Теоретические и экспериментальные основы разработки эффективных ресурсосберегающих технологий лекарственных средств растительного происхождения

Каухова, Ирина Евгеньевна

Диссертации по фармакологии → Технология лекарств и организация фармацевтического дела

Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Теоретические и экспериментальные основы разработки эффективных ресурсосберегающих технологий лекарственных средств растительного происхождения

ДИССЕРТАЦИЯ

Теоретические и экспериментальные основы разработки эффективных ресурсосберегающих технологий лекарственных средств растительного происхождения - диссертация, тема по фармакологии

АВТОРЕФЕРАТ

Каухова, Ирина Евгеньевна Санкт-Петербург 2007 г.

Ученая степень: доктора фармацевтических наук

ВАК РФ: 15.00.01

Автореферат диссертации по фармакологии на тему Теоретические и экспериментальные основы разработки эффективных ресурсосберегающих технологий лекарственных средств растительного происхождения

На правах рукописи

КАУХОВА Ирина Евгеньевна

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ РАЗРАБОТКИ ЭФФЕКТИВНЫХ РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩИХ ТЕХНОЛОГИЙ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

15.00.01 - Технология лекарств и организация фармацевтического дела

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

Санкт-Петербург — 2007

003060878

Работа выполнена в ГОУ ВПО Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии Федерального Агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации на кафедре технологии лекарств и фитопрепаратов

Научный консультант:

доктор фармацевтических наук, профессор Минина Сусанна Александровна Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Молдавер Бенюмен Лейбович доктор фармацевтических наук, профессор Демина Наталья Борисовна доктор фармацевтических наук, профессор Степанова Элеонора Федоровна

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Защита состоится " 04 " сентября 2007 г в 1400 часов на заседании Диссертационного Совета Д208 088 01 при ГОУ ВПО Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии Росздрава по адресу 197376, Санкт-Петербург, ул Проф Попова, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу 197376, Санкт-Петербург, ул Проф Попова, 4/6

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат фармацевтических наук

Марченко Н В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

В настоящее время в медицинской практике важное место принадлежит лекарственным средствам растительного происхождения, т к они обладают широким спектром биологического действия, что позволяет использовать их для профилактики и лечения многих заболеваний

Между тем потребность населения, возможности расширения применения фитопрепаратов (ФП) в медицинской практике удовлетворяются далеко не полностью, главным образом из—за неэффективной переработки лекарственного растительного сырья (ЛРС) и дефицита некоторых его видов В связи с этим особое значение приобретают исследования по созданию эффективных, целенаправленных технологий в производстве фотохимических лекарственных средств с целью комплексного использования ЛРС, достижения более высоких выходов, расширения спектра извлекаемых БАВ и ресурсосбережения

Эти проблемы можно решить, разрабатывая прогрессивные технологии переработки ЛРС, обеспечивающие максимальное извлечение биологически активных веществ (БАВ), и используя новый вид фитосырья - биомассу лекарственных растении, получаемую биотехнологическим способом с направленным биосинтезом индивидуальных веществ

Метод культивирования растительных клеток и тканей вызывает большой интерес у исследователей, пригодность его для решения ряда технологических и медицинских проблем не вызывает сомнений (Бутенко, 1986, Носов, 1991, Воллосович, 1992, Mlsawa, 1994) Особенно перспективно применение биомассы как источника БАВ тех видов растений, которые являются редкими, исчезающими, произрастающими в труднодоступных регионах или с трудом культивируемых на плантациях, а также импортируемых Однако сырье, получаемое методом культуры тканей, еще достаточно дорогое и в ряде случаев не может конкурировать с заготовкой интактных растений, поэтому остается актуальным поиск новых эффективных направлений, позволяющих снизить себестоимость сырья за счет повышения продуктивности штаммов-продуцентов, совершенствования методов выращивания биомассы и выделения активных субстанций

При разработке технологии суммарных фитопрепаратов целесообразно максимально извлекать природный комплекс БАВ, характерный для данного лекарственного растения При существующих, далеко не всегда прогрессивных технологиях промышленного производства фитопрепаратов эффективность извлечения в ряде случаев достигает лишь 40-50% из-за недостаточности истощения сырья по различным группам действующих веществ

В связи с указанным, разработка эффективных способов получения дефицитных видов сырья методом культуры тканей и создание новых технологий фитопрепаратов представляет собой актуальную научно-практическую проблему, решение которой позволит внести важный вклад в развитие фармацевтической технологии и увеличить выпуск необходимых здравоохранению лекарственных средств

Цель и задачи исследования

Целью диссертационной работы явилось совершенствование технологии выращивания биомассы как источника БАВ методом культуры тканей и создание эффективных ресурсосберегающих способов переработки сырья в производстве лекарственных средств растительного происхождения

Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд задач

1 Изучить особенности питания, газообмена и изменений в структурной организации клеток растительных тканей и установить закономерности их влияния на продуктивность штаммов-продуцентов.

2 Разработать технологию целенаправленного обогащения биомассы растительных тканей биологически активными веществами, обеспечивающую получение высокопродуктивных промышленных штаммов

3 Оптимизировать параметры культивирования штаммов, гарантирующие их высокую продуктивность и стабильность в условиях промышленных производств

4. Усовершенствовать метод выделения и очистки индивидуальных БАВ из культуры растительных тканей на примере биомассы раувольфии змеиной, сырья для выделения аймалина, с целью получения эффективного ан-тиаритмика М(4)-пропилаймалиния бромида (ЫПАБ),

5 Научно обосновать и эксперименгально разработать способ экстрагирования ЛРС двухфазной системой экстрагентов, а также исследовать влияние природы и соотношений экстрагентов на процесс двухфазной экстракции для выделения комплекса БАВ

6 Изучить особенности и выявить закономерности экстрагирования БАВ из различных видов лекарственного растительного сырья и установить факторы, влияющие на эффективносгь процесса

7 Разработать технологические режимы комплексной переработки различных видов ЛРС и показать возможности практического использования метода двухфазной экстракции

8 На основании анализа теоретических и экспериментальных исследований разработать методологические основы создания ресурсосберегающих технологий лекарственных средств растительного происхождения

Научная новизна

Впервые изучены особенности потребления компонентов питания при выращивании различных штаммов раувольфии на агаризованных и жидких питательных средах При этом установлена динамика их накопления в биомассе, чю позволило осуществить направленную регуляцию биосинтеза алкалоидов путем дополнительного введения в среду компонентов питания

В результате проведения комплекса фотохимических и биотехнологических исследований получена суспензионная культура раувольфии змеиной Установленные маркерные признаки (физиологические, фитохимические, биохимические) позволили охарактеризовать культуру как штамм Я-Ш Но-

визна выполненных разработок подтверждена авторским свидетельством на штамм

Разработан алгоритм получения высокопродуктивных клеточных линий и посевного материала культуры растительных тканей, заключающийся в отборе клонов с ускоренным ростом, что позволило, на примере культуры раувольфии змеиной выделить производственный штамм-продуцент (К-27) с увеличением содержания аймалина в 2,5 раза Определены основные фотохимические, цитологические и биохимические показатели, характеризующие штамм, составлен паспорт, и штамм депонирован во Всероссийской коллекции клеточных культур высших растений за коллекционным № ВСКК-ВР-30-87 Приоритет полученных результатов подтвержден авторскими свидетельствами на штамм и его способ получения

Впервые проведенные комплексные исследования позволили выявить взаимосвязь формирования анатомо-морфологической структуры клеточных компонентов с процессами дыхания и роста тканей растений и определить наиболее интенсивные периоды биосинтеза вторичных метаболитов в пассаже

В технологии фитопрепаратов теоретически и экспериментально обоснован новый способ комплексной переработки JIPC, позволяющий на основе целенаправленного выбора экстрагентов в одной стадии извлекать сумму как липофильных, так и гидрофильных БАВ и существенно повысить эффективность технологических процессов и качество получаемых препаратов

Установлены общие закономерности и индивидуальные особенности процесса экстракции двухфазной системой экстрагентов (ДСЭ) различных видов сырья, отличающегося анатомо-морфологическим строением и природой БАВ (трава зверобоя и сушеницы, цветки календулы и ромашки, плоды рябины и шиповника, а также бурые водоросли)

Впервые изучено влияние состава ДСЭ на эффективность процесса экстракции С применением методов математического планирования эксперимента установлено, что наиболее значимыми факторами, влияющими на перенос липофильных веществ в масляную фазу при двухфазной экстракции, являются соотношение объемов водно-органической и масляной фаз и природа полярной фазы

Впервые установлена возможность использования липофильных суп-позиторных основ для извлечения БАВ из JIPC в составе двухфазных систем экстрагентов и показано, что по экстрагирующей способности твердые жиры не уступают жидким растительным маслам

Впервые показана перспективность двухфазной экстракции J1PC в присутствии поверхностно активных веществ (ПАВ) При этом установлено, что степень извлечения липофильных БАВ при экстракции ДСЭ зависит от значения гидрофильно-липофильного баланса и состава вносимой в систему смеси эмульгаторов, что позволяет, создавая определенное соотношение используемых ПАВ, осуществлять направленный процесс экстрагирования комплекса БАВ

Разработан алгоритм создания ресурсосберегающей технологии лекарственных средств растительного происхождения Предлагаемая методология обосновывает объединение всех этапов технологического процесса в единую цепь и может быть рекомендована как типовая

Практическая значимость

Предложена комплексная технология выращивания биомассы промышленного штамма-продуцента, оценки качества и последующей переработки с выделением субстанции БАВ, позволившая в дальнейшем разработать лекарственный препарат В производственных условиях на ХПХФО «Здоровье» (г Харьков) и НПК «Биофарм» (г Казань) доказана эффективность разработанной технологии, которая включена в регламент на производство биомассы раувольфии змеиной В настоящее время NTTAB из биомассы раувольфии змеиной (штамм ВСКК-ВР-30-87) разрешен Фармакологическим Комитетом к медицинскому применению и утверждена НД для его промышленного выпуска ФСП 42-0166-181701 на субстанцию NIIAB (про-малин), ФС (Т) 42-0075-01 на №1АБ-стандарт и ФСП 42-0166-186801 на таблетки NIIAB (промалина) 0,02 г, покрытые оболочкой

Для совершенствования метода выращивания биомассы с использованием штамма К-27 впервые разработана технология его культивирования в полиэтиленовых пакетах В производственных условиях показана эффективность этого способа выращивания, позволяющая снизить себестоимость биомассы на 15%

В результате оптимизации процесса экстрагирования аймалина из биомассы и очистки ионообменным методом увеличен выход фармакопейного продукта на 24% по сравнению с экстракционным методом Установлена возможность использования технического аймалина для синтеза NIIAB Из биомассы раувольфии змеиной наработан аймалин по ионообменной технологии и NIIAB Показатели качества полученных субстанций соответствовали требованиям НД Составлен лабораторный регламент на получение аймалина ионообменным методом

Разработана технология ресурсосберегающей комплексной переработки сырья с применением двухфазной системы экстрагентов (ДСЭ), позволяющая достигать 85-90% выхода липофильных БАВ, что в 2-8 раз больше, чем при моноэкстракции Выход гидрофильных БАВ составляет 60-70%, что сопоставимо с экстракцией водно-спиртовыми экстрагентами При этом длительность процесса экстракции сокращается в 1,5 -2 раза

Составлены типовые технологические схемы получения фитопрепаратов методом двухфазной экстракции Полученные этим методом масляные и водно-органические экстракты из различных видов ЛРС используются в промышленном производстве лечебной косметики (ХБО при РАН «Фирма «Вита», ОАО «Фармацевтическая фабрика Санкт-Петербурга»)

Разработана технология двухфазного экстрагирования JIPC компонентами суппозиторных основ с получением жировых экстрактов с высоким содержанием липофильных БАВ, которые могут быть использованы как суппо-

зиторные массы Показано противовоспалительное действие жирового и вод-но-пропиленгликолевого экстрактов из смеси травы зверобоя, цветков ромашки и цветков календулы Составлены проекты ФСП на водно-пропиленгликолевый экстракт и на суппозитории на основе жирового экстракта из смеси ЛРС

Разработан новый метод комплексной переработки сухого сырья бурых водорослей экстракцией ДСЭ, позволяющий получать в одном технологическом процессе масляный экстракт, маннит и альгинат натрия Способ защищен патентом и используется на НПФ «Фаркос»

Установленные закономерности экстрагирования растительного сырья двухфазной системой экстрагентов используются в научно-исследовательской работе, проводимой на кафедрах технологии лекарств и фитопрепаратов Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (СПГХФА) и технологии лекарств Пятигорской государственной фармацевтической академии (ПГФА)

Результаты выполненной работы используются в учебном процессе СПГХФА, ПГФА, Казанского государственного медицинского университета при изучении дисциплин «Биотехнология растительных тканей», «Химия и технология фитопрепаратов», «Фармацевтическая технология» и «Биотехнология» по специальностям 240901 «Биотехнология» и 060108 «Фармация», а также при обучении слушателей и интернов на факультете дополнительного профессионального образования (ФДПО) СПГХФА

Результаты научных исследований использованы при подготовке учебных пособий «Биотехнология растительных тканей» СПб, 2003, «Химия и технология фитопрепаратов», М , 2004, рекомендованного УМО по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для системы послевузовского профессионального образования провизоров.

Практическое использование результатов работы подтверждено соответствующими публикациями и Актами о внедрении

Публикации

По теме диссертации опубликовано 50 научных работ, из них 13 статей в журналах, рецензируемых ВАК, 4 авторских свидетельства СССР на изобретение и 1 патент РФ

Апробация работы

Основные результаты диссертационнои работы прошли апробацию на Международной конференции «Культура растений и биотехнология» (Кишинев, 1983), Международной конференции «Биология культивируемых клеток и биотехнология» (Новосибирск, 1988), Международного симпозиума «Проблемы и перспективы биотехнологии» (Братислава, 1989), Всесоюзной конференции «Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток» (Новосибирск, 1991), научной конференции «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1992), Международной конференции «Биология куль-

тивируемых клеток растений и биотехнология» (Алма-Ата, 1993), International Conference "Biotechnology St Petersburg'94", (Санкт-Петербург, 1994), научном семинаре «Фундаментальные основы диагностики состояния человека» (Санкт-Пегербург, 1994), Всероссийской научной конференции, посвященной 50-летию Академии медицинских наук «Актуальные вопросы медицины» (Москва, 1994), Всероссийской научной конференции «Химия и технология лекарственных веществ» (Санкт-Петербург, 1994), симпозиуме «Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология» (Москва, 1997), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1997, 1999, 2004), Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 1997), Международной научно-практической конференции «Биологически активные вещества в косметике» (Москва, 1999), Международной конференции «Фармация в XXI веке инновации и традиции» (Санкт-Петербург, 1999), Международном сьезде «Актуальные проблемы создания новых препаратов природного происхождения» (2000, 2002, 2003, 2004), Международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище XXI век» (Санкт-Петербург, 2000), Международной научно-практической конференции, посвященной 85-легию СПХФА «Выпускник фармацевтического вуза (факультета) в прошлом, настоящем и будущем» (Санкт-Петербург, 2004), научно-методической конференции «Состояние и перспективы подготовки специалистов для фармацевтической отрасли» (Санкт-Петербург, 2004), IX Международном съезде «Фитофарм 2005» (Санкт-Петербург, 2005), II Всероссийском съезде фармацевтических работников (Сочи, 2005), Межрегиональной конференции Пятигорской фармацевтической академии (Пятигорск, 2004, 2005,2006)

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Исследования проводились в соответствии с планами НИР СПГХФА по проблеме «Фармация»

Работы по совершенствованию технологии биомассы раувольфии змеиной и созданию противоаритмических препаратов на ее основе являлись частью исследований, выполняемых по целевой комплексной программе «Биотехнология» (№ roc per О Ц 043), утвержденной Госпланом, ГКНТ и АН СССР

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 8 глав экспериментальных исследований, выводов, списка литературы и приложений Работа изложена на 411 страницах машинописного текста, в т ч содержит 78 таблиц и 79 рисунков Список литературы включает 521 источник

Основные положения, выносимые на защиту

Результаты комплексного исследования по установлению закономерностей при выращивании культуры тканей растений, связанных с формированием анатомо-морфологической структуры клеточных компонентов, процессами дыхания, питания и роста штамма К-27, влияющими па биосинтез алкалоидов, позволившие определить временные этапы, в течение которых активизируются биосинтетические процессы

Технология целенаправленного обогащения тканей БАВ, позволившая увеличить содержание аймалина в 2,5 раза по сравнению с исходной культурой раувольфии змеиной Новый способ выращивания клеток растений на примере раувольфии змеиной в полиэтиленовых пакетах, позволивший снизить себестоимость биомассы на 15 %

Усовершенствованный метод выделение аймалина из биомассы, позволивший увеличить выход на 24 %, по сравнению с внедренной в производство технологией Возможность использования технического аймалина, полученного с применением ионообменного метода очистки, для синтеза N11АБ, по показателям качества удовлетворяющего требованиям НД

Результаты теоретического и экспериментального исследования и установленные закономерности процесса экстрагирования лекарственного растительного сырья, отличающегося анатомо-морфологическим строением и содержащего различные группы БАВ, двухфазными системами экстрагентов, имеющими в своем составе в качестве полярной фазы водно-органические (в тч водно-спиртовые) смеси, а в качестве масляной фазы - растительные, минеральные масла и жиры Результаты экспериментального изучения процесса экстрагирования ЛРС двухфазными системами экстрагентов в присутствии поверхностно-активных веществ, позволяющие осуществлять направленный процесс извлечения комплекса действующих веществ

Теоретическое и экспериментальное обоснование и создание технологии комплексной переработки сухого сырья бурых водорослей, в результате которой были получены альгинат натрия, маннит и новый продукт - масляный экстракт водорослей Обоснование и создание технологии суппозиториев на основе жировых экстрактов, полученных методом двухфазной экстракции ЛРС суппозиторными основами

Методологические основы создания ресурсосберегающих технологий лекарственных средств растительного происхождения

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1 Обзор литературы

Обзор литературы посвящен рассмотрению современных направлений развития производства фитопрепаратов, методов экстрагирования БАВ из лекарственного растительного сырья с целью получения экстракционных препаратов Показана эффективность использования некоторых видов ЛРС и их комбинаций для создания фитосуппозиториев, как перспективной лекарственной формы Обсуждена возможность применения биотехнологических способов для получения фитосырья, обогащенного целевым продуктом Проанализированы актуальные вопросы комплексной переработки ЛРС, что по-

зволило обосновать создание новых технологий получения БАВ в производстве лекарственных средств растительного происхождения 2 Материалы и методы исследования

Совершенствование технологии индивидуальных препаратов с использованием биотехнологических способов получения фитосырья проводили в основном на примере культуры ткани раувольфии змеиной (Rauwolfia serpentina Benth)

Для выявления особенностей и закономерностей процесса экстрагирования ДСЭ в качестве модельных объектов использовано сырье, широко заготавливаемое и применяемое в производстве фитопрепаратов, по показателям качества соответствующее требованиям ГФ

Для идентификации, разделения и количественного определения БАВ использовали различные химические, спектральные и хроматографические методы анализа Соответствие аймалина и МТАБ показателям качества НД подтверждено с помощью ВЭЖХ, УФ и ИК-спектроскопии Определение кислотных и перекисных чисел масляных, жировых экстрагентов и извлечений проводили в соответствии с требованиями ГФ XI и ЕР 4-th Edn Стабильность масел и масляных экстрактов исследовали методом «ускоренного старения» при повышенной температуре Температуру плавления и затвердевания суппозиториев определяли по методикам ГФ XI Для определения твердости суппозиториев использовали прибор ТВ-24 Erweka (Германия) Содержание ионов в питательной среде и биомассе определяли с использованием потенциометрического, спектрофотометрического и атомно-абсорбционного методов анализа Интенсивность темнового дыхания определяли по скорости выделения С02 в условиях закрытой системы газообмена с использованием инфракрасного газоанализатора ГИАМ-5М (Быков, 1997) Для выявления ультраструктурных особенностей клеток использовали электронно-микроскопический метод ультратонких срезов, которые готовили на ультратоме LKB 8800 (LKB, Швеция) и просматривали в просвечивающем электронном микроскопе JEM-100C (JEOL, Япония) (Hayat, 1974, Миронов и др , 1994, Рыбальченко, 2000)

При постановке и проведении исследований применяли методы мате-матико-статистического планирования экспериментов Результаты исследований обрабатывали с использованием математической статистики с установлением регрессионных связей между технологическими факторами и выходными параметрами Корреляционный и факторный анализы проводили с использованием пакета прикладных программ Statgraphics и Microsoft Excel для персонального компьютера

3 Разработка технологии целенаправленного обогащения БАВ биомассы растений

3.1 Получение промышленного штамма ткани раувольфии змеиной - продуцента аймалина

Основным этапом разработки технологии биомассы ткани растений является получение высокопродуктивных штаммов-продуцентов Использова-

ние таких штаммов повышает рентабельность и конкурентоспособность клеточных биотехнологий для получения ценных фармакологически активных продуктов растительного происхождения

Данный комплекс исследований проведен на примере культуры ткани раувольфии змеиной - продуцента аймалина, который применяется как препарат противоаритмического действия и наиболее эффективен при хронических желудочковых экстрасистолиях и нарушениях ритма, осложняющих инфаркт миокарда, и обладает менее выраженным побочным действием по сравнению с другими препаратами (Шпектор, 1991, Аганов и др , 2000) Дефицит импортного сырья раувольфии не позволил наладить промышленный выпуск аймалина и его производных

Альтернативным решением проблемы дефицита сырья стало использование биомассы раувольфии змеиной, получаемой биотехнологическим методом (Воллосович, 1992; Николаева, 1993)

Первичное содержание аймалина в диком штамме раувольфии змеиной было небольшим - (0,02 - 0,04)% (Воллосович, Бутенко, 1970) В последующем, в результате обработки культуры мутагеном (азотистым ипритом) и выращивания полученных мутантных линий на средах с исключением стимуляторов роста была выделена клеточная линия А (Ковалева и др , 1972, Воллосович НЕ и др, 1976) с содержанием аймалина (0,36 - 0,45)%, которая и явилась объектом наших исследований Содержание аймалина в корнях импортного сырья колеблется от 0,2 до 1,6% в зависимости от природных условий произрастания (^акЫоо, 1962)

С целью получения высокопродуктивного штамма ткани раувольфии змеиной, продуцента аймалина из популяции, обработанной мутагеном (эти-ленимином), с нижним пределом накопления алкалоидов группы индолина 0,83% была выделена клеточная линия, завершавшая ростовой цикл на 45 сутки, тогда как исходная линия А завершала рост на 60 сутки (Воллосович, Каухова, Куклин, 1984)

В результате изучения качественного состава алкалоидов методом ТСХ было показано, что штамм К-27 синтезирует все алкалоиды, характерные для исходного штамма А

Проведенное фитохимическое и физиологическое изучение полученной клеточной линии, а также совместные с Институтом молекулярной биологии и генетики АН Украины цитологические и биохимические исследования позволили охарактеризовать ее как новый штамм К-27

На штамм К-27 был составлен паспорт и культура была депонирована во Всероссийской коллекции клеточных культур за № ВСКК ВР-30-87 На штамм К-27 и способ его получения были выданы авторские свидетельства (Куклин, Каухова, Воллосович и др , 1987, 1989)

3.2 Изучение влияния физиологических процессов клеток растительных тканей на их продуктивность

С целью выявления физиологических закономерностей развития тканей раувольфии змеиной, которые определяли бы наиболее интенсивные перио-

ды биосинтеза алкалоидов, нами установлены особенности потребления компонентов питания, процессов дыхания, а также изменения в структурной организации культуры клеток штамма К-27

Изучение влияния элементов минерального питания и процессов дыхания на биосинтетические свойства растительной клетки. Изучены особенности потребления ионов Са, К, N в аммонийной и нитратной форме, фосфат и сульфат ионов, как наиболее важных элементов питания, обладающих высокой регуляторной функцией в растительных клетках (Каухова, Титов и др., 1992, 1994) Установлено, что динамика их потребностей носит нелинейный характер Определена практически противоположная зависимость в потреблении ионов К и Са В первые 21-28 сут интенсивно потребляется К и незначительно Са2+, в последующем - Са2+ начинает интенсивно поглощаться, а К+ вымывается из биомассы (рис 1)

Установленные особенности потребления ионов К и Са симбатны динамике митотической активности клеток и накопления алкалоидов (рис 2) Именно в первые 20-28 сут наблюдается интенсивное деление клеток, а после 40 суток - начинается синтез алкалоидов

Рисунок 1 - Содержание ионов калия (1) и кальция (2) в биомассе в зависимости от времени культивирования ткани раувольфии змеиной

Время культивирования, сут

- 600

400

5 о

20 40 60

Время культивирования, сут

0 14 28 42 56 70 Время культивирования, сут

1 - сухая биомасса, 2 - алкалоиды группы индолина Рисунок 2 - Динамика митотической активности, накопления сухой биомассы и алкалоидов группы индолина культурой ткани раувольфии змеиной

Анализ данных литературы о колебании содержания алкалоидов в течение развития растения и полученные нами результаты позволяют говорить о сходстве влияния процессов питания на синтез алкалоидов m vivo и хп

vitro, а также закономерности в обмене ионов клетками с окружающей средой

При изучении особенности потребления ионов Mg2+, S042", Р043 и N в аммонийной и нитратной форме из питательной среды тканью в различные периоды ее развития установлено, что основное их количество потребляется тканью к 35-40 суткам роста

Исходя из полученных результатов по потреблению компонентов питания, был разработан состав агаризованной питательной среды, на которую ткань пересевали на 35 сутки, при этом было достигнуто увеличение выхода индолиновых алкалоидов на 15-20%

Закономерности, установленные для штамма К-27, выявлены и для штамма А при разработке технологии его глубинного культивирования (Кау-хова, 1982) В результате изучения динамики потребления компонентов питания на 9 сутки были добавлены растворы минеральных солей, что позволило увеличить ростовой индекс культуры в 1,9 раза, содержание алкалоидов группы индолина в 2 раза

При изучении процесса дыхания нами показано, что интенсивность дыхания на единицу биомассы и субстрата в первые 7-14 сугок максимальна (рис 3), что коррелирует с динамикой митотической активности клеток Интенсивность процессов митотического деления обусловливает дополнительные затраты энергии, а расходование энергии АТФ служит сигналом для интенсификации процессов его синтеза, основным источником которого является темновое дыхание Затем по мере роста, дыхательная способность культуры уменьшается, достигая своего минимального значения к 70 суткам, что соответствует началу фазы старения культуры

5 и. я.чп -

—------Т*-------

Полученные результаты в последующем были использованы при разработке экспресс метода отбора посевного материала

Исследование влияния ультраструктурных изменений в клетках на их продуктивность.

Электронно-микроскопический анализ штамма К-27 выявил значительные морфологические отличия в клетках на разных этапах развития культуры Основную массу ткани составляют паренхимные клетки двух морфологических типов овальные, средних размеров, около 10 мкм шири-

Рисунок 3 - Изменение интенсивности дыхания ткани рау-вольфии змеиной в пассаже

О 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70

Время культивирования, сут

ной и около 70 мкм длиной, и округлые - от 20 до 150 мкм в диаметре, процентное содержание которых увеличивалось в пассаже

На ранних стадиях ростового цикла (7-14 сут) основную массу каллус-ной ткани составляли овальные клетки, ультраструктурная организация которых, в большей степени, чем округлых, была насыщена органеллами, что свидетельствовало о высоком уровне физиологической активности клеток на данном этапе развития культуры

Однако к 40 - 42 суткам клеточные структуры были представлены, в основном, белково-рибосомальным компонентом, находящимся в состоянии разреженности, что говорит о некотором снижении уровня метаболической активности На данном этапе развития культуры в наиболее крупных округлых клетках, находящихся, как правило, в верхних и нижних слоях ткани, где эти клетки составляли основную часть биомассы, отмечалось повышенное содержание полисахаридов Форма и размеры амилопластов варьировали (от 3 до 25 мкм) В отдельных случаях они были полностью заполнены крахмальными зернами Крупные зерна имели сложное сегментарное строение, в то время как мелкие крахмальные зерна представляли собой целостные структуры

С увеличением возраста культуры наблюдается смещение процессов биосинтеза в сторону образования вторичных метаболитов Единичные ами-лопласты на 70 - 75-сутки можно было встретить лишь в крупных округлых клетках Следует отметить, что для других штаммов раувольфии змеиной также отмечено накопление алкалоидов в клетках, не содержащих крахмал (Воллосович, 1992)

Полученные результаты позволили определить основные технологические параметры, необходимые при промышленной наработке биомассы как ЛРС Пересев культуры в качестве инокулюма следует проводить в период, когда накопление ее наибольшее, а полное истощение питательной среды не произошло, т е не позднее 40-42 суток Съем биомассы целесообразно осуществлять не позднее 70 суток К этому времени происходит замедление физиологических функций клеток, наблюдается уменьшение прироста биомассы, ИД снижается до минимума

4. Разработка технологии выращивания биомассы раувольфии змеиной (штамм К-27)

4.1 Оптимизация параметров культивирования штамма К-27

Была изучена зависимость влияния на продуктивность культуры таких параметров культивирования, как возраст и количество посевного материала, объем питательной среды, поскольку их оптимальные значения определяют технико-экономические показатели разрабатываемых технологий

Как видно из полученных результатов, возрастание объема питательной среды от 110 мл до 160 мл ведет к увеличению выхода биомассы Однако, при этом продуктивность культуры по накоплению алкалоидов достоверно уменьшается, что можно объяснить ухудшением условий дыхания куль-

туры с увеличением слоя массы ткани в сосуде для культивирования (рис 4 1а)

Увеличение количества инокулюма от 2,5 г до 10 г на 120 мл существенно не влияло на продуктивность культуры (рис 4 16) Следует отметить, что наиболее стабильные результаты по росту культуры были получены при постоянном ее пассировании инокулюмом в 4-5 г на 120 мл среды

Продуктивность культуры в зависимости от возраста посевного материала оценивали в динамике развития культуры Полученные данные, представленные на рис 4 1 в, показывают, что лучшие результаты по накоплению алкалоидов отмечены при использовании для посева ткани, выращиваемой в течение 38-40 суток

а б

600

500 -

Ё 400 -'

300

с ™

б г

о , s

4 ю

Ц 60

30 -

/Г

J„ т

- 1,8

1 4

^ 2 о.

о в. 5 О. С

100 120 140 160 180 Объем питательной среды, мл

Продуктивность -♦- Прирост биомассы

0 2 4 6 8 10 12

Величина инокулюма, г

-*>-Накопление алкалоидов, %

Прирост биомассы, г/сосуд

800

700

ь-

о о 600

а s с 500

h f 400

о о. 300

200

100

5 Возраст посевного

■ материала

* \ 2 ♦ (1) -30-37 сутки

V/2 ♦ * 4 1 ■ (2) -44 47 сутки

/ * w к Д 3 л (3) - 51-58 сутки

ж (4) 65 сутки

V • (5)-38-40 сутки

Рисунок 4 - Зависимость накопления биомассы и алкалоидов от параметров культивирования штамма К-27

35 45 55 65 75 85 95 105 Время культивирования, сутки

Оптимизация параметров культивирования позволила увеличить продуктивность ткани раувольфии змеиной в 2,5 раза по сравнению с исходной культурой - штаммом А и сократить сроки культивирования на 10-15 суток (табл 1), что в условиях промышленного производства дает значительный экономический эффект.

Разработанная нами технология культивирования штамма К-27 легла в основу промышленного регламента на получение биомассы раувольфии змеиной — штамм К-27 - сырья для выделения аймалина при организации производства на ХПФО «Здоровье»

Таблица 1 - Сравнительная продуктивность штаммов А и К-27 ткани рау-

вольфии змеиной

~ -——________ Штамм Показатель --- Штамм А Штамм К-27

Время культивирования, сут 70-75 60-65

Накопление биомассы, г/л 35-40 44,5-50,0

Продуктивность по индолиновым алкалоидам, мг/л 400-420 1000-1250

Накопление аймалина, в пересчете на абсолютно сухое сырье, % 0,36-0,45 не менее 0,9

4.2 Методы «поддерживающего» отбора штаммов-продуцентов

Использование клеток растений продуцентов БАВ может быть про-мышленно реализовано только в том случае, если они будут обладать стабильной продуктивностью, гарантирующей стандартность биомассы, как лекарственного растительного сырья Поэтому необходимым является не только увеличение продуктивности культур, но и ее сохранность на достигнутом уровне

Нами выявлена определенная зависимость выхода алкалоидов от уровня плоидности клеток раувольфии змеиной, что дает возможность регулировать процессами вторичного метаболизма и получать новые клеточные линии и штаммы Приоритет полученных научных результатов подтвержден авторским свидетельством на способ управления продуктивностью культуры тканей на примере раувольфии змеиной путем изменения уровня плоидности клеток (Кунах, Каухова и др , 1985)

При получении штамма К-27 был разработан и успешно использован отбор тканей по признаку «скорость роста», который, как нами было установлено, прямо связан с уровнем накопления алкалоидов Для массового отбора посевного материала и поддержания тканей в коллекции в промышленных условиях был разработан экспресс-метод на основании результатов изучения процессов дыхания штамма В основу метода положен отбор культур с ускоренным ростом в первые 7-10 суток выращивания, что, как показали наши исследования, соответствует наибольшей интенсивности дыхания культуры на единицу биомассы Указанный метод позволил уменьшить длительность стадии отбора посевного материала в 4 раза, сократить период наработки биомассы на 7 суток (рис 5)

С целью определения стабильности штамма К-27 при поддержании его в коллекции было проведено изучение развития культуры в пассаже Установлено, что штамм характеризуется устойчивым показателем по накоплению биомассы (рис 6)

Таким образом разработка способа поддерживающего отбора культуры в коллекции позволила получать биомассу со стандартными показателями Применение такого отбора обеспечивает стабильность штамма в течение длительного времени

А V !

1 1

Г , ! I

О 10 20 30 40 50 60 70 80 Время культивирования, сут

10 20 30 40 50 60 70 8С Время культивирования, сут □ 1984г ♦ 1997г * 2005г

Рисунок 5 - Влияние отбора на про- Рисунок 6 - Стабильность штамма К-27 дуктивность штамма К-27 по накоплению биомассы

1 - продуктивность штамма К-27 до поддерживающего отбора,

2 - продуктивность штамма К-27 в результате поддерживающего отбора

Разработана технологическая схема производства биомассы культуры раувольфии змеиной (рис 7)

ТП 4 1 Поддержание тканей в коллекции

ТП 4 2 Отбор посевного материала

ТП4 3

Выращивание посевного материала и коллекции

ТП 5 1

Пересадка тканей на наработку биомассы

ТП 5 2

Выращивание тканей

ТП 5 3

Съем сырой биомассы

ВР 1 Подготовка воды

ВР 2 Подготовка производства

тпз Кх,Кмб,Кт Приготовление и стерилизация питательных сред

ТП 4 Кх,Кмб,Кт Потуче териала коллект ние посевного маи поддержание ИИ

ТП 5 Кх,Кмб,Кт Наработка сырой биомассы

•

ТП 6 Кх,Кт Сушка биомассы

УМ0 7 Кх.Кт.Кмб Фасовка, маркировка, упаковка

Отходы

гп

Кх, Кт, Кмб - контроль химический, технологический, микробиологический соответственно Рисунок 7 - Технологическая схема производства биомассы культуры ткани растений

Апробация полученного алгоритма культивирования на других штаммах-продуцентах (женьшень, родиола розовая) позволяют рассматривать ее как типовую для получения биомассы изолированных тканей растений

5 Разработка высокоэффективных способов выращивания биомассы растительных тканей

5.1 Культивирование ткани раувольфии змеиной в жидких питательных средах

На современном этапе развития методов глубинного и суспензионного культивирования изолированных клеток растений разработаны разные режимы проточного непрерывного культивирования - открытого и закрытого, а также комбинации проточного и периодического, позволяющие осуществлять направленное культивирование изолированных клеток растений Однако, как показывают результаты исследований, длительное культивирование тканей растений в проточном режиме с относительно высокой скоростью протока неустойчиво, при этом в ряде случаев происходит самопроизвольная гибель популяции (Кандраков и др , 1994, Орешников и др , 1994) Кроме того, при хемостатном культивировании происходит в основном отбор клеток с окологаплоидным набором хромосом. Возможно это связано с их более быстрым размножением, поскольку в таком режиме выращивания идет отбор клеток с максимальным уровнем пролиферации Нами же выявлена для штаммов раувольфии змеиной прямая связь между продуктивностью и уровнем плоидности клеток (Каухова, 1982), поэтому для данной культуры наиболее эффективным является способ периодического культивирования в накопительном режиме

Первым этапом в разработке технологии глубинной культуры раувольфии змеиной явилась оптимизация состава питательной среды для культивирования (Каухова, 1982) Как показали дальнейшие исследования, эта среда, названная РЖ, оказалась наиболее эффективной и продуктивной при осуществлении генетико-селекционных работ по получению высокопродуктивных штаммов и клонов раувольфии змеиной.

