Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Виды раувольфии в культуре IN VITRO

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ЛЕНИНГРАДСКИЙ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

НИКОЛОВА Иванка Георгиева

ВИДЫ РАУВОЛЬФИИ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

15.00.02—ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ И ФАРМАКОГНОЗИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

ЛЕНИНГРАД — 1991

Работа выполнена на кафедре фармакогнозии Ленинградского химико-фармацевтического института.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор ЯКОВЛЕВ Г. П. кандидат фармацевтических наук, доцент НИКОЛАЕВА Л. А.

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук ЛИСТОВ С. А. кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ВОЛЛОСОВИЧ А. Г.

Ведущая организация — Ботанический институт АН СССР имени В. Л. Комарова, Ленинград.

Защита состоится « 1991 года м • 'часов

на заседании специализированного /совета 'К 098.02.01 при Ленинградском химико-фармацевтическом институте по адресу: 197022, Ленинград, ул. проф. Попова, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

1991 г.

^ дпс^ср 1 ацпсп мил\ли И иншиилсле

Автореферат диссертации разослан « ^

Ученый секретарь специализированного совета

К 098.02.01 I Н' А' Б0РИС0ВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми. Представители родаRauwolfia Lсемейства '"'Аросупасеае используются в медицине в качестве источника алкалоидов с широким спектром действия (прогивоаритмическое, гипотензивное, седативное и др.).

К этому роду относятся более 200 видов, однако практическое значение имеют только четыре: раувольфия змеиная - Rauwolfia serpentina Benth. , р.седоватая - В. сапезс'ёиз Ъ,, р.рвотная - Н. vomitoria Afz. и р.каффра - R. caffra Sond. Корни этих видов раувольфии являются основнмм лекарственным сырьем для получения ряда высокоэффективных препаратов и широко используются в медицине. Крупнейшим поставщиком сырья на мировом рынке длительное время являлась Индия, на территории которой находятся основные массовые естественные заросли р.змеиной. Позднее аналогичные работы с растениями рода раувольфия были развернуты в Малайе, Вьетнаме, Китае, СССР и др. странах.

При закладке плантаций применяют семенное и вегетативное .размножение, причем предпочтение отдается второму способу вследствие низкой всхожести семян.-Однако расширению плантаций даже в условиях тропических стран препятствуют: плохая приживаемость черенков, небольшой коэффициент размножения, высокая поражаем мость грибной и бактериальной инфекцией. В результате истощения естественных зарослей на вывоз сырья р.змеиной из Индии было наложена эмбарго и страны, ранее импортировавшие сырье, на сегодняшний день испытывают дефицит препаратов раувольфии.

Биотехнологический подход, предпринятый нами для получения посадочного материала видов раувольфии, позволяет решить указанные проблемы и обеспечить определенный прогресс в получении сырья от этой группы растений. Благодаря методам микроклонирования in viti'o возможно не только быстро размножить ценные клоны, но и получить посадочный материал, дающий высококачественное сырье.

Ранее Е.А.Антиповой (1990) была разработана биотехнология микроклонального размножения р.седоватой, в которой была продемонстрирована перспективность подобных методов для размножения лекарственных растений.

Цель и задачи исследования. Цель нашей работы состояла в

разработке биотехнологии микроклонального размножения р.рвотной - перспективного продуцента препаратов гипотензивного и противоаритыического действия.

Для рёализации поставленной цели необходимо било решить следующие задачи:

1. Разработать методики количественного определения алкалоидов раувольфии, позволяющие анализировать небольшие навески культур тканей, органов и растений, полученных in vitro , и лекарственное растительное сырье.

2. Изучить морфогенетические потенции и особенности видов раувольфии в1 культуре in vitro и дать рекомендации для практического использования этих 'процессов.

3. Разработать питательные среды, обеспечивающие активную пролиферацию пазушных побегов р.рвотной и их укоренение.

4. Исследовать способность к синтезу алкалоидов тканей и органов р.рвотной in vitro с различной степенью дифференцировки. . л 5. Отработать отдельные з'талы технологии микроклонального размножения р.рвотной и дать им экономическую оценку.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное исследование морфод"енетических потенций рада перспективных видов раувольфии в культуре in vitro . Установлено, что все исследуемые растения при определенных условиях проявляют высокую морфогенети-ческую способность. -<■ г

Изучены возможные модели микроклонального размножения исследуемых видов раувольфии^ а) е помощью образования каллуса и дифференциации из негр побегов; б) путем соматического эмбриогенеза; в) путем(пролиферации пазушных побегов. Выделен^ основные группы факторов, способствующие получению каллуса и морфологических структур in vitroy . Установлено, что главными из них являются концентрация минеральных солей и соотношение гормональных факторов. ■ '

Установлено, что в процессе дифференцировки структур р.рвотной, полученных in vitro , изменяется количественное содержаний алкалоидов и их спектр. -

Теоретическая и практическая значимость. В процессе изучения видов раувольфии в культуре in vitro установлен ряд общих закономерностей каллусогенеза и органогенеза, по-видимому, отражающих родство таксонов. Результаты свидетельствуют о возможности

управления морфогенетическиыи процессами in vitro путем изменения состава питательных сред в предыдущих пассажах и условий культивирования.

