Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Исследование свойств ионных каналов и ионной проводимости мембраны лимфоцитов при воздействии полимеров-иммуномодуляторов

"Л 8«5:

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

МАЛЬЦЕВ Виктор Анатольевич

ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ИОННЫХ КАНАЛОВ И ИОННОЙ ПРОВОДИМОСТИ МЕМБРАНИ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ПОЛИМЕРОВ-ИММУНОШДУЛЯТОРОВ

(14.00.36 - Аллергология и иммунология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1991 г.

Работа выполнена в лаборатории активации иммунитета Института иммунологии Минздрава СССР

Научный руководитель -

доктор медицинских наук Атауллаханов Р.И.

Научный консультант -

доктор медицинских наук, профессор Хаитов P.M.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Дозыоров И.М.

доктор медицинских наук Нестеренко В.Г.

Ведущая организация - Всесоюзный гематологический научный центр Минздрава СССР.

на засе,, ______ _________:го совета Д 074.09.01 при

Институте иммунологии Минздрава СССР по адресу: I15478,,г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иыиунологии Минздрава СССР.

Защита

1991 г. в .

•часов

Автореферат разослан

Учений секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

А.В.Колобе

итгтЦ

- w

ihft

т .. -/! е.-таций

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Полиионы - водорастворимое линейные полимеры, содержащие заряженные группы, - известны как иммуностимуляторы. Вещества этой группы с успехом применяют для поли-клональной стимуляции иммунитета (Diamantstein Т. et al., 1973). Кроме того, полиионы могут быть использованы и в качестве иммуно-адъювантов для активации узкоспеиифичной иммунной резкими. В этом случав их вводят совместно с антигеном, либо используют в качестве носителя в структуре конъюгата антигена и стимулирующего поли-' мера (Петров Р.В., Хаитов P.M., Кабанов В.А. и соавт.,. 1974-1982).

Механизмы стимуляции иммунитета полиионами являются предметом активных исследований в последние 15 лет. Установлено, что полиионы активируют клетки иммунной системы, их функции и взаимодействие (Петров Р.В., Хаитов P.M.. и соавт., 1975-1990). В частности, ' было показано, что полиионы активируют миграцию иммуноком-петентных клеток в периферические лимфоидные органы, а также взаимодействие Г- и В-лимфоиитов в ходе антителогенеза. Макрофаги под действием полиионов усиливают свою хелперную фуькцию. . Полиионы могут выступать в роли ко-активаторов пролиферации лимфоидных клеток. При этом отрииательно заряженные полианионы селективно активируют В лимфоциты, но не действуют на Т клетки. Напротив, поликатионы активируют как В-, так и Т-лимфоциты.

Активирующее влияние полиионов на различные типы клеток иммунной системы, по-видимому, реализуется через один ч тот же молекулярный механизм. Критические события при взаимодействии полимера с клеткой происходят на уровне плазматической мембраны. Полиионы модифицируют как пассивный, так и активный (опосредованный АТФа-зами) мембранный транспорт ионов к+, Na*, са2+ ухе в первые 1-2 . минуты взаимодействия полимера с клеткой (Атауллаханов Р.И. и соавт., 1984-1988). Вполне возможно, что повышение ионной проницаемости плазматической мембраны является первым звеном в иепи молекулярных событий в клетке, приводящих к развитию ее ответной реакции на полимер. Именно поэтому актуальными становятся вопросы, касающиеся детальных механизмов влияния полимеров на ионный транспорт в иммунокомпетентных клетках.

Каким образом полимерные молекулы, сорбируясь на клеточной мембране, изменяют ее проницаемость? в какой мере эти изменения селективны для различных ионов? Какова роль селективных ионных

каналов, в ответной реакции клетки на полимер? Возможно ли в присутствии полиьера появление в мембране пор или микроповреждений? Как сказывается увеличение пассивных потоков к+, на

мембранном потенциале?

Приведенные выше вопросы послужили идейной основой при постановке задач данной диссертации. Работа посвящена деталвному исследованию изменений ионной проводимости клеточной мембраны индивидуальных лимфоидных клеток при воздействии на них иммуностимулирующими полиионами.

Цель исследования.

Целью исследования было изучение свойств ионных каналов и ионной проводимости плазматической мембраны а также мембранного потенциала до и после воздействия на лимфоидные клетки различны- • ми иммуномодулирующими полимерами. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) Разработать и отладить метод измерения параметров ионной проводимости мембраны для индивидуальных иммуно-компетентных клеток.

2) Охарактеризовать свойства одиночных ионных каналов и ионной проводимости плазматической мембраны лимфоцитов.

3) Определить изменения параметров ионной проводимости и поведения мембранного потенциала (МП) при воздействии различными иммуноыодуляторами полимерной природы, а такке иммуностимулирующими ионофорами и стандартными митогенами.

