Автореферат и диссертация по медицине (14.00.53) на тему:Особенности структуры субпопуляционного состава Т-лимфоцитов у долгожителей

На правах рукописи

Столпникова Вера Николаевна

ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ СУБПОПУЛЯЦИОННОГО СОСТАВА Т-ЛИМФОЦИТОВ У ДОЛГОЖИТЕЛЕЙ

(ПО ДАННЫМ ЦИТОМЕТРИИ)

14.00.53 - Геронтология и гериатрия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2006

3/л — ¿V

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском институте геронтологии Федерального Агенства по здравоохранению и

социальному развитию

Научный руководитель:

доктор биологических наук И.В. Мирошниченко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук К.Г. Каверина доктор медицинских наук Е.Д. Курбатова

Ведущая организация:

Самарский государственный медиципский университет

Защита состоится 2006 г. в /3» часов на заседании

диссертационного совета Д. 208. 104. 01 в ФГУ НИИ геронтологии { Росздрава по адресу: 129226, г. Москва, ул. 1-я Леонова 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ РНИИ геронтологии Росздрава.

Автореферат разослан «_»_2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Н.М. Соколова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Увеличение доли пожилых людей в обществе стало особенно заметно в последней четверти XX века. Это значительно повышает интерес к геронтологии и, прежде всего, к изучению первичных механизмов старения организма и факторов, определяющих продолжительность жизни. В принятой на Второй Всемирной ассамблее ООН по проблемам старения «Программе ООН по исследованиям старения в XXI столетии» (апрель 2002 г., Мадрид) отмечается, что лучшее понимание фундаментальных механизмов старения и факторов долголетия имеет первостепенное значение для реализации полного потенциала здорового старения [Пальцев М.А., 1999; Хохлов А.Н., 1988].

Процесс старения охватывает все уровни структурной организации человека - молекулярный, субклеточный, тканевой, органный. Суммарный результат многочисленных частных проявлений старения на уровне целостного организма заключается в нарастающем с возрастом снижении его жизнеспособности, уменьшении эффективности приспособительных, гомеостатических механизмов [Ярыгин В.Н. 2001].

Важную роль в защите организма и поддержании его гомеостаза играет иммунная система, старение которой в нормальных условиях начинается раньше, чем в других системах и связано с инволюцией тимуса [Ярилин A.A. 1999].

Поэтому многими исследователями старость рассматривается как Т-иммунодефицит, сопровождающийся ослаблением реакций иммунитета и часто изменением их характера. В результате развиваются аутоиммунные, онкологические процессы и хроническое течение заболеваний, что составляет основу полиморбизма в старости [Серова Л.Д. 2002; Ярилин A.A. 2003; Globerson А. 2000].

Вместе с тем иммунная система имеет значительный запас прочности, который создается в процессе формирования защитных сил организма с момента его рождения [Globerson А. 2000].

В связи с этим, с научной точки зрения, долгожители представляют интерес для исследователя как своеобразная модель сохранения защитных свойств организма до глубокой старости и его адаптации к существованию в измененных условиях стареющего организма на фоне полиморбидности.

Поэтому тщательное исследование параметров иммунной системы долгожителей является актуальным, открывая возможности не только для оценки иммунного статуса этого возраста, но и определения потенциальных и адаптационных способностей стареющей иммунной системы, как ключа к увеличению продолжительности жизни человека.

Цель работы

Выявление количественных изменений в показателях иммунитета и определение набора признаков, позволяющих оценить иммунореактивность организма долгожителей.

Задачи исследования

1. Определить среднестатистические показатели иммунитета, частоту их отклонений от нормы у долгожителей г. Москвы и выделить для дальнейшего анализа показатели с наибольшими отклонениями от нормы.

2. Выявить и доказать наличие связи между численностью Т-клеток с фенотипом СВЗ+С04'С08", изменениями уровня сывороточной тимической активности (СТА) и количества СБЗ+СБ8+ Т-клеток.

3. Разработать метод двухцветной цитометрии для выявления Т-клеток с фенотипом СОЗ+СВ4"СБ8' и дополнительного уточнения их фенотипа.

4. Определить прогностическую значимость изменений уровня СТА, количества СБЗ+С08+ и С03+С04"С08" Т-лимфоцитов у долгожителей.

Научная новизна

Впервые дана характеристика иммунитета у долгожителей, особенностью которого является снижение уровня СТА, количественный дефицит субпопуляции СОЗ+СВ8+ Т-лимфоцитов и увеличение численности Т-клеток с фенотипом С03+С04"СВ8" у значительного процента долгожителей.

Впервые выявлены варианты связи между этими показателями: реципрокное и обратимое изменение количества С03+С04'СВ8" Т-лимфоцитов по отношению к количеству СОЗ+СВ8+ Т-клеток и уровню СТА и необратимое снижение количества СБЗ+С08+ Т-клеток и уровня СТА при отсутствии в периферической крови С03+С04"С08" Т-клеток. Показано, что первый вариант изменений согласуется с сохранением иммунореактивности, второй является предвестником летального исхода.

Впервые при первичном иммунологическом обследовании в двухцветной цитометрии с использованием двух флюорохромов фикоэритрина (ФЭ) и флюgpgcцeинизoтиoциaнaтa (ФИТЦ), с помощью разработанных нами комбинаций моноклональных антител (МКАТ) СЭЗ ФЭ/(С04+С08)ФИТЦ и С03ФЭ/(С04+СВ8+С016)ФИТЦ были выявлены два типа клеток среди СВЗ+С04"СБ8" Т-лимфоцитов, которые различались экспрессией поверхностной молекулы С016 и интенсивностью свечения СЭЗ -рецептора, и показано, что дефицит СОЗ+СБ8+ Т-клеток восполнялся за счет Т-клеток с фенотипом С03|тУС04-СВ8-С016\

Научно-практическая ценность работы

Разработанные дополнительные комбинации МКАТ

С03ФЭ/(СЭ4+С08)ФИТЦ и С03ФЭ/(С04+С08+СШ6)ФИТЦ позволяют уже на уровне первичного обследования методом двухцветной цитометрии выявить минорные группы СПЗЬ'С04'С08"С01610" (естественные Т-киллеры) и

CD3l0WCD4"CD8"CD16" T-лимфоцитов и по типу количественных изменений субпопуляций CD3+CD8+ и CD3l0WCD4"CD8"CD16" прогнозировать жизненный потенциал и эффективность лечения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У значительной части долгожителей на фоне полиморбидности и снижения гормональной функции тимуса, определяемой по уровню СТА, наблюдается количественный дефицит CD3+CD8+ Т-лимфоцитов и появление Т-клеток, лишенных субпопуляционных маркеров (CD3+CD4" CD8").

2. Появление и исчезновение CD3+CD4"CD8" Т-лимфоцитов связано с изменениями уровня СТА и количества CD3+CD8+ Т-лимфоцитов. Выявлено два варианта изменений:

- обратимые и реципрокные количественные изменения CD3+CD4"CD8" Т-лимфоцитов по отношению к уровню СТА и количеству CD3+CD8+ Т-лимфоцитов, что является благоприятным прогностическим тестом;

- необратимое снижение всех трех показателей, что расценивается как маркер риска близкого смертельного исхода.

3. Популяция Т-клеток с фенотипом CD3+CD4"CD8' является гетерогенной, что показано с помощью разработанного метода двухцветной цитометрии и включает CD3h,CD4'CD8'CD16l0W (естественные киллерные Т-клетки) и CD3lowCD4"CD8"CD16" Т-клетки, Именно численность последнего типа клеток изменяется в зависимости от уровня СТА и количества CD3+CD8+ Т-лимфоцитов.

Внедрение результатов работы Настоящее исследование проводилось в соответствии с договором Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации №004/212/001 «Мониторирование здоровья и методы реабилитации старшего поколения населения России», выполняемым в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Геронтология и гериатрия» 2001-2005г., в рамках проблемы «Дети Чернобыля» по договору с Федеральным детским научно-практическим центром противорадиационной защиты.

Основные результаты исследования изложены в пособии для врачей «Основные клинико-лабораторные критерии в оценке эффективности лечения у больных пожилого и старческого возраста», Москва 2001г. и в пособии «Клинико-лабораторная оценка состояния здоровья у долгожителей», утвержденом 'Секцией «Геронтология и гериатрия» УМС МЗ-РФ, Москва 2003г., в «Руководстве по геронтологии». Коллектив авторов / Под редакцией академика РАМН, профессора В.Н. Шабалина.- М.: Цитадель-трейд, -2005.- С. 189-196 и в 16 опубликованных работах.

Разработанный метод иммунологического обследования долгожителей внедрен в практику иммуномониторинга пациентов клиники ФГУ НИИ геронтологии Росздрава.

Апробация работы

Апробация диссертации проведена на Ученом совете ФГУ РНИИ геронтологии Росздрава. Материалы диссертации были представлены на ГУ-ый Европейский конгресс по геронтологии (Берлин, 1999г.), I и II научно-практических конференциях «Общество, государство и медицина для пожилых и инвалидов» (Москва, 2004 г. и 2005 г.) и на X Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Греция, Афины, 19-25 октября 2005 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 16 научных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 91 странице печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, заключения и выводов. Работа содержит 10 рисунков и 11 таблиц. Список литературы включает 138 литературных источников (40 российских и 98 зарубежных работ).

СОД ЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Объектом исследования были клетки периферической крови следующих групп пациентов:

— долгожителей г. Москвы в возрасте от 90 до 103 лет;

— больных апластической анемией (АА), в лечении которых был использован антитимоцитарный глобулин козий (АТГ-Кз);

— детей, проживающих на территориях, загрязненных радионуклидами после аварии на Чернобыльской атомной электростанции (ЧАЭС).

— долгожителей, в лечении которых было использовано низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ).

Характеристика обследованных групп представлена в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика обследуемых групп пациентов

Группы Количество пациентов Возраст (лет) Общее количество иммунологических обследований

Долгожители 103 90-103 112

Больные АА, пролеченные АТГ-Кз 8 17-42 21

Дети, проживающие на территориях, загрязненных радионуклидами 21 1-15 21

Долгожители, пролеченные НИЛИ 5 90-95 10

Примечание: у всех больных было получено устное согласие на обследование.

Долгожители проходили общее обследование в клинике ФГУ РНИИ геронтологии Росздрава (главный врач М.Г. Филатова).

В таблице 2 представлена частота различных заболеваний у долгожителей.

Таблица 2

Частота различных заболеваний у долгожителей

Заболевания: Частота встречаемости заболеваний (%)

сердечно-сосудистая и цереброваскулярная патология 90

органов пищеварения 63

органов дыхания 13

костно-мышечного аппарата 50

мочеполовой системы 28

онкологические 3

Примечание: данные получены на основе анализа историй болезней.