В результате селекции одновременно по трем признакам - степени аг-регированности, скорости роста и накопления алкалоидов была получена суспензионная культура раувольфии змеиной - новый штамм - ЯIII, который к 40-50 суткам культивирования накапливал суммы алкалоидов 1,35-1,45 % Содержание алкалоидов группы индолина составляло 0,35-0,82 %, из них на долю аймалина приходилось 73-90 %, что составляло 0,28-0,58 % от сухой массы клеток Выход алкалоидов в среду был незначителен и составлял 0,03 %, то есть не более 10 % от накапливаемых в биомассе На штамм был составлен паспорт, получено авторское свидетельство и штамм задепонирован в Коллекции клеток высших растений (Кунах, Каухова и др , 1987) Предложенные подходы позволили выделить высокопродуктивный суспензионный штамм II31 (Кунах с соавт, 2001)

Таким образом, нами установлена возможность получения суспензионной культуры раувольфии змеиной, как перспективной модельной системы

для проведения генетико-селекционных исследований, направленных на выделение высокотехнологичных штаммов-продуцентов БАВ

5.2 Масштабирование технологии выращивания штамма К-27

С целью совершенствования и масштабирования технологии выращивания каллусных тканей растений нами исследована возможность культивирования штамма К-27 в полиэтиленовых пакетах Культивирование штамма проводили на агаризованных и жидких питательных средах Разработана лабораторная стендовая установка, позволяющая выращивать биомассу сразу в нескольких пакетах с увеличением площади культивирования более, чем в 5 раз и осуществлять направленный синтез путем дробной подачи компонентов питания в течение ростового цикла Апробация технологии в опытно-промышленных условиях позволила снизить проектную себестоимость биомассы на 15%

Из наработанных в опытно-промышленных условиях партий биомассы был выделен аймалин, по показателям качества соответствующий требованиям НД

6 Разработка методов выделения и очистки аймалнна из биомассы раувольфии змеиной в технологии N-(4)- пропилаймалин бромида

Экстракционный метод выделения аймалина из биомассы раувольфии змеиной, апробированный в промышленных условиях на ХПФО «Здоровье», позволяет достичь выход только 45% (Харьков, 1992) Кроме того, к недостаткам этого способа получения аймалина, следует также отнести использование больших объемов органических растворителей, таких как хлороформ, толуол, н-бутанол, что существенно ухудшает условия труда и технику безопасности Исходя из выше изложенного становится актуальной разработка технологии аймалина, которая отличалась бы экономичностью и обеспечивала бы достижение большого выхода целевого продукта

В процессе разработки технологии с использованием методов математического планирования по Боксу-Уилсону на стадии экстрагирования аймалина из биомассы методом перколяции было исследовано влияние на выход ряда технологических факторов время настаивания, скорость вытеснения, измельченность сырья, соотношение массы сырья и объема сливаемой вытяжки Определены оптимальные значения этих параметров процесса, позволившие достичь выход по индолиновым алкалоидам - 98,9%, по аймалину -96,7% от содержания в сырье

Для решения задачи исключения из технологии аймалина стадии очистки с применением значительных количеств органических растворителей нами был использован ионообменный метод, применяемый для выделения и очистки ряда алкалоидов из растительного сырья В результате сравнительного изучения нами был выбран полимерный сильнокислотный сульфока-тионит КУ-2-8

При разработке технологии ионообменной очистки аймалина установлен гелевый механизм кинетики ионного обмена аймалина на катионите КУ-

2-8 Показано, что лимитирующей стадией процесса является диффузия ай-малина в зерно сульфокатионита, рассчитан эффективный коэффициент диффузии При исследовании зависимости равновесных параметров сорбции от рН раствора установлено, что уже при рН~4,0 наблюдается высокая сорб-ционная емкость катионита в отношении алкалоида, что, по-видимому, соответствует наибольшей степени диссоциации молекул аймалина, имеющего рКа=8,15 В нейтральной среде происходит резкое понижение сорбционной емкости, связанное с переходом алкалоидов в неионизированное состояние Включение стадии очистки извлечения, полученного при экстрагировании биомассы, позволило увеличить величину сорбционной емкости катионита в 5 раз Сорбцию аймалина на КУ-2-8 проводили из очищенной водной вытяжки при значении рН=4,5 со скоростью 50 см3/ч см2 до проскока аймалина, который определяли по специфической качественной реакции с концентрированной азотной кислотой Выходная кривая сорбции представлена на рис 8а Затем колонку промывали 85% этиловым спиртом и осуществляли процесс десорбции 2% раствором аммиака в 85% этиловом спирте На рис 86 представлена кинетика десорбции аймалина с катионита КУ-2-8, из которой видно, что происходит полная десорбция аймалина в условиях его перехода в неионизированную форму

а)

С|/Со

б)

С, мг/мл

V, мл

Рисунок 8 - Выходные кривые сорбции (а) и десорбции (б) аймалина на катионите

КУ-2-8

Для выделения аймалина по разработанной технологии были взяты партии сырья, выращенные в различных условиях (табл 2)

Выход аймалина технического по ионообменной технологии с использованием смолы КУ-2-8 составил 87% Содержание аймалина в техническом продукте - 77% После очистки технического аймалина (выход на стадии 85%) общий выход фармакопейного аймалина составил 69%, т е на 24% выше по-сравнению с ранее предложенной технологией

Аймалин, полученный по ионообменной технологии, по показателям качества соответствует требованиям НД, методом ВЭЖХ показано, что содержание аймалина в очищенном препарате составляет 99,55% Разработана технологическая схема (Приложение А) и составлен лабораторный регламент на получение аймалина ионообменным методом.

На основе субстанции аймалина синтезирован по технологии, разработанной Мининой С.А с сотр (1995), N-(4)- пропилаймалин бромид (МТАБ),

по показателям качества соответствующий требованиям НД Установлено, что для получения ШТАБ может быть использован технический аймалин, выделенный по ионообменной технологии, при этом общий выход составляет 72%

Таблица 2 - Показатели качества биомассы раувольфии змеиной (штамм К-27)

Условия культивирования Содержание, в % к массе абсолютно-сухого вещества

Влаги Общей золы Суммы индолино-вых алкалоидов Аймалина

В стеклянных бутылях, емкостью 250 см3 (в условиях лаборатории СПХФА)* 11,18±0,22 3,15±0,05 1,484-0,04 1,12±0,06

В стеклянных бутылях, емкостью 250 см3 (ПО «Здоровье»)* 8,28±0,20 3,67±0,06 1,40±0,04 1,07±0,05

В полиэтиленовых пакетах, емкостью 1400см3 (в опытно-промышленных условиях ЭПП «Экое»)* 12,06±0,24 3,32±0,06 1,32±0,04 1,044:0,05

*-количество серий п=5

В настоящее время утверждена НД на производство индивидуального препарата ШТАБ на основе аймалина из биомассы раувольфии змеиной (Штамм ВСКК-ВР №30) ФСП 42-0166-181701 на субстанцию №1АБ (прома-лин), ФС (Т) 42-0075-01 на ЖГАБ-стандарт и ФСП 42-0166-186801 на таблетки Ж1АБ (промалина) 0,02 г покрытые оболочкой

Таким образом в технологии индивидуальных фитопрепаратов проведен комплекс исследований, позволивший выделить высокопродуктивный штамм, оптимизировать условия выращивания биомассы с последующим выделением субстанции с высоким выходом целевого продукта Предложенный алгоритм был апробирован на примере ткани раувольфии змеиной -ценного сырья для получения противоаритмических препаратов (аймалин и его производные) и может являться типовым для различных изолированных культур тканей лекарственных растений

7 Экстрагирование лекарственного растительного сырья двухфазными системами экстрагентов

При разработке ресурсосберегающих технологий и для повышения выхода целевых продуктов в производстве фитопрепаратов нами проведено изучение особенностей и выявление закономерностей способа экстрагирования ЛРС системой несмешивающихся растворителей различной полярности - двухфазной системой экстрагентов (ДСЭ) Наиболее важной особенностью так называемой «двухфазной экстракции» (ДЭ), отличающей ее от других

применяемых методов экстрагирования, является то, что в контакт с JIPC вступают сразу два экстрагента различной полярности, это позволяет за одну технологическую стадию извлекать комплекс как липофильных так и гидрофильных БАВ (Вайнштейн и др , 1999, Каухова и др , 1999, Каухова, 2006)

В качестве объектов и моделей для исследования было использовано JIPC, широко применяемое в производстве фитопрепаратов, заготавливаемое в больших объемах, содержащее различные группы БАВ и отличающееся анатомо-морфологическим строением зверобоя продырявленного трава, сушеницы топяной трава, календулы лекарственных цветки, ромашки аптечной цветки, шиповника плоды, рябины обыкновенной плоды, а также слоевища бурых водорослей, а также их смеси

В качестве неполярной фазы ДСЭ использовали масла (кукурузное, соевое, подсолнечное, персиковое, вазелиновое и касторовое), липофильные суппозиторные основы (твердые жиры), в качестве полярной фазы - водные растворы органических растворителей (этанол, пропиленгликоль, полиэти-ленгликоль, глицерин, диметилсульфоксид) различных концентраций

Методика проведения двухфазной экстракции заключается в следующем к JIPC, измельченному до оптимального, с учетом анатомической структуры, размера частиц, приливали водный и масляный экстрагенты в различных соотношениях При проведении двухфазной экстракции сырье настаивали с полярной фазой в течение предварительно установленного времени, необходимого для набухания Экстрагирование проводили методом мацерации при нагревании Затем смесь охлаждали до температуры 45-50°С и разделяли фазы В случае ДСЭ, содержащих твердые жиры, извлечения разделяли после затвердевания жировой фазы Для сравнения проводили моноэкстракцию ЛРС в аналогичных условиях

7.1 Изучение особенностей экстрагирования липофильных БАВ двухфазной системой экстрагентов

При исследовании процесса экстрагирования для всех изученных видов сырья было установлено значительное увеличение концентрации липофильных БАВ в масляных извлечениях при ДЭ по сравнению с экстракцией только маслом, для производных хлорофилла (ПХ) — в 4-8 раз и более, для суммы каротиноидов (СК) - в 1,5-2 раза При этом выход липофильных БАВ в масляные извлечения достигает в случае производных хлорофилла 85-90 % и суммы каротиноидов - 60-70% (рис 9)

Кроме того, методами УФ-спектроскопии и тонкослойной хроматографии было установлено расширение спектра экстрагируемых липофильных БАВ за счет извлечения более полярных производных хлорофилла (Иванова, Каухова и др , 2002, Каухова, 2006)

Выход ПХ, %

Выход СК,%

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

rin

трава зверобоя слоевища ламинарии

I Экстрагирование маслом □ Экстрагирование ДСЭ

производные хлорофилла (ПХ)

цветки цветки плоды плоды

ноготков ромашки рябины шиповника ■ Экстрагирование маслом а Экстрагирование ДСЭ

сумма каротиноидов (СК) Рисунок 9 - Выход лииофильных БАВ при экстрагировании ЛРС

растительным маслом и ДСЭ При изучении кинетики экстракции установлено, что скорость извлечения БАВ - маркеров в масляную фазу при ДЭ в 1,5-2 раз выше, чем при экстрагировании только маслом (рис. 10)

б | г*

_ О i-

5 о s

-слоевища ламинарии -

120 160

Время, мин -□-трава зверобоя

60 80 100 120 Время, мин

Рисунок 10 - Кинетика экстрагирования липофильных БАВ маслом (1) и ДСЭ (2)

Полученные результаты имеют важное практическое значение, тк именно в технологии масляных экстрактов трудно достигнуть высоких выходов БАВ, поскольку из-за высокой вязкости экстрагентов и малых коэффициентов диффузии скорость массообменных процессов и степень извлечения экстрактивных веществ в системе ЛРС - масло низка

Поскольку двухфазная экстракция ЛРС проводится при нагревании, нами было определено влияние температурного режима на эффективность извлечения БАВ и возможность их деструкции Установлено, что температурный оптимум процесса экстракции зависит от природы извлекаемых БАВ Повышение температуры до 80 - 85°С увеличивало выход и концентрацию ПХ в извлечениях из травы зверобоя, цветков ромашки, календулы, плодов шиповника и бурых водорослей и не вызывало деструкции

В масляной фазе извлечения из плодов рябины максимальное содержание каротиноидов достигается при 60±5°С При более высоких температурах

экстракции содержание каротиноидов снижается за счет окислительной деструкции.

В результате оптимизации процесса ДЭ с применением методов математического планирования установлено, что независимо от вида сырья наиболее значимыми факторами, влияющими на массоперенос липофильных веществ в масляную фазу, являются природа полярной фазы и соотношение объемов спирто-водной и масляной фаз

Влияние природы полярной фазы на выход липофильных БАВ

При изучении влияния полярной фазы на процесс ДЭ нами было установлено, что она способствует процессам внутренней и молекулярной диффузии, являясь не только десорбентом липофильных БАВ, но и их переносчиком из сырья в масляную фазу (МФ) (Каухова и др , 2004) При этом выход и концентрация липофильных БАВ зависят от соотношения воды и органического растворителя в составе полярной фазы Для липофильных БАВ разной природы (хлорофиллы, каротиноиды) существует определенное соотношение объемов этанола и воды, при котором в масляную фазу переходит наибольшее количество липофильных соединений С увеличением доли воды в спирто-водной фазе (СВФ) усиливаются процессы смачивания и набухания сырья, однако растворимость и десорбция липофильных веществ снижается При использовании спирто-водных смесей, в которых концентрация органического растворителя превышает оптимальную, растворимость липофильных веществ выше, но конечный выход их в масляную фазу снижается из-за меньшей сольватации растительного материала и уменьшения коэффициента распределения БАВ между фазами Для смеси травы зверобоя, цветков календулы и ромашки показано, что максимальная экстрагирующая способность ДСЭ достигается при использовании 70% этанола, что соответствует наибольшему значению коэффициента распределения ПХ между фазами, при этом содержание ПХ в спиртовой фазе не превышает 10% от общего количества извлекаемых БАВ (рис 11)

Концентра- 70 90 96

ция спирта

в СВФ, %

Кх 7,8±0,78 5,0±0,50 4,2±0,42

96 % 90 % 70 % 40 % 20 % спирт спирт спирт спирт спирт И Содержание ПХ в масляной фазе ■ Содержание ПХ в водно-спиртовой фазе □ Общее количество ПХ, извлеченных ДСЭ

Рисунок 11 - Зависимость количества ПХ (О), извлеченных ДСЭ, от концентрации спирта в СВФ (масляная фаза — кукурузное масло, соотношение ЛРС СВФ МФ 1 10 10)

Аналогичная закономерность выявлена при экстрагировании ДСЭ каротиноидов из плодов рябины и шиповника

При экстракции ДСЭ сырья бурых водорослей наибольшие выход и концентрация производных хлорофилла в масляной фазе получены при использовании в составе полярной фазы 90% этанола

В качестве полярной фазы в составе ДСЭ нами были использованы растворы таких полярных растворителей, как пропиленгликоль (ПГ), поли-этиленгликоль-400 (ПЭГ), глицерин и диметилсульфоксид (ДМСО), широко применяемых в качестве вспомогательных веществ в технологии готовых лекарственных форм На примере травы сушеницы и зверобоя установлено, что эти экстрагенты обладают высокой экстрагирующей способностью к БАВ гидрофильной природы, а, являясь полярной составляющей ДСЭ, увеличивают выход ПХ

Концентрации водных растворов, обеспечивающие максимальное извлечение производных хлорофилла для этанола, пропиленгликоля, глицерина и полиэтиленгликоля-400 составляют 70%, 80 %, 20 % и 40 %, соответственно. Исключение составляет диметилсульфоксид, который проявляет максимальную экстрагирующую способность в концентрации 100 %, что может быть объяснено его высоким растворяющим свойством к различным группам соединений и способностью диффундировать в клетку и десорбировать БАВ (рис 12) 100

этанол

пропиленгликоль -Д-глицерин -•-ПЭГ-400 -Ж- ДМСО

100

Рисунок 12 -Влияние полярной фазы на выход ПХ в масло при экстрагировании травы зверобоя

Концентрация органического растворителя в полярной фазе, %

Изучение влияния природы масляной фазы на эффективность двухфазной экстракции липофильных соединений

Изучение влияния природы масел на их экстрактивную способность показало, что триглицериды насыщенных, ненасыщенных, гидроксилсодер-жащих ВЖК и предельные углеводороды значительно различаются по количеству и спектру извлекаемых липофильных БАВ

Все исследованные масла при непосредственном экстрагировании ЛРС проявляют достаточно низкую извлекающую способность При двухфазной экстракции концентрация липофильных соединений в масле во всех случаях увеличивается

в 5 - 8 раз для производных хлорофилла ив 1,5—2 раза для каротиноидов (рис 10) При экстракции сырья только жидкими растительными и вазелиновым маслами извлекаемые из ЛРС количества СК и ПХ практически одинаковы

При двухфазной экстракции жидкие растительные масла также близки друг другу по экстрактивной способности в отношении ПХ и СК Наименьшей экстрактивной способностью по отношению к ПХ обладает вазелиновое масло, а к СК - касторовое масло, что можно объяснить различной полярностью масел и липофильностью извлекаемых БАВ

■ - липофичьный экстрагент, - ДСЭ Рисунок 13 - Эффективность извлечения производных хлорофилла (ПХ) из смеси травы зверобоя, цветков ромашки и цветков календулы и суммы каро-тиноидов (СК) из смеси плодов рябины и шиповника различными липофиль-ными экстрагентами (полярная фаза ДСЭ - 70% раствор спирта этилового)

МетодОхМ ТСХ установлено, что различие эффективности извлечения ПХ растительными и вазелиновым маслами при двухфазной экстракции связано с тем, что при экстракции только маслом из растительного сырья извлекаются наименее полярные производные хлорофилла, которые, по-видимому, обладают достаточно высокой растворимостью в вазелиновом масле и низким сродством к гидрофильной целлюлозной матрице клетки РС

При двухфазной экстракции в неполярную фазу переходят также и более полярные хлорофиллы, которые растворяются в растительных маслах и хуже растворимы в вазелиновом масле По-видимому, водно-спиртовая фаза способствует более полному насыщению масляной фазы липофильными веществами различной степени полярности

Влияние соотношения объемов спирто-водной и масляной фаз.

Установлено, что зависимость выхода липофильных БАВ в масло от соотношения объемов фаз в ДСЭ носит экстремальный характер, при этом можно выделить три основных участка на кривых экстракции (рис 14)

Наиболее выраженное влияние соотношения фаз наблюдается при относительно малых количествах СВФ в составе двухфазного экстрагента (I участок) При этом полярная фаза практически полностью поглощается сырьем за счет процесса набухания, что соответствует кривой коэффициента набухания сырья (Кн) (рис 15)

100 Кр 26 ■

80 ь 2 -

70 | 3

во

40 1 о 1

30 * 06 ■

10 0

0 0

-*- зверобой У(СВФ)/У(МФ)

-н ромашка -А- календула

-о-теоретическое распределение ПХ (Кр) для травы зверобоя

Рисунок 14 - Зависимость концентрации ПХ в масляных вытяжках от соотношения объемов спирто-водной и масляной фаз при двухфазной экстракции ЛРС

О 25 0 5 0,75 1 1 25 1 5 1 75 5 V (СВФ) I т (сырья)

Рисунок 15 - Зависимость коэффициента набухания травы зверобоя от объема полярной фазы

На этом участке имени место процессы сольватации сырья, десорбции БАВ с клеточных стенок, внутренней диффузии, за счет чего и облегчается переход липофильных БАВ в экстрагент, при этом наибольшее влияние оказывает толщина диффузионного слоя и поверхность массообмена

При дальнейшем увеличении объема полярной фазы концентрация хлорофиллов в масляной фазе достигает максимальных значений, а затем начинает снижаться за счет процессов десорбции, молекулярной диффузии и межфазного распределения в системе ж-ж (П участок) При избытке объема полярной фазы устанавливается либо постоянный уровень, либо наблюдается некоторое снижение концентрации в масляной фазе за счет разведения (III участок) На этом участке процесс экстракции определяется межфазньм распределением ПХ в соответствии с коэффициентом распределения, что подтверждается кривой зависимости коэффициента распределения хлорофиллов в масле от относительного объема водно-спиртового экстрагента

Движущей силой процесса экстракции является разность концентраций на границе раздела сырье-экстрагент, а последующий перенос липофильных веществ из спирто-водной фазы в масляную в соответствии с законом распределения влечет за собой повышение интенсивности извлечения БАВ из сырья (рис 16)

Рисунок 16 - Схема массопереноса ПХ из сырья в МФ

Предлагаемый механизм ДЭ был подтвержден также при изучении влияния соотношения объемов фаз в составе ДСЭ на извлечение суммы ка-ротиноидов из плодов рябины и шиповника при различных концентрациях спирта в СВФ.

Экстрагирование липофильных БАВ двухфазными системами :жст-рагентщ состоящими из компонентов суппозиторных основ.

Значительную группу растительных БАВ, применяемых в форме суппозиториев составляют вещества линофилыюй природы. В суппозитории лн-пофильные соединения вводят в виде экстрактов, полученных при экст рагировании лекарственного растительного сырья, как правило, неполярными органическими растворителями или растительными маслами. Однако, большинство органических растворителей обладают высокой токсичностью, что требует их полного удаления из полученных вытяжек, а введение масляных экстрактов в количествах, обеспечивающих терапевтический эффект, приводит к ухудшению структурно-механических свойств суппозиторной массы. В связи с выше изложенным была изучена возможность применения липо-фильных су]Iгюзиторных основ в качестве экетрагентов БАВ из ЛРС.

Были исследованы: масло какао, твердый жир типа А, \\'керзо1 Н-15, \Viicpsiii У/35 основы, широко используемые в промышленном производстве суппозиториев, твердый кондитерский жир лауринового типа С-Сгеат 3438; парафин, как компонент суппозиторных основ, используемый для повышения температуры плавления суппозиторной массы. Липофильные суп-позиторпые основы сравнивали по экстрактивной способности с кукурузным и вазелиновым маслами.

На примере травы зверобоя установлено, что при экстрагировании ЛРС ТОЛЬКО жировым или масляным экстрагентом выход суммы хлорофиллов. как и для жидких масел, не превышает 7-3% (рис. 17). При двухфазном экстрагировании выход суммы хлорофиллов в неполярную фазу увеличивается в 7-(О раз, при ЭТОМ исследованные жиры и суппозиторныс основы по экстрактивной способности пе уступают1 кукурузному маслу и значительно превосходят вазелиновое масло.

РисунокП - Эффективность извлечения хлорофиллов (IIX) из травы зверобоя различными компонентами суппозиторных ОСНОВ

(полярная фаза ДСЭ - 80% раствор пропилен гликоля (ПГ))

СГ 50

Ч 43

О 30

ю 20

-Рлипофнльный экстрагент 1 ДСЭ

- II ;

—[Ь

__1:

I-

Б й>

Ж.

-г^

т г

я г

а. -ч-

о п

Наиболее высокие выходы достигаются при использовании основ \Vitepsol, что можно объяснить наличием в их составе моноглицеридов высших жирных кислот, обладающих поверхностно-активными свойствами Наименьшей экстрагирующей способностью обладает парафин, который представляет собой смесь предельных углеводородов, обладает низкой растворяющей способностью и имеет минимальное сродство к растительным тканям

С применением методов УФ-спектроскоггаи и ТСХ показано сходство качественного состава вытяжек, полученных с использованием кукурузного масла, масла какао, различных твердых жиров, основ \Уиерзо1 Аналогичные результаты получены при экстрагировании цветков ромашки и календулы

7.2 Извлечение БАВ гидрофильной природы при экстрагировании ЛРС ДСЭ

Показано, что способ ДЭ по эффективности извлечения гидрофильных БАВ не уступает экстракции водно-спиртовыми и водно-органическими растворителями, традиционно применяемыми в производстве галеновых фитопрепаратов Так, при ДЭ экстракции травы зверобоя и цветков календулы были получены спирто-водные извлечения, с выходом по действующим веществам (сумма флавоноидов) - 60-70 %, которые по качественному составу основных действующих веществ были идентичны спиртовым настойкам Аналогичные результаты (аскорбиновая кислота) были получены при ДЭ экстракции плодов рябины и шиповника, травы сушеницы

Та же закономерность была выявлена при сравнительном изучении процесса экстрагирования флавоноидов из травы сушеницы такими полярными растворителями, как пропиленгликоль, полиэтиленгликоль-400 и диме-тилсульфоксид, как непосредственно их водными растворами, так и в составе ДСЭ в качестве полярной фазы

При переработке бурых водорослей выходы и качественный состав гидрофильных продуктов (маннита и альгината натрия), получаемых по промышленной технологии и при экстракции ДСЭ, практически не различались

Таким образом ,при ДЭ различных видов ЛРС установлено, что такие группы БАВ так как гликозиды (флавоноиды, антрахиноны), водорастворимые витамины (аскорбиновая кислота) и полисахариды (альгинат натрия, маннит) могут быть выделены из ЛРС с выходом 60 - 70% При этом методами УФ-спектроскопии и ТСХ показано, что качественный состав БАВ извлечений не меняется

8 Особенности двухфазной экстракции ЛРС в присутствии поверхностно-активных веществ (ПАВ)

Для интенсификации процессов экстрагирования БАВ из сырья в технологии фитопрепаратов часто к экстрагенту добавляют ПАВ, что улучшает смачивание, набухание ЛРС за счет снижения поверхностного натяжения на границе раздела фаз (т-ж) Нами был изучен процесс двухфазной экстракции ЛРС в присутствии ПАВ - эмульгаторов 1-го рода (твин-80, ГЛБ=15,0) и 2-го

рода (моноглицериды дистиллированные - МГД, ГЛБ=3,8) В качестве полярных компонентов ДСЭ использовали нелетучие растворители (растворы пропиленгликоля), а в качестве неполярной фазы — растительное масло

Как было показано выше, при ДЭ и экстракции только полярным экст-рагентом качественный и количественный состав гидрофильных БАВ в извлечениях практически не различаются Однако при введении в систему ПАВ картина резко меняется Изучение кинетики экстракции травы зверобоя показало, что ПАВ 1-го рода — твин-80 - увеличивает, а ПАВ 2-го рода — МГД -уменьшает скорость и степень извлечения АП в полярную фазу В то же время скорость и степень извлечения АП масляную фазу, наоборот наиболее высоки в присутствии МГД, а с твином-80 минимальны (рис 18)

ш 50

< 40

к уО 30

3■ се

е- в" 20

X о Е

X 10

ъс 0

I I

—в—-

Ш '---1---------'....... —

80 100 12: Время, мин

80 100 12С Время, мин

НИ- смесь ПГ с водой -А-ДСЭ с твином 80

-ДСЭ без ПАВ -ДСЭ с МГД

Рисунок 18 - Кинетика экстрагирования антраценпроизводных (АП) из травы зверобоя в присутствии ПАВ

Значительное повышение скорости экстрагирования и концентрации АП в полярной фазе в присутствии твина 80 связано, по-видимому, с улучшением процессов смачиваемости и набухания сырья, что ускоряет процесс массопереноса гидрофильных БАВ При введении в двухфазную систему эмульгатора 1-го рода образуются мицеллы типа «масло/вода» и масляная фаза не препятствует переходу БАВ в полярную фазу При использовании эмульгаторов 2-го рода образуются мицелчы типа «вода/масло», удерживающие некоторое количество АП за счет мицеллярной солюбилизации, чем объясняется снижение концентрации гидрофильных БАВ в полярной фазе и эффективности процесса экстрагирования В основном, по тем же причинам, скорость извлечения и концентрация АП в масляной фазе при введении тви-на-80 меньше, а при введении МГД в двухфазную систему экстрагентов больше по сравнению с контролем

В связи с этим нами было изучено влияние величины гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) смеси ПАВ, добавляемых к системе экстрагентов, на извлечение соединений различной полярности Установлено, что с увеличением числа ГЛБ снижается степень экстракции производных хлорофилла При ГЛБ>5 их концентрация в масляной фазе становится меньше, чем при экстрагировании двухфазной системой экстрагентов без ПАВ

Далее с увеличением ГЛБ концентрация производных хлорофилла постепенно снижается и при ГЛБ=15 становится примерно в 4 раза меньше, чем при двухфазной экстракции без ПАВ и примерно в 6 раз меньше, чем при двухфазной экстракции при ГЛБ=3,8 (Рис 19а)

Концентрация ПХ, мг%

Концентрация АП, мг%

6 9 12 15 Число ГЛБ

6 9 12

Число ГЛБ

Концентрация флавоноидов,1

о а-,----1-

12 15 Число ГЛБ

Рисунок 19 - Влияние ГЛБ смеси эмульгаторов на степень извлечения БАВ (производных хлорофилла, антраценпроизводных, флавоноидов) из травы зверобоя при двухфазной экстракции

Предложенный нами механизм двухфазной экстракции предполагает I межфазный перенос липофильных БАВ из полярной в масляную фазу в соответствии с коэффициентом распределения Характер межфазного барьера ПАВ оказывает существенное влияние на степень и скорость переноса липофильных веществ в масляную фазу. Наибольшая концентрация липофильных производных хлорофилла в масляной фазе наблюдается при экстрагировании двухфазной системой экстрагентов в присутствии эмульгатора 2-го рода - мо-ноглицеридов дистиллированных, число ГЛБ которого равно 3,8 Снижение концентрации липофильных ПХ по мере увеличения числа ГЛБ объясняется, вероятно, тем, что возрастающая гидрофилизация структурно-механического барьера ПАВ на поверхности раздела фаз замедляет перенос через него липофильных веществ

В отношении гидрофильных БАВ установлено, что существует определенное значение ГЛБ, при котором в водной фазе достигается максимальная концентрация как флавоноидов, так и производных антрацена

Степень экстракции производных антрацена до ГЛБ=9 невелика и примерно постоянна При больших значениях ГЛБ она резко возрастает и при ГЛБ>11 уже превышает степень экстракции производных антрацена при экстрагировании двухфазной системой экстрагентов без ПАВ Максимальная концентрация производных антрацена в водной фазе достигается при ГЛБ-13 5, а затем происходит ее уменьшение (рис 196) Аналогичная зависимость наблюдается и для флавоноидов (рис 19в)

Отмечено, что при ГЛБ~13-14 система представляет собой эмульсию м/в и имеет максимальную агрегативную устойчивость, т е наибольшую поверхность раздела фаз Можно предположить, что в этом случае достигается

максимальный контакт полярной фазы с сырьем и улучшение смачивания и сольватации сырья в присутствии оптимального количества твина-80, что и определяет максимум извлечения гидрофильных БАВ при определенном значении ГЛБ

Вышеописанные эффекты влияния ПАВ на перенос липофильных и гидрофильных БАВ в процессе ДЭ обнаружены нами впервые и принципиально отличаются от ранее известной роли ПАВ в интенсификации процессов экстрагирования сырья

С практической точки зрения, создавая определенное соотношение ПАВ в составе ДСЭ, можно осуществлять направленный процесс экстрагирования веществ из ЛРС

9 Практическое использование метода двухфазной экстракции в технологии фитопрепаратов

Результаты теоретических и экспериментальных исследований по разработке способа двухфазной экстракции легли в основу оригинальной технологии комплексной переработки ЛРС, схематично представленной на рис 20

ЛРС ЗВЕРОБОЯ ТРАВА, РОМАШКИ И КАЛЕНДУЛЫ ЦВЕТКИ, РЯБИНЫ И ШИПОВНИКА ПЛОДЫ, БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ СЫРЬЕ

ПОЛЯРНЫЕ ЭКСТРАГЕНТЫ

(ВОДНЫЕ РАСТВОРЫ ЭТАНОЛА, ПРОПИЛЕНГЛИКОЛЯ, ПЭГ, ГЛИЦЕРИНА, ДМСО)

ЭКСТР/ ЛР ЖИРОВАНИЕ С ДСЭ

НЕПОЛЯРНЫЕ ЭКСТРАГЕНТЫ

(МАСЛА ЖИРЫ)

РАЗДЕЛЕНИЕ ФАЗ ИЗВЛЕЧЕНИЯ

ПОЛЯРНАЯ ФАЗА

СПИРТО-ВОДНЫЕ ИЗВЛЕЧЕНИЯ

ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКИЕ ИЗВЛЕЧЕНИЯ

МАСЛЯНЫЕ ИЗВЛЕЧЕНИЯ

НА ВЫДЕЛЕНИЕ БАВ (АЛЬГИНАТ НАТРИЯ)

ЖИРОВЫЕ ИЗВЛЕЧЕНИЯ

ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА

СУХОЙ ЭКСТРАКТ ЗВЕРОБОЯ, ПГ-ЭКСТРАКТ СМЕСИ ЛРС МАННИТ

ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА

СУППОЗИТОРИИ НА ОСНОВЕ ЖИРОВОГО ЭКСТРАКТА СМЕСИ ЛРС КРЕМЫ С МАСЛЯНЫМИ, ВОДНО-ПГ, МАСЛЯНЫЕ ЭКСТРАКТЫ

ВОДНО-ГЛИЦЕРИНОВЫМИ И ДМСО ЭКСТРАКТАМИ СЕРИИ «ЦЕЛИТЕЛЬ», «МАРИНА» КРЕМ «ЗВЕРОБОЙНЫЙ»

ЛЕЧЕБНО-КОСМЕТИЧЕСКИЕ СРЕДСТВА

Рисунок 20 - Комплексная переработка ЛРС с применением метода ДЭ

Получение фитопрепаратов на основе спирто-водных и масляных извлечений при двухфазной экстракции растительного сырья

Спирто-водные извлечения, полученные при экстракции ДСЭ травы зверобоя и цветков календулы по показателям качества не отличались от настоек, полученных в промышленных условиях и соответствовали требованиям НД (табл 6)

Таблица 6 - Основные показатели качества водно-спиртовых извлечений, полученных ДЭ, и соответствующих препаратов промышленного производства

Показатель Образец Содержание спирта, % Сухой остаток, % Содержание флавоноидов, в пересчете на рутин, %

Спирто-водная вытяжка зверобоя при экстракции ДСЭ 37 1±0 2 4 4+0 1 0 25±0 01

Зверобоя настойка производства ОАО «Фармфабрика СПб» 37 2±03 4 6+0 1 0 2410 01

Требования к зверобоя настойке ФС 42-1889-95 Не менее 36 0 Не менее 2 8 Не менее 0 2

Спирто-водная вытяжка календулы при экстракции ДСЭ 65 4±0 2 2 96±0 1 0 07±0 01

Календулы настойка производства ОАО «Тверская фармфабрика» 67 2±0 3 3 2±0 1 0 06+0 01

Требования к календулы настойке ФС 42-1948-82 Не менее 65 Не менее 2 1 -

На основе спирто-водного извлечения при двухфазной экстракции травы зверобоя был получен сухой экстракт по стандартной технологии Субстанция по показателям качества соответствовала требованиям ВФС 42-273396 «Экстракт зверобоя сухой» и ФСП 42-0171174901 «Зверобоя экстракт сухой» Определение содержания в сухом экстракте гиперицина показало его соответствие препаратам зарубежного производства, стандартизируемым по этому показателю

За счет увеличения концентрации липофильных БАВ в 5-8 раз и достижения выхода 85-90% очевидна перспективность применения метода ДЭ в производстве медицинских масел (масляных экстрактов) Масляный экстракт зверобоя, полученный методом ДЭ, входит в состав лечебно-косметического крема «Зверобойный», который по результатам клинической апробации обладает противовоспалительным, ранозаживляющим действием (Мельникова, 2000)

Масляные, водно-спиртовые и водно-пропиленгликолевые экстракты из различных видов ЛРС (зверобоя, ромашки, календулы, шалфея, тысячелистника, шишек хмеля), полученные методом ДЭ, используются в производстве лечебно-косметических средств

Комплексная переработка сухого сырья бурых водорослей

На основе метода двухфазной экстракции разработана технология комплексной переработки водорослей, в результате которой, кроме получаемых по производственной схеме на Архангельском опытном водорослевом ком-

бинате маннита и альгината, выделяется новый продукт - масляный экстракт ламинарии (МЭЛ) Качество и выходы технических альгината натрия и маннита, полученные по предложенной технологии, соответствовали требованиям НД

Для характеристики нового продукта - МЭЛ - проведено изучение состава БАБ в сравнении с наиболее близким к нему по свойствам продуктом промышленной переработки водорослей - концентратом «Ламинария» (КЛ)

Анализ показал, что МЭЛ содержит широкий набор липидных компонентов ламинарии, в том числе хлорофиллы, стерины, жирные кислоты и их эфиры. В процессе исследования установлено, что при экстракции ДСЭ сухого сырья водорослей (слоевищ ламинарии, аскофиллума и фукуса) степень извлечения липофильных компонентов достигает 90%

Сравнение состава действующих веществ КЛ и МЭ ламинарии методами ТСХ и УФ-спектроскопии показало, что новая технология обеспечивает гораздо меньшую степень деструкции ПХ, чем действующая технология КЛ

Разработанная технология комплексной переработки бурых водорослей с использованием ДСЭ (Приложение Б), прошла апробацию в производственных условиях Новизна и практическая значимость технологии подтверждена патентом На основе масляного экстракта разработаны и промышлен-но выпускаются лечебно-косметические кремы серии «Марина»

Технология суппозиториев на основе экстрактов, полученных с применением двухфазных систем экстрагентов

Суппозитории на основе ЛРС характеризуются высокой эффективностью, безопасностью при длительном использовании для лечения хронических, вялотекущих заболеваний Анализ научной и патентной литературы по применению различных растений в лечении гинекологических и проктологи-ческих заболеваний позволил выбрать для исследований смесь, состоящую из травы зверобоя, цветков ромашки и календулы При разработке технологии экстрагирования ЛРС в качестве составляющих ДСЭ использовали 80% водный раствор ПГ и твердый жир типа А, так как результаты изучения экстрагирующей способности различных компонентов суппозиторных основ показали, что такое сочетание экстрагентов позволяет получить высокие выходы БАВ При этом, выход производных хлорофилла в жировую фазу при ДЭ увеличивается в 5-6 раз, каротиноидов — в 2-2,5 раза по сравнению с экстракцией жиром.