Научная новизна исследования.

В работе впервые экспериментально исследованы электропроводящие свойства мембраны индивидуальных лимфоидных клеток под действие- различных полиэлектролитов. Обнаружено появление неселективной ионной проводимости мембраны 1' клеток под действием поликатиона поли-[.-лизина, а также отсутствие эффекта в аналогичных условиях для полианиона - сульфата декстрана, селективного активатора В лимфоцитов.

Было исследовало также поведение неноранного потенциала в присутствии иымуноыодулкторов. Епервые показано, что полиион б области иммуностимулирующих концентраций вызывает одновременно с аеполвриньцаеЯ и-жйраны и вксокоаиплитупные колеОанин мембранного пстенцкада. подуть« осцилляции получены такае и при воз-

действии на клеточную мембрану иммуностимулирующими концентрациями ионофора грамицидина С, а также при раздражении мембраны внешним электрическим током, что указывает на универсальный механизм ответа клетки на стимулирующее воздействие, связанное с индукцией ионных токов. в проведенных исследованиях впервые 'выявлены триггерные переходы мембранного потенциала в покоящихся лимфоцитах. Подобные свойства были известны ранее лишь для некоторых типов возбудимых мембран. Проанализированы изменения проводящих свойств клеточной мембраны и поведения мембранного потенциала под действием митогенного лектина конканавалина А. Показано отсутствие триггерных свойств мембраны у лимфобластов.

Практическая ценность.

Детальное исследование проводящих свойств мембраны и характерных ответов мембранного потенциала лимфоцитов, проведенное в ' данной работе, мокет служить основой для анализа эффектов многочисленных воздействий на клетку как веществами эндогенной природы, так и синтезированными искусственно.

Полученные данные о свойствах ионной проводимости клеточной мембраны лимфоцитов в присутствии различных иммуномодуляторов будут использованы при практическом создании новых иммуностимулирующих препаратов. Контроль мембраноактивных свойств, и прежде всего возможности влияния на процессы ионного транспорта, может Сыть использован как один из первых шагов при отборе наиболее перспективных иммуномодуляторов, а также для оцямки их эффективных концентраций. Индукция характерных высокоамплитудных колебаний мембранного потенциала в лимфоцитах монет являться предварительным указанием на возможность использования вещества в качестве иммуномодулятора. Апробация работы.

Основные результаты исследований были обсуждены: на 4 и 5 Всесоюзных симпозиумах "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах" (п.Планерсное, 1939, 1990г.), на I всесоюзном конгрессе иммунологов (Дагомыс, 1989г.), на 7 Международном конгрессе иммунологов (Западный Берлин, 1989г.), на 4 Международном конгрессе по нейронммуномодуляиии (Италия, 1990г.), на 10 Европейском конгрессе иммунологов (Шотландия, 1990г.), на Международном конгрессе по аллергологии и иммунологии (ФРГ, 1990г.), на

2 Международном симпозиуме секции нейроиммуномодуляиии Европейского научного фонда (Великобритания, 1990).

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, одна работа находится в печати.

Предварительная экспертиза диссертации проводилась на научной конференции отдела иымунной биотехнологии Института иммунологии Минздрава СССР 14 декабря 1990 года. Структура и объек работы.

Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 140 страницах машинописного текста, иллюстрированы 30 рисунками и 2 таблицами. В списке использованной литературы указаны 144 источника, из них 42 отечественных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛУ И МЕТОДЫ

Большинство экспериментов было выполнено на свекевыделенных Т лимфоцитах периферической крови человека. Клетки выделяли из гепаринизированной крови здоровых доноров. Мононуклеарные клетки получали центрифугированием на градиенте Ficoll-Paque. Затем для обогащения суспензии Г клетками использовался метод леннинга (маде м•g• et ах., 1977), основанный на специфическом удалении ig+ клеток фиксированными на твердой поверхности антителами к ig человека. После обогащения суспензия клеток содержала не менее 90% Т клеток, что было определено методом цитофлуориметрии по связыванию анти-соЗ антител (ОКТ-З).

Наряду со свежеввдеденниии Т лимфоцитами в работе также были использованы Т лиыфобласты, полученные при культивировании т клеток in vitro совместно с Кон А (5 икг/мл) при 37'С и 5% СО2 а увлаанинной атмосфере инкубатора в течение 48 часов. Культураль-ная среда kpmi-1640 содержала: 10™ фатальной телячьей сыворотки,-10 мы hepes, 5х10~°й 2-церкаптоцтаноАа, 50 икг/ил антибиотика гентамицина и 2 мМ L-глютамина.