Среди больных с диагнозом апластическая анемия было выбрано 8 человек с тяжелой формой заболевания, которым с лечебной целью применяли иммуносупрессивную монотерапию АТГ-Кз производства РНИИ геронтологии [Лицензия № 1

5/0031-Л/02, авторы: Шабалин В.Н., Серова Л.Д., Голубева В.Л.]. Работа выполнялась совместно с лабораторией возрастной гематологии, где осуществлялось лечение и клиническое наблюдение за больными (зав. лаб. д.м.н. Шишина Р.Н.).

Иммунологическое обследование детей в возрасте от 1 до 7 лет (9 человек) и от 8 до 15 лет (12 человек), проживающих на загрязненных радионуклидами территориях, проводили через 6 лет после аварии. Работа выполнялась в рамках проблемы «Дети Чернобыля» по договору с Федеральным детским научно-практическим центром противорадиационной защиты.

Среди долгожителей, обследованных в клинике, был дополнительно проведен иммуномониторинг 5 долгожителей, в комплексном лечении которых было использовано низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ). Облучение проводили отечественным лазерным прибором «Муравей» на длине волны 0,89 мкм. Общая доза излучения для долгожителей была снижена, по сравнению с рекомендованной инструкцией, и составила за 7 сеансов 0,07 мДж/см 2. Работа выполнялась совместно с лабораторией лазерных методов лечения (зав. лаб. к.м.н. О.М. Карпенко).

В работе использовали:

метод двухцветной проточной цитометрии для определения субпопуляций лимфоцитов; относительные (%) и абсолютные (число клеток в мкл) количества СЭЗ+, С03+С04+, СОЗ+СБ8+ Т-лимфоцитов, СБ16+СОЗ" естественных киллерных клеток (ЕКК) и С019+ В-лимфоцитов определяли с помощью моноклональных антител (МКАТ) фирмы ООО «Сорбент» и НПЦ «МедБиоСпектр», Москва;

- метод двойной иммунодиффузии в агаре по Манчини для определения иммуноглобулинов классов О, А и М с использованием иммунодиффузных планшетов фирмы «Реафарм», Москва;

- метод определения уровня СТА в азатиоприновом тесте по восстановлению чувствительности к азатиоприну розеткообразующей способности спленоцитов тимэктомированных мышей; его выражали в 1о£2, Определение СТА проводилось на базе ГНЦ РФ-Института иммунологии МЗ РФ под руководством к.м.н. Кочергиной Н.И.

Статистическую обработку результатов анализов проводили при помощи компьютерной программы, которая изложена в статье «Разработка базы данных и статистического анализа иммунологического обследования» [Тараскин В.Ф., 1995]. Для каждого показателя рассчитывали среднюю арифметическую величину, частоту отклонения от нормы и доверительный интервал средней с уровнем вероятности 95% для оценки достоверности различий рассчитанных величин.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Большинство средних показателей иммунитета у долгожителей соответствовали норме. Сохранение нормального абсолютного количества лимфоцитов обеспечивалось увеличением их процентного содержания в крови.

Таблица 3

Характеристика иммунитета долгожителей

Показатели иммунитета и единицы их измерения Количество долго жителей Средние арифметические значения (М) и оценка достоверности показателей для группы:

долгожителей (90-103 года) лиц в возрасте 20 - 50 лет (норма) Р

Лимфоциты. % кл/мкл 103 36 (34+ 39) * 28 (19+37) >0,05

1900 (1740-2100) 2100 (1200+3000) >0,05

Т-лимбоциты: СОЗ+, % кл/мкл 103 66 (63 +70) 72,5 (65+ 80) >0,05

1270 (1130+1410) 1450 (1100+1800) >0,05

С03+С04+, % кл/мкл 103 39 (36+41) 40 (30+50) >0,05

720(640+800) 800 (600+1000) >0,05

С03Х08\ % кл/мкл 103 20 (17+23) | 29 (20+38) <0,05

310 (250+370)| 600 (400+800) <0,05

С03+С04"С08",% кл/мкл 103 7 (5+9) Т <5 <0,05

130 (100+160) т <70 <0,05

ЕКК: СЕ>3"СШ6+, % кл/мкл 103 19 (16+22) 15(10+20) >0,05

370 (290+450) 300 (200+400) >0,05

13-лим<Ьопиты: СБ194", % кл/мкл 103 7 (6+8) 12(7+17) >0,05

140 (120+160) 200(100+300) >0,05

^С), г/л 103 15(13+17) 14 (8+20) >0,05

1§А, г/л 103 3,9(3,5 + 4,3) 2,7(0,9+4,5) >0,05

^М, г/л 103 2,2 (2,0+2,4) 1,5 (0,6+2,5) >0,05

СТА. 1оа2 84 2,1(2,0 + 2£)1 >3 <0,05

Примечание: * - в скобках границы доверительного интервала при уровне вероятности 95%, р - показатель достоверности различий при уровне вероятности 95%, жирным шрифтом выделены средние показатели, отличающиеся от нормы.

Для ЕКК, IgA и IgM наблюдалась тенденция роста показателей в сторону верхней границы нормы, для Т-хелперов и В-лимфоцитов — в сторону нижней границы. Колебания показателей IgG были незначительны и также находились в пределах нормы. Исключение составили достоверно отличающиеся от нормы показатели, относительного и абсолютного содержания CD3+CD8+ Т-лимфоцитов, Т-лимфоцитов с фенотипом CD3+CD4"CD8" и уровня СТА (табл.3).

Наши исследования подтвердили данные других авторов о сохранении до глубокой старости большинства среднестатистических количественных показателей иммунитета на уровне нормы [Ярилин A.A., 2003] и снижении численности субпопуляции Т-супрессоров [Бутенко Г.М., 1993, Ptak W., 1998].

Таблица 4

Оценка варьирования относительных и абсолютных показателей

иммунитета долгожителей по частоте отклонения (Е) от нормы

Показатели иммунитета Количество обследованных долгожителей Частота встречаемости показателей (Е ±ш), %, соответствующих:

норме ниже нормы выше нормы

Лимфоциты, %. кл/мкл 103 39±0,7 9±1,0 52+0,5

77+0,3 16±0,9 7±1

Т-лимфоциты, % кл/мкл 103 34±0,8 4б±0,6 20±0,9

38±0,7 . 46±0,6 16±0,9

, Т-хелперы, % кл/мкл 103 61 ±0,4 25±0,9 14+1,0

47±0,6 44±0,6 9±1,0

CD3+CD8+ Т-лф, % кл/мкл 103 29+0,8 62±0,5 9±1,0

14±3,7 78±0,4 8±1,0

CD3+CD4"CD8", % кл/мкл 103 58±0,7 - 42±0,7

43±4,0 - 57±5,1

ЕКК, %. кл/мкл 103 36+0,7 28±0,8 36±0,7

29±0,8 38+0,7 33+0,8

В-лимфоциты, %. кл/мкл 103 23±0,9 70±0,3 7±1,0

46±0,6 49±0,6 4,5±1,1

СТА, log2 84 19±4,5 81±4,5 0

Примечание: - жирным шрифтом выделены значения, наиболее отклоняющиеся от нормы.

В таблице 4 представлено процентное количество долгожителей, относительные и абсолютные показатели которых соответствовали норме, были

ниже нормы или выше нормы. Относительный и абсолютный дефицит С03+С08+ Т-лимфоцитов отмечался у значительного числа долгожителей (62±0,5% и 78±0,4%, соответственно), что отразилось на снижении средней арифметической по всей группе (табл. 3).

Наличие у 59 из 103 долгожителей (57±5,1%) Значительного количества СОЗ+СВ4'СВ8~ Т-лимфоцитов влияло на увеличение среднего арифметического значения этого показателя. У 68 из 84 обследованных пациентов (81±4,5%) был снижен показатель СТА.

Таблица 5

Относительные и абсолютные средние значения показателей иммунитета долгожителей, распределенных по группам в соответствии с отклонениями

от нормы

Показатели иммунитета Количество обследованных долгожителей M ±m показателей по группам, соответствующим :

норме ниже нормы выше нормы

Лимфоциты, %. кл/мкл 103 29±0,8 14±2,0 45±1,2

1900±60 940±90 37001210

Т-лимфоциты, % кл/мкл 103 74±0,8 52±1,8 87+1,0

1370±30 770+40 2300±140

Т-хелперы, % кл/мкл 103 41 ±0,8 22+1,3 57±1,4

840±20 420+20 1490±120

CD3+CD8+ Т-лф, % кл/мкл 103 28±1,0 12±0,7 49+2,5

620±30 196±17 1270±210

CD3+CD4"CD8", % кл/мкл 103 2,7+0,2 0 14±1,2

30+1,0 0 226±10

ЕКК, %. кл/мкл 103 15+0,4 5,6+0,6 34±2,2

280±10 110+10 760±70

В-лимфоциты, %. кл/мкл 103 10+0,5 4,4+0,2 22±2,1

180±10 60+0,0 590±150

СТА, 1о& 84 4,5±0,5 1,6±0,1 -

Примечание: - жирным шрифтом выделены значения, наиболее отклоняющиеся от нормы.

Результаты наших исследований показали, что у долгожителей, несмотря на соответствие средних значений иммунологических показателей норме, увеличена прослойка лиц с показателями ниже нормы, в частности для СОЗ+СБ8+ Т-лимфоцитов.

В таблице 5 представлены относительные и абсолютные средние значения показателей иммунитета долгожителей, распределенных по группам в соответствии с отклонениями от нормы. В группе лиц с низкими показателями СОЗ+СП8+ Т-лимфоцитов и уровня СТА средние арифметические значения были более чем в два раза ниже нормы; в группе лиц с увеличенным количеством С03+С04'С08" Т-клеток средние арифметические показатели превышали норму более чем в 5 раз.

Таким образом, наиболее существенные изменения в иммунитете долгожителей характеризовались снижением уровня СТА, количества С03+С08+ Т-лимфоцитов и появлением необычной субпопуляции Т-клеток с фенотипом СВЗ+С04"СБ8".

Для определения взаимосвязи между изменениями уровня СТА, количеством С03+С08+ и С03+СВ4"С08" Т-лимфоцитов были проанализированы данные повторных обследований 20 долгожителей, проведенных с интервалом от двух недель до 4 лет.

В процессе наблюдения на фоне низкого уровня СТА было выявлено три типа изменений соотношений показателей СОЗ+СВ8+ и СОЗ+СЛ4"СВ8" Т-лимфоцитов во времени (рис.1).

К первому типу отнесли снижение количества СРЗ+СВ4"С08* Т-лимфоцитов на фоне увеличения количества С03+С08+ Т-клеток; ко второму типу - увеличение количества СВЗ"ЧИ)4'СВ8" Т-лимфоцитов на фоне снижения С03+С08+ Т-лимфоцитов; к третьему типу — снижение всех трех показателей, что предшествовало летальному исходу.

