Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Клиническое значение некоторых тканевых маркеров метастазирования при раке желудка

Актуальность темы. Ежегодно в мире раком желудка заболевают более 1 млн. человек (Мерабишвили В.М., 2004). При этом в подавляющем большинстве стран заболеваемость раком желудка у мужчин в 2 раза выше, чем у женщин (Гарин A.M. и соавт., 2006). Однако уровень заболеваемости колеблется в достаточно широких пределах. Так, по данным МАИР в издании «Рак на 5 континентах» (т.7) максимальный уровень заболеваемости раком желудка отмечен у мужчин Японии (114,7), а минимальный - у белых женщин США (Чиссов В.М. и соавт., 2000; Мерабишвили В.М., 2001).

Наиболее высокие показатели заболеваемости раком желудка регистрируются в Японии, Китае, России, Белоруссии, Эстонии, Латвии, Новой Зеландии (Давыдов М.И.и соавт., 2006).

Программы скрининга рака желудка не работают нигде, кроме Японии (Мерабишвили В.М., 2004). Это связано с тем, что неизвестен специфический причинный фактор заболевания.

Необходимо отметить существующие различия диагностических критериев рака желудка у японских и западных патологоанатомов. Как указывает Schlemper R.J.et al. (1997), в Японии принято диагностировать рак желудка, руководствуясь нуклеарными и структурными критериями, даже в отсутствии инвазии, как это принято на Западе. Такой подход не может не оказать влияния как на уровень заболеваемости населения раком желудка, так и на эффективность его лечения.

В последние годы большое внимание при анализе причины возникновения рака желудка исследователи уделяют роли Helicobacter pylori (Аруин Л.И., 1997). В 1983 г. Marshall В.J., изучая биоптаты слизистой оболочки желудка больных язвенной болезнью, обнаружил и описал микроорганизм, классифицированный как Helicobacter pylori, в последствии признанный ведущим в этиологии хронического неиммунного антрального гастрита, исследователей заинтересовали его связи с возникновением рака желудка. При этом было показано исследователями в США и Англии, что риск возникновения рака желудка у инфицированных больных в 3,8 рака выше по сравнению с неинфицированными больными. Проспективные исследования выявили инфицированность Helicobacter pylori в 90%, а при исключении рака кардии этот процент становился еще выше. Гистологическое исследование биоптатов, проведенное японскими исследователями на наличие Helicobacter pylori у 68 пациентов с cancer in situ, показало, что Helicobacter pylori обнаружен у 86% больных с карциномой in situ кишечного типа и менее чем у половины обследованных с ранним раком диффузного типа (Endo S. et al., 1995). По классификации ВОЗ Helicobacter pylori относится к группе I - явные канцерогены. В патогенетической цепочке норма - поверхностный гастрит -атрофический гастрит - тонкокишечная метаплазия - толстокишечная метаплазия — дисплазия - рак желудка, Helicobacter pylori играет важную роль в первом, третьем и четвертом звеньях (Brissiand J.C. и соавт., 1998). Однако, маловероятно, что Helicobacter pylori является единственным фактором, ответственным за развитие рака желудка. Вместе с тем, важно, что он еще создает среду, способствующую реализации его канцерогенного потенциала (Исаков В.А. и соавт., 2003). Как указывают Walt B.et al. (1998), широкий прием антибиотиков людьми, инфицированными Helicobacter pylori, не дает ожидаемого эффекта и слишком дорог (Харченко В.П.и соавт., 1999).

В структуре онкологической заболеваемости и смертности населения России рак желудка занимает второе место после рака легкого (Чиссов В.И.и соавт., 2000). Ежегодно в России учитывается 48,8 тыс. новых случаев рака желудка и 45 тыс. больных умирает от рака желудка.

Наиболее высокий уровень заболеваемости раком желудка характерен для мужчин в возрасте 70 лет и старше (307,2), что в 68,2 раза больше, чем у 30-летних. У женщин отмечена та же тенденция, но на меньших в 2 раза показателях.

В среднем по России пациенты, отнесенные к IV стадии заболевания по раку желудка составляют 42,6%, а величина одногодичной летальности в среднем по России составляет приблизительно 56%. К сожалению, у 75% первично выявленных больных заболевание диагностируется в III-IV стадии, что предопределяет неудовлетворительные результаты лечения (Симонов Н.Н.и соавт., 2004). Частота обнаружения ранних форм рака желудка не превышает 10-20%, а у 83% больных при первично выявленном раке желудка уже существуют регионарные метастазы.

Морфологически рак желудка верифицирован по России в 71,6% (Чиссов В.И.и соавт., 2000). При этом подавляющую часть опухолей желудка составляют аденокарцинома и рак.

Основным и практически единственным методом радикального лечения рака желудка на сегодняшний день является операция, которая в ряде случаев позволяет добиться полного излечения (Давыдов М.И. и соавт., 2004). На основании предоперационных клинико-инструментальных методов обследования возможно получение исчерпывающей информации об особенностях опухолевого роста внутри желудка определить локализацию опухоли, протяженность поражения, анатомическую форму роста с подробным характером изъязвления, распространение опухолевой инфильтрации по окружности желудочной стенки, а также переход инфильтрации на пищевод, наличие интрамуральных метастазов. В последние годы многие авторы публикуют данные о достаточно высокой эффективности применения эндоскопического УЗИ для оценки глубины инвазии стенки желудка и предоперационного определения символа сТ (Uenosono Y. и соавт., 2001). Метод характеризуется достаточно высокой чувствительностью (76,3%). Причем наибольшая достоверность данного исследования отмечается при опухолях, ограниченных слизистой оболочкой -подслизистым слоем (сТ1) - 87,1%, а также при прорастании серозной оболочки, либо вовлечении окружающих структур (сТЗ/Т4) - 76,9%. В случаях, когда глубина инвазии ограничивается мышечной оболочкой, особенно при прорастании до уровня субсерозы, зачастую происходит гипердиагностика глубины инвазии, что отражается и на достоверности метода - 51,4% (Uenosono Y. et al., 2001).

