Автореферат и диссертация по медицине (14.01.30) на тему:Адаптивный ответ лимфоцитов на облучение при некоторых генетических патологиях и при старении

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИИ ИНСТИТУТ БИОРЕГУЛЯЦИИ И ГЕРОНТОЛОГИИ СЗО РАМН

04201453378 ца правах рукописи

БЕРНАДОТТ Александра

АДАПТИВНЫЙ ОТВЕТ ЛИМФОЦИТОВ НА ОБЛУЧЕНИЕ ПРИ НЕКОТОРЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПАТОЛОГИЯХ И ПРИ СТАРЕНИИ

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14.01.30 - геронтология и гериатрия

Научный руководитель:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Рыжак Галина Анатольевна Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Михельсон Виктор Михайлович

Санкт-Петербург - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 16

1.1. Некоторые теории старения, как звенья патогенеза старения 16

1.2. Пространственно-функциональная организация хромосом в ядре 33

1.3. Адаптивный ответ организма на малые дозы радиации 36

1.4. Эффект свидетеля 40 1.5 Синдромы генетической хромосомной нестабильности, репарация

двунитевых разрывов и РНК-полимераза II 43

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 48

2.1 Выделение и приготовление образцов лимфоцитов из периферической крови человека 48

2.2. Определение фазы клеточного цикла, в которой находятся лимфоциты, методом проточной цитометрии 48

2.3 Облучение лимфоцитов 49

2.4 Культивирование клеток 50

2.5 Изучение эффекта свидетеля 51

2.6. Культивирование клеток с ингибитором РНК-полимеразы II, альфа-аманитином 51

2.7. Приготовление клеточных препаратов 51

2.8. Гибридизация и детекция ДНК-зондов 52

2.9. Получение и анализ изображения ядер Go-лимфоцитов человека 53

2.10. Программный метод оценки расположения сигнала в объеме

ядра клетки 53

2.11. Статистическая обработка результатов исследования 56

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 57

3.1. Изменение положения хромосомы 1 в ядрах Go-лимфоцитов

при адаптивном ответе 57

3.2. Изменение положения хромосомы 1 в ядрах G0-лимфоцитов при адаптивном ответе при старении 60

3.3. Адаптивный ответ через эффект свидетеля в клетках молодых и старых доноров 63

3.4. Влияние мутации в генах BRCA1, 2 и ATM на процесс подготовки к реализации гомологичной репарации, именно, сближения гомологичных л оку сов хромосом 66

3.5. Индукция одной из фаз гомологичной репарации альфа-аманитином -ингибитором РНК-полимеразы II в клетках молодых доноров, доноров старше 70 лет и доноров с мутациями BRCA1, 2 69

3.6. Выявление субтоксичной дозы альфа-аманитина, при которой сохраняется эффект индукции сближения гомологичных локусов 74

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 76

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 82

ВЫВОДЫ 83

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 84

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 85

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Нарушение репарации хромосомной ДНК путем гомологичной рекомбинации приводит к нестабильности генома, характерной для старения. В то время как эпигенетические или мутационные процессы, влияющие на репарацию путем гомологичной рекомбинации, исследуются достаточно активно, процессы подготовки к ней не исследуются практически совсем. Последние процессы и явились предметом настоящей работы.

Предполагается, что для репарации путем гомологичной рекомбинации необходимо сближение локусов гомологичных хромосом [Zhang R. et al., 2007; Huang J. et al., 2008]. Следовательно, затруднение перемещения гомологичных хромосом может быть причиной нестабильности генома. Такое затруднение может быть обусловлено как приобретенными, так и наследственными причинами.

Установлено, что перемещение гомологичных локусов в нормальных (нетрансформированных) клетках может вызываться малыми дозами ионизирующей радиации [Спитковский Д.М. и др., 2005] и, как показано в нашем исследовании, альфа-аманитином - ингибитором РНК-полимеразы II.