СТА

89 91

Возраст (лет)

89 91

Возраст (лет)

Первый тип

СТА

101 102

Возраст (лет)

101 102 Возраст (лет)

Второй тип

а 2 о с

о о

Возраст (лет)

СТА .

93 94

Возраст (лет)

а о

93 94

Возраст (лет) Третий тип

93 94

Возраст (лет)

Рис.1. Примеры типов изменения соотношений количества СВЗ+СВ8+ и СОЗ+СВ4"СБ8" Т-лимфоцитов у долгожителей на фоне низких значений

уровня СТА.

Проведен длительный иммуномониторинг пяти долгожителей в течение 2 лет (3 человека), 3,5 лет (1человек) и 4 лет (1 человек) с количеством обследований более двух (рис.2).

Показано, что изменения первого и второго типов в течение жизни могут сменять друг друга в зависимости от состояния здоровья, сохраняя при этом реципрокность между количеством С03+СВ4"С08" Т-лимфоцитов, с одной стороны, и уровнем СТА и численностью СБЗ+С08+ Т-лимфоцитов, с другой. При этом обратимость реакций первого и второго типа свидетельствовала о сохранении иммунореактивности в этом возрасте и явилась благоприятным прогнозом для течения заболевания.

1-Од2 4-

90 91 возраст (лет) Пациент Д.Е.

92

1-од 1 4 3 2 ■ 1 0

97 98 99 возраст (лет)

Пациент Б.Л.

•СТА

101 102 103 возраст (лет)

Т-лф (кл/мкл) 1000

800

600 -

400

200

0

Т-лф (кл/мкл)

400 300 200 -100

Т-лф (кл/мкл) 800

600 ■

400 ■

200

0

—СОЗ+СМ+ -С03+С04-С08-

, V,

90

91 92 возраст (лет)

94

—СПЗ+С08+ — С03+СЕ14-С08-

97

98

возрзст (лет)

—СОЗ+ССЯ+ -С03+С134С[38-

101 102

возраст (лет;

Пациент П.Е.

Рис. 2. Изменения показателей уровня СТА, количества СОЗ+СБ8+ и СВЗ+СВ4"СВ8* Т-лимфоцитов у долгожителей в течение длительного

наблюдения.

По литературным данным, лица старческого возраста со сниженной активностью Т клеток-супрессоров имеют меньшую выживаемость по сравнению с нормальным возрастным контролем [Бутенко Г.М., 1993]. По нашим данным, несмотря на малое число наблюдений, прослеживалась тенденция увеличения срока жизни при наличии в организме СВЗ+СВ4"СВ8' Т-лимфоцитов. Можно предположить, что эти клетки являются резервом иммунной системы для восполнения количественного недостатка СП>3+С08+ Т-лимфоцитов.

В связи с этим появляется возможность использования иммуннокорригирующей терапии у долгожителей с целью повышения защитных сил организма.

Снижение всех трех показателей в связи с полученными нами результатами может рассматриваться как фактор риска близкого смертельного исхода.

Для объяснения причины увеличения количества CD3+CD4"CD8" Т-лимфоцитов у долгожителей в связи со снижением количества CD3+CD8+ Т-лимфоцитов и уровня СТА мы определяли эти показатели у людей в ситуациях, когда один из параметров был искусственно снижен в результате воздействия внешних факторов.

Известно, что облучение сопровождается снижением секреторной функции эпителиальных клеток тимуса и отражается на уровне сывороточных гормонов тимуса [Ярилин A.A., 1997].

Известно также, что лечение апластической анемии направлено на супрессию CD3+CD8+ Т-лимфоцитов, для чего в практике используют препарат антилимфоцитарный глобулин [фирмы-производители: Pharmacia & Upjohn Company, США; Fresenius, Германия; ФГУ РНИИ геронтологии, Россия]. 1

В связи с этим были рассмотрены результаты цитометрического анализа периферической крови и уровня СТА у двух групп пациентов, подвергшихся иммуносупрессии:

1) дети в возрасте от 1 до 7 лет (9 человек), родившиеся после аварии на ЧАЭС, и от 8 до 15 лет (12 человек), родившиеся до аварии, проживающие на территориях, загрязненных радионуклидами. Обследование проводили через 6 < лет после аварии;

2) больные (8 человек) с диагнозом апластическая анемия, которым проводился иммуномониторинг до и после супрессивного лечения АТГ-Кз.

В первой группе в обоих возрастных интервалах у детей наблюдалось снижение уровня активности гормонов тимуса. Уровень СТА находился в интервале 0 — 3 log2 (при норме больше 3 log2). Нами были проанализированы также данные цитометрического обследования этих пациентов. У детей в возрасте от 8 до 15 лет наблюдалась тенденция снижения числа CD4+ Т-лимфоцитов (32±7% или 690±240 кл/мкл, соответственно). У всех обследованных детей наблюдали снижение CD3+CD8+ Т-лимфоцитов (19±5% и 410±180 кл/мкл). Из них у половины детей относительное и абсолютное количество CD3+CD4'CD8" Т-лимфоцитов в крови превышало норму (15 ± 6 % и 290 ± 150 кл/мкл, соответственно) (табл.6, 7).

Таблица 6

Норма для иммунологических показателей в разном возрасте

Иммунологические показатели и единицы их измерения Значения иммунологических показателей (М±т) для возраста:

1—7 лет 8-17 лет 18 -50 лет

CD4+ Т-лимфоциты, % кл/мкл 35 ±5 37 ±4 40 ±1 0

1400 ± 400 900 ± 200 . 800 ± 200

CD3+CD8+ Т-лимфоциты, % кл/мкл 27 ±4 31 ± 4 29 ±9

1150 ±350 750±150 600 ± 200

CD3+CD4"CD8"- Т-лимфоциты, % кл/мкл <5 <5 <5

<70 <70 <70

СТА, log2 >3 >3 >3

Таблица 7

Иммунологические показатели у детей, проживающих на территориях, загрязненных радионуклидами

Иммунологические показатели и единицы их измерения Средние арифметические значения иммунологических показателей (М±ш) у детей в возрасте:

1—7 лет 8-15 лет

С04+Т-лимфоциты, % кл/мкл 42 ±7 32 ±7

1250 ±600 690 ± 240

CD3+CD8' Т-лимфоциты, % кл/мкл 20 ±61 19 ± 5*J.

620 ± 450| 410 ±180*|

CD3+CD4"CD8" Т-лимфоциты, % кл/мкл 4 ± 2 10 ±7 (у 58% 15±6*)Т

170±140 190 ±130 (у 58% 290±150*)Т

СТА, log2 2 ± 1,41 2,1 ± 1,81

Примечание * - статистически значимые отклонения от нормы.

У 5 из 9 обследованных детей, родившихся после аварии, наблюдали увеличение относительного количества С04+ Т-лимфоцитов, тогда как абсолютное количество было снижено. Однако средние показатели по группе не отличались от нормы. У 7 из 9 пациентов в том же возрасте наблюдались низкие относительные и абсолютные значения С03+С08+ Т-клеток. Средняя арифметическая величина по всей группе для этого показателя составила 20±6% или 620±450 кл/мкл (при норме 27±4% или 1150±350 кл/мкл,

соответственно). У 7 из 9 обследованных детей в периферической крови появлялись CD3+CD4'CD8" Т-лимфоциты. Среднее арифметическое значение для этого показателя составило 4 ± 2% или 170 ±140 кл/мкл.

Во второй группе мы рассматривали изменение иммунологических показателей под действием другого супрессирующего фактора - АТГ-Кз. Ретроспективно были проанализированы гистограммы пациентов с тяжелой формой АА, полученные в результате иммуномониторинга до и после лечения АТГ-Кз.

После проведения курса АТГ-Кз наблюдалось снижение количества CD3+CD8+ Т-лимфоцитов и появление CD3+CD4"CD8" Т-лимфоцитов. При изначально нормальном уровне СТА (больше 3 Iog2) эти изменения наступали в более поздние сроки. Были выделены два типа изменений иммунологических показателей. '

Первый тип характеризовался появлением (больной K.P.) или увеличением (больные М.Б., Б.Р. и С.Е.) количества CD3+CD4"CD8" Т-лимфоцитов на 3 — 10 сутки после окончания введения АТГ-Кз на фоне снижения количества CD3+CD8+ Т-лимфоцитов (рис.3). В более поздние сроки у больных наблюдалось обратное увеличение CD3+CD8+ Т-лимфоцитов и уменьшение количества клеток с фенотипом CD3+CD4"CD8" (больной Г.Э.). У больного Г.Э. до лечения количество CD3+CD8+ превышало норму (830 кл/мкл) и были выявлены CD3+CD4'CD8' Т-клетки (104 кл/мкл). На 10 сутки после проведения курса АТГ-Кз наблюдалось снижение количества CD3+CD8+ Т-клеток (460 кл/мкл) и увеличение количества CD3+CD4'CD8" Т-клеток (222 кл/мкл). На 20 сутки после окончания введения препарата было отмечено восстановление показателя CD3+CD8+ Т-клеток до нормы (650 кл/мкл) и уменьшение количества CD3+CD4"CD8" Т-клеток (130 кл/мкл).

Второй тип количественных изменений показателей после окончания курса лечения препаратом АТГ-Кз характеризовался отсутствием (больной Е.Е.) или появлением в очень небольшом количестве (больные С.Т. и П.С.) CD3+CD4" CD8" Т-лимфоцитов на фоне снижения количества CD3+CD8+ Т-клеток. При дальнейшем снижении численности субпопуляции CD3+CD8+ Т-клетки с фенотипом CD3+CD4'CD8" исчезали или их количество не превышало норму (рис.4), что у больных Е. Е. и С.Т. предшествовало летальному исходу. У больной П.С. число CD3+CD8+ Т-клеток значительно снизилось только к 30 суткам, при этом количество CD3+CD4"CD8" Т-лимфоцитов увеличилось незначительно, что также привело к летальному исходу (рис.4).

кл/мкл 500 ■ 450 -400 -350 -300 250 200 150 ■ 100 ■ 50 0

450

Ш

Н С 03+8+ В С 03+4-8-255-

больной К.Р.

больной М.{>

кл/мкл 300

1

больной Б.Р.

кл/мкл 1000

больной С.Е.

больной Г.Э.

Рис.3. Изменение иммунологических показателей у больных апластической анемией в процессе лечения АТГ-Кз при благоприятном

исходе.

Примечание: по оси абсцисс указаны сроки до начала введения (1) и после окончания введения препарата через 3-5 суток (2), через 11суток (3) и через 20 суток (4).

кл/мкл

больной Е.Е.

кл/мкл

1 2 больной С.Т.

кл/мкл 700 -т

13 4 5

больной П.С.

Рис.4. Изменение иммунологических показателей у больных апластической анемией в процессе лечения АТГ-Кз при неблагоприятном

исходе.

