Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Фенотипическая коррекция Ir -генного контроля иммунного ответа искусственным антиген-полимерным комплексом

Актуальность темы.

Поиск, создание и изучение механизмов действия иммуностимуляторов является одной из основных задач практической и теоретической иммунологии. Этот вопрос тесно связан с проблемой феноти-пической коррекции генного контроля иммунного ответа, т.е. перевода генетически низкореагирующих на определенные антигены особей в высокореагирующие. Пониженная реактивность к конкретным антигенам, контролируемая генетически, экспрессируется преимущественно на уровне Т-системы лимфоцитов. Поэтому основное внимание должно быть уделено компенсации функций Т-клеток.

В последние годы найдены природные и искусственные полимеры, обладающие выраженной адъювантной активностью. Их можно разделить на три группы: 1) природные высокополимерные соединения (бактериальные и растительные полисахариды, гликопротеиды, липополисаха-ридные комплексы, нуклеиновые кислоты (Доклад научной группы ВОЗ, 1978); 2) искусственно синтезированные аналоги природных полимерных соединений (полипептиды, полинуклеотиды) (В.М.Бемсков, 1973; Schmidtke J.R. et al., 1971} Vogt W. et al., 1973); 3) искусственно синтезированные полимеры, не имеющие аналогов в природе (синтетические полиэлектролиты - полианионы, поликатионы, полиам-фолиты) (Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, 1978).

Иммуностимулирующие свойства синтетических карбоцепных полиэлектролитов были открыты сравнительно недавно. Механизм их действия на иммуногенез связан со способностью полиэлектролитов замещать функцию Т-хелперов и усиливать отдельные этапы иммуногене-неза - пролиферацию и миграцию стволовых кроветворных клеток, Ти B-лимфоцитов, кооперацию Т- и B-клеток в иммунном ответе (Р.В. Петров и соавт., 1974,1975; Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, 1976,1978). Совместными исследованиями коллективов, руководимых академиком Р.В.Петровым, профессором Р.М.Хаитовым, членом-корреспондентом АН СССР В.А.Кабановым, разрабатывается принципиально новый подход к созданию искусственных высокоиммуногенных препаратов - получение искусственных антигенов, представляющих собой комплексы гаптенов или слабоиммуногенных молекул с неприродными полиэлектролитами, обладающими способностью к кооперативному взаимодействию с поверхностью иммунокомпетентных клеток.

Так, комплексирование гаптенов (Р.В.Петров и соавт., 1977) или слабоиммуногенных белков (В.А.Кабанов и соавт., 1978, 1980; Р.В.Петров и соавт., 1979,1981) с молекулами полиэлектролитов позволило получить макромолекулы, обладающие резко повышенной имму-ногенностью.

Иммунный ответ на синтетический полипептид (Т,Г)-А-Л контролируется 1г-1А геном (McDevitt Н.О., Sela М., 1965,1967? Вепасег-ка£ В., 1974{ McKenzie I.F.C., Henning МД., 1977? Klein J. et al., 1978? Benacerraf в., Germain R.H., 1978). Генетически детерминированная низкая отвечаемость особей на конкретные антигены делает важнейшей проблему фенотипической коррекции иммунного ответа. Эти искусственные антигены оказались Т-независимыми. Известно, что ir-гены проявляют свое действие преимущественно на уровне Т-клеток. Отсюда возникла идея, что создание Т-независимых антигенов - это путь к фенотипической коррекции ir-генного контроля иммунного ответа.

Цель и задачи исследования.

Целью нашего исследования явилось изучение возможности фенотипической коррекции иммунного ответа, контролируемого 1г~1А геном, с помощью синтетических полиэлектролитов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) На различных экспериментальных моделях исследовать влияние полиэлектролитов - полиакриловой кислоты (ПАК), поли-4~винил-пиридина (ИБП), сополимера акриловой кислоты (АК) и н-винилпир-ролидона (н-ВПД) - НА, а также модифицированного НА (ША) на гуморальный иммунный ответ на синтетический полипептидный антиген (Т,Г)-А-Л.

2) Исследовать способность полиэлектролитов воздействовать на клеточно-опосредованный иммунный ответ на (Т,Г)-А-Л.

3) Создать полностью искусственный антиген - синтетический полипептид - синтетический полиэлектролит путем конъюгирования (Т,Г)-А-Л с ПАК, иа и мм, обеспечивающий фенотипическую коррекцию генного контроля иммунного ответа на (Т,Г)-А-Л.

4) Исследовать тимусзависимость конъюгата полипептид-полиэлектролит.

Научная новизна результатов исследований.

В отличие от других исследований в нашей работе впервые изучен иммунный ответ на конъюгаты синтетического полипептидного антигена (Т,Г)-А-Л с неприродными полиэлектролитами - ПАК, НА и мна, была показана его тимуснезависимость и исследована возможность фенотипической коррекции иммунного ответа, контролируемого 1г-ТА геном* Впервые показана возможность усиления кооперации Т- и В-лимфоцитов с помощью синтетических полиэлектролитов в системе адоптивного переноса в иммунном ответе на (Т,Г)-А-Л и способность полиэлектролитов усиливать процесс активирования Т-хел-перов (Т,Г)-А-Л, Исследовано влияние синтетических полиэлектролитов на иммунный ответ на конъюгат (Т,Г)-А-Л-тринитрофенил (ТНФ).

Кроме того, показана возможность коррекции не только гуморального, но и клеточного ответа на (Т,Г)-А-Л на модели реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ).

Научно-практическая ценность работы.

Данная работа является частью комплексной программы создания высокоиммуногенных искусственных иммунизирующих препаратов, которые представляют собой антигены или их детерминанты, соединенные с синтетическими неприродными носителями, обладающими иммуностимулирующими свойствами. Нами исследованы некоторые ранее не известные механизмы иммуностимулирующего действия нетоксичных искусственных иммуноадъювантов - сополимеров акриловой кислоты и к-винилпирролидона, установлена возможность "обхода" генетически предетершнированной низкой отвечаемости и возможность создания полностью искусственного тшуснезависимого антигена (Т,Г)-А-Л-по-лиэлектролит.

