Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Адсорбция иммуностимулирующих полиионов и полимер-белковых конъюгатов на поверхности лимфоидных клеток: изотерия, кинетика, обратность

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ ИНСТИТУТ ККМУНОЛогии

На правая рукописи

ПОСПЕЛОВА Ольга леоЕмдоЕпа

АДСОРБЦИЯ ШШУНОСТИНУЛНРУШИХ ПО/КИОКОО И ПО/ШНЕР-НЕ/ЕОК;:; КОНЪЮГАТОВ НА ПОВЕРХНОСТИ ЛШМОЯЯШ КЛЕТОК: КЗОТЕРШ, ЬЙ-НЕТНКА, ОНРАТИЙОСТЬ.

14.00.36 - Аллергология и 15нмунояогия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нагчный консультант: чл&н-корр. Раин профессор ?. и. хаитоз

Научяхя руководитель: доктор медиииясннз наук. , профессор Р. й. Атауллаханов.

Москва 1992

/ / . ? л /

Работа выполнена в лаборатории активадха Еннукатетс. Иаспггута иииунолопш Министерства Здравоохранения России.

Научны: консультант: член-корреспондент АНН ■ профессор Хаитов р. Н.

Натчшя руководитель: доктор медицинских наук, профессор Атауллаханов Р. и.

Официальные оппонента: доктор медицинских наук, профессор,

Пикет ни Б. в.

член-корреспондент ЛЕИ.

профессор арион в. Я.

Вэдушэе учреждение: - Институт эпидемиологии и микробиологи: им. н. Ф. Гаиалеи дин

Закита диссертации состоится "___"__________1992г. в____час.

на заседании специализированного совета Д 074.09.01 при Институте иммунологии Минздрава России по адресу: 115478, г. косква. Кавирское восс?е. д. 24. корп. 2.

с диссертацией нохно ознакомиться в библиотеке Института имиук' лопш Кинздрава России.

Автореферат разослан "___"__________ 1992г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор наук.

Колобов А. В.

-г-

q Актуальность тени. Начиная с 1973 гола, ведется интенсивное мучение свойств полиэлектрояитоь - водорастворимых полимерных юлекул. имеющих множественные иоиогеннне группы (Cone R.. XoK.ison А. 19Т2: Diamant stem Т.. 1973; Зенсков в. н. . 1973; Петров ».В.. Хаитов Р. н., кабанов в. А. и др.. 1974-1986). введение по-киэлектролитов экспериментальным животнын приводит к активапга «которых звеньев кроветворения и инмгаитета (Хаитов Р. Н. и др.. 1975- 19Т7; нажмитдинов a.m.. i960, 1981). Такое действие юлиэлектролитов, в конечном счете, реализуется как в виде обшей .тинуляпии г'мунитета, особенно у ослабленных животных (Батыр-5еков А.А.. Хаитов Р.и.. 1975, 1976)., так в виде усиления он-<ретной иммунной реакпии на слабый ккнуноген (Петров р, В. и др. , 1975-19Т7). возможность синтеза подобных полимерных соединения, se обладают« токсичность» (Некрасов А. В. и др., 1983-1990). определила перспективность и успех данного научного направления. 3 ранках этого направления возник и успешно развивается принципиально новый подход к созданию иннуногеюв и вакцин путей химического соединения антигенного начала с полнэлектролитным иммуностимулятором (Петров Р. В., Хаитов Р. н.. Кабанов в. А. и др.. 1977-1 ^бб; Филатова Е. д.. кожинова Е. в. и др.. 19Т7; хаусто-ваЛ. И.. савш.ова и. в. и др., 1978-1960; Норимов А. ш., НустаФаев я. и., 1978-1981; Виноградов и. в., Некрасов А. В. и др., 1981-1982; яиознер л. л.. фонина л. и. и др.. 1985; Алексеева н. ю.. Апарин п. г.. Яекрасов А. В. и др. , 1983-1984; Петров Р. В., Хаитов Р. М. , Семенов Б. Ф. и др.. 1964; Норимов а. й., Синяков м.с. и пр., 19S4; «ельников С. Я,. Пучкова Н. Г.. виноградов И. В. и др. , 1966, 1937) Серия специальных исследований была проведена с цель» рас-зшфровки механизмов актнвируюаего влияния полиэлектролитов на клетки иммунной системы (Хаитов Р. и., Атауляаханов Р. И. ■ 1981-1987). Установлена не только природа клеток, реагирующих на ге или иные полимеры, но и суть реакции отдельно взятой клетки. Обнаружены также ключевые молекулярные события в номент взаимодействия полимера с клеткой, от которых зависит, ответит клетка на экзогенный полимер или нет. Доказано, что для активации клетки полимером решавшее значение имеет изменение ионпроводяших свойств клеточной мембраны (Атауллаханов Р. И. и др. . 1983. 1984). оно происходит в первые десятки секунд и сопровождается явными структурныни изменениями в клеточной мембране, в частности, агрегацией менбранных белков (Григорьев в. Б.. и др., 1965).

в связи с установлением ключевой роли изменений в клеточной мембране, происходящих в первые минуты, становится важный более детальное изучение ранних этапов взаимодействия полимеров с клеткой и, в частности, процесса сорбции полимерных молекул на

клеточной мембране. Во-первых, необходимо было зарегистрирова собственно Факт сорбции молекул иммуностимулирующего полимера менбране. во-вторых, следовало охарактеризовать это событие к чественно (распределение полимера в конпартментах клету. т пограФия распределения полимера на клеточной поверхности и т. г и количественно (изотерма адсорбции, кинетика адсорбции и др. В-третьих, предстояло исследовать степень обратимости сорбит возможность десорбции и ее кинетику, реакции обмена между сор« рованными и свободными моле^лани полим^-а, реакции интерполк мерного взаимодействия между сорбированными молекулами и npoi вололозшо заряженными полимерными вешестваии, внесенными в о? локлеточную среду, В рамках проблемы обратимости взаимодейст! полимер-клетка нужно было ответить на еше один очень важный вс рос: возможен ли переход молекул иммуностимулируюшего полиионг поверхности одной клетки - на другую, а затем на третью и i далее. Этот вопрос приобрел принципиальное значение, ког Р. В. Петровым, В.А.Кабановым, Р. И. Хаитовым и соавтор; (1976-1963) было установлено, что введение in vivo химичесь коныогатов антиген-полиион вызывает более интенсивную иммуннз реакцию, специфическую в отношении данного антигена, чем вве; ние этого же антигена без полииона. авторы предположили, что i нъюгат антиген-полиион мигрирует с поверхности одной клетки -другую, третью и я^пее до тех пор. пока не встретит клетку, го юшую в мембране рецептор для данного антигена. Именно на этс антигенспеиифической. клетке коньюгат задерживается и именно : клетку он активирует, очевидно, что признание такого механи: требует допущения о достаточно быстрых переходах молекул полш ра (в составе антиген-полимерного коныргата) с поверхности од! клетки на другую, прямая проверка такого допущения, эксперим« тальный анализ возможности "перехода" с клетки - на клетку moj кул иммуностимулирующего полииона. а также молекул ковалентн< конъюгата антиген-полиион представлялись весьма интересными и туальными а свете отмеченного выше.

Цель исследования.

Целью исследования было детальное изучение процесса адсо] пии иммуностимулирующих полиионов, а также конъюгатов белок-i лиион на иммуноконпетентных клетках.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Качественно охарактеризовать взаимодеиствие полиионо. с лимфоидными клетками: установить локализацию полимера в клетке в первые кинуты после их взаимодействия.

2. Количественно охарактеризовать процесс адсорбции нолии нов катионной и анионной природы на тинопитах и клетка:

селезенки: изучить кинетику и изотерму адсорбции поли-

о

аниона и поликатиона; степгнь обратимости связывания по-лизле^тролитов с клеточной поверхность»: исследовать возможность перехода молекул полииона с поверхности одной клетки - на другую.

3. Исследовать параметры процесса адсорбции белок-полимерных коньюгатов на линФоидных клетках, имеющих и не имевших сп циФическиэ рецепторы к белковой части коныогатов.

Научная новизна исследования.

В работе выявлен факт мембранной локализации Флуоресцентно меченых полианиона (сополимера акриловой и метакриловой кислот) и поликатиона толи-Ь-лизина) при взаимодействии с лдаФоид»1чч клетками. Впервые показано, что топография распределения пслна-ниона характеризуется равномерным окрашиванием клеточной поверхности, а поликатиона, напротив, ярко выраженной неравномерностыо-в виде одного-двук ярких участков, размером около о,1-1,0 мкм

Впервые детально изучена кинетика адсорбции исследуемых поли электролитов на клетках селезенки и клеткак тимуса. Обнаружено. что в: имодеиствие протекает уже в монент добавления полимера в околокле- 'ЧНУ» среду, накопление макромолекул на поверхности клеток завершается практически полностью в течение первых пяти минут.

