Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Источники шиконина в культуре тканей

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи , Г В ОД УДК 581.143.6:547.94 : 0)5.322 :582.937

: V изб

СОХА Василий Иванович

ИСТОЧНИКИ ШИКОНИНА В КУЛЬТУРЕ ТКАНЕЙ

15.00.02 — ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ И ФАРМАКОГНОЗИЯ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ —

1996

Диссертационная работа выполнена на кафедре фармакогнозии Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института Министерства здравоохранения и медицинской промышленности РФ.

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор Л. А. НИКОЛАЕВА

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор С. А. МИНИНА кандидат биологических наук А. Ю. МАКОВЕЙЧУК

Ведущая организация — Ботанический институт им. В. Л. Комарова РАН.

Защита состоится 27 февраля 1996 года в 14.30 часов на заседании диссертационного совета Д.084.63.01 при Санкт-Петербургском химико-фармацевтическом институте по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, д. 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института по адресу: Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, д. 4/6.

Автореферат диссертации разослан « » 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат фармацевтических паук А. В. РУСАК

Актуальность темы. Перспективы промышленного использования культивируемых клеток растений для получения соединений специализированного обмена растений привлекают все большее внимание исследователей. Особую актуальность этот вопрос приобретает в связи с возрастающей остротой экологических проблем. 25% всех применяемых лекарственных средств содержат соединения растительного происхождения. Если приплюсовать к этому потребности парфюмерии, пищевой промыш — ленности, сельского хозяйства, то становится очевидной необходимость замены плантационного, а тем более дикорастущего сырья на гарантировано получаемую промышленным способом биомассу культивируемых клеток, содержащую необходимые соединения в достаточном количестве.

Широкое использование шиконина в медицинской практике, пищевой и парфюмерной промышленности предполагает поиск источников этого красного пигмента, обладающего к тому же антимикробными, противовоспалительными, ранозаживляющими и противоопухолевыми свойствами. Шиконин может быть получен кз корней растений семейства Boraginaceae (виды родов Araebia, Lithospermuin, Onosma, Echiuin и др.), однако запасы дикорастущего сырья во всем мире ограничены, а работы по интродукции видов, содержащих это биологически активное соединение, не привели к желаемым результатам.

Высокий спрос на природные красители, обладающие к тому же антимикробными свойствами, для парфюмерной и пищевой промышленности, текстильного производства, а также для медицинских препаратов стимулировал исследования по разработке биотехнологических приемов получения шиконина.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было фармакогностическое и биотехнологическое исследование культуры ткани — источника красящих антимикробных препаратов и разработка условий ее выращивания, необходимых для промыш — ленного получения биомассы.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить особенности роста и синтеза производных ши — конина культур тканей арнебии красящей Arnebia euchroma (Royle) Johnst. и воробейника краснокорневого Lithospermum erythrorhizon Sieb, et Zucc. при поверхностном и глубинном методах выращивания.

2. Провести селекционные исследования в культурах тканей а. красящей и в. краснокорневого и получить высокопродуктивные штаммы.

3. Установить особенности питания культур — продуцентов шщсонина и разработать питательные среды лдя их выращивания, способствующие максимальной продуктивности, исследовать возможность замены дорогостоящих компонентов питательных сред с целью снижения себестоимости конечного продукта.

4. Дать фотохимическую характеристику биомассы культуры ткани, полученной на основе высокопродуктивного штамма.

5. Провести морфолого—физиологическое, анатомическое изучение, установить товароведческие показатели и разработать проект ГОСТ на новый вид сырья.

6. Изучить возможность использования шиконина в лекарственных и косметологических формах, установить спектр антимикробных свойств шиконина, выделенного из культур растительных тканей, и его препаратов.

Научная новизна. Впервые изучена динамика накопления производных шиконина в процессе роста культуры ткани а. красящей на агаризованной и жидкой питательных средах, и установлена зависимость между скоростью поглощения клетками основных компонентов среды и активностью процессов прироста биомассы и биосинтеза нафтохиноновых пигментов.

Разработаны питательные среды, способствующие высокой продуктивности культур тканей а. красящей и в. краснокорневого, предложены дешевые заменители некоторых компонентов питательных сред (сахарозы, агара).

С учетом физиологических особенностей культур проведены селекционные исследования, предприняты методические подходы, обеспечившие успех в получении высокопродуктивного штамма.

Изучены анатомические, физиологические и фотохимические характеристики сырья, полученного на основе штамма культуры ткани а. красящей, установлены числовые показатели, регламентирующие его качество. Изучена внутриклеточная локализация процессов биосинтеза и накопления нафтохиноновых пигментов в тканях а. красящей.

Установлен спектр микроорганизмов, чувствительных к шиконину, полученному из культивируемых клеток а. красящей.

Впервые исследована совместимость шиконина с наиболее часто используемыми компонентами мягких лекарственных и косметологических форм.

Теоретическая; н практическая значимость. Впервые выявлен комплекс биотехнологических особенностей и закономерностей клеток а. красящей и в. краснокорневого.

Для разработки питательной среды в качестве теоретической основы была взята гипотеза АГ.Воллосовича о возможности эффективной утилизации клетками концентрированных растворов углевода. Выбранная нами стратегия разработки питательной среды позволила в короткие сроки создать питательную среду, в которой, благодаря высокой концентрации сахарозы и соотношению элементов питания, были, вероятно, смоделированы условия корневого метаболизма а. красящей, т.к. в клетках биомассы содержание шиконина достигало уровня его содержания в корнях растения.

Установлены общие закономерности влияния отдельных факторов питания на продуктивность тканей а. красящей и в. краснокорневого, по —видимому, отражающие близость путей биосинтеза шиконина в культурах. Эти данные свидетельствуют о возможности управления процессами синтеза кафггохиноновых пигментов in vitro путем изменения состава питательных сред и условий культивирования.

В результате электронномикроскопического исследования растущей биомассы а. красящей было установлено, что иафто — хиноновые пигменты синтезируются на мембранах эндоплазма — тического ретикулума, а затем транспортируются из клеток и накапливаются на наружной поверхности клеточных оболочек. Этот факт является теоретической предпосылкой к разработке соответствующих способов выращивания культуры.

Показана возможность использования различных моделей селекции и их эффективность д\я получения высокопродуктивных штаммов растительных клеток, синтезирующих производные шиконина.

Получен штамм культуры ткани а. красящей, продуктивность которого позволяет рекомендовать его к промышленному ис — пользованию, и найдены условия выращивания, гарантирующие стандартность данного вида сырья.

Дана полная фармакогностическая характеристика нового вида лекарственного сырья, которая включена в разработанный проект ГОСТ "Биомасса культуры ткани арнебии красящей".

Проведен фотохимический анализ сырья, установлен состав нафюхиноновой фракции и соотношение отдельных пигментов в сумме нафтохннонов.

Разработана методика количественного определения производных шиконина, характеризующаяся высокой точностью и позволяющая значительно снизить временные затраты на проведение анализа.

Отработана методика выделения препарата "шиконин" из нового вида сырья путем гидролиза сложных зфиров шиконина в щелочной среде и последующего осаждения пигментов минеральной кислотой. Проведен качественный и количественный анализ препарата.

Даны практические рекомендации по использованию вспомогательных веществ для приготовления мягких лекар — ственнных и косметологических форм с шикоюгаом, способствующие максимальному проявлению его антимикробной ак — тивности.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на V — й конференции молодых ученых Ботанического института им. ВЛ.Комарова РАН (Санкт-Петербург, май 1994), Всероссийской конференции "Химия и технология лекарственных средств" (Санкт-Петербург, июнь 1994), научной конференции, посвященной 50—летию НИИ фармации (Москва, 1994), VIII Международном конгрессе по культуре растительных тканей и клеток (Флоренция, 1994).

Дт-г ротационная работа выполнена в соответствии с планом научно — исследовательских работ Санкт-Петербургского хими — ко — фармацевтического института по проблеме "Фармация" межведомственного научного совета №47.

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 188 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков, 34 таблицы, приложение. Список литературы включает 252 источника, из них 141 иностранных авторов.

Во введении сформулированы актуальность темы, цель и задачи исследования, научная новизна, теоретическая и практи —

ческая значимость работы, основные положения, выносимые на защиту.

В первой главе представлен обзор литературы, в котором анализируется современное состояние проблемы получения шк-конина с помощью биотехнологии культ ив ируе мых растительных клеток.

Во второй главэ дается характеристика объектов и условия проведения исследований, описаны методики и методы анализа, использованные при выполнении работы.

В третьей главе представлены материалы исследований по разработке составов питательных сред д\я выращивания культур тканех! а. красящей и в. краснокорневого; изучены возможности замены дорогостоящих компонентов сред на более доступные.

В четвертой главе протедены результаты селекционных па — следовашш » культурах тканей а. красящей и в. краснокорневого с использование« различных методов отбора; установлены условия выращивания, гаранпгругощиэ высокую продуктивность к стабильность полученной клеточной лшгап а. красящей.

В пятой гляю дана физиологическая, морфологическая, анатомическая харастеристикп нового штамма культуры ткани а. красящей; представлены результаты фотохимического анаикл лекарственного растительного сырья на основе полученной меточной линии а. красящей, методы качественного п количественного анализа сырья, методика получения нз него шнкогшиа; предложена научно— техническая документация на новый вид лекарственного сырья:.

В шестой главе представлены результаты исследований антимикробной н фунгицндной активности шиконина и его препаратов; изучены структурно —механические свойства модельных препаратов — мягких лекарственных и косметологических форм с шиконином; проведены исследования влияния вспомогательных веществ на эффективность антимикробного действия препаратов шиконина.

теоретические и экспериментальные данные, обосновывающие необходимость и объективность проведенных исследований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

I. Объекты и методы исследования,

Объектами исследования служили наиболее перспективные в отношении накопления нафггохино новых пигментов культуры тканей арнебни красящей и воробейника краснокорневого.

Линия клеток а. красящей ME—85, используемая в наших экспериментах, получена в институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) в августе 1987 г. Исходный орган — листовая почка дикорастущего растения.

Культура ткани в. краснокорневого получена нами в 1992 году. Источниками эксплантов служили растения семенного происхождения, выращенные в стерильных условиях.

Ткани а. красящей и в. краснокорневого в культуре in vitro поддерживались на жидких или агаризованных питательных средах различного состава в термостатируемом помещении при температуре 27±2°С в темноте.

Оптимизацию питательных сред проводили методом математического планирования эксперимента с обработкой результатов по программе R—MULTY, разработанной в Институте экологической генетики (Кишинев). Методы селекции, фармакошости— ческого и фотохимического анализа, использованные в этой рабо — те, являются общепринятыми,

.2, Ояттшзашш.. условий куАЕТнвировашш тканей - дроду-

Для того, чтобы рекомендовать культуру ткани к промышленной наработке необходимо достичь высокой продуктивности тканей и найти условия, которые гарантировали бы ее сохранение и стандартность этого вида сырья.

Прежде всего была изучена динамика роста и накопления нафтохинонов культурой клеток а. красящей при выращивании глубинным и поверхностным методами. Установлено, что характер роста и накопления пигментов суспензионной и каллусной культурами одинаков, несмотря на значительную разницу в продолжительности фаз жизненного цикла. Производные шиконина накапливаются культурами по мере роста тканей, а их максимальное содержание отмечается в стационарной фазе роста клеток.

Исследование скоростей и полноты усвоения основных элементов питательной среды для выращивания а. красящей, предложенной в ВИЛАРе, показало, что концентрации компонентов данной среды полностью не сбалансированы. Оптимизацию питательной среды производили методом математического планирования эксперимента. В основу разработки питательной среды была положена гипотеза АХ.Воллосовича, заключающаяся в том, что растительные клетки способны усваивать и перерабатывать высокие концентрации углеводоп. Именно такой процесс происходит в ситовидных трубках, где накапливается до 40% углеводов. Благодаря минеральный элементам питания клеткп способны к эффективной оснорегуляция. Согласно стратегии АГ.Воллосоепчэ для создания питательной среды, способной активно утилизировать высокие концентрации кассообразующего компонента сагарози, крэжд® пг.его необходимо пайтн правильное соотношение зле — кешоз. А это в свою очередь можно определить, взяв за оског.у элекэнтгшй: состав органа, накапливающего искомое вэщестпо.

Мы внесли поправку в эту стратегию, посчитав возможны?! выязоть соотношение элементов п питательной среде оеытпт:м путем. При с остановке эксперимента мы выбрали уровни Еарыг — рования коицехгграцкй компонентов сред на осноге наших ерэд— сарктельк-мх результатов к согласно литературным данкы?: по состава? I сред ддя культур—продуцентов шнконипа. При этой аимонийкую форгг/ азота мы не использовали, так как предварительно 1глу.г. было подтверждено отрицательное влгьткк:: коггоз аммония на биосинтез производных шнконипа клеткагн* а. хсрасяхцей. План опыта представлен в табл. 1.

Таблица 1

План факторного эксперимента в опыте №1 с культурой ткани АгпеЫа еисГиота

ЛГ2 Факторы Уровни варьирования фаетороп, кг/л

1 2 3 4 О

1 КНОз 3000,0 3500,0 4000,0 4500,0 5303,0

2 Мд5О4-5Н0О 400,0 500,0 600,0 700,0 800,0

3 Са(Ж>з)2 500,0 600,0 700,0 800,0 500,0

4 КС1 100,0 200,0 300,0 400,0 500,0

5 КН2Р04 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0

6 К?НРО4 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0

Содержание сахарозы во всех вариантах опыта было постоянным — 4,5%, »по более чем в 1,5 раза превышало ее кон —

центрацию в среде —прототипе. Результаты эксперимента подвергали обработке по программе R—Multy, разработанной в Институте экологической генетики АН Молдовы. Критерием оптимизации служила общая продуктивность культуры ткани а. красящей в мг шиконина на литр питательной среды. Результаты эксперимента представлены графически на рис. 1.

Таким образом, благодаря циклу предварительных опытов и емкому эксперименту методом математического планирования удалось в короткие сроки создать питательную среду, в которой, вероятно, были смоделированы условия корневого метаболизма а. красящей, что позволило в 1,5 раза увеличить общую продуктивность ткани. Ее принципиальной особенностью является высокое содержание массообразующего компонента — сахарозы. Влияние высокого осмотического давления, создаваемого сахарозой, уравновешивается соотношением остальных компонентов среды, концентрации которых, способствующие при этом максимальной продуктивности культуры, установлены точно и лежат в пределах:

КЫОз - 3750,0 - 4250,0;

MgSC>4-6H20 - 470,0 - 550,0;

Ca(NC>3)2 - 500,0 - 550,0;

КС1 - 175,0-240,0;

КН2РО4 - 110,0-125,0;

К2НРО4 - 70,0-80,0.

Для культуры ткани в. краснокорневого методом математического планирования в результате нескольких последовательных экспериментов также был подобран состав питательной среды, способствующий как росту клеток, так и биосинтезу шиконина (концентрации компонентов в мг/л): KNO3 — 3500,0; Ca(NC>3)2 ~ 500,0; МдБС^-б^О - 750,0; КН2РО4 - 150,0; К2НРО4 - 150,0; витамины, железа хелат, микроэлементы, за исключением CuS04-5H20 - по прописи Мурасиге и Скуга; CuS04-5H20 - 0,3; мезо —инозит - 100,0; сахароза - 50000,0; агар - 6000,0; ИУК -1,5; хинетин — 0,5.

Сравнительный анализ полученных композиций для обеих культур показывает их принципиальную близость, что, по-видимому, связано с одинаковым путем биосинтеза шиконина в различных тканях, его продуцирующих, и, следовательно, на близости условий, способствующих зпигенетячесхой реализации генетической информации,

Рис. 1. Зависимость продуктивности культуры ткани арнебии красящей от концентрации факторов: а — KNO3, б —

MgSC>4-6H20, в - Са(ЫОз)2. г - KCl, д - КН2Р04, е - К2НРО4. По оси абсцисс — концентрация фактора, в мг/л; по оси ординат — продуктивность, в мг/л.

Внедрение культуры ткани в промышленное производство возможно только в случае рентабельности данного производства, что достигается путем снижения себестоимости продукции. Реальным путем удешевления конечного продукта является замена дорогостоящих компонентов питательных сред на более доступные и дешевые. В результате поиска таких заменителей были найдены продукты, которые можно использовать в качестве дешевых компонентов питательных сред, вместо сахарозы и агара. Это зеленая патока — отход производства глюкозы и синтетические полимеры, способные к набуханию — производные акриловой кислоты — уникальные супервлагоабсорбенты, синтезируемые на а/о "Завод Оргполимерсинтез" по лицензии Центра экономических внешних связей и научных исследований РАН. Показана возможность их успешного использования для роста различных культур—продуцентов шиконина (а. красящей), алкалоидов (раувольфии змеиной) и гликозцдов (женьшеня). Даже частичная замена сахарозы и агара в среде на эти компоненты дает принципиальную возможность значительно удешевить процесс производства культур растительных тканей как потенциального лекарственного сырья.

3. Селекпионные исследования в культурах тканей арнебии красящей и воробейника краснокорневого.

Учитывая опыт микробиологии, где решающую роль в становлении промышленного производства антибиотиков сыграла селекционная работа с первичными культурами, позволившая увеличить в тысячи раз выход антибиотиков и тем самым сделать их доступными препаратами, мы большое внимание в своей работе уделили генетико — селекционнным исследованиям.

Большинство использованных нами методов селекции (прямой отбор, селекция на устойчивость к антиметаболиту и др.) дали положительные результаты в плане получения стабильного и высокопродуктивного штамма — продуцента нафтохиноиовых пигментов. Их эффективность обусловлена разработанными нами экспресс—методиками количественной оценки производных шиконина, которые значительно расширили долю материала, подвергаемого отбору.

На начальных этапах селекции весьма эффективным оказался прямой отбор наиболее продуктивных субпопуляций. Он позволил

стабилизировать выход пигментов в культуре ткани а. красящей, выращиваемой на жидкой питательной среде, и приблизительно в 1,5 раза повысить продуктивность ткани а. !фасящей, растущей на агаризованной среде (рис. 2). С помощью прямого отбора удалось выделить клеточную линию в. краснокорневого, способную к синтезу производных шиконина в концентрации 20,0 мкг/гт

5 ^ 4,5 4 3,5 -

3 2,52 -1,51

0,5 0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Рис. 2. Увеличение и стабилизация выхода нафтохиноновых пигментов с помощью прямого отбора в халлусной культуре ар — небни красящей.

По оси абсцисс — номер пассажа; по оси ординат — концентрация производных шиконина, в % от сухой массы.

Дальнейшее повышение продуктивности тканей было достигнуто благодаря выделению клеточных линий, устойчивых к п — фторфенилаланину, антиметаболиту фенилаланина — одного из ключевых метаболитов пути биосинтеза шиконина. Результаты исследований позволяют предположить, что нам удалось повысить внутриклеточную концентрацию фенилаланина и активизировать его ток по биосннтетическому пути, ведущему к шихонину, поскольку содержание пигментов в отселектированных клетках а. красящей на 14% превышает их содержание в исходной линии (рис. 3), а продуктивность культуры ткани в. краснокорневого возросла более, чем в 2 раза.

Рис. 3. Увеличение содержания шиконина в клеточной линии арнебии красящей, отселектированной с помощью п — фхорфенилаланина:

□ —исходная линия; 0 — отселектированная линия; 4-,Т—начало и окончание действия селектирующего фактора (добавление п — фторфенилаланина в концентрации 725 мкМ/л).

По оси абсцисс — номер пассажа; по оси ординат — концентрация производных шиконина, в % от сухой массы.

Попытки получить высокопродуктивные клеточные клоны (потомство от отдельных клеток) а. красящей и в. краснокорневого оказались неудачными. Это было связано, в первую очередь, с низкой выживаемостью протопластов а. красящей и мелких клеточных агрегатов в. краснокорневого, используемых для отбора, а также со значительной нестабильностью (по содержанию пигментов) вариантов культуры ткани а. красящей, полученных путем "клонирования" с помощью мелких агрегатов клеток.

В то же время очень эффективным для повышения и стабилизации выходд производных шиконина в культуре ткани а. красящей оказалось использование поддерживающего отбора в ранние сроки цикла выращивания. С помощью поддерживающего отбора, проводимого в середине экспоненциальной фазы роста, удалось повысить содержание нафтохиноновых пигментов в биомассе а. красящей с 4,20% до 5,10% от сухой массы клеток.

Субкультивирование же тканей в стационарную фазу в период максимального накопления производных шиконина в ткани приводит к снижению выхода пигментов, что можно объяснить происходящим в данном случае отбором более жизнеспособных клеток с невысоким содержанием нафгохинонов (рис. 4).

Рис. 4. Влияние различных сроков пересадок на эффективность отбора высокопродуктивных клеточных линий арнебии красящей.

—О — в середине экспоненциальной фазы;

— О — в конце экспоненциальной фазы;

— V— в начале стационарной фазы;

—х— в период максимального накопления нафтохинонов.

По оси абсцисс — номер пассажа; по оси ординат — концентрация производных шиконина, в % от сухой массы.

Главным итогом селекционных мероприятий, проведенных нами, можно считать получение стабильного штамма культуры ткани а. красящей АЕ —10. продуктивность которого в 2 раза превышает продуктивность исходной клеточной линии МЕ— 85.

4. Физиологическое, анатомо — морфологическое и фитохн — мическое изучение растительного сырья, полученного на основе

Как показал сравнительный анализ динамики накопления биомассы и нафтохиноновых пигментов в исходной и отселекти —

рованной клеточных линиях, новый штамм характеризуется более эффективным усвоением питательных веществ клетками из среды, и, вследствие этого, процессы роста и биосинтеза производных шиконина в клетках линии АЕ —10 проходят значительно быстрее и активнее. Так, максимальное накопление биомассы в новом штамме наблюдается на 25 сутки выращивания, а в штамме МЕ—85 — на 35 день (рис. 5). Максимальное содержание пигментов в клетках линии АЕ —10 достигается к 40 дню цикла выращивания, а в клетках исходного штамма к 55 дню (рис. 6).

Рис 5. Динамика роста штаммов арнебии красящей: -х- - МЕ—85; -□- - АЕ —10.

По оси абсцисс — сутки культивирования; по оси ординат — масса сухой ткани, г/л.

Кроме того, абсолютное значение прироста биомассы новой клеточной линии в среднем на 15—20% превышает прирост тканей в исходной линии, а концентрация производных шикошша в клетках штамма АЕ —10 в 2 раза выше, чем в клетках штамма МЕ — 85. В результате общая продуктивность тканей новой линии более, чем в 2 раза превышает продуктивность исходной клеточной линии (рис. 7).

Фотохимическое исследование показало, что в клетках биомассы а. красящей синтезируются нафтохиноны, а также бензо — хиноны, фенолкарбоновые кислоты, тритерпеновые сапонины, кумарины и алкалоиды. И если о выделении бензохинонов и

Рис 6. Динамика накопления производных шиконина штаммами арнебии красящей: — х— — МЕ— 85; —О— — АЕ —10.

По оси абсцисс — сутки культивирования; по оси ординат — содержание производных шиконина, мг/л.

10

8 6 4

9 - ■

О прирост биомассы

О накопление пигментов

МЕ - 85

Т 5

■ ■ 4,5 й*

л я §

■•3,5 | "2.5 £

--1,5 | •■1 Л

-0,5 б

АЕ —10

Рис. 7. Сравнительная характеристика штаммов культуры ткани арнебии красящей.

алкалоидов из травы и корней а. красящей ранее сообщалось, то фенолкарбоновые кислоты, тригерпеновые сапонины и ку марины впервые обнаружены в клетках данной культуры.

В результате анализа нафтохиноновой фракции установлено, что в биомассе присутствуют 6 пигментов. Хроматографически они были идентифицированы как дезоксшникошге, {3,р-диметилакрил~ шиконин, изобутирилшикоюга, ацетилшиконин, р-гидрокси— изовалерилшиконнн и шиконин. Преобладающим компонентом нафтохиноновой фракции в биомассе культуры ткани а. красящей является ацетилшиконин, в полученном нами штамме его содержание достигает почти 80% от суммы пигментов.

Значительная разница была отмечена нами в относительном содержании отдельных пигментов в сумме нафтохинонов из биомассы различных штаммов (табл. 2). В тканях штамма АЕ —10, в отличие от штамма МБ—85, и аналогично корням нативных растений, лишь в следовых количествах присутствует свободный шиконин, содержание дезоксишиконина, а также эхинофуранов — побочных продуктов биосинтеза шикошша — невысокое, что свидетельствует о высокой активности ферментов на всех стадиях синтеза нафтохинонов в клетках отселектированного штамма.

Таблица 2

Сравнительная характеристика продуцентов шиконина по содержанию нафтохинонов

Вещество Относительное содержание, %

Штамм МЕ — 85 Штамм АЕ —10 Корни растения*

Дезоксишиконин 17Д 1,7 1,4

Изобутирил — 12,2 12,5 57,7"

шиконин

р.р-Диметил — 6,1 4,7

акрилшиконин

Ацетнлш иконин 50,9 78,3 33,Л

Шиконин 5,0 0,1 1,4

р-Гидроксиизо — 8,7 2,7 6,2

валерилш иконин

Примечание; литературные данные; **— сумма изобу — тирилшиконина и (3,р-диметилакрилшиконина.

Субкультивирование тканей в течение длительного времени показало, что новая клеточная линия характеризуется стабильностью в отношении накопления биомассы, производных шико —

нина, а также в относительном содержании отдельных пигментов в сумме нафтохинонов.

Все вышесказанное позволяет нам утверждать, что полученный нами вариант является новым штаммом, который мы рекомендуем в качестве нового вида лекарственного сырья, обеспечивающего существенное снижение себестоимости продукта.

Для количественного анализа сырья и препаратов была разработана методика, основанная на измерении оптической плотности красной окраски растворов нафггохиноновых пигментов в органических растворителях. На основании сравнительного исследования в качестве экстрагента для количественного анализа производных шиконина был предложен хлороформ, позволяющий наиболее эффективно извлекать пигменты из сырья. Изучено влияние кратности и продолжительности экстракции хлороформом на степень извлечения нафтохинонов. Предложенная методика характеризуется высокой точностью и позволяет значительно снизить временные затраты на проведение анализа.

Проведено морфологическое и анатомическое исследование биомассы а. красящей. С помощью метода электронной микроскопии установлено, что в клетках а. красящей биосинтез наф — тохиноновых пигментов происходит в мембранной системе эндо — плазматического ретикулума. В дальнейшем производные шиконина транспортируются по направлению к плазмалемме и в виде особых телец зкскретируются из клеток на наружную поверхность клеточной оболочки.

Установлены товароведческие характеристики сырья. На основании полученных результатов разработан проект ГОСТ на биомассу культуры ткани а. красящей — продуцента шиконина — растительного пигмента, обладающего антимикробной, противовоспалительной активностью, и чрезвычайно перспективного для применения в фармации и косметологии.

Была отработана методика выделения препарата "шиконин" из нового вида сырья путем гидролиза сложных эфиров шиконина в щелочной среде и последующего осаждения пигментов минеральной кислотой. Химичесхое исследование готового препарата показало, что он представляет собой сумму двух нафтохиноновых пигментов: шиконина и дезоксишиконина. Установлено, что относительное содержание дезоксишиконина в продукте соответствует его содержанию в сумме нафтохинонов, выделенной из данной партии сырья. Tax, относительное содержание дезокси —

шиконина в партиях продукта, полученных из биомассы исходного штамма культуры ткани а. красящей, составляло 14 — 19%, в то время, как в партиях, выделенных из биомассы штамма АЕ —10, это значение равнялось 1,5—3,5%.

Таким образом, препарат, получаемый по предложенной методике из клеток отселектированпого нами штамма, является более однородным и на 96—99% состоит из шиконина. Это, несомненно, еще одна положительная сторона этой клеточной линии как лекарственного растительного сырья.

5. Исследование антимикробной активности шиконина и его мягких форм для применения в фармапни и косметологии.

С целью исследования возможности использования шико — шжа в катких лекарственных и косметологкческнх препаратах нами была изучена антимикробная активность шйкопыпа в субстанции и в препаратах, совместимость шиконина с рядок компонентов основ мазей и кремов.

Установлено, что спектр микроорганизмов, чувствительных к пшконину, выделенному из биомассы культуры ткаки арнебии красящей, аналогичен таковому для шиконина, получаемого из нативных растений. Наиболее чувствительными являются грам— положительные бактерии и дрожжеподобныа грибы. Впервые отмечена активность шиконина по отношению к Bacillus cereus и Candida albicans, и установлено отсутствие таковой в отношении Penicillium cyclopium, Aspergillus niger, Mucor mucedo.

Не определено существенного изменения характера течения и реологических свойств исходных наиболее часто используемых в фармации и косметологии основ: гидрофобных (вазелин), эмульсионных с ионогенными эмульгаторам;: (спермацетовый крем, эмульсионный воск; жидкая эмульсионная основа с 5% касторового масла, четвертичное аммониевое основание) к неиокогенными эмульгаторами (консистентная эмульсионная основа, эмульгатор Т—2), что свидетельствует об отсутствии влияния шиконина на структурно —механические свойства основ (см. приложение).

На основании исследований антимикробной активности мягких форм с шиконином различного состава определено, что достаточное высвобождение вещества обеспечивают лишь эмульсионные основы с жироподобнымк веществами. Противо —

микробное действие у препаратов на липофильных и эмульсионных основах с углеводородами отсутствует (табл. 3).

Таблица 3

Ингибирующая концентрация пгакошша и его препаратов, в мкг/мл (Р=0,95; п=6).

Тест — микроорганизмы

Staphylo — Bacillus Candida Saccharo —

Препарат coccus cereus albicans myces

aureus cerevisiae

Шиконин 25 50 200 25

0,05% мазь на вазе — — — — —

лине

0,05% мазь на КЗО — — — —

0,05% мазь на СК 25 50 200 100

0,05% крем— гид— 25 25 100 100

ратант с касторовым

маслом

Из полученных данных по влиянию типа используемого эмульгатора на антимикробную активность препаратов с шико — нином следует, что максимальной противомикробной активностью обладает шиконин в сочетании с ионогенными эмульгаторами (табл. 4).

Таблица 4

Активность 0,05% препаратов шиконипа на абрикосовом масле с различными эмульгаторами по отношению к Staphylococcus aureus (Р = 0,95; п = 6).

Эмульгатор Ингибирующая концентрация шиконина, мкг/мл

Без эмульгатора не активен

Твин-80 200

Эмульсионный воск 100

Лаурилсульфат натрия 25

Эмульгатор из группы 25

четвертичных аммониевых

основании

На основании полученных результатов можно рекомендовать использование шиконкна как антимикробного агента в составе лекарственных и косметологических мазей и кремов в концентрации 0,01% при использовании ионогенных ПАВ (лаурилсульфат натрия, эмульгатор пз группы четвертичных аммониевых оснований) и в концентрации 0,05% в случае применения неионогенных

ПАВ (твин—80, эмульсионный воск). Таким образом, шиконик является весьма перспективным для использования в лекарственных к косметологических препаратах, а также в качестве красителя в парфюмерной и пищевой промышленности, как вещество, обладающее в концентрациях, необходимых для придания приятной окраски, ценными фармакологическими свойствами — антимикробной, противовоспалительной, ранозаживляющей активностью.

ВЫВОДЫ.

1. С целью расширения сырьевой базы для получения красящих антимикробных препаратов предложена культура ткани арнебии красящей, как продуцент шиконина.

2. Изучена динамика роста и накопления производных шиконина культурой клеток а. красящей при выращивании глубинным и поверхностным методами. Установлено, что характер роста и накопления пигментов суспензионной и каллусной культурами одинаков. Производные шиконина накапливаются культурами по мере роста тканей, а их максимальное содержание отмечается в стационарной фазе роста клеток.

3. Установлены общие закономерности влияния отдельных факторов на продуктивность тканей, по — видимому, отражающие близость путей биосинтеза шиконина в культурах, что свидетельствует о возможности управления процессами синтеза наф — гохиноновых пигментов in vitro путем изменения состава питательных сред и условий культивирования. Использована оригинальная стратегия разработки питательных сред, позволившая увеличить продуктивность культур тканей а. красящей и в. краснокорневого в 2 раза.

4. Найдены дешевые заменители сахарозы и агара — зеленая патока (отход производства глюкозы) и синтетические полимеры — производные акриловой кислоты, дающие принципиальную возможность снижения себестоимости продукции культур тканей.

5. На основе селекционных исследований в культурах тканей а. красящей и в. краснокорневого предприняты методические подходы, обеспечивающие успех в получении высокопродуктивных штаммов. Показана эффективность селекции при отборе тканей на ранних сроках ростового цикла и получен новый штамм культуры ткани а. красящей АЕ —10, характеризующийся высокой продук —

тивностью и стабильностью в отношении накопления биомассы и производных шиконина. Установлены его химические и морфоло — го — физиологические особенности.

6. В клетках культуры ткани а. красящей обнаружены наф— тохиноны, бензохиноны, фенолкарбоновые кислоты, тритерпе — новые сапонины, кумарины и алкалоиды. В нафтохиноновой фракции идентифицированы 6 пигментов — дезоксишиконин, ß,ß— диметилакрилшиконин, изобутнрилшиконин, ацетилшиконин, ß-гидроксиизовалерилшиконин и шиконин. Преобладающим компонентом нафтохиноновой фракции в биомассе штамма АЕ —10 культуры ткани а. красящей является ацетилшиконин, его содержание достигает почти 80% от суммы пигментов.