Во время экспериментов клетки попевали в проточную ксяору, где они оседали и прикреплялись к поверхности стекла. Камеру заполняли модифицированным раствором Хоикск следующего состава (в мМ): нлсь 140; кс1. 4,5; r.gcio, 1; ijefss, 10 (рн?,4); ce.ci2, 2,

Микропипетки заполняли раствором, содержащим (е мМ): kci, 140; NaCl, 10; MgCl2> I; HEPES , Ю (pH 7,2); egta, II и CaCl2, i. Концентрация свободного составляла при этой около 2нМ.

Все измерения трансмембранных ионных токов осуществляли методом локальной фиксации мембранного потенциала в условиях плотного контакта (patch-clamp ). в работе использовали конфигурацию whole --cell, позволяющую регистрировать токи через всю клеточную мембрану (Hamill et al., 1981). Ионные токи и мембранный потенциал клеток измеряли при помощи специального высокочувствительного усилителя ЕРС-7 (List Electronic, ФРГ). Прецизионные перемещения микропипеток для обеспечения точного контакта с поверхностью клетки осуществляли используя гидравлический микроманипулятор М0-102 (Narishige, Япония). Опыты проводили при температуре 20-25°С

Экспериментальная установка работала в режиме on-line совместно с компьютером ibm-xt (США). Оцифровку сигнала, протоколы для изменений мембранного потенииала и тока осуществляли при помощи преобразователя АЦП/ЦАП daca-645-1502 (разрешение 12 бит) фирмы IBM (США) с использованием собственных оригинальных компьютерных программ. Программы были написаны на языках 'Турбо-Паскаль 5.5" и "Ассемблер". Вывод оригинальных кривых на экран дисплея компьютера и обработка гистограмм осуществлялись в режиме реального времени по ходу эксперимента. Полученные данные записывали на твердый диск компьютера в виде файлов байтовой структуры для хранения и последующей обработки.

В работе были исследованы четыре иммуномодулятора различной природы: поликатион поли-ь-лизин, м.в. 90кДа (pll); полианион сульфат декстрана, м.в. 500 кДа (СД); ионофор грамииидин С (ГрС); лектин конканавалин А (Кон А). Кон А был получен от фирмы Pharma-, cia (Швеция), остальные три препарата - от фирмы sigma (США).

результаты и обсуждение

I. И0НПР0В0ДЯЩИЕ СВОЙСТВА МЕМБРАНЫ Т ЛИМФОЦИТОВ И ЛИМФОБЛАСТОВ.

Перед тем, как исследовать эффекты иммуностимулирующих препаратов было проведено изучение проводящих свойств мембраны лимфоцитов в контроле. Для этого был проведен анализ ионных токов, стационарных свойств проводимости мембраны, свойств одиночных К"1" каналов и характеристик потенциала покоя (ПП) мембраны.

1.1. Интегральные К* токи в мембране покоящихся Т лимфоцитов.

На Рис Л,а показаны трансмембранные ионные токи, зарегистрированные в течение 820 ис в ответ на деполяризацию мембраны. Эти токи, имеюцее выходящее из клетки направление, текут через селективные К+ каналы (Cabalan М. D. et al., 1985; Bregestovaki Р. et al.; 1986). K+ токи активируются лишь выие некоторого порогового потенциала (около -40 иВ). Время достижения пикового значения тока зависит от потенциала и составляет 5-40 мс, уменьшаясь с увеличением деполяризации. После дости1ения максимального значения происходит экспоненциальное уменьшение тока, связанное с инактивацией К+ каналов (DeCoursey т.е. et al., 1984). Величина максимальной К+ проводимости по результатам 27 опытов составила Gmax = - нСи> а постоянная времени инактивации К+ тока при потенциале 0 мВ: tj = 23812? ыс (гиб). Время полной реактивации калиевого тока было около I мин.

1.2. Медленная инактивация к* тока и стационарные свойства проводимости мембраны.

На Рис.1,0 показано развитие калиевого тока при регистрации в течение 5 минут после деполяризации мембраны. Бил зарегистрирован дальнейший экспоненциальный спад тока (вслед за "быстрой" инактивацией - см. Рис.1,а), но уле с постоянной времени около одной минуты (ь> = 71116с, п=20), то есть происходила "медленная" инактивация К* каналов. Таким образом, процесс инактивации К+ проводимости g( t) uosqt быть описан двуэкспоненциальной функцией:

G{t) » Gj ¡t expí-t/tj) + G2 x exp(-t/t2) 4 G3t Амплитуда медленной экспоненты Gg составила 3,4510,712» (ru20) от водичтш максимальной K+ проводимости. Скорость медленной HiitiKTi щи и не зависела от потенциала.

