=0,41; р=0,005) между уровнями иРА и tPA; ** - для иРА р(1-III) < 0,05; p(I-IV) < 0,005; р(И-Ш) < 0,05; p(H-IV) < 0,005; для tPA p(I-II) < 0,05; p(I-IV) < 0,005; для PAI-1 p(lI-III) < 0,02; *** - для иРА р(а-в) < 0,05; для tPA р(б-в) < 0,02; **♦* - для иРА р(а-б) < 0,05.

При учете менструальной функции, все женщины, больные РЩЖ, были разделены на две группы: репродуктивный возраст и постменопауза. Статистически достоверным оказалось только двукратное увеличение активности 1РА у больных РЩЖ в постменопаузе (табл.4).

Важными фактором прогноза РЩЖ считается стадия заболевания, а также значения отдельных показателей классификационной системы ТИМ, характеризующие размер опухоли, количество пораженных метастазами

лимфатических узлов, наличие отдаленных метастазов.

Результаты анализа взаимосвязи концентрации uPA, tPA и PAI-1 в опухолях больных РЩЖ от общей клинической стадии заболевания, а также от размера опухоли (индекс Т), наличия метастазов в лимфатических узлах (индекс N) представлены в'таблице 5.

Следует выделить тенденцию к увеличению концентрации uPA в РЩЖ с увеличением распространенности опухолевого процесса, корреляционная зависимость между стадиями заболевания достоверна (табл.5). Представленные нами данные, являются подтверждением того факта, что при повышенных значениях uPA течение опухолевого процесса имеет неблагоприятный прогноз и это было отмечено при других злокачественных новообразованиях (Е.С.Герштейн и соавт., 1999; Herszenyi L. et al., 1999). Концентрация PAI-1 повышалась от I-II к III стадии заболевания, где достигала своего пика (1,92+0,21 нг/мг белка) и снижалась при IV стадии (1,00±0,21 нг/мг белка). Однако достоверными были отличия в уровне PAI-1 только в опухолях больных при II и III стадиях.

По мере увеличения размера опухоли, увеличивалась концентрация uPA и PAI-1 (табл.5); достоверным является различие между опухолями соответствующими 1 и 3 группе для значений uPA, корреляционная зависимость между группами достоверна (г=0,47; р=0,001). Значения tPA незначительно снижались от 1 ко 2 группе и достигали максимума в 3 группе (достоверно сравнение между i и 3 группами), корреляционная зависимость между группами достоверна (г=0,34; р=0,02). Не выявлено корреляционной зависимости между показателями РАМ в трех группах больных.

Из данных таблицы 5 наибольшие концентрации uPA и PAI-1 отмечены у больных с метастазами РЩЖ, а у больных РЩЖ без метастазов отмечена наибольшая концентрация tPA (достоверным является только увеличение значений uPA), что подтверждается данными, приведенными в литературе. В тканях злокачественных новообразований, при наличии метастазов, наблюдали повышенные концентрации uPA, PAI-1 и низкие уровни экспрессии tPA, что

является неблагоприятным прогностическим признаком.

Из данных, приведенных в таблице 6, содержание РА1-1 в фолликулярном и папиллярном РЩЖ практически не отличалось друг от друга, а различие между значениями иРА и 1РА было недостоверным. Медуллярный РЩЖ отличался от фолликулярного и папиллярного РЩЖ низким содержанием гРА (недостоверно) и высоким содержанием РАМ (р=0,005; р=0,0001, соответственно). Известно, что медуллярный РЩЖ характеризуется более агрессивным течением по сравнению с папиллярным и фолликулярным вариантами РЩЖ (Г.С.Зефирова, 1999). Данные литературы подтверждают результаты настоящего исследования в том, что высокие значения РАМ в РЩЖ могут свидетельствовать о неблагоприятном течении этого вида опухоли, а данный показатель, вероятно, может быть использован как один из маркеров заболевания, однако для этого необходимы исследования на большем числе больных. Как показано в таблице 6 при снижении степени дифференцировки РЩЖ в опухоли уменьшается содержание иРА и 1РА, а уровни РАМ возрастают, однако эти различия недостоверны.

В зависимости от типа роста РЩЖ (солитарное или многофокусное расположение узлов опухоли) в данных группах содержание активаторов (иРА и 1РА) и ингибитора (РАМ) плазминогена практически не отличались друг от друга (табл.6).

