Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Роль стимуляции В-клеток в профилактике и лечении стрессорных и аутоиммунных расстройств

Актуальность проблемы. Все большее число различных патологических состояний, далеких на первый взгляд от иммунопатологий, не без оснований связывают с нарушениями, возникающими в иммунной системе [Новиков, 1995]. Вместе с тем общим во влиянии как фармакологических средств, так и иммунотропных препаратов (иммуностимуляторы, иммунодепрессанты), является то, что они в норме [Wortis, 1995] и, в частности, при В-клеточных патологиях [Ivanovska, 1997; Williams, 1997] обусловливают определенный иммунный ритм стимуляции и супрессии В- и Т-клеток, сроки и интенсивность которого остаются неизученными.

Хорошо известно, что в профилактику и в схемы традиционного лечения ряда заболеваний включают иммуномодуляторы, механизм действия которых направлен по Т-зависимому типу иммунного ответа [Земсков, 1996; Караулов, 1996]. Несмотря на большие успехи в иммунотерапии, иммунокоррекция патологических состояний стрессогенной этиологии и лечение различных аутоиммунных заболеваний продолжает оставаться актуальной проблемой современной фармакологии. Все более вероятной становится возможность применения препаратов с Т-независимой активностью в иммунотерапии такого рода патологических состояний, так как известно, что эффект Т-зависимых стимуляторов в ряде случаев нивелируется за счет генетической детерминированности механизмов защиты, коррекция которых возможна при Т-независимом типе ответа [Петров, 1983; 1996; Morford, 1994].

Препаратов с Т-независимой активностью крайне мало в аре-нале иммуномодулирующих средств. Не вызывает сомнений возможность расширения, арсенала активных и безопасных стимуляторов В-клеток за счет их поиска среди препаратов на основе N-винилпирролидона (N-ВП) [Петров, 1983; Braley-Mullen, 1994]. Анализ данных литературы о влиянии холиноблокаторов на активность B-клеток [Адо, 1996, Забродский, 1995; Booker, 1994] позволяет считать целесообразным поиск стимуляторов B-клеток и среди этого ряда известных и применяемых препаратов.

Актуальным также является исследование при разных терапевтических ситуациях механизмов стимулирования B-клеток в фазе пролонгации, под которыми подразумевают вовлечение Т-хелперов в иммунный ответ с помощью альтернативных механизмов, обусловленных активностью Fe-, СЗ-рецепторов, молекул CD28, CD40 и т. д. [Mond, 1995; Snapper, 1994]. Исследование сроков стимуляции и супрессии лимфоидных клеток при применении препаратов с Т-независимой активностью предопределяет реальную возможность снижения поликлональной активности В-кпеток при сочетанном применении их с фармакологическими препаратами, где, как известно [Яновский, 1990], намечается возможность усиления пролонгированного действия лекарственных средств.

Проблематичность применения даже известных иммуномодуляторов обусловлена тем, что показания к их назначению противоречивы, отсутствуют единые методы оценки прогноза действия иммуномодуляторов [Жук, 1993; Ширинский, 1993; 1995]. Поиск методов долгосрочного прогноза для иммуномодуляторов основывается на известных результатах, демонстрирующих важную роль конкурентных взаимодействий между функциональной активностью Т- и B-клеток в динамике иммунного ответа [Freitas, 1994; 1995; Lean, 1995], поэтому методы, включающие оценку соотношения функциональной активности Т- и В-кпеток, могут являться оптимальным скрининговым подходом к оценке действия иммуномодуляторов при выборе биологически активной дозы препарата и при исследовании иммунофармакодинамики.

Целью исследования явилось обоснование целесообразности сочетанного применения препаратов с Т-независимой активностью и адаптогенных средств при профилактике стресса, а также использование для этих целей холиноблокаторов, и обоснование способов регуляции активности В-клеток при аутоиммунных расстройствах.

Задачи исследования.

1. Выбор биологически активной дозы и исследование иммунофармакодинамики иммуномодуляторов с Т-независимой активностью, среди которых ИМ-1, ИМ-2 относятся к новым соединениям, а повиаргол (антимикробный препарат на основе N1-ВП, содержащий в качестве мембраноактивного компонента металлическое серебро), метацин и бензогексоний (м- и н-холиноблокатары) - к известным и применяемым препаратам.

2. Скрининговая оценка иммунотропной активности ИМ1 - ИМ-4 и изучение иммуномодулирующих эффектов ИМ-1 в соответствии с методическими рекомендациями Фармакологического комитета, а также исследование на модели адъювантного артрита у крыс иммуномодулирующего действия различных доз ИМ-1 и различного порога стрессорных воздействий (озон в течение 30 и 90 суток, 1 мг/м3).

3. Отработка схем профилактики стресса (гипоксия, водоиммерсионный стресс) при сочетанном применении стимулятора В-клеток повиаргола и адаптогенных средств ИЭМ-1875 или натрия оксибутирата, а также использование для этих целей холиноблокаторов метацина или бензогексония.

4. Изучение особенностей монотерапии адъювантного артрита у крыс при применении стимулятора В-клеток ИМ-1, Т-клеток - диуманкала для разработки схем сочетанного применения иммуномодуляторов с разными механизмами действия.

5. Оценка влияния на анафилактический шок у морских свинок ацеклидина (стимулятор м-холинорецепторов), метацина (блокатор м-холинорецепторов), бензогексония (блокатор н-холинорецепторов) и прозерина (антихолинэстеразный препарат) по сравнению с влиянием на него метацина в комбинации с прозерином (одновременная блокада м- и стимуляция н-холинорецепторов). Исследование активности Т- и В-клеток у морских свинок, десенсибилизированных метацином в комбинации с прозерином.

Научная новизна работы. Установлено, что наличие в составе препаратов на основе [М-ВП функционально-активных групп определяет их влияние на иммунную систему; сополимеры М-ВП с эскулином (ИМ-1) и бромэтоксикумарином (ИМ-2) стимулируют В-лимфоциты, а сополимеры с имидозолэтоксикумарином (ИМ-3) и малеимидэтоксикумарином (ИМ-4) - Т-лимфоциты.

Впервые среди сополимеров М-ВП с бензопиран-2-онами выявлен нетоксичный полимерный адъювант ИМ-1, обладающий тимуснезависимым увеличенным пролонгированным действием (до 45 суток), в течение которого между Т- и В-кпетками определяется конкурентный характер взаимодействия.

Подтверждено, что маркеры функциональной активности Т- и В-клеток являются оптимальным критерием оценки действия стимуляторов В-клеток на иммунную систему при выборе доз и исследовании иммунофармакодинамики, когда оценивается действие препарата на регуляторные механизмы в разные сроки после введения препарата.

Впервые установлено, что известные и применяемые препараты обладают пролонгированным действием, при котором повиаргол (антимикробный препарат), содержащий металлическое серебро, и метацин (м-холиноблокатор) вызывают Т-зависимый (5 сутки) и Т-независимый (14 сутки) АОК-ответы, а бензогексоний (н-холиноблокатор) инициирует Т-независимый и затем Т-зависимый АОК-ответы.

Впервые разработаны схемы иммунокоррекции стресса, при которых в качестве стимуляторов В-кпеток применены известные препараты. Показано, что в зависимости от характера действия препаратов на иммунную систему назначения к их применению неодинаковы. Стимулятор В-кпеток на основе 1Ч-ВП повиаргол применяется в комбинации со стресспротекторными средством ИЭМ-1875 или натрия оксибутиратом по схеме, при которой повиаргол вводится за 14 суток, а лекарственное средство - за 30 мин до стресса, что в наибольшей степени нивелирует патофизиологические изменения при стрессе. Этим самым подтверждается представление о том, что для снижения поликлональной стимуляции В-клеток необходимо применение альтернативной иммунокоррекции. Впервые установлен факт холиноопосредованной Т-независимой стимуляции В-клеток, интенсивность которой является достаточной для профилактики стресса.