Исследования, проведенные с применением искусственных антигенов нового типа, - важный этап на пути к решению проблемы фено-типической коррекции иммунного ответа, что является одним из подходов к получению искусственных вакцин.

Работа выполнена в рамках Государственной программы о.69.07 "Исследовать генетические и молекулярные механизмы нарушений иммунитета и наследственных болезней и разработать на этой основе способы их профилактики, диагностики и лечения", утвержденной Постановлением ГКНТ СССР и Госплана СССР Ш 181/128 от 16 июля 1981 года. Результаты проведенных исследований использованы для решения задач, поставленных в разделе 03.01.Н2 данной программы: "Создать искусственные выеокоиммуногенные макромолекулярные комплексы и дать оценку возможности их применения".

ЧАСТЬ I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ВЫВОДЫ

1. Введение искусственных полиэлектролитов реципиентам адоп-тивно перенесенных Т- и В-клеток существенно усиливает иммунный ответ на синтетический антиген (1,Г)-А-Л.

2. Искусственные полиэлектролиты усиливают реакцию гиперчувствительности замедленного типа на синтетический антиген (Т,Г)-А-Л.

3. Введение искусственных полиэлектролитов мышам разных линий, оппозитноотвечающим на (Т,Г)-А-Л, приводит к нивелированию межлинейных различий в иммуногенезе, т.е. к фенотипической коррекции 1г-генного контроля иммунного ответа.

4. Полностью искусственный антиген, представляющий собой конъюгат синтетического полипептида (Т,Г)-А-Л с неприродным полиэлектролитом, проявляет свойства сильного тимуснезависимого иммуногена, обеспечивающий индукцию иммунного ответа у генетически низкореагирующих на (Т,Г)-А-Л особей, т.е. превращение их в фенотипически высокореагирующие.

5. Межлинейные различия в клеточно-опосредованном иммунном ответе на (Т,Г)-А-Л также нивелируются конъюгатом синтетического полипептида (Т,Г)-А-Я с неприродными полиэлектролитами.

6. Полученные данные впервые продемонстрировали возможность фенотипической коррекции синтетическими полиэлектролитами иммунного ответа, контролируемого конкретным 1г-геном.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Большинство природных антигенов представляют собой комплексные молекулы, введение которых в организм вызывает выработку антител на отдельные участки этих молекул, антигенные-детерминанты. Для проявления антигенности имеет большое значение молекулярная

Моделирование синтетических копий антигенных детерминант дало возможность получить иммунный ответ очень узкой специфичности (Seia м., 1975). Использование синтетических полиаминокислот для построения антигенов привели к крупным открытиям и обобщениям, одним из которых является открытие генов иммунного ответа (1г-генов). Экспериментами было показано, что если у некоторой особи отсутствует ген высокого иммунного ответа к данному антигену, то антитела на него вырабатываться будут в малом количестве или совсем не будут (Gill T.J. et al., 1963; McDevitt H.O., Sela M., 1967? Sela M. et al., 1967).

Одной из наиболее актуальных проблем современной иммунологии является нахождение способов "обхода" генетически предетерминированной пониженной реактивности на те или иные антигены и превращение низкоотвечающих на них особей в высокоотвечающие, т.е. осуществление фенотипической коррекции иммунного ответа (Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, 1976,1978). Для решения этой проблемы требуется нахождение эффективного иммунопотенциатора.

Соединения, обладающие иммуностимулирующей активностью, можно разделить на природные и искусственные. К природным относятся высокополимерные соединения - бактериальные и растительные полисахариды, гликопротеиды, липополисахаридные комплексы, нуклеиновые кислоты (Доклад научной группы ВОЗ, 1978). Искусственные включают синтетические аналоги природных полимерных соединений (В.М. Земсков, 1973; Schmidtke J.R. et al., 1971; "Vogt W. et al.,1973) и синтетические полимеры, не имеющие аналогов в природе: синтетические полиэлектролиты - полианионы, поликатионы, полиамфолиты (Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, 1978).

Мощные иммунопотендирующие свойства синтетических карбоцеп-ных полиэлектролитов были открыты сравнительно недавно. Было показано, что они способны замещать функцию.Т-хелперов и усиливать отдельные этапы иммуногенеза - пролиферацию и миграцию стволовых кроветворных клеток, Т- и B-лимфоцитов, кооперацию Т- и В-клеток в иммунном ответе. Они обладают способностью к многоточечному взаимодействию с комплементарными структурами, встроенными на поверхности мембраны клеток иммунной системы. Кроме того, они не имеют побочного действия, характерного для нерастворимых природных иммуностимуляторов типа адъюванта Фрейнда - полиартриты, образование фиброзных капсул в месте инъекции, аллергические и аутоиммунные реакции (Р.В.Петров и соавт., 1974,1975; Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, 1976,1978,1979; Р.М.Хаитов, 1976; Р.М.Хаитов, А.А.Батыр беков, 1976; А.М.Нажмитдинов и соавт., 1979; В.А.Кабанов, Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, 1982; А.Ш.Норимов и соавт., 1983).

В последние годы академиком Р.В.Петровым и профессором Р.М.Хаитовым был предложен и обоснован новый принцип создания искусственных Т-независимых антигенов, который заключается в присоединении гаптенов или относительно слабоиммуногенных белковых антигенов к полимерам-носителям (синтетическим карбоцепным и ге-тероцепным полиэлектролитам с контролируемой структурой).

Комплексирование гаптенов (Р.В.Петров и соавт., 1977) или слабоиммуногенных белков (В.А.Кабанов и соавт., 1978,1980;

Р.В.Петров и соавт., 1979,1981) с молекулами полиэлектролитов позволило получить макромолекулы, обладающие резко повышенной им-муногенностью.

Эти искусственные антигены оказались Т-независимыми. Известно, что 1г-гены проявляют свое действие преимущественно на уровне Т-клеток (Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, 1978; И.В.Виноградов и соавт., 1981). Отсюда возникла идея, что создание Т-независимых антигенов - это путь к фенотипической коррекции 1г-генного контроля иммунного ответа.