В настоящем исследовании выявлено, что уровни иРА и РАМ не зависели от возраста, менструального статуса, степени дифференцировки РЩЖ; количество 1РА, также не зависело от возраста больных и степени дифференцировки РЩЖ, но зависело от менструального статуса; значение иРА было в прямой зависимости от стадии, размера опухоли, распространенности опухолевого процесса и вовлечения регионарных лимфатических узлов; количество РАМ достигало высоких значений при медуллярном РЩЖ.

Таблица 6.

Концентрации uPA, tPA н PAI-1 в цнтозолях РЩЖ с учетом клипико-морфологнческих особенностей_

Клнннко-морфологнчсскнс параметры Число больных Исследуемые показатели

uPA (нг/мг белка) 1РА (нг/мг белка) PAI-1 (нг/мг белка)

1.Гнетологнческая структура РЩЖ: а) фолликулярный б) папиллярный в) медуллярный 13 27 4 0,5810,19 (0,03-2,18) 0,8710,22 (0,002-4,31) 0,8710,52 (0,12-2,38) 1,3710,37 (0,24-4,77) 1,74+0,32 (0,06-5,98) 0,5510,18 (0,14-0,99) 0,9210,19* (0,26-2,74) 0,9010,20* (0,05-4,99) 3,6111,44* (0,73-7,61)

2.По степени днфференцнровкн: а) высокоднффсрспцнровапнып б) умереннодифференцнрованный в) ннзкодифференцнроваипын 29 14 1 0,8210,20 (0,03-4,31) 0,7310,22 (0,002-2,38) 0,45 1,7310,28 (0,19-5,32) 1,1810,42 (0,06-5,.98) 0,27 0,9610,19 (0,16-4,99) 1,5110,53 (0,05-7,61) 1,83

З.Тнп роста узлов опухоли: а) солнтарныц б) многофокусиын 22 22 0,7210,20 (0,03-3,75) 0,8410,23 (0,002-4,31) 1,4810,33 (0,19-5,32) 1,56+0,33 (0,06-5,98) 1,04+0,17 (0,05-3,10) 1,2610,39 (0,05-7,61)

Примечание: * - для РАМ р(а-в) < 0,0001; р(б-в) < 0,005.

Сравнение концентраций uPA, tPA и РАМ при различных заболеваниях щитовидной железы. Всего нами обследовано 146 больных. Наивысшая средняя концентрация uPA отмечена в группе больных РЩЖ (0,78+0,15 нг/мг белка) по сравнению с другими группами пациентов (р(1-2) < 0,009; р(1-3) < 0,03; р(1-4) < 0,002; р(1-5) < 0,05; р(1-6) < 0,03). В этой же группе выявлены и самые низкие средние уровни tPA - 1,51+0,23 нг/мг белка (р(1-3) < 0,005; р(1-4) < 0,05; р(1-5) < 0,02; р(1-б) < 0,01). Средняя концентрация PAI-1 в группе больных РЩЖ также достигала своего максимума (1,15+0,21 нг/мг белка), но различия были достоверны только при сравнении уровней PAI-I с группой больных ДТЗ с аденоматозом (р(1-5) < 0,05; табл.7).

Наиболее близкой группой по значению uPA, tPA к PAI-1 была группа больных УКЗ без аденоматоза (0,26±0,04; 2,33±0,34; 0,74+0,98 нг/мг белка, соответственно), при этом уровень uPA был в 3 раза, а уровень РАМ в 1,5 раза

ниже, чем в группе больных РЩЖ. Уровень 1РА был выше в 2 раза при сравнении данных групп (данные достоверны для значений иРА, 1РА).

Наибольшие различия по значениям иРА, 1РА и РА1-1 обнаружены в группе больных ДТЗ с признаками аденоматоза. Уровень иРА был в 6 раз, а уровень РАМ почти в 5 раз ниже, чем в группе больных РЩЖ; 1РА был выше в 2 раза при сравнении данных групп (данные достоверны для значений иРА, 1РА).

Все больные гиперплазией щитовидной железы отличались высокими средними значениями 1РА (от 2,09 до 3,36 нг/мг белка, в группе РЩЖ - 1,52 нг/мг белка; данные достоверны для всех групп, кроме АЩЖ) и низкими средними значениями для иРА (от 0,13 до 0,26 нг/мг белка; в группе РЩЖ - 0,78 нг/мг белка; данные достоверны для всех групп) и для РАМ (от 0,24 до 0,74 нг/мг белка; в группе РЩЖ - 1,52 нг/мг белка; данные достоверны только для группы больных ДТЗ без аденоматоза).