2-3 мин деполяризации мембраны в большинстве случаев приводило ц установлению стационарного уровня проводимости. Далее К* провод «кость но изменялась со временем, и ее стационарное значение Gat составляло лиыь около IX от максимального значения

Несмотря на малое стационарное значение К* проводимость вносит ¿сношал вклад в суммарную проводимость мембраны лимфоци?а. Ийсадоктивнай проводимость маыбраны соиавдяа? величину не йодее ¡áiü нОи (11=4(1),

в 1 пЛ

Рис.1. Иекбрзнные ионные •токи а Т лимфоцитах, я,б: Записи интегральных К* токов, полученные при деполяризации мембраны (от -70 мВ до уровня v); в: записи токов через одиночны'? К* каналы.

5 с

Рис.2. Запись мембранного потенциала покоя в Т лимфоците человека.

1.3. Свойства одиночных К+ каналов.

В стационарных условиях для большинства Т клеток можно было наблюдать срабатывания одиночных К+ каналов в виде импульсов тока прямоугольной формы (РисЛ,в), при этом кинетика работы К+ каналов не зависела от потенциала. Усредненная проводимость одиночного К+ канала составила П,5±2,9 пСм (п=15). Была получена оценка числа К4" каналов в Т лимфоците: н = 312185 (п=27).

1.4. Проводящие свойства мембраны Т лимфобластов.

Т лиыфобласты по сравнению с неактивированными клетками имели, как правило, большую неселективную проводимость утечки 20 - 100 пСи и большее количество К+ каналов (ы = 7231276, n=II). Стоит, однако, отметить, что среди лимфобластов попадались клетки (около •20%), имевшие чрезвычайно низкую, приблизительно на порядок, К+ проводимость. Подробно эту клеточную субпопуляиию в настоящей работе не изучали.

1.5. Характеристики потенциала покоя (ПП) Т лимфоцитов.

Были получены характерные записи мембранного потенциала для индивидуальных Т лимфоцитов (Рис.2). Оказалось, что мембранный потенциал сильно флуктуирует около среднего значения vc=-44l5 мВ, равного порогу активации К+ каналов. Характерная частота флуктуация ПП составила -1,44 1 0,62 Ги (п=27), а среднеквадратичное отклонение 7,8 1 3,0 аВ. Зарегистрированное отрицательное значение ПП поддермв^ется за счет селективной К+ проводимости, поскольку эквимолнрная замена Na+ на К+ обратимо деполяризует мембрану.

О пА

0,5 мкг/мл

ри.

200 -40 0 1 1 1 1 [ I СпА) +40

1 ' 1 1 А У<мВ>

Рис.З. Действие лоли-ь-лизина на'трансмембранный ток в Т клетках, а: характерные кривые развития мембранного тока при действии полилизина в различных концентрациях (I - 0,5 икг/мл и 2 - о мкг/мл). б: вольт-амперная характеристика для высокопроводящего состояния клеточной мембраны под действием полилизина (0,5 мкг/мл): Д - в растворе Хенкса, О-в растворе Хенкса наполовину разбавленном эквимолярным раствором глюкозы.

К деполяризации приводит также и добавление с вьеклеточной стороны селективного блокатора К+ каналов 4-аминопиридина (4-АМР). Кроме . того в области потенциалов ус были зарегистрированы срабатывания одиночных К+ каналов (см. РисЛ.в, запись при -50 мВ).

2. ИОНПРОВОДЯЩИЕ СВОЙСТВА МЕМБРАНЫ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ.

2.1. Исследование эффекта поликатиона поли-ь-лизина (рьь).

Для изучения природы ионной проницаемости, индуиированнной им- , муностимулирующим полимером, был проведен анализ трансмембранных ионных токов для индивидуальных лимфоцитов.

Эффект ри, изучали в диапазоне концентраций 0,1 - 10 мкг/мл. После добавления ры, проводимость клеточной мембраны, как правило, резко возрастала. Характерные кривые развития мембранного тока, связанного с появлением индуцированной полимером проводимости, приведены на Рис.3,а. Изменение проводимости под действием

Рис.4. Уменьшение К+ проводимости в присутствии полилизина (0,5 мкг/мл) после перехода мембраны из высокопроводящего состояния в низкопроводящее. а: записи интегральных токов при деполяризации мембраны от -70 мВ до +40 ыВ; б: записи токов через одиночные К+ каналы. (I в контроле, 2 - в присутствии полилизина 0,5 мкг/ил)

Р1Х наступало скачкообразно и с некоторой задержкой (1.-5 чин). В некоторых случаях (20% клеток) развитие проводимости наступало позне (через 5-20 мин) или эффекта ри, не наблюдалось совсем. Популяцию клеток, не отвечающую на ри., специально не изучали.