Поскольку, жировой экстракт, полученный методом двухфазного экстрагирования, может непосредственно использоваться для получения суппозиториев, то он должен удовлетворять требованиям, предъявляемым к суппо-зиторным массам

Исследовали стабильность твердого жира типа А под воздействием основных факторов процесса двухфазного экстрагирования, таких как нагревание, присутствие полярной фазы и взаимодействие с растительным материалом О химической стабильности жира-экстрагента судили по изменению кислотного (КЧ) и перекисного (ПЧ) чисел жира Физическую стабильность

оценивали, сравнивая температуру плавления, температуру затвердевания и твердость (прочность на сжатие) исходного жира, жира, подвергнутого обработке, и жирового экстракта.

Установлено, что термическое воздействие в условиях экстрагирования, а также введение полярной фазы не влияет ни на одну из рассмотренных характеристик жира-экстрагента Выявленное увеличение кислотного и пере-кисного чисел жировой основы не превышает допустимых значений, регламентируемых нормативной документацией для жировых суппозиторных основ [ЕР, ШР]

Таким образом, по физико-химическим и структурно-механическим свойствам полученный экстракт удовлетворяет требованиям, предъявляемым к суппозиторным массам и, следовательно, может быть использован для получения суппозиториев

В результате проведенных исследований разработана технология суппозиториев на основе жирового экстракта смеси травы зверобоя, цветков ромашки, цветков календулы, включающая стадии получения жирового экстракта методом двухфазного экстрагирования и получения суппозиториев методом выливания (Приложение В) Предложенная технология позволяет объединить стадии экстрагирования ЛРС и введения экстрактов в лекарственную форму и сократить процесс по сравнению с известными технологическими схемами

Фармакологические исследования, проведенные совместно с сотрудниками кафедры фармакологии СПГХФА, выявили противовоспалительную активность полученных водно-пропиленгликолевого и жирового экстрактов, на модели «уксуснокислого» прокто-колита у крыс при профилактическом и лечебном введении, близкую к активности препарата сравнения - облепихо-вого масла (в суппозиториях).

Для стандартизации суппозиториев в проект ФСП внесены показатели описание, подлинность, средняя масса, температура плавления, кислотное число, перекисное число, количественное определение суммы хлорофиллов и каротиноидов Для стандартизации водно-пропиленгликолевого извлечения, также получаемого в результате экстрагирования сырья ДСЭ, предложены показатели описание, подлинность плотность, рН, тяжелые металлы, в качестве основных действующих веществ предложено количественно определять содержание суммы флавоноидов и антраценпроизводных.

10. Методологические основы разработки ресурсосберегающих технологий лекарственных средств растительного происхождения

В результате проведенных теоретических и экспериментальных исследований разработаны методологические основы создания лекарственных средств на основе новых ресурсосберегающих технологий, обеспечивающих комплексную переработку ЛРС и извлечение целевых продуктов с высоким содержанием БАВ Концептуальная схема создания ресурсосберегающих технологий представлена на рис 21 Предлагаемая схема состоит из отдель-

ных этапов, объединенных научно-практическими задачами, каждая из которых включает фрагмент решения конкретных целей

На первом этапе необходимо провести исследования по выбору ЛРС, обеспечивающего получение высокоэффективных лекарственных средств

Для извлечения комплекса БАВ целесообразным является использование сырья, содержащего соединения различной полярности Так, например, разработка метода комплексной переработки ЛРС была проведена с использованием широко применяемого и заготавливаемого в больших количествах сырья различных видов растений, содержащих разные группы БАВ - трава зверобоя продырявленного, трава сушеницы топяной, цветки календулы, цветки ромашки, плоды рябины, плоды шиповника, а также бурые водоросли

Рисунок 21 - Концептуальная схема создания ресурсосберегающих технологий лекарственных средств растительного происхождения

В технологии индивидуальных фитопрепаратов при получении субстанций высокоактивных БАВ (алкалоидов, гликозидов) часто используют сырье растений редких, произрастающих в тропических и субтропических районах Не случайно в последние годы в России практически прекращен выпуск индивидуальных лекарственных препаратов, производство которых осуществлялось из сырья, поставляемого странами зарубежья Кроме того, при выделении индивидуальных соединений необходимо стремиться использовать обогащенное целевым продуктом сырье, полученное, например, биотехнологическим способом с направленным синтезом БАВ

На примере получения биомассы раувольфии змеиной с высоким содержанием аймалина было показано, как проведение комплекса работ (биотехнологических, фитохимических и цитологических) позволяет выделить штамм-продуцент индивидуального алкалоида с продуктивностью в 2,5 раза выше по сравнению с исходной культурой В дальнейшем проводится цикл исследований, обеспечивающий стабильность биосинтетических показателей штамма и осуществляется разработка оптимальных условий наработки биомассы Установленные зависимости применимы и при разработке технологии культивирования других штаммов-продуцентов БАВ

При организации промышленного производства необходимым является определение сроков выращивания посевного материала штамма-продуцента БАВ и биомассы, как ЛРС Для решения этой задачи на основании установленного влияния взаимосвязи формирования анатомо-морфологической структуры клеточных компонентов, процессов дыхания, питания и роста на продуктивность штамма были определены временные этапы, в течение которых активизируются процессы роста клеток и синтеза алкалоидов, что присуще и другим видам растительных тканей

Разработки, проведенные с учетом установленных закономерностей и особенностей развития штамма, по совершенствованию и масштабированию способов выращивания биомассы, показали возможность снижения себестоимости пока еще дорогого сырья, получаемого методом культуры тканей

В дальнейшем, в производстве индивидуальных фитопрепаратов необходимым является проведение комплекса разработок, включающих оптимизацию процесса экстрагирования целевого продукта и использование теоретически и экспериментально обоснованных методов очистки Проведение таких исследований с применением ионообменного метода выделения позволило увеличить выход аймалина на 24 % по сравнению с внедренной в производственных условиях технологией Указанные этапы необходимы при выделении алкалоидов из других видов ЛРС

В технологии комплексной переработки сырья предложен метод экстрагирования сырья двухфазной системой экстрагентов, позволяющих за одну технологическую стадию получить два извлечения, содержащих БАВ липо-фильного и гидрофильного характера, с увеличением выхода липофильных веществ по сравнению с моноэкстракцией в 4-8 раз и сокращением длительности процесса в 1,5-2 раза Изучение механизма процесса и выявленные общие закономерности экстракции ДСЭ различных видов сырья показали воз-

можность осуществления направленного процесса извлечения комплекса действующих веществ из ЛРС

С использованием методов математического планирования эксперимента установлена значимость влияния различных факторов на эффективность процесса ДЭ Показано, как выбор экстрагентов в составе двухфазной системы, а также применение ПАВ, влияет на выход БАВ в полярную и неполярную фазу

Следует отметить, что предложенный алгоритм может быть применен при разработке технологии очистки и обогащения извлечений из растительного сырья, в том числе полученного методом культуры тканей

ВЫВОДЫ

1 Проведенные комплексные исследования явились основанием для установления взаимосвязи между анатомо-морфологической структурой клеточных компонентов, процессами дыхания, питания, роста и биосинтеза алкалоидов Установлены временные этапы, в течение которых последовательно происходят процессы, связанные с делением клеток, образованием структурных элементов, интенсивным ростом и накоплением алкалоидов

2 Впервые установлены закономерности потребления компонентой питательной среды, что позволило разработать методологические подходы к осуществлению направленной регуляции биосинтеза алкалоидов при выращивании различных штаммов раувольфии змеиной на агаризован-ных и жидких питательных средах

3 В результате разработанной технологии целенаправленного обогащения растительных тканей БАВ выделен производственный штамм К-27 с увеличением содержания аймалина в биомассе в 2,5 раза Получены авторские свидетельства на способ получения штамма и на штамм Разработана технология выращивания, обеспечивающая стабильность и воспроизведение продуктивности штамма в производственных условиях Биомасса на основе штамма К-27 (ВСКК-ВР-30-87) является утвержденным сырьем для получения полусинтетического производного аймалина - промалина (ИПАБ), разрешенного Фармакологическим комитетом к медицинскому применению и промышленному выпуску

4 Разработана технология выращивания растительных тканей в полиэтиленовых пакетах, при этом достигнуто снижение себестоимости биомассы Из биомассы, выращенной по предложенной технологии в опытно-промышленных условиях, выделен аймалин и на его основе получена субстанция промалина

5 Совершенствование методов выделения и очистки БАВ с оптимизацией условий проведения процессов позволило на примере получения аймалина из биомассы раувольфии змеиной увеличить выход целевого продукта на 24% по сравнению с существующей технологией Применение ионообменного метода повышает степень очистки аймалина в 3,8 раза, что позволило в последующем использовать этот очищенный

продукт для получения других биологически активных соединений, в частности N11А Б

6 Для внедрения ресурсосберегающих технологий переработки ЛРС теоретически обоснована и экспериментально доказана эффективность нового комплексного метода экстрагирования двухфазными системами экстрагентов, позволяющего за одну стадию извлекать широкий спектр липофильных и гидрофильных БАВ Установлены общие и индивидуальные закономерности экстракции ДСЭ различных видов сырья При этом выход липофильных веществ составил 85-90 %, что в 2-8 раз больше по сравнению С моноэкстракцией при увеличении скорости процесса в 1,5-2 раза.

7 Теоретически обоснован механизм двухфазной экстракции и установлены наиболее значимые факторы, влияющие на перенос липофильных веществ в масляную фазу Показано, что более высокая эффективность метода двухфазной экстракции по сравнению с экстракцией маслом определяется ролью полярной фазы (ее составом и количеством)

8 Впервые изучен процесс двухфазной экстракции с использованием в качестве полярной фазы водных смесей растворителей, применяемых в составах лекарственных и косметических средств (ДМСО, ПЭГ-400, ПГ). Установлено, что они обладают высокой экстрагирующей способностью, зависящей от их концентрации в полярной фазе

9 Впервые установлена возможность применения липофильных суппози-торных основ для извлечения БАВ из ЛРС в составе двухфазных систем экстрагентов Показано, что по экстрактивной способности твердые жиры не уступают жидким растительным маслам Установлено, что жировой экстракт, полученный при двухфазном экстрагировании ЛРС, по физико-химическим и структурно-механическим свойствам соответствует требованиям, предъявляемым к суппозиторным массам Разработана технология суппозиториев, представляющих собой твердый жировой экстракт лекарственного растительного сырья, которая позволяет снизить трудоемкость технологических процессов

10 Впервые исследован процесс двухфазной экстракции ЛРС в присутствии поверхностно-активных веществ Экспериментально изучено и теоретически обосновано положительное влияние состава ПАВ и числа гидрофильно-липофилыюго баланса вводимой в систему смеси эмульгаторов на кинетику экстракции и выход БАВ в полярную и масляную вытяжки

11 На основании выявленных особенностей и закономерностей процесса ДЭ сырья предложен способ комплексной переработки бурых водорослей, позволивший одновременно получать наряду с полисахаридами (технический альгинат, маннит) масляный экстракт, обогащенный ли-пофильными БАВ На основе полученного нового продукта - масляного экстракта бурых водорослей разработаны составы лечебно-косметических кремов и начато их промышленное производство

12 Проведение комплекса теоретических и экспериментальных исследований позволило разработать методологические основы ресурсосберегающих технологий переработки JIPC, обеспечивающих высокий выход целевых продуктов и создание эффективных лекарственных средств

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1 Особенности поведения клеток в культуре тканей Rauwolfia serpentina Benth / В А Кунах, И Е Каухова, JIК Алпатова, А Г Воллосович // Цитология и генетика. - 1982 -Т 16 Вып 5 -С 6-10

2 О связи между уровнем плоидности клеток и выходом противоаритми-ческих алкалоидов в культуре ткани Rauwolfia serpentina Benth / В А Кунах, И Е Каухова, JI К Алпатова, А Г Воллосович // Сб докладов IV съезда Все-союз общ-ва генетиков и селекционеров им НИ Вавилова - Кишинев Штиинца, 1982 -Ч I - С 136-137.

3 Каухова, И Е Получение посевного материала для выращивания ткани раувольфии змеиной / И Е Каухова, В А Цыганов // Материалы Междунар конф «Культура клеток растений и биотехнология» - Кишинев Штиинца, 1983.-С 106-107

4 Некоторые результаты исследований, направленных на повышение продуктивности культуры ткани раувольфии змеиной / В А Кунах, А Г Воллосович, И Е Каухова, Л А Николаева, Ю Б Бахтин // Материалы Междунар конф «Культура клеток растений и биотехнология» - Кишинев Штиинца, 1983 -С 85-87

5 Зависимость продуктивности клеточных линий раувольфии змеиной от уровня плоидности культивируемых клеток / В А Кунах, И Е Каухова, Л А Николаева, Л К Алпатова, Е Г Алхимова//Доклады АН СССР 1983 -Т 270 - № 4 - С 979-982

6 Каухова, И Е Поверхностное выращивание ткани Rauwolfia serpentina Benth на жидких питательных средах / И Е Каухова, В А Цыганов, А Г Воллосович//Растительные ресурсы — 1984 -Т 20 -Вып 3 -С 412415

7 Способ подготовки культуры ткани раувольфии змеиной - продуцента аймалина а с № 1181313 СССР, МКИ С 12 N 5/00 / В А Кунах, И Е Каухова, Л К Алпатова, Л А Николаева, Е Г Алхимова, А С Шаламай, И В Алексеева, А Г Воллосович, Ю Б Бахтин, В П Чернецкий - заявл 27 09 83 , Опубл 22 05 85

8 Штамм Rauwolfia serpentina Benth., используемый для получения аймалина а с № 1336563 СССР, МКИ С 12 N 5/00 / В А Кунах, И Е Каухова, Л К. Алпатова, И А Костенюк, А Г Воллосович - заявл 17 12 84 , опубл 08 05 87

9 Каухова, И Е Изучение методов культивирования ткани раувольфии змеиной / И Е Каухова, А Н Куклин // Сб "Биология культивируемых клеток и биотехнология" Междунар конф — Новосибирск, 1988 — С 97—98

10 Штамм культивируемых клеток растений Ramvolfia serpentina Benth -продуцент аймалина • а с 1540267 СССР, МКИ С 12 N 5/00 / АН Куклин, И Е Каухова, А Г Воллосович, С А Минина, В А Кунах, О В Захленюк, Е Г Алхимова, JIК Алпатова - заявл 03 08 87 , опубл 01 10 89

11 Способ получения культуры клеток растений Rauwolfia serpentina Benth - продуцента противоаримических алкалоидов а с 1540268 СССР, МКИ С 12 N 5/00 / АН Куклин, ИЕ Каухова, А Г Воллосович, С.А. Минина, В А Кунах, Т В Астахова, Т А Богаевская, JI Н Оберюхтина -заявл 06 03 87 , опубл 01 10 89

12 Каухова, И Е Биотехнология тканей раувольфии змеиной (проблемы и перспективы получения биомассы) / И Е Каухова, А Н Куклин // Материалы Междунар конф "Проблемы и перспективы биотехнологии" - Братислава, 1989 - С 99

13 Минина, С.А О подготовке и повышении квалификации инженеров-технологов по новому направлению "Биотехнология растительных тканей" / С А Минина, И Е Каухова, J1И Громова // Сб научно-методических работ "Совершенствование методической работы при подготовке и переподготовке специалистов для медицинской промышленности" -JI,1991 -С 152-154

14 Каухова, ИЕ. О потреблении ионов калия и кальция клетками культуры ткани Ramvolfia serpentina Benth / И Е Каухова, В Е Титов, А Н Куклин, ЛП Соколова, Э Д Ибрагимова // Растительные ресурсы - 1992 - Т 28 -Вып 4 -С 70-73

15 Kaukhova, I Е The study of influence of nutrients on biosynthetic properties of plant cell /1E Kaukhova, L P Sokolova, T В Stolova, V E Titov // Abstracts of Reports II International conference "Biology of plant cell cultures and biotechnology" -Almaty, 1993 -P 180

16 Каухова, И E Влияние калия, кальция, магния на продуктивность ткани раувольфии змеиной / И Е Каухова, Л П Соколова, В Е Титов // Материалы Вссрос науч конф "Химия и технология лекарственных веществ" -СПб, 1994 -С 16

17 Каухова, И Е Связь между потреблением фосфатного, сульфатного ионов и митотической активностью клеток раувольфии змеиной / И Е Каухова, В Е Титов, Л П Соколова // Материалы Всерос науч конф "Химия и технология лекарственных веществ" -СПб, 1994 —С 17

18 Каухова, И Е Методы выделения аймалина из биомассы раувольфии змеиной / И Е Каухова, Л Л Шимолина, Л П Соколова // Материалы Всерос науч. конф "Химия и технология лекарственных веществ" СПб , 1994 - С 18

19 Каухова, И Е Анагомо-физиологические особенности клеток культуры ткани раувольфии змеиной - продуцента противоаритмических алкалоидов / И Е Каухова, В М Каминская // Материалы Всерос конф "Актуальные вопросы медицины" -Москва, 1994 - С 67-68

20 Каухова, И Е Противоаритмические средства на основе аймалина из биомассы раувольфии змеиной / И Е Каухова, Л П Соколова, С А Минина //

Сб "Фундаментальные основы диагностики состояния человека" - СПб, 1994 - С 40-41

21 Minina, S A The Technology of Rauwolfia serpentina biomass antiarhytmic preparations / S A Mmina, I E Kauhova, L L Shimolina // Abstracts of Conf "Biotechnology" - St -Petersburg, 1994 -P 180

22 Перспективный источник новых противоаритмических средств - культура ткани раувольфии змеиной / В А Галынкин, И Е Каухова, Е М Сергеева, В А Кузнецова // Научные труды НИИ Фармации. М, 1997 -Т XXXVI -С 255-260

23 Каухова, И Е Фазовые изменения в структурной организации культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth в связи с ростовыми процессами и дыханием / И Е Каухова, О Д Быков, О.В Рыбальченко, Т С Беляева // Материалы Междунар конф по анатомии и морфологии растений - СПб, 1997 — С 88 -90

24 Способ комплексной переработки сухого сырья водорослей патент 2142812 РФ, МКИ С 16 А 61 К 35/80 / В В Фомин, В А Вайнштейн, И Е Каухова, Ю А Лимаренко - заявл 21 04 98, опубл 20 11 99 // БИПМ -1999 -№35

25 Новые подходы к комплексной переработке сухой травы зверобоя / В А Мельникова, В А Вайнштейн, А Н Шиков, И Е Каухова // Химико-фармацевтический журнал -1999 -№ 12.-С 27-30

26 Мельникова, В А Получение сухих и масляных экстрактов из травы зверобоя продырявленного / В А Мельникова, И Е Каухова, В А Вайнштейн // Сб "Фармация в XXI веке, инновации и традиции" Междунар конф - СПб, 1999 - С 61-62

27 Каухова, И Е Комплексная переработка сырья календулы и зверобоя / И Е Каухова В А Мельникова, М В Полякова, В А Вайнштейн // Тез. докладов VI Российского национ конгресса "Человек и лекарство" -М, 1999 -С 417

28 Двухфазная экстракция сухого растительного сырья — новый способ получения биологически активных добавок для лечебно-косметических средств / В А Вайнштейн, В А Мельникова, Ю А Лимаренко, И Е Каухова, Н А. Масленникова, В В Иванова // Материалы IV Междунар конф "Биологически активные вещества в косметике" -М,1999 - С 20-21

29 Экстракция растительного сырья двухфазной системой экстрагентов как новый способ получения биологически активных добавок / В.А Вайнштейн, В А Мельникова, Ю А Лимаренко, И Е Каухова, Н А Масленникова, В В Иванова // Материалы IV Междунар симпоз "Биологически активные добавки к пище. XXI век" - СПб, 2000 - С 43-44

30 Исследование возможности комплексной переработки водорослей рода Lammaria с использованием двухфазной системы экстрагентов / Ю А Лимаренко, В В Фомин, В А Вайнштейн, И Е Каухова // Материалы IV Междунар съезда "Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения" -Великий Новгород, 2000 - С 83-95

31 Изучение особенностей экстрагирования липофильных веществ из растительного сырья двухфазной системой экстрагентов и органическими растворителями / CA. Иванова, Ю Т Демченко, И Е Каухова, В А Вайнштейн // Материалы VI Междунар съезда "Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения" - СПб , 2002 - С 6972

32 Изучение влияния вида масляной фазы на количество и стабильность каротиноидов, извлекаемых из плодов рябины и шиповника двухфазной системой экстрагентов / CA Иванова, Ю Т Демченко, И Е Каухова, В А Вайнштейн // Материалы VII Междунар съезда "Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения" -СПб - Пушкин, 2003 - С 32-36

33 Каухова, И Е Биотехнология растительных тканей Учебное пособие / ИЕ Каухова, А Л Марченко - СПб • Изд-во СПХФА, 2003 -61 с

34 Иванова, С А. Особенности массопереноса липофильных БАВ при экстрагировании сырья двухфазной системой экстрагентов / CA Иванова, В А Вайнштейн, И Е Каухова // Химико-фармацевтический журнал - 2003 -Т 37 — № 8 - С 30-33.

35 Изучение экстракции плодов рябины и шиповника двухфазной системой экстрагентов / CA Иванова, С Е Скочипец, М Е Скочипец, В А Вайнштейн, И Е Каухова, Ю Т Демченко // Фармация - 2003 - № 6 -С. 50-56

36 Хаззаа, ИХ Экстрагирование сушеницы топяной травы с применением полярных растворителей /ИХ Хаззаа, В А Вайнштейн, И Е Каухова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции сб науч трудов / Пятигорская гос фармац академия - Вып. 59. - Пятигорск, 2004 - С 134-135

37 Экстрагирование полярных БАВ из травы зверобоя двухфазной системой экстрагентов в присутствии ПАВ / ИХ Хаззаа, В А Вайнштейн, Т X Чибиляев, И Е Каухова // Химико-фармацевтический журнал - 2004 -№5.-С 25-27

38 Хаззаа, И X Разработка состава и технологии лечебного геля на основе экстрактов травы зверобоя и сушеницы/ И X Хаззаа, В А Вайнштейн, И Е Каухова // Материалы XI Россиийского национ конгресса «Человек и лекарство» - М, 2004 - С 128

39 Хаззаа, И X Некоторые особенности двухфазной экстракции травы Hypericum perforatum L в присутствии ПАВ /ИХ Хаззаа, В А Вайнштейн, ИЕ Каухова//Растительные ресурсы -2004 -№3 -С 117-122

40 Разработка методов выделения биологически активных веществ из растительного сырья, получение на их основе лекарственных препаратов и БАД к пище / ЛИ Громова, ТВ Астахова, МА Буракова, ИЕ Каухова, А Б. Легостева, А Л Марченко, Е В Флисюк // Материалы научно-методической конференции "Состояние и перспективы подготовки специалистов для фармацевтической отрасли" - СПб , 2004 - С 73-75

41 Минина, С А Химия и технология фитопрепаратов Учебное пособие / С А Минина, И Е Каухова - M , "Гэотар Мед", 2004 - 560 с

42 Каухова, ИБО роли полярной фазы в процессе экстрагирования лекарственного растительного сырья двухфазными системами экстрагентов / И Е Каухова, Ю Т Демченко, В А Вайнштейн, С А Иванова, И X Хаззаа // Материалы международной научно-практической конференции "Выпускник фармацевтического вуза (факультета) в прошлом, настоящем и будущем" -СПб, 2004 - С 217-221

43 Каухова, И Е Особенности процессов питания и дыхания культуры клеток Rauwolfia serpentina (Apocynaceae) в ходе роста и развития / ИЕ Каухова//Растительные ресурсы -2005 -Вып 4 -С. 31-40

44 Каухова, И Е Экстрагирование лекарственного растительного сырья двухфазной системой экстрагентов — перспективное направление в технологии фитопрепаратов / И Е Каухова, В А Вайнштейн // Материалы II Всероссийского съезда фармацевтических работников - Сочи, 2005 — С 82-83

45 Каухова ИЕ Новая методика получения растительных препаратов / ИЕ Каухова//Фармация -2006 -№3 - С 37-39

46 Каухова, И Е Особенности экстрагирования биологически активных веществ двухфазной системой экстрагентов при комплексной переработке лекарственного растительного сырья / И Е Каухова // Растительные ресурсы -2006 -Т 42 - Вып 1 -С 82-91.

47 Особенности процесса экстрагирования лекарственного растительного сырья двухфазными системами экстрагентов, содержащими компоненты суппозиторных основ / ЮТ Демченко, ИЕ Каухова, В А Вайнштейн, ТХ Чибиляев // Химико-фармацевтический журнал - 2005 - Том 39 -№11 -С 30-34.

48 Противовоспалительная активность извлечений, полученных методом двухфазной экстракции трех видов лекарственного растительного сырья / Ю Т Демченко, А А Смирнова, В Ц Болотова, И Е Каухова, ЕК Вишневская//Растительные ресурсы -2006 - вып 4 — С 61-70

49 Экстрагирование растительного сырья компонентами суппозиторных основ в составе двухфазных систем экстрагентов - новый подход в технологии фитопрепаратов / ЮТ Демченко, H Г Федорова, И Е Каухова, В А Вайнштейн // Материалы IX Международного съезда «Фитофарм 2005»/ Санкт-Петербург, 22-25 июня 2005 - СПб , 2005. - С 735-739

50 Двухфазная экстракция БАВ из лекарственного растительного сырья с использованием масел, твердых жиров и синтетических эмолентов / Ю Т Демченко, А В Белякова, В А Вайнштейн, И Б Каухова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции Сб науч тр / Пятигорская гос фармац академия -Вып 61 - Пятигорск, 2006 -83-87

Приложение А

Технологическая схема производства аймалина ионообменным методом

ТП 5 3 Центрифугирование

ВР 1

ВРЗ 1 Измельчение биомассы

ВР3 2 Приготовление экстоап,нта

ВРЗЗ Подготовка кгпиоиитаКУ-2 8

ТП 4 1 Настаивание

ТП 4 2 Перколяция

ТП 5 1 Концентрирование извлечения

ТП 5 2 Отстаивание пои £=8С

Подготовка воды

ВР 2 Подготовка производства

ВРЗ Подготовка сырья

ТП 4 Кх, Кт Экстрагирование биомассы 50% этанолом

ТП 5 Кх, Кт Очистка извлечения

1 г

ТПб Кх, Кт Сорбция аймалина на катионите КУ-2-8

ТП 7 Кх, Кт Десорбция аймалина

ТП 8 Кх, Кт Выделение технического аймачина

потери

шрот

отгон атирга на ВР 3 2

отходы

потери

отработанный КУ-2-8

потери

на регенерацию

ТП 7

маточник

на потучение 1ЧПАБ ——-—

ТП 9 Выделение

Кх, Кт, фармакопейного

Кмб аймалина

маточник

ПО 10„

гп

ПО 10 Выделение аймалина

из маточников

На ТП.8. ТП 9 ^

Приложение Б

Технологическая схема комплексной переработки ламинарии

методом ДЭ

Сырье

СВЭ,

Масло

ТП 11 Экстрагирование

ТП 1 2 Фильтрация

ТП 1 3 Разделение фаз

ТП1 Кх

Кт

Экстрагирование сухого сырья водорослей

СВФ на ТП2

Шрот на ТПЗ

ГП (масляный экстракт)

СВФ ТП Отгонка этанола

-► 2 1

ХП Осаждение ман-2 2 НИ1а

ТП Фильтрация

Р-р ИагСОз

ТП Кипячение шрота в

3 1 содовом растворе

Н2804

ТП 32 Фильтрация

ТП 3 3 Осаждение альги новых кислот серной кислотой

ТП Промывка осадка

Р-р N3200, ТП Получение раство-

- 3 ь ра алы ината натрия

ТП 36

Упаривание раствора и сушка альгината

Хлористый ТП Обезжиривание

метилен -► 3 7 альгината

ТП 3 8 Фильтрация

ТП 3 9 Удаление хлористого мстилена(хм)

ТП2 Потучение мач-

Кх нита

кт

Минеральные соли

Маточник_(

Маннит на перекристаллизацию

ТПЗ Получение аль-

к, гината натрия

кт

Промывные воды

Отгон ХМ

ГП (альгинат натрия)

Приложение В Технологическая схема получения суппозиториев на основе жирового экстракта из смеси ЛРС

ВРЗ 2

ВР 2 1 Подготовка воздуха

Измельчение ЛРС

ВР 3 2 Просев ЛРС

ТП 4 3 Отделение шрота

ВР 2 2 Приготовление

дезрастворов

ВР23 Подготовка

помещений

ВР 2 4 Подготовка

оборудования

ВР 2 5 Подготовка персонала

ВРЗ 3 Приготовление 80 % раствора ПГ

ВРЗ 4 Расплавление жира

ТП 4 1 Настаивание ЛРС 80 %

раствором ПГ

ТП 4 2 Экстрагирование ЛРС

ДСЭ

ТП 4 4 Разделение жировой

и водно-ПГ фаз

ВР 1 Кт, Кх, Кмб Подготовка воды

ВР2 Кт, Кх Кмб Подготовка производства

,ГСВР1

ВРЗ Кт, Кх Подготовка сырья иэкстрагентов

ТП 4 Кт, Кх Экстрагирование ЛРС двухфазной системой экстрагентов

Отходы

Потери

Шрот

Потери

Жировой экстракт

Водно-ПГ экстракт

ТП 5 1 Выливание

суппозиториев

ТП 5 2 Охлаждение

ТП 5 3 Герметизация ячейковой упаковки

УМО 6 1 Маркировка

ТП 5 Получение

Кт, Кх, суппозиториев

Кмб

Потери

УМО 6 2 Упаковка в пачку

УМО б Маркировка,

Кт, Кх упаковка

Отходы

Потери

Готовая продукция^)

На правах рукописи Каухова Ирина Евгеньевна

Специальность 15.00 01 —Технология лекарств и организация фармацевтического дела

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

Печать Н В Андриановой

Подписано к печати 07 06 2007 Формат 60x90/16 Бумага тип Печать ризограф _Гарнитура «Тайме» Печ л 3,0 Тираж! 00 экз Заказ 682_

Санкт-Петербург 2007

Оглавление диссертации Каухова, Ирина Евгеньевна :: 2007 :: Санкт-Петербург

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2 Материалы и методы исследования

2.1. Объекты и материалы исследования

2.2 Методы анализа растительного сырья

2.3 Условия проведения электронно-микроскопического анализа

2.4 Методы проведения экстракции лекарственного растительного сырья

2.5 Методы анализа БАВ в извлечениях из лекарственного растительного сырья

2.6 Методы определения физико-химических показателей экстрагентов и извлечений из растительного сырья

2.7 Методы математической обработки результатов экспериментов

ВВЕДЕНИЕ

1 Обзор литературы. Современные тенденции развития производства препаратов растительного происхождения

1.1 Характеристика фитопрепаратов

1.2 Современное состояние и перспективы заготовки лекарственного растительного сырья

1.3 Биомасса изолированных тканей растений - новый вид сырья в технологии лекарственных средств

1.4 Экстрагирование лекарственного растительного сырья и пути интенсификации процесса

1.5 Технологии фитопрепаратов на основе комплексной переработки лекарственного растительного сырья

3 Разработка технологии целенаправленного обогащения БАВ биомассы растений

3.1 Получение промышленного штамма ткани раувольфии змеиной — продуцента аймалина

3.2 Изучение влияния физиологических процессов клеток растительных тканей на их продуктивность

3.3 Способы управления продуктивностью культур тканей растений

4 Разработка технологии выращивания биомассы раувольфии змеиной (штамм К-27)

4.1 Оптимизация параметров культивирования штамма К

4.2 Методы поддерживающего отбора штаммов продуцентов БАВ

4.3 Промышленное использование штамма К

5 Разработка высокоэффективных способов выращивания биомассы растительных тканей

5.1 Культивирование ткани раувольфии змеиной в жидких питательных средах

5.2 Масштабирование технологии выращивания штамма К

6 Разработка методов выделения аймалина из биомассы раувольфии змеиной в технологии N-(4)- пропилаймалин бромида (NTIAB)

6.1 Оптимизация стадии экстрагирования биомассы методом перколяции

6.2 Разработка ионообменного метода очистки аймалина

6.3 Технология выделения аймалина из биомассы раувольфии змеиной ионообменным методом

6.4 Получение NTIAB

7 Экстрагирование лекарственного растительного сырья (JIPC) двухфазными системами экстрагентов

7.1 Изучение особенностей экстрагирования липофильных БАВ двухфазной системой экстрагентов (ДСЭ)

7.2 Извлечение БАВ гидрофильной природы при экстрагировании JIPC ДСЭ

8 Особенности двухфазной экстракции (ДЭ) JIPC в присутствии поверхностно-активных веществ (ПАВ)

9 Практическое использование метода двухфазной экстракции в технологии фитопрепаратов

9.1 Получение фитопрепаратов на основе спиртоводных извлечений при ДЭ растительного сырья

9.2 Получение фитопрепаратов на основе масляных извлечений при ДЭ растительного сырья

9.3 Комплексная переработка сухого сырья водорослей

9.4 Разработка лекарственных средств на основе экстрагирования

JIPC компонентами суппозиторных основ в составе ДСЭ

10 Методологические основы разработки ресурсосберегающих технологий лекарственных средств растительного происхождения

ВЫВОДЫ

Введение диссертации по теме "Технология лекарств и организация фармацевтического дела", Каухова, Ирина Евгеньевна, автореферат

В настоящее время в медицинской практике важное место принадлежит лекарственным средствам растительного происхождения, т.к. они обладают широким спектром биологического действия, что позволяет использовать их для профилактики и лечения многих заболеваний

Между тем потребность населения, возможности расширения применения фитопрепаратов (ФП) в медицинской практике удовлетворяются далеко не полностью, главным образом из—за неэффективной переработки лекарственного растительного сырья (J1PC) и дефицита некоторых его видов. В связи с этим особое значение приобретают исследования по созданию эффективных, целенаправленных технологий в производстве фитохимических лекарственных средств с целью комплексного использования JIPC, достижения более высоких выходов, расширения спектра извлекаемых БАВ и ресурсосбережения

Эти проблемы можно решить, разрабатывая прогрессивные технологии переработки ЛРС, обеспечивающие максимальное извлечение биологически активных веществ (БАВ), и используя новый вид фитосырья - биомассу лекарственных растений, получаемую биотехнологическим способом с направленным биосинтезом индивидуальных веществ.