Впервые представлены результаты терапии адъювантного артрита иммунокорректорами с разным механизмом действия. Установлены сроки отвечаемости Т- и В-клеток на действие препаратов в условиях патологии. Показано, что в индуктивную фазу артрита, а возможно и других заболеваний аутоиммунной природы, целесообразно применение стимуляторов В-клеток, тогда как на поздних стадиях - стимуляторов Т-кпеток. Кроме того, в условиях индукции артрита у крыс стрессорные факторы (озон в концентрации 1 мг/кг3 в течение 90 суток и ИМ-1 в дозах 40-50 мг/кг) приводят к нарушению конкурентного взаимодействия между Т- и В-клетками, проявляющемуся в гиперактивации обоих типов клеток, на фоне усугубления симптоматики артрита.

Впервые на модели анафилактического шока у морских свинок, сопровождающегося гиперактивностью В- и супрессией Т-кпеток, показана целесообразность ингибирования функции В-кпеток путем блокады м- и одновременной стимуляции н-холинорецепторов. Лечебный эффект достигается при применении метацина за 40 мин, а прозерина - за 15 мин до шока. Десенсибилизация свинок данным комплексом приводит к нормализации активности Т- и В-кпеток.

Положения, выносимые на защиту.

1. Регулировать функциональную активность В-клеток можно сополимерами N1-ВП с бензопиран-2-онами и низкомолекулярными металлокомплексами на основе М-ВП, а также активизацией холинозависимых механизмов нервной системы холиноторопными препаратами.

2. В зависимости от механизма влияния на В-клетки фармакологических средств ИМ-1, повиаргола и метацина, а также неодинакового хронобиологического ритма отвечаемости клеток-мишеней в норме и в условиях патологии, используются различные способы их применения при профилактике стресса и лечении аутоиммунных расстройств.

3. Защитного эффекта при стрессе можно добиться комплексом препаратов, где стимулятор В-клеток применяется за 14 суток и стресспротекторные средства - за 30 мин до него; эффективные результаты могут быть получены также, если активизировать холинозависимые механизмы стимуляции В-клеток.

4. В индуктивной фазе адъювантного артрита и анафилактического шока мишенью действия лекарственных средств являются В-клетки. При артритах для восстановления сниженной функции В-клеток целесообразна их стимуляция, а при анафилактическом шоке, сопровождающемся гиперакгивностью В-клеток, - подавление их функции путем блокады м- и одновременной стимуляции н-холинорецепторов. На поздних стадиях заболевания, когда мишенью действия лекарственных средств являются Т-клетки, целесообразно применение стимуляторов Т-клеток.

Теоретическая и практическая значимость работы. Значение полученных данных состоит в обосновании возможности поиска стимуляторов В-клеток среди препаратов на основе М-ВП и среди холинотропных средств периферического действия. Однако уровень организованной функциональной активности В- и Т-клеток при непосредственной стимуляции В-клеток иммунокорректорами и холиноопосредованной их активации качественно различен. Результаты исследования позволили внести важные дополнения в общую систему иммуностимуляции организма, что теоретически обосновывает новые подходы к профилактике и лечению ряда патологических состояний.

В ходе исследования разработаны новые схемы профилактики стресса. Установлено, что применение стимуляторов В-клеток на основе М-ВП в комбинации со стресспротекторными средствами, и применение м-холиноблокаторов, когда не требуется дополнительная фармакологическая коррекция, позволяет обеспечить защиту организма при стрессе. Предложен новый подход к терапии артритов, при котором разработана схема сочетанного применения стимуляторов В- и Т-клеток, которая может найти применение и при иммунотерапии иных аутоиммунных заболеваний. Показана новая возможность ингибирования гиперакгивности В-системы при анафилактическом шоке, заключающаяся в блокаде м- и одновременной стимуляции н-холинорецепторов, которая также может найти широкое применение в клинике при немедленной терапии анафилаксий.

Внедрение результатов исследования в практику. По материалам диссертации на новые соединения получено два авторских свидетельства на изобретения. Соединение под индексом ИМ-1 зарегистрйровано в Государственном реестре изобретений СССР как "Линейный сополимер N-винилпирролидона с эскулином в качестве полимерного адъюванта" [A.c. № 1610849, 1990] и соединение под индексом ИМ-4 - как "Сополимер N-винилпирролидона и 7-/2'-малеимидэтокси/-5,6-бензопиран-2-она в качестве иммуностимулятора" [А. с. № 1702665, 1991]. Среди известных препаратов для дифференцированного лечения больных легкими формами гепатита (аутоиммунное заболевание) в клинике внутренних болезней №2 Медицинской Академии им. Мечникова (Санкт-Петербург) с 1998 г применялся метацин. У больных при низкой активности B-клеток целесообразно назначение метацина, а через две недели при отсутствии признаков усиления воспалительной реакции -последовательное его назначение каждые две недели [Акт о внедрении от 2 апреля 1999 г.].

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на IX Межинститутской конференции "Факторы гуморального и клеточного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск, 1988), на конференции "Актуальные проблемы прикладной иммунологии, биотехнологии и производства бактерийных препаратов" (Пермь, 1988), на конференции "Вопросы иммунодиагностики и профилактики в медицине" (Санкт-Петербург, 1990), на интернациональной конференции по медицинской биотехнологии и иммунопрофилактике СПИДа (Санкт-Петербург, 1991), на 17 интернациональном конгрессе (Берлин, 1991), на 1 съезде Российского научного общества Фармакологов "Фундаментальные исследования как основа создания лекарственных средств" (Волгоград, 1995), на научных конференциях в отделе нейрофармакологии НИИ экспериментальной медицины (Санкт-Петербург, 1995; 1996), на Всероссийской конференции "Актуальные проблемы создания лекарственных средств" (Санкт-Петербург, 1997), на Конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1997). Диссертационная работа апробирована на конференции отделов нейрофармакологии и иммунологии НИИ экспериментальной медицины РАМН (Санкт-Петербург, 1999), на конференции лабораторий лекарственной токсикологии, цереброваскулярных расстройств, клинической психофармакологии, психофармакологии, фармакокинетики НИИ фармакологии РАМН (Москва, 1999).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 35 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 256 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, 5 глав результатов собственных исследований, их обсуждения и выводов. В работе имеется 80 таблиц и 22 рисунка. Библиографический указатель содержит 283 источника, из которого 148 принадлежат отечественным и 135 -зарубежным авторам.

226 ВЫВОДЫ

1. Среди изученных соединений новый сополимер 14- ВП с эскулином (ИМ-1), а также применяемые фармакологические средства - антимикробный препарат на основе Ы- ВП повиаргол и м-холиноблокатор метацин являются- нетоксичными полимерными адъювантами с тимуснезависимым увеличенным пролонгированным действием (от 14 до 45 суток).*

2. Функциональные маркеры Т- и В-клеток являются адекватными критериями при выборе биологически активной дозы и исследовании пролонгированного действия стимуляторов В-клеток, характерной особенностью которого является наличие конкурентных взаимодействий между Т и В-лимфоцитами. Критерием при выборе биологически активной дозы соединения является условие, что инициация активности В-клеток препаратом не должна приводить к супрессии Т-клеток.

3. При хроническом воздействии озона (1 мг/м3, 90 суток) и однократном применении высоких доз ИМ-1 (30-50 мг/кг) нарушаются конкурентные взаимодействия в функциональной активности Т- и В-клеток, что приводит к гиперактивации этих популяций клеток, и развитие на таком фоне адъювантного артрита сопровождается усугублением тяжести процесса.

4. Результативность профилактики стресса (гипоксия, водоиммерсионный стресс) возрастает при сочетанном применении стимулятора В-клеток повиаргола и адаптогенных средств ИЭМ-1875, натрия оксибутирата, когда повиаргол вводится за 14 суток, а ИЭМ-1875 или натрия оксибутират - за 30 мин до него.