Была отмечена взаимосвязь метаболизма алкалоидов в клетках и уровня дифференцировки тканей и органов ip. vitro Состав и содержание алкалоидов каллусной массы, побегов растений-регене-рантов и корней взрослого интактного растения существенно различались.

Подтверждено, что все изученные вида in vitro способны 4с пролиферации побегов из узлов и верхушек стеблей. В культуре ткани р.рвотной и р.каффра удалось получить более сложные структуры -эмбриоиды.

Установлено, что все виды раувольфии обладают высокой способностью к укоренению побегов на разбавленных средах без фито-гормонов. ч

Проведена оптимизация состава питательных сред, позволяющих-получить большое количество однородного посадочного материала, и отработаны отдельные этапы технологии йлонального микроразмножения р.рвотной. Составлена технологическая карта трудовых затрат на получение саженцев и рассчитана стоимость одного растения. Растения-регенеранты морфофизиологически не отличаются от растений семенного происхождения.

Разработаны методики количественного определения аймалина, резерпина.и серпентина в растительном сырье и тканях раувольфии и суммы алкалоидов р.рвотной и р.седоватой,-пригодных для,анализа небольших навесок (50-100 мг) культур тканей и органов растений, полученных- in vitro, и в лекарственном растительном сырье. Методики позволяют проводить оценку накопления алкалоидов в процессе роста и развития растения и могут способствовать выявлению закономерностей их биосинтеза в процессе дифференцировки и морфогенеза.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации доложены на XI научной конференции болгарских аспирантов в СССР, Москва, 1989 г., на Ш мслодежной конференции ботаников г. Ленинграда в 1990 г., на объединенном заседании кафедры фармакогнозии и секции растительного сырья Ленинградского научного общества фар- _ мацевтов в 1990 г., на объединенном заседании кафедр фармакогнозии и фармацевтической химии Ленинградского химико-фармацевти- .

ческого института в 1991 г.

-По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (I глава), описания материалов и методов исследования (I глава), экспериментальной части (4 главы), выводов, списка литературы. Текстуальная часть ЦЧЬ стр.) иллюстрирована 15 рисунками, 50 таблицами. Список литературы включает 185источника, в том числе иона иностранных языках.

N.

CD ДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Объектом исследования служили дикорастуцдее и культивируемые во Вьетнаме виды раувольфии, а также р.каффра и р.мутовчатая, растущие в оранжереях Ботанического института АН ССОР им. В.1. Комарова.

Источниками эксплантов служили растения семенного происхождения, выращенные в оранжерее, в возрасте от 2-х месяцев до 2-х лет.

Режим культивирования. Ткани и побеги растений культивировали in vitro в термостатируемом помещении при ** 2б+2°С, освещенности 3-5 тыс. люкс, сЪ светопериодом 16 часов и в темноте. Использовали общепринятые методы работы с культурами растительных тканей.

Методы разработки питательных сред. Оптимизацию питательных сред проводили по усеченной матрице тестифакторного эксперимента методом математического планирования. В каждом опыте изучали 25 вариантов питательных сред.(Обработку данных на основе средних значений и критериев оптимизации каждого варианта проводили по программе R-Multi , разработанной в Институте экологической генетики АН Молдовы (Скирнов, 1986).

Качественный анализ. Исследование алкалоидов раувольфии проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинках •* silutoi uv-254 "в системах растворителей, обеспечивающих удовлетворительное разделение оснований. Алкалоиды идентифицировали по значениям Rf , по флуоресценции пятен в УФ-свете и их окраске после проявления хроматограмм различными реактивами.

Разработка методик количественного анализа алкалоидов раувольфии

Разработанные нами экстракционно-фотометрические методики количественного определения алкалоидов аймалина, резерпина, серпентина и суммы алкалоидов основаны на образовании при соответ-ствуицих значениях рН окрашенных комплексов алкалоидов с кислотно-основными красителями, легко экстрагируемых органическими растворителями. В качестве реактива для анализа был выбран краситель бромтимоловый синий (БТС), а в качестве экстрагента -хлороформ.

Методика количественного определения аймалина. резерпина.