Метод культивирования растительных клеток и тканей вызывает большой интерес у исследователей, пригодность его для решения ряда технологических и медицинских проблем не вызывает сомнений (Бутенко, 1986; Носов, 1991; Воллосович, 1992; Misawa, 1994). Особенно перспективно применение биомассы как источника БАВ тех видов растений, которые являются редкими, исчезающими, произрастающими в труднодоступных регионах или с трудом культивируемых на плантациях, а также импортируемых. Однако сырье, получаемое методом культуры тканей, еще достаточно дорогое и в ряде случаев не может конкурировать с заготовкой интактных растений, поэтому остается актуальным поиск новых эффективных направлений, позволяющих снизить себестоимость сырья за счет повышения продуктивности штаммов-продуцентов, совершенствования методов выращивания биомассы и выделения активных субстанций.

При разработке технологии суммарных фитопрепаратов целесообразно максимально извлекать природный комплекс БАВ, характерный для данного лекарственного растения. При существующих, далеко не всегда прогрессивных технологиях промышленного производства фитопрепаратов эффективность извлечения в ряде случаев достигает лишь 40-50% из-за недостаточности истощения сырья по различным группам действующих веществ.

Цель и задачи исследования

Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд задач:

1. Изучить особенности питания, газообмена и изменений в структурной организации клеток растительных тканей и установить закономерности их влияния на продуктивность штаммов-продуцентов.

2. Разработать технологию целенаправленного обогащения биомассы растительных тканей биологически активными веществами, обеспечивающую получение высокопродуктивных промышленных штаммов.

3. Оптимизировать параметры культивирования штаммов, гарантирующие их высокую продуктивность и стабильность в условиях промышленных производств.

4. Усовершенствовать метод выделения и очистки индивидуальных БАВ из культуры растительных тканей на примере биомассы раувольфии змеиной, сырья для выделения аймалина, с целью получения эффективного антиаритмика 1Ч(4)-пропилаймалиния бромида (N17АБ),

5. Научно обосновать и экспериментально разработать способ экстрагирования JIPC двухфазной системой экстрагентов, а также исследовать влияние природы и соотношений экстрагентов на процесс двухфазной экстракции для выделения комплекса БАВ.

6. Изучить особенности и выявить закономерности экстрагирования БАВ из различных видов лекарственного растительного сырья и установить факторы, влияющие на эффективность процесса.

7. Разработать технологические режимы комплексной переработки различных видов JIPC и показать возможности практического использования метода двухфазной экстракции.

8. На основании анализа теоретических и экспериментальных исследований разработать методологические основы создания ресурсосберегающих технологий лекарственных средств растительного происхождения.

Научная новизна

Впервые изучены особенности потребления компонентов питания при выращивании различных штаммов раувольфии на агаризованных и жидких питательных средах. При этом установлена динамика их накопления в биомассе, что позволило осуществить направленную регуляцию биосинтеза алкалоидов путем дополнительного введения в среду компонентов питания.

В результате проведения комплекса фитохимических и биотехнологических исследований получена суспензионная культура раувольфии змеиной. Установленные маркерные признаки (физиологические, фитохимические, биохимические) позволили охарактеризовать культуру как штамм R-III. Новизна выполненных разработок подтверждена авторским свидетельством на штамм.

Разработан алгоритм получения высокопродуктивных клеточных линий и посевного материала культуры растительных тканей, заключающийся в отборе клонов с ускоренным ростом, что позволило, на примере культуры раувольфии змеиной выделить производственный штамм-продуцент (К-27) с увеличением содержания аймалина в 2,5 раза. Определены основные фитохимические, цитологические и биохимические показатели, характеризующие штамм, составлен паспорт, и штамм депонирован во Всероссийской коллекции клеточных культур высших растений за коллекционным № ВСКК-ВР-30-87. Приоритет полученных результатов подтвержден авторскими свидетельствами на штамм и его способ получения.

Впервые изучено влияние состава ДСЭ на эффективность процесса экстракции. С применением методов математического планирования эксперимента установлено, что наиболее значимыми факторами, влияющими на перенос липофильных веществ в масляную фазу при двухфазной экстракции, являются соотношение объемов водно-органической и масляной фаз и природа полярной фазы.

Впервые установлена возможность использования липофильных суппозиторных основ для извлечения БАВ из ЛРС в составе двухфазных систем экстрагентов и показано, что по экстрагирующей способности твердые жиры не уступают жидким растительным маслам.

Впервые показана перспективность двухфазной экстракции ЛРС в присутствии поверхностно активных веществ (ПАВ). При этом установлено, что степень извлечения липофильных БАВ при экстракции ДСЭ зависит от значения гидрофильно-липофильного баланса и состава вносимой в систему смеси эмульгаторов, что позволяет, создавая определенное соотношение используемых ПАВ, осуществлять направленный процесс экстрагирования комплекса БАВ.

Разработан алгоритм создания ресурсосберегающей технологии лекарственных средств растительного происхождения. Предлагаемая методология обосновывает объединение всех этапов технологического процесса в единую цепь и может быть рекомендована как типовая.

Практическая значимость

Предложена комплексная технология выращивания биомассы промышленного штамма-продуцента, оценки качества и последующей переработки с выделением субстанции БАВ, позволившая в дальнейшем разработать лекарственный препарат. В производственных условиях на ХПХФО «Здоровье» (г. Харьков) и НПК «Биофарм» (г. Казань) доказана эффективность разработанной технологии, которая включена в регламент на производство биомассы раувольфии змеиной. В настоящее время №ТАБ из биомассы раувольфии змеиной (штамм ВСКК-ВР-30-87) разрешен Фармакологическим Комитетом к медицинскому применению и утверждена НД для его промышленного выпуска: ФСП 42-0166-181701 на субстанцию №1АБ (промалин), ФС (Т) 42-0075-01 на №1АБ-стандарт и ФСП 42-0166186801 на таблетки №1АБ (промалина) 0,02 г, покрытые оболочкой.

Для совершенствования метода выращивания биомассы с использованием штамма К-27 впервые разработана технология его культивирования в полиэтиленовых пакетах. ,В производственных условиях показана эффективность этого способа выращивания, позволяющая снизить себестоимость биомассы на 15%.

В результате оптимизации процесса экстрагирования аймалина из биомассы и очистки ионообменным методом увеличен выход фармакопейного продукта на 24% по сравнению с экстракционным методом. Установлена возможность использования технического аймалина для синтеза NIIAB. Из биомассы раувольфии змеиной наработан аймалин по ионообменной технологии и NIIAE. Показатели качества полученных субстанций соответствовали требованиям НД. Составлен лабораторный регламент на получение аймалина ионообменным методом.

Разработана технология ресурсосберегающей комплексной переработки сырья с применением двухфазной системы экстрагентов (ДСЭ), позволяющая достигать 85-90% выхода липофильных БАВ, что в 2-8 раз больше, чем при моноэкстракции. Выход гидрофильных БАВ составляет 6070%, что сопоставимо с экстракцией водно-спиртовыми экстрагентами. При этом длительность процесса экстракции сокращается в 1,5-2 раза.

Составлены типовые технологические схемы получения фитопрепаратов методом двухфазной экстракции. Полученные этим методом масляные и водно-органические экстракты из различных видов J1PC используются в промышленном производстве лечебной косметики (ХБО при РАН «Фирма «Вита», ОАО «Фармацевтическая фабрика Санкт-Петербурга»).

Разработана технология двухфазного экстрагирования J1PC компонентами суппозиторных основ с получением жировых экстрактов с высоким содержанием липофильных БАВ, которые могут быть использованы как суппозиторные массы. Показано противовоспалительное действие жирового и водно-пропиленгликолевого экстрактов из смеси травы зверобоя, цветков ромашки и цветков календулы. Составлены проекты ФСП на водно-пропиленгликолевый экстракт и на суппозитории на основе жирового экстракта из смеси ЛРС.

Разработан новый метод комплексной переработки сухого сырья бурых водорослей экстракцией ДСЭ, позволяющий получать в одном технологическом процессе масляный экстракт, маннит и альгинат натрия. Способ защищен патентом и используется на НПФ «Фаркос».

Установленные закономерности экстрагирования растительного сырья двухфазной системой экстрагентов используются в научно-исследовательской работе, проводимой на кафедрах технологии лекарств и фитопрепаратов Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии (СПХФА) и технологии лекарств Пятигорской государственной фармацевтической академии (ПГФА).

Результаты выполненной работы используются в учебном процессе СПХФА, ПГФА, Казанского медицинского университета при изучении дисциплин «Биотехнология растительных тканей», «Химия и технология фитопрепаратов», «Фармацевтическая технология» и «Биотехнология» по специальностям 240901 «Биотехнология» и 060108 «Фармация», а также при обучении слушателей и интернов на факультете дополнительного профессионального образования (ФДПО) СПХФА.

Результаты научных исследований использованы при подготовке учебных пособий: «Биотехнология растительных тканей» СПб, 2003; «Химия и технология фитопрепаратов», М., 2004, рекомендованного УМО по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для системы послевузовского профессионального образования провизоров.

Основные положения, выносимые на защиту

Результаты комплексного исследования по установлению закономерностей при выращивании культуры тканей растений, связанных с формированием анатомо-морфологической структуры клеточных компонентов, процессами дыхания, питания и роста штамма К-27, влияющими на биосинтез алкалоидов, позволившие определить временные этапы, в течение которых активизируются биосинтетические процессы.

Технология целенаправленного обогащения тканей БАВ, позволившая увеличить содержание аймалина в 2,5 раза по сравнению с исходной культурой раувольфии змеиной. Новый способ выращивания клеток растений на примере раувольфии змеиной- в полиэтиленовых пакетах, позволивший снизить себестоимость биомассы на 15 %.

Усовершенствованный метод выделение аймалина из биомассы, позволивший увеличить выход на 24 %, по сравнению с внедренной в производство технологией. Возможность использования технического аймалина, полученного с применением ионообменного метода очистки, для синтеза NTIAB, по показателям качества удовлетворяющего требованиям НД.

Результаты теоретического и экспериментального исследования и установленные закономерности процесса экстрагирования лекарственного растительного сырья, отличающегося анатомо-морфологическим строением и содержащего различные группы БАВ, двухфазными системами экстрагентов, имеющими в своем составе в качестве полярной фазы водно-органические (в т.ч. водно-спиртовые) смеси, а в качестве масляной фазы -растительные, минеральные масла и жиры. Результаты экспериментального изучения процесса экстрагирования ЛРС двухфазными системами экстрагентов в присутствии поверхностно-активных веществ, позволяющие осуществлять направленный процесс извлечения комплекса действующих веществ.

Теоретическое и экспериментальное обоснование и создание технологии комплексной переработки сухого сырья бурых водорослей, в результате которой были получены альгинат натрия, маннит и новый продукт - масляный экстракт водорослей. Обоснование и создание технологии суппозиториев на основе жировых экстрактов, полученных методом двухфазной экстракции ЛРС суппозиторными основами.

Методологические основы создания ресурсосберегающих технологий лекарственных средств растительного происхождения.

Выполнение отдельных фрагментов работы проведено в следующих организациях:

- электронно-микроскопические исследования проведены совместно со ст.н.с., д.б.н. Рыбальченко О.В. в лаборатории электронной микроскопии ГНЦ ФГУП «ГосНИИ особо чистых биопрепаратов»;

- цитологические и цитогенетические исследования проведены совместно с сотрудниками отдела генетики клеточных популяций

Института молекулярной биологии и генетики Национальной АН Украины (руководитель отдела, д.б.н. Кунах В.А.);

- изучение интенсивности дыхания изолированных тканей растений проводили совместно с профессором, д.б.н. Быковым О.Д. в Международном центре «Биоэкологический контроль»;

- фармакологические исследования проводились совместно с сотрудниками кафедры фармакологии ГОУ ВПО СПХФА (зав. каф., проф., д.м.н. Крауз В. А.).

В работе приведены отдельные фрагменты диссертационного исследования асп. Демченко Ю.Т., выполнение которого осуществлено под руководством к.ф.н. И.Е. Кауховой - автора данной диссертации.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. СОВРЕМЕННЫЕ ТЕНДЕНЦИИ РАЗВИТИЯ ПРОИЗВОДСТВА ПРЕПАРАТОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

1.1 Характеристика фитопрепаратов

Доля медикаментов растительного происхождения на фармацевтических рынках развитых стран достигает в настоящее время 50 % [437].

По расчетным данным ВОЗ, около 80 % из более чем 4 млрд. жителей мира в рамках системы первичной медико-санитарной помощи пользуются главным образом традиционными медикаментами природного происхождения [224]. Актуальность использования лекарственных растений и фитопрепаратов существенно возросла в последние десятилетия, особенно в связи с ростом токсико-аллергических заболеваний, повышения потребления химико-терапевтических средств и, как результат, появления т.н. "лекарственной болезни".

Увеличению производства и продаж растительных препаратов способствует также экологический настрой населения развитых стран, стремящегося предупреждать и лечить болезни с помощью средств природного происхождения [353, 505]. В частности, в реестре лекарственных средств Германии фитопрепараты составляют более 25 %. По данным Института по изучению общественного мнения в Германии более 50 % опрошенных предпочитают лечиться ЛС природного происхождения и только 20 % считают, что химические средства более надежны [108,467].

Динамика количества ЛС, регистрируемых в Российской Федерации за период с 2001 по 2005 годы, показывает, что растет общее количество как зарубежных, так и отечественных ЛС [319, 320]. По состоянию на 2005 год их число составляет свыше 16 тысяч наименований, при этом значительная часть, более 30 %, является либо лекарственным растительным сырьем, либо

18 препаратами растительного происхождения, либо полученными с использованием компонентов растительного происхождения [91].

Обращает на себя внимание тот факт, что в Государственных Реестрах РФ последних лет сохраняется тенденция увеличения отечественных регистрируемых ЛС растительного происхождения [91, 92].

Анализ патентования лекарственных растительных средств выявляет значительный рост патентной активности россиских заявителей, состовляющий 89,93% от общего количества патентов, зарегестрированных в России [306].

Среди патентов РФ, опубликованных с 1994 г (т.е. практически всех патентов РФ), около 17 % всех «фармацевтических» патентов, выданных отечественным заявителям, защищают лекарственные средства, полученные из растительного сырья [264]. Данный факт свидетельствует о том, что инновационный процесс в области поиска БАВ растительного происхождения в России идет достаточно активно.

Целебные свойства фитопрепаратов обусловлены наличием в них биологически активных веществ (БАВ), их гармоничным сочетанием и взаимодействием. Большинство БАВ и индивидуальных лекарственных препаратов, выделенных из растений, менее ксеногенны по сравнению с синтетическими веществами и не оказывают на организм выраженного побочного действия при длительном применении, т.к. более мягко включаются в метаболитические процессы животных клеток и по своему биологическому эффекту приближаются к действию естественных метаболитов, участвующих в процессах внутреннего обмена [75,97].

Получаемые в настоящее время на предприятиях из растительного сырья препараты могут быть классифицированы следующим образом:

• Суммарные неочищенные или галеновые препараты.

• Суммарные очищенные или новогаленовые (неогаленовые) препараты.

• Препараты, состоящие из индивидуальных веществ, выделяемых из растений (алкалоиды, гликозиды, кумарины и др.).

• Комбинированные препараты (содержащие наряду с лекарственными веществами из растений химические, химико-фармацевтические субстанции, витамины, гормоны и т.д.).

Процентное соотношение различных групп фитопрепаратов, представленных на фармацевтическом рынке отображено на диаграмме (рис. 1.1).

20%

15%

Ш суммарные неочищенные (галеновые) ФП и суммарные очищенные (новогаленовые) ФП □ индивидуальные ФП Я комбинированные ФП

Рисунок 1.1- Фитопрепараты представленные на фармацевтическом рынке

В последние годы на рынке фитопрепаратов появились такие понятия как "комплексный препарат11 и "многокомпонентный" препарат".

Комплексный препарат - это любой экстракционный препарат, содержащий комплекс БАВ, переходящих в него в процессе производства в нативном состоянии из исходного лекарственного растительного сырья [166]. Под многокомпонентным препаратом подразумевается лекарственное средство, полученное либо из суммарных экстрактов с добавлением вспомогательных веществ, либо путем смешивания отдельных экстрактов на основе растительного сырья, также с добавлением вспомогательных веществ и последующего создания современных лекарственных форм (капсул, таблеток, гранул и др.) [166].

Одним из примеров многокомпонентных препаратов являются эликсиры. По определению ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества

20 лекарственных средств. Основные положения» [269], эликсиры — это жидкая лекарственная форма, представляющая собой прозрачную смесь спирто-водных извлечений из лекарственного сырья с добавлением лекарственных веществ, Сахаров и ароматизаторов .

Лекарственные сборы также являются многокомпонентными препаратами. Это смеси нескольких видов измельченного, реже цельного лекарственного растительного сырья, иногда с добавлением солей, эфирных масел [166].

В России разрешены к медицинскому применению более 40 наименований лекарственных сборов, изготавливаемых отечественными производителями.

Широкое распространение получило изготовление многокомпонентных препаратов в виде водорастворимых лекарственных чаев. Лечебные чаи представляют собой гомогенный порошок, содержащий комплекс биологически активных веществ в их природной композиции, обладают высокой фармакотерапевтической эффективностью, удобством в употреблении, хорошо переносятся больными, что делает их особенно пригодными для длительного применения.

На рынке фитопрепаратов в последние годы возрос интерес к выпуску лекарственных форм с использованием растительных порошков (брикеты, фильтр- пакеты, таблетки с растительными порошками) [27].

На российском рынке представлено более 100 предприятий, выпускающих фасованное лекарственное растительное сырье и сборы. Наибольшим спросом на рынке пользуются такие виды растительного сырья: ромашка, сенна, шалфей, почечный чай, толокнянка, валериана, липа и кора дуба. А из сборов самыми популярными являются грудные, урологические, успокоительные, желчегонные и противогеморроидальные [208].

Настойки - жидкая лекарственная форма, представляющая собой разбавленные спиртовые и водно-спиртовые извлечения из лекарственного растительного сырья, полученные без нагревания и удаления экстрагента

269]. В настоящее время номенклатура настоек включает 35 наименований. Их качество регламентируется фармакопейными статьями (ФС или ФСГГ) [28, 29]. Настойки могут быть изготовлены из одного вида сырья, а также же из смесей нескольких видов лекарственного растительного сырья.

Получает дальнейшее развитие и другая традиционная лекарственная форма из растительного сырья — экстракты (жидкие, густые, сухие и масляные), а также полиэкстракты. Показатели качества экстрактов нормируются общими статьями ГФ XI, ФС и ФСП.

К галеновым препаратам относятся также эфирные масла, сиропы, фитонцидные препараты, соки и др. суммарные неочищенные.

Таким образом, все галеновые препараты являются комплексными, а многие из них и многокомпонентными.

К суммарным очищенным (новогаленовым) относят препараты, содержащие смеси действующих веществ по возможности очищенные не только от балластных, но и сопутствующих веществ. Они содержат преимущественно, нативный комплекс отдельных групп действующих веществ - алкалоидов, гликозидов, кумаринов и т.д. Производство суммарных очищенных препаратов характеризуются резко выраженным индивидуальным подходом к получению отдельных продуктов или их групп.

К индивидуальным относят фитохимические препараты, состоящие из отдельных БАВ- алкалоидов, гликозидов, дубильных веществ, кумаринов, сапонинов и т.д. В основе производства указанных лекарственных средств находится многостадийный технологический процесс, включающий различные физико-химические методы разделения и очистки биологически-активных веществ. Эта группа препаратов строго стандартизована, т.к. индивидуальные соединения обладают более направленным терапевтическим эффектом. Выделенные из растительного сырья индивидуальные биологически активные вещества в дальнейшем могут стать сырьем для получения других полусинтетических лекарственных веществ.

К группе комбинированных относятся препараты, содержащие наряду с растительными и другие вещества. Например, в препарат "Каметон" входят кристаллические терпеноиды - камфора и ментол, эвкалиптовое масло и некоторые субстанции синтетической природы. К комбинированным фитопрепаратам относят аллохол, валокордин, бесалол, бекарбон и др. Эта группа препаратов выпускается в различных лекарственных формах (таблетки, гранулы, растворы, аэрозоли).

Суппозитории как перспективная лекарственная форма фитопрепаратов

В фитотерапии ректальный и интервагинальный пути введения лекарств используют, главным образом, для местного лечения проктологических, гинекологических и урологических заболеваний; ректальный путь используется также и для достижения системного эффекта, преимущественно в педиатрии.

Препараты на основе лекарственного растительного сырья характеризуются высокой эффективностью, безопасностью при длительном использовании для лечения хронических, вялотекущих заболеваний, возможностью их применения у пожилых пациентов и во время беременности [286,287,289].

Доля фитосуппозиториев на Российском рынке на сегодняшний день составляет около 9% отечественного фармацевтического рынка препаратов в форме суппозиториев (рис. 1.2).

Среди них можно назвать такие, широко применяемые в лечебной практике, как суппозитории с облепиховым малом, с экстрактом красавки, тыквеол в суппозиториях, суппозитории с эвкалимином, с гипорамином [91, 101].

Рисунок 1.2 - Доля суппозиториев с действующими веществами растительного

4% происхождения на рынке фитосуппозиториев суппозитории с БАВ растительного происхождения □ суппозитории с синтетическими лекарственными веществами Ш комбинированные препараты

Однако анализ доступной научной и патентной отечественной и зарубежной литературы показывает, что в последнее время вопросам разработки и исследования фитопрепаратов в форме суппозиториев уделяется много внимания, как в России, так и за рубежом [200, 216, 244].

Особенности технологии фитопрепаратов в форме суппозиториев

Активным ингредиентом фитосуппозиториев чаще всего являются галеновые препараты (сухие, густые, жидкие и масляные экстракты) и очищенные комплексы БАВ различных групп, реже используют индивидуальные соединения, выделенные из растений, а также непосредственно J1PC в измельченном виде. Введение измельченного ЛРС

Для получения суппозиторной массы ЛРС измельчают до размера частиц не более 0,5 мм, постепенно вводят в разогретую жировую основу (витепсол, масло какао) и выдерживают определенное время при нагревании для проведения экстракции БАВ. Затем из массы получают свечи методом выливания [274]. Либо, в аптечных условиях, порошок ЛРС смешивают с жировой основой при температурах, близких к комнатной и формуют свечи

Предполагается, что высокая степень дисперсности порошков JIPC позволяет эффективно осуществить экстракцию липофильных БАВ жировой основой и исключить другие способы их экстрагирования [288]. Это позволяет также извлечь широкий спектр БАВ, содержащихся в сырье, и тем самым обеспечить комплексное фармакологическое воздействие [216]. Кроме того, суппозитории и ректальные мази с измельченным сырьем рассматриваются как препараты пролонгированного действия [274].

Введение густых, сухих экстрактов или очищенных препаратов в виде порошков

JIB сначала извлекают из растений, используя различные экстрагенты (вода, этанол, сжиженные газы) и методы экстрагирования [280, 283, 285, 489, 490]. Полученные экстракты диспергируют в липофильной или полиэтиленоксидной основе.

Разработана технология препарата в форме суппозиториев на основе сухого полиэкстракта одревесневшей части шиповника собачьего, обогащенного полифенолами и танинами, который получают в результате последовательной экстракции ЛРС 50% этанолом, 30% этанолом и водой. Препарат обладает гемостатическим, антисептическим, противодиаррейным и антиоксидантным действием [488].

Введение БАВ в форме жидких экстрактов, соков

Получены суппозитории с водным экстрактом, гелем или соком алоэ на различных гидрофильных основах: желатин-глицериновые гели, композиции, состоящие из глицерина и стеарата натрия, смеси полиэтиленоксидов. [490].

Жидкий экстракт эхинацеи вводили в жировые основы (витепсол W-35, витепсол Н 15, масло какао, твердый кондитерский жир) по типу эмульсии. В случае масла какао и твердого жира в качестве эмульгатора использовали моноглицериды дистиллированные [369].

Получены суппозитории на полиэтиленоксидной основе с ДМСО-экстрактом (диметилсульфоксид) травы тысячелистника и прополисом. [276].

Введение липидных (липофильных) комплексов и масляных экстрактов

Большинство липидных комплексов, рекомендованных для ректального и вагинального применения, получают по методу, разработанному О.В. Нестеровой [243]. Измельченное JIPC (жомы плодова-ягодных культур и др.) экстрагируют пищевым бензином марки "Нефракс" с последующей отгонкой растворителя. Для создания суппозиториев с липидными комплексами используют жировые основы (суппорин, масло какао и др.) [275, 278, 279, 281, 282].

Разработаны суппозитории с масляными экстрактами, получаемыми методом репрессования с высоким содержанием липофильных БАВ из плодов рябины обыкновенной, калины, облепихи, цветков бархатцев [357].

Наиболее распространенные группы растительных БАВ, применяемых в форме суппозиториев

Алкалоиды

Наиболее распространенным алкалоидсодержащим препаратом является экстракт красавки, который используется в свечах самостоятельно (суппозитории с экстрактом красавки) и входит в состав препаратов анузол и бетиол [91, 320].

В терапии бронхиальной астмы используют свечи с теофиллином [319,

393].

НПО Вилар" были разработаны и выпускались в промышленных условиях вагинальные суппозитории лютеонурина. Лютеонурин - сумма алкалоидов, содержащихся в корнях и корневищах кубышки желтой. Показания к применению: трихомонадные инфекции, трихомонадозы, в качестве противозачаточного средства. (ФС-42-1840-82; Per. уд. 72/267/66) [319, 346].

Получен патент на суппозитории хелидосан с экстрактом травы чистотела и анестезином для лечения геморроя [283].

Ректальное применение эрготамина тартрата (в комбинации с кофеином) эффективно при лечении мигреней и головных болей, особенно у пациентов с сильными мигренями, сопровождающимися тошнотой и рвотой [477].

Сердечные гликозиды

Разработаны и исследованы суппозитории с коргликоном и строфантином. Отечественной промышленностью (Нижегородский ХФЗ) выпускались суппозитории с дигитоксином (ФС 42-1634-81; Per. уд. 69/446/16), кордигитом (ФС 42-1729-81, Per. уд. 73/272/6) [319].

Антрахиноновые гликозиды

Антрагликозиды многих лекарственных растений являются эффективными слабительными, действуют непосредственно на слизистую кишечника, усиливают перистальтику и замедляют всасывание воды и электролитов. Однако они плохо всасываются при пероральном применении [490].

В качестве слабительного средства в форме суппозиториев, в том числе и в составе комплексных препаратов для детей, предложено использовать экстракт сены и суммарный очищенный препарат антрасеннин [18, 355]. Известны суппозитории с препаратами алоэ [490].

Флавоноиды

Флавоноиды все чаще в последнее время используют в терапии проктологических заболеваний, благодаря их выраженному противовоспалительному и ангиопротекторному действию.

Рутин включают в качестве венотонизирующего средства в состав комплексных препаратов для лечения геморроя. [59], эскулозид входит в состав противогеморроидальных суппозиториев "Проктоседил" (производство Roussel India Ltd, Индия) [320]. В составе суппозиториев применяют флавоноидные комплексы молочая и Гинкго [391,491].

Терпеноиды

Эвкалимин представляет собой очищенную сумму терпеноидных альдегидофенолов (эуглобалей) и тритерпеноидов, выделяемую из листьев или побегов эвкалипта прутовидного [409].

Абисил» - сумма природных терпеноидов, обогащенная монотерпенами, которая может быть получена из хвойных, шишконосных рода ель, сосна, пихта и кедр. [290].

Активная субстанция - Силбиол (вагинальные шарики Биосан) — продукт переработки древесной биомассы сосны обыкновенной, содержит терпеноиды и ациклические соединения нормального строения [288].

Липидные комплексы БАВ. Липидные комплексы содержат сумму БАВ липофильной природы (жирные кислоты и триглицериды, каротиноиды, токоферолы, фитостерины, фосфолипиды, липофильные флавоноиды), состав которых различен для разных растений. Их получают, преимущественно, из семян масличных растений (тыква, дыня), а также из жомов плодово-ягодных культур (черноплодная рябина, калина, черная смородина). Благодаря высокому содержанию антиоксидантов, витаминов, полиненасыщенных жирных кислот, фитостеринов липидные комплексы проявляют широкий спектр действия: противовоспалительное, антиоксидантное, ранозаживляющее, репаративное [97].

1.2 Современное состояние и перспективы заготовки лекарственного растительного сырья

Лекарственным растительным сырьем (ЛРС) для производства фитопрепаратов служат различные части растений: почки, листья, цветки и соцветия, плоды и семена, корни и корневища, луковицы, кора [303]. В действующую ГФ XI включены 83 частные статьи на ЛРС, которое используется для получения фитопрепаратов [90, 201].

Сырьевая база для производства фитопрепаратов формируется из нескольких источников:

• заготовка сырья из дикорастущих лекарственных растений;

• заготовка из культивируемых лекарственных растений;

• закупка по импорту.

Большая часть ЛРС собирается путем промышленной заготовки дикорастущих и культивируемых растений.

С началом рыночных реформ в нашей стране в период 1991-1999 г.г. произошло резкое изменение товарной структуры в пользу дикорастущего сырья, доля которого за этот период увеличилась с 51,79 % до 83,17 % [107].

В номенклатуру заготавливаемых дикорастущих лекарственных растений входит до 160 видов, однако только около 30 видов, включая эфиромасличное сырье, составляет максимальную часть заготовок. В это ЛРС входят: трава череды, пустырника, плоды шиповника, боярышника, рябины, листья березы, толокнянки, брусники, побеги черники, багульника и ДР

Поставку культивируемого ЛРС на внутренний рынок осуществляют около 40 специализированных совхозов, акционерных обществ, крестьянских и фермерских хозяйств. В настоящее время выращивается около 60 видов ЛРС (наперстянка, ромашка, ноготки, мята, зверобой, шалфей и др.). На долю акционерных обществ и государственных предприятий приходится более 80 рынка, крестьянские и фермерские хозяйства формируют около 8 %, остальное количество JIPC предлагают товарищества, кооперативы и т.п. В среднем каждый из поставщиков предлагает на рынок 3-5 наименований сырья, при этом монопольные производители отдельных видов JIPC отсутствуют [305].

Преимущественно культивируются те виды JIPC, которые не произрастают в России (паслен дольчатый, дурман индейский, амми большая и зубная и др.), имеют ограниченный ареал произрастания или трудно заготавливаются в природе (красавка, женьшень, валериана и др.) [322].

В перечень импортируемых видов JIPC входит сырье тропических растений или видов, не произрастающих на территории России (семена строфанта, семена чилибухи и др.). Однако, следует отметить четкую тенденцию к снижению доли импортируемых видов ЛРС в общем объеме заготовок. Если в 50-х годах она составляла более 40 %, то в 90-х годах уменьшилась до 8 % [180].

Не случайно в последние годы в Росси прекращен выпуск ряда препаратов, главным образом индивидуальных, производство которых осуществлялось из сырья, поставляемого из зарубежья [352].

Так дефицит коры корней и корневищ раувольфии, растительного сырья, поступавшего в нашу страну по импорту в недостаточном количестве и нерегулярно, не позволил наладить промышленный выпуск высокоэффективного препарата противоаритмического действия -промалина.

В настоящее время на рынке JIPC номенклатура и объем предложений практически по всем видам сырья ниже складывающего спроса [50,107]. Как видно из приведенных в табл. 1.1 данных, практически во всех отраслях народного хозяйства наблюдается устойчивый рост потребностей в ЛРС.

Годы (тысяч тонн) Темпы роста (°/ о)

Потребность В среднем за за 19851990 В среднем 1990-1995 1999 2000 2005 2000 к 19851990 2000 к 19901995 2005 к 1985 2005 к 2000

Всего в т.ч. 34,4 40,7 44,8 47,8 56,3 138,9 117,4 179,3 117,8

Здравоохра -нение 14,3 21,9 23,4 25,1 26,3 175,5 114,6 196,3 104,8

Химико-фар-мпром. 18,9 16,2 17,6 18,2 24,0 126,9 116,7 134,8 131,8

Другие отрас-ли народного хозяйства 1,2 2,6 3,8 4,5 6,0 3,75 раз 1,73 раз в 6 раз 133,3

1.3. Биомасса изолированных тканей растений - новый вид сырья в технологии лекарсвенных средств

Проблему бесперебойного обеспечения химико-фармацевтической промышленности ЛРС можно решить с помощью метода культуры изолированных органов, тканей и клеток растений [397,447,453].

Главными преимуществами культивируемых in vitro растительных клеток перед интактными растениями являются: изолированность от влияния различных факторов внешней среды, таких как климатические и географические условия произрастания, повреждение вредителями, исключение попадания пестицидов и др., четкость системы производства продукта в заданные сроки и в необходимых количествах для обеспечения рынка; высокий выход и стабильное качество продукции (возможность быстрого получения достаточного количества сравнительно однородной биомассы в асептических, контролируемых по многим параметрам условиях выращивания; возможность синхронизации процессов клеточного деления

31 роста и дифференцировки; применение принципов непрерывного культивирования; возможность регулирования процессами роста и метаболизма клеток) [45,46,62,117,141,254,333,340,368,452 ].

К настоящему времени на основании значительного объема информации установлено, что практически все классы соединений вторичного обмена (алкалоиды, стероиды, гликозиды, терпеноиды и др.) синтезированы изолированно выращиваемыми клетками растений. Перечень соединений, идентифицированных в культурах клеток растений, представленный в табл. 1.2, свидетельствует об огромном синтетическом потенциале и разнообразии вторичного метаболизма в изолированных тканях [25,62,183,185,253,299,327,340,452,456,474,481,492,521].

Особую ценность представляют штаммы, так называемые суперпродуценты, способные к синтезу индивидуальных вторичных метаболитов в количествах, значительно превышающих их содержание в интактных растениях, что очень важно для развития и повышения эффективности технологического процесса. К настоящему времени только для меньшей части из многочисленного перечня растений, введенных в культуру получены штаммы-суперпродуценты, приведенные в табл. 1.3.

Как правило, получаемые на стадии введения в культуру, неорганизованно пролиферирующие каллусные и суспензионные культуры характеризуются низким содержанием синтезируемых БАВ, примерно на порядок ниже, чем в заготавливаемом органе растения. Для преодоления этого свойства культур in vitro, значительно ограничивающего применение их как продуцентов существует ряд подходов. Одни из них связаны с регуляцией процессов роста и биосинтеза на физиологическом уровне путем оптимизации условий культивирования, использовании предшественников биосинтеза, элиситоров, создания стресса [65,255,460,473,521].