Впервые полученные изотермы адсорбции исследуемых полимеров на лимфоидных клетках описываются б-образноя кривой с участком крутого польема и областью насыщения. При этой показано, что добавление в систему свободного белка, бычьего сывороточного альбумина. выявляет отличия в адсорбции поликатиона и полианиона.

Принципиально важным является вопрос о степени обратимости сорбции макромолекул полимера на клеточной поверхности. В данной работе впервые использовались разные подходы для опенки степени обратимости: изучалась десорбция полимера с клеток при удалении его из околоклеточной среды: реакция обмена мезлу полимером. адсорбированным на клетке, и идентичным Флуоресцентно меченным полимером в среде: десорбция при добавлении противоположно заряженного полиэлектролита.

Впервые проведено детальное исследование возможности перехо- \ да макромолекул полимера с поверхности одних клеток на поверхность других интактнш клеток. Зарегистрировано наличие таких переходов, изучена динамика данного процесса. Выявлены различи? нежду полианионом и поликатионом в динамике переходов с клетки на клетку.

Наконец, в работе впервые была использована модельная систе-

на, позволяющая исследовать взаимодействие коньюгатов пол! иер-белок с клетками,. имеющими и не имеюшини специфических pi аепторов к белковой компоненте коныогата. в качестве клеток, ci эываюших и не связываюиих белковую компоненту коныогата. соо' ветственно использовали В-лимФоциты. несущие 1в-ре"»пторы. и т моциты. их не имеющие. Установлено, что ковалентное соединение полианиона с антиинмуноглобулинон не оказывает существенного в ния на специфическое взаимодействие антииммуноглобулина с Ig-P цепторами. напротив, присоединение поликатиона к антииммуногло линам существенно нарушает сг цифичность адсориии антииммуногл булина на в-клетках. Так. коныэгат антииннуноглобулин-лоликати сорбировался неспецифически и на клетках (тимоцитахь лишенных 18-рецепторов. При этой не удавалось выявить предпочтительно связывания конъюгата антииммуноглобулин-поликатион на В-клет по сравнению с тиноцитани.

Научно-практическая ценность. Методы и подходы, использованные при изучении процесса вэ; модейсгвия полиионов-иммуностимуляторов с клетками иммунной сi тены. окажутся полезными для иссле ователеи, закимашихся пр< лемои активации иммунитета с применением полимерных соединен™ Новые научные «акты, представленные в диссертации, дополн! современные представления о тонких неханизнах активации имму] тета полизлектролитами. Обнаруженные > азличия в поведении по, катиона и полианиоь . при адсорбции на лимФоидных клетках, в ч ности, негативное влияние поликатиона в составе конъюгата специфичность реакции антиген - клеточный рецептор, наруше агрегативнои устойчивости клеточной суспензии в присутствии ликатиона. позволяют рекомендовать полимеры не катионной. а а онной природы для конструирования новых полимерных имиуности ляторов. а также имнуногьнов на их основе.

Публикация результатов исследования и апробация работы. Работа апробирована в Институте иммунологии Минздрава С на совместной научноя конференции лаборатории генного конп иммунного ответа, лаборатории лекарственно диагностических фс лаборатории Физических методов исследований в иммунологии, л; ратории искусственных антигенов.

по теме диссертации опубликовано 5 работ. Основные резул) ты были представлены и одобрены на 7 международном конгрессе мунологов (Западный Берлин, 19в9i, на 3 зимнем углубленном к: се по иммунологии и инфекционным заболеваниям (Токио, 1991 на 1 Всесоюзном конгрессе иммунологов (Дагомыс, 1989).

.Объем работу, работа написана по общепринятому плану, ит из введения, обзора литературы, изложения материалов и м

а&в. собственных исследований, обсуждения результатов. выводов и списка антиг 'енол литературы, вилмаютего источников, из них отечественных авторов. Работа изложена на стр. машинописи.

- J-

МАТЕРИАЛЫ И НЕТОДЫ животные. В экспериментах йыли использованы мшаи (CBAxC57BL) саики г-4 месячного возраста массой 16-гаг, полученные из питомника лабораторных животных АМН СССР "Столбовая".

клетки селезенки мьшей выделяли в асептических условиях, суспензии готовили по общепринятым методикам. Для удаления эритропито и мертвых ядросодержащих клеток спленоциты подвергали гипотоническому шоку. Агрегаты лизированных эритром ов и нертвых клеток удаляли Фильтрованием через хлопковую вату, затем живые и ядросо-держашие клетки осаждали центрифугированием в режиме ¿ttg/io мин. Осадок клеток осторожно ресуспендировали в среде RPMI-164G (Flow. Великобритания), дополненной 10/. эмбриональной телячьей сыворотки, ю мм HEPES-бУФера, г мн L-глутамина. ьо нкм Р-меркаптоэтанола и 50 мкг/нл гентамииина.

Культивирование клеток осуиествляли в лунках специальной микропанели (Flow. Великобритания) при 37° С в атносфере увлажненного воздуха с 5* cot . При получении В-лимФобластов в качестве митогена использовали липополисахарид isigma. США) в конечной концентрации 50 мкг/мл.

В ряде экспериментов были использованы свежевыделеные тимо-циты мыши, а также клетки лимфомы линии нч, которую поддерживали in vitro в обогащенной среде RPMI-1640.

В экспериментах использовали поликатион поли-Ь-лизин (ПАЛ) с молекулярной нассои 90 кДа и сополимер акриловои и метакриловои кислот (СП) с молекулярной массой 440 кДа. меченные изотиоциана-тон флуоресиеина (ФИ'ГШ.

флуоресцентная микроскопия клеток. Препараты клеток для люминесцентной микроскопии готовили двояко: либо живые клетки "приклеивали" к стеклу, либо в микроскопе рассматривали суспензию клеток, свободно перемещающихся в тонком слое между покровным и преднетньт стеклами. Для прикрепления клеток предметные стекла обрабатывали о, ч* раствором формвара iserva, 4>РГ> в дихлорэтане и высушивали. Затем на каждое стекло наносили каплю клеточной ' суспензии и инкубировали во влажной камере при 4еС в течение 30 мин. Неприлипшие клетки отмывали культурэльной средой. Клетки, прикрепившиеся к стеклу, покрывали слоем среды, содержащей меченый полиэлектролит. Спустя 5-го мин стекла с клетками промывали большим объемом среды, препараты рассматривали в люминесцентном микроскопе-з (OPton. ФРГ) при увеличении lxiooo, сравнивая изображения отдельных клеток, полученные в проходящем свете, режиме Фазового контраста и УФ-индуцирУемой Флуоресценции. Препараты фотографировали на пленку чувствительностью 130

¿юст (Свена. СССР).

проточная питофлуоринетрия. Количественный анализ адсорбции

оресиентно неченых полиэлектролитов, а также коньюгатов на их

х е, проводили на проточной лазерной иитоФлуориметрг ЕРЮЭ-С

•ипгомсз. франция). Измерения проводили в режиме: мощность

онового лазера гоо мвт, длина волны возбуддаюшего света 488

напряжение на Фотоэлектронном умножителе, регистрирующем

оресиенцию в области "зеленых" длин волн <Я:520нм). устанав-

али в диапазоне 1500-1900 в. коэффициент по каналу налоуглово-

светорассеяния - 2. температура - 25еС. В каждой пробе анали-к

овали Ю клеток со скоростью около 300 клеток в 1 секунду. ¡Ш-луориметрические измерения проводили с клетками, предвари-ьно переведенными в раствор Хенкса, забуференныи НЕРЕБ-буфером, Инженерное обеспечение работ на приборе осуществляли сочг^'д-и лаборатории Физических методов исследования в иммунологии титута иммунологии Минздрава СССР.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЯДЕНИЕ.

АДСОРБЦИЯ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ НА ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ- ЛИМ-ФОИДНЫХ КЛЕТОК.

Для визуализации процесса сорбиии полииона на клеточной бране была использована техника люминесиентнои микроскопии ток, обработанных полиэлектролитами, меченными флуорохромон. оценки количественных параметров сорбции полимеров на клет-была использована иитоФлуориметрия.

Топография распределения полиэлектролитов на клеточной поверхности.