Отмечена тенденция к более быстрому развитию эффекта при более высоких концентрациях полимера, а также при более отрицательных значениях поддерживаемого мембранного потенциала. . Вольт-амперные характеристики клеточной мембраны после воздействия полимера (0,1 - I икг/ил) становились линейными с наклоном 1-7 нСы и потенциалом реверсии мембранного тока около 0 мВ. В присутствии Ри. (I мкг/мл) двукратное разбавление раствора Хенкса эгсвииодярным раствором глюкозы на изменяло потенциала реверсии тока, что свидетельствует о неселективноы характере индуцированной полимером ионной проводимости (Рис.3,6)

Развитие проводимости при концентрациях полимера более I мкг/мл в больаинстве случаев носило прогрессирующий характер и приводи-

ifr-P

20 мВ

0 мВ

Т-гг

60 с

PLL (0,5 мкг/мл)

Рис.5

Изменения мембранного .потенциала, индуцируемые полилизином.

ло к разрыву клеточной мембраны. Напротив, при менычих, иммуностимулирующих, концентрациях pll (0,1 - 1,0 мкг/мл) гереход мембраны в высокопроволящее состояние, как правило, был временным (1-5 мин). В этом случае происходило восстановление исходной низкой проводимости мембраны и можно было регистрировать К+ токи.

На Рис.4 приведены оригинальные записи интегральных К+ токов, а также записи токов через одиночные К+ каналм до воздействия pll и после перехода мембраны из высокопроводящвго состояния в низкопрозодящее в присутствии pll. После воздействия pll проводимость одиночных каналов оставалась прежней, однако уменьшалось число К* каналов. Возможно, это было следствием увеличения жчпо-лективного потока Са^4" во время внсокопроводящего состояния. Известно, что повыиение [Са2+]1п уменьшот эффективное число К* каналов в мембране Т клеток (nregestovsm p. ot al., 1986).

Выли исследованы характерные ответы мембранного потенциала при воздействии pll. в области иммуностимулирующих концентраций (0,1-I мкг/мл) pll индуцировал высоко-чмплитудные (20 - ЗОмВ) колебании МП (Рис.5). Большие концентрации pll ( > I мкг/мл) вызывали деполяризации апх*тч«, с»>чяинну» с резким увеличение» нвеолек-•тявной и'.

2.2. Полианион - сульфат декстрана (СД) - не влияет на проводимость клеточной мембраны Т лимфоцитов.

В качестве отрицательного контроля индукции ионной проводимости был использован полианион сульфат декстрана. Ранее было установлено, что СД не влияет на Т клетки, а селективно активирует В лимфоциты (Diamantstein Т. et al., 1975)

В наших опытах СД в иммуностимулирующих концентрациях (0,01 4 0,1 мг/мл) и выше (до I мг/мл) не вызывал сколько-нибудь значительных изменений тока в мембране Т клеток (Рис.6,а).

На Рис.6,б-в приведены записи интегральных К+ токов, а также оригинальные записи токов через одиночные К+ каналы до воздействия полианионом и спустя 20 мин после добавления препарата с внеклеточной стороны мембраны. Каких-либо существенных изменений К+ проводимости мембраны Т клеток обнаружено не было. Под действием СД не происходило изменений и мембранного потенциал.1.

2.3. Эффект иммуностимулирующего ионофора грамицидина С (ГрС).

Ранее было показано, что имиуномодулирующие эффекты мембрано-

активных полиионов можно имитировать с помощью некоторых неполимерных мембраноактивных веществ и, в частности, с помощью грамицидина С (Китаева М.Н. и др., 1986).'

В наших исследованиях высокие концентрации ГрС (2+10 мкг/мл) вызывали появление тока, который значительно возрастал со временем (Рис.7,а). В дальнейшем фактически происходил разрыв клеточной мембраны. Иммуностимулирующие концентрации ГрС <0,Iii мкг/мл) индуцировали сильно флуктуирующие нестабильные мембранные токи (Рис.7,б). Среди полученных флуктуаций невозможно было выделить срабатываний одиночных каналов. Вольт-амперные кривые, полученные в присутствии ГрС (I мкг/мл) при усреднении мембранных токов, имели <аклон от 0,1 до I нСм и нулевой потенциал реверсии тока, что указывает на неселективный характер индуцированной проводимости.

Исследования влияния ГрС на мембранный потенциал Т клеток показали, что в области иммуностимулирующих концентраций (0,1 i I мкг/мл) ГрС может вызывать характерные высокоамплитудные колебания ИП (Рис.7,в), аналогичные полученным в присутствии pll. В высоких концентрациях (5 мкг/ыл) препарат вызывал резкую деполяризацию клеточной мембраны, связанную с необратимым ее повреждением.

2 пЛ

60 с

100 пЛ ' |_0.2 с

Рис.6.

Отсутствие эффекта В-клеточного активатора полианиона сульфата декстрана (I иг/мл) на мембранную проводимость Т лимфоцитов, а: мембранный ток не изменяется после добавления препарата (поддерживаемый потенциал'-70 «В, полоса фильтрации 0-500 Гц).. ' б,в: оригинальные записи интегральных К* токов (пиковое значение тока не меняется) и токов через одиночные К+ каналы (I - в контроле, 2 - после добавления СД).