Таблица 7.

Сравнение концентраций иРА, 1РА и РА1-1 в зависимости _от патологии щнтовидной железы_

Клиннко- Число иРА 1РА РАМ

морфологическне больных (нг/мг белка] (нг/мг белка) (нг/мг белка)

параметры

1. РЩЖ 44 0,7810,15* 1,52±0,23** 1,1510,21***

(0,02-4,3) (0,06-0,12) (0,05-7,6)

2. АЩЖ 18 0,14+0,02* 2,08+0,27 0,6010,12

(0,00-0,26) (0,58-4,34) (0,08-2,20)

З.УКЗ 19 0,2610,07* 3,36±0,8** 0,6410,17

с аденоматозом (0,00-1,42) (0,00-1,42) (0,00-2,66)

4. УКЗ 43 0,2610,04* 2,33+0,34** 0,7410,08

Без аденоматоза (0,00-1,36) (0,00-11,18) (0,00-4,61)

5. ДТЗ 9 0,13+0,03* 2,75±0,27** 0,2410,20***

с аденоматозом (0,0-0,24) (1,46-4,03) (0,0-0,63)

б. ДТЗ 13 0,15 ±0,03* 3,01+0,68** 0,4410,12

Без аденоматоза (0,00-0,46) (0,01-9,30) (0,01-1,55)

Примечание: * - для иРА р(1-2) < 0,009; р(1-3) < 0,03; р(1-4) < 0,002; р(1-5) < 0,05; р(1-б) < 0,03; ** - для 1РА р(!-3) < 0,005; р(1-4) < 0,05; р(1-5) < 0,02; р(1-6) < 0,01; *** - для РАМ р(1-5) <0,05.

В группах пациентов с ДТЗ в сочетании или без признаков аденоматоза различия отмечены только для значения РАМ. Больные АЩЖ занимали промежуточное положение между группами пациентов с УКЗ и ДТЗ. Так, по

среднему значению 1РА и РА1-1 группа пациентов с ЛЩЖ приближалась к группам больных УКЗ с признаками адеиоматоза и без таковых, а по значению иРА - к больных ДТЗ без и с признаками адеиоматоза.

Данные настоящего исследования подтверждают тот факт, что наибольшее значение иРА, РА1-1 и низкие значения 1РА наблюдали в группе больных РЩЖ. Наиболее близкой к группе больных РЩЖ, по уровню экспрессии иРА, 1РА, РА1-1, оказались пациенты с УКЗ без и с признаками адеиоматоза. Данный факт позволяет предполагать о большей вероятности этих заболеваний к малигнизации.

Дальнейшие исследования должны быть направлены на разработку новых методов лечения опухолей и гиперпластических заболеваний щитовидной железы, которые способствуют нормализации процессов регуляции активности плазминогена и на изучение их роли в прогнозе заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Иммуноферментным методом в цитозолях 44 опухолей первичных больных раком щитовидной железы активатор плазминогена (иРА) обнаружен в 98% случаев, в количестве от 0,003 до 4,30 нг/мг белка (в среднем 0,78±0,15, медиана - 0,34 нг/мг белка); активатор плазминогена тканевого типа 0РА) в 100% случаев, в количестве от 0,06 до 5,98 нг/мг белка (в среднем 1,52+0,23, медиана - 1,52 нг/мг белка), а их ингибитор РА1-1 в количестве от 0,05 до 7,61 нг/мг белка (в среднем 1,15±0,21, медиана - 0,74 нг/мг белка) у 100% больных. При этом средние уровни экспрессии иРА и РА1-1 были наибольшими в злокачественных опухолях, а уровень РА1-1 наименьшим по сравнению с другими обследованными группами пациентов.

2. Концентрация иРА прогрессивно возрастает с увеличением стадии заболевания, размера опухоли и наличия регионарных метастазов в лимфатических узлах. Не обнаружено четкой взаимосвязи в злокачественных новообразованиях щитовидной железы между содержанием иРА, 1РА, РАН и типом роста, степени дифференцировки опухоли.

3. У больных медуллярным раком щитовидной железы концентрация РА1-1 в опухоли была самой высокой (р<0,005), а содержание 1РА - наиболее низким по сравнению с другими группами обследованных больных с новообразованиями щитовидной железы. Содержание иРА практически не зависело от гистологического варианта медуллярного рака.