Пятилетняя выживаемость больных раком желудка в европейских странах составила: у мужчин от 8,4 до 25,3%, а у женщин - от 10,1 до 32,1%. В большинстве стран Европы 5-летняя выживаемость женщин существенно выше не только по итоговому показателю, но и по возрастным группам. Наибольшие различия установлены для больных с разными стадиями опухолевого процесса.

Вместе с тем, остается окончательно не решенной проблема прогнозирования течения заболевания у больных раком желудка после радикального лечения. Известно, что прогноз заболевания в значительной степени определяется рядом морфологических прогностических факторов, которые тесно связаны с «биологическим поведением» опухоли и среди них: стадия заболевания (классификация TNM), тип роста, степень инвазии и дифференцировки опухоли, наличие регионарных метастазов (Давыдов М.И. и соавт., 2004). Однако использование только этих критериев явно недостаточно для оценки характера течения и прогноза заболевания.

В настоящее время интенсивно разрабатываются и внедряются в клиническую практику дополнительные молекулярно-биологические методы исследования, которые характеризуют степень агрессивности опухолевого процесса и, кроме того, позволяют индивидуализировать прогноз клинического течения и чувствительность опухоли к проводимой терапии (Лазарев А.Ф. и соавт., 2006). Среди них широкое распространение получили тканевые маркеры и, в частности, система активации плазминогена и белок nm23, экспрессия которых обнаружена во многих опухолях, в том числе и раке желудка.

Одним из потенциально важных маркеров, вовлеченных в процессы клеточной пролиферации, дифференцировки и контроля метастазирования при раке желудка, является белок nm23 (non-metastatic cells protein; белок NDP - nucleoside diphosphate kinase) (Ura H. et al., 1996; Ji S.Q. et al., 2002; Lee K.E. et al., 2003). Ген nm23-Hl расположен на хромосоме 17q21 и кодирует белок с относительной молекулярной массой 17 кД (Terada R. et al., 2002). Первоначально ген nm23 был описан как супрессор метастазирования, и в отдельных работах отмечалось снижение уровня экспрессии продукта гена nm23 при прогрессировании ряда опухолей человека. Однако в дальнейшем были отмечены более сложные взаимоотношения между появлением в раковых клетках белкового маркера и метастатической активностью опухоли (Kumar D.D. et al., 1999; Nesi G. et al., 2001). При этом, гиперэкспрессия белка nm23 обнаружена в некоторых злокачественных опухолях человека, таких как рак легкого, колоректальный рак, меланома, рак молочной железы, желчного пузыря, гортани. Особое внимание исследавателей было уделено изучению экспрессии белка nm23 при раке желудка (Yeung P. et al., 1998; Yoo С.Н. et al., 1999; Lee K.E. et al., 2003). При этом, в работах Muller W. et al. (1998), Nesi G. et al. (2001) показано, что экспрессия nm23 в злокачественных опухолях желудка была ассоциирована с неблагоприятным прогнозом заболевания.

Следует отметить, что клиническая значимость экспрессии nm23 и особенностей продукции основных компонентов системы активации плазминогена в опухолях начинают только интенсивно изучаться. Однако клиническими исследованиями показано, что уровень и соотношение экспрессии различных компонентов системы активации плазминогена в опухоли может служить показателем ее метастатической и инвазивной активности, а следствие этого и биологически значимым фактором прогноза при различных новообразованиях (Герштейн Е.С.и соавт., 2004).

Изучение системы активации плазминогена проводили при различных опухолях у человека: при колоректальном раке (Голубченко О.В., 2004), раке желудка (Щербаков А.М.и соавт., 2002; Ognerubov N.A. et al., 2003), молочной железы (Герштейн Е.С. и соавт., 2004), пищевода (Кушлинский Н.Е. и соавт., 2002), опухолях костей (Юсифов А.И.,

2001), новообразованиях щитовидной железы (Харидити Т.Ю.и соавт.,

2002). При этом, исследователям удалось выявить в большинстве злокачественных опухолей различного гистогенеза значительное увеличение концентрации иРА и PAI-1 по сравнению с гомологичными нормальными тканями и доброкачественными новообразованиями (Gershtein E.S. et al., 2002).

Система активации плазминогена представляет собой протеолитический каскад, участвующий в разрушении окружающей опухоль базальной мембраны и внеклеточного матрикса, способствуя выходу опухолевых клеток из их первоначального окружения и образованию опухолевых узлов в отдаленных органах и тканях (Герштейн Е.С.и соавт., 2002). Ключевыми компонентом этой системы является сериновая протеаза - активатор плазминогена урокиназного типа (иРА), которая расщепляет плазминоген до плазмина (Огнерубов Н.А. и соавт., 2005). Плазмин уменьшает уровень внеклеточных матричных гликопротеидов и активирует некоторые про-металлопротеазы, что играет решающую роль в процессах инвазии и метастазирования (Mignatti P. et al., 1993). В ранних исследованиях изучение системы активации плазминогена в опухолях и окружающей слизистой больных раком желудка показало, что уже на ранних стадиях заболевания проявляется характерное для большинства злокачественных опухолей усиление активации плазминогена по урокиназному типу.

Известно, что активность иРА регулируется несколькими способами, в частности, подавляется двумя белковыми ингибиторами класса серпинов - PAI-1 и PAI-2 (Andreasen P.A. et al., 1990). Помимо uPA в активации плазминогена может участвовать также активатор тканевого типа (tPA), однако, его роль при развитии опухолей, по-видимому, противоположна роли иРА и сводится к разрушению опухолевых клеток и защите окружающих тканей от распространения опухоли (Bell W.R., 1996).

Уровень и соотношение экспрессии различных компонентов системы активации плазминогена в опухолевой ткани может служить показателем метастатической и инвазивной активности опухоли, являясь вследствие этого биологически значимым фактором прогноза при различных новообразованиях (Герштейн Е.С. и соавт., 2001, 2004; Duffy M.J. et al., 1999). Кроме того, подавление активации плазминогена по урокиназному типу может стать одним из подходов к разработке новых схем антиметастатической терапии (Schmitt М. et al., 1997).