5. Защитный эффект от последствий стресса может быть обеспечен, если активизировать холинозависимые структуры метацином, у которого определяется два механизма защиты организма: непосредственная блокада м-холинорецепторов

22 7 желудка (метацин за 30 мин до стресса) и активация Т-независимых механизмов иммунорегуляции (метацин за 14. суток до стресса).

6. Лечение адъювантного артрита предполагает на стадии локального воспаления применение стимулятора В-клеток (ИМ-1, 10 мг/кг), а через две недели при диссеминированных артритных повреждениях - стимулятора Т-клеток (диуманкал, 0,1 мг/кг). Сочетание избирательно действующих средств позволяет рассматривать полистимуляцию как один из оптимальных путей иммуностимулирующей терапии аутоиммунных заболеваний.

7. В индуктивной фазе анафилактического шока, где мишенью действия лекарственных средств являются гиперактивные В-клетки, целесообразно подавление их функции путем блокады м- и одновременной стимуляции н-холинорецепторов (метацин вводится за 40 мин, а прозерин - за 15 мин до воспроизведения шока), что может иметь большое значение при немедленной терапии анафилаксий.

Заключение

Данное исследование направлено на поиск стимуляторов В-клеток и применение их при профилактике стресса и лечении иммунопатологии. Согласно концепции стимулирования иммунного ответа Т-независимыми иммуномодуляторами, оценивается действие не только вводимого иммуномодулятора и реагирующей системы, но и возможность контроля фенотипической коррекции иммунного ответа [85, 105, 106, 107, 129, 138]. Поиск стимуляторов В-клеток проводился среди двух групп препаратов: среди новых и известных препаратов на основе [Ч-винилпирролидона (Ы-ВП), а также среди известных избирательно действующих холинотропных препаратов периферического действия.

Предпосылки использования препаратов на основе Ы-ВП для стимуляции В-клеток достаточно обоснованы [58, 76, 105, 106, 135, 163]. Работа в этом направлении позволяет одновременно дополнить данные о механизме пролонгированного действия препаратов на основе Ы-ВП на иммунную систему и применять эти препараты как инструмент для анализа механизмов действия стимуляторов В-клеток иных лекарственных групп. Не вызывает сомнений, что м- и н-холинозависимая активация иммунной системы приводит к усилению активности В-клеток [8, 10, 151, 267], поэтому оценка влияния препаратов избирательно действующих на периферические м- и н-холинорецепторы целесообразна с позиций использования холинотропных препаратов в качестве стимуляторов В-клеток. Уникальность действия стимуляторов В-клеток заключается в том, что такие препараты при однократном применении способны обеспечить высокую интенсивность иммунного ответа при наличии глубоких нарушений в иммунной системе [24, 147, 234 273]. В-лимфоциты не только удерживают антиген на своей поверхности, но и являются антигенпредставляющими клетками, превращающимися благодаря альтернативным путям активации в плазматические клетки-продуценты иммуноглобулинов, а одна из функций полиреактивных антител заключается в том, что на их фоне развивается специфическая иммунная реакция [96, 127 283], характер которой определяется конкурентным взаимодействием В- и Т-клеток [105, 185, 186. 221]. Неизученность пролонгированного действия иммуномодуляторов и отсутствие общепринятых способов снижения поликлональной активности затрудняют их применение при профилактике и лечении иммупатологических состояний. Проблема оценки пролонгированного действия препаратов становится актуальной, так накапливающийся фактический материал [283] свидетельствует, что не только иммунотропные препараты (иммуностимуляторы, иммунодепрессанты), но и фармакологические агенты инициируют иммунный ритм стимуляции и супрессии лимфоидных клеток, сроки которого остаются неизвестными для конкретных групп препаратов. Известно, что общепринятых скрининговых методов оценки действия В-стимуляторов на иммунную систему нет, но, основываясь на данных о важной роли конкурентных взаимодействий между Т- и В-клетками в динамике иммунного ответа, использование маркеров, включающих оценку функциональной активности Т- и В-клеток, является оптимальным критерием прогноза действия иммуномодуляторов как при выборе биологически активной дозы препарата, так и при исследовании иммунофармакодинамики.

В главе 3 показаны результаты оценки ИМ-1 - ИМ-4. Предварительный анализ влияния препаратов на число АОК и РОК, на морфологический показатель аффинности (МПА), на реакцию трансплантат против хозяина и на появление незрелых форм макрофагов у мышей-гибридов (CBAxC57BI/6)Fi показал, что ИМ-1 и

ИМ-2 влияют преимущественно на активность В-клеток, а ИМ-3 и ИМ-4 - на активность Т-клеток (см. табл. 3.2.1). Полученные результаты позволили заключить, что влияние препаратов на основе N-ВП обусловливается мембраноактивными компонентами, какими для ИМ-1 являются гидроксильная и глюкозидная этоксигруппы, для ИМ-2 - бромэтоксигруппа, а характер действия ИМ-3 и ИМ-4 определяют функционально-активные гетероциклы имидазол и малеид, соответственно, что согласуется с результатами работы В.М. Манько и сотр. [84]. Авторы показали, что имидазолсодержащие полиэлектролиты стимулируют Т-клетки, но их влияние зависит от дозы соединения.

В связи с тем, что ИМ-2 обладает более жестким физиологическим действием на организм [41 ], детальному иммунологическому анализу был подвергнут ИМ-1, тогда как ИМ-2 применялся в качестве препарата сравнения при выборе доз и при исследовании иммунофармакодинамики препаратов. Выбор дозы препарата для фармакологического применения определялся тем, что стимуляция В-клеток, не должна сопровождаться супрессией Т-клеток, так как известно, что чрезмерная стимуляция иммунной системы есть такая же, если не худшая, чем иммунодефицит, форма нарушения иммунного гомеостаза [75]. Исследование влияния различных доз ИМ-1 и ИМ-2 (от 1 до 150 мг/кг) на число АОК и РОК при выборе биологически активной дозы препаратов, позволило показать, что доза 10 мг/кг обеспечивала сохранение функциональной активности Т-лимфоцитов. Число РОК на ранних сроках иммунной реакции (5 сутки) составляло 14±-19±0,1% от общего числа спленоцитов (п=24) (см. рис. 3.3.1, 3.3.2).

Хорошо известно, что N-ВП содержится в ретикулоэндотелиальных клетках в течение 75 суток [114]. Однако влияние полимеров на основе N-ВП на активность В-клеток исследовалось лишь в течение 21 суток [104]. Было продемонстрировано, что при введении полимеров число АОК остается увеличенным в течение 21 суток, но, оценивая пролонгирующее действие полимера, авторы не сопоставляли активность Т- и В-клеток в эти сроки, поэтому иммунный ритм стимуляции и супрессии лимфоидных клеток остался неизвестным, а более поздние исследования механизма действия иммуномодуляторов с очевидностью продемонстрировали, что иммунная система обладает саморегулирующимися механизмами, действие которых обусловливается активацией одних процессов и супрессией других [32,105, 131, 177, 240]. С позиций имеющихся в настоящее время сведений не исключается возможность того, что инициирующее хелперное или супрессивное действие может проявлять одна и та же клетка [35, 159]. Косвенным подтверждением такого рода предположений является собственный анализ динамики функциональной активности Т- и В-лимфоцитов на протяжении 80 суток после введения мышам-гибридам (CBAxC57B/l6)Fi ИМ-1 и ИМ-2 в дозах 10 и 150 мг/кг. Исследование пролонгированного действия препаратов в дозе 10 мг/кг на число АОК и РОК в селезенке мышей позволило продемонстрировать, что активность В-клеток подчиняется осцилляторному ритму стимуляции и супрессии, который определяется в течение 60 суток. Анализ конкурентных взаимодействий между Т- и В-кпетками показал, что ИМ-1 в дозе 10 мг/кг вызывает Т-зависимый иммунный ответ в индуктивный период (5 сутки), а Т-независимый - в продуктивный период (14 сутки) и в отдаленные сроки иммунной реакции (45 сутки), когда увеличение числа АОК доходило до 1649±26310"6 (Р<0,001, п=18) (см. рис. 3.3.1). Препарат ИМ-2 в дозе 10 мг/кг инициировал активность В-клеток, которая характеризовалась Т-независимыми АОК-ответами (5 - 45 сутки), а препараты в дозах 150 мг/кг вызывали пролонгированную толерантность между Т- и В-клетками, что наиболее выражено было при применении ИМ-2 (см. рис. 3.3.2 - 3.3.4). Вместе с тем у ИМ-1 и ИМ-2 независимо от примененной дозы уже на 7 и вплоть до 50 - 70 суток, наряду со специфической активацией, проявлялась поликлональная стимуляция В-клеток (см. табл. 3.3.1 и табл. 3.3.2).