4. Прямую, высоко достоверную корреляционную зависимость наблюдали между уровнями иРА и 1РА в группах больных раком щитовидной железы и диффузным токсическим зобом без аденоматоза, а также между уровнями иРА и РАМ в группах больных узловым коллоидным зобом без и с аденоматозом и диффузным токсическим зобом с аденоматозом.

5. Не обнаружено зависимости уровней иРА, 1РА и РАМ от возраста и длительности заболевания. Уровень экспрессии РАМ зависит от сохранения репродуктивной функции женщин в группах больных, аденомой и узловьш

коллоидным зобом без аденоматоза, а уровень экспрессии 1РА был более высоким в группе больных раком щитовидной железы в менопаузе. 6. У больных узловым коллоидным зобом без и с аденоматозом показатели экспрессии активаторов и ингибитора активаторов плазминогена приближались к значениям этих показателей у больных раком щитовидной железы. Значения иРА, 1РА и РА1-1 практически не отличались между больными узловым коллоидным зобом без и с аденоматозом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Активатор плазминогена урокиназного и тканевого типа (uPA, tPA) и его ингибитор (PAI-I) в опухолевой и неопухолевой тканях щитовидной железы (в соавторстве с Кушлинским Н.Е., Герштейн Е.С., Казанцевой И.А., Лякиной JI.T., Богатыревым О.П., Калининым А.П., Трапезниковым H.H.). Тезисы докладов третьей Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы эндокринологии» (16-18 мая 2000 г., Пермь).-с.120-121.

2. Активатор плазминогена урокиназного (uPA) и тканевого типа (tPA) и их ингибитор (PAI-I) при новообразованиях щитовидной железы (в соавторстве с Кушлинским Н.Е., Казанцевой И.А., Герштейн Е.С., Богатыревым О.П., Смирновым В.В., Казаковым С.П., Карпищенко В.И., Калининым А.П.). Тезисы докладов «IV Российской онкологической научной конференции» (21-23 ноября 2000 г., Москва).-с.83-84.

3. Сравнительный анализ уровня активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типа и их ингибитора при заболеваниях щитовидной железы (в соавторстве с Кушлинским Н.Е., Казанцевой И.А., Герштейн Е.С., Лякиной Л.Т., Богатыревым О.П., Смирновым В.В., Казаковым СЛ., Карпищенко В.И., Калининым А.П.). Тезисы докладов научно-практической конференции ГВКГ им. Н.Н.Бурденко МО РФ «Современные подходы к диагностике и лечению злокачественных новообразований» (7 декабря 2000 г., Москва).-с.61-62.

4. Изучение ингибиторов и активаторов плазминогена в опухоля? щитовидной железы (в соавторстве со Скрипниченко М.В., Бритвинык Т.А.). Тезисы докладов I Московской городской научно-практическог молодежной конференции «Медицина на пороге XXI века. Актуальньк проблемы и вопросы» (22 февраля 2001 г., Москва).-с.76.

5. Уровень tPA, uPA, PAI-1 в опухолях и гиперплазиях щитовидно! железы (в соавторстве с Герштейн Е.С., Казанцевой И.А., Смирновым В.В. Казаковым С.П., Карпищенко В.И., Богатыревым О.П., Калининым А.П. Кушлинским Н.Е.). Тезисы докладов VIII Российского Национальной Конгресса «Человек и лекарство» (2-6 апреля 2001г., Москва).-с.322.

6. Уровень tPA, uPA, PAI-1 в новообразованиях щитовидной железы (i соавторстве со Скрипниченко М.В., Бритвиным Т.А.). Тезисы докладов I Российской конференции молодых ученых «Фундаментальные науки i прогресс клинической медицины» (24-28 апреля 2001г., Москва).-с.406.

Актуальность темы исследования. В последнее десятилетие повсеместно отмечается увеличение частоты заболеваемости (в 5-6 раз) раком щитовидной железы (РЩЖ) (С.Б.Пинский и соавт., 1999). Причиной высокой заболеваемости считают ухудшение экологической обстановки, радиоактивное загрязнение. Согласно современным данным литературы частота случайного выявления онкологических заболеваний щитовидной железы при лечении эутиреоидного узлового зоба составляет 0,4-27%, а частота опухолей при диффузном токсическом зобе - 0,5-21,5% (А.Л.Акинечев и соавт., 1998). Диагностика гиперпластических и опухолевых процессов в щитовидной железе затруднена. Примерно в 50% случаев у больных раком щитовидной железы устанавливается ошибочный диагноз. При этом почти у 60% больных выявляется РЩЖ в III или IV стадиях заболевания, хотя они относятся к визуальным формам новообразований (И.С.Агеев, 1992). В начальных стадиях болезни ошибки диагностики составляют 50-100%. При поступлении больных в клинику ошибки диагностики имеют место в 33,2-85,0% случаев (Л.Н.Камардин и соавт., 1984; Г.А.Гинзбург, 1991). В связи с этим большое внимание уделяется разработке новых методов обследования для своевременной диагностики РЩЖ, применению новых тест-систем для дальнейшей оценки биологического поведения узловых новообразований, а следовательно, риска малигнизации, активности процессов инвазии и метастазирования.