Несмотря на то, что исследования системы активации плазминогена проводили при различных опухолях, большинству исследователей удалось выявить общую закономерность, заключающуюся в том, что в злокачественных опухолей различного гистогенеза происходит значительное увеличение концентрации иРА и PAI-1 по сравнению с гомологичными нормальными тканями и доброкачественными новообразованиями. Все это может иметь как теоретическое, так и практическое значение. С одной стороны, оно свидетельствует о том, что усиление активации плазминогена по урокиназному типу, сопровождающееся усилением защиты опухолевых клеток от саморазрушения (за счет увеличения уровня PAI-1), является достаточно универсальным признаком малигнизации. С другой стороны, повышенная экспрессия иРА в опухоли по сравнению с окружающей тканью делает этот фермент перспективной избирательной мишенью для антиметастатической противоопухолевой терапии, характеризующемся достаточно низкой чувствительностью к стандартным видам химиотерапии.

Прогноз рака желудка определяет целый ряд клинико-морфологических и молекулярно-биологических факторов. В настоящее время известно большое количество молекулярно-генетических маркеров опухолей, которые являются показателями биологической активности раковых клеток и могут быть использованы в качестве прогностических критериев в онкологической клинике. Наличие или отсутствие экспрессии отдельных маркеров делает возможной более точную оценку такого сложного, комплексного, многоступенчатого процесса как метастазирование опухоли. Вместе с тем, значение большинства этих факторов окончательно не изучено.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ изучение экспрессии белка пш23 и содержания основных компонентов системы активации плазминогена в опухолях больных раком желудка для оценки их взаимосвязи с основными клиническими и морфологическими характеристиками заболевания, прогнозом.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести иммуногистохимический анализ экспрессии белка nm23 в первичных опухолях больных раком желудка и сопоставить его показатели с основными клиническими и морфологическими характеристиками болезни.

2. Провести сравнительное изучение особенностей продукции основных компонентов системы активации плазминогена (uPA, tPA, PAI-1) в первичных опухолях у больных раком желудка.

3. Провести анализ корреляционной зависимости между содержанием основных компонентов системы активации плазминогена в опухоли больных раком желудка и клинико-морфологическими характеристиками заболевания (возраст больных, морфологический вариант строения и степень дифференцировки опухоли, стадия заболевания).

4. Определить клиническую роль особенностей экспрессии белка nm23 и продукции основных компонентов системы активации плазминогена в первичной опухоли больных раком желудка при оценке прогноза заболевания.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Впервые проведен анализ экспрессии белка nm23 с учетом продукции основных компонентов системы активации плазминогена (uPA, tPA, PAI-1) в первичных опухолях больных раком желудка. Анализ исследуемых показателей проведен с учетом основных клинических и морфологических характеристик заболевания, а также изучена связь выше указанных биохимических показателей с клиническим течением и прогнозом рака желудка.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Настоящая работа представляет практический интерес для анализа роли экспрессии белка nm23 с учетом основных компонентов системы активации плазминогена в первичных опухолях больных раком желудка, а результаты исследования позволили представить молекулярно-биологические критерии в оценке прогноза заболевания у этой категории пациентов. Высокие уровни продукции PAI-1 в опухоли больных раком желудка, следует считать неблагоприятным фактором прогноза общей выживаемости, которые связаны с повышенной экспрессией белка nm23 в ядрах опухолевых клеток. Количественное определение уровней экспрессии nm23 и продукции PAI-1 в первичной опухоли больных раком желудка после радикального хирургического лечения в сочетании с другими клиническими и морфологическими показателями позволят дифференцированно подходить к выбору методов адъювантного лечения этой категории пациентов и оценке прогноза болезни.

Апробация работы Материалы диссертации доложены на конференции «Национальные дни лабораторной медицины России-2005» (Москва, 11-14 октября 2005г.); на IX Российском онкологическом конгрессе (Москва, 22-24 ноября 2005г.); на Международной научно-практической конференции «Ведущий многопрофильный госпиталь страны: основные функции, достижения и направления развития» (Москва 1-2 июня 2006г.).

Диссертация апробирована 6 февраля 2007 г. на совместной научной конференции сотрудников лаборатории клинической биохимии, отдела патологической анатомии опухолей человека, хирургического отделения диагностики опухолей, торако-абдоминального отдела ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН, кафедры онкологии Московского государственного медико-стоматологического университета ФПДО.

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 6 научных работ.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Характеристика обследованных больных и методы исследований», главы результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и указателя литературы. Общий объем диссертации 163 листа машинописного текста. Указатель литературы содержит 234 работы отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 35 таблицами и 32 рисунками.

Выводы

1. Экспрессия белка пш23 в цитоплазме клеток рака желудка выявлена у 63% больных, а ядерная экспрессия этого белка обнаружена в опухолях 22% больных.

2. Цитоплазматическая экспрессия белка шп23 чаще выявлялась в аденокарциномах желудка, чем в перстневидноклеточном раке, а также в опухолях больных в возрасте до 50 лет по сравнению с опухолями больных старшей возрастной группы.

3. Ядерная экспрессия nm23 не была достоверно связана с основными клинико-морфологическими факторами, можно отметить лишь ее отсутствие в перстневидноклеточном раке желудка.

4. Многофакторный анализ взаимосвязи уровней иРА и PAI-1 в опухолях больных раком желудка с основными клинико-морфологическими характеристиками заболевания показал, что наиболее выраженная и достоверная связь наблюдается с возрастом пациентов, гистологическим строением опухоли и показателем Т; для tPA значимых взаимосвязей с клинико-морфологическими факторами не выявлено.

5. Взаимосвязи между уровнями иРА и экспрессией белка nm23 в цитоплазме и ядрах клеток опухолей больных раком желудка не выявлено. Концентрация PAI-1 в опухолях больных раком желудка также не была достоверно связана с уровнем экспрессии белка пш23 в цитоплазме и ядрах опухолевых клеток.

6. Отмечена положительная корреляция уровня tPA и интенсивности окрашивания цитоплазмы клеток антителами к nm23 (rs=0,4; р=0,01), взаимосвязи уровня tPA со степенью окрашивания ядер антителами к nm23 не обнаружено.