Целью нашего исследования было изучение возможности феноти-пической коррекции иммунного ответа с помощью синтетических полиэлектролитов на модели синтетического многоцепочного полипептидного антигена (Т,Г)-А-Л, иммунный ответ на который контролируется аутосомно-доминантным геном (McDevitt Н.О., SelaM., 1965И967; Benacerraf В., 1974? McKenzie I.F.C., Henning M.M., 1977; Klein J. et al., 1978i Benacerraf В., Germain H.H., 1978).

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) На различных экспериментальных моделях исследовать влияние полиэлектролитов - полиакриловой кислоты (ПАК), поли-4-винил-пиридина (ПВП), сополимера акриловой кислоты (АК) и н -винилпир-ролидона (н-ВПД)-М, а также модифицированного на (мна) на гуморальный иммунный ответ на синтетический полипептидный антиген (Т,Г)-А-Л.

2) Исследовать способность полиэлектролитов воздействовать на клеточно-опосредованный иммунный ответ на (Т,Г)-А-Л.

3) Создать полностью искусственный антиген-синтетический полипептид - синтетический полиэлектролит путем конъюгирования (Т,Г)-А-Л с IIAK, НА, МНА, обеспечивающий фенотипическую коррекцию генного контроля иммунного ответа на (Т,Г)-А-Л.

4) Исследовать тимусзависимость конъюгатов полипептид-полиэлектролит.

Эксперименты были выполнены на инбредных мышах оппозитноот-вечаюцих на (Т,Г)-А-Л линий balb/c (h-2d), gba (н-2к), C57BL/6 (Н-2Ъ) и (CBAxG57BL/6)F1 (Н-2к/Ъ).

Работа проводилась в двух направлениях: 1) изучение влияния синтетических полиэлектролитов на гуморальный и клеточно-опосре-дованный иммунный ответ на синтетический полипептидный антиген (Т,Г)-А-Л; 2) изучение возможности фенотипической коррекции гуморального и клеточно-опосредованного иммунного ответа конъюгатами (Т,Г)-А-Л с полиэлектролитами, представляющими собой антигены нового типа, построенными на основе высокомолекулярных синтетических полиэлектролитных носителей и антигена (Т,Г)-А-Л.

С помощью культивирования клеток в системах in vivo и in vitro, а также в клинической практике было показано, что иммунный ответ на большинство антигенов требует взаимодействия нескольких типов клеток: I- и В-лимфоцитов и макрофагов. Каждый из перечисленных типов клеток, в свою очередь, состоит из многих подтипов кооперирующих клеток (Р.В.Петров, 1968,1970,1976; Р.В.Петров, А.Н.Чередеев, 1974; Р.В.Петров, Р.М.Хаитов и соавт., 1981; Miller J., Mitchell G.E., 1968; Claman H.O., Chaperon E.A., 1969; Osoba D., 1970; Playfair J.H.L., 1971). Т-лимфоциты генерируют и поставляют в кровообращение и периферические лимфоидные органы три самостоятельных субкласса лимфоцитов: Т-хелперы, Т-эффекторы и Т-супрессоры.

Хелперные Т-клетки являются помощниками В-клеток при продуцировании антител к тимусзависимым антигенам, каким является (Т,Г)-А-Л. Это относится к образованию igG, igA и igE антител (Waksman в.н., 1979; Miller J.F.A.P., 1980). Образование igM антител отличается меньшей Т-зависимостью (Cantor н. et al», 1975). Существует также пул промежуточных регуляторных Т-клеток, влияющих на функцию более зрелых хелперных и супрессорных клеток (Cantor н., Gershon R.K., 1980). Эти клетки обеспечивают регуляцию иммунного ответа по принципу обратной связи (Cantor н. et al., 1978; Eardley D.D. et al., 1978). Важным свойством большинства субклассов Т-клеток является их способность к миграции и рециркуляции в организме (Р.М.Хаитов, 1972,1973,1977).

Имеются работы по изучению тимусзависимости иммунного ответа на синтетические антигены. Был сделан вывод о том, что повторяющиеся антигенные детерминанты не являются основным свойством, обеспечивающим тимуснезависимость антигенов, так как многие многоцепочные полипептидные антигены с повторяющимися антигенными детерминантами являются Т-зависимыми. Было также показано, что медленно метаболизирующиеся в системе in vivo D -аминокислотные полимеры являются Т-независимыми, а быстро распадающиеся Ь-полимеры, несущие аналогичное число повторяющихся детерминант, требуют участия Т-клеток и макрофагов для продукции антител (Seia ж., Mozes е., 1975). В работах по изучению Т-зависимости многоцепочных полимеров, состоящих из идентичных химических структур многоцепочного полипролина с присоединенными пептидами тирозина и глу-таминовой кислоты, было показано, что тимуснезависимыми являются только те полимеры, которые медленно метаболизируются, а полимеры, которые быстро разрушаются, были тимусзависимыми (Jaton J.C., Sela М., 1968г Sela М. et al., 1972? Medlin J. et al., 1973). Иммунный ответ на (Т,Г)-Про-Л, содержащий исключительно D-аминокислоты, является тимуснезависимым (Schmitt-Verb.ulst a.m. et al., 1974).

Популяция B-лимфоцитов также гетерогенна. Пре-В-клетка отличается большими размерами и идентифицируется по цитоплазматиче-скому не обнаруживаемому на клеточной мембране (Raff м.с. et al., 1976? Oleos A.J., GatMngs w.s., 1977). Несмотря на то, что все этапы дифференцировки B-клетки являются антигеннезависимыми и Т-независимыми, было показано влияние антигенов внешней среды на пул B-клеток (Owen J.J.T., 1980). Важным свойством В-лимфоцитов является способность к миграции в периферические лим-фоидные органы (Р.М.Хаитов, 1975). Было также показано, что популяции I- и B-лимфоцитов строго клонированы по сродству к антигену (Б.Д.Брондз, О.В.Рохлин, 1978; Ada J.L. et al., 1969? Wigzel H., 1974). Возникновение клонов запрограммировано генетически и реализуется в ходе антиген-независимой дифференцировки Т- и В-клеток (Б.Д*Брондз, О.В.Рохлин, 1978).