Нами проведено исследование распределения меченого полианио-:п-фитц и неченого поликатиона плл-фита на клетках в первые уты после их внесения в среду, омывающую клетки, прикреплен-к предметнону стеклу, клеточные препараты, с нанесенным на раствором полиэлектролита, инкубировали в течение 15-20 низа это время достигался необходимый уровень яркости свечения эрохрома и, кроне того, это позволяло рассматривать препарат постепенном "выгорании" метки. Для предотвращения эндоиитоза ромолекул. сорбировавшихся на плазматической мембране, все зедуры по нанесению растворов, инкубирование, отмывание сте-с клетками проводили при температуре таюшего льда, используя гворы. охлажденные до *ч°с. В некоторых экспериментах прово-1 30 минутное Фиксирование клеточной мембраны раствором пара-альдегида (З.ЪХ) при +4 С.

-ю-

Инкубирование живых лимфоцитов, прикрепленный к стеклу. присутствии ПЛЛ-ФИТЦ (конечная концентрация io"r И) приводил адсорбции нетки на плазматической мембране, но не сопровождал ее проникновением внутрь клетки. Мы наблюдали некоторую гете генность морфологии распределения меченого поликати^на на >в ности клеток. На большинстве (65Х) лимфоцитов селезенки мыши ли-ь-лизин сорбировался в виде одного яркого полюса. Около зо клеток имели два и более полюса. И лишь небольшая часть клето (около среди всех лимфоцитов селезенки представлялась при люминесцентной микроскопии в гиде ярко светящихся кругов.

Можно было озимать, что в процессе прикрепления живого л Фоиита к стеклу происходит полярная ориентация клетки и neper пределение каких-либо молекул на ее поверхности, и. как слег вие, полярная ориентация меченого лиганда. взаимодеиствуюшег этими молекулами, однако изучение адсорбции плл-ФИТЦ на -лимфс них клетках, свободно взвешенных в среде, отвергло это предпс хение. лимфоциты в суспензии, как и лимфоциты, прикрепленные стеклу, адсорбировали на своей поверхности поликатион в виде ного-двух полюсов.

Можно было предположить, что первично молекулы поликат! сорбируются равномерно по всей поверхности. Перераспредел; нолекул поликатиона и (или) их конплексов с белками мембраны ляется следствием активной реакции клерки, в частности ее ци: скелета. Для проверки этого предположения перед внесением в ( меченого полииона клетки обработали параформальдегидом. ч: Фиксировать элементы клеточной нембраны. полностью предотвра-перемещение белковых молекул в плоскости бислоя. Предварител] Фиксация клеток параформальдегидом .юзволила нам исключить < тор перемещения полимерных молекул после их адсорбции на пла: тической мембране и выявить первичную картину распределения ликатиона в момент адсорбсии на клеточной поверхности. Ок. лось, что она практически не отличается от картины распредел! плл-о-итц на нефиксированных живых лимфоцитах, следовател места преимущественной адсорбции поликатиона имеют неравноме характер распределения в мен&ране еше до адсорбции на ее пов ности молекул экзогенного полимера.

В случае полианиона наблюдаемая картина была следую СП-ФИТ11 сорбировался практически на всех клетках, при этом тенсивность свечения клеток была неодинаковой. Около 25-?у. ток окрашивались наиболее ярко. Характер распределения метки клетке был несколько необычен для поверхностного и скорее б похож на диффузное свечение содержимого клетки. Обычно при в модеиствии меченых Флуорохромом антигенов, г.ормоноп или иеир

- уУ-

ди.Огоров с соответствующими рецепторами на клеточной мембране, наблюдается равномерное кольцо Флуоресценции по периметру клетки и слабое свечение всея видимой поверхности клетки, в нашей случае свечение напоминало равномерно окраиенни диск с нечеткими, размытыми краями. Представлялось маловероятным проникновение отрицательно заряженой макромолекулы через мембрану живой клетки. Важно, что окрашенные клетки не были повреждены, так как при контрольном прокрашивании о. 5/ раствором трипановой сини оказывались поврежденными только 5-7/. клеток. Вместе с тем, чтобы исключить возможность повреждения клеточной мембраны за время инкубации с сп-ФИТЦ, клетки фиксировались при 4ес, после чего иа-раФормальдегид отмывался и в околоклеточную среду вносили мече-полианион. Картина Флуоресцениьи не менялась, для того, чтобы подтвердить поверхностный характер адсорбз_м полианиона на клетках, воспользовались методикой тушения флуоресценции. используя поликатион поли-4-вияил-н-этилпиридиний бромид (ПВЭПБ), пиридиновые звенья кото, ого обладают свойством "тушить" Флуоресценцию фитц. из предыдущих экспериментов было известно, что поликатионы сорбируются на поверхности клеток и не проникают внутрь через плазматическую мембрану (по крайней нере за время эксперимента ю-го минут), такин образом, после приготовления перпаратов для микроскопии и нанесения раствора СП-ФИТЦ

-7 -в

(2,2x10 ш, на стекла нанесли каплю раствора ПВЭПБ (Ю Н) и инкубировали во влажной атмосфере 5 минут, непрореагировавший поликатион отмывали средой, и препараты рассматривали в микроскопе в режине флуоресценции. Под влиянием ПВЭПБ распределение меченого полианиона на лимфоцитах быстро и существенно изменялось. Во-первых, после внесения пвэпб в среду сушественно уненьэалась интенсивность Флуоресценции клеток, меченных СП-ФИТЦ. Во-вторых, язменялась топография распределения сп-ФИТЦ относительно контура <летки. Исходно равномерно распределенная метка СП-ФИТЦ. иневшая вид светяшегося диска, совпадавшего с контуром клетки, перераспределялась под влиянием ПВЭПБ на 65-70Х клеток в отчетливо "по-пярный" вариант свечения, нетка. концентрировалась на одном по-пюсе клетки, а больная часть контура клетки либо вообше не све-гилась. либо сохраняла очень слабое свечение, изменения в харак-гере распределения Флуорохрома на клетках и наблюдаемое падение яркости свечения свидетельствовали о поверхностной Флуоресценции слеток после обработки их СП-ФИТЦ.

динамика адсорбции полиэлектролитов на линФоидных клетках. для решения данной задачи нами были выбраны клетки тимуса швея как наиболее однородная популяция линФоидных клеток, на

гистограинах. Фиксирующих Флуоресценцию частш. получали распре

деление клеток по интенсивности их свечения. Образцы готовили

непосредственно перед измерениями, смешивая предварительно

о «

охлажденную до ч С клеточную суспензию с концентрацией 2x10 кле

ток в 1 кл с раствором Флуоресцентно меченого полиэлектролига

выбранной концентрации. Сразу после перемешивания суспензии

клеток и раствора полииона отбирали пробы клеток и измеряли их

Флуоресценцию.

На рис.1 представлены данные по нарастанию Флуоресценции клеток при совместной инкубировании сп-фитц. как видно из представле! ного рисунка, адсор&пия полииона происходит ухе в момент смешивания и продолжается в течение еше 2-3 минут после чего ¡еличин; характеризующая среднюю интенсивность свечения (Кт> практически

изменяется, причем важно заметить, что ход кинетической криво1

-в

для двух различных концентрация, например, полианиона 2.2x10 и i г, 2Х10*?Н принципиально не отличается. Флуоресценция клеток характеризуется резким возрастанием от значения, в среднем 39.1 ("Фоновая" флуоресценция интактных клеток) до значении 61.6 I 132.0 соответственно через 90 сек I еле перемешивания. Аналогичные результаты получены и для поликатиона.

Изотерны адсорбции поликатиона <ПЛЛ) и полианиона (СП) н; имнунокомпетентных к^гках. Типичная гистограмма распределения клеток в популяции по интенсивности флуоресценции в результате адсорбции полимера представлена на рис. 2. при исследовании трех различных вариантов ли» Фоидных клеток (линфоциты селезенки, тимуса, клетки линии Н9). гистограммы имели один максимум по интенсивности, измерения про! проводили через 2-3 нинуты после перемешивания клеточной суспензии с раствором Флуоресцентно меченого полиэлектролита, чтоб! Фиксировать значение максимума флуоресценции ("плато" на кинетической кривой) для каждой конкретной концентрации полииона. Анализируя на проточном цитоФлуориметре пробы с различным содержа-

-9 -б

нием полимера в диапазоне от ю до ю м, получали гистогран-мы распределения клеток по интенсивности свечения. Графическое изображение дозовои зависимости свечения тиноцитов от концентрации полиэлектролита в среде представлены на рисунках 3,1. Дозо-вая зависиность для поликатиона имеет Б-образный вид с резко выраженный крутим участком и отчетливым "насыщением". Так в интервале концентраций ПЛЛ-ФИТЦ от 5. 5х1<? Н до 5. 5х104Н интенсивное^ Флуоресценции (Пп) возрастает от "фонового" до максимального зн; чения (для данного полимера и данных клеток), дальнейшее увеличение концентрации полимера в среде не приводит к сколько-нибуд!