В результате изучения реакций взаимодействия указанных алкалоидов с БТС было установлено, что наибольшая оптическая плотность для экстракции комплексов БТС с аймалином наблюдается при-рН 7.6, для резерпина - при рН 7.3, для серпентина - при рН 8.5. Максимум поглощения комплексов алкалоидов с БТС находится при Л max 595-605 ни.

Алкалоиды определяли после разделения экстракта из растительного материала на пластинках силуфола с последующим их элш-рованием с хроматограмм. Содержание алкалоидов рассчитывали по калибровочному графику зависимости оптической плотности растворов комплексов алкалоидов с БТС от концентрации алкалоидов.

Для проверки методики готовили смесь из равных количеств алкалоидов аймалина, серпентина и резерпина, наносили их на хрома-тографические пластинки и анализировали согласно методике. Метрологическая характеристика количественного определения аймалина, резерпина и серпентина в коре корней раувольфии змеиной представлена в таблице I.

Количественное определение аймалина, резерпина и серпентина в коре корней раувольфии змеиной (п = 6)

серпентина

Таблица I

Название Среднее содержание, % S

алкалоида

х

аймалин

резерпин

серпентин

1.50 0.36 0.14

0.0420 0.1029 6.86 0.0142 0.0349 9.70 0.0044 0.0109 7.82

Методика количественного определения суммы алкалоидов

Для количественной оценки содержания алкалоидов в небольших навесках (50-100 иг) культур тканей, культур органов, ювенильных форм растений-регенерантов, полученных in vitro и в лекарственном сырье р.седоватой и р.рвотной мы разработали экстракционно-фотометрическую методику анализа. В процессе работы были найдены оптимальные условия проведения анализа: установлена концентрация красителя, степень разбавления растворов, найдены оптимальные значения рН для экстрагируемости комплексов БТС с алкалоидами и др. Определение оптимального значения рН проводилось с экстрактами из коры корней р.рвотной и р.седоватой, разделенными при различных значениях рН на фракции: при рН 2 (фр. I), при рН 6 (фр. 2), при рН 8 (фр. 3), при рН 10 (фр. 4), с экстрактами алкалоидов из побегов, полученных in vitro , и из культур тканей. Результаты определения представлены графически (рис. I). Как видно, оптимальным значением рН, при котором наблюдается наибольшая интенсивность окраски является 7.6 для р.седоватой и 7.2 для р.рвотной.

Для проверки разработанной методики мы использовали весовой метод количественного определения суммы алкалоидов (Britiech, .., 1959) и получили хорошее совпадение результатов. Методика отличается высокой чувствительностью и обеспечивает достаточную точность определения содержания алкалоидов.

Выбор объекта исследования

С целью выбора объектов исследования с помощью разработанных нами методов мы провели сравнительное фотохимическое' изучение лекарственного сырья - коры корней видов раувольфии, произрастающих во Вьетнаме (табл. 2). Результаты исследования показали, что все изученные растения содержат значительные количества алкалоидов и могут служить промышленным источником цяя получения лекарственных препаратов.

Наибольшее количество алкалоидов накапливают р.рвотная и р.змеиная, что позволило нам выбрать их для дальнейшего изучения в условиях in vitro , Кроме того, в качестве объектов были взяты р.мутовчатая, как холодостойкое растение, перспективное в плане получения гибридов in vitro, и р.каффра, древесный вид, накапливающий значительное количество аймалина.

% (

1,1

1.0

0,9

0,8

0,7

0,6

0.5

0,4

0,3

0,2

0,1 О

1,2'

1,1

1,0

0,9

0,8 I 5

0,7

0,6 4

0,5

0,4 3

0,3 72

0,2 /Т

0,1 /

0 /

5 6 7 8 9 10 II 12 рН

7 8 9 10 II 12 13 рН

Рис.1. Влияние величины рН на экстрагируемость комплекса краситель-алкалоиды. А - раувольфия рвотная; Б - раувольфия седоватая

Экстрагируемые комплексы: I - из культуры ткани; 3 - из побегов,' полученных \nvitio ; -

2, 4, 5, 6 - из коры корней при рН 2, 10, Б, 8,соответственно.

I

Таблица 2

Сравнительная фотохимическая характеристика некоторых видов раувольфии, произрастающих

во Вьетнаме

Вид Дикорастущий или культивируемый Возраст (в % от Содердание алкалоидов массы воэдушносухой коры корней)

сумма аймалин серпентин резерпин

Р. змеиная дикорастущий - 3.25*0.06 1.46*0.08 0.15*0.01 0.33*0.03

культивируемый I год 2.75+0.05 1.6010.10 0.15*0.01 С.33*0.03

Р.камбоджийская дикорастущий - 4.05*0.08 0.65*0.05 - 0.42*0.04

Р.мутовчатая дикорастущий - 2.87*0.05 0.55+0.05 0.36+0.06 следа

Р.прибрежная дикорастущий - 6.10+0.II - - 0.56*0.03 0.17+0.01

Р.рвотная дикорастущий - 6.35+0.10 3.00*0.09 - 0.70+0.04

культивируемый 3 года 6.00*0.08 3.00*0.09 - 0.72*0.04

Р.седоватая культивируемый 3 года 5.20+0.08 1.70*0.10 0.35*0.02 0.15+0.01

Примечание: - отсутствие алкалоида.