7. На основании электронномикроскопического исследования установлено, что биосинтез нафтохиноновых пигментов в клетках культуры ткани а. красящей происходит в мембранной системе эндоплазматического ретикулума, а в дальнейшем производные шиконина транспортируются по направлению к плазмалемме и в виде особых телец экскретируются из клеток на наружную поверхность клеточной оболочки.

8. Установлено, что спектр микроорганизмов, чувствительных к игакошшу, выделенному из биомассы культуры ткани арнебии красящей, аналогичен таковому для шиконина, получаемого из нативных растений. Впервые отмечена активность шиконина по отношению к Bacillus cereus и Candida albicans, и установлено отсутствие таковой в отношении Pénicillium cyclopium, Aspergillus niger, Mucor mucedo.

9. Не определено существенного изменения характера течения и реологических свойств наиболее часто используемых в фармации и косметологии основ кремов и мазей. На основании исследований антимикробной активности мягких форм с шико — ннном различного состава определено, что достаточное высвобождение вещества обеспечивают лишь эмульсионные основы с жироподобными веществами. Максимальной противомикробной активностью обладает шиконин в сочетании с ионогенными эмульгаторами.

10. Разработан ГОСТ на новое лекарственное сырье — биомассу арнебии красящей и получен препарат шиконина, рекомендуемый в качестве красящего и антимикробного средства в фармацевтической, косметической и пищевой промышленности.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях;

1. Соха В.И. Вторичный метаболизм культуры ткани Amebia euchroma. // Решение актуальных задач фармации на современном этане. Тезисы докладов научной конференции, посвященной 50 — летию НИИ фармации. Москва, 1994. С. 266.

2. Соха В.И., Панарина Е.А. Динамика продуктивности культуры клеток и тканей арнебии красящей. // Химия и технология лекарственных веществ. Материалы Всероссийской научной конференции. Санкт-Петербург, 1994. С. 29-30.

3. Соха В.И. Продуктивность тканей Arnebia euchroma (Royle) Johnst. в суспензионной и каллусной культурах. // Труды Пятой молодежной конференции ботаников Санкт-Петербурга / Вотан, ин—т РАН, 24—26 мая 1994 г. — Санкт-Петербург, 1995. С. 143-146.

4. Николаева ЛА, Соха В.И. Культура тканей растений и ее использование в качестве лекарственного сырья // Современные аспекты изучения лекарственных растений. Научные труды НИИ фармации, том XXXIV. - Москва, 1995. С. 30-35.

5. Coxa B.I., Николаева A.A. Культура тканин арнебп фарбую — 4oi як джерело лжарсько! сиро вини // Фармацевтичний журнал. — Кшв (в печати).

6. Sokha V.l., Nikolaeva L.A. The shikoam producents m plant tissue and cell culture // Abstracts VIHth International Congress of Plant Tissue and Cell Culture. - Firenze, June 12-17, 1994. P. 240.

Приложение

Структурно —механические свойства 0,05% препаратов с шиконином на различных основах и основ при 20 «С и 37 °с (Р=0,95; п =6).

Иссле — дуемый образец Преде — льное напря -жение сдвига, Па Скорость сдвига, с ~1

= 5,40 IV =9,00 Ог = 16,20

напряже — ние сдвига, эффектов ~ ная вяз — кость, Па с напряжение сдвига, Па эффектов — ная вязкость, Па-с напряже — ние сдвига. Па эффективная вязкость, Па-с

Мазь на вазе — лине Вазелин Мазь на КЭО КЭО Препарат на СК Крем — гидратант Основа 14,92 16,41 59,68 62,66 19,40 52,22 25,36 25,36 56,70 89,52 152,18 152,18 314,81 402,84 43,27 43,27 при 20 ос 10,50 16,58 28,18 28,18 58,30 74,60 8,01 8,01 61,17 96.23 162,63 162,63 323,02 421,49 49.24 49,24 6,80 10,69 18,07 18,07 35,89 46,83 5,47 5,47 68,63 105,93 198,44 198,44 332,72 440,89 58,93 58,93 4,24 6,54 12,25 12,25 20,54 27,22 3,64 3,64

при 37 ОС

Мазь на вазе — 2,82 11,35 2Д0 11,51 1,28 13,52 0,83

лине

Вазелин 1,53 8,13 1,51 8,29 0,92 9,26 0,57

Мазь на КЭО 32,08 35,81 6,63 38,05 4,23 41,78 2,58

КЭО 33,57 33,57 6,22 35,06 3,90 41,78 2,58

Препарат на СК 33,57 105,93 19,62 115,63 12,85 120,85 7,46

ск 100,71 152,93 28,32 160,39 17,82 170,09 10,50

Крем — гидратант 26,86 . 43,27 8,01 49,98 5,55 58,93 3,64

Основа 26,86 43,27 8,01 49,98 5,55 58,93 3,64

Примечание: КЭО - консистентно - эмульсионная основа; СК- спермацетовый крем.