Оценка иммуномодулирующего действия ИМ-1 в соответствии с требованиями методических рекомендаций Фармакологического комитета [93] подтвердила, что рекомендуемая для фармакологического использования доза 10 мг/кг не супрессирует реакции Т-клеточного иммунитета. Однако ИМ-1 в этой дозе не влияет на кооперативное взаимодействие Т-, В-клеток, которое проявляется лишь при дозах 30 и выше мг/кг (см. табл. 3.4.5.4 - 3.4.5.7), что согласуется с результатами работы [105], в которой показано, что полиэлектролиты в дозах 50 мг/кг усиливали кооперацию Т-В-клеток. Однако собственные результаты оценки иммунофармакодинамики позволяют предположить, что ИМ-1 инициирует Т-В-клеточное взаимодействие в фазе пролонгации. Установлено также, что ИМ-1 в дозе 10 мг/кг усиливает фагоцитарную активность макрофагов, но завершенность фагоцитоза можно обеспечить лишь очень большими дозами препарата (50, 100, 150 мг/кг) (см. табл. 3.4.3.1 - 3.4.3.2). По-видимому, результатом действия высоких доз является активация естественных механизмов защиты и последующая толерантность между Т- и В-кпетками в ответ на стрессорное действие высоких доз химических соединений.

Показано, что препарат ИМ-1 усиливает действие не только корпускулярных АГ (эритроциты барана), но и усиливает действие слабых белковых АГ, в качестве которых применялись с гемагглютинины (ГА) вирусов гриппа группы НЗМ2. Исследование различных составов конъюгатов выявило, что соотношение ГА и ИМ-1 1:10 является наиболее оптимальным вариантом для применения в биотехнологии (см. табл. 3.4.1.2). Обратный среднегеометрический титр антител в реакции РТГА у подопытных кроликов, получивших конъюгат ГА-ИМ-1 (1:10), составлял 320000±521 (Р<0,001, п=30), по сравнению с 5000+240 при применении ГА (п=24) (см. табл. 3.4.1.3).

Таким образом, ИМ-1 - это новое уникальное иммуномодифиццрующее средство, интенсивность и продолжительность действия которого носит дозозависимый характер. Это нетоксичное соединение и в качестве полимерного адъюванта превосходит по своим свойствам ИМ-2 в отношении значения ЛД50, не оказывает митостатической и лимфотоксической активности (см. табл. 3.4,5.1), не обладает аллергезирующим действием (см. подраздел 3.4.6) и может быть использовано в биотехнологии и иммунологии как иммуномодулятор с Т-независимой активностью, подобной АГ 2 типа. Преимуществом таких соединений является то, что структура и состав их четко контролируется современными физико-химическими методами и это позволяет разрабатывать такие иммунобиологические препараты, у которых сохраняется нативная конформация и определенный химический состав, обеспечивающий высокую активность и избирательность действия препарата. Оценка пролонгированного действия ИМ-1 и ИМ-2 позволила показать, что они, являясь В-клеточными стимуляторами, способны осуществлять запуск механизмов, определяющих конкурентный характер взаимодействия в функциональной активности Т- и В-лимфоцитов, что, по-видимому, может отражать один из этапов саморегулирования иммунной системы, который проявляется в данных условиях в течение 45-60 дней.

В главе 4 представлены результаты оценки иммунотропной активности сомономеров ИМ-1 и ИМ-2 - эскулина и диуманкала, соответственно. При исследовании различных доз препаратов и их иммунофармакодинамики было подтверждено, что сопоставление числа АО К и РОК является информативным скрининговым маркером прогноза действия препаратов. В результате исследования широкого диапазона доз эскулина (1 - 150 мг/кг) было установлено, что наиболее биологически оптимальной его дозой является доза 10 мг/кг, а при исследовании диуманкала в диапазоне доз 0,01 - 10 мг/кг - доза 0,1 мг/кг (см рис. 4.1.1 и 4.1.2). Оценка иммунофармакодинамики эскулина и диуманкала показала, что в меньшей степени эскулин и в большей - диуманкал изменяют активность Т- и В-клеток. Диуманкал, являясь по принципу изначального действия стимулятором Т-клеток (см. подраздел 4.2), инициирует осцилляторный характер стимуляции и супрессии Т- и В-кпеток, который определяется в течение 100 суток. Однако размах варьирования между активностью Т- и В-клеток не так существенен как при ИМ-1 и ИМ-2 (см. рис. 4.3.1). Можно предположить, что сополимеризация сомономеров с N-ВП пролонгирует и усиливает действие эскулина (ИМ-1) на В-клетки, а включение при полимеризации диуманкала и N-ВП (ИМ-2) в состав макромолекул мембраноактивных бромэтоксигрупп также предопределяет их влияние на В-клетки.

Детальный характер оценки действия ИМ-1 и ИМ-2, как и диуманкала позволил наметить, на наш взгляд, основные первичные критерии оценки действия препаратов. Показано, что оценка функциональной активности Т- и В-клеток является оптимальным маркером при выборе биологически активных доз и при оценке пролонгированного действия препаратов, обладающих иммуностимулирующими свойствами, к которым, как известно, могут относиться лекарственные средства различных фармакологических групп: транквилизаторы, нейролептики, стимуляторы центральной и вегетативной нервной систем, нестероидные противовоспалительные средства, блокаторы кальциевых каналов, аминокислоты, азолы и другие соединения [13, 18, 28, 36, 47, 84, 150].

Представлялось, что повиаргол, относящийся к новому поколению антимикробных серебросодержащих препаратов на основе N-ВП, будет действовать по известному механизму [175], вызывая Т-зависимую активацию В-клеток. Анализ активности Т- и В-клеток после однократного введения повиаргола (10 мг/кг) показал наличие двух пиков АОК-ответов: на 5 и 14 сутки, но конкурентные взаимодействия между Т- и В-клетками определялись лишь на 14 сутки (число АОК на 5 сутки в опыте - 600±, на 14 сутки - 880+; в контроле - 480±30'10*, Р<0,05, Р<0,001; п=12, п=12) (см. рис. 4.4.1.1). Полученные результаты позволили предположить, что повиаргол в индуктивную фазу вызывает Т-зависимый, а в продуктивную фазу Т-независимый поликпональные АОК-ответы. При Т-независимом ответе на фоне существенного повышения числа АОК снижается число РОК по сравнению с контролями (естественный фон, иммунизация ЭБ) (п=12, Р<0,001).

Таким образом, иммуноспецифический механизм действия повиаргола подтвердил также правомочность предположений [106, 152], что ряд низкомолекулярных мембраноактивных соединений может стимулировать активность В-клеток по принципу действия Т-независимых стимуляторов. Сопоставимыми параметрами действия полимерных и низкомолекулярных стимуляторов В-клеток является их влияние на Т-зависимые и Т-независимые АОК-ответы в индуктивный и продуктивный период иммунного ответа (5 и 14 сутки).