7. Из всех изученных показателей только высокий уровень медианы PAI-1 в опухоли (>0,6 нг/мг белка) является фактором неблагоприятного прогноза общей выживаемости больных раком желудка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рак желудка считается одной из наиболее важных проблем современного здравоохранения. В мире ежегодно регистрируется более одного миллиона новых случаев рака желудка и около 750 тысяч случаев смерти от этого заболевания (2-е место по показателям смертности после рака легких). Россия относится к странам с высокими показателями заболеваемости раком желудка - 33,4 случаев на 100000 населения (Давыдов М.И. и соавт., 2001).

Известно, что основным условием успешного лечения больных раком желудка является своевременная диагностика опухоли на ранней стадии опухолевого процесса. К сожалению, до настоящего времени результаты диагностики рака желудка в нашей стране нельзя считать удовлетворительными, что также в значительной мере относится и к странам Европы и США. Изучение ранних стадий заболевания является основой не только для улучшения результатов лечения рака желудка, но для понимания патогенеза и факторов риска возникновения опухолевого процесса. Существенный прогресс в диагностике и лечении раннего рака желудка достигнут в Японии, где показатели заболеваемости раком желудка наиболее высокие в мире, а показатели диагностики ранних форм рака впечатляющие - более 40-50% случаев опухолей диагностируется в ранней стадии развития опухолевого процесса, а показатели 5-летней выживаемости после хирургических и эндоскопических операций составляют 95%. По данным японских исследователеей это связано не только с совершенствованием методик хирургических вмешательств, но и в первую очередь с улучшением ранней диагностики. В России при высоком уровне заболеваемости только 5-10% случаев рака желудка диагностируется в ранней стадии, а у большинства пациентов выявляется запущенный опухолевый процесс, который требует помимо хирургического вмешательства, дополнительных лекарственных методов терапии. В настоящее время ни у кого не вызывает сомнения, что хирургический метод является самым важным и необходимым этапом в лечении большинства солидных опухолей, в том числе и рака желудка. Однако только с помощью хирургического удаления злокачественной опухоли избавиться от болезни часто бывает невозможно. Чем больше опухоль, тем больше вероятность развития метастазов.

В настоящее время интенсивно разрабатываются и внедряются в клиническую практику дополнительные молекулярно-биологические методы исследования, которые характеризуют степень агрессивности опухолевого процесса и, кроме того, позволяют индивидуализировать прогноз клинического течения и чувствительность опухоли к проводимой терапии. Среди них широкое распространение получили тканевые маркеры и, в частности, система активации плазминогена и белок nm23, экспрессия которых обнаружена во многих опухолях, в том числе и раке желудка.

Опухолевые клетки способны проникать в кровеносное русло и распространяться по всему организму. Инвазия и метастазирование являются основными проявлениями прогрессии опухоли, причем эти процессы взаимосвязаны (Огнерубов Н.А. и соавт., 2004). В настоящее время пристальное внимание исследователей направлено на изучение этих процессов. При этом некоторые процессы, связанные с механизмами инвазии и метастазирования опухолевых клеток, уже известны. К ним относится адгезия и межклеточное взаимодействие, протеолитическая активность и подвижность опухолевых клеток, а также неоангиогенез. Также немаловажную роль играет иммунная система организма, так как в результате ее толерантности некоторые клоны опухолевых клеток выживают и дают начало новым (вторичным) опухолям.

Известно, что процесс метастазирования довольно сложен и представляет собой ряд последовательных этапов. Так, чтобы образовать метастатическую опухоль клетка должна быть способна покинуть первичную опухоль, внедриться в ткани в другом месте и, наконец, выжить и пролиферировать. Для осуществления этого сложного процесса необходимо проникновение клеток в микроциркуляторное русло, прикрепление их в отдаленном кровеносном или лимфатическом сосуде, выход из сосуда в интерстиций и паренхиму органа с последующей пролиферацией и образованием метастатического очага. Все эти процессы тесно связаны с инвазивной способностью опухолевых клеток. Опухолевые клетки пенетрируют базальную мембрану и внедряются в подлежащий интерстиций. При этом известно, что сама базальная мембрана представляет собой сеть коллагена IV типа, протеогликанов, гликопротеинов и в норме не содержит пор, достаточных по размеру для прохождения злокачественных клеток. Таким образом, инвазия базальной мембраны является активным процессом и опухолевым клеткам необходимо пройти через внеклеточный матрикс в ходе процессов инвазии и метастазирования. Для более быстрого прохождения опухолевые клетки способны секретировать и выделять в окружающую среду ряд протеолитических ферментов, которые способны разрушать межклеточное вещество и базальные мембраны, в состав которых входят следующие белки: коллаген, эластин, ламинин и др.). В некоторых случаях опухолевые клетки сами не образуют протеаз, а привлекают макрофаги, фибробласты и нейтрофилы, которые способны выполнять за них инвазивную функцию.

В настоящее время известны 4 класса протеаз, участвующих в процессах опухолевой инвазии: 1) металлопротеиназы (коллагеназы, желатиназы, стромелизины); 2) цистеиновые протеиназы - катепсины В и L; 3) аспартиловая протеаза (катепсин D); 4) сериновые протеазы -плазмин, активаторы плазминогена урокиназного и тканевого типов. Некоторые их этих протеаз выделяются опухолевыми клетками во внеклеточное пространство (коллагеназа), другие оказываются связанными с поверхностью клеток (протеазы, деградирующие фибронектин внеклеточного матрикса). Для некоторых протеаз обнаружен рецептор на поверхности клетки, и поэтому они могут находиться как в связанном, так и в свободном состоянии (иРА). Кроме веществ, активирующих протеолиз, в ткани опухоли и в плазме крови присутствуют вещества, специфически ингибирующие действие этих ферментов. К ним относятся тканевые ингибиторы металлопротеиназ и ингибиторы активаторов плазминогена. В настоящее время уже известны два ингибитора активаторов плазминогена - PAI-1 и PAI-2. Причем, с увеличение экспрессии PAI-1, повышается риск возникновения метастазов и рецидива опухоли, а повышение уровня PAI-2 в ткани опухоли коррелирует с благоприятным прогнозом опухолевого процесса. Это явление объясняется тем, что PAI-1 защищает саму опухоль от разрушающего действия протеаз (Constantini Y., 1996). В последние годы все большее число публикаций свидетельствует о существенной роли плазминогена в развитии опухолевого процесса, а точнее в механизмах инвазии и метастазирования. Следовательно, необходимо проведение дополнительных исследований по изучению факторов, биологически активных веществ, которые способствуют развитию, инвазии, метастазированию и прогрессии опухолевого процесса.