Грамицидин С (5 мкг/мл)

О мВ

Рис.?. Влияние грамицидина С на проводимость мембраны Т клеток, ч: развитие мембранного тока при добавлении с внеклеточной сто-¡■■мы мйкорчнн грамицидина С в концентрации 5 мкг/мл; б - неста-' и.'1-И:.; 1 чокЛрипые токи, в присутствии грамицидина С в концентра-•.!,!> «иг/мл; в: колебания комбраиного потенциала, индуциро-

3. ОСЦИЛЛЯЦИИ И ТРИГЕРНЫЕ СВОЙСТВА МЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА (МП)

ЛИМФОЦИТОВ.

Поскольку индукция неселективной ионной проводимости иммуностимулирующими препаратами приводила к характерным высокоамплитудныч колебаниям МП, было проведено детальное исследование поведения МП при стимуляции мембраны лимфоцитов импульсами внешнего тока.

3.1. Поведение мембранного потенциала в покоящихся лимфоцитах!

Импульс внешнего тока длительностью ь, деполяризующий мембрану, активировал К+ проводимость и вызывал первоначально равный ему по величине К+ выходящий ток, при этом мембранный потенциал возвращался на исходный уровень ПП (Рис.8,а). Таким образом, К+ каналы стабилизируют мембранный потенциал на уровне ПП. Если импульс внешнего тока был короткий (ь = 10 + 100 мс), то впоследствии моано было наблюдать значительную (около -70 мВ х 250 мс) гиперполяризацию мембраны.

Если внешний ток.поддерживали достаточно долго (с > 30 с) на уровне около I пА, то происходила деполяризация мембраны. Деполяризация, очевидно, была обусловлена уменьшением селективной К+ проводимости, поскольку токи через К+ каналы имеют свойство инактивироваться со временем. Одновременно с деполяризацией, после "достижения 'некоторого порогового уровня (около -30 мВ), можно было наблюдать значительное увеличение амплитуды колебаний МП до величин 20*50 мВ (см. Рис.8,б). Частота колебаний уменьшалась при этом до 0,6410,26 Ги (п=14).'

Обнаруженные высокоамплитудные колебания МП были вызваны изменениями К+ проводимости, поскольку они обратимо исчезали при добавлении с внеклеточной стороны селективного блокатора К+ каналов 4-аминопиридина (Рис.8,б). Амплитуда колебаний зависела от числа К* каналов в мембране клетки. Клетки с большим числом К* каналов имели большую амплитуду осцилляций, и для них требовалась большая величина возбуждающего тока.

Поведение мембраны после выключения внешнего тока также зави- • село от числа К"1" каналов в клетке. Для большинства покоящихся Т лимфоцитов МП оставался в.деполяризованом состоянии,' при этои высокоамплитудные колебания продолжались (Рис.9). Ято качественно новое состояние мембраны было устойчиво; самопроизвольного восстановления исходного значения ИП не наблюдалось.

-60 мВ 20

0 мВ

-ПО нВ

О_I

отмывка

2 г»А

Рис.8.

Характерные записи мембранного потенциала при стимуляции Т клеток иилульсами внешнего тока, а: гиперполяризация мембраны после пропускания короткого импульса внешнего тока (20 пА х 40 мс); С: высокоамплитудные колебания мембранного потенциала, индуциро-■ впнке длительным (5 мин) импульсом внешнего тока (колебания об-рчгнио устранялись селективным блокатором К+ каналов 4-аминоПи->>г/.-ноч в концентрации 10 мл).

Рис.9. Тригерныэ свойства мембраны покоящихся Т лимфоцитов. Высокоамплитудные цолебания мембранного потенциала продолжаются после выключения внешнего тока (запись приведена для клетки имевшей 250 К+ каналов во внешней мембране).

Тем не менее, ' К+ проводимость можно было реактивировать фиксацией напряжения на мембране уровне -50 т -70 мВ (ниже порога активации К+ каналов) в течение 5 * 10 мин. После этого МП возвращался к своему первоначальному уровню ПП, и клетка била готова к следующему триггерному переходу.

3.2. Поведение мембранного потенциала в лиыфобластах. Отсутствие триггерных свойств.