Особое внимание в последнее время многие исследователи уделяют проблеме инвазии и метастазирования опухолей щитовидной железы. Это связано с тем, что, основными проявлениями прогрессии опухолевого процесса считается способность раковых клеток проникать в прилежащие ткани, повреждая их, а также перемещаться с током крови или лимфы в отдаленные органы и ткани, давать начало новым очагам опухолевого роста (Murray P. et al., 1988).

Центральное место в этой проблеме занимает система активации плазминогена - многокомпонентный каскад протеолитических реакций, участвующий в разрушении базальной мембраны и внеклеточного матрикса, окружающих опухоль, что способствует выходу опухолевых клеток и образованию метастазов (Ellis V. et al., 1991; Graeff H. et al., 1992). Центральную роль в этих процессах играют сериновые протеазы активаторы плазминогена урокиназного (иРА) и тканевого (tPA) типов (Andreasen Р.А. et al., 1990). Стало известно, что иРА участвует в процессах деградации межклеточного вещества соединительной ткани, a tPA участвует в тромбофибринолизе (Mignatti P. et al., 1993; Pollanen J. et al., 1987).

Активность uPA может подавляться двумя специфическими ингибиторами PAI-1 и PAI-2 (Andreasen Р.А. et al., 1990; Ginsburg D. et al., 1986; Kruithof E.K.O. et al., 1986). По некоторым данным литературы роль ингибиторов, в частности, PAI-1 (Eaton D.L. et al., 1984), может сводиться не только к подавлению метастазирования и инвазии (через торможение активации плазминогена и всего следующего протеолитического каскада), но и к распространению опухолевого процесса (защита опухолевых клеток от протеолиза) (Reilly D. et al., 1992; Е.С.Герштейн и соавт., 1999). Поэтому высокий уровень ингибитора PAI-1 является неблагоприятным прогностическим фактором. Высокие концентрации иРА в тканях считают неблагоприятным признаком общей и безрецидивной выживаемости. Высокие значения tPA наоборот коррелировали с лучшей общей и безрецидивной выживаемостью, о чем свидетельствуют ряд работ, доказывающих прогностическое значение активаторов и ингибиторов активаторов плазминогена в опухолях различных локализаций (Foekens et al., 1992, 1996; Kim et al., 1998). Так, в ткани злокачественных опухолей яичников содержание иРА и PAI-1 значительно выше, a tPA -значительно ниже у женщин в более поздних стадиях заболевания. Исследования, проведенные при раке молочных желез, доказали что, чем агрессивнее болезнь, тем ниже содержание в опухоли tPA.

В опухолях мозга высокий уровень иРА и отсутствие tPA коррелируют с гистологически более агрессивными злокачественными новообразованиями, характеризующимися более быстрым характером течения и короткими сроками выживаемости. Высокий уровень ингибитора PAI-1 может расцениваться как неблагоприятный прогностический фактор (Но С.Н. et al., 1999; Ruppert С. et al., 1997; Bindal A.K. et al., 1994).

Несмотря на то, что активаторы и ингибиторы активаторов плазминогена являются объектом многих исследований, в литературе представлено немного данных относительно их роли в процессах инвазии рака щитовидной железы, а также возможности их использования в дифференциальной диагностике гиперпластических и опухолевых процессов этого органа.

Цель исследования - сравнительная оценка показателей активности активаторов плазминогена урокиназного (иРА) и тканевого 0:РА) типов и их ингибитора (РА1-1) при раке, аденоме и гиперпластических процессах щитовидной железы с учетом основных морфологических и клинических характеристик заболевания.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи.

Задачи исследования

1. Провести сравнительное изучение содержания активаторов плазминогена урокиназного (иРА) и тканевого 0:РА) типов, а также ингибитора активаторов плазминогена 1 типа (РА1-1) в цитозолях злокачественных опухолей, доброкачественных новообразований и при гиперплазиях щитовидной железы.