В последние годы пристальное внимание исследователи уделяют изучению экспрессии белка nm23 (Yeung P. et al., 1998; Yoo С.Н. et al., 1999; Lee K.E. et al., 2003), который считают одним из важных маркеров, тесно связанных с процессами клеточной пролиферации и контролем метастазирования при различных опухолях, в том числе, и при раке желудка (Ji S.Q. et al., 2002; Lee K.E. et al., 2003). При этом отмечены довольно сложные взаимоотношения между появлением в раковых клетках белкового маркера и метастатической активностью опухоли (Kumar D.D. et al., 1999; Nesi G. et al., 2001). Следует отметить, что гиперэкспрессия белка пш 23 обнаружена в различных злокачественных опухолях человека, таких как рак легкого, колоректальный рак, меланома, рак молочной железы, желчного пузыря, гортани. По данным некоторых авторов показано, что экспрессия nm23 в злокачественных опухолях желудка ассоциируется с неблагоприятным прогнозом болезни (Muller W. et al., 1998; Nesi G. et al., 2001). Клиническая значимость экспрессии nm23 и особенностей продукции основных компонентов системы активации плазминогена в опухолях желудка начинают только интенсивно изучаться. Однако по данным предварительных клинических исследований установлено, что уровень и соотношение экспрессии различных компонентов системы активации плазминогена в опухоли может служить показателем ее метастатической и инвазивной активности, а следствие этого и биологически значимым фактором прогноза (Герштейн Е.С. и соавт., 2004; Огнерубов Н.А. и соавт., 2004).

Изучение системы активации плазминогена проводили при различных опухолях у человека: при колоректальном раке (Голубченко О.В., 2004), раке желудка (Щербаков A.M. и соавт., 2002; Ognerubov N.A. et al., 2003), молочной железы (Герштейн Е.С. и соавт., 2004), пищевода (Кушлинский Н.Е. и соавт., 2002), опухолях костей (Юсифов А.И., 2001), новообразованиях щитовидной железы (Харидити Т.Ю. и соавт., 2002). При этом, исследователям удалось выявить в большинстве злокачественных опухолей различного гистогенеза значительное увеличение концентрации иРА и PAI-1 по сравнению с гомологичными нормальными тканями и доброкачественными новообразованиями (Gershtein E.S. et al., 2002).

Система активации плазминогена представляет собой протеолитический каскад, участвующий в разрушении окружающей опухоль базальной мембраны и внеклеточного матрикса, способствуя выходу опухолевых клеток из их первоначального окружения и образованию опухолевых узлов в отдаленных органах и тканях (Герштейн Е.С. и соавт., 2002). Ключевыми компонентом этой системы является сериновая протеаза - активатор плазминогена урокиназного типа (иРА), которая расщепляет плазминоген до плазмина (Огнерубов Н.А. и соавт., 2005). Плазмин уменьшает уровень внеклеточных матричных гликопротеидов и активирует некоторые про-металлопротеазы, что играет решающую роль в процессах инвазии и метастазирования (Mignatti P. et al., 1993). В ранних исследованиях изучение системы активации плазминогена в опухолях и окружающей слизистой больных раком желудка показало, что уже на ранних стадиях заболевания проявляется характерное для большинства злокачественных опухолей усиление активации плазминогена по урокиназному типу. Известно, что активность иРА регулируется несколькими способами, в частности, подавляется двумя белковыми ингибиторами класса серпинов - PAI-1 и PAI-2 (Andreasen Р.А. et al., 1990). Помимо иРА в активации плазминогена может участвовать также активатор тканевого типа (tPA), однако, его роль при развитии опухолей, по-видимому, противоположна роли иРА и сводится к разрушению опухолевых клеток и защите окружающих тканей от распространения опухоли (Bell W.R., 1996).

Уровень и соотношение экспрессии различных компонентов системы активации плазминогена в опухолевой ткани может служить показателем метастатической и инвазивной активности опухоли, являясь вследствие этого биологически значимым фактором прогноза при различных новообразованиях (Герштейн Е.С. и соавт., 2001, 2004; Duffy

M.J. et al., 1999). Кроме того, подавление активации плазминогена по урокиназному типу может стать одним из подходов к разработке новых схем антиметастатической терапии (Schmitt М. et al., 1997).

Несмотря на то, что исследования системы активации плазминогена проводили при различных опухолях, большинству исследователей удалось выявить общую закономерность, заключающуюся в том, что в злокачественных опухолей различного гистогенеза происходит значительное увеличение концентрации иРА и PAI-1 по сравнению с гомологичными нормальными тканями и доброкачественными новообразованиями. Все это может иметь как теоретическое, так и практическое значение. С одной стороны, оно свидетельствует о том, что усиление активации плазминогена по урокиназному типу, сопровождающееся усилением защиты опухолевых клеток от саморазрушения (за счет увеличения уровня PAI-1), является достаточно универсальным признаком малигнизации. С другой стороны, повышенная экспрессия иРА в опухоли по сравнению с окружающей тканью делает этот фермент перспективной избирательной мишенью для антиметастатической противоопухолевой терапии, характеризующемся достаточно низкой чувствительностью к стандартным видам химиотерапии.

Прогноз рака желудка определяет целый ряд клинико-морфологических и молекулярно-биологических факторов. В настоящее время известно большое количество молекулярно-генетических маркеров опухолей, которые являются показателями биологической активности раковых клеток и могут быть использованы в качестве прогностических критериев в онкологической клинике. Наличие или отсутствие экспрессии отдельных маркеров делает возможной более точную оценку такого сложного, комплексного, многоступенчатого процесса как метастазирование опухоли. Вместе с тем, значение большинства этих факторов окончательно не изучено.