Таблица 1.2- Соединения, идентифицированные в культурах клеток и тканей растений in vitro

Вид растения Идентифицированные соединения

Ajuga reptans Экдистероиды

Ammi visnaga Виснагин

Artemisia glabella Сесквитерпеновый лактон арглабин

Atropa belladonna Атропин, гиосциамин

Camptotheca acuminata Камптотецин

Cassia tora Антрахинон

Catharanthus roseus (=Vinca rosea) Аймалицин, серпентин и многие другие индольные алкалоиды; некоторые из них отсутствуют в исходном растении

Cephalotaxus harringtonia Цефалотаксин, харрингтонин

Coffea arabica Стигмастерол, кампестерол, ситостерол, кофеин, теобромин

Coleus blumei Розмариновая кислота

Coptis japonica Берберин, пальмитин, коптисин, ятрорицин, магнофлорин

Datura stramonium (или innoxia) Гиосциамин, скополамин и другие тропановые алкалоиды

Digitalis purpurea (или lanata) Антрахиноны, отсутствующие в исходном растении Стигмастерол, холестерин, ситостерол и многие другие стероиды Кардиотонические гетерозиды

Dioscorea deltoidea Стероидные сапонины, включающие диостенин

Ephedra foliata (или gerardiana) Эфедрин

Hyoscyamus niger Гиосциамин, скополамин и другие алкалоиды

Lithospermum erythrorhizon Шиконин и другие пигменты

Macleaya microcarpa Протопин, аллокриптин

Matricaria camomilla Эфирные масла

Morinda citrifolia Антрахиноны, мориндин

Nicotiana tabacum Никотин и другие алкалоиды Убихинон-10, токоферол, витамин К Глутатион, кумарины (скополетин)

Многочисленные стеролы (стигмастерол, ситостерол, кампестерол, холестерин), диосгенин Ферменты (фосфодиэстераза)

Panax ginseng Гинзенозиды, ферменты (СОД)

Papaver bracteatum Сангвинарин

Papaver somniferum Тебаин, папаверин, наркотин, нарцеин, протопин, сангвинарин

Podophyllum peltatum Подофиллин

Polyscias filicitolia Тритерпеновые гликозиды

Rauwolfia serpentina Резерпин, ресцинамин, аймалин, серпентин, аймалицин, перакин, некоторые из них отсутствуют в исходном растении Ферменты (СОД)

Rhaponticum carthamoides Экдистероиды

Ruta graveolens Алкалоиды (рутакридон, различные метилакридоны) Кумарины (бергаптен, псорален), эфирные масла, пигменты

Serratula coronata Экдистероиды

Stephania glabra Стефарин

Stevia reabudiana Дитерпеновые стевиолгликозиды

Thalictrum minus Берберин

Ungernia victoris Алкалоиды (галантамин, ликорин, горденин)

Таблица 1.3 - Культуры тканей растений - суперпродуценты БАВ [49, 41,24]

Содержание БАВ в Увеличение от сухой массы продуктивности

Растение БАВ В культуре тканей В культуры по сравнению с растении растением-, количество раз

Алкалоиды

Catharanthus roseus Аймалицин 1,8 0,3 6

Catharanthus roseus Серпентин 1,0-2,0 0,5 2,0-4,0

Coptis japonica Берберин 15,0 2-4 7,5-3,4

Eschscholzia californica Бензафенантридино-вые алкалоиды 1,7 0,4 4

Thalictrum minus Берберин 10,0 1,0 10

Ammi visnaga Виснагин 0,31 ОД 3

Ruta graveolens Рутакридон 1,5-2,0 од 20

Антраценпроизводные

Cassia tora Антрохиноны 6,0 0,6 10

Morinda citrifolia Антрохиноны 18,0 2,2 8

Нафтохиноны

Lithospermum erythrorhizon Шиконин 12,4 1,5 8

Сапонины

Panax ginseng Панаксозиды 2,2 0,5 4

Dioscorea deltoidea Диосгенин 7,8 3,0 2,6

Tripterygium wilfordii Дитерпеноид 0,2 0,01 20

Coleus blumei Розмариновая кислота 15-25 3,0 5-8

Nicotiana Убихинон-10 0,036 0,003 12 tabacum

Другие основаны на использовании генетической вариабильности изолированных клеточных культур посредством мутагенеза, клонирования и клеточной селекции [308,407].

В настоящее время перспективными для получения культур-суперпродуцентов является сочетание обоих подходов [308,299,399].

В результате осуществления мутагенеза и оптимизации селективных систем был выделен ряд перспективных клеточных клонов и штаммов продуцентов, характеризующихся стабильностью в течение многих лет [1,2,6,247,321,504]. Однако, поскольку изменчивость популяций является характерной особенностью клеточных культур, потеря селектируемого признака весьма вероятна при длительном культивировании [299]. При этом клетки могут сохранять или, наоборот, утрачивать способность к синтезу спектра БАВ, присущих интактному растению. Факт длительного сохранения клеточными штаммами способности к синтезу ряда специфических групп вторичных соединений установлен для культур Panax ginseng, Dioscorea deltoidea, Rauwolfia serpentina, Solanum laciniatum, Ruta graveolens [1,2,291,321,468].

С другой стороны, пересеваемая культура клеток Papaver bracteatum Lindl. синтезировала сангвинарин и теряла способность к синтезу тебаина, характерного для взрослого растения. В свою очередь, сангвинарин отсутствовал в сформировавшемся растении и обнаруживался в листьях только в первый год его жизни, что авторы связывают с низким уровнем дифференцировки [315].

Влияние степени дифференциации клеточных культур на их биосинтентические способности описаны для ряда культур - полыни гладкой, раувольфии змеиной, подофилла щитовидного, барвинка розового и др. [106,327,482].

Часто спектр синтезируемых БАВ в культивируемых клетках шире, чем в интактных растениях; в ряде случаев установлен синтез веществ, не характерных для исходных растений [46,254,362].

По мнению некоторых авторов, для метаболизма вторичных соединений в изолированной культуре клеток является также характерным "своеобразный" спуск либо по филогенетической, либо по онтогенетической "лестнице" [254,315]. Например, в культуре клеток живокости были п определены А -стерины, не синтезируемые интактным растением, но характерные для филогенетически ранних групп растений [502].

Приведенные данные свидетельствуют, что культивируемые клетки растений можно рассматривать не только как альтернативное сырье для получения традиционных продуктов, но и как системы, способные к синтезу новых химических структур, то есть как источник принципиально новых продуктов.

Для большинства культур процессы клеточной пролиферации, рост клеток и их биосинтетическая активность разобщены во времени при выращивании в периодических системах. Обычно синтез вторичных продуктов возрастает в фазе замедленного роста культуры и достигает максимума в стационарной фазе развития.

При этом показано, что механизмы и условия, блокирующие клеточную пролиферацию, являются одновременно механизмами активации, обеспечивающими синтез ферментов вторичного метаболизма [462].

Взаимосвязь процессов роста и биосинтеза БАВ в культуре клеток имеет большое значение для сохранения стабильного уровня синтеза в клеточных линиях при длительном культивировании. Как уже указывалось, изолированные клетки, длительно выращиваемые in vitro, представляют собой генетически гетерогенные популяции. Сохранение или потеря признаков будет зависеть от селективного процесса, в котором преимущества получают клетки с большей скоростью размножения.

В работах с культурами клеток диоскореи дельтовидной [308], василистника малого [265] показано, что при взаимоисключении процессов роста и синтеза образование вторичных метаболитов в клеточных линиях и штаммах будет не стабильным, если же рост и биосинтез совпадают, то можно ожидать стабильного синтеза в течение длительного времени. Такие культуры могут быть рекомендованы в качестве активных продуцентов.

Продуктивность и стабильность штаммов культур клеток также в значительной степени определяются условиями культивирования, такими как трофические и гормональные компоненты питательной среды, физическими факторами (температура, освещение, аэрация), а также методами выращивания.

Вопросы изучения и разработки оптимальных режимов выращивания изолированных клеток и тканей растений, их поддержания в коллекции достаточно широко освещены [42, 43, 57, 99, 117, 141, 150, 236, 247, 261, 321, 389, 390, 456, 479, 486,517].

Таким образом, с использованием метода культуры тканей возможно получить биомассу, обогащенную целевым продуктом, что является перспективным именно в технологии индивидуальных препаратов. Одним из направлений в этой области является развитие в последние годы метаболической инженерии растений, позволяющей посредством переноса гена, определяющего направленный синтез БАВ, в другое растение и превратить его в продуцент необходимых биологически активных веществ [45]. Такая технология наиболее применима для работы с уникальными ценными тропическими и эндемическими растениями, недоступными для их агротехнического производства в умеренных климатических зонах.

Достигнутые результаты по исследованию метаболизма и его регуляции в изолированных клетках и тканях растений позволили перейти к разработке промышленных технологий с целью получения экономически важных целевых продуктов. К настоящему времени на основе биомассы, полученной в результате выращивания клеток и тканей in vitro разработан ряд технологий лекарственных препаратов, биологически активных добавок и лечебно-профилактических косметических средств.

Биотехнологическое производство шиконина из культуры клеток Lithospermum erythrorhizon, берберина из культуры клеток Coptis japonica и убихинона-10 из биомассы клеток Nicotiana tabacum реализовано в Японии [455,481].

В настоящее время спрос на препараты женьшеня постоянно растет, завоевывая новые рынке в Европе, Египте, Израиле, Чили, Эквадоре, Бразилии и др. Наиболее разнообразен ассортимент составов с женьшенем (как пищевых добавок) в развитых странах с профилактической направленностью медицины и большой продолжительностью жизни населения - в Японии и США [342]. Все это говорит о высоком спросе на сырье. В России дикорастущий женьшень встречается только на дальнем востоке, однако, в последние годы заросли его резко истребляются. Культивирование растения, занимающее 5-6 лет, недостаточно эффективно и довольно рискованно, т.к. зависит от природных факторов. Альтернативным решением проблемы дефицита сырья стало получение биомассы женьшеня с использованием метода культуры ткани.

Одним из первых лекарственных препаратов на основе биомассы, вышедших на отечественный рынок, была настойка "Биоженьшень", получаемая из изолированных клеток женьшеня и рекомендованная в качестве тонизирующего и стимулирующего средства (ВФС 42-1890-89).

Экстракты из биомассы женьшеня, обладающие антиоксидантным, иммуностимулирующим и противовоспалительным действием, входят в состав Б АД к пище, например, "Неовитин", и пищевых продуктов [5].

Начат выпуск пищевой добавки и косметических средств на основе настойки из биомассы клеток Ungernia victoris, проявляющей антимутагенное, радиопротекторное, общестимулирующее, противоопухолевое действие [185].

Изучение экстрактов из биомассы клеток полисциаса показало, что они оказывают противовоспалительный, антигриппозный, антитератогенный эффекты, что дало возможность разработать ряд средств на их основе — БАД

39 к пище "Витагмал", "Антивирол", "Антерат" и кремы серии "Витагмалин" [182].

На АО "Биохиммаш" разработана опытно-промышленная установка для производства биомассы клеток воробейника краснокорневого и арнебии красящей, входящих в состав препарата "Эритроризан" для лечения гнойных заболеваний кожи и мягких тканей [352] .На этой же производственной базе планируется осуществить промышленное производство паклитакселя, выделяемого из биомассы клеток Taxus и являющегося биологически активным компонентом ряда противораковых препаратов[364]. Впервые таксол (первоначально названный паклитакселем) начал использоваться для лечения раковых заболеваний в 1992 г. В настоящее время фирма Bristol-Myers Squibb производит препарат для лечения рака яичника, выделяя таксол из коры дикорастущих деревьев Taxus brevifolia. Как правило, концентрация таксола в растениях Taxus очень мала, а потребность в таксоле будет возрастать по мере его применения против других видов рака — груди, легких [501].

Одним из критериев успешного промышленного применения технологий на основе культур тканей растений является цена продукта. В настоящее время получаемое этим методом сырье является дорогим и в ряде случаев не может конкурировать с заготовкой интактных растений [46,368,455].

Однако, анализ данных литературы и патентных разработок показывает, что метод культивирования изолированных растительных клеток и тканей достиг в последнее десятилетие высокого технического уровня, пригодность его для решения ряда технологических и медицинских проблем не вызывает сомнений [38, 46, 55, 186, 204, 252, 333, 397, 424, 428, 436, 439, 454, 458, 508, 509].

В настоящее время в РФ осуществляется выпуск лекарственных препаратов и косметических средств на основе биомассы клеток женьшеня, полисциаса папоротниколистного, воробейника краснокорневого и родиолы

40 розовой [182,339,341,352,444,455]. Проводятся работы по созданию препаратов с использованием культур тканей стефании гладкой, диоскореи дельтовидной, унгернии Северцева, алтея лекарственного, подофилла щитовидного, солодки голой, тисса и др. растений [182,185,254,327,339,364,481].

Особенно перспективно применение биомассы как источника БАВ, тех видов растений, которые являются редкими, исчезающими, произрастающими в труднодоступных регионах или с трудом культивируемых на плантациях.

Не случайно в последние годы в России прекращен выпуск ряда лекарственных препаратов, главным образом, содержащих индивидуальные БАВ, производство которых осуществлялось из сырья, поставляемого странами дальнего и ближнего зарубежья.

Основными направлениями в развитии технологии биомассы и препаратов на ее основе являются поиск способов регуляции продуктивности клеточных культур, использование эффективных селекционных систем, направленных на повышение синтеза целевого продукта, оптимизации условий и способов выращивания штаммов-продуцентов и, как следствие, снижение стоимости целевого продукта.

В многочисленных исследованиях отечественных и зарубежных ученых показана возможность и перспективность использования биомассы, полученной методом культуры тканей, как нового вида JIPC, главным образом, в технологии настоек, мазей, лечебно-косметических средств и биологически активных добавок. Однако, методологические подходы к разработке технологии биомассы, с целью повышения ее продуктивности, основанные на установленных закономерностях и особенностях развития культур тканей растений, до настоящего времени не предложены. Кроме того, сведений о проведении комплекса НИР, позволивших получить штаммсуперпродуцент, оптимизировать условия культивирования с целью наработки биомассы на его основе, разработать технологию выделения

41 субстанции индивидуального БАВ и получения лекарственной формы препарата с утверждением НД для организации промышленного производства мы не встретили ни в одном доступном источнике научной и патентной литературы. Поэтому как проведенные нами ранее, так и планируемые в диссертационной работе исследования являются актуальными [147-156,256,267,394]

1.4. Экстрагирование лекарственного растительного сырья и пути интенсификации процесса

1.4.1 Основные закономерности процесса экстрагирования

В основе технологии всех фитопрепаратов лежит стадия экстрагирования ЛРС, поэтому от того, как организован этот процесс, в значительной степени зависит достигаемый выход БАВ и длительность процесса получения готового продукта.

Экстрагирование ЛРС является сложным физико-химическим процессом, определяемым законами массопередачи, физико-химическими свойствами извлекаемых веществ и применяемого экстрагента [24,302]. При экстрагировании высушенного растительного сырья обычно выделяют следующие этапы, которые взаимосвязаны и протекают почти одновременно: смачивание внешней поверхности сырья и проникновение экстрагента в сырье под действием капиллярных сил; смачивание веществ, находящихся внутри клеток за счет вытеснения воздуха из клеток сырья и заполнение их экстрагентом; десорбция и растворение веществ, находящихся на клеточных стенках или в виде высохших кусочков внутри клеток и смыв веществ из разрушенных клеток и открытых пор; массоперенос веществ через пористые клеточные стенки путем молекулярной диффузии; массоотдача веществ от поверхности материала в раствор. Проникновение экстрагента в частицы сырья происходит под действием капиллярных сил, и скорость его определяется поверхностным натяжением и вязкостью растворителя. Чем выше поверхностное натяжение растворителя, тем медленнее происходит пропитка растительных частиц. Следует отметить, что структурный материал клеточных стенок обладает дифильными свойствами, причем для клетчатки в гораздо большей степени выражена гидрофильность [57,223]. Заполнению частиц экстрагентом препятствует воздух, находящийся в порах, из-за чего продолжительность процесса пропитки может быть значительной и лимитируется скоростью вытеснения воздуха из капилляров и его диффузии в жидкость [16,17,23]. Для ускорения процесса применяют предварительное вакуумирование сырья, повышение давления и различного рода пульсационные воздействия на систему [17,207, 237,311].

Проникая внутрь клеток и вступая в контакт с ее содержимым экстрагент вызывает увеличение размеров частиц сырья в результате их набухания. Динамика поглощения экстрагента при набухании сырья оказывает непосредственное влияние на кинетику экстрагирования веществ. Продвижение экстрагента происходит быстрее по крупным капиллярам и сосудам, снижение скорости в боковых направлениях вызывают полупроницаемые перегородки клеточных стенок. Процессы смачивания протекают одновременно с проникновением экстрагента в сырье, и от них в большой степени зависит скорость экстрагирования [24,239,302].

Скорость процесса растворения веществ, находящихся в клетке, подчиняется, как известно, первому закону Фика и в основном зависит от коэффициента массопередачи:

4Z=KF(ck-Ch), (1) где G - масса растворенного вещества в момент времени т, кг; F — поверхность частицы, м ; Ск — концентрация конечная, кг/м ; С„ концентрация начальная вещества в растворе, кг/м3: К — коэффициент массопередачи.

Чаще всего скорость межфазного перехода высока, поэтому у поверхности растворения формируется слой насыщенного раствора, откуда вещество диффундирует через пограничный слой в основной объем растворителя [24]. Коэффициент скорости растворения в этом случае приблизительно равен коэффициенту массоотдачи:

K*P = DX IS, (2) где Р - коэффициент массоотдачи; DM - коэффициент молекулярной диффузии; 8 — толщина диффузионного пограничного слоя.

Толщина диффузионного слоя зависит от гидродинамических условий процесса растворения. Внутри растительного материала растворитель практически не двигается, поэтому скорость экстрагирования будет определяться скоростью массопередачи через пористое тело и толщину диффузионного слоя можно считать равной размеру частиц сырья. Для вещества, находящегося на поверхности частиц сырья, условия меняются -под воздействием гидродинамических условий значительно уменьшается толщина диффузионного слоя.

Некоторые вещества внутри клеток связаны силами притяжения и при растворении экстрагент должен вызывать их десорбцию. Проникая в растительную клетку и насыщаясь веществами, экстрагент образует концентрированный раствор, так называемый «первичный сок». Градиент осмотических давлений в клетке и внешнем экстрагенте способствует проникновению растворителя в клетку, одновременно с этим протекает диализ - диффузия извлекаемых веществ через клеточную стенку по градиенту концентрации до наступления динамического равновесия.

Скорость растворения вещества внутри частиц будет определяться скоростью массопередачи его через пористое тело, а на поверхности — скоростью массоотдачи от поверхности тела. Скорость растворения вещества на поверхности значительно увеличивается при создании соответствующих гидродинамических режимов. Это проявляется в появлении «периода быстрой экстракции», характеризующем процессы смыва вещества из разрушенных клеток и открытых пор.

Скорость массопереноса веществ через клеточные стенки зависит от многих факторов - количества и структуры слоев материала, числа и диаметра пор в клеточных оболочках, количества и размеров клеток, а также других особенностей строения растительных тканей. Но, принимая во внимание малые размеры капилляров и микропор в клеточной стенке, а также сложность учета всех вышеперечисленных факторов, для описания процесса используют данные работ по изучению массопереноса через полупроницаемые мембраны [17,23,302]. В полупроницаемой мембране коэффициент массопередачи значительно снижается и принимает значение Di = т D L где m-коэффициент, определяющий пористость растительного материала. В этом случае величину D\ называют коэффициентом массопроводности [23,24].

Изменение концентрации диффундирующего извлекаемого компонента в определенной точке периферийного слоя пористого тела описывается дифференциальным уравнением нестационарной диффузии: д2С д2С д2С1 + —— + —— дх2 ду2 dz2 )

3) дт

Поток вещества, переносимого из периферийного слоя к поверхности частицы:

4) dt дп где - градиент концентрации диффундирующего компонента по нормали дп к поверхности пористого тела по координате п.

Такое же количество вещества отводится с поверхности частицы по механизму массоотдачи, поэтому: где Сп— концентрация вещества на поверхности частицы, Сж — концентрация вещества в жидкой фазе. Для сферических частиц последнее уравнение может быть приведено к формуле: где безразмерный радиус (р = r/R; R - радиус частицы растительного материла; г,- — рассматриваемый радиус растворяемой частицы (0 > г, < R); Bi ~ Р • R/D - критерий Био.

Возможны два предельных случая экстрагирования. Если Bi —> оо , то Сп и градиент концентрации внутри частиц достигает максимального значения. Такой режим называется внутридиффузионным, так как скорость процесса экстрагирования определяется скоростью диффузии в пористых частицах. Если коэффициент массоотдачи мал и Bi «1, то градиент концентраций внутри пористых частиц стремится к нулю и распределение вещества в них равномерное. Такой режим называется внешнедиффузионным, так как скорость процесса лимитируется скоростью диффузии извлекаемого компонента с поверхности частиц [161,302].

При установившемся режиме массопередачи движущей силой процесса является разность концентраций извлекаемого вещества в жидкой и твердой фазах. В этом режиме происходит перенос вещества из ядра частиц к их поверхности, диффузия через ламинарный подслой и конвективный перенос вещества с его поверхности в объем экстрагента [23,302]. Процесс описывается уравнением:

6) dG = K-F-{Cm-Cj-dt ,

7) 2 где К - коэффициент массопередачи, м/с; F — поверхность контакта фаз, м ; г - время экстракции, с; Ст - концентрация вещества в твердой фазе, кг/м ; Сж — концентрация вещества в жидкой фазе, кг/м3.

В реальный условиях эффективность экстракции в значительной степени зависит от природы растительного сырья и его технологических свойств. Технологические свойства сырья описываются рядом параметров, учитывающих анатомо- морфологическое строение ЛРС, способ и степень измельчения, удельную, объемную и насыпную плотность, пористость и порозность, свободный объем слоя, удельную поверхность и др. [228,239,302,392].

Кроме того, на эффективность экстракции оказывают влияние такие факторы, как природа экстрагента, его вязкость, применение поверхностно активных веществ, температурный режим и продолжительность экстракции, гидродинамические условия проведения процесса. В литературе накоплен значительный экспериментальный материал о степени влияния каждого из перечисленных факторов на процесс извлечения БАВ из ЛРС.

1.4.2 Интенсификация процесса экстрагирования лекарственного растительного сырья

Эффективность экстрагирования ЛРС, как любого массобменного процесса, определяется скоростью протекания наиболее медленной стадии, и именно на нее должны быть направлены интенсифицирующие воздействия.

Предварительным вакуумированием сырья или проведением пропитки в переменном поле давления достигается ускорение процессов набухания сырья за счет удаления из него защемленного газа [16,303]. Если процесс протекает во внутридиффузионной области (диффузия молекул в пористых телах), то его ускорение достигается увеличением скорости внутренней диффузии за счет уменьшения размеров частиц, повышения температуры или частичной заменой диффузионного массопереноса на конвективный. В том случае, когда наиболее медленной стадией является отвод целевого компонента с поверхности пористых тел или подвод экстрагента (внешнедиффузионная область) на скорость процесса существенное влияние оказывают гидродинамические условия в аппарате [119].

В основе гидродинамических методов, интенсифицирующих в системе твердое - жидкость, лежит передача системе вибрации, пульсации или колебаний различных амплитуд, частот, интенсивностей. К распостраненным импульсным методам обработки материалов относят механические, гидравлические, электроимпульсные и магнитоимпульсные методы.

Механические колебания жидкости способствуют непрерывному обтеканию твердых частиц жидкостью с переменным вектором скорости. Экспериментально доказано, что наложение поля колебаний ускоряет внешний массобмен [24,122,123].

Интенсифицирующее воздействие пульсаций давления не ограничивается ускорением процесса на стадии пропитки. Оно положительно сказывается и на последующих стадиях, хотя и не столь значительно.

Гидравлические удары, кавитация, механическая деформация сырья и другие эффекты способствуют снижению внешнедиффузионного сопротивления и

48 ускорению массопереноса внутри капиллярно- пористых тел [103,139,270,326].

Для интенсивного гидромеханического воздействия на обрабатываемое сырье, эффективный турбулизации и пульсации потока в фармацевтической промышленности широкое использование получили роторно-пульсационные аппараты (РПА) [30]. В аппаратах этого типа сочетаются принципы работы интенсивных смесителей, дезинтеграторов и дисмембраторов, центробежных и вихревых насосов, коллоидных мельниц [30,202]. Благодаря этому достигается высокая дисперсность компонентов, обеспечивается требуемая интенсификация массообменных процессов, повышается коэффициент использования сырья.

Однако, именно за счет эффективного измельчения сырья в извлечения переходят значительное количество балластных веществ, что затрудняет дальнейшую очистку. Кроме того, может иметь место, как сопутствующий измельчению, процесс механического активирования, при котором возможно изменение свойств получаемых продуктов [326,387].

Перспективным направлением интенсификации экстрагирования в аппаратах с переменным давлением является использование пульсационной резонансной аппаратуры (ПРА) [16,17,271]. В разрабатываемых комбинированных пульсационных аппаратах амплитуда и частота пульсации подбираются т.о., чтобы относительная скорость движения фаз была максимальной, что приводит к постоянному обновлению диффузионного пограничного слоя на поверхности твердой фазы и способствует увеличению эффективности процесса [311].

Значительно ускорить процесс экстракции растительного материала можно под действием ультразвука (УЗ) с частотой колебаний выше 20000 Гц

77,229,363,388]. Ускорение процесса экстракции под влиянием ультразвуковой энергии объясняется возникающими эффектами перемешивания, нагрева и кавитации. Экспериментально установлено, что

УЗ ускоряет процессы растворения частиц, массоперенос в пористых телах с

49 большими размерами пор и увеличивает проницаемость перегородок растительного происхождения [30]. Недостатками ультразвукового способа интенсификации, наряду со сложностью и относительно высокой стоимостью установок, часто являются изменения или потеря фармокологической активности веществ за счет явлений химической деполимеризации [229,230].

Исследования, проведенные по экстрагированию растительного сырья при низкочастотной (3- 5 Гц) и высокочастотной (1,5- 20 МГц) обработке свидетельствуют не только об ускорении цикла экстракции, но и увеличении выхода БАВ. Воздействие низкочастотных колебаний может быть отнесено к пульсационным способам растворения вещества, совмещенным с естественной конвекцией, прямым обтеканием, гравитационным или инерционным способом В поле высоких частот электромагнитных волн, по мнению авторов, увеличивается десорбция экстрагируемых веществ, снижается степень гидратации, вследствие чего увеличивается массоперенос вещества в системе клетка- экстрагент [56,328]. Однако несмотря на высокую эффективность данного способа он не получил распространения в промышленных масштабах, что в основном связано с малой глубиной проникновения СВЧ поля [115,471,487].

При электроимпульсном способе интенсификации процесса экстрагирования, колебательного движения экстрагента достигают при высоковольтном разряде, образующемся в результате аккумулирования электрической энергии, а затем ее выделения в короткие промежутки времени. Электрические разряды создают условия для очень быстрого течения внутриклеточной диффузии [81].

Основным недостатком рассмотренных методов интенсификации процесса экстрагирования являются большие энергозатраты, при этом гидродинамические воздействия дают эффект только на начальной стадии процесса. Далее массоперенос в пористых частицах переходит из диффузионно- конвективного режима в диффузионный и большие расходы энергии на обработку сырья становятся не эффективными [118].

1.4.3 Влияние природы экстрагента на эффективность извлечения биологически активных веществ (БАВ)

Одним из наиболее распространенных, доступных и эффективных способов извлечения БАВ из разных частей растений является экстракция сырья растворителями различной полярности.

Тип экстрагента, применяемого для экстрагирования определенной группы веществ, играет решающую роль. Рассматривая степень гидрофильности веществ, экстрагируемых из растений, их можно условно разделить на растворимые в полярных растворителях - гидрофильные, растворимые в малополярных растворителях — смешанной группы и растворимые в неполярных растворителях - гидрофобные (табл. 1.4) [302].

Выбор экстрагента для экстрагирования зависит от степени гидрофильности извлекаемого вещества. На примере изучения процесса экстрагирования корня солодки, ценного ЛРС, содержащего комплекс БАВ, было показано, что подбирая экстрагенты возможно селективно извлекать различные группы БАВ: гексаном или петролейным эфиром - липиды, этилацетатом - агликоны и частично моногликозиды флавоноидов, этиловым спиртом - гликозиды флавоноидов, водным раствором оснований или ацетоном, содержащим 5% азотной кислоты, - глицирризиновую кислоту [102].

Таблица 1.4 - Гидрофильность ряда экстрагируемых веществ растительного происхождения

Гидрофильные Смешанные Гидрофобные

Соли алкалоидов Гликозиды Дубильные вещества Углеводы Соли терпеноидных сапонинов Водорастворимые витамины Основания алкалоидов Агликоны гликозидов Дубильные вещества Стероидные сапонины Терпеноидные сапонины Кумарины Жирные масла Эфирные масла Смолы Жирорастворимые витамины Стерины Липиды

Необходимо отметить, что экстрагент оказывает влияние не только на экстрагирование какой-то определённой группы веществ, но и общее количество извлеченных веществ зависит от гидрофильности экстрагента. Учитывая, что в растениях большинство веществ гидрофильные, более полярные экстрагенты будут извлекать больше экстрактивных веществ.

Кроме диэлектрической постоянной экстрагента, большое влияние на растворимость и скорость диффузии веществ в нём оказывают и другие физические свойства, такие как вязкость и поверхностное натяжение. Целесообразно при экстрагировании использовать наименее вязкие растворители.

Наиболее широкое применение в фармации для экстрагирования нашли вода очищенная и спирт этиловый, а также спирто-водные смеси. При смешивании спирта с водой диэлектрическая постоянная смеси может быть изменена в больших пределах и это позволяет такими смесями экстрагировать широкий спектр веществ.

Для уменьшения поверхностного натяжения на границе раздела фаз в экстрагент вводят поверхностно-активные вещества (ПАВ). Рядом авторов установлено, что поверхностно-активные вещества значительно ускоряют процесс экстракции алкалоидов, гликозидов, эфирных масел и других соединений из растительного сырья [78,79,132,133]. Показано, что под влиянием растворов ПАВ при экстракции эфирных масел из растений

52 снижается поверхностное натяжение воды и облегчается процесс пропитки, смачивания и набухания растительного сырья. Увеличение выхода рутина при экстракции из бутонов софоры японской отмечено при использовании растворов ПАВ в различных концентрациях [132,133]. Добавление к экстрагенту 2,5 % твина-80 позволило увеличить выход действующих веществ при экстракции цветков ромашки [140].

Однако, в ряде случаев добавление ПАВ к экстрагенту не ускоряет процесс экстракции, по-видимому, из-за наличия природных ПАВ в растительном сырье [197].

В последние годы при производстве фитоэкстрактов стали использовать такие экстрагенты для извлечения БАВ из сырья, как 1,2-пропиленгликоль, ПЭГ-400, глицерин, широко применяемые в качестве неводных растворителей в технологии готовых лекарственных средств [32,98,120,195, 385,426 ]. Их добавление к воде значительно уменьшает ее поверхностное натяжение, что позволяет интенсифицировать процесс извлечения БАВ из сырья [32].

В технологии медицинских масел (масляных экстрактов) в качестве экстрагентов используют жидкие жирные масла, которые представляют собой смеси триглицеридов высших жирных кислот (ВЖК)[241,403]. По внешнему виду - это массы плотной однородной консистенции или маслянистые жидкости пряного вкуса и запаха, обусловленного присутствием эфирных масел. Жидкие масла получают из семян и плодов растений и они содержат ненасыщенные жирные кислоты: олеиновую, линолевую, линоленовую и гидроксиолеиновую. В зависимости от природы ненасыженных жирных кислот жидкие масла подразделяют на высыхающие (льняное, конопляное и др.), полувысыхающие (подсолнечное, кукурузное и др.) и невысыхающие (миндальное, персиковое, оливковое, касторовое и др.) [ 370,403].

Для приготовления лекарственных препаратов чаще всего используют миндальное, персиковое, оливковое, подсолнечное и другие масла. Качество

53 их регламентировано ГФ X издания и соответствующими фармакопейными статьями по определенным показателям: цвет, запах, вкус, растворимость, плотность, число омыления, йодное, кислотное, эфирное число и др. При установлении чистоты жирных масел определяют примеси парафина, воска, минеральных масел и смоляных кислот [89,403].

При производстве масляных экстрактов используют масла растительные (оливковое, соевое, кукурузное, подсолнечное и др.), минеральные (вазелиновое), животные жиры и их отдельные фракции, которые обладают избирательностью к липофильным БАВ (каротиноиды, жирные масла, токоферолы и т.п.). Из-за высокой вязкости масел процессы экстрагирования в таких системах затруднены, поэтому их используют в нагретом состоянии, непосредственно экстрагируя сырье или проводят предобработку JIPC, например этанолом или этанольно- аммачным раствором [40,97,366]. Предобработка сырья смесью двух растворителей (этанол- хлад он 113) позволила получить экстракты на норковом жире из кукурузных рылец, плодов шиповника, травы и цветков зверобоя и ромашки [97].

Успешно были использованы в качестве экстрагентов фракции моно-, ди-, и триацилглицеринов НЖК, полученных в результате глицеролиза подсолнечного масла, для извлечения пигментов и витаминов из ЛРС, причем моноацилглицерины оказались более эффективными [97,515].

Однако, в некоторых случаях использование жидких растительных масел или экстрактов на их основе в составах лекарственных и лечебно-косметических средств является нежелательным. В связи с этим для экстрагирования липофильных БАВ из сырья предложены синтетические эфиры ВЖК, а также некоторые другие эмоленты, применяемые в косметике, и характеризующиеся различной полярностью, вязкостью и растекаемостью [35]. Установлено, что эти соединения, в ряде случаев, по эффективности извлечения БАВ превосходят традиционно используемые растительные масла [100,307].

В настоящее время наряду с медицинскими маслами широкое применение в фитотерапии и фитокосметике получили липофильные экстракты извлекаемые из ЛРС и отходов его переработки неполярными, малополярными растворителями, сжиженными газами и их смесями. Они отличаются от масляных экстрактов разнообразием липофильных компонентов (фосфолипиды, гликолипиды, стеролы, тритерпены, алкалоиды, дубильные вещества и др.), что расширяет их спектр фармокологического действия [97].

Предложены пероральные, парентеральные и наружные лекарственные средства, оказывающие противовоспалительное, болеутоляющее, противоожоговое, ранозаживляющее и антивирусное действие, которые содержат липофильные экстракты из лекарственного эфиро-масличного и пряно-ароматического сырья [97]. Так, полученный в результате многостадийного процесса экстрагирования и очистки липофильный экстракт из растений сем. Resedaceae был обогащен В- ситостеролом, а-токоферолом, а-линоленовой кислотой и использовался в составе противовоспалительных косметических и лекарственных препаратов [97]. •

С использованием пищевого бензина был получен липофильный эктракт из надземной части Daucus sativus, содержащий 60% триацилглицеринов, тритерпенолов, алканолов, полипренолов, и обладающий ранозаживляющей и противоожоговой активностью [49]. Более высокий выход липофильных БАВ был получен при экстракции мяты смесью гидрофобных и гидрофильных растворителей (бензин с этанолом или изопропанолом) [97].

Однако, использование в качестве экстрагента пищевого бензина марки «Нефракс» может способствовать увеличению содержания в эктракте железа, молибдена, никеля, меди, цинка, а также токсического элемента свинца, в количестве, значительно превышающем допустимые значения концентраций, нормируемых ГФ [370].

В технологии фитопрепаратов, особенно индивидуальных фитосоединений, для извлечения БАВ используют также органические растворители: хлороформ, хлористый метилен, этил ацетат, гексан и др. Обладая хорошей избирательностью, они широко используются для исчерпывающей и дробной экстракции определенных групп БАВ липофильного характера.