В последнее время накапливаются данные, свидетельствующие о том, что хроматин имеет определенную, специфичную для разных типов клеток структуру — фенотип хроматина [Zhang R. et al., 2007], а также о том, что

хромосомы занимают определенные положения - хромосомные территории - в ядрах различных клеток. Фенотипическим свойством хроматина является его конденсация при старении. Фенотипическим признаком является также типовое инвариантное расположение хромосом в различных клетках.

Кроме того, прогрессивная конденсация хроматина, ограничивающая способность гомологичных локусов к транспозиции, наиболее отчетливая в старых клетках [ОЬ е1 а1., 2013], уменьшает возможность осуществления репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации. Это, в свою очередь, усугубляет стремительное накопление мутаций, столь характерное для клеток старых и склонных к онкологическим заболеваниям доноров.

Мы предположили, что накопление мутаций, свойственное клеткам старых организмов, может быть сопряжено с изменением фенотипа хроматина, т. е. с конденсацией хроматина, при которой невозможна рекомбинантная гомологичная репарация ДНК. А точнее - затруднен процесс движения хромосом. В задачу работы входило выяснить, так ли это. И возможно ли сближение хромосом в старых клетках, когда система сигнализирует о необходимости сближения, например, при той же самой гомологичной репарации в ответ на повреждения ДНК.

Для того чтобы определить, действительно ли в старых клетках затруднена репарация ДНК путем гомологичной рекомбинации, мы рассматривали способность клеток отвечать сближением гомологов при

адаптивном ответе (АО) клетки на малые дозы облучения. Модель адаптивного ответа была выбрана по двум причинам: во-первых, адаптивный ответ - это реакция, при которой стимулируется репарация в ответ на незначительные повреждения ДНК, во-вторых, повреждения эти не так велики, чтобы приводить клетки к апоптозу или малигнизации. То есть клетки, облученные в малых дозах (2-10 сГр) можно рассматривать как условно интактные.

Для исследования нами была выбрана пара больших хромосом 1, так как из данных литературы было известно, что в Go фазе клеточного цикла эта пара занимает примембранную ядерную территорию — то есть периферию ядра [Walt Н. et al., 1989; Tai P.W. et al., 2013]. Это означает, при их сближении транспозиция меченных локусов в ядре была бы наиболее значительной и удобной для регистрации в процессе эксперимента. Используя программный метод оценки изменения положения прицентромерных локусов хромосомы 1 в ядрах Go-лимфоцитов при адаптивном ответе после рентгеновского облучения в дозе 10 сГр. можно было бы наблюдать их сближение.

Этот метод позволял определить, возможно ли индуцировать гомологичную репарацию, оставляя клетки неповрежденными. Такая возможность крайне важна как теоретически - для понимания молекулярных основ механизма передачи сигнала о необходимости сближения хромосом для осуществления репарации с помощью гомологичной рекомбинации, так и практически - активация такого сближения была бы первым шагом на пути к

терапии или профилактике нарушения репарации ДНК при старении.

Вероятно, нарушение процессов репарации ДНК, свойственное некоторым генетическим синдромам, сопряжено с затруднением сближения гомологичных хромосом, и фенотип хроматина при таких синдромах близок к фенотипу хроматина при старении организма. Для доказательства функциональной близости между старением и некоторыми генетическими патологиями мы рассмотрели сближение гомологичных хромосом при адаптивном ответе в лимфоцитах, полученных от доноров с мутациями в генах BRCA1, 2 и ATM.

В процессе изучения возможности повышения сниженной при старении активности процессов репарации ДНК был исследован также «эффект свидетеля» в Go-лимфоцитах, взятых от доноров разного возраста и доноров, страдающих некоторыми генетическими синдромами, характеризующимися нарушением процессов репарации ДНК.