Настоящее исследование посвящено изучению экспрессии белка пш23 и содержания основных компонентов системы активации плазминогена в опухолях больных раком желудка для оценки их взаимосвязи с основными клиническими и морфологическими характеристиками заболевания, прогнозом. В работе использованы современные высокочувствительные иммуноферментные методы определения тканевых молекулярно-биологических маркеров в опухоли у 108 больных раком желудка, прошедших обследование и лечение в Воронежском областном клиническом онкологическом диспансере и НИИ клинической онкологии ГУ Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН с 2001 по 2005 гг.

По данным настоящего исследования обнаружено, что содержание иРА в цитозольной фракции опухолей желудка колебалось в довольно широких пределах - от 0,01 до 1,34 нм/мг белка. При этом не было выявлено связи продукции иРА с учетом пола обследованных пациентов и весь последующий анализ полученных результатов проводили в общей группе больных. Представленные нами данные подтверждают исследования других авторов, которые так же выявили широкий разброс иРА в опухолях желудка (Nekara Н. et al., 1994, 1998). Результаты изучения уровня антигенов tPA и uPA Y.Umehara et al. (1991) в экстрактах 30 карцином желудка и непораженной опухолевым процессом нормальной слизистой показано, что уровень tPA был выше в нормальной слизистой, а иРА - в опухоли. Кроме того, при сравнении уровней иРА в опухолях обследованных нами больных раком желудка с учетом стадии процесса обнаружены достоверные различия. Так, у больных с ранней стадией 1Б значения иРА были наименьшими (медиана 0,07 нм/мг белка), у пациентов II и IIIA стадиями медианы составили 0,2 и 0,41 нм/мг белка, соответственно. У больных с ШБ стадией медиана уровней иРА была больше в 5,9 раз по сравнению с пациентами 1Б стадией, а у больных с IV стадией медиана уровней иРА также была выше (0,17 нм/мг белка), чем у пациентов в 1Б стадии. Таким образом, с увеличением стадии заболевания содержание иРА в цитозольной фракции опухолей достоверно увеличивалось.

Кроме того, анализ значений иРА с индексами системы TNM показал, что средние значения иРА в опухолях больных раком желудка повышались при увеличении индекса (Т), значение медианы

126 | увеличивалось в 2,7 раза при индексе (Т4) по сравнению с группой больных с индексом (Т2). Однофакторный дисперсионный анализ сравнения средних значений иРА с учетом индекса (Т) показал, что различия тенденциозны (р=0,05), однако при учете множественности сравнений выявлено достоверное различие между группами пациентов T2-T4 (р=0,02) и Т3-Т4 (р=0,05). Аналогичная закономерность изменения средних значений иРА выявлена и при увеличении индекса (N). При изучении уровней этого индекса с учетом наличия прорастания опухоли в соседние органы, и состояния слизистой желудка выявили, что наиболее высокие уровни иРА выявлены при прорастании опухоли в соседние органы (медиана составила 0,82 нм/мг белка) и изъязвлении слизистой (медиана 0,53 нм/мг белка). Медиана иРА была наиболее низкой у больных без прорастания всех слоев стенки желудка или изъязвления слизистой (0,15 нм/мг белка). Следует отметить, что по данным Y.Umehara et al. (1991) и Y.Okusa et al. (2000) uPA был также выше в опухолях желудка с инвазией сосудов, метастазами в печени или канцероматозом брюшины. А по данным N.Tanaka et al. (1991) самое высокое соотношение uPA/(uPA+tPA) наблюдалось в центральной части опухоли желудка, уменьшалось к периферии, и было самым низким в нормальной слизистой оболочке органа. Представленные нами данные и анализ отечественной и зарубежной литературы показывают, что высокий уровень экспрессии иРА в опухолях желудка следует считать универсальным признаком злокачественного процесса, поскольку большинство исследователей выявили высокие значения иРА в цитозольной фракции многих опухолей человека (рак молочной железы, колоректальный рак, рак печени, матки, яичников). Группа итальянских исследователей убедительно показала, что иРА является не только активным участником в процессах инвазии и роста рака желудка, но и в процессе прогрессии предраковых заболеваний желудка в злокачественную опухоль (Farinati F. Et al., 1996). Авторы пришли к заключению, что усиление экспрессии иРА при предраковых заболеваниях желудка (хроническом атрофическом гастрите с дисплазией) может способствовать процессам опухолевой трансформации. Подтверждением этому могут быть результаты проведенного анализа показателей иРА с учетом степени дифференцировки рака желудка. Так, по данным настоящего исследования показано, что средние значения иРА и его медианы у больных раком желудка с учетом степени дифференцировки опухоли были самые низкие в аденокарциномах с высокой степенью дифференцировки (медиана 0,12 нм/мг белка). Самые высокие уровни иРА обнаружены в опухоли больных с умеренной степенью дифференцировки аденокарцином (0,53 нм/мг белка). И несмотря на то, что эти различия были недостоверными, тем не менее, эта тенденция нами была отмечена. Несмотря на то, что не было выявлено достоверных различий в показателях средних значений иРА и его медианы в группе больных аденокарциномой по сравнению с больными перстневидноклеточным раком желудка. У женщин, в отличие от мужчин, нами выявлен факт повышения концентрации иРА в цитозольной фракции аденокарцином, по сравнению с перстневидноклеточным раком желудка. Объяснение этому может быть связано с различным гормональным фоном пациентов, кроме того, ранее было показано, что рак желудка мужчин и женщин отличается по уровню рецепторов эстрогенов в опухоли.

Многофакторный анализ связи изучаемых признаков с изменением уровней иРА в опухолях больных раком желудка показал, что наиболее важными оказались такие признаки как пол совместно с локализацией опухоли (р=0,0008), возраст пациентов (р=Ю,002), а также гистологическое строение опухоли (р=0,013) и индекс (Т) (р=0,02).