Экстракция ростков пшеницы петролейным эфиром в установке «Сокслет» позволяет сохранить нативный комплекс БАВ, благодаря чему получаемый витаминный липофильный экстракт широко применяется в лекарственных и косметических препаратах [97]. Масло мякоти околоплодника облепихи, полученное экстракцией органическими растворителями значительно превосходило по содержанию БАВ фармакопейное на основе подсолнечного или соевого масел. Кроме индивидуальных органическх растворителей для извлечения липофильных БАВ используют их смеси. Например, для увеличения выхода фосфолипидов в технологии дынного масла предложен хлороформ - метанольный экстрагент [97].

Применение органических растворителей имеет ряд ограничений, основным из которых является взрывопожароопасность этих экстрагентов. Кроме того, их остаточные количества в препарате могут оказывать токсическое воздействие на организм человека.

В последние годы широкое распространение получило использование сжиженных газов для экстрагирования ЛРС, особенно жидкой углекислоты в докритическом и надкритическом состоянии [52,97,162,443,463,510]. Использование сжиженных газов позволяет сократить время экстракции, извлечь безводные нативные соединения, исключить воздействие высоких температур на стадии концентрирования вытяжек и повысить качество фитопрепаратов [233].

Для экстракции растительного сырья также используют пропан (C3Hg), бутан (СфНю), хлор- и фторсодержащие углеводороды. Сжиженные газы

56 химически индифферентны по отношению к извлекаемым веществам, нетоксичны, не образуют взрывоопасных смесей с воздухом, пожаро- и взрывобезопасны (за исключением пропана и бутана). Для экстрагирования ЛРС сжиженными газами была разработана технология и предложена установка [52]. Экстракты, полученные с помощью сжиженных газов, представляют собой сложные смеси, содержащие жиры, сложные эфиры, лактоны, карбонильные соединения, фенолы, витамины, воски, гликозиды, триглицериды и другие соединения. Для производства таких экстрактов целесообразно использовать воздушно-сухое сырье, содержащее остаточную влагу не более 12-14%. Необходимо измельчение растительного сырья в крупку с последующим лепесткованием до размера частиц (0,1-0,2) мм .

Жидкой СО2 в докритическом состоянии выделены липофильные экстракты из 69 видов лекарственного, зернового сырья, плодов и отходов переработки растительной биомассы [97]. Однако, являясь малополярным растворителем, диоксид углерода плохо либо вообще не извлекает такие БАВ, как глико-, фосфолипиды, часть нейтральных липидов, производные хлорофилла, каротины [52].

Показано, что хладоны ряда метана, пропана и бутана извлекают эфирные и жирные масла, производные кумаринов, каротиноиды, токоферолы, сесквитерпены, терпеноиды, стерины, хлорофиллы, алкалоиды и ряд других соединений, в основном липофильной природы. Причем хладоны обладают избирательностью в отношении разных групп природных веществ. Так, наиболее селективным в отношении эфирных масел является хладон — С318, практически не извлекающий жирных масел [52]. Также установлено, что хладоны не извлекают водорастворимые вещества (полисахариды, белки, фенольные соединения и др.). Следовательно, последующая обработка шрота более полярными растворителями (вода, водноспиртовые растворы, спирты) позволит комплексно использовать ценное растительное сырье.

По разработанной технологии в ГНЦЛС был получен ряд липофильных препаратов с использованием хладона-12: масло облепиховое, масло шиповника, каротолин. Предложена технология новых препаратов: аромелина - из плодов аронии черноплодной, сорбилина - из плодов рябины обыкновенной и ликоперсикола — из семян томатов [52].

Сравнительное изучение различных экстрактов травы шалфея показало, что из шести экстрактов, полученных с применением диоксида углерода, петролейного эфира, ацетона, диэтилового эфира, хладона и этанола, наибольшим антибактериальным действием обладает петролейный экстракт, в меньшей степени это свойство присуще СОг- экстракту, ацетоновому и диэтилэфирному [395].

Таким образом, рациональный выбор экстрагента для извлечения из растительного сырья определенных групп веществ во многом определяет скорость процесса экстрагирования и качество получаемого препарата. В настоящее время для получения средств с заданным фармакологическим действием применяют различные сочетания углеводородных, масляных, спирто-глицериновых, хладоновых и СОг- экстрактов.

1.5. Технологии фитопрепаратов на основе комплексной переработки лекарственного растительного сырья

За счет многообразия биологически активных веществ (БАВ), содержащихся в растениях, терапевтический эффект суммарных ФП складывается из суммы множественных воздействий на организм и функциональные системы. Следует отметить, что стремление ' к максимальному использованию всего комплекса растительных БАВ прослеживается во многих традиционных системах, а также в практике народной медицины [194, 346].

Методологические подходы к комплексной переработке ЛРС могут быть различными.

Одним из них является использование для получения ФП различных частей растения, например, корней и листьев женьшеня [349], корней и листьев солодки [351], коры и листьев осины [354].

Другим традиционным способом переработки является использование ЛРС для получения одного или нескольких ФП по отдельным технологическим схемам. При этом в шроте остается значительное количество БАВ различной химической природы. Примером такого подхода является использование корней солодки из которых получают экстракты, сироп, новогаленовые препараты «Глицирам» и «Глициренат», содержащие сапонины, флавоноидные препараты «Ликуразид» и «Ликвиритон», обладающие широким спектром фармакологического действия [223,351].

В настоящее время широко применяется в производственных условиях комплексная технология плодов шиповника, в основу которой положено последовательное извлечение БАВ из плодов, шрота и семян различными экстрагентами, что позволяет получить препараты аскорбиновой кислоты, концентрат витаминов группы Р, каротиноидный препарат «Каротолин» и препарат, содержащий витамин Е [235]. Эти препараты применяются в медицинской практике в качестве витаминных, ранозаживляющих средств, при ожогах, дерматитах и при облучении рентгеновскими лучами.

При разработке безотходных технологий используется свежее растительное сырье, что позволяет на первой технологической стадии получать соки растений. Примером может являться, также внедренная в производство, комплексная переработка плодов облепихи. После отжатия сока из полученного и высушенного жома отделяют семена. Из мякоти плодов облепихи и семян экстракцией органическими извлекателями получают облепиховое масло и концентрат витамина Р [223].

По этой же схеме разработана технология переработки крапивы двудомной с получением из свежесобранных листьев сока по классическому методу, на основе которого предложен состав 10 % мази в качестве кровоостанавливающего и ранозаживляющего средства [198,199]. Из

59 высушенного шрота выделяют максимально очищенный хлорофилл, который вводят в 2% мазь на липофильной основе, рекомендованную как противовоспалительное, антимикробное и ранозаживляющее средство [199].

В технологии ФП известны так называемые «полиэкстракты» (полифракционные экстракты) — суммарные препараты, полученные путем последовательного экстрагирования JIPC несколькими извлекателями, например, с повышающейся полярностью. Из полученных извлечений растворители отгоняют, остатки сушат, порошки смешивают и получают полиэкстракт. Показано, что проведение такого способа экстрагирования повышает выход БАВ для травы зверобоя продырявленного, крапивы двудомной, наперстянки шерстистой [260]. Для обеспечения качества получаемых препаратов предложена методика определения экстрактивных веществ в растительном сырье, учитывающая влияние на выход БАВ одного или нескольких экстрагентов при однократном и многократном воздействии [317].

В качестве извлекателей, последовательно используемых для извлечения БАВ различной полярности, используют также спиртоводные смеси различной концентрации, органические экстрагенты и растительные масла. В этом случае получают отдельно несколько ФП — настойки, густые и сухие экстракты и медицинские масла (масляные экстракты).

М.Э. Дудников с соавторами [112] предложил комплексную схему переработки околоплодника ореха черного, содержащего БАВ различной химической природы: дубильные вещества, органические кислоты, флавоноиды, каротиноиды. В результате экстракции сырья 96%, 40% спиртом и маслом были получены два препарата - настойка спиртовая и экстракт масляный, показавшие перспективность их использования в качестве лечебных средств.

В работах Чураковой Г.В., Бондаренко А.Е. [398] при изучении биологической активности липофильной и гидрофильной фракций хмеля обыкновенного установлено их седативное действие на организм человека.

Одним из способов извлечения БАВ из растительного сырья является использование продуктов переработки одного вида сырья в качестве экстрагента для получения фитопрепаратов из других растений. Так, предложен способ комплексной переработки плодов расторопши пятнистой, позволивший на первом этапе получить жирное масло, а из жмыха экстракцией этиловым спиртом с последующей очисткой — субстанцию -«силимар», обладающую гепетопротекторным действием. Полученный шрот предложено использовать в виде кормовой добавки для скота. В дальнейшем масло расторопши может быть использовано как самостоятельно, так и для экстракции травы зверобоя и календулы с получением ряда лекарственных средств [95].

В последнее время существенно возрос интерес к разработке безотходных технологий, включающих переработку шротов, остающихся после стадии экстрагирования JIPC в значительном количестве. Одним' из основных путей использования шрота при производстве суммарных ФП до последнего времени являлось применение его в сельском хозяйстве на корм животных. Однако, как показали многочисленные исследования, в шроте часто остается большое количество БАВ, которые могут являться основой получения лекарственных препаратов и биологически активных добавок (БАД) к пище [292].

Особенно перспективными с этой точки зрения являются шроты, полученные после экстрагирования JIPC сжиженными газами (диоксид углерода, пропан, бутан, хлор- и фторсодержащие углеводороды, так называемые хладоны) [293,348].

Экстракты, полученные с помощью сжиженных газов, содержат эфирные масла, производные кумаринов, каротиноиды, токоферолы, терпеноиды, стерины, хлорофиллы и другие соединения, в основним липофильной природы. Сжиженные газы не извлекают водорастворимые БАВ (полисахариды, рад витаминов, фенольные соединения и др.), следовательно, последующая обработка шрота полярными растворителями позволит комплексно использовать JIPC.

На основе шротов плодов шиповника и травы зверобоя и череды после получения соответствующих медицинских масел экстракцией сжиженными газами были разработаны технологии водных и водно-спиртовых извлечений, содержащих БАВ полярной природы (флавоноиды, полисахариды, кислота аскорбиновая) [135,137,235]. Авторами также отмечено, что в ряде случаев экстракция из JIPC липофильного комплекса БАВ сжиженными газами увеличивает выход гидрофильных БАВ при последующей экстракции шрота водой или водно-спиртовыми смесями [135,235].

В настоящее время химико-фармацевтической промышленностью выпускается жидкий экстракт кукурузных рылец, применяемый в качестве желчегонного, а также кровоостанавливающего и мочегонного средства при мочегонной болезни. Установлено, что в шроте после получения препарата остается значительная часть БАВ, которые могут стать основой создания лекарственных средств и БАВ к пище [330]. Учитывая, что около 20 предприятий России выпускает жидкий экстракт кукурузных рылец, проблема использования шрота является актуальной. Была разработана совмещенная технология переработки сырья, позволяющая получить два продукта - жидкий экстракт и водорастворимый препарат и снизить себестоимость продукции [245].

Еще одним перспективным направлением использования шрота является разработка на его основе сорбентов различного действия. Таким примером может являться технология комплексной переработки семян сосны кедровой сибирской. Экстракция цельных семян соевым маслом позволяет получить БАД к пище «Кедрол», содержащий комплекс полиненасыщенных жирных кислот, различные дитерпеноиды, флавоноиды и рекомендованный к применению при атеросклерозе, для активации иммунной системы и профилактики авитаминозов [284]. Затем, из семян был получен сорбент,

62 обладающий свойствами извлечения ионов металлов (Cd2+, Hg+, Pb2+) из водных растворов [347].

При переработке кедрового ореха на ядра и / или кедровое масло остается скорлупа, составляющая 51-59% от массы исходного сырья. В результате специальной переработки скорлупы были получены продукты с сорбционной активностью, соответствующей уровню промышленных сорбентов из древесного сырья [356,433].

С.А. Мининой с соавторами [219] на основе шрота после получения настоек из корня женьшеня и биомассы женьшеня были разработаны препараты «Гинсорб» и «Панасорб», являющиеся энтеросорбентами.

Во всех применяемых в настоящее время комплексных переработках ЛРС либо процесс экстрагирования идет продолжительно, в несколько стадий, либо в шроте остается значительное количество БАВ либо гидрофильного, либо липофильного характера, в зависимости от химической природы используемого экстрагента.

Следует отметить, что при промышленном производстве суммарных ФП эффективность извлечения комплекса БАВ в ряде случаев достигает лишь 40 - 50 % из-за недостаточности истощения шрота по всем группам действующих веществ [22].

Все это доказывает необходимость рационального использования растений, совершенствования и разработки новых прогрессивных ресурсосберегающих комплексных технологий переработки ЛРС, обеспечивающих максимальное извлечение БАВ.

Результаты, достигнутые по культивированию биомассы на основе целенаправленно полученных в управляемых условиях штаммов изолированных растительных клеток, суперпродуцентов БАВ, делают перспективным использование данного метода именно в технологии индивидуальных фитопрепаратов, где основным условием обеспечения высокого выхода биологически активного соединения, является использование обогащенного целевым продуктом сырья.

Приведенный обзор литературных данных о современном уровне производства фитопрепаратов свидетельствует о возможности и необходимости совершенствования их технологии с целью повышения выхода целевого продукта и полноты извлечение комплекса БАВ, а также разработки новых способов получения концентрированных извлечений из ЛРС с целью создания на их основе лекарственных средств.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Заключение диссертационного исследования на тему "Теоретические и экспериментальные основы разработки эффективных ресурсосберегающих технологий лекарственных средств растительного происхождения"

выводы

1 Проведенные комплексные исследования явились основанием для установления взаимосвязи между анатомо-морфологической структурой клеточных компонентов, процессами дыхания, питания, роста и биосинтеза алкалоидов. Установлены временные этапы, в течение которых последовательно происходят процессы, связанные с делением клеток, образованием структурных элементов, интенсивным ростом и накоплением алкалоидов.

2 Впервые установлены закономерности потребления компонентов • питательной среды, что позволило разработать методологические подходы к осуществлению направленной регуляции биосинтеза алкалоидов при выращивании различных штаммов раувольфии змеиной на агаризованных и жидких питательных средах.

3 В результате разработанной технологии целенаправленного обогащения растительных тканей БАВ выделен производственный штамм К-27 с увеличением содержания аймалина в биомассе в 2,5 раза. Получены авторские свидетельства на способ получения штамма и на штамм. Разработана технология выращивания, обеспечивающая стабильность и воспроизведение продуктивности штамма в производственных условиях. Биомасса на основе штамма К-27 (ВСКК-ВР-30-87) является утвержденным сырьем для получения полусинтетического производного аймалина - промалина (NTLAB), разрешенного Фармакологическим комитетом к медицинскому применению и промышленному выпуску.

4 Разработана технология выращивания растительных тканей в полиэтиленовых пакетах, при этом достигнуто снижение себестоимости биомассы. Из биомассы, выращенной по предложенной технологии в опытно-промышленных условиях, выделен аймалин и на его основе получена субстанция промалина.

5 Совершенствование методов выделения и очистки БАВ с ' оптимизацией условий проведения процессов позволило на примере получения аймалина из биомассы раувольфии змеиной увеличить выход целевого продукта на 24% по сравнению с существующей технологией. Применение ионообменного метода повышает степень очистки аймалина в 3,8 раза, что позволило в последующем использовать этот очищенный продукт для получения других биологически активных соединений, в частности NIIAE.

6 Для внедрения ресурсосберегающих технологий переработки ЛРС теоретически обоснована и экспериментально доказана эффективность нового комплексного метода' экстрагирования двухфазными системами экстрагентов, позволяющего за одну стадию извлекать широкий спектр липофильных и гидрофильных БАВ. Установлены общие и индивидуальные закономерности экстракции ДСЭ различных видов сырья. При этом выход липофильных веществ составил 85-90 %, что в 2-8 раз больше по сравнению с моноэкстракцией при увеличении скорости процесса в 1,5-2 раза.

7 Теоретически обоснован механизм двухфазной экстракции и . установлены наиболее значимые факторы, влияющие на перенос липофильных веществ в масляную фазу. Показано, что более высокая эффективность метода двухфазной экстракции по сравнению с экстракцией маслом определяется ролью полярной фазы (ее составом и количеством).

ПГ). Установлено, что они обладают высокой экстрагирующей способностью, зависящей от их концентрации в полярной фазе.

9' Впервые установлена возможность применения липофильных суппозиторных основ для извлечения БАВ из ЛРС в составе двухфазных систем экстрагентов. Показано, что по экстрактивной способности твердые жиры не уступают жидким растительным маслам. Установлено, что жировой экстракт, полученный при двухфазном экстрагировании ЛРС, по физико-химическим и структурно-механическим свойствам соответствует требованиям, предъявляемым к суппозиторным массам. Разработана технология суппозиториев, представляющих собой твердый жировой экстракт лекарственного растительного сырья, которая позволяет снизить трудоемкость технологических процессов.

10 Впервые исследован процесс двухфазной экстракции ЛРС в .• присутствии поверхностно-активных веществ. Экспериментально изучено и теоретически обосновано положительное влияние состава ПАВ и числа гидрофильно-липофильного баланса вводимой в систему смеси эмульгаторов на кинетику экстракции и выход БАВ в полярную и масляную вытяжки.

11 На основании выявленных особенностей и закономерностей процесса ДЭ сырья предложен способ комплексной переработки бурых водорослей, позволивший одновременно получать наряду с полисахаридами (технический альгинат, маннит) масляный экстракт, обогащенный липофильными БАВ. На основе полученного нового продукта - масляного экстракта бурых водорослей разработаны составы лечебно-косметических кремов и начато их промышленное производство

12 Проведение комплекса теоретических и экспериментальных исследований позволило разработать методологические основы ресурсосберегающих технологий переработки ЛРС, обеспечивающих высокий выход целевых продуктов и создание эффективных лекарственных средств.

Список использованной литературы по фармакологии, диссертация 2007 года, Каухова, Ирина Евгеньевна

1. А. с. 1167895 СССР, МКИ3 С 12 N 5/00. Питательная среда для выращивания ткани раувольфии продуцента аймалина / А. Г. Воллосович, Т. П. Мартынова, С. И. Полищук ( СССР ). - заявл. 05.11.82 ; опубл. 27.10.85.

2. А. с. 1644490 СССР, МКИ3 С 12 N 5/04, А 61 К 35/78. Способ получения аймалина / JI. JI. Шимолина, Т. Н. Петровская, Е. К. Савельева, С.

3. A. Минина и др. (СССР). заявл. 05.12.89 ; зарег. 01.03.90.

4. А. с. 323126 СССР, МКИ3 А 61 К 27/14. Сорбционный способ получения ликорина / Т. Садиков, Т. Т. Шакиров, X. А. Абдуазимов (СССР).

5. А. с. 412212 СССР, МКИ3 С 07 С 43/30. Ионообменный метод получения сальсолина и сальсолидина из солянки Рихтера / Ю. В. Шостенко, С. X. Мушинская, А. Т. Шеин и др. (СССР).

6. А. с. 562282 СССР, МКИ3 А 61 К' 31/485. Способ получения наркотолина / Ю. В. Шостенко, С. X. Мушинская, А. Т. Шеин и др. (СССР).

7. А. с. 618212 СССР, МКИ3 А 61 К 35/78. Способ получения суммы алкалоидов травы барвинка / Ю. В. Шостенко, Т. Н. Губина, Ю. И. Лапкина и др. (СССР).

8. А. с. 972694 СССР, МКИ3 А 61 К 35/78. Способ получения аймалина / С. А. Минина, Т. В. Астахова, Л. А. Николаева, Л. Л. Шимолина и др (СССР). заявл. 29.12.80 ; зарег. 07.07.82.

9. А. с. 972695 СССР, МКИ3 А 61 К 35/78. Способ получения аймалина /

10. Абиев, Р. Ш. Исследование процесса пропитки капилляров при постоянном и переменном давлении в жидкости / Р. Ш. Абиев// Журнал прикладной химии. 1994. - Т. 67. - № 3. - С. 419-422.

11. Абиев, Р. Ш. Новые разработки пульсационной резонансной аппаратуры / Р. Ш. Абиев, Е. Г. Аксенова, Г. М. Островский // Химическая промышленность. 1994. - № 11. - С. 44-46.

12. Абрамович, Р. А. Создание и исследование суппозиториев для детей с глицйрамом, антрасеннином, экстрактом алое сухим : автореф. дис. . канд. фарм. наук / Р. А. Абрамович. М., 1994 - 23 с.

13. Аверьянов, А. А. Активные формы кислорода и иммунитет растений / А. А. Аверьянов // Успехи современной биологии. 1991. - Т. 111. - Вып. 5.- С. 722-737.

14. Аксельруд, Г. А. Введение в капиллярно-химическую технологию / Г. А. Аксельруд, М. А. Альтшулер. М.: Химия, 1983. - 264 с.

15. Аксельруд, Г. А. Экстрагирование (система твердое тело жидкость) / Г. А. Аксельруд, В. М. Лысянский. - Л. : Химия, 1974. - 256 с.

16. Аманов, С. Б. Культура каллусных тканей полыни гладкой как новый источник противоопухолевого препарата "Арглабин" / С. Б. Аманов, А. Ш.

17. Додонова, .С. М. Адекенов // Abstracts VIII International Conference "The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology". Saratov, 2003г. Саратов: 2003.- С. 21.

18. Антиаритмическая активность аймалина, полученного из биомассы раувольфии змеиной, выращенной в культуре ткани / Я. В. Костин, А. П. Цыбусов, С. А. Минина и др. // Кардиология. 1990. - Т. 30. - № 8. - С. 7274.

19. Ассортимент лекарственного растительного сырья на фармацевтическом рынке / В. А. Багирова, И. А. Баландина, Т. А. Сокольская, О. Н. Воробьева, JI. Г. Алехина // Новая аптека. 2004. - № 2. - С. 57-63.

20. Балабудкин, М. А. Роторно-пульсационные аппараты в химико-фармацевтической промышленности / М. А. Балабудкин. М. : Медицина, 1983.- 169 с.

21. Барашков, Г. К. Химия водорослей / Г. К. Барашков. М.: Изд-во АН СССР, 1963.- 142 с.

22. Беленовская, Л. М. Продукты вторичного метаболизма Hypericum perforatum и их биологическая активность / Л. М. Беленовская, А. Л. Буданцев // Растительные ресурсы. 2004. - т. 40. - вып. 3. — С. 131-153.

23. Беликов, В. Г. Применение математического планирования и обработки результатов эксперимента в фармации / В. Г. Беликов, В. Д. Пономарев, Н. И. Коковкин-Щербак. М. : Медицина, 1973. - 132 с.

24. Белякова, А. В. Разработка фотозащитных средств на основе комбинаций синтетических УФ фильтров и БАВ растительного происхождения: автореф. дис. . канд. фармац. наук / А- В. Белякова. СПб., 2005. -25 с.

25. Биологически активные вещества растительного происхождения : в З.т. / Б. И. Головкин, Р. Н. Руденская, И. А. Трофимова, А. И. Шретер ; отв. ред. В.Ф. Селихов. М. : Наука. - 2001. - 2 т.

26. Биотехнологическое получение берберина из клеточной культуры Thalictrum minus L. / А. В. Смирнов, В. В. Урманцева, Е. А. Гукасова, О. А. Гаевская, Д. И. Банрамашвили // Биотехнология. 2000. - № 1. - С. 14-22.

27. Биотехнология. Принципы и применение / под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса; пер. с англ. под ред. А. А. Баева. М. : Мир, 1988. - 479 с.

28. Блинова, Е. И. Культивирование морских водорослей за рубежом / Е. И. Блинова, Г. Е. Макарова. М. : ВНИЭРХ, 1990. - 22 с.

29. Богданова, Л. С. Жирорастворимые вещества Gnaphalium uliginosum L. / Л. С. Богданова // Растительные ресурсы. 1984. - №3. - С. 400-^ЮЗ.

30. Богданова, JI. С. Исследования по технологии и стандартизации масляного экстракта, мазей и линиментов сушеницы топяной: автореф. дис. . канд. фармац. наук / Л. С. Богданова Харьков, 1984. - 22 с.

31. Бриттон, Г. Биохимия природных пигментов / Г. Бриттон. М. : Мир, 1986. - 422 с.

32. Бурьянов, Я. И. Успехи и перспективы генно-инженерной биотехнологии растений / Я. И. Бурьянов // Физиология растений. 1999. - Т. 46. - № 6. - С. 930-944.

33. Бутенко, Р. Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения / Р. Г. Бутенко // Культура клеток растений и биотехнология. М. : Наука, 1986. - С. 3-20.

34. Быков, О. Д. Кинетика С02-темнового дыхания пшеницы в процессе обезвоживания растений / О. Д. Быков // Физиология растений. 1997. - Т. 44.-№3.-С. 373-378.

35. Вако Ю. К. Заявка 61-40646 Яп. // ИСМ. 1987, вып.15. - № 12. - С. 43.

36. Валь, Е. В. Препараты из растительного сырья: отраслевые проблемы / Е. В. Валь //Ремедиум. 2001. - № 1-2. - С. 38-39.

37. Василенко, Ю. К. Исследование фармакологической активности извлечений из беломорских водорослей / Ю. К. Василенко, М. Н. Ивашев, В. А. Кайшева и др. // Фармация. 1992. - Т. 41. - № 6. - С. 60 - 63.

38. Ветров П. П. Экстрагирование природных веществ из растительного сырья сжиженными газами / П. П. Ветров // Технология и стандартизация лекарств. Харьков : PUPER, 1996. - С. 220-234.

39. Ветров, П. П. Определение содержания липофильных веществ и суммы каротиноидов в растительном сырье / П. П. Ветров, С. В. Гарная, JI. Г. Долганенко // Химико-фармацевтический журнал. 1989. - Т. 24. - № 3. - С. 320.

40. Ветров, П. П. Фитохимическое производство и пути повышения его эффективности / П. П. Ветров, А. П. Прокопенко, С. В. Гарная, Т. Д. Носовская, А. И. Русинов // Технология и стандартизация лекарств. -Харьков : PUPER, 1996. С. 475-488.

41. Виестур, У. 3. Биотехнология. Биотехнологические агенты, технология, аппаратура / У. 3. Виестур, И. А. Шмите, А. В. Жилевич. Рига : Зинатне, 1987.- 263 с.

42. Влияние наложения поля низкочастотных колебаний на эффективность экстрагирования и математическая модель процесса / Р. М. Малышев, А. М. Кутепов, А. Н. Золотников и др. // Доклады АН. 2001. - Т. 381. - № 6. - С. 800-805.

43. Влияние фитогормонов на процессы роста и синтеза вторичных веществ в культуре in vitro василистника малого / Е. В. Скуратова, В. М. Гольд, Е. В. Юшкова, С. М. Репях // Биотехнология. 1999. - № 2. - С. 46-52.

44. Влияние экстремальных факторов на накопление алкалоидов в культуре ткани змеиной Rauwolfia serpentina Benth. / И. Р. Чечеткин, С. Н. Неуструева, Н. С. Сиянова, В. Г. Винтер // Растительные ресурсы. 2001. -Вып. 2. - С. 90-95.

45. Вовк, Е. И. Рациональная фармакотерапия фактор успешного лечения геморроя / Е. И. Вовк // Русский медицинский журнал. - 2002. - Т. 10. - №2. -С. 1-11.

46. Воллосович, А. Г. Динамика роста культуры ткани стебля Rauwolfia serpentina Benth. и накопления в ней алкалоидов / А. Г. Воллосович, О. А. Щигельский // Растительные ресурсы. 1972. - Т. 8. - Вып. 4. - С. 521-523.

47. Воллосович, А. Г. Культура ткани раувольфии змеиной как продуцент алкалоидов / А. Г. Воллосович, Р. Г. Бутенко // Культура изолированных органов, тканей и клеток растений. М.: Наука, 1970. - С. 235- 237.

48. Воллосович, А. Г. Культура ткани раувольфии как продуцент противоаритмических алкалоидов: автореф. дис. . д-ра фармац. наук / Воллосович А. Г. СПб., 1992. - 38 с.

49. Воллосович, А. Г. Оптимизация состава макросолей для культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. Сообщение 3 / А. Г. Воллосович, Т. Н. Пучинина, Н. А. Листунова // Растительные ресурсы. 1982. - Т. 18. - Вып. 2. - С. 239-242.

50. Воллосович, А. Г. Оптимизация состава макросолей для культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth.' Сообщение 1 / А. Г. Воллосович, Т. Н. Пучинина, Л. А. Николаева// Растительные ресурсы. -1979. Т. 15. - Вып. 4. -С. 516-526.

51. Воллосович, Н. Е. Раувольфия змеиная в статической культуре ткани. Выбор штаммов, пути удешевления сред, фармакологическая оценка препаратов: автореф. дис. . канд. фармац. наук / Н. Е. Воллосович. Л. , 1979.- 17 с.

52. Временная инструкция по проведению работ целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода «ускоренного старения» при повышенной температуре.- № 42-2-8, М., 1994.- 10 с.

53. ВФС 42 1890 - 89. Настойка «Биоженьшень».

54. ВФС 42-2733-96. Экстракт зверобоя сухой.

55. ВФС 42-2734-96. Таблетки сибектана 0,1 г.

56. Гаврилин, М. В. Методы получения и анализа диметилсульфоксида / М. В. Гаврилин, Т. В. Сеньчукова, Е. В. Компанцева // Химико-фармацевтический журнал. 2000. - Т. 34. - № 9. - С. 35-38.

57. Гагарина, А. Б. Влияние масляной основы на стабильность растворенного микробиологического каротина / А. Б. Гагарина, Н. М. Евтеева, JI. А. Смурова // Химико-фармацевтический журнал. 1996. - Т. 30. -№ 6.-С.-51-56.

58. Гельферих, Ф. Иониты / Ф. Гельферих. М. : Изд-во иностр. лит., 1962. - 490 с.

59. Генденштейн, Э. И. Исследование спектра противоаритмического действия N-пропилаймалинбромида / Э. И. Генденштейн // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1969. - Т. 67. - № 4. - С. 60-64.

60. Генденштейн, Э. И. К фармакологии N-пропилаймалинбромида (N -ПАБ) / Э. И. Генденштейн // Фармакология и токсикология. 1970. - Т. 33. -№ 3. - С. 303-305.

61. Георгиевский, В. П. Биологически активные вещества лекарственных растений / В. П. Георгиевский, Н. Ф. Комиссаренко, С. Е. Дмитрук. -Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1990. 333 с.

62. Георгиевский, В. П. Стандартизация и контроль качества лекарственных средств / В. П. Георгиевский, А. И. Гризодуб // Технология и стандартизация лекарств : Сборник научных трудов / ГНЦЛС ; под ред. В. П.

63. Георгиевского и Ф. А. Конева. Т 1. - Харьков : ООО "Риггер", 1996. - С. 412-519.

64. Гистлинг, А. М. Ультразвук в процессе химической технологии / А. М. Гистлинг, А. А. Барам. JL: Госхимиздат, 1960. - 96 с.

65. Глузман, М. X. Поверхностно- активные вещества и их применение в фармации / М. X. Глузман, Г. С. Башура, Т. В. Цагареишвили. Тбилиси : Мецниереба, 1972. - 201 с.

66. Глузман, М. X. Применение ПАВ для интенсификации процесса экстрагирования лекарственных веществ из растений / М. X. Глузман, Б. Н. Дашевская // Медицинская промышленность СССР. 1964. - № 9. - С. 38^2.

67. Голик, К. Н. Темновое дыхание растений / К. Н. Голик. Киев, 1990.

68. Голов, Е. В. Интенсификация процессов электроразрядного экстрагирования: автореф. дис. . канд. техн. наук / Голов Е. В. Тамбов, 2004. 22 с.

69. Головко, Т. К. Исследование дыхания как фактора продуктивности растений (на примере клевера красного): автореф. дис. . канд. биол. наук / Т.К.Головко. Л., 1978.

70. ГОСТ 26185 84. Водоросли морские, травы морские и продукты их переработки. Методы анализа.

71. ГОСТ 26593-85. Масла растительные. Методы определения перекисного числа. введ. -М. : Изд-во стандартов, 1984.

72. ГОСТ 29188.3-91 Косметические кремы

73. ГОСТ 5482 90. Показатель преломления масел.

74. Государственная Фармакопея СССР / МЗ СССР. 9 изд. - М. : Медгиз, 1961.-912 с.

75. Государственная Фармакопея СССР / МЗ СССР.- 10-е изд. М. : Медицина, 1989.-1077 с.

76. Государственная Фармакопея СССР. Вып.1 и 2. / МЗ СССР. 11-е изд., доп.- М.: Медицина, 1989. - 826 с.

77. Государственный реестр лекарственных средств, (по состоянию на 01.01.2006) Электронный ресурс. / условия доступа: http//www.rosdravnadzor.ru /registration/Is/ ind

78. Государственный реестр лекарственных средств. Официальное издание : в 2-х томах. М. : Минздрав России. Фонд фармацевтической информации, 2000

79. Гриненко, Н. А. Состав флавоноидов и производных антрахинона в Hypericum perforatum L. и Н. maculatum Crahtz / Н. А. Гриненко // Растительные ресурсы. 1989. - Т. 25. - Вып. 3. - С. 387-392.

80. Гурин, И. С. БАВ гидробионтов источник новых лекарств и препаратов / И. С. Гурин, И. С. Ажихин. - М. : Наука, 1981. - 131 с.

81. Гусакова, С. Д. Липофильные экстракты в фитотерапии и фитокосметике: получение и биологические свойства / С. Д. Гусакова, Ш. Ш.

82. Сагдулаев, 3. А. Хушбактова // Химия природных соединений. 1998. - № 4. -С. 437-448.

83. Дашевская, Б. И. Полиэтиленоксиды и их применение в фармации / Б. И. Дашевская, М. X. Глузман, В. М. Бодня. Серия "Химико-фармацевтическая промышленность". - вып.2. - М.,1974. - 27 с.

84. Двустадийное культивирование иммобилизованных на пенополиуретане клеток василистника малого / Е. В. Скуратова, Е. В. Юшкова, Н. А. Величко, С. М. Репях // Биотехнология. - 1998. - № 6. - С. 3641.

85. Демченко, Ю. Т. Разработка суппозиториев на основе твердых эмульсий и жировых растительных экстрактов : дис. . канд. фармац. наук / Ю. Т. Демченко. СПб., 2006. - 192с.

86. Денисова, С. Б. Термодинамика экстракции биологически активных веществ корня солодки / С. Б. Денисова, Ю. И. Муринов // Материалы XI конф. по экстракции. М., 1998. - С. 51-52.

87. Димов, X. Т. Влияние электрогидравлического удара на степень разрушенности структуры сырья листьев красавки и семян дрона / X. Т. Димов, В. Д. Пономарев // Фармация. 1979. - № 6. - С. 57-58.

88. Добродеева, JI. К. Иммуномодулирующие свойства препаратов водорослевого происхождения / Л. К. Добродеева // Тез. докл. научно-практич. конф., посвящ. 80-летию Архангельского водорослевого комбината. Архангельск. - 1998. - С. 27.

89. Об Додонова, А. Ш. Изучение суспензионной культуры полыни гладкой / А. Ш. Додонова, С. Б. Аманов, С. М. Адекенов // Abstracts VIII International Conference "The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology". Saratov, 2003.-C. 81.

90. Достижения и перспективы использования лекарственных растений в медицине // Deutsche Apoteker Zeitung. 1987. - Bd. - 127 V. - № 40. - S. 1997-2002.

91. Дощицин, В. Л. Аритмии и блокады сердца: классификация, методы диагностики и принципы лечения / В. Л. Дощицин // Клиническая медицина.-1993.- Т.69.-ЖЗ.- С. 109- 115.

92. Дощицин, В. Л. Лечение нарушений сердечного ритма гилуритмалом (аймалином) / В. Л. Дощицин // Кардиология.- 1968.- Т.8.- №2.- С. 109- 111.

93. Дубровин, И. И. Целебный зверобой / И. И. Дубровин. М.: Изд-во Яуза, Изд-во ЭКСМО- Пресс, 2000. - 128с.