Гт

(50

(39

го

(о <5

Рис. 1 динлмика возрастания «лгореечениин тинопитов при совместном ТШУЕированим с пояиаиионом, где кривая 1 .- г. гхю"' и

г ■ г.гно * я

л

рис. г Тиличнне гистограммы распределения клеток по их «•лхорес-ирниин в популяции тиноиитов ммчи. меченных СП-ФИШ (а! и ПЛЛ-ФИТИ (в). Получено методом проточной иитоФлуоринетрии.

Рис. 3 Доэовме зависимости ♦лгорес-иениии клеток ври совнестиои инкубировании с гслианионои. крива* 1-клеткк в рчстворе Хеикса: кривая 2-клетки р раствор« хеикса. содержании 1,86 нг/кп бычьего сывороточного альбумина. По оси абсиисе-соаерха-ние СП-«-ити я среде ст. по оси ор-динаг-средияя интенсивность *луо-ресиениим тиноиитов.

Рис.* дозовме ээямспности ♦лгорес-аеяиии клеток пгж еовиестяон инку-. еировании с полихатиоком. кривая ) •клетки в растворе хенкеа: кривая г клетки в растворе хенкса. одержании иг/ил бычьесг сывяроточко го альбунииа! по оси абеиисс-солер хамме илл-еити в среде (щ. по оси ордмват-средняя интенсивность ♦лго ресвехонм тмиопктов.

Таблниа I. Зка'-^юи интенсивности ♦луореспенини лимфоцитов (Р'ш)

при различных способах обработки полизлектролитэми.

Конечная конвентрааия■ сп-*Ш1 в сгспеяэюс (П) Значения иктепсивиости »луоресиемиии клеток при обработке сп-фити

Интактнне клетки клетки, предварительно ин-кубирояанные в растворе СП 'г. гхю"* и

-6

г. гхю 65. 5 61. г

г. гхю 36, 4 35,5

г. гкю 12,0 • го. з

Конечная концентрация плл-гити я суспензии (П) Значения интенсивности ♦луоресиениии клеток при обработке ПЛЛ-фитц

Интактние клетки Клетки, предварительно инкубированные в растворе ПЛ/ 1. 1Х1СГ6 П

-т

1.4X10 78.7 г-5.1

г.тхю 142.« 62. 3

5.5*10 152.5 юо.о

1. »55.6 120. 1

-

з^йетному увеличен!!» количества метки, связавшейся с поверхностью клеток (рис. 4>. похожие результаты были получены и для

полианиона. в этом случае при повышении концентрации СП-ФИТИ от -9 "f

10 и до 5x10 н средняя интенсивность Флуоресценции клеток плавно нарастала от значений 43,0 ("Фон" интактных клеток) до 1 зо.о. Дальнейшее увеличение концентрации сп-фитц не приводило к еще большему нарастанию средней интенсивности Флуоресценции клеток. По Форме изотерма адсорбции сп-фятц напоминала s-образную кривую (рис. 3).

Картина ; енялась. если в среду, в которой были взвешены ти-моциты. добавляли белок, бычий сывороточный альбумин и.бб мг/мл). Изменение изотермы для поликатиона выражалось в следующем: в исследованном интервале концентрации поликатиона интенсивность свечения клеток и. следовательно, количество адсорб-п-о-ванного поликатиона, были меньше вплоть до концентрации насыше-ния (10 М). При концентрациях вьие указанной, значения Fm начинали превосходить соответствующие ¿начения флуоресценции клеток, находящихся в безбелковой среде, в случае полианиона изотерма адсорбции смешается по оси ординат вверх (рис. з и 4).

Изучение обратимости связывания полимеров с клеточной поверхностью.

Для оценки степени обратимости связывания полимеров с поверхностью клеток целесообразно рассмотреть следующие вопросы, существует ли обмен между цепями "акромолекул в растворе и находящимися на клеточной поверхности; будут ли покидать молекулы полиэлектролитов клеточную менбрану. если их удалять из околоклеточной среды. Возможно ли участие полиэлектролитов в реакциях макромолекулярного обмена и возможен ли переход макромолекул с поверхности одной клетки на поверхность другой.

Серия экспериментов посвяшена изучению возможности обмена между макромолекулами (меченной и немеченнон Флуорохромом) на клеточной мембране. Для этого клетки предварительно инкубировали в присутствии полимера в концентрации насыщения, затем клетки осаждали центрифугированием, тщательно отбирали надосадочный раствор, содержащий немеченый полимер. После этого клетки ресус-пендировали в среде с различным содержанием меченого полииона. При этом происходило связывание последнего с поверхностью клеток. В таблице 1 сравнено увеличение средней интенсивности Флуоресценции клеток пт повышении концентрации в среде сп-ФИТЦ от г.axio^i до г.гхю~н и для плл-фити от i.4xio7h до i.ixiom в случае использования интактных лимфоцитов и идентичных клеток, предварительно обработанных немече.шым полимером (СП или ПЛЛ,

соответственно).

В делом, с клетками, предварительно обработанными СП. свя: валось приблизительно такое же количество СП-ФИТЦ. как и с ко! рольными (необработанными СП) клетками. Проведение аналогич •процедуры с тимопитани. предварительно обработанными ПАП. о зало, что спустя 5 минут в суспензии обнаруживалось значитель количество меченых клеток, сорбировавших ПЛЛ-ФИТЦ. .При этом Г процент меченых клеток зависели от концентрации внесенного плл-фити (табл. и.

десорбция полимера с поверхности клеток при удалении е из среды.

В следующей серии экспериментов были проведены иитоФлус нетрические измерения, когда поэтапными отмывками удаляли ме ныи полиэлектролит из внеклеточной среды. Первый столбец (О) рисунках ба и та соответствовал средней интенсивности флуо! цениии клеток, измеренной в присутствии полимера. Все последз значения получали измерением проб после каждого этапа отмыв; поли электролита 50-ти кратным избытком Физиологического р?^' ра. Каждый этап отмывания занимал, в среднем. Ю минут (доба) ние раствора Хенкса в суспензию меч лых тиноиитов. тшзтел: перемешивание, центр .фугирование, удаление надосадочной жидю и, наконец, измерение проб на цитоФлуориметре). описанная иедура носила характер принудительного отмывания полимера с точной мембраны.

Поэтому для параллельного анализа ¿.¿сорбции несколько модифи вали эксперимент, после насыщения поверхности клеток полика ном или полианионом через э кинут в- пробирки с пробами добав избыток раствора хенкса. Образны оставляли при 4°с на ю, 20 и 40 минут, т.е. на время, затрачиваемое на каждый этап при тельного отмывания соответственно, результаты приведены на 5б и бб. сравнивая значения №. соответствующие первому з отмывки • и ю-минутному инкубированию меченых клеток в из« среды и так далее, можно отметить, что полимер десорбирэ с клеток в большей степени в результате поэтапного удаления из среды, чем в случае длительного инкубирования меченных ю в избытке Физиологической среды.

исследование десорбции поликатиона с клеточной повер! ти в присутствии противоположно заряженного полиэлектг*

Гя. 100

50

-1-, д . гЬ <*>он

гЬ

гЬ

<М)и

%

л

2 3 4

О 50 20 50 ¿0

Рис. 3 Десорбиия макромолекул полизниона при различны* реяинз* гаа» ления полимерз кэ среды: а) проведение четыре* >тапо» последовательного отмывания в 30—ги кратной избытке ♦нзиологкчесхоя среди: 6) к смеси клеток и полимера доваеляли 50-ти кратный избыток среди и оставляли на »0. го. 30 и чо нинуг. Перед и?мерекиями отнывочкыи раствор удаляли иеятрифугированиен. Ш1фрами обозначены: о - интенсивность флуоресценция клеток, обработанных сп-»ити (г.гхЮ Н). во отмывания: 1.2.3. и ч - средняя интенсивность свечения после соответствующего этапа отмывания.

гЬ

1*1

гЬ

Й-

<ьон

Гг» 150

•50

*1 [Ь [Ь ¿1 гЬ £ ФОН

О < 2 5 4 0 Ю 20 30 АО

Риг. Г: легорбиия макромолекул поликатиона при различных режимах удаления полимера из среды: а) проведение четырех этап«в последовательного отмывания в *>0-ти кРатнон избытке ♦и?иологическои среды: Л1 к сноси клеток и полимера довдвляли 5о-тн кратнни избыток среди и оставляли на ю. го. 30 и Ю минут. п»гед измерениями отнырочнын раствор удаляли иектрифугироранием, Цифрами обо?нач1>н<э: о - интенсивность Флуоресценции клеток, обработанных плл-фити п. 1X10*111. до отмипания; 1,2,3 и 1 - средняя интенсивность стечения после со-ответстеукхдего этапа вттюапия.