Клиническое значение tPA при раке желудка значительно менее изучено, чем роль остальных компонентов урокиназной системы. Вместе с тем, нами обнаружено, что показатель tPA у больных в опухолях изменялся в широких пределах - от 0,01 до 2,36 нм/мг белка, а в 25,9% наблюдений он был равен нулю. При этом, средние уровни tPA в опухолях желудка у мужчин и женщин достоверно не различались (р=0,4), а при учете стадии заболевания также не было выявлено достоверных различий в показателе tPA. Индексы (Т) и (N), а также степень дифференцировки опухоли не были связан с изменением уровней tPA. Как и при анализе показателей иРА в опухолях желудка значения tPA не были связаны с локализацией рака в органе. Вместе с тем, во всех возрастных группах больных раком желудка средние уровни tPA у мужчин были примерно в 2 раза ниже, чем у женщин, а дисперсионный анализ показал, что возраст был связан с изменением уровней tPA в опухолях как у мужчин, так и у женщин. Однако, достоверное различие уровней tPA (р=0,014) наблюдали только у мужчин старше 65 лет (0,2±0,06 нм/мг белка, медиана - 0,29 нм/мг белка) по сравнению с более молодыми пациентами (0,60±0,08 нм/мг белка, медиана - 0,55 нм/мг белка). В группе женщин такой закономерности выявлено не было. При этом, у мужчин выявили достоверную обратную корреляционную зависимость между уровнями tPA в опухолях и их возрастом (rs=-0,39 [95% С1=0,7-0,63]; р=0,017), причем у больных с низкой степенью дифференцировки рака желудка зависимость усиливалась до значения (rs=-0,71 [95% С1=0,4-0,86]; р=0,0002), а при индексе (N0) эта зависимость была максимальной (rs=-0,85 [95% С1=0,57=0,95]; р=0,0001). В группе женщин возраст не был связан корреляционной зависимостью с изменением уровней tPA в опухолях.

Таким образом, в опухолях больных раком желудка при однофакторном анализе нами выявлено достоверное уменьшение уровней tPA в группе мужчин старше 65 лет. При многофакторном анализе изменений уровней tPA в опухолях достоверные различия выявлены только при совместном проявлении таких признаков как пол, возраст и показатель Т (р=0,049).

Особое внимание в клинических исследованиях уделяется ингибиторам активаторов плазминогена и, в частности, PAI-1 в оценке прогноза некоторых опухолей человека. Первое сообщение об активности PAI-1 и его прогностической значимости при раке молочной железы было опубликовано в 1991 году Janicke F. et al. (1991). Высокие уровни PAI-1 свидетельствовали о неблагоприятном прогнозе болезни. Работ по исследованию PAI-1 при раке желудка немного. Полученные нами результаты показали, что PAI-1 выявлен практически во всех обследованных опухолях, однако колебания концентраций PAI-1 в цитозольной фракции рака желудка были наиболее выраженными по сравнению с иРА и tPA. Показатели PAI-1 не зависели от пола пациентов, но были связаны со стадией опухолевого процесса. Так, при стадии 1Б медиана PAI-1 была наименьшей (0,12 нм/мг белка), а при стадиях ШБ и IV медианы показателя возрастали в 5-8 раз. Подобные закономерности были выявлены в работах зарубежных авторов. Высокодостоверно (р=0,00006) различались уровни PAI-1 при учете индекса (Т): медиана PAI-1 при (Т3) была в 1,7 раза (р=0,01), а при (Т4) -в 5,2 раза выше по сравнению с индексом (Т2) (рЮ,0003). Наибольшее значение PAI-1 в опухоли желудка (9,7 нм/мг белка) было отмечено у больного раком желудка с индексом (Т4). Вместе с тем, индекс (N), так же как и локализация опухоли в органе и ее гистогенез, степень дифференцировки не были достоверно связаны с изменением уровней PAI-1 в опухолях пациентов раком желудка. Таким образом, нами обнаружено, что повышенные уровни PAI-1 в опухолях больных раком желудка отмечены при поздних стадиях заболевания, у больных аденокарциномой, в возрасте старше 70 лет. Многофакторный дисперсионный анализ выявил, что достоверное повышение уровней PAI-1 было связано только с индексом (Т) (р=0,0014).

Вместе с тем, анализ корреляционных зависимостей между уровнями uPA, tPA и PAI-1 в опухолях больных раком желудка с учетом основных клинических признаков выявил достоверную положительную зависимость между показателями иРА и PAI-1 (г=0,69; р=0,0001). Стало быть, при увеличении уровней иРА в опухоли желудка одновременно нарастали и показатели PAI-1. Зависимость была одинаково характерна как для мужчин, так и для женщин. Эта закономерность проявлялась при всех стадиях индексы (Т) и (N), при всех локализациях, при учете гистогенеза опухоли, но не зависела от степени дифференцировки и возраста пациентов и, таким образом, эта закономерность была свойственна всем больным раком желудка.

Зависимость между уровнями иРА и tPA также была значимой (г=0,43; р=0,005). При этом, у женщин зависимость усиливалась до значения г=0,81 (р=0,001). Показатель tPA был связан с PAI-1 также достоверной корреляционной зависимостью в опухолях больных раком желудка (г=0,57; р=0,0001), и также более выраженной в группе женщин (г=0,98; р=0,0001).

Для выявления структуры связей между признаками нами проводился «факторный анализ» с использованием метода выделения главных компонент и было выделено 3 общих фактора, которые, наиболее полно характеризовали общую группу больных раком желудка. Рост индекса (Т) сопровождался повышением уровней PAI-1. Гистологическое строение и степень дифференцировки опухоли были связаны с полом больного. Показатели иРА и tPA изменялись согласованно. В то же время при проведении факторного анализа отдельно в группе мужчин и женщин выявили некоторые особенности в указанных связях. Так, для мужчин было характерно в большей степени согласованное увеличение показателей Т, PAI-1 и иРА. Изменение показателя tPA было связано с возрастом. Локализация опухоли была связана с гистологическим ее строением.