В главе 5 представлены результаты оценки влияния холинотроных препаратов периферического действия на активность Т- и B-кпеток. Установлено, что метацин и бензогексоний (м- и н-холиноблакаторы) в той или иной степени влияют преимущественно на активность В-клеток и лишь прозерин (антихолинэстеразный препарат), обладает выраженным модулирующим эффектом. В индуктивную фазу иммунного ответа метацин (2 мг/кг) оказывает незначительное стимулирующее влияние (число АОК в опыте - 580+ - 620±, в контроле - 400± -450+5010"6 (Р<0,05, п=24), а бензогексоний (10 мг/кг) в эти сроки обеспечивает высокую активность В-лимфоцитам (число АОК - 1000+ - 1100+5010"6; Р<0,001, п=24). В продуктивную фазу иммунного ответа лишь метацин влияет на активность В-лимфоцитов (число АОК варьирует в пределах 800+ - 1000+5010"6, Р<0,001, п=24) и кривая его действия является более крутой по сравнению с действием бензогексония (см. рис. 5.2.1). Анализ характера функциональной активности Т- и В-клеток на пиках активности В-клеток позволил предположить, что метацин инициирует Т-зависимый (5 сутки) и Т-независимый АОК-ответ (14 сутки), а бензогексоний, наоборот - Т-независимый (5 сутки) и Т-зависимый АОК-ответ (14 сутки). Особенности изменения функциональной активности, обусловленные холинотропными препаратами, проявлялись не только в селезенке подопытных животных, но и в тимусе, костном мозге и бронхиальных лимфатических узлах (см. рис. 5.2.2 - 5.2.4). Сопоставление иммуностимулирующих свойств ИМ-1 и метацина, ИМ-2 и бензогексония позволило заключить, что для стимуляции В-клеток можно использовать холинотропные препараты. Существующие сведения об альтернативных механизмах активации В-клеток [24, 147, 234, 273] и анализ собственных результатов позволил предположить, что препараты, опосредуют холинозависимый альтернативный механизм активации В-клеток.

В главе 6 представлены результаты исследования влияния высоких доз ИМ-1 (20 - 50 мг/кг) и влияния высоких концентраций озона (1мг/м3, в течение 30 и 90 суток) на активность Т- В-клеток и особенности развития на этом фоне адъювантного артрита. Доказана зависимость глубины иммунодефицита от вида и дозы химического ксенобиотика, в связи с чем показатели реактивности иммунной системы предложено использовать в качестве критерия для установления предельно допустимых концентраций химических веществ, а модель адъювантного артрита может служить для оценки иммуносупрессирующего действия лекарственных средств и стрессорных воздействий [69, 101]. Известно, что высокая доза стимулятора ингибирует пролиферацию и вызывает супрессию Т-клеток в течение 72 часов. Механизм действия высокой дозы соединения определяется ее влиянием на активность В-клеток и чрезмерная стимуляция клеток приводит к их апоптозу [167, 169]. Собственные результаты показали, что влияние высоких доз химически активных агентов различной природы приводят к одному результату -значительному увеличению активности не только В-, но и Т-клеток. В связи с чем можно было предположить, что высокие дозы биологически активных соединений приводят к нарушению взаимодействия между Т- и В-клетками, проявляющегося отсутствием реакции друг на друга. Это согласуется с работами [154, 244], где при детальном изучении аутоиммунных заболеваний было установлено, что, несмотря на обилие клеточных элементов, составляющих иммунную систему, центральным звеном, усугубляющим ход процесса, являются толерантность между Т- и В-лимфоцитами.

При исследовании влияния высоких доз ИМ-1 течение адъювантного артрита у крыс были получены доказательства того, что препарат в дозе 40 и 50 мг/кг приводит к усугублению симптоматики артрита. Увеличение интенсивности реакции (ИР) отека лапок на поздних сроках болезни (21 сутки) варьировало в пределах 260+ - 270+ - в опыте, по сравнению со 180±4 - в контроле (нелеченые крысы) (значения + по Стъюденту, Р<0,001, п=24) (см. рис. 6.2.1). Число АОК и РОК в эти срйки составляло: в опыте - 263± - 245±1010"6 и 68±-51±310~3, в контроле -137+1310"6 и 15±1,3"Ю~3 (Р<0,001, п=24) (см. табл. 6.2.16 и табл. 6.2.17).

Анализ течения адъювантного артрита у крыс, подвергнутых хроническому воздействию высокой концентрации озона, показал, что интенсивность реакции отека лапок зависела от уровня сенсибилизации их озоном. После 30-суточной сенсибилизации на ранних сроках заболевания наблюдалось резкое снижение суставного синдрома, на 60 сутки изменения в суставах подопытных крыс существенно усилились по сравнению с группой контроля (интакгные крысы с адъювантным артритом) (ИР, % в опыте - 291+22, в контроле - 171+14) (Р<0,001, п=24). Наряду с усилением интенсивности воспалительных реакций у крыс в эти сроки в 80% случаев было выявлено наличие язв на голеностопных суставах, в отличие от контрольных животных, где изъязвление суставов определялось в 50% случаев уже на 3 сутки (см. табл. 6.2.1).

В условиях 90-суточной сенсибилизации крыс озоном практически невозможно было затормозить развитие артрита. Язвы на голеностопных суставах у стрессированных крыс появлялись на 7 сутки опыта в 90% случаев (ИР,% в опыте -448±39, в контроле -191 ±24) (см. табл.6.2.8 и табл. 6.2.9). Анализ активности Т- и В-клеток при наличии язв на голеностопных суставах показал, что в случае 30-суточной сенсибилизации озоном число АОК в селезенке крыс достигало 787±27'10'6 клеток, а число РОК - 24±2,7% (в контроле -152±12'10"6 и 16+1,4%, Р<0,001 и Р<0,05, соответственно, п=20) (см. табл. 6.2.5), тогда как при 90-суточной сенсибилизации эти величины составляли - 1523±27Ю"6 клеток и 33±2%, соответственно (см. табл. 6.2.13). Полученные нами факты согласуются с результатами работ [97, 134, 156], где показано, что существует определенный порог стрессорных воздействий, который способен затормозить развитие аутоиммунного процесса. Так, 30-суточная сенсибилизация, при которой происходит увеличение числа АОК в 4-5 раз, приводит к снижению воспалительного процесса. Случаи отягощения симптоматики артрита в этих условиях наблюдаются на 60 сутки. Можно предположить, что после 90-суточной сенсибилизации, когда число АОК возрастает в 6-10 раз, нарушаются саморегуляторные механизмы в иммунной системе, что приводит к выходу из-под контроля скорости созревания Т-лимфоцитов. Гирерактивация В- и Т-кпеток (см. табл.6.2.13), сопровождающаяся выраженной атрофией тимуса (% массы тимуса от массы тела в опыте - 0,6± - 0,9±0,01, в контроле -1,8± -1,9+0,3, Р<0,001, п=30, см. табл. 6.2.12), на фоне нарушений в неспецифической защите организма (эритро- и лейкоцитопения, Р<0,05 - Р<0,001, увеличение числа поврежденных нейтрофилов, Р<0,001, п=24, см. табл. 6.2.14 и табл. 6.2.15) приводит к отягощению процесса.

Таким образом, воздействия высоких доз химически активных агентов различной природы приводят к одному результату - значительному увеличению активности В- и Т-клеток, проявляющемуся в отсутствии реакции друг на друга, а не снижающаяся активность Т- и В-клеток при выраженной атрофии тимуса и нарушении неспецифических механизмов защиты является, по-видимому, стимулирующим фактором развития аутоиммунных процессов в организме.