МорсЬогенетические потенции видов раувольфии в культуре

Каллусогенез и органогенез в культуре ткани. В процессе исследования каллусообразования выбранных нами видов раувольфии были изучены потребности растений в экзогенных фитогормонах и элементах минерального и углеводного питания для индукции каллуса. В результате было установлено, что каллусогенез на листовых эксплантах наблюдается только при наличии НУК и БАП в среде. НУК в сочетании с любым из цитокининов (БАП, кинетин) была неактивна. Из известных сред только среды АЪои-Мапйош? (1977) и Гам-борга (1980), характеризующиеся сравнительно невысокой концентрацией большинства минеральных солей, способствовали каллусо-образованию.

На основе предварительных экспериментов была поставлена серия опытов методом математического планирования, в которых были найдены оптимальные сочетания минеральных солей и углеводорода для каллусогенеза р.рвотной, р.змеиной и'р.мутовчатой. В отдель^ ном опыте были уточнены видовые потребности тканей в фитогормонах (табл. 3). ^

Для получения каллуса р.каффра была проведена дополнительная оптимизация питательной среды. Вместо нн^ио^ в качестве аммонийного азота в состав среды были вклшены соли НН^С! и №4)22с4 и значительно снижено содержание ига^ . в результате опытов был найден состав компонентов, индуцирующий каллуо, способный в следующем пассаже дифференцироваться в органы.

'Для изучения морфогенной способности листовые каллусы исследуемых растений переносили на среды для морфогенеза. Формирование побегов и корней в культуре ткани р.змейкой и р.рвотной наб-людалосгтолько у каллусов, полученных в условиях темноты. Р.му-товчатая формировала побеги 1п vitгoв условиях-оветопериода. Р.рйотная после культивирования каллуса на среде с фитогормоном 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д) - 2 мг/л и пересадки на безгормональную среду была способна образовывать эмбриоиды.

Формирование побегов и эмбриоидов в культуре ткани р.каффра наблюдалос только на средах, где отсутствовал или содержался в низкой концентрации аммонийный азот. Обязательным было присутствие в среде двух фитогормонов: БАП (2.0-3.5 мг/л) и НУК (0.010.1 мг/л). >

Структуры, полученные в культуре ткани, были изучены с по-

Таблица 3

Питательные среды для каллусообразования некоторых видов раувольфии

Компоненты Содержание компонентов, в мг/л

сред -

р.рвотная р.змеиная р.каффра р.мутовчатая

кно3 2000.0 2000.0 1500.0 2000.0

вн4мо3 1000.0 1000.0 - 1000.0

МЕ304 350.0 350.0 350.0 350.0

СаС1 безводный 300.0 300.0 190.0 300,0

КН2К>4 100.0 100.0 - 100.0

ЕН4С1 - - 500.0 -

- 250.0 -

На Н2Р04 - - 200.0 -

Сахароза 25000.0 25000.0 20000.0 25000.0

Микроэлементы и железа хелат по прописи среды Мурасиге и Ску1

Витамин В| 10.0 10.0 10.0 10.0

Витамин 1.2 1.2 ' 1.2 1.2

Витамин РР 1.0 ' 1.0 1.0 1.0

Витамин С 2.0 2.0 2.0 2.0

Инозит 100.0 100.0 100.0 100.0

Агар 6000.0 6000.0 ; 6000.0 6000.0

БАЛ 0.3 2.0 0.8 -

НУК 3.0 2.0 1»6 2.0

Кинетин - - - 1.0

Примечание: "-" - отсутствие компонента

мощью методов гистогенеза и электронной микроскопии в Ботаническом институте АН СССР им. В.Л.Комарова. Было подтверждено, что морфогенез в культурах тканей р.рвотной и р.каффра идет путем гемморизогенеза и эмбриоидогенеза. Растения-регенеранты морфологически не отличались от исходных форм.