Учитывая данные литературы о том, что РНК-полимераза II играет важную роль в безошибочном воссоединении двунитевых разрывов ДНК, то есть в репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации, было важно исследовать ее роль в сближении гомологичных хромосом при адаптивном ответе. Для выяснения механизма влияния подавления активности РНК-полимеразы II на перемещение гомологичных хромосом в контроле и при адаптивном ответе был выбран ингибитор РНК-полимеразы II - альфа-аманитин. Предварительные результаты исследования показали, что подавление

активности РНК-полимеразы II в необлученных клетках молодых доноров вызывает сближение гомологичных хромосом как при адаптивном ответе. В связи с этим была изучена возможность инициации альфа-аманитином сближения хромосом в тех клетках, где отсутствие этого процесса является единственной причиной нарушения репарации ДНК. В первую очередь - при старении. При этом мы исходили из того, что именно затруднение сближения гомологов является основной причиной нарушения репарации при старении. Для этого было исследовано действие альфа-аманитина в клетках здоровых молодых доноров, доноров старше 70 лет, доноров с мутациями в генах ВЯСА1, 2 и АТМ.

К настоящему времени нет работ, которые оценивали бы изменения способности к безошибочной репарации путем гомологичной рекомбинации при старении и наследственных синдромах через способность гомологичных хромосом осуществлять сближение, необходимое для этого типа репарации. Также нет работ, где бы рассматривались попытки решить эту проблему, активируя адаптивный ответ клетки и усиливая репарацию ДНК, используя ингибиторы РНК-полимеразы II. Это обусловило актуальность темы исследования.

Цель исследования - изучение адаптивного ответа как начального этапа репарации ДНК путем гомологической рекомбинации в клетках молодых и старых здоровых доноров и доноров, несущих мутации в генах ВЯСА1,2

(предрасположенность к опухолям молочной железы и яичников у женщин) и ATM (атаксии-телеангиэктазии или синдром Луи-Бар), а также возможности влияния на этот процесс.

Задачи исследования:

1. На примере положения прицентромерных локусов хромосомы 1 в ядрах Go-лимфоцитов молодых доноров в норме и при адаптивном ответе изучить способность к сближению гомологичных хромосом как процесса, необходимого для осуществления репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации. Адаптирующая доза рентгеновского облучения - 10 сГр.

2. Исследовать ту же способность к сближению хромосом при адаптивном ответе у доноров старше 70 лет.

3. Исследовать ту же способность к сближению хромосом при адаптивном ответе у доноров с нарушением процессов репарации двунитевых разрывов ДНК путем гомологической рекомбинации, несущих мутации в генах BRCA1, 2 и ATM.

4. Описать эффект свидетеля при адаптивном ответе, наблюдая изменение положения прицентромерных локусов хромосомы 1 в ядрах необлученных Go-лимфоцитов всех изученных доноров, инкубированных в среде от облученных в адаптивной дозе 10 сГр Go-лимфоцитов молодых здоровых доноров.

5. Изучить возможность индукции начальных этапов репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации ингибитором РНК-полимеразы II альфа-

аманитином в клетках здоровых молодых доноров, доноров старше 70 лет и доноров, несущих мутации в генах BRCA1, 2 и ATM.

6. Определить минимальную эффективную дозу ингибитора РНК-полимеразы II альфа-аманитина и оценить ее токсичность.

Научная новизна результатов исследования

Впервые показано, что при старении (у людей, достигших 70-летнего возраста) нарушено сближение гомологичных хромосом в ответ на облучение малыми дозами радиации, что может рассматриваться как причина накопления мутаций.

Впервые показано, что мутации в генах BRCA1 и BRCA2 сопряжены с нарушениями транспозиции гомологов хромосом в ответ на облучение в малых дозах (10 сГр). Впервые произведена индукция сближения гомологичных локусов хромосом в клетках с затрудненным прохождением репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации, а именно — при старении и в клетках с мутациями BRCA1, 2.

Показано, что все типы клеток (при старении, в норме и патологии) при инкубации с ингибитором РНК-полимеразы II альфа-аманитином приобретают свойства, характерные для активированных клеток молодых доноров после облучения малыми дозами. Найдена минимальная доза агента, инициирующего сближение гомологичных хромосом, которое можно рассматривать как первый шаг гомологичной рекомбинации.