Эксперименты проводили следующим образон. Тимопиты инкубировали в суспензии с различным содержанием меченого плл. Через 5 минут клетки осаждали и тщательно отбирали надосадочную жидкость. После чего клетки ресуспендировали в среде с 1мг/нл гепарина. Известно, что гепарин является сильнын природным полианионом. который в данном случае может играть роль конкурента во взаимодействии с исследуемым поликатионом. Действительно, при внесении избытка гепарина в околоклеточную среду, в которой находились тимоииты. "покрытые" меченым пол. катионом, происходило значительное уменьшение интенсивности Флуоресценции клеток. Так. клетки, меченные плл-мтц в концентрации насыщения но"' м). через 5 минут инкубирования в присутствии ПАЛ-фитц имелп среднюю интенсивность флуоресценции соответствующую кт=182. б. после внесения в околоклеточную среду гепарина № снижалась до 53.0. Причем такое снижение нельзя было объяснить десорбцией пал-фити с клеток лишь в результате смены среды, т. к. при адекватной замене среды в контроле Кт снижалась лишь до юг.9. следовательно, при внесении в среду отрицательно заряженного полианиона происходила > интенсивная десорбция молекул положительно заряженного п/1л. ранее сорбированных на клеточной поверхности.

Изучение возможности миграции макромолекул полиэлектролита г одной клетки на другую. На этапах отработки экспериментов смешивали суспензии меченых тимоцитов и немеченых клеток лимфоиы Н9. Преимущество такого подхода -состояло в том. что клетки лииФомы Н9 имеют большие, по сравнению с лимфоцитами, размеры, ^этому, на бипараметрических гистограммах по светорассеянию смесь тимоцитов и клеток линии Н9 представляет собой две. практически непересекающиеся области точек. Следовательно, можно раздельно анализировать флуоресценцию клеток Н9 и тиноиитов даже при их перемешивании. Для увеличения вероятности контактов клеток Н9 и тимоцитов между собой, смесь клеток осаждали центрифугированием и инкубировали в осадке при До смешивания проводили подсчет концентраций клеток в каждой суспензии и смешивали равные объемы, содержащие одинаковое количество клеток, после чего анализировали пробы через различные промежутки времени. Результаты проделанных экспериментов представ лены в таблице 2.

так было показано, что после инкубирования предварительно неченных сп-ФИТи тимоцитов, с немеченныии клетками линии Н9, на поверхности последних появляется флуорохрон. Нетку приобретают приблизительно гъ* клеток Н9 после совместного инкубирования исходно немеченых клеток Н9 с мечеными тимопитани в течение 60 ми-

ТЗллнш г. Изиенение глгоресоеипии исходно неиеченых клеток линии Н9 в процессе их инкг'бировгиии в контакте с тинсчштакн.

лрелвагитздмю неченикни сп-tKTU.

Провент клеток Н9 с различно» интенсивностью Тип флуоресценции ■ каналах: клеток 0-ю si-ее н-юо tet-г»

II? иемчемню 99.0 г.т 0,0 0. 1

<И9 ♦ ТЧ 1Ри сиевмваякп «а. о 11.0 о. г 2.»

IH9 ♦ ТЧ в осадке: 30 нни so mm тт. ь 11,1 1Т. ге, t о. в о. в 4. ) 4.1

Процент тямопитов е различной интенсивностью Тип «луоресаенвия а каналах: клеток 0-Ю 11 -40 »1-160 161-255

Т иекечеигае ее. в ts.s 0.1 о. э

iz::zz «. 3 г. s 9.7

1 <т« • hoi рри смеаппаним 3.1 ' г.г J. 1 90.6

(т> • н9> в осадке: 30 ния 90 нни 4. 1 3.3 г, 1 г, з в, г »4.7 в?. 9 34. 2

Vcлогин» обозначения: Т - тииоиити нат. иятактпмв! f • ТНЯЛЦИ7* пмвя. превварктелько обработан««® 11ЛЛ-ФИТ11; Н9 - клетки линия Н9.

Таблина з. Изменение »луоресвенвйи кл»ток в npmietoe ниграини

полнанн^на г мечгнних Т"-клеток на иктактные т-клеткн

Тип клеток Провеит тииоцитов е различной интенсивностью ♦дуоресиеншш в каналах: 0-10 11-140 141-1 ТО 1Т!-г?5

Т 1т.г »1.6 0, в 0,4

т» 5. 1 17. t г, 7 45. 1

IT • ТЧ 1ГИ снетнеанин П. 2 47. 1 3.4 3V. 1

(Т « ТЧ t осалке: 5 иин 15 нии 25 иин 55 иин 6.2 &, 3 4.2 2.5 54.6 39.« 31,0 i9. 3 и, 6 29.3 3», 1 37.0 1». Ь 2».6 гв.т з/.е

условные обозначения: Т - тииоииты нши. ннтактны»; Т» - ти-ноииты нмии предварительно инкубировали с полианионом.

-а-

нут в условиях клеточного осанка, то есть в условиях пряного контакта двух типов клеток, всё вновь меченые клетки содержали очень небольшое количество сп-ФИТЦ, так как по интенсивности Флуоресценции они попадали в каналы 11-60. то есть в каналы с наименьшей интенсивностью), достоверно превышающей "Фоновую" <" 7уо-ресценпию (каналы 0-Ю>.

отработка методики проведения экспериментов на клетках, отличающихся по размера», позволила, в дальнейшем, исследовать миграцию полиэлектролитов при совместном инкубировании клеток одного размера - меченых и немеченых тимоцитов.

Данные, полученные в экспериментах по перераспределению полианиона СП-ФИТЦ и поликатиона ПЛЛ-ФИТЦ между тимопитами сведены в таблицы 3 и 4 соответственно, для контроля в параллельной серии . к меченым лимфоцитам добавляли соответствующий объем раствора хенкса, клетки перемешивали, осаждали центрифугированием и оставляли на такие же промежутки времени, как и смесь меченых и немеченых клеток, контроль позволял оценить: не является ли падение Флуоресценции клеток результатом не столько перераспределения метки между мечеными и вновь добавленными тимоцитами. сколько десорбции 1 полиэлектролита в раствор при внесении дополнительного количества раствора хенкса вместе с суспензией немеченых клеток, с другой стороны, известно, что полиэлектролиты сорбируются на различных поверхностях (стекло, пластик; и не исключена возможность приобретения немечеными тим-читами Флуоресценции не за счет перераспределения полиэлектролита при непосредственном контакте между клетками, а за счет перехода полимера с поверхности пластика на

клеточную'мембрану. Для исключения данного пути миграции полимера

-6

пробирки обработали раствором плл- чтц <10 н) и через 5 минут тщательно отобрали. После этого, в пробирки внесли клеточные суспензии и оставляли инкуби оваться в состоянии плотного осадка на ьо минут (последняя строка в табл. 4>. Поставленные контроли позволили полностью исключить перераспределение полиэлектролитов через поверхность используемых в экспериментах пластиковых пробирок. Кроме того, стало ясно, что падение Флуоресценции исходно меченых клеток не является результатом десорбции полимера при внесении дополнительной порции среды с суспензией интактных клеток. Результаты перераспределения полианиона и поликатиона представлены на рисунках т и 8. из рис. т видно, что до смешивания предварительно меченые полимером клетки и интактные давали распределение по Флуоресценции в виде непересекающихся пиков. В случае интактных клеток имеется в виду аутофлуореспенпия клеток в отсутствие меченых лигандов. Сразу после перемешивания суспензия состоит наполовину из меченых и немеченых клеток. Но уже через

таблица 4. Изменение Флуоресценц' 1 клеток в процессе миграции

поликатиона И/1Л-ФИТЦ с меченных Т«-клеток на интактные Т-клетки.

Тл:юциты, меченные ПАЛ-фИТЦ Тимоаиты интактные СРЕДА Флуоресценция клеток Кш '/. клеток с Рт досто верно выше "фона"

— 6 10 --- 10,0 0

в 10 — --- --- 1в5, 7 99, 7

б 10 в 10 --- 1МНН 145, 3 49. 6

б 10 б 10 --- ЗОМИН 120. в 33, 7

6 10 6 10 --- бОКИН 105, 9 35, 5

6 10 б 10 --- 90мин 96.4 37, 4

6 10 — + 1МИН 187,4 99.7

б 10 — ЗОмин 185. 7 99.5

б 10 — 60МИН 180, Т 99.7

б 10 — + 90НИН 171. 1 99. 5

Контроль: 100 мкл раствора ПАЛ-ФИТЦ (10-* И, без клеток). Затем раствор удален. с 10 еомин 1. 1 2, 4

») к суспензии меченых клеток прибавляли равный объем раствора Хенкса.