В то же время в группе женщин первым и наиболее важным общим фактором было согласованное изменение в опухолях показателей PAI-1, uPA, tPA независимо от других признаков. Индекс (Т) был связан с локализацией и гистологическим строением опухоли, а степень ее дифференцировки - с возрастом пациенток.

Таким образом, нами выявлены значительные различия в характере связей основных показателей системы активации плазминогена в опухолях мужчин и женщин, больных раком желудка и их зависимости с другими клиническими и морфологическими признаками болезни.

Помимо основных компонентов системы активации плазминогена, одним из потенциально важных маркеров, тесно связанных с процессами клеточной пролиферации, дифференцировки и контроля метастазирования, является белок nm23 (Pal S. et al., 2004). При этом стало известно, что ген пш23 играет важную роль в защите организма от прогрессирования злокачественных опухолей. Следует отметить, что представленные результаты по изучению пш23 указывают на сложные взаимоотношения между появлением в опухолевых клетках белкового маркера и их метастатической активностью, с неоднозначным отношением к действию этого белка (Wang C.S. et al., 2002; Gao Q.L. et al., 2004).

Нами проведен иммуногистохимический анализ уровня экспрессии белка пш 23 в 108 злокачественных эпителиальных опухолях желудка и одновременно изучали концентрацию основных компонентов системы активации плазминогена (uPA, tPA, PAI-1) в цитозольной фракции этих опухолей. Экспрессия белка пш23 проявлялась в виде диффузного, гомогенного окрашивания цитоплазмы опухолевых клеток. По интенсивности экспрессии белка шп23 в цитоплазме клеток опухоли больные были разделены на 3 группы: 1) отсутствие экспрессии или очень слабая экспрессия, 2) низкий уровень экспрессии, 3) высокий уровень экспрессии. В настоящем исследовании накопление белка nm23 (низкий и высокий уровень экспрессии) выявили в 68 образцах цитоплазмы клеток опухолей (63,0%). При этом, наибольшее число опухолей было с низкой экспрессией (37,0%) белка nm23 в цитоплазме клеток. Отсутствие экспрессии было у 11,1% больных, а высокий уровень экспрессии - у 25,9% больных. Пол больных не был связан с уровнем экспрессии белка nm 23 в цитоплазме клеток опухоли. Таким образом, на основании полученных нами результатов исследования, а также по данным зарубежной литературы экспрессия белка nm23 в злокачественных эпителиальных опухолях желудка неоднородна и у большинства пациентов она низкая или отсутствует. Кроме того, нами не выявлено связи экспрессии пш23 с индексами (Т) и (N). И, в отличие от опухолей, локализованных в теле желудка, экспрессия nm23 в карциномах антрального отдела желудка выявлялась крайне редко или была сниженной. Также, у преобладающего числа больных, опухоли которых имели строение перстневидноклеточного рака, экспрессия белка nm23 не выявлялась или была крайне низкой. Следовательно, снижение экспрессии nm23 характерно для низкодифференцированных опухолей, которые имеют крайне неблагоприятное клиническое течение и прогноз.

Интересен факт увеличения частоты выявления экспрессии nm23 в опухолях больных в более молодом возрасте (до 50 лет). Причем эта закономерность была характерна как для мужчин, так и для женщин. Уровни иРА недостоверно изменялись при изменении окрашенности цитоплазмы клеток, однако медиана показателя иРА была наиболее высокой (0,23 нм/мг белка) у больных раком желудка с высоким уровнем экспрессии nm23 в цитоплазме клеток опухолей. Эти различия в группе женщин были более выражены, хотя также недостоверны. Так, например, медиана иРА у женщин с высоким уровнем экспрессии nm23 в цитоплазме клеток опухолей в 2,8 раза превышала уровень иРА в опухолях женщин с отсутствием экспрессии белка nm23 в цитоплазме клеток. Не было выявлено корреляционной зависимости между уровнями иРА и экспрессией белка nm23 в цитоплазме клеток опухолей больных раком желудка как в общей группе, так и в группах с учетом других клинических признаков болезни.

Концентрации tPA в цитозольной фракции опухолей желудка не изменялись при различной степени окрашенности цитоплазмы клеток антителами к nm23 (р=0,3), однако медианы увеличивались с ростом интенсивности окрашивания. Кроме того, была выявлена слабая, но достоверная корреляционная зависимости между уровнями tPA и экспрессией белка nm23 в цитоплазме клеток опухолей больных раком желудка в общей группе (rs=0,34; р=0,01). С увеличением экспрессии белка шп23 в цитоплазме опухолевых клеток отмечено снижение продукции этими клетками его ингибитора - PAI-1 (р=0,9).

Таким образом, анализ экспрессии белка nm23 в цитоплазме клеток опухолей больных раком желудка с учетом показателей системы активации плазминогена показал, что при высокой экспрессии белка концентрации tPA достоверно, а иРА недостоверно были выше.

В 24 из 108 (22,2%) опухолей было выявлено окрашивание ядер опухолевых клеток антителами к nm23. Показатели иРА и tPA не отличались между опухолями желудка с окрашенными и не окрашенными ядрами клеток. При этом, в случаях перстневидноклеточного рака желудка, окрашенные ядра отсутствовали во всех опухолях, при аденокарциномах желудка таких наблюдений было значительно больше (30%). Различия статистически достоверны (р=0,03). Степень дифференцировки аденокарцином желудка не была связана с наличием окрашенности ядер клеток опухоли (р=0,9).

Факторный анализ показал, что в опухолях больных раком желудка индекс Т был связан с окрашенностью ядер раковых клеток и показателем РА1-1 в опухоли (39,8% общей дисперсии), а окрашенность цитоплазмы клеток опухоли была связана с иРА и tPA (22,0% общей дисперсии).

Таким образом, в настоящем исследовании получены данные, указывающие на связь уровней экспрессии белка пш23 в цитоплазме и ядрах клеток опухоли с основными показателями, характеризующими систему активации плазминогена, а также со стадией заболевания индекс (Т). Дальнейшее изучение этих зависимостей, возможно, позволит разработать методы коррекции возникающих нарушений у больных раком желудка.