Глава 7 посвящена отработке режимов профилактики стресса и выбору тактики лечения В-клеточных патологий. Моделями стресса служили гипоксия с гиперкапнией (мыши) и водоиммерсионный стресс (крысы), а моделями В-клеточных патологий - адъювантный артрит (крысы) и анафилактический шок (морские свинки).

Режимы профилактики гипоксии были следующие: введение препаратов за 30 мин; введение стимулятора В-клеток повиаргола за 1, 5, 14, 21 и 28 суток до гипоксии. На фоне введенного повиаргола исследовалось влияние на гипоксию стресспротекторных средств ИЭМ-1875 (10 мг/кг, хлоргидрат-2-аминоэтиламид пальмитовой кислоты) и натрия оксибутирата (300 мг/кг, препарат сравнения), которые применялись за 30, 60 мин и 4 суток до гипоксии. Критерием влияния препаратов на гипоксию служила продолжительность жизни мышей. Показано, что препараты повиаргол, ИЭМ-1875 и натрия оксибутират, введенные за 30 мин до гипоксии, удлиняют продолжительность жизни мышей (от 8,8+0,9 мин - в контроле, до 15,8±0,4, 17,2±0,7 и 15,3±0,6 мин - в опыте, Р<0,001, п=24) (см. табл. 7.1.1.2). Как и ожидалось, различная степень модуляции активности В-кпеток повиарголом (5, 14, 21 сутки) до гипоксии удлиняет продолжительность жизни мышей (см. рис 7.1.1.2). При исследовании сочетанного действия препаратов на гипоксию выявилось, что введение повиаргола за 5 суток, а препарата ИЭМ-1875 - за 30 мин до гипоксии увеличивает продолжительность жизни мышей до 19,3+1,1 мин (Р<0,001, п=24). Однако наиболее значимых результатов в условиях сочетанного применения препаратов можно было достичь, если применять ИЭМ-1875 на 14 сутки, где продолжительность жизни мышей достигала 31,4±0,8 мин (Р<0,001, п=24) (см. табл.7.1.1.3). На основании данных литературы [127] можно предположить, что эффект действия лекарственных средств в индуктивном периоде иммунного ответа связан с активностью немутированного полиспецифического клона В-клеток, которые в продуктивную фазу иммунного ответа заменяются мутированными В-клетками.

Таким образом, даже на такой жесткой модели, какой является гипоксия с гиперкапнией в гермообъеме, удалось продемонстрировать, что выбор оптимальных сроков применения препаратов имеет большое значение.

Важным подтверждением сделанных выше заключений явилось исследование схем профилактики водоиммерсионного стресса (ВИС). Оценка противоязвенного действия препаратов показала, что только метацин, введенный за 30 мин до стресса приводит к наиболее существенному снижению числа язв в желудке. Индекс язвообразования (ИЯ, баллы) в контроле составляет 3,2+ 0,2, в опыте - 1,3+0,3 (Р<0,001, п=24,) (см. табл.7.1.2.1). Существенного снижения числа язв в желудке можно добиться также при апробированном на гипоксии регламенте сочетанного применения препаратов, когда повиаргол (10 мг/кг) вводится за 14 суток, а ИЭМ-1875 (10 мг/кг) и натрий оксибутират (50-300 мг/кг) - за 30 мин до ВИС. ИЯ в контроле составляет 3,4+ - 3,5+0,2, в опыте - 1,3+ и 1,3± - 1,8±0,1, соответственно (Р<0,001, п=24,) (см. табл.7.1.2.2). Помимо того, оказалось, что на фоне предварительной стимуляции В-клеток появляется возможность снижения доз препарата ИЭМ-1865 (5 мг/кг) и натрия оксибутирата (50 мг/кг), которые могли проявлять антистрессорное действие в более высоких дозах: ИЭМ-1865 - 10, 20 мг/кг и натрия оксибутират - 300 мг/кг (см. табл. 7.1.2.1). Полученные результаты позволили заключить, что при неспецифическом действии препаратов на процессы язвообразование влияет активация иммунных механизмов, что и приводит к снижению числа язв в желудке крыс. Сопоставление данных литературы о механизмах действия иммуномодуляторов [47, 86, 107, 170, 221] и анализ собственных результатов позволяют предположить, что при Т-независимом ответе усиление активности В-клеток приводит к замедлению хронобиологического ритма отвечаемости Т-клеток, активность которых можно восстановить в продуктивную фазу иммунного ответа (14 сутки). Поэтому введение лекарственных средств в эти сроки, согласно имеющимся сведениям [51, 214, 215], вызывает немедленный Т-зависимый иммунный ответ на введение лекарственного препарата, который реализуется в течение 30 мин через специфические фармакологические рецепторы Т- и В-клеток.

Таким образом, на модели водоиммерсионного стресса подтвердилась результативность введения адаптогенных средств на пике продуктивного периода антителогенеза (14 сутки), тогда как отдельное введение повиаргола или лекарственных средств менее эффективно по сравнению с их сочетанным применением.

Полученные результаты позволяют заключить, что необходимый уровень активности В-клеток в продуктивную фазу иммунного ответа (14 сутки) можно обеспечить одноразовым введением препарата, инициирующего с Т-независимую активность В-клеток, и это является оптимальным сроком предварительной иммунокоррекции при стрессе. Если высокий уровень активности В-клеток, инициированный повиарголом, где они, вполне вероятно, выполняли функции антигенпредставляющих клеток, способствовал усилению эффективности антистрессорных свойств лекарственных средств, то при применении холинотропных препаратов определяются иные механизмы активации В-клеток. Анализ документированного материала о влиянии холинотропных средств на иммунную систему демонстрирует, что стимуляция м-холинорецепторов приводит к увеличению числа АОК в индуктивную фазу иммунного ответа [8, 10, 48, 49, 151]. На сопоставлении имеющихся сведений литературы вполне допустимым представляется механизм их действия, при котором стимуляция м-холинорецепторов, в силу реципрокных взаимодействий, приведет к угнетению адренергических механизмов [16] и снижению активности Т-лимфоцитов [251], а в силу реципрокных взаимодействий активированных Т- и В-клеток [185, 186, 221] - к увеличению активности В-клеток. При сопоставлении большого фактического материала о механизмах блокады м-холинорецепторов, можно предположить, что вещества, подобные никотину, оказывают возбуждающее, а затем тормозящее влияние на вегетативные ганглии, повышают выход адреналина из надпочечников [16], который активирует Т-клетки [251], синтезирующие ацетилхолин [188]. Последующий дефицит адреналина [16], а также увеличивающаяся продукция глюкокортикоидов оказывают супрессирующее действие на Т-опосредованные механизмы. Как показали результаты последних работ (1998 г) [267], глюкокортикоиды блокируют Т-клетки в G1-фазе, вследствие чего снижается число Т-лимфоцитов, формирующих - розетки с эритроцитами барана (РОК), что и приводит, по-видимому, в фазе пролонгации к Т-независимой стимуляции В-клеток.

В разработке схем профилактики водоиммерсионного стресса мы исходили из того, что активация периферических м- и н-холинорецепторов оказывает влияние на Т-зависимые и Т-независимые механизмы стимуляции В-клеток, активность которых снижает патофизиологические изменения при стрессе. Полученные результаты подтвердили, что крысы, подвергнутые стрессу на 5 сутки (индуктивная фаза иммунного ответа) после ведения метацина или бензогексония, имеют значительно меньшее число язв в желудке по сравнению с контролем (физиологический контроль). Однако наиболее эффективные результаты получены на 14 сутки после введения метацина (ИЯ в контроле - 3,2±0,1, в опыте - 1,0±0,01, Р<0,001, п=24). Дополнительная модуляция активности м- и н-холинорецепторов (на 5 и 14 сутки) метацином (2 мг/кг, за 40 мин) в комбинации с прозерином (0,02 мг/кг, за 15 мин) или бензогексонием (10 мг/кг, за 40 мин) в комбинации с прозерином (0,02 мг/кг, за 15 мин) увеличивала уровень защиты желудка крыс, но лишь по сравнению с контролем, но не по сравнению с модулированной холинотропными препаратами иммунной защитой (см. табл. 7.1.2.3). Имеющиеся в литературе сведения [192] и полученные собственные результаты, позволят предположить, что активность В-клеток при Т-независимом иммунном ответе, инициированном метацином, является физиологичной для защиты организма от последствий стресса и не требует дополнительной фармакологической коррекции. На основании полученных результатов можно заключить, что у метацина определяются два механизма влияния на процессы язвообразования в желудке крыс, один из которых обусловлен блокадой м-холинорецепторов органа, а другой - инициацией Т-независимой активности В-лимфоцитов.