Рис. у. т^оцесе перераспределения иолианиона ме*ду тимонитани. схематическое изображение основных этапов процесса

тггаюти, шчкспи СМШ

шчеиыв х леиечешо маоитт в осадке 30 шщгт

рис. ¡ процесс перераспределения попикатио»м между тимонитани. схематически изображение основных этапов процесса.

через 60 мзяут после перетащяная

минут клетки в образце несут на своей поверхности приблизительно одинаковое количество летки (оаин пик с достаточно узким распределением. см. рис. 7).

ус'! новлено. что в описанных выше условиях эксперимента миграция и • перераспределение полианиона сп-ФИТЦ между клетками завершается в течение 15-25 минут.

В случае поликатиона для выявления процесса требовалось увеличение времени совместного инкубирования клеток, в среднем, до 1 часа. Результат перераспределения плл-ФИШ был не столь одно-

начным «рис в), как с полианионом, значительно более широкое распределение клеток по интенсивности свечения на гистограммах говорит о неравномерном заселении поликатионом всех клеток в смеси, или о незавершенности пронсса перехода. Даже через 1 час после совместного инкубирования клеток значительная их часть с:-тавалась в пике, соответствующем немеченым клеткам, а также в пике, соответствующем меченый тимоиитам до их перемешивания с интактными клетками.

адсорбция белок - полимерных конъюга'гов на клетках, инеших и

не имехмх специфические рецепторы к белковой части конъюгата

В связи с обнаружением эффекта повышения иммуногенности белка-антигена при его ковалентиом конъюгировании с полиионон (Р.В.Петров и соавт. . 197Т-1983) стало принципиально важным исследовать взаимодействие антиген-полимерного коньюгата с лимфоцитами. имеющими специфические рецепторы к антигенной части, а также с лимфоцитами, не имевшими таких рецепторов, прямое исследование взаинодеяствия антиген-полинерных коньюгатов с клетками, специфически связывающими антиген, требует работы с клетками ан-тигенспеииФического клона, клоны T-лимФоцитов не пригодны для данной работы, так как их рецепторы ориентированы лишь на "узнавание" комплекса [антиген+белок шс1. необходимо использовать клоны В-линФонитов. несущие lg-реиепторы, которые бы специфически связывали соответствующий антиген, однако, предпринятые многими исследователями попытки вырастить и поддерживать m vitro антигенспеииФические клоны в-лимфодитов пока не имели успеха. Учитывая изложенное выше. Р. И. Атауллаханов предложил исследовать взаимодействие белок-полимерного коньюгата с клеткани. несущими специфические репепторы к белковой части коньюгата. используя нодельнло экспериментальную систему, которая полностью имитирует взаимодействие антиген-полимерного коньюгата с антиген-связывающими B-лимфопитами. в качестве белковой части коньюгата предлагается использовать антитело, специфически связывающееся с la-рецептором на в-клетках. такое антитело, являясь иммуноглобу-

лином, по своим Физико-химическим свойствам будет полностью имитировать такие глобулярные белковые антигены, как, например, бычий гамма-глобулин или ганна-глобулин лооади, яичный альбумин или бычий сывороточный альбумин, для которых были описаны э >ек-ты повышения иммуногенности при их коньюгировании с полиионами. Более того, антитело (антиимнуноглоеулин) будет взаимодействовать на B-лимФодитах с теии же репепторными белками (18-рецепто-ры), что и антигены. К тому же константы взаимодействия аятиин-нуноглобулина с le-рецепторами будут того же порядка, что и константы взаимодействия большинства антигенов с I в-рецепторами, следовательно, изучив взаимодействие коныогата антииммуг глобулин -полиион с Ie-несушини В-клетками, можно экстраполировать, по--лученные результаты на случай взаимодействия коныогата анти-ген-полиион с в-клетками, несущими ie-реиепторы, специфически связывающие антиген.

Основываясь на описанной выше идее, мы провели модельные эксперименты с конъпгатами антииннуноглобулин-полиион и в-линфоци-тами. несущими на своей поверхности Ig-рецепторы. В качестве контрольных клеток, не имеющих рецепторов к антииммуноглобулину, были использованы тимоииты. Работу выполняли на лимфоидных клетках мыши, а в конъюгатах соответственно использовали меченые ФИТЦ антитела, специфически связывающиеся с le мыши (Cedanте. Канада).

Кинетика адсорбции конъюгатов антииммуноглобулин-полиион на поверхности 1в* - и 1е* - кл1 /ок.

Для анализа специфичности взаимодействия меченого лиганда с теми или иными клетками необходимо знать кинетику процесса сорбции, чтобы оценивать количество лиганда. связавшегося с клетка-ни. а также процент клеток, с которыми произошло связывание.

Взаимодействие акти-1е. меченных 'фиш, с 1е -клетками было специфичным. Нетились только В-лимФопиты и В-лимФОбласты. но не метились тимоииты. кинетика связывания антирецепторных антител с -клетками описывалась кривой 1 на рисунке 9а с отчетливыми признаками "насыщения" приблизительно через 30 минут. Здесь следует отметить, что использовалась конечная концентрация ан^и-!е. меченных фиш, равная гигг/ма , которая была подобрана в предварительных экспериментах и обеспечивала насыщение специфических нест связывания на 18*"-клетках в данных условиях эксперимента (инкубирование проводили в среде с эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мн эдта и о,ог'/ нал, при температуре таюшего льда), в уело-

виях насыщения реиепторных мест связывания в суспензии линфоци-

о

тов селезенки мыши метилось около клеток. Количество свя-

завшихся с ними антииммуноглобулинов характеризовалось средней интенсивностью Флуоресценции клеток около 80 условных единиц (по шкале интенсивности 1-255 канал).

Кинетика связывания коньюгатов антииммуноглобулин-полианион и антииммуноглобулин-поликатион существенно отличалась от кинетики свя~двания самих антииммуноглобулинов (рис. 9). Коньюгаты насышали поверхность клеток быстрее. При этом кокьюгат анткимну-ноглобулин-поликатион связывался не только с в-клетками - метилось около 75-80* лииФоидкых клеток селезенки. Напротив, коьъю-гат антиимм юглобулин-полианион связывался с таким же процентом лимфоцитов селезенки, как и сами а гииннуноглобулины (рис. 96).

Специфичность взаимодействия коньюгатов с клетками.

связывание коньюгата поликатион-антгиммуноглобулин с во/лимфоцитов селезенки указывало на появление неспецифического взаинодеяствия лиганда с поверхность» клеток, наряду со специфическим вза! .одействием антительнои части коньюгата с 18-рецеп-торами. Деяст! )тельно, коньюгат поликатион-антииммуноглобулин сорбировался не только на 1в+ -клетках, но. и на 85-90Х тимоци-тов, не имеющих 18. коньюгат полианион-антиимнуноглобулин обладал значительно меньшей способностью к неспецифической сорбции на поверхности 18~ -клеток, лишь около 15-20/. тиноцитов сорбировали небольшое количество коньюгата антииммуноглобулин-полианион. при этом взаимодействие такого коньюгата с В-линФобластами практически не отличалось от взаинодеяствия антииммуноглобулинов с такими же клетками. !

Степень обратимости сорбции коньюгатов.

Как известно, последовательные отмывки клеток, сорбировавших лиганд, большим объемом среды позволяют десорбировать и удалить ниэкоаФФинные лиганды, но не нарушают высокоаффинных связей, это хорошо известно из случая взаимодеиствия меченых антител с соответствующими антигенами на поверхности клеток.

В предшествующих разделах данной работы были описаны данные > десорбции полианиона и поликатиона, представляло интерес ис-:ледовать, в какой мере обратимо взаимодействие коньюгатов анти-1ММУноглобУлин-полнион с клетками, имеющими специфические для штител места связывания и не имеющими таковых. Это позволило бы >пенить. в какой мере полиионная часть конн>гата влияет на проч-

Рис 9 динамика возрастания а) Флуоресценции белых клеток селезенки; б) числа флуоресцирующих клеток при совместном инкубировании с анти-имнуноглобулинами и их конъюгатами: кривая 1

_ кривая 3 -ПЛЛ-анти-1в-фитц.

По оси абсписс - время совместного инкубирования (мин. >; "

по оси ординат - а) средняя интенсивность Флуоресценции клеток сгт).

б) число флуореспируюших клеток (¡о.

Гт

КГ* 10"7 М

РИС. ю Дозовые зависимости интенсивности' Флуореспенции спленоцитов <ш) при совместном инкубировании с: 1 - СП-анти-1в-ФИТО;

2 " ПЛ/1-БСА-фИШ»

3 - плл-анти-1в-фитц.

По оси абсшсс - содержание коныогатов в клеточной суспензии (Н).