Индукция пазушных побегов. Для изучения способностей исследуемых видов индуцировать рост пазушных почек брали микрочеренки с одной парой листьев, стерилизовали их и высаживали.на известные питательные среди (Мурасиге и Скуга, Уайта, Нича, Гамборга Bg и др.), дополненные фитогормонаыи. Среда Мурасиге и Скуга, по сравнению с другими средами, способствовала более активной пролиферации пазушных побегов у всех видов раувольфии. Изучение влияния фитогормонов на этот процесс в различных комбинациях и концентрациях позволило определить видовые потребности растений для индуцирования пазушных меристем: 3.5 мг/л БАП - для р.каффра, I мг/л БАП - для р.змеиной, 0.5 мг/л БАП и 0.01 мг/л НУК -для р.рвотной, 0.1 мг/л НУК и 2 мг/л кинетина - для р.мутовчатой.

Укоренение побегов. В опытах по укоренению сформировавшихся in vitro побегов была установлена еще одна общая для видов раувольфии закономерность, заключающаяся в том, что все взятые нами растения укоренялись только на средах с низкой концентрацией-компонентов без добавления экзогенных фитогормонов, причем образование . корней наблюдалось уже на 8-10 день инкубации. В короткие сроки возможно было укоренить около 90% микрочеренков. В результате исследования морфогенетических потенций перспективных видов раувольфии в культуре было установлено, что исследуемые растения при определенных условиях способны к активной регенерации in vitro, в табл. 4 представлены морфологические структуры и возможные модели микроклонального размножения видов раувольфии. Как видно, изученные растения активно пролиферируют пазушные побеги и все виды при определенных условиях образуют каллус и способны к морфогенезу в культуре ткани. Р.рвотная и р.каффра могут формировать в культуре ткани более сложные структуры - эмбриоиды.

Суммируя эти данные, можно заключить, что виды раувольфии , можно размножать in vitro следующими способами:

I. Пролиферацией пазушных побегов из узлов и верхушек побегов.

Таблица 4

Морфогенетические потенции раувольфии в культуре

Вид Индуцируемые структуры Модель размножения

Р.каффра радушные почки, побеги; пролиферация пазушных

побегов;

эмбриоиды, побеги в эмбриоидогенез и орга-

культуре ткани; ногенез в культуре

ткани;

Р. змеиная пазушные почки, побега; пролиферация пазушных

побегов;

'побеги и корни в куль- органогенез в культуре

туре ткани; ткани;

Р.рвотная пазушные почки, побега; пролиферация пазушных

/ побегов;

эмбриоиды, побега и кор- эмбриоидогенез и орга-

ни в культуре ткани;г ногенез в культуре

\ \ ткани;

Р.цутоЬчатая пазушные почки, побеги; пролиферация пазушных

цобегов; ,

\ побеги в культуре ткани; органогенез в культуре

ткани; 1

2. Образованием каллуса и регенерацией из него побегов.

3. Дутем соматического змбрио^огенеза.

В процессе исследований мы обегали ряд общих для изученных видов особенностей к^ллусогенеза и морфогенезу, отражающих, по-видимому, их филогенетическое родство. ^ I ,

К настоящему времени"культура побегов изученных нами видов раувольфии в качестве генетически гомогенного растительного мате- г риала были переданы в Ботанический институт АН'СССР им. В.Л.Комарова и Институт ботаники им. Холодного, АН УССР, где они использовались в качестве источника протопластов для соматической гибри-

V 1 о

дизации.

Для дальнейшего научения в культуре . in vitro и разработки биотехнологии микроклонального размножения нами была выбрана р.рвотная - высокоалкалоидный вид, для которого проблема получения посадочного материала наиболее актуальна.

Технология микроклонального размножения рауволыЬии рвотной

Проведенные исследования позволили заключить, что предпочтительным для микроклонального размножения р.рвотной является способ пролиферации пазушных побегов, индуцируемых из узлов и верхушек побегов.

Технология микроклонального размножения р.рвотной' включала следующие этапы: отбор и стерилизацию исходных эксплан-тов; культивирование микрочеренков до образования пазушных побегов; микрочеренкование и размножение побегов; укоренение побегов; пересадку растений в почву и их адаптацию к условиям открытого грунта. ч

Исходные экспланты отбирали от здоровых, активно растущих экземпляров маточных растений.

Для выяснения влияния возраста на пролиферацию побегов мы сравнивали экспланты от взрослых растений, сеянцев семенного происхождения и побегов, полученных in vitro . Результаты показали, taro чем моложе посадочный материал, тем раньше он индуцирует побега и7наоборот. Для получения первичной культуры мы использовали 2-3 месячные раатения пененного происхождения и растения такого же возраста, полученные in vitro.

После отбора эксплантов их подвергали стерилизации, используя р*лнчные стериленты самостоятельно или в комбинации друг с другом. Наилучший положительный эффект (мен^е 1056 инфицированного материала) t. достигался при последовательном применении двух стерилизующих растворов: раствора перекиви вЬдорода в эта-Але и раствора пантоцида.

Разработка питательной среды длд размножения побегов микоо-черенкованием. Индукция роста пазушных почек р.рвотной осущест-. влялась на среде Мурасиге и Скуга, дополненной БАЛ - 0.5 мг/л и НУК - 0.01 мг/л.

Для размножения индуцированных от первичных эксплантов побегов был испытан ряд сред и на хх основе поставлена серия экспериментов методом математического планирования, в которых

было исследовано влияние минеральных солей, сахарозы и фитогор-монов на пролиферацию. Критериями оптимизации служили число побегов и количество узлов.

Ниже мы приводам два заключительных опыта, в которых были уточнены потребности культуры побегов р.рвотной в фитогормонах, а также концентрации солей - источников азота и м^о^. План этих опытов представлен в табл. 5 и 6. Во втором эксперименте взяты более высокие концентрации минеральных солей.

Таблица 5

План заключительного эксперимента (№1). Уровни варьирования компонентов среды.

п/п Факторы оптимизации Концентрация исследуемых факторов, мг/л

I 2 3 4 5

I БАП 0.1 0.5 1.0 2.0 • 3.0

2 НУК 0 0.001 0.01 0.1 1.0

3 Ш)3 750 900 1050 1200 1350

4 нн4ш5 100 170 240 310 380

5 Са(НС>3) 300 400 500 600 700

6 М@5С>4.7Н20 100 150 200 250 300

Постоянные компоненты, в мг/л: саС12.2Н20 _ по, НаНО^ _ 85, КН2Р04 - 210, сахароза - 30000, агар - 6000, витамины - по прописи Смирнова, микроэлементы и железа хелат - по прописи Му-расиге и Скуга.

Таблица 6

План заключительного эксперимента (№2). Уровни варьирования компонентов среды.

п/п Факторы оптимизации Концентрация исследуемых факторов, мг/л,

I 2 3 4 5

I БАП 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

2 НУК 0 '0.001 0.01 0.1 1.0

3 КЕО, Р 1000 1150 1300 1450 1600

4 НН..Н0, 7 ^ 100 200 300 400 500

5 Са (жу. 400 500 600 700 800

6 МЕБ04 . 100 200 300 400 500

Неварьирующие компоненты, в иг/л: СаС12.2Н20 - 160, ИаЛО^ -100, КН2Р04 _ 315, сахароза - 30000, агар - 6000, витамины - по прописи Смирнова, микроэлементы и железа хелат - по прописи Му-р&сиге и Скуга.

В конце цикла выращивания (32 день) подсчитывали число побегов и узлов. Эти данные вводили в ЭВМ и обрабатывали по программе К-Ш1+у . Результаты математической обработки представлены в виде графиков на рис. 2 и 3.

По результатам изучения была предложена среда для размножения побегов р.рвотной. Ее состав представлен в табл. 7.

В процессе размножения побегов наблюдали, что различные черенки отличались по своей способности пролиферировать пазушные побеги. Эксплант, представляющий собой верхушку побега, формировал только один побег. Микрочеренки, состоящие из 2-3 узлов, индуцировали побеги только из почек верхнего узла, редко из второго и никогда не наблюдалось индукции побегов из третьего узла. Мы сделали вывод, что в целях экономии выгоднее расчленять побеги на микрочеренки длиной 0.5-1.5 см с одной парой листьев.

Укоренение побегов. Для успешного укоренения размноженных побегов р.рвотной провели оптимизацию питательной среды, ранее разработанной Е.А.Антиповой (1990) для р.седоватой.

В качестве факторов оптимизации были взяты следующие компоненты среды: кш,, hh.no,, мезо4, кн„ро4, СаС12 и пиридокснн. Результаты опыта обрабатывали на ЭВЬГпо двум критериям - числу побегов, образовавших корни, и числу корней у растения.

Найденный состав питательной среды для укоренения побегов р.рвотной представлен в табл. 7. Анализ среды показывает, что она отличается от известных сред высокой степенью разбавления. В частности, концентрации кко,, иуго,, 1'-е304, кн2?о4снижены в 2-3 раза. Комбинация солей и витаминов позволила сделать среду безгормональной. Отличительной особенностью среды является присутствие в ней пиридоксина. Побеги р.рвотной на этой среде обладали очень высокой способностью к укоренению. Уже к 15 дню культивирования более 905? микрочеренков размером 1.5-2.0 см с 1-2 узлами индуцировали корни.

Растения-регенеранты после образования корней адаптировали к условиям пониженной влажности в течение 5-7 дней и затем высаживали их в почву. Более 90& растений хорошо приживались в почве.