2. Сопоставить уровни 1РА, иРА и РА1-1 в злокачественных опухолях, доброкачественных новообразованиях и гиперпластических процессах щитовидной железы с учетом основных морфологических и клинических особенностей заболевания.

3. Оценить взаимосвязь показателей 1РА, иРА и РА1-1 в опухоли у больных различными морфологическими вариантами рака щитовидной железы.

Научная новизна

Впервые в отечественной литературе проведено сравнительное определение содержания активаторов плазминогена урокиназного и тканевого (иРА и 1РА) типов и их ингибитора типа 1 (РА1-1) в цитозольной фракции злокачественных опухолей, доброкачественных новообразований и гиперпластических заболеваний щитовидной железы.

На основании лабораторных и клинических исследований выявлена взаимосвязь между экспрессией активаторов плазминогена урокиназного и тканевого (иРА и 1РА) типов и их ингибитора 1 типа (РА1-1) в цитозольной фракции злокачественных опухолей щитовидной железы.

Показано, что в аденомах и при гиперпластических заболеваниях щитовидной железы экспрессируется меньше иРА и РА1-1 и больше 1РА, по сравнению со злокачественными опухолями.

Выявлено повышение уровня РА1-1 при медуллярном раке щитовидной железы в отличие от других гистологических вариантов рака.

Установлена взаимосвязь содержания иРА в злокачественных опухолях щитовидной железы со стадией заболевания и вовлеченностью регионарных лимфатических узлов.

Практическая значимость исследования Работа представляет не только теоретический интерес для анализа роли активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типов (иРА и 1РА) и их ингибитора типа 1 (РА1-1) в процессах инвазии и метастазирования злокачественных опухолей щитовидной железы, но имеет значение для оценки степени риска малигнизации узловых образований и гиперпластических процессов в этом органе.

Кроме того, представленные данные исследования открывают перспективу создания новых лекарственных средств, влияющих на экспрессию иРА, 1РА и РА1-1 в опухолях, с целью ингибирования процессов инвазии и метастазирования при раке щитовидной железы.

Апробация работы Основные результаты диссертации изложены на 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы эндокринологии» (16-18 мая 2000г., Пермь), IV Ежегодной Российской онкологической конференции (21-23 ноября 2000г., Москва), научно-практической конференции «Современные подходы к диагностике и лечению злокачественных новообразований» (7 декабря 2000г., Москва), первой Московской городской научно-практической молодежной конференции

Медицина на пороге XXI века. Актуальные проблемы и вопросы» (22 февраля 2001г., Москва), VIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (2-6 апреля 2001г., Москва), второй Российской конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (24-28 апреля 2001г., Москва).

Материалы диссертации доложены на совместной научной конференции лаборатории клиническои биохимии, хирургических отделении опухолей головы и шеи и верхних дыхательно-пищеварительных путей НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, хирургического отделения диагностики, отделения изучения новых противоопухолевых лекарств, лаборатория патологической анатомии опухолей с прозектурой.

20 декабря 2001г.

Публикации результатов исследования

По теме диссертации опубликованы 6 научных работ.

Структура и объем работы

ВЫВОДЫ

1. Иммуноферментным методом в цитозолях 44 опухолей первичных больных раком щитовидной железы активатор плазминогена (иРА) обнаружен в 98% случаев, в количестве от 0,003 до 4,30 нг/мг белка (в среднем 0,78±0,15, медиана - 0,34 нг/мг белка); активатор плазминогена тканевого типа ОРА) в 100%) случаев, в количестве от 0,06 до 5,98 нг/мг белка (в среднем 1,52±0,23, медиана - 1,52 нг/мг белка), а их ингибитор РА1-1 в количестве от 0,05 до 7,61 нг/мг белка (в среднем 1,15±0,21, медиана - 0,74 нг/мг белка) у 100% больных. При этом средние уровни экспрессии иРА и РА1-1 были наибольшими в злокачественных опухолях, а уровень РА1-1 наименьшим по сравнению с другими обследованными группами пациентов.

2. Концентрация иРА прогрессивно возрастает с увеличением стадии заболевания, размера опухоли и наличия регионарных метастазов в лимфатических узлах. Не обнаружено четкой взаимосвязи в злокачественных новообразованиях щитовидной железы между содержанием иРА, 1РА, РА1-1 и типом роста, степени дифференцировки опухоли.