Таким образом, анализ иммунотропной активности холинотропных средств показал, что блокада м-холинорецепторов метацином способна обеспечить Т-независимую стимуляцию В-клеток в продуктивный период иммунного ответа (14 сутки). Результаты профилактического применения препаратов при водоиммерсионном стрессе позволили показать, что применение м-холиноблокаторов периферического действия может являться важным компонентом профилактических мероприятий, предпринимаемых для снижения патофизиологических изменений при стрессе. В ходе проведенных исследований очевидным явилось, что Т-независимость иммунного ответа, инициированная стимулятором В-клеток на основе Ы-ВП повиарголом и опосредованная блокадой м-холинорецепторов метацином, имеет качественные различия, связанные с активностью В-клеток, которые не удается дифференцировать количественным измерением числа АОК в лимфоидных органах.

Вопросам иммунотерапии заболеваний, связанных с активацией В-клеток, уделяется крайне мало внимания. В наших экспериментах моделями В-клеточных патологий служили адъювантный артрит у крыс (3 тип иммунопатологии) и анафилактический шок у морских свинок (1 тип иммунопатологии). Разный патогенез заболеваний и неодинаковый механизм влияния на активность В-клеток иммунотропных средств предопределили поиск способов применения их в каждом конкретном случае.

Согласно существующим версиям, основой развития аутоиммунных болезней является нарушение гормонального контроля иммунной системы [202], активизация В- и супрессия Т-клеток [272], нарушение в соотношении Т хелперов 1 и 2 типов [29, 121, 261], а в ряде случаев - наличие толерантности во взаимодействии Т- и В-клеток [154]. Анализ работ показывает, что авторы исследовали определенные этапы генерализованного артрита, а различные нарушения в активности Т- и В-лимфоцитов при раннем локальном воспалении остаются не изученными. Вместе с тем в эксперименте на модели адъювантного артрита показано, что у крыс на стадии раннего отека тестерон подавляет активность В-клеток, а во время генерализованной артритной реакции простогландины супрессируют активность Т-клеток [280]. Лечение артрита веществами, оказывающими влияние на активность В- и Т-клеток приводит к стимуляции или супрессии процесса, что связано с различной чувствительностью В- и Т-лимфоцитов, вовлеченных в иммунный ответ [202, 206]. Кроме того анализ данных литературы [160, 168, 174, 177] показал, что при аутоиммунных заболеваниях существует специфическая и неспецифическая лоликлональная активация и супрессия В-, и с Т-лимфоцитов. Однако ритмы стимуляции и супрессии В- и Т-клеток при применении иммуномодуляторов остаются неизвестными. Схем сочетанного применения иммуностимуляторов с разными механизмами действия практически нет, хотя эффекты взаимодействия такого рода препаратов продемонстрированы в ранних работах Р. В. Петрова и соавт. [105]. В приведенных исследователями материалах было показано, что предварительное введение Т-независимого антигена (N8-3) мышам за 2-4 дня до иммунизации их ЭБ снижает число АОК. Авторы предположили, что угнетение иммунной реакции связано с тем, что большинство В-клеток под влиянием полиэлектролитов дифференцируются в АОК-продуценты, а другие клетки, находящиеся на промежуточных стадиях дифференцировки, не в состоянии адекватно реагировать на антигенную стимуляцию. Механизм этого действия требует детального изучения, но полученные факты свидетельствовали о том, что активность В-клеток можно корректировать с помощью Т-зависимых иммуномодуляторов.

Сопоставление собственных результатов монотерапии адъювантного артрита у крыс при использовании избирательно действующих на Т- и В-клетки стимуляторов, а также а-токоферол ацетата (а-ТА), мембраноактивного препарата, обладающего противовоспалительными и иммуномодулирующими свойствами и применяемого для этих целей в эксперименте [19, 110] позволяло конкретизировать сроки стимулирующего и супрессирующего влияния различных иммунокорректоров и сроки их назначения. Полученные результаты монотерапии артрита ИМ-1 в дозе 10 мг/кг (В-клеточный стимулятор), диуманкалом в дозе 0,1 мг/кг (Т-клеточный стимулятор) и а-ТА в дозе 400 МЕ на животное показали, что на ранних стадиях заболевания (7 сутки) у крыс, получивших ИМ-1, интенсивность отека голеностопных суставов существенно снижалась (ИР, % в опыте - 60+9, в контроле - 175±24, Р<0,001, п=24). На поздних стадиях заболевания, начиная с 3-й недели, ИМ-1 не снижал артритную реакцию (ИР,% в опыте -190±, в контроле -185±4, Р<0,5, п=24). В данных условиях опыта ИР снижался у крыс, получивших а-ТА и диуманкал (145± и 62±4, Р<0,001, п=24) (см. рис. 7.2.1).

Сопоставление динамики иммунных реакций с симптоматикой артрита позволяло предположить, что на ранних стадиях заболевания введение ИМ-1, вызывающего 5-6 кратное увеличение числа АОК и восстановление числа Т-клеток (см. рис. 7.2.2 а, б), предотвращает альтерирующее действие патогенных вирусов и способствует снижению интенсивности воспаления. Однако увеличение активности В-клеток на поздних стадиях артрита (21 сутки) нивелирует защитный эффект ИМ-1. На основании данных литературы [31, 97, 102, 164] и полученных собственных результатов можно заключить, что при гипериммунном ответе интенсивное антителообразование в фазе пролонгации является мощным супрессивным компонентом, приводящим к срыву адаптации. Подтверждением тому является анализ морфологического показателя аффинности Т-клеток (МПА). Установлено, что ИМ-1 не предотвращает изменений в рецепторной активности Т-клеток, обусловленных патологическим процессом, когда превалирует число свободных Т-лимфоцитов и Т-лимфоцитов, имеющих на поверхности мембраны 1-3 рецептора к эритроцитам барана, а, напротив, ускоряет эти сроки изменений. К концу 2 недели число свободных Т-лимфоцитов и число Т-лимфоцитов, имеющих на поверхности разное количество рецепторов к эритроцитам барана, соответствует контрольным значениям (интакгные крысы), но на 3 неделе значения МПА вновь соответствуют патологическому состоянию (см. рис.7.2.3).

Имеющийся документированный материал по действию липидного модулятора и антиоксиданта - а-ТА на Т-лимфоциты [19] и полученные нами результаты показали, что при патологии Т-клетки становятся мишенью действия как для а-ТА, так и для диуманкала на 14 и 21 сутки после их введения, что приводит к снижению воспалительного процесса. Выявлено, что к концу 2-й недели лечения артрита а-ТА число РОК достигает 61+%, а к концу 3-й недели при лечении диуманкалом - 64±3% (см. рис. 7.2.2 а, в, г). Оценка МПА (см. рис.7.2.3 - 1, 2, 3, 5) подтверждала, что в сроки снижения воспалительного процесса функциональная активность Т-лимфоцитов восстанавливалась и в количественном измерении соответствовала контрольным результатам (интактные животные). Заключая оценку характера действия препаратов на течение адъювантного артрита можно предположить, что на поздних стадиях заболевания не только антиоксидантные свойства препарата, но и стимуляция Т-клеток, способны обеспечить снижение тяжести артрита. Вполне допустимым является предположение о том, что направленная, а не патологическая мобилизация активности Т-лимфоцитов приводит к снижению интенсивности воспалительного процесса.