94. Дядицина, А. М. Препараты водорослевого происхождения: проблемы и перспективы / А. М. Дядицина // Тез. докл. научно-практической конф., посвящ. 80-летию Архангельского водорослевого комбината. -Архангельск, 1998. С. 6.

95. Еремка, В. Д. Исследование энергий СВЧ в технологических процессах переработки лекарственного растительного сырья / В. Д. Еремка, Б. П. Ефимов, М. В. Мильго // Фармаком. 1992. - № 5. - С. 14-18.

96. Зависимость продуктивности клеточных линий раувольфии змеиной от уровня плоидности культивируемых клеток / В. А. Кунах, И. Е. Каухова, JI. А. Николаева, Л. К. Алпатова, А. Г. Воллосович // Докл. АН СССР. 1983. - Т. 270. - № 4. - С. 979-982.

97. Запрометов, М. Н. Вторичный метаболизм и его регуляция в культурах клеток и тканей растений / М. Н. Запрометов // Культура клеток растений. М. : Наука, 1981. - С. 37-50.

98. Иванов, Е. В. Кинетические закономерности процесса экстрагирования пористых частиц в диффузионно-конвективном режиме / Е. В. Иванов // Химическая промышленность. 2006. - Т. 83. - № 6. - С. 271-276.

99. Иванова, К. А. Пропиленгликолевые экстракты в косметике / К. А. Иванова // Косметика и медицина. 1998. - №4. - С. 30-32 с.

100. Иванова, С. А. Особенности массопереноса липофильных БАВ при экстрагировании сырья двухфазной системой экстрагентов / С. А. Иванова, В. А. Вайнштейн, И. Е. Каухова // Химико-фармацевтический журнал 2003. -Т. 37.-№8.-С. 30-33.

101. Игнатьева, Г. П. Влияние пульсационного режима подачи жидкости на кинетику массообмена с твердой фазой / Г. П. Игнатьева // Журнал прикладной химии. Т. 68. - № 4. - С. 559-674.

102. Извлечение экстрактивных веществ древесной зелени при резонансных колебательных воздействиях / Е. Г. Аксенова, Р. Ш. Абиев, Г. М. Островский, С. Н. Васильев, В. И. Рощин, М. Ю. Алябьева // Изв. вузов. Лесной журнал. -1993. № 2-3. - С. 176-179.

103. Измайлов, Н. А. Исследования в области ионообменной хроматографии / Н. А. Измайлов. М. : Изд-во АН СССР, 1957. - 55 с.

104. Измайлов, Н. А. Основы адсорбционной технологии выделения веществ из растворов / Н. А. Измайлов, Ю. В. Шостенко, С. X. Ягушинская // Успехи химии. 1955. - Т. 24. - Вып. 3. - С. 346-376.

105. Изменение дыхательной активности в процессе роста суспензионной культуры женьшеня / И. В. Александрова, Г. В. Зайцева, Н. А. Константинова и др. // Тез. докл. III Всесоюз. конф. "Культура клеток растений". Абовян, 1979. С. 26-27.

106. Изучение ранозаживляющих свойств и определение верхних параметров токсичности травы зверобоя шероховатого / С. Г. Зайчикова, Н. И. Гринкевич, Е. И. Барабанов, и др. // Фармация. 1985. - №1. - С. 62-64.

107. Изучение экстракции плодов рябины и шиповника двухфазной системой экстрагентов / С. А. Иванова, С. Е. Скочипец, М. Е. Скочипец, В. А. Вайнштейн, И. Е. Каухова, Ю. Т. Демченко // Фармация. 2003. - № 6. -С. 50-56.

108. Исаев В. А. Полиненасыщенные жирные кислоты и их роль в мозговом кровообращении // условия доступа : http: www.trinita/ru/articles/pnzhh morg.htm

109. Искандаров, Р. С. Особенности экстракции эфирных масел из растительного сырья в присутствии поверхностно-активных веществ / Р. С. Искандаров, С. Н. Аминов, X. Т. Аведов // Химия природных соединений. -1998.-№5.-С. 648-652.

110. Исследование экстракции из растительного сырья в экстракторе-прессе (макет 2) / Н. А. Громова, С. А. Минина, Н. А. Филиппин, Б. К. Котовский, Т. Н. Тюкина // Химико-фармацевтический журнал. 1976. - № 3. -С. 135-138.

111. Калинин, Ф. Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений / Ф. Л. Калинин, В. В. Сарнацкая, В. Е. Полищук. Киев : Наукова думка, 1980. - 488 с.

112. Кандараков, О. Ф. Биосинтетические характеристики популяции клеток Dioscorea deltoidea при. проточном культивировании / О. Ф.

113. Кандараков, А. С. Воробьев, А. М. Носов // Физиология растений. 1994. - Т. 41.-№6.-С. 913-917.

114. Карнаухов, В. Н. Биологические функции каротиноидов / В. Н. Карнаухов. М.: Наука, 1988. - 240с.

115. Каталог. Всесоюзная коллекция клеточных культур. JI. : Наука, 1991.-С. 116-117.

116. Катценштейн, JI. Зверобой против депрессии, или секреты травы Иоанна Крестителя / JI. Катценштейн. М. : Изд-во "Крон-Пресс", 1998. -110 с.

117. Каухова, И.Е. Поверхностное выращивание ткани Rauwolfia serpentina Benth. на жидких питательных средах / И.Е. Каухова, В.А. Цыганов, А.Г. Воллосович // Растительные ресурсы. 1984. - Т. 20. -Вып. 3.-С. 412-415.

118. Каухова, И.Е. О потреблении ионов калия и кальция клетками культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. / И.Е. Каухова, В.Е. Титов, А.Н. Куклин, Л.П. Соколова, Э.Д. Ибрагимова // Растительные ресурсы. 1992. -Т. 28,-Вып. 4.-С. 70-73.

119. Каухова, И. Е. Развитие культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. на жидких средах и образование алкалоидов: дис. . канд. фармац. наук / И. Е. Каухова. Л., 1982. - 196 с.

120. Каухова, И. Е. Биотехнология растительных тканей: учебное пособие / И. Е. Каухова, А. Л. Марченко. СПб. : Изд-во СПХФА, 2003. -61с.

121. Каухова, И. Е. Биотехнология тканей раувольфии змеиной (проблемы и перспективы получения биомассы) / И. Е. Каухова, А. Н. Куклин // Материалы Междунар. конф. "Проблемы и перспективы биотехнологии". Братислава, 1989. - С. 99.

122. Каухова, И. Е. Выбор питательной среды для глубинного культивирования тканей раувольфии змеиной Rauwolfia serpentina Benth. / И. Е. Каухова, В. А.Цыганов, А. Г. Воллосович // Растительные ресурсы. -1981.-Т. 17.-Вып. 2.-С. 217-227.

123. Каухова, И. Е. Изучение методов культивирования ткани раувольфии змеиной / И. Е. Каухова, А. Н. Куклин // Сб. "Биология культивируемых клеток и биотехнология». Новосибирск, 1988. — С. 97-98.

124. Каухова, И. Е. Изучение состава алкалоидов глубинной культуры раувольфии змеиной / И. Е. Каухова // Исследования по изысканию лекарственных средств природного происхождения : всесоюз. науч. конф. -Л., 1981.-С. 168.

125. Каухова, И. Е. Методы выделения аймалина из биомассы раувольфии змеиной / И. Е. Каухова, Л. Л. Шимолина, Л. П. Соколова // Материалы Всерос. науч. конф. "Химия и технология лекарственных веществ". СПб., 1994. - С. 18

126. Каухова, И. Е. Особенности процессов питания и дыхания культуры клеток Rauwolfia serpentina (Apocynaceae) в ходе роста и развития / И. Е. Каухова // Растительные ресурсы. 2005. - Вып. 4. - С. 31-40.

127. Каухова, И. Е. Особенности экстрагирования биологически активных веществ двухфазной системой экстрагентов при комплексной переработке лекарственного растительного сырья / И. Е. Каухова // Растительные ресурсы. 2006. - Т. 42. - Вып. 1. - С. 82-91.

128. Каухова, И. Е. Поверхностное выращивание ткани Rauwolfia serpentina Benth. на жидких питательных средах / И. Е. Каухова, В.367

129. А.Цыганов, А. Г. Воллосович // Растительные ресурсы. — 1984. — Т. 20. — Вып. 3.-С. 412-415.

130. Каухова, И. Е. Противоаритмические средства на основе аймалина из биомассы раувольфии змеиной / И. Е. Каухова, JI. П. Соколова, С. А. Минина // Фундаментальные основы диагностики состояния человека : сб. ст. — СПб., 1994.-С. 40-41

131. Каухова, И. Е. Цитогенетическое изучение глубинной культуры ткани раувольфии змеиной / И. Е. Каухова, В. С. Легейда, Т. Н. Чеченева // Структура и генетические функции биополимеров : сб. науч. трудов. Киев : Наукова думка, 1981. — С. 71-72.

132. Кафаров, В. В. Основы массопередачи / В. В. Кафаров. М. : Высшая школа, 1972.

133. Кечатова, Н. А. Сжиженный углекислый газ как экстрагент сексвитерпеноидов полыни таврической / Кечатова Н. А. // Актуальные вопросы фармации. Вып. 2. - Ставрополь, 1974. - С. 76-81.

134. Кизеветтер, И. В. Промысловые морские водоросли и травы дальневосточных морей / И. В. Кизеветтер, М. В. Суховеева, Л. П. Шмелькова. М. : Легкая и пищевая промышленность,' 1981. - 112 с.

135. Кизеветтер, И. В. Технологические аспекты рационального и комплексного использования морского животного и растительного сырья / И. В. Кизеветтер // Использование биологических ресурсов Мирового Океана. М., 1980. С. 97 - 105.

136. Кириллова, Н. В. Ферменты антиоксидантной системы культивируемых растительных клеток: автореф. дис. . д-ра биол. наук / Н. В. Кириллова. СПб., 2000. - 30 с.

137. Киселева, Т. Л. Анализ и унификация терминологии в области фито-и натурофармации / Т. Л. Киселева, А. А. Карпеев // Материалы IV

138. Междунар. съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». СПб., 2000. - С. 24-27.

139. Китанов Г. М. Фитохимическое изучение и анализ видов Hypericum L., произрастающих в Болгарии / Г. М. Китанов // Растительные ресурсы. -1988. Т. 24. - Вып. 1. - С. 114—121.

140. Китанов, Г. М. Современное состояние химического изучения видов типа Hypericum / Г. М. Китанов, К. Ф. Блинова // Химия природных соединений. 1987. - № 2. - С. 185-203.

141. Кларксон, Д. Транспорт ионов и структура растительной клетки / Д. Кларксон. М. : Мир, 1978. - 332 с.

142. Князьков, И. Е. Определение локализации стероидных гликозидов в культуре клеток Dioscorea deltoidea на основе изучения их ультраструктуры / И. Е. Князьков, Е. С. Лобакова, А. М. Носов // Физиология растений. 1994. -Т. 41.- №6. -С. 896-902.

143. Ковалева Т. А. Цитологическое изучение культуры ткани раувольфии (Rauwolfia serpentina Benth.) / Т. А. Ковалева, 3. Б. Шамина, Р. Г. Бутенко //Генетика. 1968. - Т. 4. - № 5. - С. 7-13.

144. Ковалева, Т. А. Действие азотистого иприта на культуру изолированных тканей раувольфии / Т. А. Ковалева, 3. Б. Шамина, Р. Г. Бутенко // Генетика. 1972. - Т. 8. - № 2. - С. 46-54.

145. Кокотов, Ю. А. Теоретические основы ионного обмена / Ю. А. Кокотов, П. П. Золотарев, Г. Э. Елькин. Л. : Химия, Ленингр. отд-ние, 1986. -281с.

146. Количественное определение основных действующих веществ у видов Hypericum L. / В. В. Беликов, Т. В. Точкова, Л. В. Шатунов, Т. В. Колесник, И. И. Баяндина // Растительные ресурсы. 1990. - Т. 26. - Вып. 4. -С. 571-578.

147. Коноплева, М. М. Флавоноиды Gnaphalium uliginosum / М. М. Коноплева, Л. П. Смирнова, В. И. Глызин // Химия природных соединений. -1979.-№4. С. 483-485.

148. Косенко, Н. В. Организационно-экономические и технологические проблемы развития перерабатывающе-сырьевого комплекса лекарственных растений / Н. В. Косенко. М., 1999. - 291 с.

149. Костин, Я. В. Противоаритмическое действие четвертичных производных тримекаина и аймалина: автореф. дис. . д-ра мед. наук / Я. В. Костин. -Казань, 1989. 32 с.

150. Кузовкина, И. М. Организация вторичного метаболизма в культивируемых клетках и корнях Ruta graveolens / И. М. Кузовкина // Abstracts VIII International Conference "The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology". Saratov, 2003. - C. 173.

151. Кулевская, JI. В. Изучение стабильности p-каротина в комплексах с фосфолипидами / Л. В. Кулевская, О. А. Коренева, Ю. А. Лимаренко // Химико-фармацевтический журнал. 2002. - Т. 36. - № 1. - С. 35-38.

152. Культура тканей и клеток алкалоидных растений / Л. Н Березнеговская., И. Ф. Гусев, С. Е. Дмитрук, А. В. Смородин, В. В. Смородин, Н. А. Трофимова, Н. А. Шмыкова. Томск : Изд-во Том. ун-та, 1975.- 194 с.

153. Культура ткани чайного дерева: дифференциация, уровень плоидности, образование фенольных соединений / Н. В. Загоскина, В. Г. Федосеева, Л. В. Фролова, Н. Д. Азеренкова, М. Н. Запрометов // Физиология растений. 1994. - Т. 41. - № 5. - С. 762-767.

154. Кунах, В. А. Влияние кинетина на уровень и типы аберраций хромосом в культуре тканей Haplopappus gracilis / В. А. Кунах, В. П. Зосимович // Генетика. 1977. - Т. 13. - № 8. - С. 1355-1365.

155. Кунах, В. А. Диплоидизация культуры тканей растений с помощью 5-урацилилтиоуреидоглюкозы (тиациала) / В. А, Кунах, О. В. Захленюк // Докл. АН СССР. 1984. - Т. 279. - № 5. - С. - 1241-1244.

156. Кунах, В. А. Геномная изменчивость и накопление индолиновых алкалоидов в культуре клеток раувольфии змеиной Rauwolfia serpentina Benth / В. А. Кунах // Биополимеры и клетка. 1994. - Т. 10. - № 1. - С. 3-30.

157. Кунах, В. А. Геномная изменчивость соматических клеток растений и факторы, регулирующие этот процесс / В. А. Кунах // Цитология и генетика. 1980. - Т. 14. -№ 11. - С. 73-81.

158. Кунах, В. А. Особенности получения и продуктивность суспензионных культур клеточных клонов раувольфии змеиной Rauwolfia serpentina Benth. in vitro / В. А. Кунах, JI. П. Можилевская, С. И. Губарь // Биотехнология. -2001. № 4. - С. 9-21.

159. Кущинская, И. Н. Исследование активных веществ плодов шиповника и технология их комплексной переработки / И. Н. Кущинская. -М., 1965.194Ладынина, Е. А. Фитотерапия / Е. А. Ладынина, Р. С. Морозова. Л. : Медицина, 1987. - 208 с.

160. Лазарева, К. М. Пропиленгликолевые экстракты / К. М. Лазарева // Косметика и медицина. 1999. - №4. - С. 25- 27.

161. Лакович, Д. Основы флуоресцентной спектроскопии / Д. Лакович. -М. : Мир, 1986.-496с.

162. Лежнева, Л. П. Производство извлечений и соков из свежих лекарственных растений / Л. П. Лежнева // Химико-фармацевтическое производство. М., ГНИИЭМП, 1997. - Вып. 8. - 23 с.

163. Лекарственные растения Государственной фармакопеи / Под. ред. И. А. Самылиной, В. А. Северцева. М.: «АММИ», 1999. - 488 с.

164. Леквеишвили, М. В. Использование РПА в производстве экстракционных препаратов из лекарственных растений / М. В. Леквеишвили, М. А. Балабудкин // Химико-фармацевтический журнал. -1983.-№3.-С. 354-355.

165. Либберт, Э. Физиология растений / Э. Либберт. М. : Мир, 1976. -590 с.

166. Липский, А. X. Глубинное культивирование клеток высших растений / А. X. Липский // Культура клеток: растений. М. : Наука, 1981. - С. 51-68.

167. Липский, А. X. Физиология роста клеток растений в биореакторах (периодические режимы): автореф. дис. . канд. биол. наук / А. X. Липский. -Москва, 1993. 25 с.

168. Ломачинский, В. А. Экстрагирование с промежуточным отжимом растительного сырья / В. А. Ломачинский. М. : АгроНИИТЭИПП, 1995. - 24 с.

169. Мадичка, Р. Российский рынок лекарственных трав и сборов / Р. Мадичка, Е. Жданова // Ремедиум. 2000. - № 4. - С. - 38-40.

170. Мази. Современный взгляд на лекарственную форму / В. Л. Багирова, Н. Б.'Демина, Н. А. Куличенко // Фармация. 2002. - №2. - С. 24-26.

171. Машковский, М. Д. Лекарственные средства / М. Д. Машковский. М. : Новая волна, 2000. Т 2. - 608с.

172. Машковский, М. Д. Лекарственные средства / М. Д. Машковский. -М.: Новая волна, 2000. Т. 1. - 539с.

173. Мельникова, В. А. Экстракция травы зверобоя двухфазной системой экстрагентов: дис. . канд. фармац. наук / В. А. Мельникова. СПб., Изд-во СПХФА, 2000. - 169 с.

174. Мельникова, В. А. Получение сухих и масляных экстрактов из травы зверобоя продырявленного / В. А. Мельникова, И. Е. Каухова, В. А. Вайнштейн // Фармация в XXI веке: инновации и традиции. Междунар. конф. : сб. ст. СПб., 1999. - С. 61-62.

175. Метелица, Д. И. Активация кислорода ферментными системами / Д. И. Метелица. М. : Наука, 1982. - 256 с.

176. Метод количественного определения алкалоидов группы индолина в культуре ткани раувольфии змеиной / А. Г. Воллосович, Л. А. Николаева, Н. Н. Позднякова, Т. Н. Пучинина // Растительные ресурсы. 1977. - Т. 13. -Вып. 1.-С. 127-132.

177. Методы анализа суппозиториев с лекарственным растительным сырьем / А. Н. Фетисова и др. // Материалы IV Международного съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратовприродного происхождения». Великий Новгород, 2000. — С. 325-327.

178. Методы биохимического анализа растений / под ред. В. В. Полевого, Г. Б. Максимова. Л. : Изд-во ЛГУ, 1978. - С. 90-101.

179. Методы количественного определения суммы алкалоидов в культуре ткани раувольфии змеиной / А. Г. Воллосович, Л. А. Николаева, С. Г. Дуксина, Л. X. Карташева //Фармация. 1977.- Т. 26.- №1.- С. 29-32.

180. Минина, С. А. Новые энтеросорбенты растительного происхождения Панасорб и Гинсорб / С. А. Минина, Л. И. Слепян, А. Н. Шиков // Человек и лекарство: тез. докл. VI Рос. нац. конгр. Москва, 1999. -С. 489.

181. Минина, С. А. Оптимизация процесса экстрагирования корня женьшеня / С. А. Минина, Л. В. Шигарова, В. А. Вайнштейн // Химико-фармацевтический журнал. 1998. - № 7. - С. 42-45.

182. Минина, С. А. Оптимизация технологии N-(4)- пропилаймалина бромида / С. А. Минина, Е. И. Молохова, М. Д. Павловская // Химико-фармацевтический журнал. 1986. - № 9. - С. 1120-1123.

183. Минина, С. А. Совершенствование технологии очистки N-(4)-проп'илаймалина бромида / С. А. Минина, Е. М. Пучкова, О. Н. Пожарицкая // Химико- фармацевтический журнал. 1995. - № 5. - С. 55-56.

184. Минина, С. А. Химия и технология фитопрепаратов / С. А. Минина, И. Е. Каухова. -М. : ГЭОТАР-МЕД, 2004. 560 с.

185. Мироненко, Т. А. Аптечный ассортимент: фитопрепараты / Т. А. Мироненко // Новая аптека. 2000. - № 8. - С. 50-53.

186. Миронов, А. А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине / А. А. Миронов, Я. Ю. Комиссарчик, В. А. Миронов. СПб., 1994. - С. 9—122.

187. Мицеллообразование, солюбилизация и микроэмульсии / под ред. К. Миттела. М. : Мир, 1980. - 597 с.

188. Молохова, Е. И. Экспериментально-теоретическое обоснование составов, технологии и стандартизации лекарственных форм биополимеров: автореф. дис. . д-ра фармац. наук /Е. И. Молохова. Пермь, 2003. 45 с.

189. Молчанов, Г. И. Интенсивная обработка растительного сырья / Г. И. Молчанов. М.: Медицина, 1981. - 208 с.

190. Молчанов, Г. И. Ультразвук в фармации / Г. И. Молчанов. М. : Медицина, 1980. - 176 с.

191. Молчанов, Г. И. Экстракция фенольных соединений ультразвуком и их стабильность: тез. докл. Всесоюз. симпоз. по фенольным соединениям / Г. И. Молчанов, J1. П. Молчанова. Тбилиси, 1976. - С. 103.

192. Момот, Н. Н. Изучение динамики сорбции-десорбции оксикобаламина на силохроме С-120 / Н. Н. Момот, М. Е. Богданова // Химико-фармацевтический журнал. 1994. - Т. 28. - № 2. - С. 39-41.

193. Морозова С. С., Куприянова Л. А., Пехов А. В. // ЦНИИТЭИПП. -М., 1986, сер. 5.-№4.-С. 15.

194. Муравьев, И. А. Получение галенового препарата валерианы с помощью сжиженного углекислого газа / И. А. Муравьев, Е. А. Кечатов, Ю. И. Сметанин // Химико-фармацевтический журнал. 1970. - № 1. - С. 48-52.

195. Муравьева, Д. А. Фармакогнозия / Д. А. Муравьева, И. А. Самылина, Г. П. Яковлев. М.: Медицина, 2002. - 656 с.

196. Мухамеджанова, Д. М. Исследование комплекса биологически активных веществ разных видов шиповника и создание лекарственных препаратов на основе безотходной технологии: автореф. дис. . д-ра фармац. наук / Д. М. Мухамеджанова. М., 1996. - 48 с.

197. Нарушения ритма и проводимости сердца / 3. И. Янушкевичюс, Ю. Ю. Бредикис, А. И. Лукошявичюте и др.- М. : Медицина, 1984. 288 с

198. Настойки, экстракты, элексиры и их стандартизация / под ред. проф. В. Л. Багировой, проф. В. А. Северцева. СПБ. : СпецЛит, 2001. - 223 с.

199. НД 42-10067—99. Препарат Зверобой (таблетки) / Натур-Продукт, Франция.

200. Некрасова, В. Б. Рациональное применение отходов производства маннита / В. Б. Некрасова, С. М. Кирова, Т. Е. Полянская // Пищевая и перерабатывающая промышленность. 1987. - №11. - ,С. 24-25.

201. Нестерова, О. В. Фармакогностическое изучение видов пищевого растительного сырья с целью получения биологически активных веществ липофильной природы : автореф. дисс. . док. фарм. наук. / О. В. Нестерова М, 1997.-28с.

202. Никитюк, В. Г. Основные направления работы сектора капсулированных и сектора суппозиторных форм ГНЦЛ / В. Г. Никитюк, Н. Г. Козлова // Провизор. 2000. - № 16

203. Николаева, Л. А. Клеточные технологии на основе культуры раувольфии in vitro: дис. . д-ра фармац. наук / Л. А. Николаева. СПб., 1993. - 345 с.

204. Николаева, Л. А. Культура тканей лекарственных растений и ее биотехнологическое использование / Л. А. Николаева. СПб : Изд-во ЛХФИ, 1992. - 60 с.

205. Николаева, Л. А. Методы количественного определения аймолина в культуре ткани раувольфии змеиной / Л. А. Николаева, Т. В. Астахова, С. А. Минина // Химико- фармацевтическая промышленность. 1982. - №7. - С. 21-23.

206. Николаева, Л. А. Химический состав культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth / Л. А. Николаева, Л. П. Шимолина, И. И. Смирнова // Растительные ресурсы. 1988. - Вып. 4. - С. 579-584.

207. Нобел, П. Физиология растительной клетки / П. Нобел ; пер. с англ. под ред. И. И. Гунара. М. : Мир, 1973. - 288 с.

208. Новые подходы к комплексной переработке сухой травы зверобоя / В. А. Мельникова, В. А. Вайнштейн, А. Н. Шиков, И.'Е. Каухова // Химико-фармацевтический журнал. 1999. - № 12. - С. 27-30.

209. Носов, А. М. Культура клеток высших растений — уникальная система, модель, инструмент / А. М. Носов // Физиология растений. 1999. -Т. 46'. - № 6.-,- G. 837-844.

210. Носов, А. М. Особенности синтеза изопреноидов в клетках растений in vitro / А. М. Носов // Abstracts VIII International Conference "The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology". Saratov, 2003. - P. 225.

211. Носов, A. M. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений / Носов А. М. // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М. : Наука, 1991. - С. 5-20.

212. Носов, А. М. Физиологическая регуляция синтеза стероидов культурой тканей диоскореи дельтовидной / А. М. Носов, В. Н. Пауков, Р. Г. Бутенко // Культура клеток растений и биотехнология. М. : Наука, 1986. - С. 76-79.

213. Оганов, Р. Г. Проблемы сердечно-сосудистых заболеваний в Российской Федерации и возможности их решения / Р. Г. Оганов, Г. Я. Масленникова // Российский кардиологический журнал. 2000. - № 4. - С. 7— 10.

214. Оптимизация условий получения каллусной ткани борца северного / И. Г. Мигранова, А. Г. Мардамшин, Ф. Н. Старухин, И. А. Лукичева // Биотехнология. 1997. - № 9-10. - С. 24-26.

215. Опытно-промышленный регламент на производство аймалина порошка / Харьков, ХПХФО «Здоровье», 1992. 146 с.

216. Орешников, А. В. Физиологические особенности культивируемых клеток Dioscorea deltoidea Wall, при выращивании в режиме закрытого протока / А. В. Орешников, А. М. Носов, М. Н. Манаков // Физиология растений. 1994. - Т. 41. - № 6. - С. 918-922.

217. Орлов, Д. Патентная защита фитоизобретений: лучше меньше да лучше / Орлов Д. // Ремедиум. 2000. - № 4. - С. 48-49.

218. Осипова, Е. А. Вариабельность клеточных клонов Thalictrum minus in vitro / E. А. Осипова, H. С. Цыбулько, 3. Б. Шамина // Физиология растений. -1999. Т. 46. - № 6. - С. 908-914.

219. Особенности антиокислительного действия токоферолов как природных антиоксидантов / Е. Н. Кухтина, Н. Г. Храпова, Е. Б. Бурлакова и др. // ДАН СССР, 1983. Т. 272. - № 3. - С. 720-732.

220. Особенности поведения клеток в культуре тканей Rauwolfia serpentina Benth. / В. А. Кунах, И. Е. Каухова, Л. К. Алпатова, А. Г. Воллосович // Цитология и генетика. 1982. - Т. 16. - №5. - С. 6-10.

221. Особенности процесса экстрагирования лекарственного растительного сырья двухфазными системами экстрагентов, содержащими компоненты суппозиторных основ / Ю. Т. Демченко, И. Е. Каухова, В.

222. A. Вайнштейн, Т. X. Чибиляев // Химико-фармацевтический журнал. 2005.- Том 39. № 11.-С. 30-34.

223. ОСТ 91500.05.001-00. Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения. М., 2000. - 54 с.

224. Островский, Г. М. О пропитке сквозных капилляров с помощью периодического изменения давления / Г. М. Островский, А. Ю. Иваненко, Е. Г. Аксенова // Теоретические основы химической технологии. 1995. - Т. 29.- №6. -С. 607-611.

225. Островский, Г. М. Пульсационная резонансная аппаратура для процессов в жидкофазных системах / Г. М. Островский, Р. Ш. Абиев // Химическая промышленность. 1998. - № 8. - С. 468-478.

226. Нижегородский хим-фарм завод» (Россия). №96118889/14 ; заявл. 30.09.1996 ; опубл. 27.01.1998. - 9 с.

227. Пат. 2112537 С1 Российская Федерация, МПК6 А 61 К 35/78, 9/02. Средство для лечения хронического простатита / О. В. Нестерова и др. ; заявитель и патентообладатель ММА им. И. М. Сеченова. № 96114348/14 ; заявл. 10.07.1996 ; опубл. 10.06.1998. - 5 с.

228. Пат. 2141336 Российская Федерация, 6 МПК А 61 К 35/78. Способ выделения биологически активных веществ из растительного сырья / А. Н. Шиков, О. Н. Пожарицкая, В. Г. Макаров, JI. А. Климов, К. А. Краснов ( Россия)//БИ. № 32. 1999.

229. Перспективный источник новых противоаритмических средств — культура ткани раувольфии змеиной / В. А. Галынкин, И. Е. Каухова, Е. М. Сергеева, В. А. Кузнецова // Научные труды НИИ Фармации. М., 1997. -Т. XXXVI. - С. 255-260.

230. Перспективы разработки препаратов из отходов производства настоек и жидких экстрактов / А. М. Сампиев, Е. Б. Никифорова, М. М.

231. Дзаурова /У Наука о человеке: тез. докл. IV конгр. молодых ученых и специалистов. Томск, 2003. - С. 2i3.

232. Петренко, Е. Р. Российский рынок, антиаритмических средств // Е. Р. Петренко // Мир медицины. 2000. - №1-2. - С. 6-8.

233. Племенков, В. В. Введение в химию природных соединений / В: В. Племенков. Казань, 2001. - 376 с.

234. Поверхностно-активные вещества и композиции. Справочник / под ред. М. Ю. Плетнева. М.: Изд-во ООО "Фирма Клавель", 2002. - 768 с.

235. Повышение продуктивности культуры клеток стефании гладкой— Stephania glabra (Roxb) Miers / 3. Б. Шамина, Т. А. Савина, Е. А. Осипова, Ю. Г. Попов // Физиология растений. 1994. - Т. 41. - № 6. - С. 885-890.

236. Полевой, В. В. Физиология растений / В. В. Полевой. М. : Высш. школа, 1989. - 289 с.

237. Полежаева, Н. С. Содержание флавоноидов, дубильных веществ и каротинов в Hypericum maculatum crants / Н. С. Полежаева // Растительные ресурсы. 1995. - Т. 24. - Вып. 3. - С. 340-343.

238. Пономарев, В. Д. Экстрагирование растительного сырья / В. Д. Пономарев. М. : Медицина, 1976. - 210 с.

239. Правдивцева, О. Е. Сравнительное фитохимическое исследование сырья и препаратов травы зверобоя продырявленного / О. Е. Правдивцева, В.

240. A. Куркин // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. Пятигорск, 2004. - Вып. 59. - С. 48-49.

241. Правила и инструкции, управляющие фитопроизводством в России /

242. B. А. Северцев, В. JI. Багирова, В. Г. Макаров и др. // Материалы V Междунар. съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». СПб., 2001. - С. 44-52.

243. Применение синтетических эфиров ВЖК для экстрагирования листьев крапивы / А. В. Белякова, В. А. Вайнштейн, Ю. Г. Маркова, Ю. Т. Демченко, Т. X. Чибиляев // Химико-фармацевтический журнал. 2005. - № 11.-С. 60-64.

244. Продуктивность различных тканей диоскореи дельтовидной / С. JI. Каранова, А. М. Носов, В. Н. Пауков, 3. Б. Шамина // Культура клеток растений и биотехнология. М. : Наука, 1986. - С. 83-87.

245. Промышленный регламент на производство биомассы раувольфии змеиной — сырья для получения аймалина / ХПФО "Здоровье". Харьков, 1991.- 126 с.

246. Процессы пульсационной экстракции из растительного сырья / Р. М. Малышев, А. М. Кутепов, А. Н. Золотников, А. А. Седов, В. Е. Бомштейн, Е. А. Рябенко // Теоретические основы химической технологии. 2001. - Т. 35. -№ 1 . - С. 57-60.

247. Пучинина, Т. Н. Анатомо-морфологическое исследование культуры ткани раувольфии змеиной / Т. Н. Пучинина, Л. М. Городнянская, А. Г. Воллосович // Растительные ресурсы, 1980. Т. 16. - Вып. 4. - С. 578-582.

248. Пучинина, Т. Н. Поверхностный способ культивирования ткани раувольфии змеиной и перспективы его внедрения в промышленное производство : автореф. дис. . канд. фармац. наук / Т. Н. Пучинина. Л., 1984.-22с.

249. Пучкова, Е. М. Совершенствование процесса очистки N(4)-пропилаймалинбромида и разработка технологии таблетирования комплесного состава на его основе: автореф. дис. . канд. фармац. наук / Е. М. Пучкова. СПб., 1995. - 25 с.

250. Рабинович, С. А. Алкалоиды каллусных тканей Papaver bracteatum Lindl / С. А. Рабинович, А. М. Смирнов // Культура клеток растений и биотехнология. М. : Наука, 1986. - С. 63-66.

251. Радзинский, В. Е. Лекарственные растения и Б АД в акушерстве и гинекологии / В. Е. Радзинский, Е. Г. Михайленко, К. В. Захаров ; под. ред. д.м.н. проф. В.Е. Радзинского. Элиста : АПП «Джангар», 1998. - 288 с.

252. Разработка методики определения экстрактивных веществ при получении растительных полиэкстрактов / Е. И. Саканян, К. Э. Кабишев, Б. Л. Молдавер. и др. // Фармация в XXI веке: инновации и традиции: тез. докл. междунар. науч. конф. СПб., 1999. - С. 72.

253. Растения для нас : Справочное издание / К. Ф. Блинова, В.

254. B. Ва'ндышев и др. ; под ред. Г. П. Яковлева, К. Ф. Блиновой СПб. : Учебная литература, 1996 г. - 330 с.

255. Регистр лекарственных средств России. РЛС «Аптекарь». 2001 -М. : Изд-во «РЛС-2001», 2001. - 1584 с.

256. Регистр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств. -М. : ООО «РЛС-2005», 2005. 1053 с.

257. Ржежабек, И. Влияние количества и форм азота на рост клеток и накопление стероидных соединений в суспензионной культуре Solanum laciniatum / Й. Ржежабек, О. А. Горелова // Культура клеток растений и биотехнология. М. : Наука, 1986. - С. 70-76.

258. Романова, С. Отечественное производство лекарственных средств из растительного сырья / С. Романова, В. Захарова // Ремедиум. 2000. - № 4.1. C. 42-48.

259. Ростовая активность замещенных 6-азаурацилов / 3. В. Лазуркевич, С. И. Губарь, А. С. Шаламай и др. // Физиология и биохимия культур растений. 1985. - Т. 17. - № 1. - С. 48-54.

260. Рубин, Б. А. Физиология и биохимия дыхания растений / Б. А. Рубин, М. Е. Ладыгина. М., 1974.

261. Русанов, А. И. Мицеллообразование в растворах поверхностно-активных веществ / А. И. Русанов. СПб. : Химия, 1992.

262. Рязанова, Т. В. Об интенсификации процесса экстракции коры лиственницы сибирской в дезинтеграторе / Т. В. Рязанова, Н. А. Чупрова, Н. Ю. Ким // Химия растительного сырья. 2000. - № 1. - С. 95-100.

263. Саморядов, Б. А. Исследование технологии выделения скополамина и гиосциамина из надземной части скополии тангутской: автореф. дис. . канд. техн. наук / Б. А. Саморядов. Л., 1974. - 27 с.

264. Самсонов, Г. В. Ионный обмен. Сорбция органических веществ / Г. В. Самсонов, Е. Б. Тростянская, Г. Э. Елькин. Л. : Наука, 1969. - 336 с.

265. Самсонов, Г. В. Сорбционные и хроматографические методы физико-химической биотехнологии / Г. В. Самсонов, А. Т. Меленевский. Л : Наука, 1986. - 230 с.