Для Т лимфобластов, в отличие от неактивировашшх Т клеток, мембранный потенциал был более устойчив при приложении к клеточной мембране внешнего тока. Как ухе отмечалось выше, для индукции деполяризации выше порогового потенциала и последующих ьысоко-аыплитудных осцилляций МП в покоящихся Т лимфоцитах необходимо' было приложить внешний ток величиной 1-2 пА. Что касаегсм Т лимфобластов, полученных через 48 часов исслй? актиькцли Кон А, имеющих больнее число К+ каналов, то' значительно большие ьвличн-ны внешнего тока вплоть до 4-20 пА (в завискиссги от числа капа-

20 мВ

1 ех = 5 пЛ

31) с

нВ

10 пД

20 п/\

плН 1ох

О иВ

Рис.10. Характерные записи ответов мембранного потенциала в Т лимфобластах при стимуляции мембраны внешним электрическим током, а: для данной клетки, имевшей 1360 К+ каналов, токи величиной вплоть до 20 пА не индуцировали колебаний МП; б: отсутствие тригерных ответов в лимфобластах - мембранный потенциал возвращается к своему первоначальному значению (до стимуляыии> сразу после окончания импульса внесшего тока (запись приведена для клетки, имевшей 712 К+ каналов).

лов) не вызывали высокоамплитудных осцилляций (см. РисЛО.а),

Кроме того, если осцилляции и появлялись, то лишь после значительной временной задержки около 2-3 мин (Рис.10,0), приблизительно равной времени установления стационарного уровня К+ проводимости в результате ее медленной инактивации. Кроме того, лимфо-' бласты не проявляли триггерных свойств, характерных для покоящихся клеток, то есть МП возвращался к своему первоначальному значению ПП сразу же после окончания импульса внешнего тока (Рис.10,6).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работа были исследованы свойства ионных каналов и ионной проводимости плазматической мембраны Т лимфоцитов человека при воздействии имыуномодуляторов различной природы: поликатиона Р1х, . полианиона СД, грамицидина С и лектина Кон А.

В результате проведенных исследований удалось установить, что проводимость мембраны представлена в лимфоцитах, главным образом, селективной потенциал-зависимой К+ проводимостью и небольшим неселективныи компонентом (1818 пСм). Поликатион рьь, как и ГрС, вызывают значительное увеличение неселективной проводимости мембраны Т лимфоцитов. Характер индуцированной проводимости позволяет заключить, что оба препарата не формируют в мембране каких-либо определенных проводяцих структур по типу ионных каналов, а облапают деструктивный действием на мембраны. Нонофороподобное действие 'ГрС и рсх приводит н характерным ответам МП в виде высока амплитудных (20 - 30 мВ) осцилляций.

В-клеточный активатор СД, в отличие от ра, не влияет на прово-аимость мембраны и мембранный потенциал Т клеток, что подтверяда-зт селективный характер действия полианионов лишь на В-лимфоциты.

В результате исследований поведения МП выяснилось, что меибра-•¡а покоящихся (неактивированных) Т клеток монет давать характерные «линейные ответы при раздраяении эе внешний электрический током. 5 зависимости от характера воздействия обнаружены ответа трех гипов: гкперполяриэация, высокоамплигудные колебания МП и триггер-шо переходы. Все типы ответов обусловлены свойствами'К* каналов.

В результате бласттрансфориации под действием миюгеннах юз Кон А а лимфоцитах значительно возрастает К* проводимость и 'трачивается способность клеток к тристерииа

Новые свойства плазматической мембраны Т клеток, описанные в настоящей работе, и экспериментальные данные об изменении этих свойств под действием различных иммуномодуляторов могут послужить хорошей основой для дальнейших более глубоких исследований как процессов иммуномодуляции, так и проблемы трансмембранной передачи сигналов и клеточной активации в целом.

ВНЕОДЫ

[.Используя метод фиксации потенциала на индивидуальных клетках, были исследованы ионпроводящие свойства плазматической мембраны Т лимфоцитов периферической крови человека. Выявлены два основных типа ионной проводимости мембраны: это нйселективная проводимость утечки величиной 18 ± 8 пСм (п=40) и селективная потенциал-зависимая калиевая проводимость, максимальное значение которой составляет 3,7 ±1,0 нСм (п=27). Последняя обеспечива-отся работой К+ селективных каналов с проводимостью около 12 пСм. Среднее число К+ каналов в мембране малого Т лимфоцита составляет 312185 (п=27). В условиях фиксации тока мембранный потенциал покоя у Т лимфоцитов флуктуирует в диапазоне потенциалов от -50 до -40 мВ с частотой 1*2 Гц и амплитудой 5*10 мВ. Я.Иммуностимулирующий поликатион поли-ь-лизин индуцирует в Т лимфоцитах трансмембранные ионные токи неселективной природы. Изменение проводимости под действием иммуностимулирующих концентраций препарата (0,1 - I мкг/мл) имеет временный обратимый характер. Повышение электрической проводимости мембраны под влиянием ргх индуцирует устойчивые высокоамплитудные (20-30 мВ) колебания мембранного потенциала с частотой 0,4 * 0,8 Ги. индуцировать высокоамплитудные колебания мембранного потенциала. л.Иммуностимулирующий полианион сульфат декстрана, селективный активатор В клеток, не вызывает регистрируемых изменений ион-прпводяших свойств плазматической мембраны Т лимфоцитов. 4.Иммуностимулирующий ионофор грамицидин С (0,1 - 1 мкг/мл) увеличивает неселективную проводимость клеточной мембраны, индуцирует переход мембранного потенциала в состояние устойчивых ьнсокоамплитудных колебаний, аналогичных полученным под действием поли-ь-лиэина.