Таким образом, полученные результаты показали, что на ранних стадиях заболевания стимуляторы В-клеток оказывают положительный эффект, приводящий к снижению отеков голеностопных суставов, тогда как на поздних стадиях адъювантного артрита а-ТА и в большей степени диуманкал оказывают тормозящий эффект на развитие воспалительной реакции. Проведенное исследование определяет возможное направление в иммуностимулирующей терапии аутоиммунных заболеваний, при которой в индуктивную фазу заболевания целесообразно рекомендовать использовать Т-независимые иммуностимуляторы для повышения активности В-клеток. Учитывая патогенетическую направленность процесса, а также пролонгирующее действие препаратов на В-клетки, в продуктивную фазу артрита для снижения гиперактивности В-клеток необходима стимуляция Т-клеток. Восстановление количественных и функциональных параметров клеток сопровождается резким снижением воспалительного процесса.

В связи с изменением понимания молекулярной и генетической этиологии анафилаксии стала очевидной важная роль механизмов активации Т- и В-клеток в патогенезе её развития [236, 277]. Однако имеющийся экспериментальный материал по иммунотерапии анафилактического шока носит достаточно противоречивый характер [11, 39, 83, 181, 184, 248]. Поэтому мы предположили, что комплекс метацина в комбинации с прозерином (за 40 и за 15 мин соответственно), который, как известно [80], блокирует м- и одновременно стимулирует нхолинорецепторы, будет являться оптимальным способом предупреждения анафилактического шока (АШ). Предпосылкой применения такого комплекса препаратов служили результаты работ, в которых показано, что механизм действия м-холиноблокаторов обусловлен снижением чувствительности эффекторных тканей за счет ингибиции м-холинорецепторов [37, 245, 249, 270] и стимуляцией адренергических механизмов [10, 16, 80], активность которых, сопряжена с увеличением активности Т- [36] и супрессией активности В-клеток [8, 10, 158]. Следовательно, перспективность применения холинотропных средств периферического действия при немедленной терапии АШ связана, прежде всего, с тем, что блокада м-холинорецепторов сопряжена со снижением высокой активности В-клеток, а активация периферических н-холинорецепторов, в свою очередь, как известно [267], приводит к снижению аутоиммунных процессов.

Анализ собственных результатов оценки влияния на анафилактический шок ацекпидина (стимулятор м-холинорецепторов, 0,35 мг/кг), метацина (блокатор м-холинорецепторов, 2 мг/кг), метацина (2 мг/кг) в комбинации с прозерином (0,02 мг/кг) (блокада м- и одновременная стимуляция н-холинорецепторов), бензогексония (блокатор н-холинорецепторов, 10 мг/кг) подтвердил, что холинотропные препараты различно влияют на тяжесть АШ. Оказалось, что как избирательное стимулирование м-холинорецепторов ацекпидином, так и блокада н-холинорецепторов бензогексонием, согласно анафилактическому индексу (АИ), практически не снижают выраженности системной анафилактической реакции. Прозерин достоверно снижает выраженность АШ в случае применения его за 15 и 30 мин и не оказывает существенного влияния при введении за 40 мин до индукции АШ (АИ в опыте - 2,5±0,1, 2,8+0,2 и 3,5±0,3 соответственно; контроле - 4,0+0,0, Р<0,5 - Р<0,001, п=18). По-видимому, накапливающийся в течение 15, 30 мин ацетилхолин подвергается постепенному разрушению ацетилхолиноэстеразой. В небольших концентрациях ацетилхолин оказывает воздействие как на м-, так и н-холинорецепторы, не исключена возможность более существенной стимуляции им н-холинорецепторов, но через 40 мин при более высокой концентрации нейромедиатора у прозерина проявляется высокое м-холиномиметическое действие сравнимое с эффектом ацеклидина. В случае блокады м-холинорецепторов метацином за 15, 30 и 40 мин АИ снижается до 2,3+ 2,3± и 2,5±0,2 балла соответственно (Р<0,001, п=18), а когда одновременно имеет место блокада м- и стимуляция н-холинорецепторов (метацин введен за 40 мин, а прозерин на фоне метацина - за 15 мин до шока) АИ снижается в 10 раз по сравнению с контролем (АИ в опыте - 0,4+, в контроле - 4±0,01) (Р<0,001, п=30). При сравнении эффектов метацина в комбинации с прозерином с эталонными препаратами было установлено, что метацин по действию равнозначен супрастину, а комплекс метацина с прозерином - эуфиллину (см. табл. 7.3. 2).

Исследование функциональной активности Т- и В-клеток у сенсибилизированных и нелеченных свинок показало наличие конкурентных взаимодействий между этими популяциями клеток. Установлено, что через 24 часа при благоприятном исходе шока у свинок, десенсибилизированных метацином в комбинации с прозерином, активность Т- и В-клеток приближается к норме. Число АОК снижается от 877+2510'6 в контроле (нелеченые свинки) до 193+1510"6 в опыте метацин в комбинации с прозерином), а число РОК повышается от 0,5±0,001% до 9+2% соответственно (см. табл. 7.3.3).

Таким образом, нами было показано, что у нелеченых свинок определяются выраженные конкурентные взаимодействия между активностью Т- и В-клеток, а одновременная блокада м- и стимуляция н-холинорецепторов наиболее существенно снижают анафилаксию и нивелируют эту зависимость между Т- и В-клетками. Следовательно, применение холинотропных препаратов, оказывающих действие на структуры нервной системы, способные контролировать интенсивность иммунного ответа, чрезвычайно важно при немедленной терапии анафилаксий.

В заключение можно обобщить, что исследование иммуноспецифического механизма действия стимуляторов В-клеток в норме и в условиях патологии, а также расширение их арсенала за счет препаратов на основе М-ВП и известных холинотропных препаратов периферического действия, стимулирующих те структуры нервной системы, которые способны контролировать фенотипическую коррекцию иммунного сохраняет свою высокую актуальность. Для этого существуют веские основания, обусловленные конкретной возможностью их назначения при патологических состояниях.

Во-первых, результативность профилактики стресса (гипоксия, водоиммерсионный стресс) возрастает при сочетанном применении стимуляторов В-клеток и стреспротекгорных средств за счет усиления протекторных свойств лекарственных препаратов, если они применяются на 14 сутки после введения стимулятора В-клеток; эффективные результаты могут быть достигнуты при применении холинотропных препаратов, блокирующих активность периферических м-холинорецепторов. При данных способах профилактики появляется реальная возможность снижения доз применяемых препаратов.

225

Во-вторых, в русле данного подхода осуществляется терапия В-клеточных иммунопатологии Установлено, что в индуктивной фазе адъювантного артрита и анафилактического шока мишенью действия лекарственных средств являются В-клетки. При артритах для восстановления сниженной функции В-клеток целесообразна их стимуляция, а при анафилактическом шоке, сопровождающемся гиперактивностью В-клеток, подавление их функции путем блокады м- и одновременной стимуляции н-холинорецепторов. На поздних стадиях заболевания (для артрита на 14 сутки, а для анафилактического шока на 2 сутки), когда мишенью действия лекарственных становятся Т-клетки, целесообразно применение препаратов, стимулирующих Т-клетки.

В связи с получением новых экспериментальных данных об организованной активности Т- и В-клеток, вновь становится актуальной оценка их функциональной активности в качестве прогностического критерия при выборе биологически активной дозы и исследовании пролонгированного действия препаратов с Т-независимой активностью, что позволяет контролировать их назначение при профилактике и лечении ряда патологических состояний.