Примечание: по оси абсцисс указаны сроки до начала введения (1) и после окончания введения препарата через 3-5 суток (2), через 11суток (3), через 20 суток (4), через 30 суток (5) и через 45 суток (6).

Таким образом, показано, что при искусственном снижении уровня СТА (действие радиационного облучения) наблюдалось снижение количества CD3+CD8+ Т-лимфоцитов и, как правило, появление субпопуляции CD3+CD4" CD8" Т-лимфоцитов. С другой стороны, искусственное подавление субпопуляции CD3+CD8+ (действие АТГ-Кз) также вызывало появление CD3+CD4"CD8" Т-лимфоцитов. Следует отметить, что при изначально низком уровне СТА ингибирование численности CD3+CD8+ Т-лимфоцитов проходило быстрее, чем при нормальном уровне СТА и, соответственно, раньше появлялись Т-клетки с фенотипом CD3+CD4'CD8". Увеличение количества CD3+CD4"CD8" Т-лимфоцитов ассоциировалось с эффективностью лечения заболевания, отсутствие CD3+CD4'CD8" Т-лимфоцитов при низком количестве CD3+CD8+ Т-лимфоцитов являлось маркером плохого прогноза.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что численность субпопуляции CD3+CD8+ Т-лимфоцитов находится под контролем гормонов тимуса, а снижение количества CD3+CD8+ Т-клеток, в свою очередь, сопровождается появлением в периферической крови Т-клеток с фенотипом CD3+CD4"CD8".

По данным литературы воздействие радиации на клетки эпителия тимуса осуществляется опосредованно через выработку аутоантител к ним и между старением организма, различными иммунодефицитными, аутоиммунными состояниями и пострадиационным синдромом есть много общего. При обследовании населения, проживающего на загрязненных территориях, наблюдали формирование вторичных иммунодефицитов; резко понижался уровень регуляторного сывороточного тимусного фактора; выявлялся дисбаланс пулов Т-лимфоцитов, что являлось патогенной основой аутоиммунных и аутоаллергических процессов [Ярилин A.A., 1997].

В связи с этим полученные нами данные могут быть экстраполированы на изменения субпопуляционного состава у долгожителей.

Выявленная нами прямая зависимость численности субпопуляции CD3+CD8+ Т-клеток от уровня СТА позволила нам в дальнейшей нашей работе ограничиться анализом связи между CD3+CD8+ и CD3+CD4"CD8" Т-лимфоцитами, исключив трудоемкое определение СТА.

Мы поставили перед собой задачу определить локализацию CD3+CD4" CD8" Т-клеток на гистограмме, используя двухцветную цитометрию.

Для подтверждения данного фенотипа у этой группы клеток мы использовали комбинацию МКАТ CD303/(CD4+CD8) ФИТЦ. В этом случае нам удалось изолировать в квадранте 1 CD3+CD4'CD8" Т-клетки (рис.5 Б). Количество клеток в этом гейте совпало с определением CD3+CD4"CD8' Т-лимфоцитов методом математического расчета с четким обозначением двух групп клеток, различающихся интенсивностью свечения CD3-рецептора.

ФЭ

10»

102 -

1 1 Ю4+СОЗ+ С08+ГОЗ+ 2

ш : 4

10

10' ФИЩ

10?

ФЭ

1<Г

103

С04+С03+

, СР5+СШ+

С03+С04-С08-10* "

•¡•••Л'л

ли,

10

10г Ф11ТЦ

103

10'

Рис.5. Схема распределения субпопуляций Т-лимфоцнтов здорового донора (А) и долгожителя (Б) в двухцветной цитометрии.

С помощью дополнительной комбинации

С03ФЭ/(С04+СВ8+СШ6)ФИТЦ мы определяли наличие СОЗ|0*СО4'СО8" СБ 16' и С03ЫС04"С08"С0161ощ Т-клеток. Последние соответствовали естественным киллерным Т- лимфоцитам. При этом Т-клетки с фенотипом

СОЗ|0"СО4'СО8'СБ16" остаются при тестировании комбинацией МКАТ анти СОЗФЭ/(СБ4+СБ8+СВ16)ФИТЦ в квадранте 1, а клетки с фенотипом

С03Ь,С04"С08"С0161ош переходят в квадрант 2 и занимают то же положение, что и СОЗ+СО!6+ Т-клетки, определяемые, обычной комбинацией С03ФЭ/С016ФИТЦ.

СБЗ С04'СВ8' Т-лимфоциты довольно детально изучены в экспериментальных моделях. Они разнообразны по происхождению и локализации, отличаются по типу Т-клеточного рецептора (ар- или уб-), имеют некоторые общие характеристики, такие как локализация в барьерных тканях, ограниченный спектр распознаваемых низкомолекулярных антигенов, в основном белков теплового шока, цитотоксическая функция, участие в регуляции иммунного ответа [Пинегин Б.В., 2001; Сепиашвили Р.И., 2005; Симонова А.В., 2001; Ярилин А.А., 1999; ОЬЬегеоп А., 2000].

Высказана гипотеза, что уо С03+СВ4"С08" Т-лимфоциты прямо или косвенно могут выполнять функцию иммунозащиты в тех случаях, когда отсутствуют зрелые ар Т-клетки, контролируя иммунную реакцию независимым от НЬА класса I или II распознаванием антигенов [Наус1ау С., 2000].

Возможно, выявленные нами СВ31оиСЮ4"С08"С016" Т-лимфоциты относятся к у5 Т-клеткам. В этих случаях длительный срок жизни человека объясняется сохранностью численности и активности данной популяции клеток. Последние расширяют адаптационные возможности иммунной системы, по-видимому, за счет, восполнения количественного дефицита и, соответственно, функции СБЗ+С08+ Т-лимфоцитов.

С помощью разработанного нами метода мы провели дополнительное фенотипирование СВЗ+С04"С08" Т-лимфоцитов, различающихся по экспрессии молекулы СБ 16, у 14 долгожителей (табл.8).

Как видно из таблицы 8, у 13 из 14 обследованных долгожителей были выявлены СПЗ|ОЖСВ4"С08'С016" Т-лимфоциты в количествах, превышающих нормальные показатели, при этом у 8 пациентов доминировали клетки с указанным фенотипом. У 5 долгожителей присутствовали как СОЗ С04"СБ8' СВ161омг, так и С031о™С04"СВ8"СШ6' Т-клетки, и их количество было выше нормы. Только у одного пациента были выявлены клетки с фенотипом естественных киллерных Т-клеток при отсутствии Т-лимфоцитов с фенотипом СВ31о"С04"СВ8"С01б\

Нас интересовало также, какой из этих двух типов клеток реципрокно изменяется в соответствии с количественными изменениями С1ЭЗ+СВ8+ Т-лимфоцитов.

Таблица 8

Состав CD3+CD4"CD8" Т-лнмфоцитов у долгожителей

№№ п/п Пациенты Количество Т-лимфоцитов с фенотипом:

CD3 h'CD4"CD8"CD 16low CD3 lowCD4"CD8"CD 16"

% кл/мкл % кл/мкл

1 П.З. 1,0 15 16,6 246

2 П.Е. 1,9 22 17,7 218

3 К.А. 1,2 39 5,5 148

4 М.А. 3,4 70 12 249

5 М.А. 3,1 33 17,7 189

6 В.И. 3,2 56 7,6 132

7 O.E. 2,9 56 8,5 163

8 O.E. 2,0 53 8,3 220

9 Б.И. 5,3 279 14 737

10 Д.Е. 4,6 109 7,1 169

11 П.А. 18,6 268 16,9 243

12 Ш.В. 17,7 382 15,6 337

13 Д.Н. 5,3 179 3,8 128

14 В.Л. 14,8 292 0,3 23

Примечание: жирным шрифтом отмечены величины показателей, превышающие

норму.

Иммуномониторинг 5 долгожителей, в комплексном лечении которых было использовано НИЛИ, дал следующие результаты: если количество CD3+CD8+ Т-лимфоцитов соответствовало нормальному показателю, то в реакции иммунной системы на воздействие лазерного излучения не участвовали CD3l0WCD4"CD8~CD 16' Т-лимфоциты (пациенты А.К., Д.Е., вД). У двух пациентов с дефицитом CD3+CD8+ Т-лимфоцитов в периферической крови (пациенты В.Й, и O.E.) было увеличено количество CD3 CD4'CD8"CD16" Т-лимфоцитов. При нормализации показателя CD3+CD8+ Т-лимфоцитов после лазеротерапии CD3,0WCD4"CD8"CD16" Т-лимфоциты исчезали. Четкой корреляции между снижением численности CD3+CD8+ Т-клеток и увеличением числа CD3h'CD4"CD8"CD16!ow Т-клеток не отмечено. Эти клетки появлялись в случаях, когда число CD3+CD8+ Т-лимфоцитов соответствовало норме или было на нижней границе нормы (табл.9).

Таблица 9

Изменения абсолютных показателей иммунитета у группы долгожителей в _1__процессе лазеротерапии_

№№ п/п Показатели Абсолютное количество Т-лимфоцитов с фенотипом:

СБЗ+Т -лф С03+С04+ ~ Тх-лф СБЗ+С08+ Т-лф СВЗтС04-008^016'°"' С031ожС04' С08"СЕ>16"

А.К. ДО лечения 1527 790 790 0 0

после лечения 1685 820 805 0 0

Д.Е. ДО лечения 1443 812 475 76 42

после лечения 1699 1045 621 0 0

в.и. ДО лечения 1177 856 1301 56 131|

после лечения 2810| 2153| 563 105| 0

в.л. до лечения 1791 1268Т 400 103| 0

после лечения 1523 788 415 292| 0

О.Е. ДО лечения 982 450 303 1 56 163|

после лечения 1466 807 413 53 220Т

Примечание: жирным шрифтом отмечены величины показателей, отклоняющиеся от нормы.

Таким образом, популяция С03+С04"С08" Т-лимфоцитов оказалась гетерогенной по экспрессии рецептора С016. Однако у долгожителей были выявлены преимущественно СВЗ|0ЛСО4"СО8"СО1б" Т-клетки (у 13 из 14 обследованных).

При дефиците СОЗ+СБ8+ Т-лимфоцитов у долгожителей увеличение количества Т-клеток с общим фенотипом СВЗ+С04"С08" происходило, прежде всего, за счет увеличения Т-лимфоцитов с фенотипом СОЗ|0Л,СВ4"СО8"СО16". Изменение числа Т-клеток с фенотипом С03ьС04"С08"СВ161с™ не коррелировало со снижением С03+С08+ Т-лимфоцитов.

Лазеротерапия в низких дозах оказывала как терапевтический, так и стимулирующий/иммуномодулирующий эффект.