3. У больных медуллярным раком щитовидной железы концентрация РА1-1 в опухоли была самой высокой (р<0,005), а содержание 1РА наиболее низким по сравнению с другими группами обследованных больных с новообразованиями щитовидной железы. Содержание иРА практически не зависело от гистологического варианта медуллярного рака.

4. Прямую, высоко достоверную корреляционную зависимость наблюдали между уровнями иРА и 1РА в группах больных раком щитовидной железы и диффузным токсическим зобом без аденоматоза, а также между уровнями иРА и РА1-1 в группах больных узловым коллоидным зобом без и с аденоматозом и диффузным токсическим зобом с аденоматозом.

5. Не обнаружено зависимости уровней иРА, 1РА и РА1-1 от возраста и длительности заболевания. Уровень экспрессии РА1-1 зависит от сохранения репродуктивной функции женщин в группах больных, аденомой и узловым коллоидным зобом без аденоматоза, а уровень экспрессии tPA был более высоким в группе больных раком щитовидной железы в менопаузе.

6. У больных узловым коллоидным зобом без и с аденоматозом показатели экспрессии активаторов и ингибитора активаторов плазминогена приближались к значениям этих показателей у больных раком щитовидной железы. Значения иРА, 1РА и РА1-1 практически не отличались между больными узловым коллоидным зобом без и с аденоматозом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние время многие исследования сконцентрированы в области изучения механизмов инвазии и метастазирования опухолей. Центральное место в этой проблеме занимает система активации плазминогена -многокомпонентный каскад протеолитических реакций, участвующий в разрушении базальной мембраны и внеклеточного матрикса окружающих опухоль тканей, что способствует выходу опухолевых клеток и образованию метастазов (Ellis V. et al., 1991; Graeff Н. et al., 1992).

Ключевую роль в процессах активации плазминогена играют сериновые протеазы, активаторы плазминогена урокиназного (иРА) и тканевого (tPA) типов, а также их специфические ингибиторы, относящиеся к семейству серпинов - PAI-1 и PAI-2. Известно, что иРА участвует в процессах деградации межклеточного вещества соединительной ткани, как в норме, так и при патологии, a tPA - в тромбофибринолизе (Mignatti P. et al., 1993; Pollanen J. et al., 1987). Роль PAI-1 связана преимущественно с защитой опухолевых клеток от разрушающего действия иРА.

Многие авторы подтверждают важность и перспективность исследования ферментов системы активации плазминогена в различных типах опухолей для дальнейшего использования результатов в клинической практике. При этом наиболее перспективными показателями с точки зрения уточнения прогноза заболевания и оценки злокачественного потенциала опухоли, являются иРА и РА1-1. Роль активатора плазминогена тканевого типа пока недостаточно изучена.

Наименее исследована роль иРА, 1РА и РА1-1 при заболеваниях щитовидной железы. В литературе встречаются отдельные работы, посвященные данной теме, однако большинство этих исследований проведено в эксперименте либо на животных, либо в культуре клеток. Основу настоящего клинического материала составили 146 больных с различными заболеваниями щитовидной железы.

Согласно представленным нами данным, заболеваниями щитовидной железы в основном страдают женщины, что подтверждают и результаты других исследователей (С.Б.Пинский и соавт., 1999). Так, из 146 обследованных нами больных было 129 женщин и 17 мужчин, что составило 88,4 и 11,6%, соответственно. В связи с этим сравнение значений исследуемых показателей между мужчинами и женщинами не проводили.

Проведенное нами иммуноферментное определение концентрации некоторых наиболее важных компонентов системы активации плазминогена в цитозолях злокачественных опухолях, доброкачественных новообразований и при гиперпластических процессах щитовидной железы позволило выявить ряд закономерностей. В первую очередь, было убедительно продемонстрировано многократное увеличение концентрации активатора плазминогена урокиназного типа - иРА в злокачественных опухолях по сравнению с другими заболеваниями щитовидной железы табл.22, рис.16). Это наблюдение согласуется с предполагаемой универсальной ролью иРА в механизмах злокачественной трансформации клеток. Как известно, иРА считается ключевым звеном в запуске каскадного механизма превращения плазминогена в плазмин, который, в свою очередь, участвует в разрушении межклеточных компонентов матрикса и проникновении опухолевых клеток в окружающие ткани. Уровень ингибитора активаторов плазминогена также был увеличен, однако данные сравнения между группами (кроме группы больных аденомой щитовидной железы) РА1-1 были не достоверны. При сопоставлении средних значений активатора плазминогена тканевого типа его концентрация в опухолевой ткани оказалась достоверно ниже (в группе больных аденомой щитовидной железы не достоверно). При сопоставлении медиан и средних значений иРА и 1РА в различных группах наблюдается обратная зависимость: минимальному количеству иРА в группе гиперплазий щитовидной железы соответствует максимальное значение гРА. И наоборот, максимальные количества иРА, в злокачественных опухолях щитовидной железы соответствовали минимальные значение 1РА.