5.Стимуляция мембраны малого Т лимфоцита внешним деполяризующим током приводит к триггерному перекоду мембранного потенциала в состояние устойчивых высокоамплитудных колебаний, как и в случае воздействия иммуностимулирующими концентрациями поли-ь--лизина и грамицидина С.

6.При активации Т клеток мигогенным лектином Кон А число К+ ка- -

. налов во внешней мембране возрастает приблизительно в два-три

раза). Лимфобласты не проявляют триггерных свойств, характерных для неактивированных Т клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Мальцев В.А., Маляев A.A. Регуляция мембранного потенциала в Т-клетках человека. - Тезисы Всесоюзного симпозиума "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах" (Карадаг, 26-28 апреля 1989) под ред. Берестовского Г.Н. и др. Научный центр биологических исследований АН СССР в Пущине, стр.62.

2. Маляев A.A., Мальцев В.А. Одиночные ионные каналы в мембране макрофагов мыши. - Тезисы Всесоюзного симпозиума "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах" (Карадаг, 26-28 апреля 1989).под ред. Берестовского Г.Н. и др. Научный центр биологических исследований АН СССР в Пучине, стр.63.

3. Атауллаханов Р.И-., Мальцев В.А. Анализ свойств ионпроводящих структур, индуцируемых в мембране лимфоцитов при воздействии иммуностимулирующим полиионом. - Тезисы Первого Всесоюзного иммунологического'съезда (Сочи, 15-17 ноября 1989) под ред. Петрова Р.В., том 2, стр.312.

4. Ätaullakhanov R.I . , üaltaev V.A. Patch-clamp analysis of ion conductance induced by an ironunostimilating polyion in the lymphocyte rcembrane. - ñstracts of the 7th International Congress of Iramunology, Weat Barl in, July 30~Auoust 5, 1989 (öd. Fisher G.), p.355.

in Мальцев В.Л. Анализ осцилляцкй мембранного потенциала Т-клеток человека. - Тезисы Всосомзного симпозиума "Ионные канали в Отологических мембранах" (Карадаг, 24-27 апреля 1990) под ред. Ореяестовского П.Д.,Посква, типография ВАСХНИЛ» стр.49.

6. Мальцев В.А., Маляев А.А., Каримов Д.П. Стационарные свойства калиевой проводимости мембраны Т-клеток человека. - Тезисы Всесоюзного симпозиума "Ионные каналы в биологических мембранах" (Карадаг, 24-27 апреля 1990) под ред. Брежестовского П.Д., Москва, типография ВАСХНИЛ, стр.50.

7.'Маляев А.А., Мальцев В.А. Кластерная организация К+ каналов

^ входящего выпрямления в мембране макрофагов мыши. - Тезисы

Всесоюзного симпозиума "Ионные каналы в биологических мембранах" (Карадаг, 24-27 апреля 1990) под ред. Брежестовского П.Д., Москва, типография ВАСХНИЛ, стр.51.

a. Maltsev V.A. Analysis of human T cell membrane potential

behaviour. - Abstracts of the 1st International Congress ISNIM (International Society for Neuroimmunomodulation, 4-th International Workshop on Neuroimmunomodulation, Florence, Italy -May 23-26, 1990), ed. Fortezza Da Basso.p,47.

9. Maltsev V.A. Membrane potential fluctuations in human T cells.- Abstracts of the 10-th European Congress EFIS (European Federation of Immunological Societies) Edinburgh, U.K., September 10-12, 1990, p. 27-30.

1С.Maltsev V.A. Is a lymphocyte an excitable cell? Report of ESF Network on Neuroimmunomodulation. Workshop 2: Receptor Transducer Mechanism, Edinburgh 12-14 October 1990, Supplement p.1-11.

11.Maltsev V.A. The threshold of lymphocyte excitability depends on the number of K+ channels in the plasma membrane. - Allergologie (F.R.G.), 1990, v.13, £9, p,317.

12.Maltsev V.A. Oscillating and triggering properties of T cell membrane potential - Immunology Letters, 1990, v.26, p.277-282.

13.Petrov R.V., Khaitov R.M., Ataullakhanov R.I., Maltsev V.A. The polymer interaction with the cell membrane.

1. Modification of ion-transporting properties of the lyraphocyte membrane. - Biomedical Science, 1991 (in press).