Макрофаги или A-клетки можно по гистологическим признакам разделить на две группы: макрофаги периферической крови и тканевые макрофаги (Montfort I., Ташауо Р.В., 1971; Schwartz H.H. et al., 1978). Макрофаги первыми захватывают и перерабатывают антиген, представляя его лимфоцитам. В такой форме антиген комплекси-руется с la-структурой, что обеспечивает взаимодействие с Т-клет-ками (Rosenthal A.S. et al., 1978 í Beller D.I. et al., 1978). В некоторых экспериментах были показаны, как иммуностимулирующие, так и иммуносупрессивные свойства макрофагов (В.Г.Галактионов, 1978; Calderón J., ünanue E.R., 1975), они выполняют функцию эф-фекторных клеток (Kelson D.S. et al., 1976).

Необходимость кооперации Т- и B-клеток в иммунном ответе была показана МНОГИМИ авторами (Miller J.F.A.P., Mitchell G.P., 1968; Claman E.H., Chaperon E.А., 1969 i Davies A.J.S. et al., 1970). Дальнейшими работами было показано, что выработка антигена может быть увеличена или уменьшена добавлением к ним других типов клеток (Р.В.Петров, А.А.Михайлова, 1973,1978). Существует два основных подхода к объяснению механизма взаимодействия Т-хел-перов и В-клеток-предшественников. Первый предполагает прямой клеточный контакт между взаимодействиями клеточными популяциями (Button R.W. et al., 1971; Mitcbison H.A., 1971). Второй - гуморальный механизм Т-В кооперации, осуществляющийся через продукцию растворимых медиаторов (Feldman М., Nossal G.J.Y., 1973). Исследования, очень активно проводимые в последнем направлении, привели к открытию ряда факторов I-клеток, обладающих хелперными свойствами. Некоторые из этих факторов являются специфичными по отношению к антигену, вызвавшему их продукцию, другие - антиген-неспецифичными. Разные хелперные факторы вырабатываются различными субклассами Т-клеток (Feldman М., Mossal G.J.V., 1973; Taussig M.J., Munro A.J., 197^? Feldman M. et al., 1975; Taussig M.J. et al., 1975; Marrack P., Kappler J.W., 1976; Howie S., Feldman M., 1977; Mozes E. et al., 1980; Tada Т., Hayakawa К., 1980; Schimpl A. et al., 1980).

Большое внимание также уделялось генетической рестрикции Т-В взаимодействия (Katz d.h. et al., 1973,1976). Было показано, что кооперация между Т- и B-клетками происходит только при их сингенности по субрайону I-A комплекса Н-2. Различия по К, I-C, S, в локусам,' либо по генам, находящимся вне Н-2 комплекса, не играют роли в кооперации Т- и В-лимфоцитов.

Если в экспериментах применялись синтетические полипептиды, ответ на которые контролируется ir -генами, то т-хелперы гибридов первого поколения между отвечающими и неотвечающими на данный синтетический антиген линиями мышей кооперируют только с клетками отвечающего гаплотипа (Katz D.H. et al., 1976). Гены, контролирующие Т-В взаимодействие при иммунизации синтетическими антигенами, ответ на которые контролируется lr-генами, картируются в субрайонах I-A и I-C. Рестрикция Т-В кооперации, как предполагают, свидетельствует о необходимости идентичности между молекулами I-района на т-в-клетках (Katz D.H., Benacerraf В., 1976; Benacerraf В., Germain R.N., 1978).

Таким образом, этапы иммуногенеза можно схематизировать следующим образом (Р.М.Хаитов, 1975,1977; Р.В.Петров, 1976):

1) Миграция предшественников Т- и В-лимфоцитов, стволовых кроветворных клеток из костного мозга в центральные органы иммунной системы.

2) Расселение иммунокомпетентных Т- и В-клеток из центральных в периферические органы иммунной системы.

3) Взаимодействие различных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов при развитии иммунного ответа.

Исследованиями было установлено, что гены, ответственные за такую специфичную иммунную реакцию, как иммунный ответ на тимус-зависимые антигены, локализуются в главном комплексе гистосовме-стимости. При более детальном изучении были идентифицированы ло-кусы I-A и I-C, которые отвечают за эти феномены (Benacerraf в., 1977). На инбредных рекомбинантных линиях мышей было доказано картирование lr-гена, ответственного за иммунный ответ на (Т,Г)-A-JI В I-A субобласти Н-2 комплекса (Markman М., Dickler Н.В., 1980).

Ген 1г-1А контролирует иммунный ответ на многоцепочные разветвленные полипептиды - (Т,Г)-А-Л, (Гис,Г)-А-Л, (Ф,Г)-А-Л. Мыши

К Я с гаплотипом н-2 являются высокоотвечающими на (Т,Г)-А-Л, Н-2 - среднеотвечающими, н-2к, Н-2*1, н-2г, H-2S, H-2W - низкоотвеча-ющими или неотвечающими. Максимальные различия между отвечающим и неотвечающим фенотипом проявляются при повторной иммунизации, на уровне синтеза igG антител (McDevitt и.о., Sela м., 1967» Benacerraf В., McDevitt Н.О., 1972; McDevitt Н.О., Bechtol К.В. et al., 1974).

В системе адоптивного переноса было показано (Taussig M.J. et al., 1974), что IgG ответ на (Т,Р)-А-Л также контролируется 1г-1А геном. Мы использовали данную экспериментальную модель для изучения влияния ПВД и ПАК на иммунный ответ, контролируемый 1г-IA геном. Помимо количественного анализа эффекта этих синтетических полиэлектролитов на уровне иммунного ответа, контролируемого одним геном, эта модель позволяет также проводить изучение влияния ПВП и ПАК на кооперацию Т- и В-лимфоцитов. Это особенно важно, так как местом экспрессии 1г-1А гена являются Т-лимфоци-ты и их способность к взаимодействию с В-лимфоцитами.