266. Сассон, А. Биотехнология: свершения и надежды / А. Сассон ; пер. с англ. под ред. В. Г. Дебабова. М. : Мир, 1987. - 411 с.

267. Семихатова, О. А. Дыхательная способность высших растений. Таксономический обзор / О. А. Семихатова, М. Г. Николаева // Физиология растений. 1996. - Т. 43. - № 3. - С. 450-461.

268. Семихатова, О. А. Оценка адаптационной способности растения на основании исследований темнового дыхания / О. А. Семихатова // Физиология растений. 1998. - Т. 45. - № 1. - С. 142-148.

269. Семихатова, О. А. Показатели, характеризующие дыхательный газообмен растений / О. А. Семихатова // Ботанический журнал. 1968. - Т. 53.-№8. -С. 1069-1084.

270. Семихатова, О. А. Энергетика дыхания растений в норме и при экологическом стрессе / О. А. Семихатова. JI. : Наука, 1990. - 72 с.

271. Сергеева, Е. М. Получение фармакологически активных полусинтетических производных аймалина и их лекарственных форм: автореф. дис. канд. фармац. наук / Е. М. Сергеева. СПб., 1993. - 25 с.

272. Синтез и исследование противоаритмической активности N-(4)-пропилаймалин бромида / Я. В. Костин, С. А. Минина, Э. И. Генденштейн, Е. И. Молохова // Химико-фармацевтический журнал. 1987. - № 5. - С. 559561.

273. Синтез, накопление и локализация стероидных гликозидов в клетках разных штаммов Dioscorea deltoidea Wall. / Р. Г. Бутенко, А. С. Воробьев, А. М. Носов, И. Е. Князьков // Физиология растений. 1992. - Т. 39. - Вып. 6. -С. 1146-1150.

274. Слепян, JI. И. Культуры тканей лекарственных растений и перспективы их использования в фармации / JI. И. Слепян, А. Г. Воллосович, Р. Г. Бутенко // Растительные ресурсы. 1968. - Т. 4. - Вып. 4. - С. 457-467.

275. Слепян, JI. И. Препараты женьшеня : особенности и перспективы правовой охраны по материалам патентов / Л. И. Слепян, И. И. Брунштейн, Н. В. Кустова // Биотехнология, 2005. №2. - с. 3-10.

276. Смолов, А. П. Влияние концентрации Ог на газообмен Ог и ССЬ гетеротрофной и фотогетеротрофной культуры ткани руты / А. П. Смолов, В. С. Полевая, Т. Н. Смолова // Физиология растений. 1983. - Т. 20. - № 2. - С. 269-275.

277. Содержание флавоноидов в сушенице топяной / М. М. Коноплева, В. И. Глызин, Л. П. Смирнова, А. А. Кирьянов // Химико-фармацевтический журнал. -1981. №1. - С. 72-75.

278. Соколов, О. А. Технологии извлечения БАВ из растительного сырья / О. А. Соколов, В. Ф. Корсун // Практическая фитотерапия. 2000. - № 3. - С. 52-53.

279. Соколов, С. Я. Справочник по лекарственным растениям (Фитотерапия) / С. Я. Соколов, И. П. Замотаев. М. : Медицина, 1990. - 464 с.

280. Способ приготовления и фармакологические, свойства настойки из листьев женьшеня / С. А. Минина, А. Б. Легостева, Н. В. Сыровежко, Н. Е.

281. Тушина и др. // Химико-фармацевтический журнал. 2000. - № 9. - С. 3137.

282. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Элиот, У. Элиот, К. М. Джонс: М.: Мир, 1991.-544 с.

283. Степанова, Э. Ф. Биотехнологические исследования по безотходному использованию солодки: автореф. дис. . д-ра фарм. наук / Э. Ф. Степанова. -Харьков, 1989.-47 с.

284. Строгов, С. Установка для получения препаратов из культур клеток растений / С. Строгов, В. Муратов // Ремедиум. 2000. - № 3. - С. 59.

285. Сур, С. В. Проблемы и перспективы разработки и внедрения современных лекарственных средств растительного происхождения / С. В. Сур, Э. Н. Гриценко // Фарматека. 2001. - № 9/10. - С. 10-13.

286. Тенцова, А. И. Лекарственная форма и терапевтическая активность лекарств (введение в биофармацию) / А. И. Тенцова, И. С. Ажгихин. — М. : Медицина, 1974 г. 336 с

287. Технология комплексной переработки кедровых орехов / А. В. Рудковский, О. Г. Парфенов, М. Л. Щипко, Б. Н. Кузнецова // Химия растительного сырья. -2000. № 1. - С. 61-68.

288. Технология масляных экстрактов и создание на их основе лекарственных препаратов / В.И. Погорелов и др. // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. Тр. -Пятигорск, 2003. Вып. 58. - С. 147.

289. Титель, X. Границы проницаемости клеточных стенок в клеточных суспензиях / X. Титель, Р. Эвальд // Физиология растений. '- 1999. Т. 46. - № 6. - С. 845-850.

290. Трухин, Н. В. Современные технологии обработки морских водорослей / Н. В. Трухин. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. -43 с.

291. Туницкий, Н. Н. Диффузия и случайные процессы / Н. Н. Туницкий. Новосибирск, 1970. - 116 с.

292. Туркова, Н. С. Дыхание растений / Н. С. Туркова. М., 1963. с.

293. Тухтасинов, М. X. Химическое изучение культуры ткани раувольфии змеиной Rauwolfia serpentina (L.) Benth. и получение из нее лекарственных препаратов: автореф. дис. . канд. фармац. наук / М. X. Тухтасинов. М., 1977.-21 с!

294. Ультразвуковая экстракция алкалоидов листьев белладонны / Тончева М. и др. // Фармация (Болг.). 1963. - Т. 13. - № 3. - С. 36-38.

295. Уразбахтина, Н. А. Особенности культивирования растений семейства тиссовых — продуцентов дитерпеноида — таксола: автореф. дис. . канд. биол. наук / Н. А. Уразбахтина. Уфа, 2000. - 24 с.

296. Усов, А. И. Химические исследования водорослей / А. И. Усов, Д. С. Чижов. М.: Знание, 1988.

297. Фаулер, М. В. Экономические аспекты промышленного культивирования клеток растений / М. В. Фаулер ; пер. с англ. В. И. Негрука // Биотехнология сельскохозяйственных растений. М. : Агропромиздат, 1987. - С. 9-42.

298. Финкелыитейн, Е. И. Исследование окисления полиенов ряда витаминов А и Д: Результаты и проблемы (обзор) / Е. И. Финкелыптейн, Э. И. Козлов // Химико-фармацевтический журнал. 1986. - № 4. - С. 474-485.

299. Фитотерапия с основами клинической фармакологии / под. ред. В. Г. Кукеса. -М. : Медицина, 1999. 192 с.

300. Фролова, JI. В. Особенности популяций культивируемых клеток / JI. В. Фролова // Культура клеток растений и биотехнология. М. : Наука, 1981. -С. 5-20.374 ФС 42-1876-82. Аймалин.

301. ФС 42-1889-59. Настойка зверобоя.

302. ФС 42-1948-82. Настойка календулы.377 ФС 42-2705-90. Альгипор.

303. ФС 42-2733-96. Экстракт зверобоя сухой.379 ФС 42-2959-93. Альгимаф.

304. ФСП 42-0171174901. Зверобоя экстракт сухой.

305. Хаззаа И. X. Экстракция травы зверобоя и сушеницы двухфазными системами растворителей с применением ПАВ : автореф. дис. . канд. фарм. наук. / И. X. Хаззаа. СПб., 2004 г. - 23 с.

306. Хаззаа, И. X. Разработка состава и технологии лечебного геля на основе экстрактов травы зверобоя и сушеницы/ И. X. Хаззаа, В. А. Вайнштейн, И. Е. Каухова // Материалы 11-го Россиийского национального конгресса «Человек и лекарства». М, 2004. - С. 128.

307. Хаззаа, И. X. Экстрагирование липофильных БАВ из травы зверобоя водно-масляными эмульсиями / И. X. Хаззаа, В. А. Вайнштейн, Т. X. Чибиляев // Химико-фармацевтический журнал. 2003. - Т. 37. - № 7. - С. 2023.

308. Хасирджев, А. М. Пропиленгликоль как экстрагент для выделения косметических БАВ из природных источников / А. М. Хасирджев. М. : Камелия, 2003. - 50 с.

309. Химический анализ лекарственных растений: Учеб. пособие для фармацевтических вузов / Е. Я. Ладыгина, Л. Н. Сафронич, В. Э. Отряшенкова и др. // Под ред. Гринкевич Н.И. Сафронич Л.Н. М.: Высш.школа, 1983. 176 е., ил.

310. Хинт, И. П. О принципиальных проблемах механической активации / И. П. Хинт // Об. СКТБ "Дезинтегратор". Таллин, 1979. - С. 47-49.

311. Хитерхеев, С. К. Кавитационные тепломассообменные аппараты / С. К. Хитерхеев, Н. С. Хитерхеева. Улан-Удэ : Изд-во ВСГТУ. - 1999. - 141 с.

312. Ходаковская, М. В. Влияние некоторых метаболитов изопреноидного пути на накопление биомассы и содержание гинзенозидов в клеточных культурах женьшеня / М. В. Ходаковская, В. П. Булгаков, Ю. Н. Журавлев // Биотехнология. 1997. - № 1. - С 42-47.

313. Холодова В. П. Рост и метаболизм углеводов в культуре ткани растений В. П. Холодова // Культура клеток растений. М. : Наука, 1981. - С. 17-36.

314. Хоменкж, В. С. Влияние поверхностно-активных веществ на экстракцию алкалоидов из травы плавуна булавовидного / В. С. Хоменюк, В. П. Георгиевский, И. Г. Швагер // Материалы 2-го Всесоюз. съезда фармацевтов. Рига, 1974. - С. 97-98.

315. Хравченко, Н. В. Выбор оптимальных размеров частиц при совместном экстрагировании различных видов растительного сырья, входящего в состав сбора / Н. В. Хравченко, И. А. Муравьев, Ю. Г. Пшуков // Фармация. 1976. - С. 9-12.

316. Цагарейшвили, Г. В. Биофармацевтические, фармакокинетические и технологические аспекты создания мягких лекарственных форм. Ректальные препараты / Г. В. Цагарейшвили, В. А. Головкин, Т. А. Грошовый. Тбилиси : Мецниерба, 1987. - 264 с.

317. Цитологическое изучение высокопродуктивной клеточной линии Rauwolfia serpentina Benth. при глубинном выращивании / И. Е. Каухова, В.

318. А. Кунах, В. С. Легейда, А. Г. Воллосович // Цитология и генетика. 1981. -Т. 15. - Вып. 3.-С. 33-37.

319. Череватый, В. Т. Сравнительное изучение антибактериального действия различных экстрактов из шалфея лекарственного / В. Т. Череватый, Т. Н. Ващенко, Г. 3. Шишков // Растительные ресурсы. 1980. - Т. 16. - № 1. -С. 137-139.

320. Черноморский С. А. Изучение состояния1 хлорофилл-белкового комплекса в листьях высших растений: автореф. дис. . канд. биолог, наук / С. А. Черноморский. Л.; 1961. - 21с.

321. Чибиляев, Т. X. Состояние и перспективы работ по культивированию тканей и клеток лекарственных растений / Т. X. Чибиляев // Химико-фармацевтический журнал. 1984. - № 8. - С. 971-979.

322. Шамина, 3. Б. Генетическая изменчивость в популяциях соматических клеток в культуре: автореф. дис. . д-ра биолог, наук / 3. Б. Шамина.-Л., 1988.-34 с.

323. Шамина, 3. Б. Стратегия получения мутантных штаммов клеток растений — продуцентов биологически активных веществ / 3. Б. Шамина // Физиология растений. 1994. - Т. 41. - № 6. - С. 879-884.

324. Шарикова, Л. А. Пропиленгликолевые экстракты. Производство, свойства, применение / Л. А. Шарикова, С. Ю. Бокарева // Сырье и упаковка. 2004. - № 10 (49). - С. 12-15.

325. Шебатин, Р. В. Разработка методов получения, изучения биологической активности и стандартизация солей М(4)-пропилаймалиния с карбоновыми кислотами: автореф. дис. . канд. фармац. наук / Р. В. Шебатин. СПб., 2002. - 27 с.

326. Шиков, А. Н. Растительные масла и масляные экстракты: технология, стандартизация, свойства / А. Н. Шиков, В. Г. Макаров, В. Е. Рыженков. М.: Издательский дом "Русский врач". - 2004. - 264 с.

327. Шимолина JI. П. Алкалоиды культуры ткани раувольфии змеиной / JI. П. Шимолина, С. А. Минина, Т. А. Дербина // Культура ткани и клеток растений и биотехнология. М. : Наука, 1986. - С. 58-60.

328. Шостенко, Ю. В. Адсорбционная технология в производстве лекарственных веществ природного происхождения / Ю. В. Шостенко // Технология и стандартизация лекарств: сб. науч. тр. Харьков: PUPER, 1996. -С. 186-219.

329. Шпектор, А. В. Электрокардиографическая оценка механизмов аритмии и дифференцированный подбор антиаритмической терапии: автореф. дис. . д-ра мед. наук / А. В. Шпектор. М., 1991.

330. Штаммы культуры тканей Rauwolfia serpentina и их продуктивность / Н. Е. Воллосович, А. Г. Воллосович, Т. А. Ковалева, 3. Б. Шамина, Р. Г. Бутенко // Растительные ресурсы. 1976. - Т. 12. - № 4. - С. 578-582.

331. Щигельский, О. А. Содержание некоторых микро- и макроэлементов у видов раувольфии и в культурах их изолированных тканей / О. А. Щигельский, А. Г. Воллосович, В. К. Яценко // Растительные ресурсы. 1980. -Т. 16.-Вып. 3.-С. 425^430.

332. Эвкалимин (Eukaliminum) Электронный ресурс. / ГУЛ «ПЭЗ ВИДАР». условия доступа : www.mtu-net.ru/vilarplant/evkalimin.htm. -01.10.2004.

333. Экстрагирование полярных БАВ из травы двухфазной системой экстрагентов в присутствии ПАВ / И. X. Хаззаа, В. А. Вайнштейн, Т. X. Чибиляев, И. Е. Каухова // Химико-фармацевтический журнал. 2004. — № 5.-С. 25-27.

334. Экстрагирование растительного сырья компонентами суппозиторных основ в составе двухфазных систем экстрагентов — новый подход в технологии фитопрепаратов / Ю. Т. Демченко, Н. Г. Федорова, И. Е. Каухова,

335. B. А.-Вайнштейн// Материалы IX Международного съезда «Фитофарм 2005» и конференции молодых ученых Европейского Фитохимического Общества «Растения и здоровье», Санкт-Петербург, 22-25 июня 2005. СПб., 2005.1. C.735-739.

336. Экстрагирование полярных БАВ из травы двухфазной системой экстрагентов в присутствии ПАВ / И.Х. Хаззаа, В.А. Вайнштейн, Т.Х. Чибиляев, И.Е. Каухова // Химико-фармацевтический журнал. 2004. -№ 5. - С. 25-27.

337. Эмульсии / Под ред. Ф. Шермана ; пер. с англ. под ред. А. А. Абрамзона. JI. : Химия, 1972. - 448 с.

338. Юинг, Г. Инструментальные методы химического анализа / Г. М. Юинг. — М. : Мир, 1989. 608 с.

339. Якубович, В. С. Альгинатные препараты в медицине / В. С. Якубович // Тез. докл. науч.-практич. конф., посвящ. 80-летию Архангельского водорослевого комбината. Архангельск. - 1998. - С. 24.

340. Abbott, A. J. Changes in growth and metabolism of excised pea roots associated with iron deficiency. 1.Changes in number of cells nitrogenous399constituents and respiration rate / Abbott A. J. // New Phytologist. 1968. - V. 67. -№ 4. - P. 947-952.

341. Actions of N-propylajmaline on experimental arrhythmias and electrophysiological propertios of the heart / S. Koki, K. Yutaha, G. Gunichi et al. // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 1974. - V. 22. - № 10. - P. 2329-2336.

342. Ahmad, V. U. Further studies in the ajmaline series / V. U. Ahmad, A. Basha // Рак. J. Sci. Ind. Res. 1972. - V. 15. - № 4/5. - P. 249-251.

343. Ajmaline derivatives // Chem. Abstrs. 1963. - V. 59. - R8816d: Pat. 622395 Belgium. - 10 p.

344. Ajmaline derivatives and process there for // Chem. Abstr. 1964. - V. 61. - R4412d: Pat. 3 133 929 US. - 9 p.

345. Ajmaline. Part 1 / F. Anet, D. Chakravarti, R. Robinson et al. // J. Chem. Soc.- 1954.-№ 11.-P. 1242-1260.

346. Alan, L., St. John's Wort (Hypericum perforatum): Clinical Effects on Depresson and Other Conditions / L. Alan, N. D. Miller // Alternative Medicine Review.- 1998.-vol. 3.-p. 18-25.

347. Allan, E. J. Biologically active plant secondary metabolites: perspectives for the future / E. J. Allan, M. W. Fowler // Chem. Ind. (London). 1985. - V. 17. -№ 12.-P. 408-410.

348. Antiarrhythmic 17-0-acylajmalines // Chem. Abstrs. 1971. V. 74. № 17. R 88189e: Pat. 2 023 947 DBR. 14 s.

349. Barene I., Daberte I., Zvirgzdina L., Iriste V. The complex technology on products of German chamomile // Medicina (Kaunas). 2003. T. 39. Suppl. 2. S. 127-131.

350. Barnes, J. St. John's Wort (Hypericum perforatum): a review of its chemistry, pharmacology and clinical properties / J. Barnes, L. A. Anderson, D. Phillipson // Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2001. - Vol. 53. - P. 583400

351. Barz, W. Potential of Plant cell cultures for pharmaceutical production / W. Barz, В. E. Ellis // Natural products as medicinal agents / Eds J. L. Beal and E. Reinhard Stuttgart: Hippokrates, 1981. P. 471-507.

352. Berlin, J. Comparison of various strategies designed to optimize indole alkaloid accumulation of a cell suspension culture of Catharanthus roseus / J. Berlin, C. Mollenschott, F. DiCosmo // Z. Naturforsch. 1987. - V. 42. - № 9-10. -P. 1101-1108.

353. Bite, P. Synthesis of ajmaline derivatives, II / P. Bite, E. Diszler // Acta Chim. Acad. Sci. Hung. - 1972. - V. 71. - № 1. - P. 121-124.

354. Blunden, G. Medicinal and Pharmaceutical uses of algae / G. Blunden, S. Gordon // Pharm. Int. 1986. - № 7 (Nov.). - P. 287 - 290.

355. Bombardelli, E. Derivati dell' Ajmalina. Nota II / E. Bombardelli, A. Bonati //Farmaco. -Ed. Sci. 1963. - V. 18. - №11. - P. 851-863.

356. Bonati, A. Ion exchange resins and electrodialysis in extraction and purification of alkaloids / A. Bonati // Fitoterapia. 1961. - V. 32. - № 2. - P. 2-6.

357. Bonati, A. Rauwolfia alkaloides as sources of new medicaments / A. Bonati // Fitoterapia. 1962. - V. 33. - №. 1. - P. 34-39.

358. British Pharmacopoeia 2004 ; Addendum 2005 ( Electronic) : complete version Электронный ресурс. 2005

359. Brodelius, P. Production of Biochemicals with Immobilized Plant Cells: Possibilities and Problems / P. Brodelius // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1983. - V. 413. - P. 383-393.

360. Bruhn, J. G. The use of natural products in modern medicine / J. G. Bruhn // Acta Pharm. Nord. - 1989. - V. 1. - P. 117-130.

361. Bussmann, W. D. Orally administrared proajmalium bitartrate in acute and chronic ventricullar arrhythmias / W. D. Bussmann, E. Muller, H. Hanel // Amer. J. Cardiol. 1978. - V. 41. - P.-577-583.

362. Butenko, R. G. Some Features of Cultural Plants Cells / R. G. Butenko // Plant Cell Culture. Advances in Science and Technology in the USSR / Ed. R.G. Butenko. M.: Mir Publishers, 1985.-P. 11-20.

363. Capra, C. Antiarrhythmic activity of 17-(monochloracetyl) ajmaline in comparison with that of 17, 21-bis-(mono-chloracetyl) ajmaline. Experimental and clinical study / C. Capra, E. Pretolani // Panminerva Med. 1973. - V. 15. - № 9. -P. 303-333.

364. Cardiac actions of 17-monochloro-acetylajmaline, N-propylajmaline and ajmaline as studied in the heart-lung preparations of the dog / Y. Katano, T. Otorii, S. Maruyama et al. // Arzneimittel-Forschung. 1973. - V. 23. - № 3. - P. 483484.

365. Chatterjee, A. The constitution of ajmaline / A. Chatterjee, S. Bose // J. Indian Chem. Soc. 1954. - V. 31. - № 1. - P. 17-24.

366. Dransfeld, B. Zur Behandlung der ventrikularen Exstrasystolie mit N-n-Propyl-Aimalinium-hydrogen-tartrat (N-PAB) / B. Dransfeld // Therapiewoche. 197L-V. 21.-P. 2632-2638.

367. Drapeau D., Blanch H.W., Wilke C. R. Growth Kinetics of Dioscorea deltoidea and Catharanthus roseus in Bath Culture // Biotechnology and Bioengineering. 1986. V. 28. P. 1555-1563.

368. Ekiert, U. Medicinal plant biotechnology: the Apiaceas family as the example of rapid development / U. Ekiert // Pharmazie. 2000. - V. 55. - № 8. - P. 561-567.

369. European Pharmacopoeia 4-th. edn. Электронный ресурс. / Council of Europe. Strasbourg, 2002. - CD ROM.

370. Final report on safety assessment of Calendula officinalis extract and Calendula officinalis // International Journal of Toxicology. 2001. -№ 20. -suppl. 2. - P. 13-19.

371. Final report on safety assessment of Hypericum perforatum extract and Hypericum perforatum oil // International Journal of Toxicology. 2001. -№ 20. — suppl. 3.-P. 31-39.

372. Flos Chamomillae // WHO monographs on selected medicinal plants / World Health Organization. Geneva, 1999. - Vol. 1. - p. 86-94.

373. Fowler, M. W. Problems in Commercial Exploitation of Plant Cell Cultures / M. W. Fowler // Applications of Plant Cell and Tissue Culture. -Chichester: J. Wiley and Sons, 1988. P. 228-240.

374. Fowler, M. W. The large scale cultivation of plant cells / M. W. Fowler // Prog. Ind. Microbiol. 1982. - № 16. - P. 207-229.

375. Fujita, Y. Industrial Production of Shikonin and Berberin / Y. Fujita // Application of Plant Cell and Tissue Culture. CIBA Foundation Symposium, 1988. - P. 218-225.

376. Fujita, Y. Selection of cell lines with high productivity of shikonin derivatives by protoplast culture of Lithospermum erythrorhizon cells / Y. Fujita, S. Takahashi, Y. Yamado // Agric. Biol. Chem. 1985. - Vol. 49. - P. 1755-1759.

377. Gao, S. A newly-detected reductase from Rauwolfia closes a gap in the biosynthesis of the antiarrhythmic alkaloid ajmaline / S. Gao, G. von Schumann, J. Stockigt // Planta Med. 2002. - V. 68. - № 10. - P. 906-911.

378. Garew, D. P. Plant tissue culture: Its fundamentals application and relationship to medicine plant studies / D. P. Garew, E. J. Staba // Lloydia. 1965. -V. 28.-№.3.-P. 1-26.

379. Gelbke, H. P. Suicide by an Overdosage of N-Propylajmalinum Bitartrate / H. P. Gelbke, H. J. Schlicht // Arch. Toxicol. 1977. - V. 37. - P. 135-141.

380. Godoy-Hernandez G. Effect of Fungal Homogenate Enzyme Inhibitors and Osmotic Stress on Alkaloid Content of Catharanthus- roseus Cell Suspension Cultures / G. Godoy-Hernandez, V. M. Loyola-Vargas // Plant. Cell Rep. 1991. -V. 10. -№ 11.-P. 537-540.

381. Griffin, W. C. Classification of Surface-Active Agents by "HLB" / W. C. Griffin // J. Soc. Cosmet. Chem. 1949. - V. 1. - P. 311-326.

382. Hahlbrock, K. Regulatory aspects of phenylpropanoid biosynthesis in cell cultures / K. Hahlbrock // Plant tissue culture and its biotechnological application / W. Barz, E. Reinhard, M. H. Zenk (Eds). Berlin: Springer, 1977. - P. 95-111.

383. Hayat, M. A. Principles and techniques of electron microscopy / M. A. Hayat // Biological applications, New York: Van Nostrarid Reinhold. Co, 1974. -V. 3.-№ l.-P. 3-51.

384. Hefner, T. Probing suggested catalytic domains of glycosyltransferases by site-directed mutagenesis / T. Hefner, J. Stockigt // Eur. J. Biochem. 2003. - V. 270.-№3.-P. 533-538.

385. Henning, T. Polyethylene glycols (PEGs) and the pharmaceutical industry / T. Hennning // PharmaChem. 2002. - Vol. 5. - P.57-59.

386. Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals / M. Wichtland, N.G. Bisset (eds.)'. Stuttgart: Medpharm Scientific Publischers, 1994.- 566 p.

387. Hosoda, N. Some accounts on culture conditions of callus tissues of Solanum laciniatum Ait. for producing solasodine / T. Hefner, J. Stockigt // Agric. and Biol. Chem. 1979. - V. 43. - № 8. - P. 1745-1748.

388. Hypericum perforatum. Monograph // Alternative Medicine Review. -2004.-Vol. 9.-P. 318-325.

389. Kadatz, R. Vergleichende Untersuchungen von Chinidin, Ajmalin und N-Propyl-ajmaliniumbromid (NA 309) / R. Kadatz, W. Rossbach // Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 1962. - V. 245. - № l.-P. 71-72.

390. Kaufmann, B. Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurized solvent extraction / B. Kaufmann, P. Christen // Phytochem. Anal. 2002. - V. 13. - № 2. - P. 105-113.

391. Keck, V. J. Synthese von N(b)-Alkyl-ajmalinium-Verbindungen mit starker antiarrhythmischer Wirkung / V. J. Keck // Z. Naturforsch. 1963. - V. 18 B. -№3. - P. 177-179.

392. Knobloch, К. H. Influence of Medium Composition on the Formation of Secondary Compounds in Cell Suspension Cultures of Catharanthus roseus (L.) G. Don / К. H. Knobloch, J. Berlin // Z. Naturforsch. 1980. - V. 35C. - P. 551-556.

393. Kokate, С. Steroidal glycoalkaloids in tissue cultures of Solanum khasianum during organogenesis / C. Kokate, S. Radwan // Planta med. 1978. -V. 33.-№3.-P. 301-310.

394. Kybal, J. A device for cultivation of plant and animal cells / J. Kybal, B. Sikyta // Biotechnol. Lett. 1985. - V: 7. - № 7. - P. 467-470.

395. Larcher, W. Physiological Plant Ecology / Larcher W. Berlin, Heidelberg, NY: Springer - Verlag, 1975. - 252 p.

396. Mathew, N. T. Dosing and administration of ergotamine tartrate and dihydroergotamine / N.T. Mathew // Headache. 1997. - 37 Suppl 1. - P. 26-32.

397. Miller, A. L. St. John Wort (Hypericum perforatum): Clinical Effect on Depresion and Other Conditions / Alan L. Miller // Alternative medicine Review. -1998.-V. 3. — P. 18-25.

398. Miller, С. O. Evidence for the natural occurrence of zeatin and derivatives compounds from maize withe promote cell division / С. O. Miller // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1965. - V. 54. - P. 1052-1058.

399. Minina, S. A. The Technology of Rauwolfia serpentina biomass antiarhytmic preparations / S. A. Minina, I. E. Kauhova, L. L. Shimolina // Abstracts of Conf. "Biotechnology". St.-Petersburg, 1994. - P. 180.

400. Miura, Y. Isolation of vinblastine in callus culture with differentiated roots of Catharanthus roseus (L.) G. Don-Vinca rosea / Y. Miura, K. Hirata, N. Kurano // Agr. and Biol. Chem. 1987. - V. 51. - P. 611-614.

401. Morgan, P. H. Arrhythmias and antiarrhythmic drugs: Mechanism of action and structure-activity relationships II / P. H. Morgan, I. W. Mathison // J. Pharm. Sci. 1976. - V. 65. - № 5. - P. 635-648.

402. Muknerji, D. Chemistry of Ajmaline, Rauwolfine of van Itallie and Steenkanuer / D. Muknerji, R. Robinson, E. Schlitter // Experientia. 1949. - № 5. -P. 215-217.

403. Mulry, M. C. First international conference on St. John's Wort / M.C. Mulry // HerbalGram / American botanical Council. 1999. - P. 60-64. - условия доступа: www.herbalgram.org

404. Murashige, Т. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol, plant. 1962. - V. 15. -№ 13. - P. 473—497.

405. Pat. 2002/0031559 Al US, Int. CI. A61K 35/78. Herbal suppositories / K. C. Liang, L. Liang (US). appl. № 09/974452 ; 09.10.2001 ; publ. 14.03.2002. - 91. P- .

406. Pat. 2004/0265344 Al US, Int. CI. A61K 9/02. Aloe suppositories / E. Zolotariov, Z. Zolotariov ; appl. № 20030691518 ; 24.10.2003 ; publ. 30.12.2004

407. Pat. 9403487 KR, Int. CI. A61K 9/02. Suppositories containing Gingko leaves extract used for hemorrhoids / Om Ki-An, Min Dong-Son, Park Kyong-A ;applicant: Sunkyong Ind. Ltd. (KR). appl. № 19910019657 ; 06.11.1991 ; publ. 23.04.1994.

408. Peters, J. Rooting and the metabolism of nicotine in tobacco callus cultures / J. Peters, P. Wu, W. Sharp, E. Paddock // Physiol, plant. 1974. - V. 31.- № 2. P. 97-100.

409. Polz, L. Characterization of 2 beta (R)-17-0-acetylajmalan: acetylesterase- a specific enzyme involved in the biosynthesis of the Rauwolfia alkaloid ajmaline / L. Polz, H. Schubel, J. Stockigt // Z. Naturforsch. 1987. - V. 42. - № 4.- P. 333-342.

410. Principles and techniques of electron microscopy: Biological applications, V. 3 / Ed. M. A. Hayat. 1st. N. Y.: Van Nostrand Reinhold Co, 1973. - № 1. - P. 3-51.

411. Rauwolfia alkaloids. Strereospecific degradations leading to the absolute configurations and structures of ajmaline, sarpagin and corynentheidine / M. F. Barlett, R. Sklar, W. I. Taylor et al. // J. Amer. Chem. Soc. 1962. - V. 84. - № 4.- P. 622-630.

412. Schaumloffel, E. Pharmakokinetische Studien mit radioaktiv markierten N-(n-propyl)-Ajmalinium-hydrogentartrat / E. Schaumloffel//Med. Welt. 1974. -Bd. 25.-P. 2008-2014.

413. Shigenobu, К. Actions of N-propylajmaline on experimental arrhythmias and electrophysiological properties of the heart / K. Shigenobu, Y. Kasuya, I. Ishiko // Chem. Pharm. Bui. 1974. - V. 22. - № 10. - P. 2329-2336.

414. Siddiqui, S. Alkaloids serpentina Benth. Studia in the ajmalin esteres. Pt. 11 / S. Siddiqui, R. F. Siddiqui // J. Indian Chim. Soc. 1935. - V. 12. - № 1. - P. 37-47.

415. Snader, K. Workshop on Taxol and Taxus / K. Snader. Bethesda, M. D. USA, 1990. -P. 30-40.

416. Sterols of Delphinium ajacis: Production and metabolic relationships in whole plants and callus tissue / G. R. Waller, S. Mangiatico, R. C. Foster, I. R. Lawrence // Plan. Med. 1981. - Bd. 42. - S. 344-355.

417. Stochigt, J. Indole alkaloids from cell suspension cultures of Rauwolfia serpentina Benth / J. Stochigt, A. Pfitzner, S. Tirl // Plant cell Reports. 1981. - №. 1.-P. 36-39.

418. Sw'erdlow, J. L. Nature's Rx. National Geographic / J. L. Swerdlow. -2000.-V. 197.-S. 98-117.

419. Szekeres, L. Experimental cardiac arrhythmias and antiarrhythmic drugs / L. Szekeres, G. Papp Budapest, 1971. P. 327-328.

420. Tal, B. Growth and Diosgenin Production by Dioscorea deltoidea Cells in Bath and Continious cultures / B. Tal, J. Goldberg // Planta Medica. 1982. - V. 44. -№ 1. - P. 107.

421. Taticek, R. A. The Scale-up of Plant Cell Culture: Engineering considerations / R. A. Taticek, Murray Moo -Yong, R. L. Legge // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1991. - V. 24. - № 2. - P. 139.

422. The Synthetic Potential of Cultured Plant Cell /. M. M. Yeoman, M. B. Meidzybrodska, K. Lindsey, W. R. McLauchlan // Plant Cell Cultures: Results and Perspectives / Eds. Sala et al.. Amsterdam: Elsevier, 1980. - P. 327.

423. Trompler Von, A. T. Pharmakokinetik und antiarrhythmische Wirkung1 von Prajmaliumbitartrat / А. Т., Trompler Von, B. G. Woodcock, W. D. Bussmann //Arzneimittel-Forsch. 1983. - B. 33(1). - № 3. - S. 436-439.

424. USP 28/NF19 The United States Pharmacopeia. The National Formulary / United States Pharmacopeial Convention, 2005. 3187 p.

425. Vernon, L. P. The chlorophylls / L. P. Vernon, G. R. Seely. New York, London: Academic Press, 1966.

426. Wakhloo, G. L. Variations in the total alkaloids content of Rauwolfia serpentina roots a consideration from ecological point of view / G. L. Wakhloo // G. In. Bot. Soc. 1962. - Vol. - 42. - P. 214-221.

427. Wilde, P. E. New solvents for extraction / P. E. Wilde, P. G. McClory // Perfumer and Flavorist. 1994. - V. 19. - P. 25-28.1

428. Wood, C. G. Seaweed extracts: a unique ocean resource / C. G. Wood // J. Chem. Educ. 1974. - V. 51 (Jul). - P. 449 - 452.

429. Wood, H. N. Studies on the regulation of certain essential bio-synthetic systems in normal grown-gall tumor cells / H. N. Wood, A. C. Braen // Proc. Nath. Acad. Sci. (USA). 1961. - V. 47. - P. 1907-1913.

430. Yu, В. Deoxysarpagine hydroxylase — a novel enzyme closing a short side pathway of alkaloid biosynthesis in Rauwolfia / B. Yu, M. Ruppert, J. Stockigt // Bioorg. Med. Chem. 2002. - V. 10. - № 8. - P. 2479-2483.

431. Zaman, K. Condensed and Hydrolyzable Tannins in Two Soybean (Glycine max L. cv. Mandarin) Cell Lines that Differ in their Ploidy Levels / K. Zamam // Acta Soc. Bot. Pol. 1988. - V. 57. - № 2. - P. 279.

432. Zaman, K. Phenolic Compounds and Phenylalanine Ammonia Lyase Activity in Two Soybean (Glycine max L. cv. Mandarin) Cell Lines that Differ in their Ploidy Levels / K. Zaman // Acta Soc. Bot. Pol. 1988. - V. 57. - № 1. - P. 177.

433. Zenk, M. H. Anthraqhinon Production by Cell Suspension Cultures of Morinda citrifolia / M. H. Zenk, H. El-Shagi, U. Schulte // Planta Medica. 1975. -V. 41. Suppl. - P. 79.

Оглавление диссертации Каухова, Ирина Евгеньевна :: 2007 :: Санкт-Петербург

Введение диссертации по теме "Технология лекарств и организация фармацевтического дела", Каухова, Ирина Евгеньевна, автореферат

Список использованной литературы по фармакологии, диссертация 2007 года, Каухова, Ирина Евгеньевна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций