Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Разработка составов и технологии мягких лекарственных форм гипорамина

На правах рукописи

ДЖАВАХЯН МАРИНА АРКАДЬЕВНА

РАЗРАБОТКА СОСТАВОВ И ТЕХНОЛОГИИ МЯГКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ ГИПОРАМИНА

.00.01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 2006

Работа выполнена во Всероссийском научно - исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Научный руководитель:

Кандидат фармацевтических наук, старший научный сотрудник

Охотникова Валентина Федоровна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор Доктор фармацевтических наук

Астраханова Маргарита Михайловна Давыдова Валентина Николаевна

Ведущая организация:

Институт государственного контроля лекарственных средств ФГУ Научного Центра экспертизы средств медицинского применения (ФГУ «НЦ ЭСМП» Росздравнадзора).

Защита состоится «10» января 2006 г. в « 14 » часов на заседаний диссертационного совета Д 006.070.01 при Всероссийском НИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИИ лекарственных и ароматических растений ВИЛАР РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7.

Автореферат разослан «У'0_у>

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.070.01 М.В. Кирцова

кандидат с/х наук * '

2 РОб - Ч ЗО/Об

г 2652 г?

Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Современная медицина имеет в своем арсенале разнообразные препараты для профилактики и лечения вирусных инфекций кожи и слизистых оболочек. Тем не менее, потребность в-высокоэффектив-ных, доступных отечественных лекарственных препаратах растительного происхождения удовлетворяется не полностью.

В связи с широким распространением вирусных заболеваний, хронических рецидивов воспалительного характера различной этиология разработ ка новых средств противовирусного действия является актуальной.

В настоящее время для многих стран мира, в том числе и для России, серьезную медико-социальную проблему представляют и герпесвирусные инфекции.

По данным ВОЗ представители семейства вирусов простого герпеса человека поражают 60-95% населения, как в развитых, так -и развивающихся странах. Герпесвирусные заболевания протекают как тяжелейшие осложнения у больных с пониженным иммунитетом и занимают второе место после гриппа.

Известно, что при лечении вирусных инфекций синтетическими препаратами происходит ослабление иммунной системы организма, а также их применение нежелательно в связи с высокой токсичностью. *

Поэтому возрос интерес к лекарственным препаратам растительного происхождения, которые имеют ряд преимуществ перед синтетическими и занимают ведущее место в профилактике и лечении различных заболеваний, терапевтический эффект которых обусловлен высокой концентрацией биологически активных веществ.

Медико - биологические исследования, проведенные во Всероссийском институте лекарственных и ароматических растений,, связанные с изучением гипорамина показали актуальность разработки лекарственных препаратов на его основе.

Гипорамин - сухой, очищенный экстракт, выделенный из листьев облепихи крушиновидной /ШррорИае гкатпо'шеЬ Ь./ семейства /Е1еацпасеае/. Гипорамин обладает высокой противовирусной активностью в отношении различных штаммов вирусов гриппа А и В, аденовирусов, парамиксовирусов, вирусов простого герпеса. Кроме того, гипорамин обладает интерферонин-дуцирующими свойствами, а также является ингибитором роста грамполо-жительных бактерий, туберкулезных микобактерий, кандид. Разнообразие клинических показаний, при которых доказана эффективность гипорамина, подчеркивает его особое место среди других противовирусных средств.

В настоящее время разработаны сублингвальные таблетки гипорамина, лиофилизированный порошок, суппозитории и мазь. Однако, раннее разработанная мазь гипорамина на гидрофобной рснове. не отвечает требованиям,

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.Пете( 1 «9

ни ■ см

згйй

1.11»

предъявляемым к мягким лекарственным формам (МЛФ)' для лечения гер-песвирусных инфекций и в настоящее время не выпускается.

Таким образом, исходя из клинической картины герпесвирусных инфекций разработка МЛФ гипорамина для лечения и профилактики вирусных инфекций с учетом стадии заболевания является актуальной.

Цель и задача исследования. Целью настоящего исследования является разработка научно-обоснованных составов, технологии и методов стандартизации геля и линимента гипорамина для лечения вирусных инфекций.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- теоретически и экспериментально обосновать оптимальный состав и технологию геля и линимента гипорамина;

- провести комплексные исследования по изучению технологических, физико-химических и биофармацевтических свойств геля и линимента;

- разработать методики подлинности и количественного определения биологически активных веществ в лекарственных формах гипорамина с целью их стандартизации и установления сроков годности;

- провести доклинические исследования по безопасности геля и линимента;

- на основании полученных результатов составить Фармакопейную статью предприятия (ФСП) и опытно-промышленный регламещ (ОПР) на гель гипорамина.

Связь темы диссертации с планом научных исследований. Диссертационная работа выполнена в соответствии с «Программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений по научному обеспечению агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2001-2005 г.г.».

Научная новизна исследований. Разработаны технологии получения оригинального, отечественного геля и линимента гипорамина, обладающего противовирусным действием.

Экспериментально обоснован выбор вспомогательных веществ различных физико-химических свойств, влияющих на технологию и качество мягких лекарственных форм гипорамина.

Проведено комплексное исследование геля и линимента гипорамина с использованием технологических, физико-химических, и биофармацевтических методов исследования с целью стандартизации препарата и установления сроков его годности.

Впервые разработаны методики подлинности и количественного определения биологически активных веществ в лекарственных формах гипорамина методом ВЭЖХ.

Практическая значимость полученных результатов. На основании экспериментальных исследований разработаны:

- лекарственные формы гипорамина наружного применения, для лечения и профилактики заболеваний, вызванных герпесвирусными инфекциями;

- методики подлинности и количественного определения действующих веществ в геле и линименте гипорамина;

- проект ФСП на гель гипорамина;

- ОПР по наработке опытных партий геля гипорамина.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы и результаты исследований представлены и изложены на Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (2004г.), Международной научной конференции «Генетические ресурсы лекарственных и ароматических растений» (2004г.), 59-й региональной конференции по фармации и фармакологии, Пятигорск, (2004г.), Научно - практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» РАЕН, (2005г.)

На защиту выносятся:

- результаты исследования по обоснованию составов и технологий геля и линимента гипорамина, предназначенных для профилактики и лечения вирусных инфекций;

- результаты проведения комплексных исследований с использованием физико-химических, реологических и биофармацевтических методов по оценке качества мягких лекарственных форм гипорамина; .

- результаты по разработке методик подлинности и количественного определения биологически активных веществ (БАВ) в геле и линименте гипорамина.

- результаты изучения стабильности и условий хранения лекарственных форм гипорамина для обоснования сроков годности;

- результаты доклинического изучения биологической безопасности МЛФ;

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, двух экспериментальных глав, заключения, общих выводов, библиографии и приложений.

Раздел библиографии включает 163 источника литературы. Во введении представлены актуальность темы, цель и задачи исследований, научная новизна и практическая значимость.

В обзоре литературы рассматриваются сведения об этиологии, патогенезе вирусных инфекций и их лекарственной терапии. Отражены аспекты применения М.Л.Ф для лечения герпетических инфекций; дана характеристика вспомогательных веществ, использующихся в технологии изготовления гелей и линиментов. Содержится характеристика исходного сырья (листья облепихи) для получения противовирусного препарата гипорамин.

Во второй главе дана характеристика материалов, методов и приборов, используемых в работе. Изложены методики стандартизации и исследования реологических, биофармацевтических свойств геля и линимента гипорамина.

Глава третья посвящена выбору оптимального состава и технологии получения геля и линимента гипорамина, на основании которых разработаны технологические схемы для наработки экспериментальных серий препаратов. В четвертой главе представлены результаты экспериментального изучения общетоксического и местнораздражающего действия МЛФ гипорамина. Приложение содержит: отчет об экспериментальном исследовании безвредности геля и линимента гипорамина, проект фармакопейной статьи и опытно - промышленный регламент на производство геля гипорамина.

Содержание работы.

Объекты и методы исследования. Объектом исследования является сухой экстракт гипорамина (ФСП 42-071-2953-02), выделенный из листьев облепихи крушиновидной с содержанием таннинов не менеё 60% в пересчете на казуаринин. Показатели качества действующего и вспомогательных веществ, используемых в эксперименте, соответствуют требованиям нормативных документов (НД).

С целью выбора эффективной концентрации гипорамина были проведены опьггы в НИЦ медицины ВИЛАР под руководством доктора медицинских наук Колхира В.К., в процессе которых была подтверждена 0,5% концентрация активного вещества. Для изучения структурно - механических свойств гидрогелевых систем использованы реологические методы исследования с помощью ротационного вискозиметра «Кео1ез! - 2» типа ЯУ (Германия)

Определение подлинности и количественного содержшия гипорамина в геле и линименте было осуществлено методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Оценка высвобождения гипорамина из МЛФ проведена методом равновесного диализа через полупроницаемую мембрану (по Крувчинскому).

Определение микробиологической чистоты геля и линимента гипорамина проводили в соответствии с методикой ГФ XI изд. вып. 2. с.187 и Изменением №3 «Методы микробиологического контроля лекарственных средств» от 19.06.03. ^

Экспериментальное токсикологическое исследование МЛФ гипорамина выполнено в соответствии с Методическими указаниями по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (2000г.) в НИЦ Медицины ВИЛАР.

Разработка состава и технологии получения геля и линимента гипорамина.

Получение высокоэффективных МЛФ гипорамина для лечения герпетических инфекций представляет практический интерес. При выборе основы для геля и линимента руководствовались основными положениями биофармации, согласно которым препарат требует индивидуального подбора вспомогательных веществ с учетом физико-химических и фармакологических свойств гипорамина.

На основании сравнительного изучения кинетики высвобождения пи-порамина из основ различной природы - гидрофильной (ареспол, карбопол, метилцеллюлоза М-16) и гидрофобной (вазелин, ланолин) был выбран ред-косшитый акрилрвый полимера ареспол (ТУ 2219-005-29053342-97), который обеспечивает наиболее полное высвобождение лекарственного вещества, обладает осмотическими свойствами, способствует поглощению экссудата. При нанесении на кожу образует тончайшие гладкие пленки, обеспечивая пролонгированный эффект препаратов, хорошо распределяется по слизистым и кожным поверхностям, оказывают охлаждающий эффект.;

Для обоснования составов и технологии гелевой основы были проведены исследования по изучению факторов, влияющих на структурообразо-вание гелей. Для характеристики структурно - механических свойств гидро-гелевых основ МЛФ были выбраны следующие показатели: эффективная вязкость и напряжение сдвига.

Выбор растворителя был осуществлен в процессе изучения набухания ареспола в различных растворителях: вода, вода-полиэтиленгликоль-400

(ПЭГ),пропиленгликоь(ПГ).

вода —■— водя ПЭГ-400 (90* 10) —А— «ода.ПЭМОО (80 20) | » вода.ПЭГ-400 (70 30) —Ж— пропилднгликоль____________|

Рис. 1. Кинетика набухания ареспола в различных растворителях. Из данных рис.1, видно, что ареспол относится к ограниченно набухающим полимерам о чем свидетельствует равновесное состояние системы, наступающее через 24 - 36 часов. ,

Полученные результаты показали, что изменение свойств растворителя при переходе от сильно полярного (вода) к менее полярному (ПГ) приводит к ухудшению процессов структурообразования. .

Важной характеристикой мазевых основ являются их структурно - механические свойства, которые могут быть описаны комплексом реологических параметров, таких, как предельное напряжение сдвига, тиксотропность и эффективная вязкость.

Изучение реологических свойств мазевых основ имеет большое теоретическое и практическое значение, так как они влияют на терапевтические и потребительские качества МЛФ.

Одним из основных фактором, влияющих на реологические свойства гелевых основ является концентрация полимера. Изменение концентрации полимера оказывало существенное влияние, как на величину эффективной вязкости, так и на глубину структурирующих процессов.

0 1гз концентрация,%

Рис.2. Зависимость эффективной вязкости гелевых основ от концентрации полимера при 9 об\сек.

Как видно из рис. 2.увеличение концентрации аресщша ведет к повышению эффективной вязкости у всех образцов, т.е. оптимальное" значение эффективной вязкости системы соответствует концентрации от 1% до 2%.

Для получения структурированных гидрогелевых сиЬтем необходима нейтрализация карбоксильных групп, присутствующих в аресполе. Нами изучена возможность получения гелей с использованием нейтрализующих агентов натрия гидроксида и триэтаноламина (ТЭА). Характер зависимости влияния степени нейтрализации гелей и типа нейтрализующего агента на их вязкостные характеристики представлен на рис. 3., который показывает, что

для гелей ареспола, нейтрализованных гидроксидом натрия полученные кривые отражают следующее: с увеличением величины рН от.-3,2 до "6,5 происходит резкое возрастание вязкости гелей - примерно в 5 раз для 1 % -ного геля. Интервал рН от 8,8-14,0 характеризуется заметным снижением вязкости гелей.

Кривая зависимости гелей, нейтрализованных ТЭА показывает, что в изучаемом интервале рН от 3,2-8,8 вязкость существенно увеличивается, а при дальнейшем изменении рН геля его вязкость изменяется незначительно. Включенный в состав геля ТЭА проявляет себя как нейтрализующий агент и позволяет получить гелевые основы с практически постоянными реологическими показателями в широком интервале значений рН (рис. 3.)

1 - гидрогель ареспола 1%, нейтрализованный ЫаОН,

2 - гидрогель ареспола 1% нейтрализованный ТЭА;

Рис. 3. Зависимость эффективной вязкости от рН среды.

Учитывая назначение геля гипораминав в процессе лечения вирусных поражений кожи на первой стадии заболевания, сопровождающейся зудом, болью, гиперемией и высыпаниями везикул, нами в состав.геля гипорамина введен ПГ, способствующий проникновению действующего вещества и обеспечивающий упруго-вязко-пластичные свойства лекарственной формы. В процессе изучения влияния концентрации ПГ на эффективную вязкость гелевых систем установлено, что увеличение количества ПГ от 10% до 30% приводит к снижению значений эффективной вязкости.

Для предотвращения высыхания мазевых основ и более мягкого воздействия на кожу в состав геля и линимента гипорамина включен глицерин. В ходе эксперимента установлено, что глицерин, введенной в состав геля в количестве 10% незначительно влияет на вязкостные характеристики лекарственных форм.

Для разработки оптимального состава линимента гипорамина изучалось влияние масла касторового (Oleum Ricini) в различных концентрациях на реологические показатели и структурную стабильность-гелевой основы. При оценке реологических параметров нами изучена зависимость эффективной вязкости гидрогеля ареспола от содержания масла касторового. Обнаружена линейная зависимость реологических свойств эмульсионной основы от концентрации ареспола и содержания масла. Чем меньше содержание масляной фазы, тем в большей степени повышается эффективная вязкость с повышением концентрации полимера (рис. 4,5).

1 2 3 : с'% •

Крнцмщмция полимере

1-10% масла касторового, 2-5% масла касторового, 3-0% масла касторового Рис 4 . Зависимость эффективной вязкости гидрогеля ареспола от содержания масляной концентрации полимера.

содержанием масла касторового

На основании проведенных исследований гидрогелевых систем арес-пола, типа нейтрализующего агента, содержания масляной фазы, были предложены следующие составы МЛФ гипорамина с учетом медико-биологических требований, предъявляемых современной медициной (таб.1).

.Таблица 1

Составы образцов геля и линимента гипорамина на основе ареспола.

Наименование компонента Нормативный документ Гель (г) Линимент (г))

Гипорамин ФСП 42-0171-2953-02 0,5 • 0,5

Ареспол ТУ 2219-005-29053342-97 1,5 1,5

Натрия гидроксид или Триэтаноламин ГФХ1 с.120 ТУ 6-09-2448-86 до-рН=5,5.-6,0

Пропиленгликоль ФС 42-1242-96 10,0 -

Глицерин ФС 42-2202-84 10,0 10,0

Твин-80 ФС 42-2540-88 - 1,0

Масло касторовое ГОСТ 18102-72 - 10,0

Кислота сорбиновая ТУ 6-22-5800146-358-92 0,2 ■• 0,2

Вода очищенная ФС 42-2619-97 До 100,0

С целью разработки оптимальной технологии геля и линименты были изучены их структурно-механические свойства.

Т, Па

Напряжение сдвига, Па Рис 5. Изучение структурно-механических свойств геля гипорамина 0,5 %

Т,Г1а

Напряжение сдвига, Па Рис.6. Изучение структурно-механических свойств линимента гйпорамина 0,5%

Кривые кинетики деформации геля и линимента гипорамина (рис. 6,7) с узкими «петлями гистерезиса» свидетельствует о малом времени релаксации напряжений и о слабом межмолекулярном взаимодействии. Присутствие восходящих и нисходящих кривых "петли гистерезиса" Свидетельствуют о том, что исследуемые образцы обладают слабыми тиксотропнымй свойствами, на основании которых можно предположить безболезненное нанесение на кожу. В результате экспериментальных исследований разработаны технологические схемы производства. *

Схема 1.Технологическая схема производства геля гипорамина 0,5%

В Р 1 1 Взвешивание ареспола, отмеривание растворителя

В. Р. 1.2 Взвешивание, растворение гипорамина и кислоты сорбино-вой

В Р.1. Подготовка лекарственных и вспомогательных веществ Дх Кт

В.Р.1.3 Приготовление нейтрализующего агента

Т.П. 1.1 Набухание ареспола

Т П 1.2 Нейтрализация ареспола до рН 5,5-6,0

Т.П. 1.3 Гомогенизация

Т.П.1. Приготовление гидрогеля ареспола Кт

Т.П 2 1 Введение раствора гипорамина и кислоты сорбиновой

Т.П 2.2.. Гомогенизация

УМО.1 Подготовка первичной и ВТОрИЧНОЙ упаковки

Т П.2. Приготовление геля гипорамина Кх Км

Отдел контроля качества

УМО 1.1 Фасовка, упаковка, маркировка

На склад готовой-продукции

Схема 2. Технологическая схема производства линимента Гипорамина

0,5% концентрации.

В.Р.1.1 Взвешивание ареспола, отмеривание растворителя

В Р 1 2 Взвешивание, растворение гипорамина и кислоты сорбино-вой

В Р. 1.3 Приготовление нейтрализующего агента

В Р. 1.4 Взвешивание масла касторового и твин-80

Т.П 1 1 Набухание ареспола

Т.П 1.2 Нейтрализация ареспола до рН 5,5-6,0

ТП.1.3 Гомогенизация

Т.П 2.3. Введение эмульгатора твин-80

Т.П 2.4 Гомогенизация

В.Р.4.1 Подготовка первичной и вторичной упаковки

В Р 1 Подготовка лекарственных и вспомогательных веществ Кх„ Кт

Т.П.1. Приготовление гидрогеля ареспола Кг

( / \

Т.П.2 1 Введение рас- Т.П.2 Приготовление

твора гипорамина и —_ линимента гипорами-

кислотысорбиновой на Кх, Км

— V У

Т П 2 2 Введение мас-

ляной фазы масляной

Отдел контроля качества

УМО 1 Фасовка, упаковка, маркировка

На склад готовой продукции ?

Количественное определение и идентификация таннинов в геле и линименте гипорамина методом ВЭЖХ.

Необходимо отметить, что согласно утвержденной Фармакопейной статье (ФСП 42-0171-2953-02) методика количественного.определения таннинов в гипорамине осуществляется спектрофотометрическим методом.

Для расчета содержания суммы таннинов в препарате используется разность коэффициентов удельного поглощения растворов казуаринина с алюминия хлоридом и без него (Е1 %/1см = 80,3) .

Содержание суммы таннинов в препарате гипорамина регламентируется не менее 60,0%. Ошибка единичного определения с 95% вероятностью составляет ± 5,76% Казуаринин является преобладающим таннином гипорамина.

УФ спектр казуаринина представлен на рис.7.

1. УФ - спектр казуаринина в спирте 70% (С=0,012мг/мл)

2. УФ - спектр казуаринина в спирте 70% (С=0,012мг/мл) +0,01г А1С1з.

Рис. 7. УФ спектры казуаринина.

Однако, экспериментальные исследования показали, нто данный метод количественного определения таннинов в МЛФ гипорамина неприемлем, в результате взаимодействия таннинов с вспомогательными веществами.

В результате неудовлетворительной оценки полученных данных при определении таннинов в геле и линименте спектрофотометрическим методом, нами был разработан метод ВЭЖХ.

При подборе хроматографических условий анализа использовали PCO казуаринина, полученный в лаборатории алкалоидов ВИЛАР.

На первом этапе был осуществлен поиск индивидуальных условий ВЭЖХ анализа субстанции гипорамина с целью его количественного определения. Хроматографические исследования проводились на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы Перкин Эльмер с диодно-матричным детектором в интервале длин волн от 190 до 365 нм. Управление, сбор и обработка хроматографической информации осуществлялись с помощью программно-аппаратного комплекса «Турбохром 4» (США). В работе использована стальная колонка размером 4,0x250 мм с обращенной фазой Диасфер-

110-С-8, размер зерен сорбента 5 мкм и предколонка Security Guard Cartridge С 18(2)(4хЗмм) (Phenomenex США).

Подготовка пробы при исследовании условий количественного анализа методом ВЭЖХ в гипорамине заключалась в растворении навески субстанции в 20% растворе метанола, подкисленного трифторуксусной кислотой до значения рН 2,5. Перед хроматографическим анализом пробу фильтровали через стеклянный фильтр с размером микропор 45 мкм.

Выбор длин волн детектирования основан на результатах исследования спектров поглощения субстанции гипорамина, представленных на рис.8.

Wavelength (nm)

1. Растворитель 20% метанол 2 Растворитель 15% ацетонитрил

Концентрация 0,1 мг/мл, длина кюветы 10мм.

Рис.8 .Спектр субстанции гипорамина.

Спектры субстанции гипорамина в 20% метаноле и 15% ацетоншриле представленные на рис. 7 и 8 совпадает. Имеется нечётко выраженный максимум поглощения в области 220 нм и плато с небольшим наклоном в области 260-280 нм. Предположительно, это связано с присутствием в данном образце соединений, максимум поглощения которых может лежать в области 255 нм (флавоноиды).

Исследуемый образец казуаринина был подвергнут хроматографиче-скому анализу. Полученная хроматограмма представлена на рис 9. Время удерживания казуаринина составляет 15,73 мин.

Относительное содержание основного компонента составляет 80%, сумма таннинов - 90%. Одновременно были получены и проанализированы спектры всех выявленных хроматографических пиков. На рис.10 представлен спектр хроматографического пика казуаринина.

Рис.9. Хроматограмма казуаринина

Рис.10. УФ спектр казуаринина

Спектр казуаринина имеет максимум поглощения в области 276 ± 1 нм. Отсутствие поглощающих примесей позволяет выбрать длину волны 275 нм

для исследования остальных образцов. На рис.11. представлена хромато-грамма субстанции гипорамина. Времена выхода и спектры поглощения PCO казуаринина и субстанции гипорамина совпадают. Это даёт основания для идентификации препарата по казуаринину

Условно компоненты субстанции на хроматограмме можно разделить на 3 группы. Первая - высокополярные соединения, например, галловая кислота, относительное содержание которой составляет 0,75%, и др. Их общее количество составляет 5,11%.

Во второй группе находятся соединения таниновой природы, где относительное содержание казуаринина составляет 21,51%.

К третьей группе относятся менее полярные соединения - флавоноид-ной природы, относительное содержание которых составило 25,72%. Суммарное содержание таннинов составило 64,94%.

58848 Si ftiTT 1

1

Концентрация 0,9 мг/мл. Длина волны детектора 275 нм.

Рис. 11. Хроматограмма субстанции гипорамина

1. Флавоноиды; 2. Таннины Рис 12. Спектры поглощения основных компонентов субстанции гипора-

мина.

На рис.12 приведены спектры хроматографических пиков основных компонентов субстанции. В первую группу вошли соединения флавоноидной природы, вторую группу составляют таннины. Полученная информация была использована для приведённой выше идентификации компонентов субстанции.

Определение содержания суммы таннинов в геле и линименте ги-порамина.

На втором этапе определяли содержание суммы таннинов в геле и линименте. При подготовке пробы для анализа геля и линимента 250 мг (точная навеска) исследуемого образца помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл прибавляли 20 мл метанола, доводили до метки тем же растворителем и после перемешивания фильтровали через стеклянный фильтр с размером пор 45 мкм. Аликвотную часть надосадочной жидкости подвергали хромато-графическому анализу.

Вместимость петли инжектора 10 мкл. Скорость элюирования 1000 мкл/мин. Подвижная фаза ацетонитрил/вода (рН2, ФУ). Градиент ацетонит-рила от 5 до 38% в течение 40 мин. Длина волны детектора 275 нм.

Типичная хроматограмма представлена на рис.13 где .показано отсутст-- вие целевых компонентов и мешающих пиков.

Спектры основных компонентов М.Л.Ф. гипорамина-представлены на рис. 16.

200 тУ

сЫ

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 И 15 16 17 18 мш Рис. 13. Хроматограмма «Плацебо»

Как видно из опытов по выявлению мешающих пиков и чистоты используемого вспомогательного сырья в области выхода таннинов (11-17мин) отсутствуют какие-либо поглощающие соединения. Кроме того, показано, что такая подготовка пробы достаточна для количественного определения таннинов в лекарственных формах.

Условия ВЭЖХ определения суммы таннинов в геле и линименте.

Для определения содержания суммы таннинов в лекарственных формах был разработан отдельный метод ВЭЖХ с использованием градиентного элюирования, который позволяет установить подлинность препарата по содержанию в нем казуаринина и других таннинов.

Типичная хроматограмма геля и линимента гипорамина, представлены на рис 14 и 15. Анализ спектров поглощения в интервале 200-330 нм показал, что казуаринин имеет чётко выраженный максимум поглощения в области 277 нм.

Рис.16. Спектры основных компонентов МЛФ гипорамина.

Построение калибровочных графиков.

Для количественного определения суммы таннинов был применён метод абсолютной градуировки, рис.17.

Установлено, что в области рабочих концентраций определяемых веществ наблюдается линейная зависимость площади пика от содержания определяемого компонента в испытуемом растворе. Оказалось, что сред-неквдратичное отклонение (СКО) = 4,62 %, коэффициент корреляции Я = 0,99991. Из приведённых данных видно, что СКО в нашем случае достаточно высокое.

Поэтому были спланированы и реализованы эксперименты по определению суммы таннинов методом добавок.

I

I

ЗД\*£

«шо

30000 -

¡0000 -

10090 -

0--1--1-1-1-1-1-1-1

ОВ 0.1 ОД 0.3 0.( С,%

Рис. 17. Калибровочный график для определения суммы таининов.

По оси ординат - суммарная площадь пиков таннинов на хроматограмме 8,мВмин) По оси абсцисс - концентрация суммы таннинов (С, %)

Таблица 2

Результаты количественного определения суммы таннинов в геле и линименте гипорамина. п=3, Р=0,95% • _

Фактически обнаружено

Содержание действующих Гель Линимент

веществ г/100г г/100г % г/100г %

Казуаринин 0,0105 0,1030 0,1010 0,1064 98,10 96,19 101,33 0,1066 0,1046 0,1054 101,57 99,61 100,39

Сумма таннинов 0,320 0,310 0,320 0,326 97,85 100,00 101,88 0,31398 0,32000 0,31312 98,12 100,00 97,85

Из табл. 2 следует, что с помощью ВЭЖХ можно определять количественное содержание казуаринина и сумму таннинов в модельной смеси препарата с относительной погрешностью определения не более 4,0 % при доверительной вероятности 95%. Метрологические характеристики методики количественного анализа суммы таннинов рассчитывались из результатов анализа геля и линимента гипорамина. Относительные ошибки единичного определения в 10 независимых измерениях одного образца приведены в табл.3.

Таблица 3

Метрологические характеристики методики количественного анализа сум^ы таннинов в геле и линименте гипорамина

Лекарственная форма Компонент Г X в2 в Р 1(Р,0 Дх е

Гель Сумма таннинов 9 0,00002 0,0714 0,0050 95% 2,26 о.опз 3,59%

Линимент Сумма таннинов 9 0,00003 0,0775 0,0054 95% 2,26 0,0121 3,84%

Достоверность предлагаемой методики определения суммы таннинов проверялась опытами с «добавками» компонентов - стандартных образцов. Экспериментальные данные представлены в табл. 4.

Таблица 4.

Результаты опытов с добавками.

Исходное содержание компонента мг Добавлено компонента мг Расчётное содержание, мг Фактически обнаружено, мг Относительная ошибка %

0,300 0,050 0,350 0,356 +1.6

0,100 0,400 0,393 -1,7

0,150 0,450 0,443 -1,5

Как следует из результатов, представленных в табл.4, относительная ошибка определений с добавками находится в пределах случайной ошибки разработанной методики, свидетельствует об отсутствии систематической ошибки методики.

Разработанные гель и линимент гипорамина при проведении доклинических исследований на лабораторных животных легко наносятся и равномерно распределяются на коже. Токсикологические исследования показали хорошую переносимость, отсутствие местнораздражающего и сенсибилизирующего действия.

Изучение стабильности разработанных

МЛФ гипорамина при длительном хранении проводили с помощью физико - химических, химических, микробиологических методов анализа. В момент изготовления образцов геля и линимента гипорамина 0,5 % концентрации и далее через 6 мес, 1 год, 1 год и 6 мес., 2 года и 2 года и 3 мес. МЛФ гипорамина контролировали визуально, определяли подлинность, количественное содержание гипорамина, значения рН водных вытяжек и микробиологическую чистоту. Изменение концентрации гипорамина укладывается в ошибку методики количественного определения. Внешний вид, запах, значения рН, микробиологическая

чистота геля и линимента, соответствуют требованиям ГФ XI изд. вып.2 и Изменению №3 «Методы микробиологического контроля лекарственных средств от 19.06.03. Результаты анализа препаратов в процессе хранения свидетельствуют о стабильности разработанных МЛФ гипорамина в течение 2-х лет.

Данные экспериментальных исследований геля и линимента гипорамина могут служить основанием для проведения клинических испытаний лекарственных препаратов при лечении вирусных поражений кожи.

Общие выводы

1. На основании изучения физико-химических, структурно-механических и технологических свойств субстанции гипорамина и ареспола, разработаны составы и технология геля и линимента гипорамина.

2. Методом равновесного диализа через полупроницаемую мембрану выбрана гидрофильная полимерная основа ареспол, обладающая; осмотическими свойствами и обеспечивающая пролонгированное действие препарата, а также способствующая оттоку экссудата и очищению раневой поверхности.

3.На основании изучения реологических параметров МЛФ методом ротационной вискозиметрии установлена зависимость структурно - механических свойств препаратов от концентрации полимера, физико-химической природы растворителя, рН раствора, присутствия масла касторового и твина - 80.

4. Впервые разработана методика определения содержания суммы танни-нов в субстанции и лекарственных формах гипорамина с использованием метода ВЭЖХ. Предварительно осуществлен выбор индивидуальных условий ВЭЖХ анализа субстанции гипорамина с целью количественного определения суммы таннинов, а также идентификации сопутствующих веществ. Метод ВЭЖХ обеспечивает высокую точность результатов определения.

5. Осуществлен контроль качества геля и линимента гипорамина по основным показателям, установлен срок годности - 2 года.

6.Проведенные токсикологические исследования показали хорошую переносимость геля и линимента лабораторными животными, отсутствие местноразд-ражающего и сенсибилизирующего действия. .

7 На основании проведенных исследований разработаны; проект фармакопейной статьи предприятия и опытно - промышленный регламент на производство геля гипорамина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Джавахян М.А., Охотникова В.Ф., Сокольская Т.А. Фит<5препарат противовирусного действия. Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции // Сборник научных трудов, .вып. 59.- Пятигорск, 2004. -С. 80- 81.

2. Джавахян М.А., Охотникова В.Ф., Сокольская Т.А. Противовирусный гель наружного применения. Генетические ресурсы лекарственных и ароматических растений // Материалы международной научной конференции, посвященной

памяти профессора Алексея Ивановича Шретера.- Сборник научных трудов ВИЛАР. - Москва, 2004 .- Т.1.-С.271-273.

3. Джавахян. М.А., Охотникова В.Ф., Сокольская Т.А. Разработка состава и технологии геля гипорамина // Тез.докл. XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва,2004.-С.782.

4. Семкина O.A., Суслина С.Н., Джавахян М.А. Сравнительное изучение реологических параметров редкосгаитых акриловых полимеров // Материалы III Российской научно - практической конференции РАЕН «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов». - Москва, 2005.- С. 91-92.

5. Джавахян М.А., Семкина O.A., Охотникова В.Ф. Разработка состава и технологии линимента гипорамина // Материалы III Российской" научно - практической конференции РАЕН «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов». - Москва, 2005.- С. 92-93.

6. Семкина О.А, Джавахян М.А., Левчук Т.А., Гагулашвили Л.И., Охотникова В.Ф. Вспомогательные вещества, используемые в технологии мягких лекарственных форм (мазей, гелей, линиментов, кремов) (Обзор) // Химико-фармацевтический журнал.-2005,- №9,- С.45-48.

Принято к исполнению 09/12/2005 Заказ № 1370

Исполнено 09/12/2005 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (095) 975-78-56 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru

"?5786

РНБ Русский фонд

2006-4 30106

i i

Лечение вирусных заболеваний является одной из наиболее сложных и актуальных проблем современной медицины, несмотря на значительные достижения, в области их терапии. В Резолюции IV Международного конгресса «Народная медицина России - прошлое, настоящее» было отмечено, что уровень смертности от инфекционных заболеваний возрос в 2003 году по сравнению с предыдущим годом на 6,8%.

Несмотря на ряд мероприятий по борьбе с гриппом, включающих профилактические прививки, противоэпидемические меры и раннюю терапию грипп занимает одно из первых мест по количеству людей, вовлеченных в эпидемический процесс и опасен рядом осложнений, вызванных данным заболеванием.

В арсенале лекарственных средств против гриппа, имеются живые и инактивированные вакцины, этиотропные противовирусные средства, действие которых направлено на возбудителя инфекции с учетом их точек приложения в цикле репродукции вирусов, противогриппозный человеческий иммуноглобулин, интерфероны. Однако, справиться с ростом инфекционных заболеваний особенно трудно в эпидемиологический период. Следует отметить, что повышение числа вирусных инфекций, как правило, связано со снижением иммунной системы. Одним из радикальных средств является вакцинопрофилактика населения, но при этом существуют различные трудности массовой вакцинации. Прежде всего, способность вирусов модифицироваться в организме и преодолевать иммунитет к предыдущим штаммам, невозможность проведения вакцинации в короткие сроки (оптимальное время проведения с октября до середины ноября), массовые отказы от профилактических мероприятий (23,27, 145,166).

К наиболее изученным химиотерапевтическим препаратам для профилактики и лечения гриппа относятся ремантадин и амантадин. На основе ремантадина создан новый препарат Полирем, представляющий собой его полимеризованную форму, действие которого аналогично ремантадину и его производным (86).

Недостатком этих препаратов является наличие терапевтического эффекта только на ранних стадиях заболевания при гриппе А и отсутствие эффективности при гриппе В. Кроме того, их широкое применение приводит к возникновению ремантадинустойчивых штаммов вируса гриппа А.

Следует отметить, что в настоящее время серьезную медико-социальную проблему представляют и герпесвирусные инфекции для многих стран мира, в том числе и для России.

По данным ВОЗ представители семейства вирусов простого герпеса человека поражают 60-95% населения, как в развитых, так и в развивающихся странах.

Герпесвирусные заболевания протекают как тяжелейшие осложнения у больных с пониженным иммунитетом и занимают второе место после гриппа.

Известно, что при лечении герпеса химиотерапевтическими средствами снижается иммунная система организма, а также их применение нежелательно в связи с их высокой токсичностью. Поэтому возрос интерес к лекарственным препаратам растительного происхождения, которые имеют ряд преимуществ перед синтетическими и занимают ведущее место в профилактике и лечении различных заболеваний. Терапевтический эффект препаратов на основе лекарственного растительного сырья обусловлен высокой концентрацией биологически активных веществ.

Работы ученых в последние годы убедительно доказали, что лечебный эффект фитопрепаратов определяется действием не только основного вещества, но часто и всей композицией веществ, содержащихся в растении; алкалоидами, флавоноидами, сапонинами, витаминами, минеральными солями, микроэлементами, таннинами. Наряду с широким спектром действия они обладают хорошей переносимостью и отсутствием побочных эффектов, возможностью сочетания с различными химиотерапевтическими препаратами, отсутствием аллергических реакций. Все перечисленные преимущества фитопрепаратов делают возможным их использование для всех возрастных групп населения.

Учеными ВИЛАР разработан оригинальный противовирусный препарат гипорамин, представляющий собой сухой, очищенный экстракт, выделенный из листьев облепихи крушиновидной / Шрроркае rhamnoid.es Ь / семейства лоховы х / Eleagnaceae / (30).