-zo-

ноауь взаимодействия антииммуноглобулина с lg-репепторани. в свою очередь, в какоя мере антительная часть молекулы коныогата определяет или не определяет его предпочтительное связывание с la -кле.ками, в сравнении с 1е~ -клетками.

эксперименты по десорбции конъюгатов проводили в сравнении с экспериментами по лесорбиии антител и соответствующих полиионов. после инкубирования клеток с меченым лигандом (в условиях "насышения"> клетки последовательно отмывали 50-кратаым объенон среды, после каждого этапа отмывки регистрировали процент меченых клеток и гчтенсивность их Флуоресценции. Полученные данные (рис.11) показывают, что связывание коныогатов антииммуногло^у-лин-лолиион ^ -клетками очень прочное: сорбировавшиеся ли-1 .нды практически не десорбировались в результате последовательных четырехкратных отмывок. По этому признаку их взаимодействие

4

с Ig -клетками не отличалось от взаимодействия антиинмуноглобу--t

линов с la -клетками.

исследование десорбции коныогатов с 1.^верхности ls-негатив-ных клеток продемонстрировало, что коньюгат антииммуноглобулин-поликатион сорбировался на 90г тимоиитов и почти не десорби-ровался в результате четырех последовательных отмывания клеток в избытке среды. Как и следовало охидать. замена антииммуноглобулина на альбумин в составе конъюгата с поликагионон ничего не изменила. Следовательно, прочность взаимодействия коныогата белок- поликатион с клетками, липенными рецепторов к белковой части коныогата. полностью определялась взаинодействиеи поликатионной части с клеточной мембраной. Коньюгат антииммуноглобулин-полианион сорбировался на 85клеток тимуса и в результате последовательных отмывок практически полностью десорбировался. Очень небольшое количество коныогата обнаруживалось лить на 15/ тимоиитов (рис. 12).

следовательно, в отличие от коныогата на основе поликатиона, коньюгат антииммуноглобулин-полианион главным образом удерживается на поверхности \г -клеток за счет специфического взаимодействия с Ig-peuenторами и относительно легко десорбируется с клеток (тинонитов). не инетих поверхностных 18.

Исследование возможности миграции конъюгатов с поверхности одной клетки на другую.

Выше было отпечено, что вопрос о возможности миграции коныогата антиген-полиион очень важен для создания обоснованных представлений о механизме иммунной роакпин на такие коньюгаты, для понимания, почему in vivo реакция на коньюгат антиген-полиион

260 ¿00

iSO 100 50

о

Pwc. it. язнененне интенсивности свечгняя <Fa> солеиоиитов в реэгль-та« десорваии : 1 - антк-М-Фйти:

г - пл^-антя-1а-«нти;

3 - СП- :и-11-»ИП1. ери 4-х кратных последовательны* отниваниях клеток в Физиологической раствор«, заштрихованные столбик» с Кг I • HHTiHCKBHOCTV свгчгния нечгкаа клеток до начала отнызания.

400 ?5

50 25

%

fa К

rfl

ih r*i

к5

рис. tie изменение числа «луоресцирлсашя сЬленоинтов ш в результате десореиии: t - анта-1в-«ити;

г - плл-аити-ii'wrm

3 - сп-аити-И-ФИТИ. при %-х кратных послеяорательнмх отниваниях клеток в Физиологическом растворе. Заштрихованные столбики (<;) - количество меченых клеток по начала отмывания.

Гг

12 Изменение интенсивности свечения сят») и числа Флуоресдиру-тинопитов (X) в результате десорбции: 1 - анти-1в-ФИТЦ;

г - плл-анти-18-ФИТЦ:

3 - ПЛЛ-БСЛ-ФИТЦ;

4 - сп-анти-1в-Фита. последовательных 4-х кратных отмывках тимопитов в Физиологическом воре. Заштрихованные столбики (К;) - соответствующие значения Рш еток до отмывания.

-JH

более интенсивная, чем на антиген в отдельности, одна из теорий (Петров Р. В. . Кабанов В. А. . Хаитов Р. И., 19S2) предполагает селективную доставку иммуностимулирующего полимера на клетки, имеющие рецептор к антигеннои части конъюгата и, как результат, активацию полимером именно этик клеток, и следовательно, активацию иммунной реакции. Такое представление предполагает боэнояность относительно быстрой миграции конъюгата с клетки на клетку до тех пор. пока он не окажется на клетках, имеющих рецепторы к антигенной части конъюгата. однако, правомерно ть предположения о миграции конъюгата ранее не исследовалось, в данной части работы мы попытались в принципе оценить возможность перехода сорбированных на клетке молекул ковъюгата антииймукоглобулин-поли..он на поверхность другой клетки. При этом кы использовали в-лимФоблас-ты с Iß-реиепторами. с которыми специфически сорбировалась белковая часть коньюгата.

Суспензию В-лимФобластов. полученных из 3-х дневной культуры лимфоцитов, активированных /шс из е. сон. разделяли на две порции Одну порцию инкубировали с меченым конъюгатом в условиях "насып ния" клеточной поверхности лигандом. _атем неченые клетки отныва несколько раз средой для удаления несвязавтегося лиганда из среды После этого суспензию меченых в-лииФобластов сливали с суспгнзи немеченых таких же клеток (вторая порция исходной суспензии), сме меченых и немеченых клеток инкубировали в течение 1.5 часов, проб дя исследование интенсивности Флуоресценции и процента меченых кл ток каждые полчаса.

в-лимфобласты, предварительно меченые конъюгатом антиикмуногл булин-поликатион, локализовались по интенсивности Флуоресценции области от 121 до 255 усл. ед. (рис. 13. табл. б). Неокраяенные клетк давали небольшой уровень спсчтаннной флуоресценции в области от О то усл.ед. Только что приготовленная смесь двух суспензия, меченн и немеченнои. в соотношении по числу клеток 1:1 денонстрирова равное число клеток в двух областях 0-70 усл. ед. и 121-255 усл. ед Через 30, 60 и 90 минут совместного инкубирования снеси клеток в условиях суспензии гистограмма муоресиенпии не изменялась и соответствовала четкому разграничению двух популяции В-бластов на меченые и немеченые.

В другом варианте экспериментов после смешивания суспензии н ченнх В-ьластов с немечеными все клетки осаждали мягким ыентриФУГ рованием и оставляли инкубироваться в виде клеточного осадк_, в к тором меченые и немеченые В-бласты находились в условиях прямо контакта. В этом варианте совместного инкубирования подавляют большинство клеток так и оставалось либо немечеными (область 0-Угл. ед. I. либо меченными (область iai-255 усл. ед. I. Но меьа* да?

' ! ! } 1 ■ ^ _ ) ; ' ч* . ^ , ^ , ~ / ^ _

чп» «г ¿1 .1 ' '

немеченые бласты ¿ласты, метенные каньигатои

через 60 ;?ан после емеинваиия через 90 мян после смеппзаняя

Ряс. 13 Перераспределение коггвигага ШИ-знта-Гд -ИПЦ ме-зду ЛПО-акта-вяровапными бластшин клеткамя.

По оса абсцисс - интенсивность •Злуордсцеяцви; по осз ордгнат - количество клеток.

та»лич.з 5. Лро'сесс перераспределения анта-1в-ФИТи не»дг

ЛПС-активированными Сластиини клетками.

Тки процент властны* клгтск с различной клеток кнтег.сквяостыо флуоресценции в каналах 0-50 51-90 91-255

Ш игиечгвае 1вв> 6

В« 1 »5.1

10. ^ Еа)

при сиеанвааиа: 23, 1 1,1 70,0

♦ Ба)

■аз всаакг:

30 нш 17, е з, а тз, а

«о «ми 1а, г 4. 1 77, 7

Углоияые обозначения: Б - /ШС-активированные властные клетки, иитактиыя Б« - /ШС-актиеиро-ванныр властные клгтки, нгчешше мти-1г-')4!Ш.

Тазлида б. Перераспределение конъсгата ПЛЛ-аити -1«-<Йт1

»(»еду /ис-акткЕИРованиымй багетными клетками.

Тип Проке клеток ят клеток с различной интенсивностью флуоресценции в каналах: 0-Ю 10-70 ' 71-120 121-255

В яемечениг «0. 7 9.0 0.3 0,0

В« 1. 1 о, г 0.7 98, 0

при смрииэании 43. 3 ■ е, 4 г. з «в, 0

в осадке:

30 мни 19. е ю,; е.г 61, 3

СО мии 34, 5 10, 5 9.3 «5, 5

50 мни 24, 5 11, и 11.7 50.«

VгIioв«ыг обозначении: Б - ЛЯС-активнгованные балетки? клетки, интзктные; Б» - .ЛПС-активированные пластин» клетки, предварительно обработанные Плл-анти-И-■шти, пваады отиытые в Физиологическои растворе.