Генетически предетерминированная неспособность вырабатывать иммунный ответ у неотвечающих особей может быть нивелирована иммунизацией антигеном - (Т,Г)-А-Л, соединенным с иммуногенным 1-зависимым носителем МБСА (Benacerraf В., McDevitt Н.О., 1972). Это говорит о присутствии у неотвечающих особей В-клеток, способных отвечать на определенные антигенные детерминанты и которые не могут этого сделать из-за отсутствия Т-хелперов.

Было показано, что Т-хелперы продуцируют антиген-специфический фактор, несущий антигенные детерминанты, кодируете генами Н, сцепленными с главным комплексом гистосовместимости, а именно - с I-A субобластью. Неспособность обеспечивать эффективный иммунный ответ на (Т,Г)-А-Л связана с неспособностью Т-клеток низ-коотвечающих или неотвечающих генотипов вырабатывать антиген-специфический хелперный фактор, либо В-клеток неотвечающих генотипов акцептировать этот фактор (Taussig М.J. et al., 1975; Мо-zes Е., 1976).

Ранее в опытах на В-мышах, практически не содержащих Т-кле-ток, было показано, что синтетические полиэлектролиты замещают функцию Т-хелперов: тимэктомированным мышам через 8 суток после летального облучения и переноса костного мозга одновременно с антигеном вводили ПВД и ПАК и определяли количество антителообразу-ющих клеток в селезенке. Оказалось, что В-мыши практически не развивают иммунный ответ к эритроцитам барана, что связано с дефицитом Т-лимфоцитов. Введение полиэлектролитов увеличивает антитело-образование в 17-27 раз (Р.В.Петров и соавт., 1975).

Введение В-мышам синтетических полианионов декстран сульфата и ПАК значительно увеличивает образование иммуноглобулинов классов М и С (Б1атаи^е1п Т. et а1., 1971). Клетки лимфоидных органов В-мышей, обработанных полиэлектролитами, обладают хелпер-ной функцией. В селезенке реципиентов, которым трансплантировали интактные клетки костного мозга и клетки селезенки от В-мышей, полученные через 7 суток после введения ПВП, образуется в 5,5 раза больше антителообразующих клеток, чем в селезенке реципиентов, которым были введены только клетки костного мозга в смеси с клетками селезенки интактных В-мышей. Введение летально облученным сингенным реципиентам костного мозга в смеси с клетками селезенки, полученными у В-мышей через 14 суток после введения им ПВП приводило к образованию почти в 25 раз большего числа антитело-образующих клеток, чем в контрольной группе. Клетки лимфоузлов В-мышей, обработанных ПВД, взятые через 7 суток после введения полимера, в условиях адоптивного переноса способствовали образованию в 1,7 раза большего количества антителообразующих клеток, чем в контрольной группе. На 14-е сутки после введения полиэлектролита хелперная активность этих клеток повышалась в 17 раз по сравнению с клетками, не обработанными полиэлектролитом, что говорит о способности полиэлектролитов замещать хелперную функцию Т-лимфоцитов (Р.В.Петров и соавт., 1975).

При исследовании влияния Ш. на ответ у тимэктомирован-ных и В-шшей на эритроциты барана было показано значительное увеличение иммунного ответа при введении полиэлектролитов.

При изучении влияния на ig№ и igG ответ у мышей с врожденным отсутствием тимуса также было показано значительное усиление антителообразования при введении Ш (Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, Р.И.Атауллаханов, 1983).

В нашей работе представлены данные, полученные при изучении взаимодействия Т- и В-лимфоцитов при индукции иммунного ответа на (Т,Г)-А-Л в системе адоптивного переноса. При введении клеток костного мозга (В-лимфоцитов) с (Т,Г)-А-Л формируется незначительное количество АОК, синтезирующих антитела на (Т,Г)-А-Л. Небольшое количество АОК наблюдается также при трансплантации ти-моцитов (Т-лимфоцитов).

Введение смеси клеток костного мозга с тимоцитами вызывает накопление АОК в количестве в 8-10 раз превышающем общую сумму АОК, образующихся при раздельном введении В- и I-лимфоцитов. Эти опыты демонстрируют необходимость кооперации между Т- и В-лимфо-цитами для индукции иммунного ответа на (Т,Г)-А-Л, что хорошо согласуется с ранее опубликованными данными (Taussig M.J. et al., 1974; Munro a.i., Taussig M.J., 1975).

В системе адоптивного переноса Т- и В-клеток наблюдаются межлинейные различия при индукции первичного иммунного ответа на (Т,Г)-А-Л, т.'е. на уровне формирования igM АОК. Так, мыши линии C57BL/6 оказались высокоотвечающими, СВА - низкоотвечающими, balb/c - среднеотвечающими. У гибридов (CBAxG57BL/6)F<l способность продуцировать IgM АОК в системе адоптивного переноса Ти В-клеток по высокому типу наследуется как доминантный признак.

При введении летально облученным сингенным реципиентам смеси клеток костного мозга и клеток тимуса с ПАК в их селезенке накапливается в 2-3 раза больше антителообразующих клеток на (Т,Г)-А-Л, чем у реципиентов, получивших только смесь Т- и В-лимфоци-тов. Аналогичный результат наблюдается и при введении ПВП с Т- и В-лимфоцитами.

Таким образом, при введении ПАК или ПВП с клетками костного мозга и тимуса наблюдается усиление кооперативного Т-В взаимодействия при индукции иммунного ответа на (Т,Г)-А-Л.

Следует отметить, что кооперативное взаимодействие Т- и В-лимфоцитов в иммунном ответе на (Т,Г)-А-Л усиливается под влиянием полиэлектролитов в 2-3 раза у мышей высокоотвечающих генотипов С57ВЬ/б, (СВАХС57ВЬ/6)Е1 и в 3-5 раз у низкоотвечающих СВА. В результате высота иммунного ответа у низкоотвечающих мышей, обработанных полиэлектролитом, поднимается до уровня ответа высоко-отвечающих особей, не получивших полиэлектролита, т.е. происходит фенотипическая коррекция иммунного ответа на (Т,Г)-А-Л.

Представляло большой интерес изучить влияния синтетических полиэлектролитов на процесс активирования или "обучения" Т-хел-перов синтетическим антигеном (Т,Г)-А-Л.

При введении летально облученным сингенным реципиентам клеток костного мозга с Т-клетками, активированными (Т,Г)-А-Л в присутствии ПВП или ПАФ, в селезенке реципиентов в ответ на иммунизацию (Т,Г)-А-Л формируется в 2-2,5 раза больше АОК, чем при введении клеток костного мозга и тимоцитов, активированных (Т,Г)-А-Л без дополнительного введения полиэлектролита или адъюванта. Иначе говоря, ПВП усиливает процесс активирования или "обучения" Т-хелперов синтетическим антигеном (Т,Г)-А-Л.

Недавно в системе культуры клеток in vitro было показано, что в присутствии полиэлектролитов происходит усиление дозревания тимоцитов в Т-клетки, обладающие хелперной активностью (А.Ш* Норимов и соавт., 1984).

Таким образом, проведенные исследования показали, что в системе адоптивного переноса кооперирующих Т-клеток проявляются контролируемые 1г-1А геном различия в иммунном ответе на (Т,Г)-А-Л на уровне синтеза в секреции igM антител.

Введение реципиентам Т- и В-клеток синтетических полиэлектролитов усиливает процессы активирования Т-хелперов и Т-В кооперации при индукции иммунного ответа. При этом усиление процессов Т-В кооперации сильнее выражено у мышей низкоотвечающего на (Т,Г)-А-Л генотипа. Как следствие этого происходит коррекция низкого иммунного ответа, контролируемого 1г-1А геном. Полученные данные впервые продемонстрировали возможность коррекции иммунного ответа, контролируемого конкретным Ir -геном, синтетическими полиэлектролитами. Механизм усиления иммунного ответа связан с интенсификацией процесса Т-В-кооперации.

Исследованиями в системах in vivo и in vitro было показано значение макрофагов для экспрессии ir-генов. С их помощью формируется иммуногенный стимул, активирующий специфические клоны Т-клеток (Schwartz R.H. et al., 1977). Было установлено, что выработка антител на ТНФ в системе in vitro требует обязательного присутствия Т-клеток и макрофагов в популяции клеток селезенки. Кроме того, показано, что иммунный ответ на (Т,Г)-А-Л-ТНФ контролируется ir-генами Н-2 комплекса (Hodes r.j.» singer А., 1977).

В экспериментах на мышах (вЮхБЮ.а)р1 было показано, что иммунный ответ клеток селезенки in vitro на (Т,Г)-А-Л-ТНФ можно ингибировать удалением макрофагов. Ответ восстанавливается при добавлении сингенных макрофагов и макрофагов В10 (отвечающего генотипа), добавление макрофагов В10.А (неотвечающий генотип) не давало результата. Аутосомный доминантный ген, контролирующий функции макрофагов, как A-клеток, локализован в К или I-A субобласти Н-2 комплекса, то есть там же, где располагается Ir-ген, контролирующий иммунный ответ на (Т,Г)-А-1. Это доказывает существование ir-генного контроля функции макрофагов в гуморальном иммунном ответе на (1,Г)-А-Л-ТНФ (singer a. et al., 1978)¿

Последующие исследования в системах in vitro и in vivo подтвердили наличие ir-генного контроля иммунного ответа на синтетический полипептид (Т,Г)-А-Л после его гаптенизации (Miller J.F.A.P., 1980; Benacerraf В., 1980; Rosenthal A.-S. et al., 1980; betvin L.N. et al., 1981).

Представляло интерес исследовать возможность влияния с помощью синтетических полиэлектролитов на первичный и вторичный иммунный ответ на конъюгат (Т,Г)-А-Л-ТНФ в системе in vivo.

При однократной иммунизации мышей (Т,Г)-А-Л-ТНФ в их селезенке формируется небольшое количество ТНФ-специфических АОК. При иммунизации мышей (Т,Г)-А-Л-ТНФ с ПАФ наблюдалась незначительная стимуляция иммунного ответа. Введение животным (Т,Г)-А-Л-ТНФ с ПАК или на обеспечивает развитие выраженного ТНФ-спе-цифического ответа¿

При вторичной иммунизации животных (Т,Г)-А-Л-ТНФ получены данные, свидетельствующие об оппозитной реактивности мышей СБА и C57BL/6 на уровне вторичного IgG ответа.

Исследование характера IgG АОК у мышей, предварительно иммунизированных (Т,Г)-А-Л-ТНФ с ПАК или НА и через месяц получивших (Т,Г)-А-Л-ТНФ, показало, что в данной системе наблюдается формирование приблизительно одинакового количества АОК в селезенке мышей линий С57В1//6 и СБА, то есть наблюдается фенотипи-ческая коррекция иммунного ответа, контролируемого 1г-геном, сцепленным с Н-2 комплексом.

Представляло интерес исследовать клеточно-опосредованный иммунный ответ на (Т,Г)-А-Л и изучить возможность корригировать его с помощью синтетических полиэлектролитов.

Предыдущими исследованиями с применением синтетического полипептидного антигена (Т,Г)-А-Л была показана возможность получения "обученных" Т-лимфоцитов, которые переносили способность вырабатывать РГЗТ на полипептид летально облученным и необлучен-ным реципиентам. Показано, что "обученные" лимфоциты мышей гап-лотипа н-2Ъ переносили способность вырабатывать РГЗТ сингенным реципиентам* Клетки мышей гаплотипов н-га, н-2к, н-г25 такой способностью не обладают. РГЗТ развивалась и в тех случаях, когда "обученные" лимфоциты мышей гаплотипов Н-2а и н-2к вводили реципиентам - гибридам первого поколения между отвечающими и неот-вечающими линиями мышей. Развитие РГЗТ, как и гуморальный ответ, контролируется 1г-генами Н-2 комплекса (з-Ьгааатап et а1., 1979).

В наших исследованиях был изучен клеточно-опосредованный иммунный ответ на (Т,Г)-А-Л при дополнительном введении полиэлектролитов.