В лаборатории антимикробных средств ВИЛАР проведены исследования гипорамина в отношении различных штаммов, в том числе эпидемических, вируса гриппа А и В, аденовирусов, парамиксовирусов, герпеса и ВИЧ-инфекции. Кроме того, изучен антимикробный спектр гипорамина в отношении патогенных бактерий и грибов. Данные экспериментальных исследований показали, что гипорамин обладает противовирусной активностью в отношении широкого спектра патогенных РНК и ДНК содержащих вирусы гриппа А и В, герпеса, аденовирусов, парамиксовирусов, ряда болезнетворных микроорганизмов и обладает при этом интерферониндуцирующим свойством (135,136,137,138, 140).

Решение проблемы создания высокоэффективных мягких лекарственных форм (МЛФ) для лечения заболеваний вирусной этиологии осуществляется в настоящее время с учетом клинической картины и стадии заболевания, локализации очага поражения, использования новых вспомогательных веществ, с целью усиления лечебного действия. Включение редкосшитых акриловых полимеров (РАП) в качестве стрктурообразователя мазевых основ способствует получению стабильных лекарственных форм. (1,2,4,6)

Поэтому разработка и создание новых высокоэффективных лекарственных форм гипорамина с использованием отечественных вспомогательных веществ является актуальной.

Цель и задача исследования:

Целью настоящего исследования является разработка научно-обоснованных составов, технологии и методов стандартизации геля и линимента гипорамина для лечения вирусных инфекций.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• теоретически и экспериментально обосновать оптимальный состав и технологию геля и линимента гипорамина;

• провести комплексные исследования по изучению технологических, физико-химических и биофармацевтических свойств геля и линимента;

• разработать методики подлинности и количественного определения биологически активных веществ в лекарственных формах гипорамина1 с целью их стандартизации и установления сроков годности;

• провести доклинические исследования по безопасности геля и линимента;

• на основании полученных результатов составить Фармакопейную статью предприятия (ФСП) и опытно-промышленный регламент (ОПР) на гель гипорамина.

Научная новизна исследований.

• Разработаны технологии получения оригинального, отечественного геля и линимента гипорамина, обладающего противовирусным действием.

• Экспериментально обоснован выбор вспомогательных веществ различных физико-химических свойств, влияющих на технологию и качество мягких лекарственных форм гипорамина.

• Проведено комплексное исследование геля и линимента гипорамина с использованием технологических, физико-химических, и биофармацевтических методов исследования с целью стандартизации препарата и установления сроков его годности.

• Впервые разработаны методики подлинности и количественного определения биологически активных веществ в лекарственных формах гипорамина методом ВЭЖХ.

Практическая значимость полученных результатов.

На основании экспериментальных исследований разработаны:

• лекарственные формы гипорамина наружного применения, для лечения и профилактики заболеваний, вызванных герпесвирусными инфекциями;

• методики подлинности и количественного определения действующих веществ в геле и линименте гипорамина;

• проект ФСП на гель гипорамина;

• ОПР по наработке опытных партий геля гипорамина. Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы и результаты исследований представлены и изложены на Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (2004г.), Международной научной конференции «Генетические ресурсы лекарственных и ароматических растений» (2004г.), 59-й региональной конференции по фармации и фармакологии, Пятигорск, (2004г.), Научно - практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» РАЕН, (2005г.)

На защиту выносятся:

• результаты исследования по обоснованию составов и технологий геля и линимента гипорамина, предназначенных для профилактики и лечения вирусных инфекций; результаты проведения комплексных исследований с использованием физико-химических, реологических и биофармацевтических методов по оценке качества мягких лекарственных форм гипорамина; результаты по разработке методик подлинности и количественного определения биологически активных веществ (БАВ) в геле и линименте гипорамина. результаты изучения стабильности и условий хранения лекарственных форм гипорамина для обоснования сроков годности; результаты доклинического изучения биологической безопасности МЛФ;

Общие выводы

1. На основании изучения физико-химических, структурно-механических и технологических свойств субстанции гипорамина и ареспола, разработаны составы и технология геля и линимента гипорамина.

2. Методом равновесного диализа через полупроницаемую мембрану выбрана гидрофильная полимерная основа ареспол, обладающая осмотическими свойствами и обеспечивающая пролонгированное действие препарата, а также способствующая оттоку экссудата и очищению раневой поверхности.

3. На основании изучения реологических параметров МЛФ методом ротационной вискозиметрии установлена зависимость структурно -механических свойств препаратов от концентрации полимера, физико-химической природы растворителя, рН раствора, присутствия масла касторового и твина - 80.

4. Впервые разработана методика определения содержания суммы таннинов в субстанции и лекарственных формах гипорамина с использованием метода ВЭЖХ. Предварительно осуществлен выбор индивидуальных условий ВЭЖХ анализа субстанции гипорамина с целью количественного определения суммы таннинов, а также идентификации сопутствующих веществ. Метод ВЭЖХ обеспечивает высокую точность результатов определения.

5. Осуществлен контроль качества геля и линимента гипорамина по основным показателям, установлен срок годности — 2 года.

6. Проведенные токсикологические исследования показали хорошую переносимость геля и линимента лабораторными животными, отсутствие местнораздражающего и сенсибилизирующего действия.

7. На основании проведенных исследований разработаны проект фармакопейной статьи предприятия и опытно - промышленный регламент на производство геля гипорамина