Теоретическая значимость работы

Полученные результаты свидетельствует о том, что адаптивный ответ проявляется сближением хромосом, что необходимо для репарации путем гомологичной рекомбинации.

Показано, что нарушения репарации при некоторых синдромах и при старении характеризуются затруднением сближения гомологичных хромосом, что может являться причиной прогрессирующей нестабильности генома, которая отмечается с возрастом и при некоторых генетических патологиях. Данное затруднение сближения гомологов в случае старения может быть связано с конденсацией хроматина.

Сближение гомологичных хромосом можно индуцировать некоторыми веществами (альфа-аманитин) и радиационным воздействием в малых дозах.

Альфа-аманитин может рассматриваться как универсальный индуктор репарации путем гомологичной рекомбинации, так как он в отличие от рентгеновского облучения в малых дозах вызывает сближение гомологичных хромосом не только в норме, но и при патологиях различного генеза и при старении. Альфа-аманитин может рассматриваться как агент, индуцирующий деконденсацию хроматина и переводящий клетку в стимулированное состояние.

Роль РНК-полимеразы II и её ингибитора альфа-аманитина в репарации путем гомологичной рекомбинации до конца не изучена, но показано, что использование ингибитора может индуцировать репарацию в обход работы

РНК-полимеразы II.

Установлено, что затруднения осуществления репарации путем гомологичной рекомбинации при старении и при некоторых генетических патологиях не связаны с нарушением передачи сигнала между клетками при адаптивном ответе.

Практическая значимость результатов исследования

Нарушение сближения гомологичных хромосом можно рассматривать как дополнительный фактор, характерный для старых гетерохроматизированных клеток, то есть как маркер старения, одновременно показывающий степень выраженности изменений при старении.

Нарушение сближения гомологичных хромосом может рассматриваться как прогностический и диагностический признак для выявления степени выраженности возрастных изменений хроматина и нарушения репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации.

Малые дозы ионизирующей радиации могут использоваться для стимулирования адаптивного ответа как профилактика повреждений для людей, подвергающихся рискам взаимодействия с генотоксикантами.

Положения, выносимые на защиту:

1. При старении и некоторых генетических патологиях, для которых характерно снижение эффективности репарации ДНК, в клетках не выявляется сближение гомологичных хромосом, необходимого для осуществления

репарации путем гомологичной рекомбинации.

2. Сближение хромосом, необходимое для осуществления гомологичной репарации, не происходит в клетках пожилых доноров, что предположительно связано с уровнем конденсации хроматина.

3. Адаптивный ответ передается через эффект свидетеля в клетках здоровых молодых доноров и не индуцируется в клетках пожилых доноров и пациентов с некоторыми генетическими патологиями. Это свидетельствует о том, что у последней группы доноров затруднение сближения гомологов хромосом не связано с передачей сигнала между клетками.

4. Альфа-аманитин индуцирует сближение гомологичных хромосом в клетках пожилых доноров и доноров с некоторыми генетическими патологиями.

5. Доза альфа-аманитина, достаточная для индукции сближения гомологичных хромосом, превышает токсическую.

Апробация работы

Работа была доложена и обсуждена на III международном симпозиуме «Хроническое радиационное воздействие: медико-биологические эффекты» (Россия, Челябинск, 2005); V съезде медицинской генетики (Уфа, 2005); 9-й международной Волфсбергской встрече «Молекулярная радиационная биология. Онкология» (Швейцария, 2005); III международном симпозиуме «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций» (Дубна, 2005).

Публикации

Основные положения диссертации отражены в 11 публикациях, в том числе 5 статьях в изданиях, включенных в Перечень ВАК, и 6 тезисах докладов.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, методической части, результатов исследования и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 100 страницах, содержит 8 рисунков. Список цитируемой литературы состоит из 157 источников, из них 146 иностранных.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Некоторые теории старения, как звенья патогенеза старения

Старение является состоянием (нормальным или патологическим — зависит от выбора парадигмы теории старения), характеризующимся возрастным снижением эффективности работы систем и органов, потерей пластичности системы в целом и снижением адаптационной спо