При сенсибилизации (Т,Г)-А-Л мыши как СВА, так и С57ВБ/6 реагируют слабовыраженным уплотнением кожи на месте инъекции. При введении (Т,Г)-А-Л с ПАК или ПВП за 1 месяц до повторной инъекции наблюдается резковыраженная местная реакция, проявляющаяся в припухлости и покраснении кожи основания ушной раковины в месте инъекции.

Сравнительный анализ показал, что синтетические полиэлектролиты стимулируют клеточно-опосредованный иммунный ответ у оппо-зитнореагирующих на (Т,Г)-А-Л мышей СВА и С57ВЬ/6.

Внутрикожное введение в качестве контроля не приводило к перекрестной реакции с (Т,Г)-А-Л, что говорит о специфичности РГЗТ на (Т,Г)-А-Л.

Наибольший интерес представляло изучение фенотипической коррекции 1г -генного контроля иммунного ответа искусственным антигеном: конъюгатом (Т,Г)-А-Л-еинтетический полиэлектролит, представляющий собой высокоиммуногенную 1г- и Т-независимую иммунизирующую молекулу, сконструированную на основе принципа, сформулированного и обоснованного академиком Р.В.Петровым и профессором Р.М.Хаитовым (создание иммунизирующих препаратов нового типа - макромолекул, составленных на необходимой антигенной детерминанты и искусственного полимерного носителя, обеспечивающего адъ-ювантность, Т- и 1г -независимость всей макромолекулы (Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, 1977,1978,1979).

Мощные иммуностимулирующие свойства синтетических полиэлектролитов были использованы для создания на основе данного принципа полностью искусственных антигенов, не имеющих природных аналогов. Они представляют собой макромолекулярные комплексы, полученные присоединением гаптенов или относительно слабых белковых антигенов к молекулам полиэлектролитов, что позволяет создать высо-коиммуногенные макромолекулы, проявляющие ряд свойств Т-независи-шх антигенов (Р.В.Петров и соавт., 1977,1979; В.А.Кабанов и со-авт., 1978; Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, 1979; В.А.Кабанов, Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, 1983).

Так, например, предыдущими исследованиями этих лабораторий были исследованы антигенные свойства веществ, в которых тринитро-фенил был соединен с высокомолекулярными носителями, обладающими адъювантными свойствами - ДВП и ПМВП.

Полученные вещества - ТНФ-ПВП (пикрат ПВП) и ТНФ-ПМВП (пик-рат ПМВП) были тестированы по числу антителообразующих клеток (АОК), розеткообразующих клеток (РОК) и титров гемагглютининов к ним, тестированных при помощи тринитрофенилированных эритроцитов барана (ЭБ).

Были продемонстрированы ярко выраженные антигенные свойства пикратов ПВП и ПМВП, Число антителообразующих клеток на ТНФ было прямо пропорционально дозе вводимого пикрата (Р.В.Петров и соавт., 1977).

Выраженный иммунный ответ на указанные пикраты формируется в отсутствие дополнительного введения адъюванта. Тринитрофенили-рование молекул ПВП и ПМВП не снижает их способность усиливать пролиферацию и миграцию стволовых клеток, Т- и В-лимфоцитов, кооперацию I- и В-клеток в иммунном ответе (А.Ш.Норимов, С.Г.Завго-родний, 1980).

С помощью летально облученных мышей, защищенных клетками костного мозга нормальных животных или клетками селезенки В-мышей, была показана Т-зависимость тринитрофенилированных ПВП и ПМВП. В их селезенке при иммунизации пикратами ПВП и ПМВП накапливается значительное число Т-специфических антителообразующих клеток благодаря действию полиэлектролитной части комплекса, обеспечивающей Т-независимость, так как она замещает хелперный сигнал Т-кле-ток (Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, 1978).

Синтетические полиэлектролиты обладают свойством образовывать комплексы с белковыми молекулами, не нарушая их структуры

В.А.Кабанов и соавт., 1977). Оно было использовано для получения комплексов бычьего сывороточного альбумина (БСА) и бычьего гамма-глобулина (БГГ) с ПВП и сополимером 4-винил-н -этилпириди-ний и 4-винил-н-цетилпиридиний бромидов.

БСА и ПВП образуют с ними растворимые стабильные комплексы. С помощью электронной микроскопии, а также физико-химическими методами было показано, что такие комплексы являются стержнеобраз-ными частицами, смонтированными из глобул, стабилизированных цепочками поликатиона. Было сделано предположение, что в процессе скольжения адсорбированных глобул вдоль сорбента в процессе формирования комплекса, происходит самосборка системы, благодаря установлению оптимальных контактов, что обеспечивает наличие минимальной свободной энергии (В.А.Кабанов и соавт., 1977).

Дальнейшие опыты заключались в экспериментах по введению В -алкильных радикалов различной длины в комплексную молекулу, что имело целью упрочить образующиеся комплексы при связывании ПВП с белками. Алкилирование не отразилось на способности полиэлектролитов усиливать отдельные этапы иммуногенеза: расселение Т-клеток из тимуса, В-клеток из костного мозга, усиливать миграцию кроветворных стволовых клеток из костного мозга, стимулировать 1-В-кооперацшо в иммуногенезе (В.А.Кабанов и соавт., 1978, 1979; Р.В.Петров и соавт., 1979,1981).

Конъюгирование БСА с сополимером 4-винил- Н-этилпиридиний и 4-винил- н-цетилпиридиний бромидов приводило к антителообразова-нию, которое в 50-100 раз превышало уровень формирования АОК при иммунизации исходным БСА. Раздельное введение БСА и сополимера к такой значительной выработке антител не приводило (В.А.Кабанов и соавт., 1978).

В связи с тем, что во всех описанных выше экспериментах синтетические полиэлектролиты были конъюгированы с антигенами, иммунный ответ на которые находится под полигенным контролем, представляло большой интерес проверить обнаруженные закономерности в системе антигена (1,Г)-А-Л, обладающего узкоспецифичным действием, конъюгированного с мощными иммуноадъювантами - синтетическими карбоцепными полиэлектролитами.