1050 1350- *

300 500

750 1050 1350

. Зависимость числа побегов (у) и узлов (ут) от концентрации компонентов (х) в первом эксперименте, а - БАП; б - НУК; в - Ш3; г - ИНдкЮд; д - Са(М3)2 .

Рис. 3. Зависимость чисда побегов (у) и узлов (ут) от концентрации компонентов (х) ао втором эксперименте. ^ _ ш. б _ Ш; и _ р _^н4М03; д - Са(Ы03)2>

Морфологически клонально размноженные растения были аналогичны контрольным, выращенным из семян.

Полученные в процессе разработки биотехнологии микроклональ-ного размножения р.рвотной данные были использованы при составлении расчетно-технологической карты. Затраты на размножение р.рвотной in vitro согласно технологической карте составляют 17 коп. за один саженец. Питательные среды, использованные для получения посадочного материала, просты по составу, не содержат дорогостоящих добавок и их цена не превышает 27 коп. за I литр (табл. 7). -

В оптимальных условиях за 6 месяцев при относительно небольших затратах возможно получить более 200 тыс. саженцев, которые могут служить оздоровленным посадочным материалом для получения лекарственного сырья - источника противоаритмических и гипотензивных препаратов.

Содержание и состав алкалоидов раувольфии рвотной на разных стадиях морфогенеза

Известно, что существует тесная связь между уровнем клеточной дифференциации тканей растения, его развитием и вторичным метаболизмом. Отсутствие дифференциации часто является причиной того, что в них не синтезируются продукты, характерные для интахтных растений. '

Мы исследовали состав и содержание алкалоидов в каллусах и различных морфологических структурах р.рвотной, культивируемой in vitro . В результате установлено, что свет оказывает ингибиру-пцее действие на синтез алкалоидов, их содержание в каллусах нулевого - третьего пассажа, выращенных в условиях светового режима незначительно (табл. 8). Каллусы р.рвотной, растущие в темноте, уже в нулевом пассаже накапливают около 1% суммы алкалоидов, причем их содержание при пассировании значительно увеличивается. Этот факт указывает на перспективность изучения биомассы культуры ткани р.рвотной как источника сырья для получения ценных алкалоидов раувольфии. (

Интерес представляет способность побегов i» vitro накапливать в 2 раза больше алкалоидов, чем в надземных частях растений, выращенных из семян. После инициации корней содержание алкалоидов в растении резко возрастает, что свидетельствует о существенной ро-

Таблица 7

Состав питательных сред в биотехнологии размножения раувольфии рвотной индукцией пазушных меристем

Компоненты сред Содержание компонентов, в мг/л в средах для

индукции побегов микрочеренкования укоренения

Калия нитрат 1950 1400 500

Аммония нитрат 1650 400 250

Магния сульфат 370 450 20

Кальция" хлорид беав. 340 120 350

Калия дигидрофосфат 180 315 120

Кальция нитрат - 485 -

Натрия нитрат - 100 -

Микроэлементы и железа хелат по прописи Мурасиге и Скуга i

Витамин В^ 10.0 10.0 -

Витамин В§ 1.2 1.2 3.0

Витамин РР 1.0 1.0 1.0

Витамин С 2.0 2.0 -

Инозит г 100 100 100

Сахароза ' ^ 25000 25000 15000 '

6-бензиламинопурин 0.5 0.5 ч

А-нафтол уксусная кислота агар - ' 0.01 6000 0.01 6СЮ0 ' 6000

Цена 1л питательной cpefcu (в руб.)

0.27

0.26

0.26

Примечание: I. - отсутствие компоненте

2. Расчет стоимости питательных сред проведен по прейскуранту № 05-11-45, 4.1-2 "Оптовые цены на химические реактивы и препараты"

Алкалоиды в тканях раувольфии рвотной in vitro

Таблица 8

Алкалоиды Морфологические структуры Интактные растения

световой каллуо темповой каллус побеги растения-регенеранты надземная часть кора корней

нулевой пассаж третий пассаж нулевой пассаж третий пассаж

Сумма 0.19+ 0.014 0.20+ 0.015 1.01+ 0.051 1.84+ 0.092 1.66+ 0.136 2.01+ 0.164 0.80+ 0.050 6.35+ 0.010

Иохимбин - - - + + + + +

Резерпин - - - - + + - +

Аймалин - - - следы + - +

Перакин - - + + + + + -

Вомиленин - - + + - + - +

Ангидрониевое основание - + + + - - + +

Примечание: "-" отсутствие алкалоида

ли процесса корнеобраэования в синтезе алкалоидов.