Таблица Т. Процесс пере'аспределения коньсгата СИ-анти-1е-ФИ

нежду лпс-активированньши властными клетками.

Тип клеток Процент клеток с различной интенсиеностьр Флуоресиениии в каналак: 0-10 11-50 91-150 151-2^5

(Я) 73,4 25, Т 0, 9 и. 0

1Е" 1 16. 1 а. 4 9. г 6». 3

' 1 БЧ

пги смешивании 34,5 19,г 7, 0 40. 3

<Б>•(Е-)

з ос*вХе:

30 мим 29.0 24, 7 10, 5 ?5. «

ьо ййн 25, з 24. 5 12. 2 зс. 1

90 НИН гз, 9 2 3. 5 1?.. 0 40. 6

УсЛорнмр обозначения: (Б) - УЗПС-активированные линфоииты срлвт^нки ныгаи. интактные: (БЧ - /ШС-актнвигованнне лин-Фоиити. йеченные конмогатои.

основными пиками на гистограмнах появлялось немного клеток, меченных коньюгатом, соответственно интенсивности флуоресценции от то усл. ед. до 1го усл. ед. (рис. 13, табл. б).

при этой общий процент меченых клеток (от то до 255 усл. ед. ) возрастал с 51* в момент смешивания двух суспензия до 62* через 90 минут совместного инкубирования меченых и немеченых клеток.

Полученные данные, по-видимому, указывают на возможность перехода небольиого количества меченого конъюгата с поверхности одних клеток на небольшое число других. Однако, процент клеток, которые приобрели нетку с поверхности соседних клеток, невелик. Более того, этот процесс занимает довольно большие промежутки времени - порядка 30-60 кинут. Наконец, он реально может быть зарегистрирован липь в условиях прямого контакта меченых и немеченых клеток, но не в условиях клеточной суспензии.

Похожие результаты были получены при исследовании возможности миграции коныогата антииммуноглобулин-полианион с поверхности одних В-бластов на другие (табл.7). В этом случае при совместной инкубировании неченых и немеченых клеток в условиях суспензии не было никаких признаков миграции конъюгата даже в течение 1,5 часов.

При инкубировании клеток в виде смешанного осадка наблюдали лишь небольшую тенденцию к появление вновь мечены;-: клеток: сразу после смешивания двух суспензий было итл, а через 60 и 90 минут их совместного инкубирования в условиях прямого контакта - соответственно 5ок и 5гк. такие небольшие изменения (на 3-4'/.) близки к обычным ошибкам метода цитофлуоринетрии и поэтому ногут быть расценены лить как указание на тенденцию к появлению вновь меченых клеток с очень небольшой интенсивностью Флуоресценции. Причем не ранее, чем через 60 минут после начала контактирования меченых клеток с немечеными.

Из полученных данных можно заключить, что миграция молекул ,

-I-

кокьюгатов антитело-поликатион или антитело-полианион с одних Iв --клеток на другие представляется маловероятной, либо относится к довольно медленным (времена порядка 1 часа) и редким событиям, требующим прямого длительного контактирования меченых клеток с немечеными.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В пелом. экспериментальные исследования, представленные в данной работе, подробно описывают процессы адсорбции иммуностимулирующих полиионов и беяок-полиионных коньюгатов на иинунокомпетентаых клетках. Помимо чисто качественных (топография распределения меченых лигандов на поверхности клерки), получены количественные характеристики процессов взаинодеистеия полимер-клетка и коньюгат-клет-

- ла-

ка . Представлены зависимости доза-эффект, кинетика процессов, и. обратимость при удалении лиганда из среды или при внесении в сред конкурирующего лиганда. В случае конъюгатов белок-полиион исследо вано их взаимодействие как с клетками, несущими высокоаФФиш е ре ыепторы к белковой части коньюгата. так и с клетками, не инеюшии таких рецепторов, наконец, принципиально изучена возможность нигра аии полиионов и еелок-полинерных коньюгатов с клетки на клетку.

выводы

1. Иммуностимулирующие полвдоны. взаимодействуя с лимфоидньм клетками, адсорбируются на их поверхностной мембране, топографй! распределения на клеточной нембране различна в случае адсорбции по лианиона и поликатиона, меченый флуорохромон полианион (сополиме: акриловой и метакриловои кислот) равномерно распределялся по клеточной поверхности, напротив, поликатион <поли-Ь-лизин) сорбировал ся в виде 1-г полюсов размером около 1-1.0 мкм.

2. Кинетика адсорбции полиионов на поверхности лимФоидных кле ток относительно быстрая. "Насыщение" поверхности клеток полиионо! завершается в первые 5-7 минут.

3. сорбпия полиионов на лимфоидных ) .етках обратима, однако, п этому признаку кие». :я значительные различия между полианионом поликатионом. Молекулы поликатиона удерживаются на клеточной повер хности значительно прочнее, чем молекулы полианиона. Удаление поли иона из околоклеточной среды сопровождается десорбцией 10-15?. моле кул поликатиона и около 80/. молекул полианиона.

4. между молекулами полинома, сорбированными на клеточной немб ране, и свободными молекулаии полимера в околоклеточной среде про исходят реакции обнена. Неченые молекулы полианиона, внесенные околоклеточную среду, эффективно вытесняют идентичные немеченые по лимерные молекулы с клеточной поверхности, занимая их места сорб ции. Неченые молекулы поликатиона десорбируются с поверхности лим Фоидных клеток в течение 1-2 минут после внесения в околоклеточну среду противоположно заряженного полианиона.

5. Возможен переход нолекул полииона с поверхности одной лим-Фоидной клетки на поверхность другой клетки, процесс перехода медленный, характеризуется временами порядка 1 часа, наблюдаете лишь при условии прямого контакта клеток, ко не в суспензии. Даа при соблюдении указанных условий с одних клеток на другие мигриро вало очень небольшое количество сорбированных молекул полииона. и процесс перехода наблюдался не более, чем у Ю* контактирующих кле ток.

Ь. взаимодействие коньюгата поликон-белок с я1:н*-оияш:кя клетка-

о

ш. нмеюпими спеакФическпг рецептора :< белковой части ко?:ьюгг*та, или : клетками, • не имекотми таких редептороз, сзтзестзояно зг>"?;сит сг >нлка заряда ионогенных гр/лл полимера. При адсорб«:-;и юлианион-белок на лимфоидгшх клетках, несупих специфически? рекс-л-?орн к белку, определявшим является высокоаФ^инвое взаикодейстеке ¡елкозоп части коньюгата с соответствухжкми рецепторами. полимерная теть коньюгата (полианион) слабо взаимодействует с клеточке"! тзб >аной, легко десорбируется и не нарушает специфичности и пгочлост:' гзаимодействия белка с рецептором. ■ Напротив, адсоръаия кон^л-.гятов ¡оликатион-белок на лимфоидныя клетках практически полностью опре-:еляется абсорбционными свойствами поликатиона. Неэаппсимо от '{алчна на клетке рецептора к белковой части, такие конъ»с -та прочно дсорбируютсп на клеточной ненбране, вклад специфического взанно-.еяствня белковой части коньюгата с соответствующий рецептора!« естественен.

Список опубликованных работ.

1. фев^адепа И. с. , Поспелова о. Д.. . Свиридов б. д, Некрасов А. S. . тауллаханов г и., Хаитов Р. Н. Адсорбция полиэлектролнта на позе??:-ости лимФоидной клетки: различия между поликатионом и лолиашюном. АН ссср. 19s9, т. 307. н 2, стр. 504-506,

2. AtaullaKhanov к. I. , Fevraieva i.s.. Pospeiova о. L. Polarity f the external membrane of the lymphoid cell. - Abstract:: of tnt th international consress «.-t Iiraunoiogy. west Berlin, July '0-usust 5, 1969 led. Fisher G. ), p, 158.

3. Атауллаханов P. И.. февгалева И. С. , Поспелова о. Л. Полярность пенней некбраиы лки4оидной клетки. - Тезиса Первого Pct» союзного мунологического съезда (Сочи, 15-17 ноября 1909)

эд ред. Петрова Р. В., том г, стр. 4.

4. Pospeiova о. L. Studies of adsorption of mfíunostmmtins Mylons on the lymphoid cells, uaciid 91, Furusato Village, Chli»a, ipim. Feb. 3-6, 1991, p. 62.

5. Поспелова о. Л , Атауллаханоз P.M., Хаитов P.M. Адсорбппя по-ганиона на линфоидншг клетках: распределение на клеточной попер«- , зсти, кинетика и обратимость связывания. Иммунология (991, КЗ, ПР. 33-36.

участок кисжительной техники оонц аш СССР ПОЛИ. К ПЕЧАТИ Л7.РЗ заказ иг тирля JóO zr.i.