Получение конъюгатов искусственного многоцепочного полипептидного антигена (Т,Г)-А-Л с мощными стимуляторами иммуногенеза поставило на повестку вопрос об их применении для коррекции первичного и вторичного иммунного ответа.

Установлено, что при однократной иммунизации мышей СБА и C57BL/6 только (Т,Г)-А-Л в селезенке формируется небольшое, примерно равное количество и IgG АОК на (Т,Г)-А-Л.

У мышей, иммунизированных однократно конъюгатами (Т,Г)-А-Л-ПАК и (Т,Г)-А-Л- НА, происходит увеличение накопления АОК на (Т,Г)-А-Л в 20-22 раза по сравнению с их количеством при иммунизации только (Т,Г)-А-Л.

Совершенно иная картина наблюдается при двухкратной иммунизации животных (Т,Г)-А-Л. Мыши линии C57BL/6 развивают высокий иммунный ответ на (Т,Г)-А-Л с индукцией большого числа IgG АОК, а СВА не отвечают на этот антиген, что согласуется с данными литературы (McDevitt и.о., 196З» bichtenberg L., 1974). Иначе говоря, мыши C57BL/6 несут ir-ген высокого ответа на (Т,Г)-А-Л, а мыши СВА - низкого ответа. Следует также отметить, что генетические различия в высоте иммунного ответа на (1,Г)-А-Л проявлены при вторичном ответе преимущественно на уровне синтеза IgG антител.

При повторной иммунизации животных (1,Г)-А-Л через месяц после первичной иммунизации конъюгатами (Т>Г)-А-Л-ПАК или (1,Г)-А-Л-ыа в селезенке мышей C57BL/6 и СВА формируется резко повышенное, по сравнению с контролем (двухкратная иммунизация только пептидом), количество igG АОК на (Т,Г)-А-Л. Причем происходит нивелирование различий в иммунном ответе, контролируемом 1г-1-геном. Иначе говоря, иммунизация конъюгатами полипептида (Т,Г)-А-Л с полиэлектролитами приводит к фенотипической коррекции иммунного ответа, контролируемого 1г-1 геном.

Эти данные свидетельствуют о том, что (Т,Г)-А-Л, ковалентно связанный с синтетическим полиэлектролитом, проявляет свойства высокоиммуногенного антигена. Результаты описанных выше экспериментов полностью согласуются с ранее полученными данными о повышении иммуногенности слабоиммуногенных антигенов или гаптенов в результате их комплексирования или конъюгирования с искусственными полиэлектролитами (В.А.Кабанов и соавт., 1978; Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, 1979; Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, А.Ш.Норимов, 1979; И.В.Виноградов и соавт., 1982; В.А.Кабанов, Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, 1982).

Слабоиммуногенные тимусзависимые белковые антигены, такие как бычий сывороточный альбумин и бычий гамма-глобулин в составе антиген-полиэлектролитных комплексов проявляют свойства высоко-иммуногенных тимуснезависимых антигенов (И.В.Виноградов и соавт., 1982; Р.В.Петров и соавт., 1983). В этой связи представляло интерес исследование Т-независимости иммунного ответа на (Т,Г)-А-Л у мышей, иммунизированных конъюгатом (Т,Г)-А-Л-полиэлектролит. Показано, что (Т,Г)-А-Л в составе конъюгата индуцирует ответ на (Т,Г)-А-Л у В-мышей. Иначе говоря, (Т,Г)-А-Л в результате ковалентного связывания с полиэлектролитом приобретает свойства ти-муснезависимого высокоиммуногенного антигена.

В работе представлены результаты исследований РГЗТ на (Т,Г)-А-Л при иммунизации животных конъюгатом (Т,Г)-А-Л-МНА. Результаты этих исследований показывают, что иммунизация конъюгатом (Т, Г)—А—Л— МНА обеспечивает развитие более выраженной РГЗТ на (Т,Г)-А-Л по сравнению с выраженностью РГЗТ у мышей, иммунизированных (Т,Г)-А-Л. РГЗТ при введении конъюгата (Т,Г)-А-Л-ША в 7 раз превышает интенсивность РГЗТ при иммунизации животных (Т,Г)-А-Л. Причем, РГЗТ при иммунизации (Т,Г)-А-Л- МНА у мышей СБА и С57вь/б была выраженной почти в одинаковой степени, т.е. происходит фенотипическая коррекция 1г-генного контроля клеточ-но-опосредованного иммунного ответа.

Ранее было показано, что синтетические полиэлектролиты обладают выраженным митогенным эффектом на Т- и В-лимфоциты (В.А.Кабанов, Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, 1982; Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, Р.И.Атауллаханов, 1982). Показано, что кооперативная сорбция полиэлектролитов на лимфоцитах сопровождается каскадом молекулярных событий, начинающихся с повышения проницаемости поверхностной мембраны клеток с последующими метаболическими изменениями, ведущими к росту, делению и дифференцировке лимфоцитов (Р.М.Хаитов, Р.И.Атауллаханов, 1982; В.А.Кабанов, Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, 1983). Сочетание антигенной детерминанты и полиэлектролита обеспечивает фокусирование действия полиэлектролита только на антиген-специфических лимфоцитах (молекулы полиэлектролитов без антигенной части взаимодействуют с лимфоцитами поликлонально). В результате такого взаимодействия полиэлектролиты как бы заменяют хелперный сигнал Т-клеток. Именно этим объясняется способность антиген-полиэлектролитного комплекса вызывать иммунный ответ у особей, несущих 1г-гены низкого ответа. Это согласуется с данными о том, что 1г-гены проявляют свое действие преимущественно через систему Т-лимфоцитов.

Результаты этих исследований показывают, что конъюгаты (Т,Г)-А-Л с синтетическими полиэлектролитами проявляют свойства высоко-иммуногенных тимуснезавиеимых антигенов, индуцирующих выраженный 1г-независимый иммунный ответ, что обеспечивает превращение генетически низкореагирующих на (Т,Г)-А-Л особей в высокореагиру-ющие, то есть осуществляет фенотипическую коррекцию генного контроля иммунного ответа.