Процессы дифференцировки и морфогенеза способны изменять не только уровень, но и спектр синтезируемых веществ. В темновых каллусах уже в нулевом пассаже можно хроматографически идентифицировать иохимбин, перакин и вомиленин, характерные для взрослого растения. Синтезируются и другие алкалоиды, которые не идентифицировались. В процессе дифференцировки с развитием побегов ткани накапливали более широкий спектр алкалоидов. В побегах in vitro хроматографически идентифицирован резерпин, не накапливающийся в побегах взрослого растения.

ВЫВОДЫ

1. Исследованы морфогенетические потенции ряда перспективных видов рода раувольфия в культуре in vitro , Установлено, что все исследуемые таксоны проявляют высокую морфогенную активность и способны к образованию различных структур в культуре ткани и пролиферации побегов из узлов и верхушек побегов. Даны практические рекомендации к разработке соответствующих высокоэффективных клеточных технологий микроклонального размножения изученных видов.

2. Выявлены некоторые общие для исследованных видов закономерности каллусогенеза, органогенеза и укоренения. Показана возможность управления этими процессами in vitro _ Установлено, что каллусообразование у всех видов происходит только на питательных средах с невысокой концентрацией шнеральных солей; морфогенез в ткани зависит от состава питательных сред и условий культивирования тканей и органов на предыдущем этапе роста.

3. Разработаны методики количественного рпределенйя аймалина, резерпина и серпентина в растительном сырье и тканях раувольфии,' а также суммы алкалоидов р.рвотрной^и^).седоватой для анализа небольших навесок (50-100 мг) культур тканей ^ ррганов растений, полученных in vitro , позволяющих контролировать накопление алкалоидов на всех этапах развития растений ft способствующих выявлению закономерностей биосинтеза алкалоидов в процессе дифференцировки и морфогенеза.

4. Каллусы при пассировании способны накапливать значительное количество алкалоидов, что позволяет рекомендовать культуру ткани р.рвотной к дальнейшему изучению как источника сырья для получения препаратов раувольфии.

5. Установлена зависимость между накоплением алкалоидов и уровнем дифференцировки тканей. В процессе дифференцировки тканей р.рвотной с появлением побегов и корней изменяется спектр алкалоидов и значительно возрастает их содержание. Свет ингиби-рует биосинтез алкалоидов в тканях р.рвотной.

6. Морфологические структуры, развившиеся in vitro , могут служить моделью для изучения биосинтеза алкалоидов в растительных клетках и использоваться в качестве генетически однородного материала для получения соматических гибридов.

7. Разработаны питательные среды, обеспечивающие активную пролиферацию побегов р.рвотной и их укоренение. Существенное преимущество среда для укоренения - отсутствие в ней фитогормонов.

8. Разработана биотехнология массового производства оздоровленного посадочного материала р.рвотной. Биотехнология имеет существенные преимущества в сравнении с традиционными методами вегетативного размножения и позволяет в короткий сроки- получить большое количество (более ста тысяч) однородных саженцев.

Основные материалы диссертации изложены в следующих работах:

I., Николова И.Г., Антнпова Е.А. Виды раувольфии как объекты в биотехнологических исследовашях//Научная конф. "Изучение, охрана и рациональное использовешие природных ресурсов": - Тез. докл. - ч.П,- Уфа, 1989. - С. 142.

2. Некоторые результаты исследования растений в культуре ia vitro /Николаева Л.А., Антипова Е.А., Николова И.Г. и др.// Результаты и перспективы научных исследований по биотехнологии в фармации: Тез. докл. Всесоюзной конф. - Л., 1989. - С. 152-153.

3. Николова И.Г. Биотехнология размножения видов раувольфии в культуре in vitro //Рукопись представлена на II научной кон$е-рзнции болгарских аспирантов в СССР в Москве. Деп. в ЦНТБ, София, 20.06.89. - ЦЦ » 3643/Й9. - II с. -

4. Нгуен Ким Кан, Николова И.Г., Николаева Д.А. Количественное определение алкалоидов в коре корней некоторых видов Bauwol-fia L. методом тонкослойной хроматографии // Растительные ресурсы. - 1989. - Т.25. - Вып. 4. - С. 594-599.

5. Аймалинсодержащие вида Rauwolfia ь. /Николаева Л.А., Антипова Е.А., Николова И.Г. и др. // Растительные ресурсы. - 1990.-Т.26. - Вып. 2. - С. 219-224.

6. Николов&И.Г. Лекарственные растения в культура in vitro и их продуктивность // Тр. Ш молодежной конф. ботаников г. Ленинграда. -Ленинград, апрель, 1990. - Л., 1990. - чЛУ. - С. 25-35.

Подписано к печати . Закаа?^"#' 1 . Тира-* JCCJy •

формат бумаги 60x84 1/16, /й new.л. Бесплатно.

1Ю - 3 "Ленуприздата".

I9II04 Ленинград, Литейный пр., дом № feb.