В этой связи представлялось интересным выявить зависимость содержания активаторов и ингибитора активаторов плазминогена в зависимости от клинико-морфологических показателей в исследуемых группах больных. Статистический анализ показал, что концентрации иРА, 1РА и РА1-1 во всех группах сравнения не коррелировали с возрастом, и длительностью заболевания. Концентрация РА1-1 зависела от сохранения репродуктивной способности женщин (в группах больных аденомой и узловым коллоидным зобом щитовидной железы), а уровень экспрессии 1РА был достоверно выше в группе больных раком щитовидной железы. Нами не обнаружено четкой взаимосвязи содержания иРА, 1РА и РА1-1 в опухолях щитовидной железы со степенью дифференцировки и характером опухолевого поражения. Концентрация иРА прогрессивно возрастала с увеличением стадии заболевания, размера опухоли и наличия регионарных метастазов. Изменения концентрации 1РА были не столь однозначны, наблюдалось возрастание уровня 1РА от I ко II стадии РЩЖ, незначительное понижение его отмечено в III стадии и максимальное значение - в IV стадии болезни. Содержание РА1-1 было практически одинаковым при I и II стадиях РЩЖ, достигало максимума в III стадии и понижалось в IV стадии болезни. Изменение концентраций исследуемых показателей в зависимости от индекса N выявило повышение иРА, РА1-1 и незначительное снижение концентрации 1РА.

При гистологическом исследовании большинство опухолей было отнесено к папиллярному РЩЖ, вторую по величине группу составил фолликулярный рак, в единичных наблюдениях обнаружен медуллярный рак щитовидной железы. Содержание РА1-1 в фолликулярном и папиллярном РЩЖ практически не отличалось друг от друга, а различие между значениями иРА и 1РА было недостоверным. Медуллярный РЩЖ отличался от других гистологических вариантов рака низким содержанием 1РА (недостоверно) и высоким содержанием РА1-1, что в сравнении с папиллярной и фолликулярной карциномой является неблагоприятным фактором и подтверждается тяжелым клиническим течением, большей агрессивностью, склонностью к рецидивированию после лечения по сравнению с папиллярным и фолликулярным вариантами РЩЖ (Г.С.Зефирова, 1999).

Во всех группах сравнения, кроме группы больных аденомой щитовидной железы, наблюдалась достоверная корреляционная зависимость. В группах больных узловым коллоидным зобом щитовидной железы с аденоматозом и диффузным токсическим зобом с аденоматозом, корреляционная зависимость определялась между уровнями иРА и РА1-1, тогда как в группах больных злокачественными опухолями и диффузным токсическим зобом щитовидной железы - между уровнями иРА и 1РА.

Значения иРА, 1РА и РА1-1 практически не отличались в группах больных узловым коллоидным зобом щитовидной железы с признаками аденоматоза и без таковых.

Наиболее близкой к группе больных РЩЖ, по уровню экспрессии активаторов и ингибитора активаторов плазминогена, оказались группы пациентов с узловым коллоидным зобом щитовидной железы с аденоматозом.

В группе больных УКЗ щитовидной железы с аденоматозом, отмечено, достоверное снижение уровня РА1-1 с увеличением размеров гиперплазированных узлов, что по утверждению ряда авторов является хорошим прогностическим признаком. В группе больных УКЗ щитовидной железы без аденоматоза с увеличением размера узлов, отмечено, достоверное увеличение уровня 1РА, что также характерно для благоприятного прогноза заболевания и, возможно, снижает риск малигнизации.

В заключении следует отметить, что результаты изучения системы регуляции плазминогена при разных заболеваниях щитовидной железы подтверждают связь экспрессии активаторов плазминогена иРА, 1РА и их ингибитора РА1-1 в биологии опухоль-трансформированных тканей, а также со степенью распространенности опухолевого процесса. Дальнейшие исследования должны быть направлены на разработку новых методов лечения опухолей и гиперпластических заболеваний щитовидной железы, которые способствуют нормализации процессов регуляции активности плазминогена и на изучение их роли в прогнозе заболевания.