Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Совершенствование комплексной технологии лекарственных средств из фукуса пузырчатого (Fucus vesiculosus L.)

На правах рукописи

Q&^ "

ОБЛУЧИНСКАЯ Екатерина Дмитриевна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ КОМПЛЕКСНОЙ ТЕХНОЛОГИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ИЗ ФУКУСА ПУЗЫРЧАТОГО (Fucus vesiculosus L.)

15.00.01. Технология лекарств и организация фармацевтического дела

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2004

Диссертационная работа выполнена на кафедре микробиологии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (СГГХФА) Министерства Здравоохранения Российской Федерации и лаборатории альгологии Мурманского морского биологического института (ММБИ) Кольского научного центра (КНЦ) Российской академии наук (РАН).

Научные руководители: доктор технических наук,

профессор Галынкин Валерий Абрамович

кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Воскобойников Григорий Михайлович

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

доктор фармацевтических наук, профессор

Вайнштейн Виктор Абрамович Мирошниченко Юрий Владимирович

Ведущая организация: Научно-исследовательский технологический институт антибиотиков и ферментов (г. Санкт-Петербург)

Защита состоится «28» семти2%>л_2004 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 208.088.01 при Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 14.

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор фармацевтических наук

M B. Рыжкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Значительное место в современной медицине занимают лекарственные препараты из растительпого сырья. Несмотря на широкий ассортимент существующих фитопрепаратов, поиск и создание новых эффективных и удобных для применения лекарств на основе биологически активных веществ (БАВ) растительного происхождения не теряют своей актуальности.

Источниками ценных БАВ служат бурые водоросли: ламинариевые и фукусовые. Фукусовые водоросли, в отличие от ламинариевых, традиционно мало используются как для получения пищевых продуктов, так и для выделения БАВ, хотя являются продуцентами веществ с широким спектром фармакологических свойств.

Fucus vesiculosus L. (фукус пузырчатый, далее фукус) является массовым видом литорали Баренцева и Белого морей и содержит такие БАВ, как альгиновая кислота и ее соли, маннит, полиненасыщенные жирные кислоты, стерины, пигменты и другие. Кроме того, в состав фукуса пузырчатого входит полисахарид фукоидан, обладающий иммуномодулирующими свойствами, гепариноподобным действием, противовирусной и противомикробной активностью. Доказаны также гастропротекторный эффект, общеукрепляющее воздействие фукоидана, противоопухолевая активность этого полисахарида. Однако ни в нашей стране, ни за рубежом не создано препаратов на основе фукоидана, притом, что фармакологические исследования проводятся более 30 лет. Отсутствие научно обоснованной технологии фукоидансодержащих препаратов сдерживает внедрение этого ценного полисахарида в медицинскую практику.

В связи с вышеизложенным представляется актуальным совершенствование комплексной технологии, позволяющей получать наряду с традициошгыми веществами из бурых водорослей (маннита и альгината натрия) новые высокоэффективные лекарственные средства, с созданием на их основе перспективных лекарственных форм, удобных в применении и стабильных при хранении.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы — совершенствование комплексной технологии переработки фукусовых водорослей с получением маннита, альгината натрия и новых лекарственных средств: густого экстракта и сухого экстракта.

В соответствии с заявленной целью нами были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать качественные и количественные характеристики сухого сырья и шрота фукуса пузырчатого, используемых для получения БАВ.

2. Изучить влияние технологических факторов на кинетику процессов экстрагирования сырья (слоевищ фукуса и шрота), выходы и концентрацию БАВ.

3. Разработать оптимальную технологию сухого экстракта фукуса пузырчатого (СЭФП), содержащего полисахарид фукоидан. Изучить технологические свойства и стабильность

4. Разработать методики качественного и количественного анализа новых лекарственных средств - густого экстракта фукуса пузырчатого (ГЭФП) и СЭФП.

5. Определить физико-химические показатели выделяемых в процессе комплексной технологии маннита и альгината натрия в соответствии с нормативной документацией.

6. Провести комплекс исследований по разработке рационального состава и технологии гранул СЭФП в твердых желатиновых капсулах. Установить срок годности препарата на основе СЭФП.

7. Разработать нормативную документации на слоевища фукуса пузырчатого, густой и сухой экстракты фукуса, капсулы с гранулами СЭФП.

Научная новизна. Изучение фитохимического состава слоевищ фукуса пузырчатого позволило установить перспективность использования данного вида сырья для производства лекарственных средств. 'Впервые показана возможность получения маннита, густого и сухого экстрактов, альгината натрия методом последовательных экстракций из фукуса. Выявлено, что изменение последовательности использования экстрагентов приводит к более полному извлечению БАВ сырья, к повышению степени чистоты конечных продуктов. Разработан оригинальный способ получения СЭФП в процессе комплексной переработки фукуса. Получены данные о гигроскопичности СЭФП при влажности воздуха более 75%. Обоснован состав вспомогательных веществ при гранулировании СЭФП.

Практическая значимость Разработан и утвержден лабораторный регламент ЛР 02699872-01-2003 на производство густого экстракта фукуса, маннита, сухого экстракта фукуса, альгината натрия. Новая комплексная технология прошла апробацию на базе научно-производственной лаборатории Института Химии Коми научного центра РАН (г. Сыктывкар) и на предприятии

000 «Сирена» (г. Санкт-Петербург), что подтверждено соответствующими актами.

Разработаны состав и способ получения гранул СЭФП в твердых желатиновых капсулах. Составлена технологическая схема и описание технологии гранул СЭФП, определены технологические параметры, необходимые для лабораторного регламента на производство готового лекарственного средства — СЭФП в виде гранул в твердых желатиновых капсулах.

Составлены проекты фармакопейных статей предприятия на слоевища фукуса пузырчатого, ГЭФП, СЭФП и гранулы СЭФП в твердых желатиновых капсулах.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на ежегодных конференциях молодых ученых Мурманского морского биологического института 1999-2004; I и II Всероссийских конференциях «Химия и технология растительных веществ», 2000 и 2002 гг.;

1 Всероссийской конференции «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки», Москва - Галицыно, 2002; Всероссийской конференции молодых ученых, посвящ. 140-летию со дня рожд. Н.М. Книповича, Мурманск, 2002. Материалы работ представлены на V и VI Международных съездах «Актуальные проблемы создания новых

лекарственных препаратов природного происхождения», 2001 и 2002 гг.; 7th International Phycological Congress, Thessaloniki, Greece, 2001; International Symposium «Chemistry and Biology ofMarine Organism», Greece, 2003 и других.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Санкт-Петербургской Государственной химико-фармацевтической академии и Мурманского морского биологического института КНЦ РАН.

Объем в структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав, содержащих результаты экспериментальных исследования и их

обсуждении, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на_

страницах машинописного текста, содержит 65 таблиц, 18 рисунков. Список литературы включает 288 источника.

В обзоре литературы сриведены краткие сведепия о химическом составе бурых водорослей, рассмотрены основные БАВ макрофитов, их терапевтическое действие, препараты и биологически активные добавки на их основе. Обобщены современные аспекты гранулирования и создания лекарственных препаратов в виде капсул. Вторая глава содержит характеристику объектов исследования, выбор методов и разработку методик анализа слоевищ фукуса и препаратов на его основе, описание методов и приборов, используемых в работе. В третье главе изложены результаты экспериментальных исследований по совершенствованию' технологии комплексной переработки фукуса. Четвертая глава посвящена изучению фармакологической активности СЭФП. В пятой главе представлены результаты исследований по разработке оптимальной технологии лекарственного препарата па основе СЭФП в виде гранул в твердых желатиновых капсулах. Приложение включает проекты ФСП на слоевища фукуса пузырчатого, густой и сухой экстракты фукуса, капсулы сухого экстракта, акты и другие материалы.

Считаю своим долгом поблагодарить руководство и администрации Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии и Мурманского морского биологического института за предоставленную возможность выполнить диссертационную работу, и лично директора академика РАН Г.Г. Матишова за поддержку и вникание к исследованиям молодых ученых, и аспирантов.

На защиту выносятся:

Результаты экспериментальных исследований по совершенствованию комплексной технологии лекарственных средств из фукуса - манкита, густого и сухого экстрактов, альгиката натрия; материалы по разработке методик анализа фукуса, густого и сухого экстрактов фукуса; экспериментальные данные по созданию препарата с сухим экстрактом фукуса в виде гранул в твердых желатиновых капсулах; экспериментальные данные по изучению стабильности СЭФП и гранул СЭФП в твердых желатиновых капсулах.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литератури (глава 1) представлены основные сведения по ботаннко-морфологическш характеристике и фитохимическому составу бурых

водорослей, терапевтической активности БАВ, входящих в их состав. Рассмотрены особенности технологии БАВ, получаемых из бурых водорослей. Дан анализ современных аспектов технологии гранулирования лекарственных веществ и их фасовки в капсулы, проанализированы основные технологические и физико-химические факторы, влияющие на их качество.

Материалы и методы исследования (глава 2). В качестве объекта исследования использовали сухие водоросли фукус пузырчатый (Fucus vesiculosus L.) семейства фукусовых (Fucales), заготовленные в августе и сентябре в период с 1999 по 2003 гг. в губе Дальнезеленецкой Баренцева моря в районе биостанции Мурманского морского биологического института. Для определения числовых показателей сырья выбраны методы и разработаны методики качественного и количественного анализа. Разработан проект ФСП на слоевища фукуса пузырчатого.

Таблица 1

Числовые показатели слоевищ фукуса_

Наименование определяемого показателя Количественное содержание, % от аб.сух.масс.

Дата заготовки сырья

авг. 1999 авг. 2000 сент. 2001 сент. 2002 авг. 2003

Лльпиноная кислота 20,56±2,23 23,97+1,84 22,57±1,73 21,1411,62 23,2911,97

Фукоидан 13,87±2,02 14,70±1,7 14,41±1,89 14,3211,12 14,9111,06

Ламинаран 0,64Ю,02 0,6210,03 0,61 ±0,05 0,69Ю,04 0,6010,02

Маннят 12,08±1,67 10,8811,93 11,56+1,13 11,1411,89 1 ОД 112,06

Сумма липидов и пигментов 3,57±0,39 3,63±0,48 2,9910,61 3,09Ю,52 3,4710,70

Сумма экстрактивных веществ, извлекаемых водой 23,11±0,73 21,3210,98 22,0911,89 20,7611,03 20,9711,17

Иод 0,13±0,02 0,12±0,01 0,1410,01 0,1510,01 0,1010,02

Азот 1,36+0,03 1,02±0,07 1,8310,06 1,6510,09 0,9610,11

Влажность 12,01±0,36 12,4110,24 11,1710,29 123310,18 11,8510,44

Общая зола 25,01±1,13 22,18±1,36 20,6211,07 21,7711,42 23,4611,78

В качестве критериев стандартизации выбраны следующие качественные показатели: присутствие полисахаридов подтверждали образованием осадка при добавлении этанола 95%, машина — выпадением осадка при взаимодействии с аммиачным раствором сульфата меди, наличие суммы липидов — методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), хлорофилла -спектрофотометрическим методом. Количественный анализ полисахаридов проводили по модифицированным методикам спектрофотометрически. Для определения альгиновой кислоты использовали цветную реакцию уроновых кислот с 3,5-диметилфенолом. Содержание фукоидана определяли по реакции L-фукозы с L-цистеином, ламинарана — глюкозооксидазным методом. Количество маннита, хлорофилла и йода оценивали спектрофотометрнчески, сумму липидов и пигментов - гравиметрически. Результаты оценки числовых показателей сухих водорослей F. vesiculosus представлены в таблице 1.

Определены технологические свойства сырья (измельчепность, фракционный состав, насыпная масса, сыпучесть, угол откоса). Исследована набухаемость фукуса в различных растворителях.

На основании анализа данных литературы и выполненных собственных исследований разработаны методики качественного и количественного анализа густого и сухого экстрактов из фукуса. Составлены проекты ФСП на густой и сухой экстракты фукуса.

Поиск оптимальных условий процессов экстрагирования фукуса и гранулирования сухого экстракта проводили с помощью метода математического планирования эксперимента Бокса-Уилсона. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программы «Statistica 5.0» (StatSoft Inc., USA, 1998).

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКИ ФУКУСА ПУЗЫРЧАТОГО (Глава 3).

На основании данных литературы (Некрасова и др., 1998; Ожигова и др., 2001), а также собственных предварительных экспериментов установлено, что для выделения ГЭФП из фукуса лучшими экстрагентами являются азеотропная смесь метиленхлорида со спиртом этиловым, хлороформ, метанол, гексан. Экстрагирование сырья осуществляли методами циркуляционной экстракции в аппарате Сокслета и мацерации с нагреванием. По окончании процесса экстракции, вытяжку фильтровали, концентрировали на роторном испарителе до получения густого экстракта. Густой экстракт сушили в вакуум-сушильном шкафу.

Результаты экспериментов (рис. 1) показывают, что использование метода циркуляционной экстракции привело к увеличению технологических выходов ГЭФП на 12-16%. Установлено, что наиболее эффективным экстрагентом для получения ГЭФП является азеотропная смесь метиленхлорида с этанолом, при этом технологический выход составил 88,09±0,89%.

Рис. 1. Зависимость техналогического выхода ГЭФП от метода экстрагирования и применяемого экстрагепта. Качественная и количественная характеристика полученного ГЭФП по разработанной технологии представлена в таблице 3.

Таблица 3

Характеристика густых экстрактов, полученных из различных образцов фукуса

№ п/п Год сбора сырья Выход ГЭФП от количества сырья, % Выход от суммы липидови пигментов, % Содержание хлорофилла, % Количество пятен и их расположение, определяемое методом тех

1 1999 2,97±0,45 83,12±1,76 8,19±0,20 5 (на старте и с Ш=0,13; 0,25; 0,47; 0,86)

2 2000 ЗД(>±039 88,09±0,89 8,63±0,35 6 (на старте и с ЯМ),24; 0,46; 0,83; 0,98)

3 2001 2,50±0,33 83,47±1,06 7Д7±0,1б 5 (на старте и с Ш^О.М; 0,24; 0,48; 0,84)

4 2002 2,56±0,50 82,69±1,62 6,54±0Д7 5 (на старте и с 1УЧ),15; 0,26; 0,46; 0,82)

5 2003 2,89±0,40 83Л±1,47 6,79±0,10 5 (на старте и с №0,14; 0,22; 0,48; 0,85)

На основании полученных результатов, а также имеющихся сведений о биологической активности липидно-пигмеитного комплекса фукусовых водорослей разработан проект ФСП на густой экстракт фукуса пузырчатого, обладающего свойствами биогенного стимулятора.

Следующий этап совершенствуемой технологии комплексного использования фукусовых водорослей - выделение маннита. Установлено, что в шроте фукуса, оставшегося после получения ГЭФП, содержится значительное количество маннита, альгиновой кислоты и фукоидана (табл. 4).

Таблица 4

Характеристика шрота фукуса_

Наименование определяемого показателя Количественная характеристика показателя

Дата сбора сырья

авг. 1999 авг. 2000 сент. 2001 сент. 2002 авг. 2003

Содержание маннита, % 11,93±0,83 11,06±1,64 11,33±1,07 10,87±1,66 9,96±1,71

Содержание альгиновой к-ты,% 20,74*2,09 23,07±2,21 22,15±1,75 21,01±1,85 22,94*1,11

Содержание фукоидапа, % 14,06±1,63 14,91±1,42 14,67*1,80 14,37±1,73 15,09±2,13

Влажность, % 0,53±0,05 0,27±0,04 0,68±0,05 0,81 ±0,06 0,34*0,03

Общая зола, % 24,67±1,20 23,03±1,12 19,94±1,34 21,46±1,18 22,98±1,50

С целью совершенствования существующей технологии маннита, действующей на Архангельском опытно-промышлешюм водорослевом комбинате (АОПВК) проведено сравнительное исследование двух методов экстрагирования - мацерации при нагревании (традиционный) и циркуляционной экстракции в аппарате Сокслета. В качестве экстрагента использовали спирт этиловый 95%. Выход неочищенного маннита, полученного методом мацерации, составил 62,97+1,38%, методом циркуляционной экстракции - 92,38+1,50%.

Совершенствование технологии маннита из шрота фукуса привело к повышению выхода данного вещества на 30% за счет применения более эффективного способа экстрагирования (табл. 5).

Таблица 5

Характеристика технического машшта, получемного двумя разными способами

№ Год сбора Способ экстракции Масса Выход от Содержание

п/п сырья сырья, г количества маннита в сырье, % маннитав образце, %

1 1999 Мацерация 250 62,9741,38 86,55±0,97

2 2000 200 60,3542,00 823041,11

3 2001 300 58,1042,74 В4,0741,35

4 2002 200 63,0841,55 85,461:1,44

5 2003 400 59,9041,05 83,5440,81

6 1999 Циркуляционная 500 95,1842,10 85,1941,50

7 2000 экстракция 600 93,6341,56 88,0340,62

8 2001 300 92,9741,82 86,9140,70

9 2002 350 92,26*0,95 86,2240,65

10 2003 400 94,11±1,43 87,6441,09

Для очистки технического маннита попользовали метод колоночной хроматографии (сорбент оксид алюминия). Степень чистоты маннита составила 99,12±1,56%, общий технологический выход - 72,13±2,06%.

Третьим этапом комплексной технолопга является получение сухого экстракта, содержащего фукоидан. Из литературы известно, что для выделения фукоидана применяют воду очищенную, растворы НС1, растворы Са02, и спиртоводные смеси с содержанием этанола 10-40%. Для получения фукоидансодержащего экстракта, исследовали следующие методы экстрагирования сырья - мацерацию с перемешиванием при комнатной температуре и при нагревании, и перколяцию. В качестве сырья использовали шрот фукуса, оставшегося после получения ГЭФП и маннита, характеристика которого представлена в таблице 6.

Таблица 6

Характеристика шрота фукуса после извлечения ГЭФП и маннита

Наименование определяемого показателя Количественная характеристика показателя

Дата сбора

авт. 1999 авг. 2000 сеят. 2001 сент. 2002 авг. 2003

Содержание альгииовой к-ты, % 20,3442,18 23,6541,85 222441,63 21,3741,55 22,7840,95

Содержание фукоидана, % 13,7141,79 14,3341,13 14,0741,88 14,1541,64 14,8242,01

Влажность, % 0,3940,06 0,4140,04 03340,05 0,5540,04 0,4840,05

Общая зола, % 24,1541,10 22,7341,24 19)6541,18 21,5141,20 22,6741,06

На рис. 2 и 3 представлены данные о содержании фукоидана, альпшата натрия и экстрактивных веществ в извлечениях, полученных методами двухступенчатой мацерации с перемешиванием (п=80 об/мин) и перколяции при комнатной температуре. Наибольшая концентрация фукоидана достигнута в извлечениях, экстрагируемых 0,1 н раствором соляной кислоты и 10% этанолом. Технологические выходы фукоидама в пересчете на содержание этого полисахарида в сырье составили: при мацерации ОДн НС1 - 25,34± 1,12% и 10% этанолом - 21,26±0,89%; при перколщии - 40,22±0,79 (0,1н НС1) и 42,40±0,69 (10% этанол). Результаты проведенных экспериментов показывают,

что метод перколяции позволяет получать вытяжки с большей концентрацией фукоидана.

Рис. 2. Содержание БАВ в вытяжках, Рис. 3. Содержание БАВ в вытяжках,

полученных методом двухступенчатой полученных методом перколяции.

мацерации.

Низкие значения технологических выходов фукоидана (до 42,40%), указывают на невысокую эффективность экстрагирования сырья при комнатной температуре применяемыми методами.

Изучено влияние температуры на переход фукоидана в вытяжку. Для этого шрот водорослей экстрагировали в течение 6 ч методом одноступенчатой мацерации при различных температурных режимах.

Рис. 4. Влияние температуры на концентрацию фукоидана в вытяжке, при использовании

различных экстрагентов. В ходе экспериментов (рис. 4) установлено, что повышение температуры оказывает существенное влияние на увеличение содержания фукоидана в

вытяжках. Максимальный выход фукоидана достигнут при экстрагировании 0,1 н раствором НС1 и составил 49-51% при температуре выше 60°С.

Для определения наиболее эффективной концентрации спиртоводной смеси при получении фукоидансодержащего экстракта, изучена зависимость содержания фукоидана, альгиновой КЕСЛОТЫ И экстрактивных веществ в вытяжке от концентрации этанола. Установлено, что экстрагирование шрота фукуса 5% и 10% растворами спирта этилового приводит к получению вытяжек с содержанием фукоидана 6,03% и 5,94% соответственно (в пересчете на технологический выход - 41% и 40%), однако содержание экстрактивных веществ в первом случае выше, что нежелательно из-за перехода большого количества балластных веществ в экстракт.

С целью повышения выхода фукоидана использовали экстракцию с принудительной циркуляцией экстрагента, что позволило увеличить концентрацию фукоидана в извлекателе в среднем на 1,4% (технологический выход увеличился на 9,5% и составил 51%). Время наступления динамического равновесия находилось в интервале 10-12 часов по сравнению с 12-14 часами в обычных условиях, что свидетельствует о целесообразности использования предложенного приема.

Исследовано влияние температуры на содержание фукоидана в вытяжке при экстрагировании 10% этанолом. Показано, что при повышении температуры значительно возрастает количество фукоидана, перешедшего в извлекатель. Оптимум температуры находился в диапазоне 60-80 С, технологический выход увеличился до 70-75%.

Для оптимизации процесса экстрагирования фукоидана из шрота фукуса применили метод математического планирования эксперимента по Боксу-Уилсону с последующим крутым восхождением критерия оптимизации У (выход фукоидана).

Факторы, влияющие па процесс экстрагирования, их уровни и интервалы варьирования определены на основе анализа литературы и экспериментальных данных и представленные в таблице 7.

Таблица 7

Интервалы и уровни варьирования факторов _

Х| Фактор Уровень Интервал варьирования

нижнкЗ ОСЕОВНОЙ верхний

X, Продолжительность, настаивания, ч 6 9 12 3

х2 Температура, "С 20 40 60 20

Х3 рН 1.3 4.0 6,5 2,5

Х4 Измельченпость сырья Бср., мм 1.0 2,0 3,0 1,0

х5 Модуль экстракции (сырье: экстрагент) 1:8 1:10 1:12 1:2

По данным, полученным в ходе экспериментов, рассчитано уравнение регрессии:

У=57,83+9,97X1+10,88X2-6,46X3+3,30X4 [1]

Анализ уравнения показывает, что на процесс экстрагирования фукоидана оказывают влияние продолжительность настаивания, температура, рН, измельченность сырья. Соотношение сырье : экстрагент в выбранном диапазоне варьирования не влияет на выход фукоидана (фактор незначим).

Значительное влияние на выход фукоидана оказывает продолжительность настаивания (степень влияния фактора 42,51%). На втором месте по степени важности для достижения полноты экстрагирования находится повышение температуры (степень влияния фактора 35,71%). Следующий по степени влияния фактор - рН (степень влияния фактора 15,00%): снижение этого показателя приводит к существенному увеличению концентрации фукоидана в вытяжке, так как фукоидан хорошо растворим в кислой среде. Кроме вышеперечисленных факторов немаловажную роль, согласно уравнению регрессии, играет и измельченность сырья - степень влияния фактора 3,91%.

При экстрагировании фукуса в оптимальных условиях получена вытяжка с выходом фукоидана 97,11± 1,16%, экстрактивных веществ - 15,68±0,56%, альгиновой кислоты - 0,97+0,17%. Установленный режим был реализован на базе Института Химии КомиНЦ УрО РАН при наработке экстракта для проведения клинических испытаний.

Для очистки фукоидансодержащего экстракта использовали два способа. Способ 1: 3-х кратное переосаждение 95% этанолом с предварительным диализом в воде очищенной. По окончании процесса переосаждения осадок сушили в вакуум-сушильном шкафу. Технологический выход фукоидансодержащего экстракта составил 79,23+1,19%.

Способ 2: ультрафильтрация. Вытяжку пропускали через ультрафильтрационный аппарат, диализовали, затем концентрировали и сушили на лиофильной сушилке. Технологический выход экстракта, содержащего фукоидан, составил 83,37+1,19%.

Таблица 8

Характеристика сухого экстракта фукуса

из различных образцов сырья__

№ серии Способ сушки и очистки Выход от количества фукоидана, % Содержание фукоидана в экстракте, % Общая зола, % Влажность, %

01.99 Лиофильная сушка, ультрафильтрация 82,96±1,25 88,00±0,90 22,76±1,39 4,79±0,55

03.00 84.05i.U2 88,45±0,78 21,34±1,27 4,31 ±0,60

05.01 83,21±0,95 88,87±0,75 22,15±1,44 4,6110,47

07.02 85,36±1,10 88,72±0,64 23,00±1,38 4,51 ±0,63

09.03 83,44±1,45 88,96*0,91 21,62±1,50 4,47±0,41

02.99 Вакуумная сушка, диализ 79,65.1:1,30 85,22±0,86 28,81±1,88 3,84±0,50

04.00 79,23±1,28 85,06x0,80 31,17±1,70 4,03±0,53

06.01 79,16±0,94 85,54±0,69 29,55±1Д4 3,95±0,69

08.02 79,53±1,11 85,86±0,90 27,90±1,08 4Д7±0,54

10.03 79,07±1,15 85,11±1,00 29,75±1,16 3,78±0,40

Результаты анализа сухих экстрактов, полученных по двум разным схемам очистки и сушки, представлены в таблице 8. Экстракты, полученные способом 2, содержали более высокое значение фукоидана и меньшую зольность. Таким образом, способ ультрафильтрации является более предпочтительным для очистки фукоидансодержащего экстракта по сравнению с диализом через целлофановую мембрану, так как увеличивает технологический выход и улучшает качественные и количественные характеристики СЭФП. Преимущество способа 2 заключается в отсутствии энергоемких стадий

концентрирования в вакууме, которые могут отрицательно повлиять на качественные характеристики полисахарида фукоидана.

Для создания проекта ФСП были разработаны методики качественного и количественного (анализа СЭФП: подобраны условия проведения анализов, концентрации определяемых растворов с учетом чувствительности и погрешностей методов.

Для оценки технологических свойств СЭФП исследованы фракционный состав, сыпучесть, насыпная масса, остаточная влага, влагопоглощаемость различных серий сухого экстракта. Данные исследования фракционного состава демонстрируют его существенную зависимость от способа сушки экстракта. Лиофильно высушенный экстракт мелкодисперсный, содержание в нем пылевидной фракции составляет 80,21%. Экстракт, высушенный в вакууме, имеет большое количество более крупных частиц размером от 2,00 до 0,315 мм (78,43%).

Таблица 9

№ п/п Способ сушки Насыпная масса, кг/м3 Сыпучесть, г/с Угол естествениого откоса, 0 Нрессуемость, МН/м2

1. Вакуумзая 179±37 Не обладает 58 Не обладает

2. Лнофилыгая 237112 Не обладает 61 Не обладает

Анализ результатов сравнительного исследования технологических свойств экстрактов фукуса (табл. 9) в зависимости от способов сушки показывает, что оба экстракта имеют плохие характеристики. Отсутствие прессуемости и сыпучести свидетельствует о том, что экстракты нельзя прессовать или помещать в капсулы без предварительного гранулирования.

Рис. 5. Зависимость влагопоглощения сухих экстрактов от времени экспозиции при разных

значениях относительной влажности воздуха. Для выбора оптимальных условий хранения экстрактов были изучены их гигроскопические свойства при относительной влажности воздуха 66%, 75% и

100% (рис. 5). На основании полученных данных сделан вывод, что СЭФП высокогигроскопичен и следует соблюдать особые условия его хранения (в герметичной таре при относительной влажности воздуха ниже 75%).

С целью установления срока годности СЭФП методом «ускоренного старения» были исследованы 5 серии экстракта. Определен срок годности сухого экстракта фукуса- 2 года (срок наблюдения).

Завершающим этапом комплексной технологии является получение альгината натрия. Наиболее часто в качестве экстрагента в данном случае применяют раствор карбоната натрия. По существующим технологиям обязательно проводят предварительную очистку сырья от водорастворимых примесей. Для выделения альгината натрия нами предложено использовать высушенный шрот фукуса, который освобожден от липофильных и водорастворимых веществ на предыдущих этапах, поэтому необходимость в проведении предварительной очистки сырья отпадает. В таблице 10 представлена характеристика шрота.

Таблица 10

Традиционно альгинаты выделяют мацерацией сырья при температуре 50°С с перемешиванием или без. Проведено сравнительное исследование содержание альгиновой кислоты в вытяжках, полученных методами двухступенчатой мацерации с перемешиванием и перколяции с принудительной циркуляцией экстрагента (рис. 6). Процессы экстрагирования проводили при температуре 50°С.

Рис. 6. Содержание альгиновой кислоты в вытяжках в зависимости от метода экстрагирования.

Определены значения выходов альпшовой кислоты от содержания в шроте, которые составили от 82,95% до 87,00% при перколяции, от 68,99% до 74,09% при мацерации.

Полученные результаты подтверждают преимущество метода перколяции по сравнению с мацеращией для экстрагирования альгинатов. Как следует из данных, представленных на рис. 6, несмотря на значительное повышение выхода альгиновой кислоты по сравнению с традиционным способом, не удалось достигнуть максимального извлечения этого полисахарида. Возможно, это связано с недостаточной длительностью процесса, а также невысокой температурой экстракции - 50°С, поэтому проведено исследование влияния этих факторов на полноту экстрагирования альгиновой кислоты. Установлено, что при повышении температуры значительно возрастает количество альгиновой кислоты, перешедшей в вытяжки. Оптимальные значения температуры находятся в диапазоне 60-80°С, технологический выход увеличивается до 97%..

При изучении кинетики экстрагирования альгиновой кислоты методом перколяции определевю, что наступление динамического равновесия в системе «сырье - экстрагент» наступает через 5 ч настаивания, выход при вытеснении составляет 96-99%.

Полученные извлечения обрабатывали концентрированной серной кислотой. Образовавшийся осадок отделяли, растворяли в 1,5% растворе гидрокарбоната натрия. Раствор альгината натрия диализоваля через целлофановую мембрану, затем диализат однохратно осаждали 95% этанолом. Алъгинат натрия сушили в вакуум-сушильном шкафу. Технологический выход альгината натрия составил 82,42±2,59%, содержание альгината в препарате 95,31±1,83%. В соответствии с разработанным способом получения и очистки альгината натрия были наработаны 5 серий препарата, характеристики которых представлены в таблице 11.

Таблица 11

№ серии Год сбора сырья Выход от количества сырья, % Содержание альгината натрия в препарате, % Влажность, %

01.99. А 1999 17,46±2,40 95,35±1,07 6,83±0,90

02.99.А | 1999 17,69±2Д5 95,71 ±1,47 7,04±1,15

05.01.А ( 2001 19,89±1,95 94,29±0,70 539±1Д0

09.03.А 1 2003 19,74±1,12 96,12±1,68 6,50±1,10

10.03.А | 2003 20,42±1,75 95,10±1,27 7,14±1,18

Результаты исследований показывают, что разработанная технология позволяет получать альгинат натрия с высоким технологическим выходом и достаточно высокой степенью чистоты. Достоинством данного метода является отсутствие энергоемкой стадии вакуум-выпаривания вытяжек, который нежелательно сказывается на качественных показателях альпшатов.

На рисунке 7 приведена технологическая схема усовершенствованной комплексной технологии использования фукуса.

Рис. 7. Схема комплексной технологии переработки фукуса

ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СУХОГО ЭКСТРАКТА ИЗ ФУКУСА ПУЗЫРЧАТОГО (Глава 4)

Фармакологические исследования проведены в Испытательном лабораторном центре Института травматологии и ортопедии им. P.P. Вредена под руководством профессора Афиногенова Г.Е.

Определена острая токсичность сухого экстракта фукуса методом Кербера при пероральном введении. Установлено, что СЭФП относится к классу малотоксичных веществ (DL^o при пероральном введении составляет >2500 мг/кг массы тела).

На основании результатов доклинической оценки иммуномодулирующей активности СЭФП установлено, что при пероральном введении экстракт фукуса выступает как потенциальный стимулятор иммуногенеза.

Изучена сорбционная способность СЭФП по отношению к метиленовому синему и к метаболитам (альбумину, глюкозе, креатинину, мочевине) (рис. 8).

Рис. 8. Адсорбционная способность исследуемых веществ Экспериментальные данные показали, что СЭФП обладает достаточно высокими сорбционными свойствами по сравнению с другими медицинскими сорбентами, такими как лигнин, Полисорб, МКЦ-102.

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА НА .

ОСНОВЕ СУХОГО ЭКСТРАКТА ФУКУСА ПУЗЫРЧАТОГО В ВИДЕ ГРАНУЛ В ТВЕРДЫХ ЖЕЛАТИНОВЫХ КАПСУЛАХ (Глава 5) Для получения лекарственного препарата на основе сухого экстракта фукуса, учитывая его низкие технологические характеристики, а также высокую дисперсность и гигроскопичность, выбрана лекарственная форма в виде гранул в твердых желатиновых капсулах. С целью улучшения физико-химических и технологических свойств СЭФП в качестве вспомогательных веществ исследовали лактозу, крахмал, муку, каолин и сахарозу. Провели изучение влагопоглощающей способности модельных смесей этих компонентов с СЭФП

(соотношение 1:1) при относительной влажности 100% (рис. 9) и установили, что наименьшее поглощение влаги происходит в смеси с лактозой.

Рис. 9. Влагоноглощающая способность модельных смесей с СЭФП.

Так как экстракт фукуса пузырчатого по химическому составу представляет собой сумму фракций полисахарида фукоидана, растворимого в воде и образующего с водой вязкие высокомолекулярные растворы, то в качестве связующего агента использовали воду очищенную. Методом влажной и смешанной грануляции было получено несколько гранулятов с содержанием СЭФП 0,2 г. Изучили влагопоглощаюшую способность при 100%, время распадаемости, прочность на истирание полученных гранулятов (табл. 12). На основании проведенных экспериментов для гранулирования СЭФП выбран метод смешанной грануляции.

Таблица 12

№ п/п Метод грануляции Состав гранулируемой смеси, г Влагосодержание при экспозиции 4 ч, % Распадаемость, мин Прочность на истираемость, %

I Влажная грануляция Лактоза - 0,2 Вода очищенная - 0,05 2,71 5,08±0,4 99,82±1,13

2 Лактоза - 0,4 Вода очищенная - 0,05 2,55 5,67±0,5 99,28±2,00

3 Лактоза - 0,2 Вода очищенная - 0,07 Гранулообразоваяия не произошло

4 Лактоза - 0,4 Вода очищенная - 0,07 2,43 8,17±0,3 100±0,60

5 Смешанная грануляция Лактоза - 0,2 Вода очищенная - 0,05 2,29 2,58±0,5 98,77±1,10

б Лактоза - 0,4 Вода очищенная - 0,05 1,84 2,22±0,4 98,16±0,75

7 Лактоза - 0,2 Вода очищенная - 0,07 2,05 3,50±0,3 99,70±0,54

8 Лактоза - 0,4 Вода очищенная - 0,07 1,67 3,03 ±0,5 99,98±0,33

Для установления оптимальных условий грануляции применили метод математического планирования эксперимента по Боксу-Уилсопу с использованием V* реплики от полного факторного эксперимента. В качестве критериев оптимизации выбраны насыпная масса 0^), фракционный состав сыпучесть с предварительной вибрацией и естественная сыпучесть (УД поскольку эти параметры важны для дальнейшего наполнения капсул.

Факторы и интервалы варьирования, выбранные на основании литературных и экспериментальных данных, представлены в таблице 13.

Таблица 13

Фактор Уровень Интервал

нижпий основной верхний варьирования

XI Количество наполнителя 100 125 150 25

относительно экстракта, % г 10,0 12,5 15,0 2,5

Х2 Количество увлажнителя 50,0% 62,5% 75,0% 12,5%

относительно экстракта, % г 5,0 6,25 7,5 2,5

Х3 Количество

опудривакяцего агента, % г 0 0 0,5 0,125 1,0 0,250 0,5 0,125

Хд Размер отверстий гранулятора, мм 0,50 0,75 1,0 0,25

Х5 Остаточная влажность

гранулята, % 1,6 2,3 3,0 0,70

Установлено, что зависимость критериев оптимизации от указанных выше факторов выражается следующими уравнениями регрессии: У1=698,8-69,1Х1+55,2Х2+8,8ХЗ-82,ЗХ4-40,5Х5 [2]

У2=86,81+1,14Х1+6,41ХЗ+4,84Х4-2ДЗХ5 [3]

УЗ=8,65-0,71Х2+О,73ХЗ [4]

У4=11,68-1,14Х2+1,24Х3 [5]

В условиях адекватности (по критерию Фишера) уравнения регрессии реальному процессу проведено крутое восхождение для критерия оптимизации (насыпная масса). Определены оптимальные условия процесса гранулирования экстракта фукуса: количество наполнителя - 112,5% от количества СЭФП, количество увлажнителя - 62,5%, количество опудривающего агента - 0,55%, размер отверстий гранулятора - 0,50 мм, остаточная влажность гранулята не более 2,0%.

При гранулировании сухого экстракта в приведенных условиях получены гранулы с фракцией 0,25-0,50 мм с выходом 92,83+2,61%, остаточной влажностью 1,98+0,2%, насыпной массой 935+7 кг/м3, сыпучестью естественной 13,17+1,45г/с, сыпучестью с вибрацией 10,38+1,29 г/с.

Составлено описание технологического процесса получения гранул СЭФП методом смешанной грануляции и фасовки гранул в капсулы, а также технологическая схема данного производства.

Выбраны критерии стандартизации и подготовлен проект ФСП на гранулы СЭФП в твердых желатиновых капсулах. Наработаны серии капсул с гранулами сухого экстракта фукуса, которые были проанализированы в

соответствии с требованиями проекта ФСП. Полученные результаты (табл. 14) свидетельствуют, что препарат серий 1-5 отвечает всем требованиям показателей качества. Низкое значение времени распадаемости наряду с растворением 100% позволяют сделать предположение о высокой биодоступности капсул с гранулами СЭФП in vitro.

Таблица 14

№ серии Отклонение от средней массы, % Реакция на подлинность Содержание фухошинав 10 капсулах, г Распада-емость, мин Растворение, %

полиса-хариды фукондан

Требования Не более 10 Образование осадка при добавлении спирта этил. 96% С серной кислотой хонц. и 5 мл 1% раствора Ь-цисгеина Максимумы поглощения при 396 нм и 430 нм. Не менее 1,50 г Не более 15 Не менее 75%

1 2,80 Положит Положит 1,76±D,08 3±1 100

2 2,06 Положит Положит 1,75iO,06 4±1 100

3 6,48 Положит Положит 1,73±0,05 3±1 100

4 2,26 Положит Положит 1,76*0,07 2±1 100

5 3,60 Положит Положит 1,79±0,08 4±1 100

Рис. 10 и 11. Влагопоглощающая способность гранул СЭФП и капсул с гранулами СЭФП.

Исследована влагопоглощающая способность капсул с гра1гулами СЭФП в условиях повышенной влажности воздуха 75% и 100% (рис. 10 и 11). Установлено, что гранулы СЭФП в желатиновых капсулах обладают меньшей

способностью сорбировать влагу по сравнению с суммарной влагопоглощаемостью капсул и гра!гул. Определение влагосодержания гранул СЭФП, помещенных в капсулы, показало, что их гигроскопичность значительно снизилась и практически не менялась за экспериментальный период.

Влагопрошщаемость двух видов упаковок с капсулами СЭФП исследовали при относительной влажности воздуха 100% и 75% и температуре 20°С и различном времени экспозиции. На основании полученных данных установлено, что оба вида упаковки капсул СЭФП полностью обеспечивают сохранность капсул в течение экспериментального периода при 75% и 100% относительной влажности воздуха.

Методом «ускоренного старения» была исследована стабильность гранул СЭФП в твердых желатиновых капсулах. Установлено, что препарат серий 1-5 по показателям качества соответствовал требованиям проекта ФСП в течение экспериментального периода, определен срок годности капсул с гранулами

0.2.г СЭФП-2 года.

ВЫВОДЫ

1. Предложена комплексная технология лекарственных средств из фукуса пузырчатого (Fucus vesiculosus): густого экстракта, маннита, альгината натрия, сухого экстракта.

2. Установлено, что густой экстракт фукуса пузырчатого целесообразно получать методом циркуляционной экстракции с использованием в качестве экстрагента азеотропной смеси хлористый метилен : этиловый спирт. Получен ГЭФП с высоким технологическим выходом (88,09±0,89%).

3. Примените способа циркуляционной экстракции шрота фукуса позволяет получать технический маннит с выходом 92,3 8± 1,50%, что превышает выход по существующей технологии на 30%. Очистка методом колоночной хроматографии обеспечивает получение из него фармакопейного машшта высокой степени чистоты (99,12± 1,56%).

4. Доказано преимущество метода перколяции с периодической циркуляцией экстрагента для выделения альгината натрия по сравнению с методом мацерации. Получен фармакопейный альгинат натрия с высоким выходом (82,42±2,59%) и степенью чистоты (95,31±1,83%).

5. Создана технология сухого экстракта фукуса. Оптимизация процесса экстрагирования шрота методом математического планирования эксперимента позволила достигнуть высокого значения выхода фукоидана (97,11± 1,16%). Применение способа ультрафильтрации вытяжки обеспечило увеличение содержания фукоидана в сухом экстракте до 88,72±0,71%. Установлена высокая гигроскопичность сухого экстракта фукуса пузырчатого.

6. Разработан научно обоснованный способ гранулирования сухого экстракта фукуса пузырчатого. Предложен лекарственный препарат в виде гранул сухого экстракта фукуса 0,2 г в твердых желатиновых капсулах. Показана его высокая доступность в опытах in vitro и стабильность при хранении в течение не менее 2 лет.

7. Разработаны проекты ФСП на слоевища фукуса пузырчатого, на сухой экстракт фукуса пузырчатого, густой экстракт фукуса пузырчатого, гранулы экстракта фукуса пузырчатого ОД г в твердых желатиновых капсулах. Составлен и утвержден лабораторный регламент на производство густого экстракта, маннита, сухого экстракта, альгината натрия. Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Облучинская Е.Д. Анализ содержания фукоидана в сухих экстрактах Fucus vesiculosus L. / Материалы конф. молод, уч. ММБИ. Мурманск: ММБИ КНЦРАН. 2000. с. 51-53.

2. Облучинская Е.Д. Сезонные изменения содержания полисахаридов фукусовых водорослей Баренцева моря / Материалы конф. молод, уч. ММБИ. Мурманск: ММБИ КНЦ РАН. 2001. с. 65-70.

3. Obluchinskaya E.D. Effect of the external factors on the composition of seaweed polysaccharides ofthe Arctica / Phycologia. v. 40. N 4. suppl. 2001. P. 88.

4. Облучинская Е,Д. Новое в технологии переработки бурых водорослей / Тез. докл. Ш форума представителей промышл. предприятий, научн. и проекта, организаций в обл. биотехнологии. Санкт-Петербург. 2001. с. 32-33.

5. Воскобойников Г.М., Галынкин В. А., Облучинская Е.Д. Новая технология комплексной переработки бурых водорослей / Материалы V Межд. съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». Санкт-Петербург. Петродворец. 2001. с. 71-74.

6. Облучинская Е.Д., Воскобойников Г.М., Галынкин В.А. Содержание алъгиновой кислоты и фукоидана в фукусовых водорослях Баренцева моря / Прикладная биохимия и микробиология. 2002. т. 38. № 2. с. 213-216. (Obluchinskaya E.D., Voskoboinikov G.M., Galynkin V.A. Contents of alginic acid and fucoidan in Fucus algy ofthe Barents sea / Appl. Biochem. and Microbiol. 2002. v. 38. N 2. pp. 186-188. Translated from Prikladnaya Biohimiya i Mikrobiologiya. 2002. v. 38. N2. pp. 213-216).

7. Облучинская Е.Д., Афиногенова АХ. Сорбционная активность биомассы бурых водорослей Баренцева моря / Материалы конф. молод, уч. ММБИ. Мурманск: ММБИ КНЦ PAR 2002. с. 117-123.

8. Облучинская Е.Д., Воскобойников Г.М., Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г. Изучение сорбциошюй активности бурых водорослей / Материалы VI Межд. съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». Санкт-Петербург. 2002. с. 581-585.

9. Облучинская Е.Д. Комплексная технология переработки водорослей рода Fucus / Материалы Всерос. семинара «Новые достижения в химии и химической техпологии растительного сырья». Барнаул. 2002. с. 252-254.

10. Облучинская Е.Д. Содержание полисахаридов в фукусовых водорослях Баренцева моря / «XXI век - перспективы развития рыбохозяйствешгай пауки». Материалы Всерос. иытернет-коиф. молод, уч. Владивосток. 2002. с. 168-172.

11. Облучинская Е.Д., Воскобойников Г.М., Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г. Исследование сорбциошюй активности бурых водорослей Баренцева моря / Материалы Всерос. конф. «Химия и технология растительных веществ». Казань. 2002. с. 106.

12. Облучинская Е.Д. Влияние факторов внешней среды на динамику содержания полисахаридов бурых водорослей Баренцева моря / Тез. докл.

Всерос. конф. мол. уч., посвящ. 140-летию со дня рожд. Н.М. Книповича. Мурманск. 2002. с. 158.

13. Облучинская Е.Д. Динамика содержания полисахаридов бурых водорослей Баренцева моря под влиянием различных факторов / Тез. докл. конф. мол. уч. Сыктывкар. 2002. с. 79.

14. Облучинская Е.Д. Изучение изменения содержания полисахаридов бурых водорослей под влиянием факторов внешней среды / Тез. докл. Первой Всерос. конф. «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки». Москва, Галицыно. 2002. с. 86.

15. Облучинская Е.Д. Совершенствование технологии экстракта из фукусовых водорослей Баренцева моря / Материалы конф. молод, уч. ММБИ. Мурманск: ММБИ КНЦ РАН. 2003. с. 108-112

16. Obluchinskaya E.D. Chemical constituents and pharmacological activity of a new extract from Fucus vesiculosus / Thesis of Intern. Symp. "Chemistry and Biology ofMarine Organism'*, Greece, 2003. P. 117.

17. Облучинская Е.Д. Разработка комплексной технологии получения БАВ из фукусовых водорослей / Материалы конф. молод, уч. ММБИ. Мурманск: ММБИ КНЦ РАН. 2004. с. 100-108.

18. Облучинская Е.Д., Воскобойников Г.М., Минина С.А. Полисахариды в бурых водорослях / Фармация. № 3.2004. с. 15-18.

19. Облучинская Е.Д., Минина С.А. Совершенствование способа получения экстракта из фукусовых водорослей / Хим.-фарм. журн. т. 38. № 6. 2004. с. 3537.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

ЛР № 021251 от 23.10.97. Подписано в печать 23.06.2004. Тираж 100. Заказ 520. Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия. Издательство СПХФА—член Издательско-полиграфической ассоциации вузов Санкт-Петербурга, 197376, С-Петербург, ул. Профессора Попова, 14

- 14109

Актуальность темы. Значительное место в современной медицине занимают лекарственные препараты из растительного сырья. Несмотря на широкий ассортимент существующих фитопрепаратов, поиск и создание новых эффективных и удобных для применения лекарств на основе биологически активных веществ (БАВ) растительного происхождения не теряют своей актуальности.

Источниками ценных БАВ служат бурые водоросли: ламинариевые и фукусовые. Фукусовые водоросли, в отличие от ламинариевых, традиционно мало используются для получения как пищевых продуктов, так и выделения БАВ, хотя являются продуцентами веществ с широким спектром фармакологических свойств.

Fucus vesiculosus L. (фукус пузырчатый) является массовым видом литорали Баренцева и Белого морей и содержит такие БАВ, как альгиновая кислота и ее соли, маннит, полиненасыщенные жирные кислоты, стерины, пигменты и другие. Кроме того, в состав фукуса пузырчатого входит полисахарид фукоидан, обладающий иммуномодулирующими свойствами, гепариноподобным действием, противовирусной и противомикробной активностью. Доказаны также гастропротекторный эффект, общеукрепляющее воздействие фукоидана, противоопухолевая активность этого полисахарида. Однако ни в нашей стране, ни за рубежом не создано препаратов на основе фукоидана, притом, что фармакологические исследования проводятся более 30 лет. Отсутствие научно обоснованной технологии фукоидансодержащих препаратов сдерживает внедрение этого ценного полисахарида в медицинскую практику.

В связи с вышеизложенным представляется актуальным совершенствование комплексной технологии, позволяющей получать наряду с традиционными веществами из бурых водорослей (маннита и альгината натрия), новые высокоэффективные средства (густой и сухой экстракты), и разработка на их основе перспективных лекарственных форм, удобных в применении и стабильных при хранении.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы -совершенствование комплексной технологии переработки фукусовых водорослей с получением маннита, альгината натрия и новых лекарственных средств: густого экстракта и сухого экстракта. б

В соответствии с заявленной целью нами были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать качественные и количественные характеристики сухого сырья и шрота фукуса пузырчатого, используемых для получения БАВ. Усовершенствовать технологию комплексного использования фукуса пузырчатого.

2. Изучить влияние технологических факторов на кинетику процессов экстрагирования сырья (слоевищ фукуса и шрота), выходы и концентрацию БАВ.

3. Разработать оптимальную технологию сухого экстракта фукуса пузырчатого (СЭФП), содержащего полисахарид фукоидан. Изучить технологические свойства СЭФП.

4. Выбрать методы и разработать методики качественного и количественного анализа новых лекарственных средств - густого экстракта фукуса пузырчатого (ГЭФП) и СЭФП.

5. Определить физико-химические показатели выделяемых в процессе комплексной технологии маннита и альгината натрия в соответствии с нормативной документацией.

6. Провести комплекс исследований по разработке рационального состава и технологии гранул СЭФП в твердых желатиновых капсулах. Определить срок годности СЭФП и готовой лекарственной формы на его основе в виде гранул в твердых желатиновых капсулах.

7. На основании полученных результатов разработать нормативную документации на слоевища фукуса пузырчатого, густой и сухой экстракты I фукуса, капсулы с гранулами СЭФП.

Научная новизна. Изучение фотохимического состава и технологических свойств слоевищ фукуса позволило установить перспективность использования данного вида сырья для производства лекарственных средств.

Впервые показана возможность получения маннита, густого и сухого экстрактов и альгината натрия методом последовательных экстракций из фукуса пузырчатого. Выявлено, что изменение последовательности использования экстрагентов приводит к более полному извлечению БАВ сырья, к повышению степени чистоты конечных продуктов. Установлен оптимальный способ получения и гранулирования СЭФП в процессе комплексной переработки фукуса. Теоретически и экспериментально обоснован состав вспомогательных веществ при гранулировании СЭФП с 7 учетом его технологических и физико-химических свойств. Получены данные о гигроскопических свойствах СЭФП и препарата на его основе в виде гранул в твердых желатиновых капсулах при влажности воздуха более 75%.

Практическая значимость Разработан и утвержден лабораторный регламент JIP 02699872-01-2003 на производство густого экстракта фукуса, маннита, сухого экстракта фукуса, альгината натрия. Новая комплексная технология прошла апробацию на базе научно-производственной лаборатории Института Химии Коми научного центра РАН (г. Сыктывкар) и на предприятии ООО «Сирена» (г. Санкт-Петербург), что подтверждено соответствующими актами.

Разработаны состав и способ получения гранул СЭФП в твердых желатиновых капсулах. Составлена технологическая схема и описание технологии гранул СЭФП, определены технологические параметры, необходимые для лабораторного регламента на производство готового лекарственного средства - СЭФП в виде гранул в твердых желатиновых капсулах.

Составлены проекты фармакопейных статей предприятия на слоевища фукуса пузырчатого, ГЭФП, СЭФП и гранулы СЭФП гранул в твердых желатиновых капсулах.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на ежегодных конференциях молодых ученых Мурманского морского биологического института 1999-2004, г. Мурманск; I Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ», г. Сыктывкар, 2000; Ш форуме представителей промыпш. предприятий, научных и проектных организаций в области биотехнологии, г. Санкт-Петербург, 2001; V Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», г. Санкт

Петербург, Петродворец, 2001; 7 International Phycological Congress,

Thessaloniki, Greece, 2001; VI Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», Санкт-Петербург, 2002; Всероссийском семинаре «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья»,

Барнаул, 2002; Всероссийской Интернет-конференции молодых ученых «XXI век - перспективы развития рыбохозяйственной науки», Владивосток, 2002;

П Всероссийской конференции «Химия и технология растительных 8 веществ», Казань, 2002; Всероссийской конференции молодых ученых, посвящ. 140-летию со дня рожд. Н.М. Книповича, Мурманск, 2002; Первой Всероссийской конференции «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки», Москва-Галицыно, 2002; International Symposium «Chemistry and Biology of Marine Organism», Greece, 2003.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Санкт-Петербургской Государственной химико-фармацевтической академии и Мурманского морского биологического института КНЦ РАН.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Предложена комплексная технология лекарственных средств из фукуса пузырчатого (Fucus vesiculosus): густого экстракта, маннита, альгината натрия, сухого экстракта.

2. Установлено, что густой экстракт фукуса пузырчатого целесообразно получать методом циркуляционной экстракции с использованием в качестве экстрагента азеотропной смеси хлористый метилен : этиловый спирт. Получен ГЭФП с высоким технологическим выходом (88,09±0,89%).

3. Применение способа циркуляционной экстракции шрота фукуса позволяет получать технический маннит с выходом 92,38±1,50%, что превышает выход по существующей технологии на 30%. Очистка методом колоночной хроматографии обеспечивает получение из него фармакопейного маннита высокой степени чистоты (99,12±1556%).

4. Доказано преимущество метода перколяции с периодической циркуляцией экстрагента для выделения альгината натрия по сравнению с методом мацерации. Получен фармакопейный альгинат натрия с высоким выходом (82,42±2,59%) и степенью чистоты (95,31±1,83%).

5. Создана технология сухого экстракта фукуса. Оптимизация процесса экстрагирования шрота методом математического планирования эксперимента позволила достигнуть высокого значения выхода фукоидана (97,11±1,16%). Применение способа ультрафильтрации вытяжки обеспечило увеличение содержания фукоидана в сухом экстракте до 88,72±0,71%. Установлена высокая гигроскопичность сухого экстракта фукуса пузырчатого.

6. Разработан научно обоснованный способ гранулирования сухого экстракта фукуса пузырчатого. Предложен лекарственный препарат в виде гранул сухого экстракта фукуса 0,2 г в твердых желатиновых капсулах. Показана его высокая доступность в опытах in vitro и стабильность при хранении в течение не менее 2 лет.

7. Разработаны проекты ФСП на слоевища фукуса пузырчатого, на сухой экстракт фукуса пузырчатого, густой экстракт фукуса пузырчатого, гранулы экстракта фукуса пузырчатого 0,2 г в твердых желатиновых капсулах. Составлен и утвержден лабораторный регламент на производство густого экстракта, маннита, сухого экстракта, альгината натрия.

Заключение.

На основании проведенного обзора литературы можно сделать следующие выводы:

Бурые водоросли являются ценным сырьем для получения БАВ, которые обладают широким спектром фармакологической активности. Перспективен комплексный подход к переработке макрофитов с целью получения индивидуальных компонентов, а также лекарственных средств, содержащих сумму БАВ водорослевого происхождения. Существующие технологии направлены в основном на получение традиционных продуктов из бурых водорослей - маннита, альгиновой кислоты и ее солей, липидного концентрата. Другие БАВ макрофитов такие, например, как фукоидан, из-за отсутствия рациональных способов получения, в нашей стране не производятся и не находят применения в медицине.

Фукусовые водоросли - перспективное сырье для получения БАВ. Запасы фукоидов на побережье Баренцева моря оцениваются специалистами как значительные (более 300 тонн), данные виды водорослей имеют широкое распространение, произрастают в удобных для заготовки местах - на литорали.

F. vesiculosus - представитель фукусовых на побережье Баренцева и Белого морей, используется за рубежом для производства коммерческого фукоидана, для которого многочисленными исследованиями установлены иммуномодулирующая, антикоагулянтная, антитромботическая, противоопухолевая активности.

Получение фукоидана в процессе комплексного использования сырья находится в стадии разработки, предлагаемые технологии обладают рядом существенных недостатков (многостадийность, длительность, применение дорогостоящих реагентов, низкие технологические выходы). Поэтому проведение исследований в области разработки комплексной технологии БАВ из бурых водорослей актуально.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Материалы исследования.

2.1.1. Характеристика фукуса пузырчатого.

Fucus vesiculosus L. - фукус пузырчатый. Цельное сырье. Слоевища фукуса пузырчатого в виде крупных кустов до 100 см высоты, с плоскими ветвями, со срединной жилкой, с ровными или слегка волнистыми краями, дихотомически и неправильно разветвленными, обычно с парными пузырями. Рецептакулы округлые и овальные, простые и вильчатые образуются на концах ветвей. Цвет цельных слоевищ от темно-оливкового до зеленовато-черного. Запах своеобразный. Вкус солоноватый.

Измельченное или шинкованное сырье. Кусочки слоевищ различной формы и размеров. Цвет зеленовато-черный. Запах своеобразный. Вкус солоноватый.

В работе использованы высушенные водоросли фукус пузырчатый (F. vesiculosus) 3-6 лет, собираемые ежегодно в августе и сентябре в период с 1999 по 2003 гг. в губе Дальнезеленецкой Баренцева моря в районе биостанции Мурманского морского биологического института. Высушенные водоросли фукус пузырчатый измельчали на мельнице лабораторной «Эксцельсиор» типа ДМ. Для получения более мелких частиц использовали дисмембратор.

2.1.1.1. Определение числовых показателей сырья.

Фукус пузырчатый не входит в реестр лекарственных растений, поэтому определение числовых показателей мы проводили исходя из целей и задач данного исследования и биохимического состава водорослей данной систематической группы на основании методов ГОСТ 26185-84, Справочника биохимика (1991), Руководства по физиологическим и биохимическим методам анализа водорослей (Сиренко и др., 1975) и другим справочным материалам (Усов и Кирьянов, 1994; Усов, 1999; Усов и др., 2001; Percival et al., 1967; Larsen, 1978; Scott, 1979; Loban et al., 1985)

Ранее было отмечено (см. п. 1.2., стр. 11-19), что водорослевое сырье не отличается постоянством своего биохимического состава, и в зависимости от систематической принадлежности вида, возраста растений, мест обитания, сезонных и других факторов содержание большинства БАВ водорослей меняется. Поскольку основными продуктами совершенствуемой технологии использования фукусовых водорослей являлись полисахариды (фукоидан и натриевая соль альгиновой кислоты), было проведено исследование по

49 изучению сезонной динамики накопления этих БАВ. Установлено (Облучинская и др., 2002), что у всех четырех видов фукусовых водорослей Баренцева моря в летне-осенний период обнаружено наибольшее количество альгиновой кислоты - около 20 %. Содержание альгиновой кислоты увеличивалось от весны к осени. У водорослей F. vesiculosus ее количество в апреле уменьшалось до 8,40+1,91%, в конце августа - в начале сентября составляло (23,97±1,84%). Количество фукоидана не претерпевало значительных изменений под влиянием сезонных факторов в биомассе фукусов. Так у F. vesiculosus содержание фукоидана в апреле составляло 12,12±1,12%, в августе 14,70±1,70%, в декабре 10,00±1,81%. По результатам проведенного исследования можно сделать вывод, что сбор и заготовку фукусовых водорослей Баренцева моря следует проводить в летне-осенний период, когда отмечается максимальное накопление альгиновой кислоты и фукоидана.

Для продолжения работ по совершенствованию комплексной технологии лекарственных средств из фукусовых водорослей использованы слоевища фукуса пузырчатый (F. vesiculosus), собранный в августе и сентябре в 1999-2003 гг. Результаты определения числовых показателей этого вида макрофитов по представлены в таблице 2.1.1.1.1.