Наличие СВ31ошСВ4"СБ8"СБ16- Т-клеток при дефиците СОЗ+СБ8+ Т-лимфоцитов являлось благоприятным прогнозом эффективности иммунокорригирующей терапии, в данном случае, с использованием малых доз

^ Таким образом, особенностью структуры субпопуляционного состава лимфоцитов долгожителей является количественный дефицит субпопуляции СОЗ+СБ8+ Т-лимфоцитов. При этом на фоне гормональной дисфункции тимуса увеличивается вероятность появления в периферической крови Т-клеток с фенотипом С03+СВ4'СО8\

Установлена прямая зависимость между изменением численности субпопуляции С03+С08+ Т-клеток и уровнем СТА и обратная зависимость между величинами СТА и субпопуляцией С03+С08+, с одной стороны, и числом С03+С04"С08" Т-клеток с, другой.

Дополнительный фенотипический анализ С03+С04"С08" Т-клеток показал, что в их состав могут входить СВЗЫСВ4'СВ8"С016|<"У (естественные Т-киллеры) и С031гтСВ4'С08"С016" Т-клетки. Именно численность последних реципрокно изменялась в зависимости от величины СТА и С03+С08+ Т-клеток.

Изменения выделенных нами показателей могут быть обратимыми и не обратимыми. Обратимые и реципрокные изменения свидетельствовали о сохранении иммунореактивности у долгожителей, что подтверждено положительной динамикой иммунологических показателей после курса лазеротерапии. Необратимое снижение всех трех показателей предшествовало смертельным исходам.

Наличие или отсутствие С031о"СВ4'С08"СП1б" Т-клеток у долгожителей может быть оценено с помощью разработанных комбинаций МКАТ в двухцветной цитометрии уже на уровне первичного иммунологического обследования, а характер изменений в структуре субпопуляционного состава Т-лимфоцитов у долгожителей может быть использован в качестве критерия оценки состояния иммунореактивности и жизненного потенциала.

ВЫВОДЫ

1. Определены среднестатистические параметры количественных показателей субпопуляционного состава лимфоцитов, концентрации иммуноглобулинов классов О, А и М и уровня СТА у долгожителей г. Москвы, и выявлены особенности структуры субпопуляционного состава Т-лимфоцитов периферической крови, характеризующиеся количественным дефицитом субпопуляции СБЗ+С08+ Т-лимфоцитов и появлением Т-лимфоцитов с фенотипом СВЗ+С04"С08" на фоне сниженного уровня СТА.

2. Установлены типы взаимосвязанных изменений величин показателей уровня СТА, СБЗ+С08+ и С03+С04ХЛЖ Т-лимфоцитов:

- обратимые и реципрокные изменения количества СОЗ+СБ4"СВ8" Т-лимфоцитов по отношению к уровню СТА и численности субпопуляции СБЗ+СБ8+ Т-лимфоцитов; : - необратимое снижение всех трех показателей.

3. Обратимые и реципрокные изменения свидетельствовали о сохранении иммунореактивности у долгожителей, что подтверждено положительной динамикой иммунологических показателей после курса лазеротерапии. Необратимое снижение всех трех показателей являлось маркером летального исхода.

4. Уточнен фенотип СВЗ+СВ4'СБ8" Т-лимфоцитов, которые в отличие от естественных киллерных Т-лимфоцитов (СВЗЫСБ4"С08"С01 б1'™') характеризовались слабой экспрессией СОЗ -рецептора, отсутствием молекулы СБ 16 и изменением их численности реципрокно количеству СБЗ+С08+ Т-клеток.

5. Предложена дополнительная комбинация МЬСАТ СБЗФЭ/ (С04+С08+С016)ФИТЦ, с помощью которой уже при первичном обследовании в двухцветной цитометрии могут быть выявлены Т-клетки с фенотипом СБЗ 1т"СО4'С08"С016".

6. Характер изменений в структуре субпопуляций Т-лимфоцитов С03+С08+ и СОЗ туСВ4"С08"С01б* может быть использован в качестве прогностического теста для оценки состояния иммунореактивности и жизненного потенциала долгожителей.

Практические рекомендации

1. С целью прогноза течения заболевания и эффективности лечения пациентов-долгожителей рекомендуется в случае обнаружения при иммунологическом обследовании образцов крови разницы между общим количеством Т-клеток и суммой С03+С04+ и С03+С08+ Т-клеток, и особенно при дефиците С03+С08+ Т-клеток, использовать предложенные нами комбинации МКАТ анти- СБЗФЭ/(СБ4+С08ФИТЦ и анти-СВЗФЭ/(С04+С08+СШ6)ФИТЦ.

2. Метод может быть применен в клинических иммунологических лабораториях регионального и федерального уровня с использованием комбинаций из трех и четырех МКАТ и только двух красителей ФЭ и ФИТЦ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мирошниченко И.В., Рябинина И.Д., Шарова Н.И., Мальцева В.В., Столпникова В.Н., Кочергина Н.И. и др. Методические подходы к анализу пострадиоционных нарушений лимфо- и гемопоэза.. // Радиационная биология. Радиоэкология,-1994.-Т. 34.- № 4-5.- С. 467-473.

2. Miroshnitchenko I.V., Ryabinina I.D., Maitzeva V.V., Stolpnikova V.N. The signs of hormone-dependent postradiation immunodeficiency. // International Journal of Immunoreabilitation. - 1994.- №1.- Suppl. - P. 239.

3. Рябинина И.Д., Столпникова В.Н. Возможности метода двухцветной цитофлюорометрии при выявлении нарушений клеточного иммунитета у лиц, подвергшихся действию радиации. // Материалы II Международной конференции «Радиобиологические последствия аварий на атомных станциях». Москва.- 1994.- С. 227.

4. Miroshnitchenko I.V., Kosova I.P., Maitzeva V.V., Stolpnikova V.N., Kochergina N.I. Aging Criteria of the Immune System. // Abstract IV-th Europ. Congress of Gerontology. Berlin.- 1999.- P. 876.

5. Борисова A.M., Мирошниченко И.В., Косова И.П., Мальцева B.B., Столпникова В.Н. Иммунологические аспекты старения. // Int. Immunoreabil. — 1999.-№11.-P. 63-69.

6. Юрина Т.М., Голубева В.Л., Суворова И.А., Серова Л.Д., Косова И.П., Столпникова В.Н. Влияние антитимоцитарного глобулина Антилимфолин на показатели иммунитета //Материалы I Международной практической конференции "Пожилой человек. Качество жизни", М., 1-2 октября 2001 г., С.83.

7. Шишина Р.Н., Рахманова Д.Ф., Савенко Т.Н., Столпникова В.Н./Применение иммуносупрессирующей терапии у больных апластической анемией //Мед. иммунология.-т.4,- №2.-2002.-С.377-378.

8. Мирошниченко И.В., Косова И.П., Столпникова В.Н., Кочергина Н.И. Изменения показателей иммунитета, обусловленные возрастными и патологическими процессами //Ж. Клинич. геронтол.-2003.-№9.-С.149.

9. Столпникова В.Н. Иммунитет долгожителей //Ж. Клинич. геронтол.-2003.-№9.-С. 176.

10. Столпникова В.Н., Косова И.П., Кочергина Н.И., Мирошниченко И.В. Изменения показателей клеточного и гуморального иммунитета при старении //Альманах "Геронтология и гериатрия".-2003.-Вып,2.-С.105-106.

11. Столпникова В.Н., Мирошниченко И.В. Особенности иммунитета долгожителей // Материалы I научно-практич.конференции "Общество, государство и медицина для пожилых и инвалидов" .М.-2004.-С.88-89.

12. Столпникова В.Н., Кочергина Н.И., Мирошниченко И.В. Характеристика иммунитета долгожителей Москвы //Альманах "Геронтология и гериатрия".-2005.-Вып. 4,- С.166-169.

13. Мирошниченко И.В., Столпникова В.Н., Левашова Т.В. глава "Возрастной иммунодефицит и его коррекция" // Руководство по геронтологии под ред. акад. РАМН, проф. В.Н. Шабалина. М., "Цитадель-трейд", 2005, С.189-197.

14. Столпникова В.Н., Карпенко О.М., Мирошниченко И.В. Критерии прогноза эффективности терапии долгожителей // Тезисы 2-ой научно-практической конференции "Общество, государство и медицина для пожилых и инвалидов", Москва, 27-29 сентября 2005.- С.98-99.

15. Мирошниченко И.В., Столпникова В.Н.. Количественный дефицит цитотоксических киллерных Т-лимфоцитов у долгожителей. //Тезисы X Международного конгресса по реабилитации в медицине и иммунореабилитации. Греция, Афины, 19-25 октября 2005 г.-С. 425.

16. Столпникова В.Н., Кочергина Н.И., Карпенко О.М., Мирошниченко И.В. Количественные изменения показателей иммунитета у долгожителей // ЖМЭИ.- 2006.- №5.- С.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АА АГ

- апластическая анемия

- антиген

- антитимоцитарный глобулин козий

- В-лимфоциты

- естественные киллерные клетки

- лимфоциты

- моноклональные антитела

- низкоинтенсивное лазерное излучение

- сывороточная тимическая активность

- флюоресцеинизотиоцианат

- фикоэритрин

- Т-лимфоциты

- хелперные Т-лимфоциты

- Чернобыльская атомная электростанция

АТГ-Кз

В-лф ЕКК Лф

МКАТ ПИЛИ

СТА

ФИТЦ

ФЭ Т-лф Тх-лф ЧАЭС

hi

low IgA IgM IgG

- яркое свечение (от английского high)

- слабое свечение

- иммуноглобулин класса А

- иммуноглобулин класса М

- иммуноглобулин класса G

TCR

- Т-клеточный рецептор (Т cell receptor)

Отпечатано в типографии "АРБАТ"

Адрес: г. Москва, ул. Поварская, д. 8/1, стр. 2

Подписано в печать 25.04.2006 г.,

Тираж 100 экз. Заказ N2 657

Тел.: 291-71-42/62

Увеличение доли пожилых людей в обществе стало особенно заметно в последней четверти XX века. Это значительно повышает интерес к геронтологии и, прежде всего, к изучению первичных механизмов старения организма и факторов, определяющих продолжительность жизни. В принятой на Второй Всемирной ассамблее ООН по проблемам старения «Программе ООН по исследованиям старения в XXI столетии» (апрель 2002 г., Мадрид) отмечается, что лучшее понимание фундаментальных механизмов старения и факторов долголетия имеет первостепенное значение для реализации полного потенциала здорового старения [20, 30].

Процесс старения охватывает все уровни структурной организации человека - молекулярный, субклеточный, тканевой, органный. Суммарный результат многочисленных частных проявлений старения на уровне целостного организма заключается в нарастающем с возрастом снижении жизнеспособности его, уменьшении эффективности приспособительных, гомеостатических механизмов [40].

Важную роль в защите организма и поддержании его гомеостаза играет иммунная система, старение которой в нормальных условиях начинается раньше, чем в других системах и связано с инволюцией тимуса [35].

Поэтому многими исследователями старость рассматривается как Т-иммунодефицит, сопровождающийся ослаблением реакций иммунитета и часто изменением их характера. В результате развиваются аутоиммунные, онкологические процессы и хроническое течение заболеваний, что составляет основу полиморбизма в старости [25, 36, 78].

Вместе с тем иммунная система имеет значительный запас прочности, который создается в процессе формирования защитных сил организма с момента его рождения [78].

В связи с этим, с научной точки зрения, долгожители представляют интерес для исследователя как своеобразная модель сохранения защитных свойств организма до глубокой старости и его адаптации к существованию в измененных условиях стареющего организма на фоне полиморбидности.

Поэтому тщательное исследование параметров иммунной системы долгожителей является актуальным, поскольку открывает возможности не только для оценки иммунного статуса этого возраста, но и определения потенциальных и адаптационных способностей стареющей иммунной системы, как ключ к увеличению продолжительности жизни человека.

Цель работы

Выявление количественных изменений в показателях иммунитета и определение набора признаков, позволяющих оценить иммунореактивность организма долгожителей.

Задачи исследования

1. Определить среднестатистические показатели иммунитета, частоту их отклонений от нормы у долгожителей г. Москвы и выделить для дальнейшего анализа показатели с наибольшими отклонениями от нормы.

2. Выявить и доказать наличие связи между численностью Т-клеток с фенотипом СБЗ+С04'С08", изменениями уровня сывороточной тимической активности (СТА) и количества СЭЗ+С08+ Т-клеток.

3. Разработать метод двухцветной цитометрии для выявления Т-клеток с фенотипом С03+С04"С08" и дополнительного уточнения их фенотипа.

4. Определить прогностическую значимость изменений уровня СТА, количества СЭЗ+С08+ и С03+СБ4'С08' Т-лимфоцитов у долгожителей.

Научная новизна

Впервые дана характеристика иммунитета у долгожителей, особенностью которого является снижение уровня СТА, количественный дефицит субпопуляции СЭЗ+С08+ Т-лимфоцитов и увеличение численности Т-клеток с фенотипом С03+СВ4"С08" у значительного процента долгожителей.

Впервые выявлены варианты связи между этими показателями: реципрокное и обратимое изменение количества С03+С04ТЮ8" Т-лимфоцитов по отношению к количеству СВЗ+СЭ8+ Т-клеток и уровню СТА и необратимое снижение количества СОЗ+СБ8+ Т-клеток и уровня СТА при отсутствии в периферической крови СОЗ+СБ4"СВ8" Т-клеток. Показано, что первый вариант изменений согласуется с сохранением иммунореактивности, второй является предвестником летального исхода.

Впервые при первичном иммунологическом обследовании в двухцветной цитометрии с использованием двух флюорохромов фикоэритрина (ФЭ) и флюоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ), с помощью разработанных нами комбинаций моноклональных антител (МКАТ) С03ФЭ/(С04+СБ8)ФИТЦ и С03ФЭ/(С04+С08+С016)ФИТЦ были выявлены два типа клеток среди С03+С04"С08" Т-лимфоцитов, которые различались экспрессией поверхностной молекулы СБ 16 и интенсивностью свечения СЭЗ-рецептора, и показано, что дефицит СОЗ+СБ8+ Т-клеток восполнялся за счет Т-клеток с фенотипом С031спуСВ4"СВ8"С016\

Научно - практическая ценность работы

Разработанные дополнительные комбинации МКАТ

СБЗ ФЭ/(СБ4+СО 8)ФИТЦ и С03ФЭ/(С04+С08+С016)ФИТЦ позволяют уже на уровне первичного обследования методом двухцветной цитометрии выявить минорные группы С03Ь|СВ4ХЛЖС0161спу (естественные Т-киллеры) и СВ31туСБ4'СВ8Ч1Т)16" Т-лимфоцитов и по типу количественных изменений субпопуляций СОЗ+СЭ8+ и СО310№СО4"СО8'СО16" прогнозировать жизненный потенциал и эффективность лечения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. У значительной части долгожителей на фоне полиморбидности и снижения гормональной функции тимуса, определяемой по уровню СТА, наблюдали количественный дефицит СБЗ+СБ8+ Т-лимфоцитов и появление Т-клеток, лишенных субпопуляционных маркеров (С03+С04*С08").

2. Появление и исчезновение СОЗ+СБ4"СВ8" Т-лимфоцитов связано с изменениями уровня СТА и количества С03+С08+ Т-лимфоцитов. Выявлено два варианта изменений:

- обратимые и реципрокные количественные изменения С03+С04*С08" Т- лимфоцитов по отношению к уровню СТА и количеству С03+С08+ Т-лимфоцитов, что является благоприятным прогностическим тестом;

- необратимое снижение всех трех показателей, что расценивается как маркер риска близкого смертельного исхода.

3. Популяция Т-клеток с фенотипом СВЗ+С04'С08" является гетерогенной, что показано с помощью разработанного метода двухцветной цитометрии и включает СОЗыСЭ4'СВ8-СВ 1 б1™ (естественные киллерные Т-клетки) и С031(ПУСВ4"СВ8"С016" Т-клетки. Именно численность последнего типа клеток изменяется в зависимости от уровня СТА и количества СОЗ+СЭ8+ Т-лимфоцитов. * *

Благодарим главного врача клиники РНИИ геронтологии МЗ РФ Маргариту Георгиевну Филатову и заведующих отделениями: Наталью Викторовну Журавлеву (терапия), Светлану Ильиничну Муромову (кардиология), Валентину Васильевну Лопатину (гастроэнтерология), Зинаиду Степановну Митину (неврология), заведующую лабораторией возрастной гематологии Регину Николаевну Шишину, заведующую лабораторией иммуномодуляторов Веру Леонидовну Голубеву, заведующую лабораторией лазерных методов лечения Ольгу Матвеевну Карпенко за возможность работы с историями болезней пациентов клиники и использовании в нашем исследовании диагнозов и сотрудничество.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Гипотезы, объясняющие механизмы старения

Механизмы и последовательность событий, развивающихся при старении, мало изучены и остаются предметом научных исследований. В связи с этим существует множество формулировок, как самого процесса старения, так и гипотез (теорий), пытающихся объяснить его причины и характер происходящих при этом в организме изменений.

Большинство теорий не выдержало проверку временем и представляет чисто исторический интерес.

Суть гипотез, ценных с научной точки зрения изложена и проанализирована в ряде обзоров [1, 2, 36], на основании которых можно сделать следующие обобщения:

• Старение организма есть, безусловно, системный процесс, базирующийся на взаимодействии стареющих с разной скоростью клеточных ансамблей.

• Причиной старения, в конечном счете, признается дисбаланс биологических структур и выполняемых функций.

• Первичная роль в старении отводится изменениям свойств белковых молекул и внутриклеточных структур.

• Структурные дефекты обусловливают функциональные расстройства на метаболическом, клеточном, тканевом, органном уровнях, свойственны всем физиологическим системам организма и служат основой развития множественных патологий (полиморбидность) старческого возраста.

• Процесс старения может быть выражен рядом алгоритмов, отражающих характер и динамику изменений на молекулярно-генетическом, метаболическом, клеточном, гомеостатическом, органном, системном, организменном и видовом уровне с учетом ятрогенных факторов.

Основное разногласие в гипотезах старения касается первичных механизмов, запускающих деструктивные изменения, которые ведут, в итоге, к гибели организма.

Авторы эпигенетических теорий рассматривают старение как стохастический процесс накопления с возрастом «ошибок», инициированных случайными во времени и локализации внутренними (спонтанная мутация) и внешними (ионизирующая радиация, химические мутагены, УФ-излучение) факторами.

Генетические теории рассматривают старение как запрограммированный процесс, который развивается в плановом порядке, подобно другим стадиям онтогенеза, при этом в процесс старения всегда вовлечены носители наследственной информации, заключенные в ДНК. Существуют разногласия относительно существования специальных генов старения или генетических программ [17].

Все теории старения, несмотря на некоторые противоречия, не являются взаимоисключающими, вполне совместимы, дополняют друг друга и используют зачастую одни и те же факты для их подтверждения.

Наиболее приемлемыми и интересными на современном этапе развития геронтологии остаются гипотезы соматических мутаций [2], свободнорадикального окисления, износа структур [12], фонтанная теория [19].

Согласно теории соматических мутаций, старение является результатом постепенного накопления случайных мутаций в геноме соматических клеток, что является также основным фактором, определяющим развитие возрастной патологии [131].

В научной литературе имеются многочисленные доказательства в поддержку этой теории.

Так, при обследовании двух групп людей (в возрасте от 4 до 85 лет) доноров и лиц, подвергшихся облучению в низких дозах за 1-4 года до исследования, установлено более быстрое увеличение с возрастом стабильных повреждений в хромосомах лимфоцитов облученных людей [134].

Весьма важен вывод о частоте и скорости накопления соматических мутаций в различных органах и тканях. На мышах LacZ было установлено, что увеличение частоты соматических мутаций в печени происходит равномерно с рождения до 27-месячного возраста, после чего их число резко увеличивается, тогда, как в головном мозге нарастает частота мутаций только до 4-6 месяцев жизни, а затем не изменяется [61, 62].

Ряд исследователей связывают начальные изменения старения организма с мутационными изменениями физико-химических и биологических свойств макромолекул: ДНК, РНК, белков хроматина, цитоплазматических и ядерных белков, ферментов.

Так, в нормальных тканях человека с возрастом накапливаются клонально распространяющиеся мутации митохондриальной ДНК (мДНК) [109]. Выявлена также существенная тенденция к увеличению частоты мутаций антионкогена р53 в тканях человека по мере старения [98].

Одной из причин накопления повреждений ДНК с возрастом может быть снижение эффективности систем ее репарации [52]. Установлена прямая корреляция между продолжительностью жизни вида и скоростью репарации ДНК, поврежденной ультрафиолетовым светом или ионизирующей радиацией [91]. Полагают, что системы репарации ДНК при старении чаще ошибаются, что приводит к накоплению мутаций [131].

Радиационная поврежденность ДНК стволовых клеток кишечного эпителия мышей разного возраста одинакова, но скорость репарации этих повреждений с возрастом снижается. Способность фибробластов человека к репарации индуцированных у-излучением однонитевых разрывов ДНК снижается с увеличением возраста доноров [119].

Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что ряд возрастных изменений в структуре и функции ДНК вовлечен в процесс естественного старения.

Согласно свободнорадикалъной теории старения активные формы кислорода, продуцируемые, главным образом, в митохондриях, вызывают повреждения клеточных мембран, коллагена, ДНК, хроматина, структурных белков, регуляции внутриклеточного уровня кальция и т.д.[86, 120, 121]. В ряде исследований показано, что мишенью свободных радикалов являются липидный слой клеточных мембран [59, 87].

Сбои в работе рецепторов, в частности клеточных оболочек, нарушают эффективность регуляторных механизмов, что приводит к рассогласованию процессов жизнедеятельности.

У крыс линии OXYS с ускоренным старением выявлено усиление окислительного стресса, который сопровождался дисфункцией митохондрий, развитием нейродегенеративных заболеваний и нарушением поведенческих рефлексов [11, 18].

Видовая продолжительность жизни млекопитающих прямо коррелирует с состоянием антиоксидантной системы и устойчивостью клеток к окислительному стрессу [91]. Витамин Е, мелатонин и некоторые синтетические антиоксиданты увеличивают продолжительность жизни дрозофил, мышей и крыс [44]. На модели ишемии мозга установлено, что применение карнозина, обладающего свойствами антиоксиданта, существенно уменьшает смертность и улучшает функцию мозга у крыс [4].

К рассматриваемому направлению относятся также гипотезы, усматривающие первооснову старения в нарастающем с возрастом износе структур в диапазоне от макромолекул до организма в целом, приводящем, в конце концов, к состоянию, не совместимому с жизнью [77, 131]. Но возникновению и накоплению мутационных изменений в ДНК противостоят природные антимутационные механизмы, а вредные последствия образования свободных радикалов снижаются благодаря функционированию антиоксидантных механизмов [9]. В итоге скорость возникновения возрастных изменений организма является следствием преимущественного преобладания разрушительных или защитных процессов и зависит от таких факторов, как генетическая предрасположенность, условия и даже образ жизни.

Второе направление представлено генетическими гипотезами. Генетический контроль, согласно одним взглядам, осуществляется с помощью специальных генов. В настоящее время в соответствии с каталогом генов человека Мак-Кьюсика со старением связывают 133 гена [26].

По мнению H.A. Малыгиной и А.И. Потапенко [14, 22], на продолжительность жизни влияют гены, связанные с сердечно-сосудистыми заболеваниями и причинами их возникновения. При анализе полиморфизма генов липопротеинлипазы (ЛПЛ) и аполипопротеина Е (АроЕ), контролирующих липидный обмен, была выявлена связь аллелей Н+ЛПЛ и ЕУ АроЕ с инфарктом миокарда. Напротив, у долгожителей чаще встречались генотипы, имеющие протектиновые аллели Н-ЛПЛ и Е2 АроЕ, в связи с чем была снижена вероятность нарушений липидного обмена, развития атеросклеротических изменений в сосудах и инфаркта миокарда [13,14, 70].

По другим предположениям, старение связано с наличием специальных генетических программ, как это при других стадиях онтогенеза, например эмбриональной.

Некоторые программные гипотезы основаны на допущении, что в организме функционируют биологические часы, в соответствии с которыми происходят возрастные изменения. Роль «часов» приписывают, в частности, вилочковой железе (тимусу), прекращающей полноценное функционирование при переходе организма в зрелый возраст [7].

В пользу запрограммированности старения приводят следующие доказательства. В природе существуют виды, у которых вслед за размножением бурно нарастают изменения, приводящие животных к гибели. Типичный пример - тихоокеанские лососи, погибающие после нереста, что связано с изменением режима секреции половых гормонов. Однако кастрированная горбуша не нерестится и живёт в 2-3 раза дольше. Именно в эти дополнительные годы жизни следует ожидать появления признаков старения и в клетках и в тканях [40].

Другим примером, противоречащим запрограмированности старения, является продолжительность жизни синиц в природе (2 года) и в лабораторных условиях (7-8 лет) [40].

Считают, что генетические программы, в том числе и индивидуального развития, являются результатом эволюции, закрепляемым в генофонде вида вследствие естественного отбора.

По мнению одних авторов, естественный отбор должен благоприятствовать увеличению продолжительности жизни.

По мнению других авторов, основной целью естественного отбора является обеспечение воспроизводства вида, в связи с чем генетические программы ограничивают жизнь репродуктивным периодом [89, 117, 122].

В обоих вариантах приобретение видом в ходе эволюции генетической программы старения, ведущей к неизбежной смерти, представляется маловероятным.

Изложенное выше не исключает зависимости скорости старения и времени наступления старческих изменений от генетических факторов, однако этими факторами, по мнению большинства ученых, не являются специальные гены или программа. Это хорошо видно на примере такого заболевания, как хорея Гентингтона. Для нее типичным признаком служит сильный тремор головы, конечностей (пляска святого Витта). Симптомы этого наследственного заболевания обычно появляются в возрасте 35-39 лет, причём у мужчин позднее, чем у женщин. Различие в сроках появления болезни объясняется особенностями эволюции мужского и женского генотипов. У мужчин, имеющих по сравнению с женщинами большую продолжительность репродуктивного периода, давление отбора против соответствующего признака угасает с возрастом более медленно. Неблагоприятное фенотипическое действие гена, лежащего в основе хореи Гентингтона, в юношеском и зрелом возрасте подавлялось благодаря присутствию в геноме генов-модификаторов [15, 27].

Рассматривается также возможность связи между более быстрым старением и наличием генов системы НЬА [25].

Согласно фонтанной теории [19] в процесс старения эукариотических клеток вовлечен особый механизм модуляции уровня экспрессии генов, который зависит от поступления ионов из перинуклеарного пространства внутрь ядра через каналы ядерной мембраны. Механизм действия таких ионных каналов, по аналогии с работой гейзера, можно назвать гейзерным или фонтанным. К числу ионных каналов можно отнести кальцевые и цинковые каналы. Каждый из них открывается на очень короткий срок в результате комплементарного взаимодействия так называемой фонтанной РНК (фРНК) с участком ДНК, находящимся вблизи соответствующего гена.

Предполагают, что кратковременная активация ионного фонтана (в случае формирования его вблизи определенного гена) изменяет локальную продуктивность соответствующего гена.

Когда теломеры делаются в стареющих клетках слишком короткими, фРНК - зависимые ионные каналы, вероятно, на стадии перехода в Б-фазу клеточного цикла, становятся недоступными для субтеломерных генов.

В связи с этим автор рассматривает процесс старения как «болезнь количественных признаков».

По-видимому, адаптационные механизмы, сформировавшиеся в процессе эволюции, имеют большой запас прочности, обеспечивая существование вида в пострепродуктивном периоде.

Большую роль в сохранении жизнеспособности вида играют специальные структуры, поддерживающие гомеостаз. Одной из них является иммунная система организма.

В связи с этим особый интерес представляет иммунологическая теория старения.

Основная функция иммунной системы, сформировавшаяся в процессе эволюции и естественного отбора, — защита организма от внешней (инфекции) и внутренней (измененные клетки собственного организма) биологической агрессии [35]. Эта защита осуществляется с помощью разнообразных механизмов, лежащих в основе естественного и приобретенного (адаптивного) иммунитета. Многочисленные исследования показали, что наступление старости генетически запрограммировано для каждого индивидуума и является отражением спада иммунной функции, в первую очередь, в связи с инволюцией тимуса. Поэтому наиболее значимые возрастные сдвиги наблюдаются в адаптивном иммунитете и связаны с нарушением функционирования Т-клеток [10].

Глава 2. Структурно-функциональные изменения в системе адаптивного

ВЫВОДЫ

1. Определены среднестатистические параметры количественных показателей субпопуляционного состава лимфоцитов, концентрации I иммуноглобулинов классов в, А и М и уровня СТА у долгожителей г. Москвы, и выявлены особенности структуры субпопуляционного состава Т-лимфоцитов периферической крови, характеризующиеся количественным дефицитом субпопуляции СЭЗ+СБ8+ Т-лимфоцитов и появлением Т-лимфоцитов с фенотипом С03+СО4"СО8" на фоне сниженного уровня СТА.

2. Установлены типы взаимосвязанных изменений величин показателей уровня СТА, СОЗ+СБ8+ и С03+С04"СБ8" Т-лимфоцитов:

- обратимые и реципрокные изменения количества СЭЗ+С04"С08' Т-лимфоцитов по отношению к уровню СТА и численности субпопуляции СОЗ+СБ8+ Т-лимфоцитов;

- необратимое снижение всех трех показателей.

3. Обратимые и реципрокные изменения свидетельствовали о сохранении иммунореактивности у долгожителей, что подтверждено положительной динамикой иммунологических показателей после курса лазеротерапии. Необратимое снижение всех трех показателей являлось маркером летального исхода.

4. Уточнен фенотип С03+С04"С08" Т-лимфоцитов, которые в отличие от естественных киллерных Т-лимфоцитов (С03Ь,'С04"С08'С01 б'™) характеризовались слабой экспрессией СЭЗ-рецептора, отсутствием молекулы СБ 16 и изменением их численности реципрокно количеству СБЗ+С08+ Т-клеток.

5. Предложена дополнительная комбинация МКАТ СБЗФЭ/ (С04+С08+С016)ФИТЦ, с помощью которой уже при первичном обследовании в двухцветной цитометрии могут быть выявлены Т-клетки с фенотипом С031туС04'С08"С016\ 6. Характер изменений в структуре субпопуляций Т-лимфоцитов СОЗ+СЭ8+ и С031ота>4"С08'С016" может быть использован в качестве прогностического теста для оценки состояния иммунореактивности и жизненного потенциала долгожителей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований показано, что у долгожителей на фоне полиморбидности средние арифметические значения для большинства иммунологических показателей (лимфоциты, общее количество Т-лимфоцитов, Т-хелперов, ЕКК, В-лимфоцитов, концентрация IgM, G и А) статистически не отличались от норм, принятых для практически здоровых людей в возрасте от 20 до 50 лет.

Вместе с тем прослеживалась тенденция сдвига средних значений для Т-хелперов и В-лимфоцитов к нижнему пределу нормы, для ЕКК, IgA и IgM -к верхней границе нормы. В то же время статистически достоверно были снижены средние значения относительного и абсолютного количества CD3+CD8+ Т-лимфоцитов (20±3% и 310±60 кл/мкл, соответственно) (глава 4, табл.4).

Нами впервые была выявлена особенность структуры субпопуляционного состава лимфоцитов у долгожителей, характеризующаяся статистически достоверным уменьшением количества CD3+CD8+ Т-лимфоцитов и повышением количества CD3+CD4"CD8" Т-лимфоцитов на фоне снижения уровня СТА. Сдвиг этих средних величин за пределы нормы был вызван увеличением процента долгожителей с количественным дефицитом CD3+CD8+ Т-лимфоцитов, низким уровнем СТА и избыточным количеством CD3+ Т-лимфоцитов, лишенных субпопуляционных маркеров CD4 и CD8 (CD3+CD4'CD8") (глава 4, табл.5).

Данные литературы по поводу изменения численности субпопуляции CD3+CD8+ Т-лимфоцитов весьма противоречивы. Возможно, это связано с определением общего количества CDS-положительных лимфоцитов без учета существования субпопуляции CD16+CD8+ киллерных клеток, которые действительно, по нашим неопубликованным данным, увеличиваются у старых людей и у детей, проживающих в районах, загрязненных радионуклидами. Возможно также, что увеличение CD3+CD8+ Т-лимфоцитов в старческом возрасте относится к клеткам с отсутствием корецептора CD28, которые выполняют супрессорную функцию в иммунитете.

В обзоре литературы по старению иммунной системы, однако, отмечено, что количественные изменения основных субпопуляций Т-лимфоцитов наступают лишь в глубокой старости [104, 115], что соответствует нашим данным [26].

Известно, что гормоны тимуса регулируют функцию периферических CD3+CD8+ Т-лимфоцитов [35]. Поэтому естественно было ожидать снижение количества CD3+CD8+ Т-лимфоцитов при гормональной дисфункции тимуса у долгожителей. Нами подтверждено, что дефицит CD3+CD8+ Т-лимфоцитов наблюдался, как правило, у долгожителей с низкими показателями СТА (глава 4, табл.5).

Также в наших исследованиях впервые выявлены варианты связи между тремя упомянутыми выше показателями: реципрокное и обратимое изменение количества CD3+CD4"CD8" Т-лимфоцитов по отношению к количеству CD3+CD8+ Т-клеток и уровню СТА и необратимое снижение количества CD3+CD8+ Т-клеток и уровня СТА при отсутствии или уменьшении в периферической крови CD3+CD4"CD8" Т-клеток. Показано, что первый вариант изменений согласуется с сохранением иммунореактивности, второй является предвестником летального исхода (глава 5, рис.2, 3, 4, табл.7).

По литературным данным, известно, что лица старческого возраста со сниженной активностью клеток-супрессоров имеют меньшую продолжительность жизни по сравнению с нормальным возрастным контролем [5]. По нашим данным, на фоне количественного дефицита CD3+CD8+ Т-лимфоцитов прослеживалась тенденция увеличения срока жизни при наличии в организме CD3+CD4"CD8" Т-лимфоцитов. Можно предположить, что эти клетки являются резервом иммунной системы для восполнения количественного недостатка и, возможно, цитотоксической функции CD3+CD8+ Т-лимфоцитов.

Для доказательства существования связи между естественным процессом снижения гормональной функции тимуса, количественным дефицитом CD3+CD8+ Т-лимфоцитов и появлением CD3+CD4"CD8" Т-лимфоцитов у долгожителей мы проанализировали эти же показатели у лиц в ситуациях, когда под действием внешних факторов один из параметров был искусственно снижен.

При обследовании детей, проживающих в течение 6 лет на территориях, загрязненных радионуклидами после аварии на ЧАЭС, нами выявлено, что на фоне сниженного уровня СТА у детей, родившихся как до, так и после аварии, отмечалась тенденция к снижению количества CD3+CD8+ Т-лимфоцитов. Нами впервые было показано, что у детей на фоне дефицита СТА и CD3+CD8+ Т-лимфоцитов в периферической крови появлялись Т-клетки с фенотипом CD3+CD4"CD8" в количествах, превышающих норму (см. глава 6, табл.9).

Исследованиями A.A. Ярилина [35, 37] показано, что последствиями радиации является снижение уровня секреции гормонов тимуса. Воздействие радиации на клетки эпителия тимуса осуществляется опосредованно через выработку аутоантител к ним и между пострадиационным синдромом, различными иммунодефицитными и аутоиммунными состояниями и старением организма есть много общего. Так, при обследовании населения, проживающего на загрязненных территориях, наблюдали формирование вторичных иммунодефицитов и резкое понижение уровня регуляторного сывороточного тимусного фактора [36].

Таким образом, мы считаем правомочным наше заключение, что причиной снижения численности CD3+CD8+ Т-лимфоцитов у долгожителей является нарушение секреции гормонов тимуса.

По-видимому, появление в периферической крови CD3+CD4'CD8" Т-клеток может быть связано как со снижением уровня СТА, так и численности CD3+CD8+ Т-лимфоцитов. Мы предположили, что искусственное подавление числа CD3+CD8+ Т-клеток при лечении больных аутоиммунным заболеванием апластическая анемия может служить моделью для доказательства вероятности появления на этом фоне Т-клеток с фенотипом CD3+CD4"CD8\

При лечении апластической анемии в мировой практике используется в качестве иммунодепрессанта препарат антилимфоцитарной сыворотки [фирмы-производители: Pharmacia & Upjohn Company, США; Fresenius, Германия], в частности, в клинике ФГУ РНИИ геронтологии Росздрава успешно применяют отечественный антитимоцитарный глобулин козий (АТГ-Кз). Этот препарат, как показали наши исследования, избирательно снижал количество CD3+CD8+ Т-лимфоцитов.

По-видимому, это связано с тем, что в антигенном материале (тимус, удаленный у детей при операциях на сердце) преобладают CD3'CD4+CD8+ тимоциты (80 - 90%), в связи с чем действие АТГ-Кз направлено преимущественно на подавление рецепторов CD4 и CD8.

На циркулирующих периферических хелперных Т-лимфоцитах рецептор CD4, по данным цитометрии, имеет более низкую плотность, чем CD8. Вследствие этого, основными клетками-мишенями АТГ-Кз были Т-лимфоциты, несущие на поверхности рецептор CD8. Интересно, что количество CD3+CD8+ Т-лимфоцитов активнее снижалось после курса АТГ-Кз на фоне низких значений СТА.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что численность субпопуляции CD3+CD8+ Т-лимфоцитов в периферической крови находится под контролем гормонов тимуса, а снижение количества CD3+CD8+ Т-клеток на низком гормональном фоне, в свою очередь, сопровождается появлением в периферической крови Т-клеток с фенотипом CD3+CD4"CD8\

Эти данные могут быть, по нашему мнению, экстраполированы и на изменения субпопуляционного состава у долгожителей.

Особый интерес, с нашей точки зрения представляет факт выявления CD3+CD4"CD8" Т-клеток у долгожителей.

При дополнительном фенотипировании этих Т-лимфоцитов с помощью разработанного нами метода было выявлено два типа клеток, различающихся по экспрессии молекулы CD 16 (раздел 6.2.). При этом у подавляющего большинства долгожителей (13 из 14 человек) наблюдали появление в циркулирующей крови Т-лимфоцитов, которые не экспрессировали маркеров CD4, CD8 и отличались от CD3+CD16+ естественных киллерных Т-клеток (ЕКТ) слабым свечением CD3 и отсутствием CD 16 маркеров. Эти клетки мы обозначили CD3lovvCD4"CD8"CD16". Только у одного человека из всех обследованных были выявлены CD3hiCD4"CD8"CD16l0W ЕКТ при отсутствии Т-лимфоцитов с фенотипом CD3lowCD4"CD8"CD 16" (глава 7, табл. 10).

Нами уточнено, что у долгожителей увеличивалась частота появления CD3IowCD4'CD8"CD 16' Т-лимфоцитов, а не ЕКТ. Изменения числа CD3lowCD4"CD8"CD16' Т-лимфоцитов было реципрокно количеству CD3+CD8+ Т-лимфоцитов и ассоциировалось с наличием хронических воспалительных процессов.

Анализ результатов иммуномониторинга 5 долгожителей, в комплексном лечении которых было использовано низкоинтенсивное лазерное излучение, показал, что у лиц с малым количеством CD3+CD8+ Т-лимфоцитов и наличием CD3|0WCD4"CD8"CD16" Т-лимфоцитов положительный результат лечения совпадал с восстановлением пула CD3+CD8+ до нормальных величин и, соответственно, исчезновением CD3 lowCD4'CD8"CD 16* Т-лимфоцитов.

Из научных публикаций известно, что группа клеток с фенотипом CD3+CD4"CD8' является гетерогенной и включает а(3- и у5 Т-клетки [8, 23].

Рецептор CD16 чаще экспрессируется на ар CD3+CD4'CD8" Т-клетках, в связи с чем можно предположить, что CD3lowCD4"CD8'CD16' Т-клетки относятся к у5 Т-клеткам [128].

Имеются публикации, согласно которым у8 Т-клетки устойчивы к апоптозу [84], локализуются в эпителиальных тканях желудочно-кишечного тракта, матки, кожи [31, 80], то есть в тех компартаментах организма, которые, как правило, являются очагами воспалительных и деструктивных процессов в старости.

Учитывая все выше сказанное, можно предположить, что выявленные нами CD3lowCD4'CD8"CD16' Т-лимфоциты, с большой вероятностью, относятся к у8 Т-клеткам.

Согласно гипотезе, ранее высказанной С. Hay day [88] уб Т-клетки прямо или косвенно могут выполнять функцию иммунозащиты в тех случаях, когда отсутствуют зрелые арТ-клетки. Тогда длительный срок жизни человека обеспечивается сохранностью численности и активности этой популяции клеток.

Как показали наши исследования, отсутствие CD3lowCD4"CD8"CD16" Т-лимфоцитов на фоне недостатка CD3+CD8+ Т-клеток наблюдалось перед летальным исходом, как у долгожителей, так и у больных с тяжелой формой апластической анемии.

В этом аспекте наши данные совпадают с информацией о том, что мыши, компрометированные по у8 Т-клеткам, несмотря на наличие зрелых аР Т-клеток погибали от инфекции [115].

По-видимому, CD3lowCD4"CD8'CD16" Т-клетки расширяют адаптационные возможности иммунной системы долгожителей.

В связи с обнаруженной способностью у8 Т-клеток регулировать специфический иммунный ответ с помощью секретируемых цитокинов, изменяя соотношения Thl/Th2 [138] возможен и другой механизм контроля реципрокных изменений количества CD3+CD8+ и CD3lowCD4'CD8"CD16" клеток по типу обратной связи. Однако ясность в этом вопросе может внести дополнительная характеристика этих клеток и, в первую очередь, определение типа Т-клеточного рецептора.

В своей работе мы лишь отметили факт преобладания у долгожителей С031(ШС04'СЭ8'С016" Т-клеток.

Такие же клетки мы обнаружили при аналогичных изменениях в структуре субпопуляций Т-клеток у лиц молодого и среднего возраста с диагнозом апластическая анемия после лечения АТГ-Кз и у детей, проживающих на загрязненной радионуклидами территории. В связи с этим остается открытым и ждет своего решения в будущем вопрос, в какой степени появление в периферической крови -клеток связано с самим процессом физиологического старения, и какую роль играют при этом те или иные заболевания.

Характер изменений в структуре субпопуляционного состава Т-лимфоцитов у долгожителей может быть использован в качестве критерия оценки состояния иммунореактивности, жизненного потенциала и вероятности наличия воспалительных процессов. Важно, что информацию можно получить при рутинном первичном иммунологическом обследовании в специализированной лаборатории.