Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Проточные методы анализа в контроле качества, производстве и биофармацевтических исследованиях аминосодержащих лекарственных веществ

На правах рукописи

Гармонов Сергей Юрьевич

ПРОТОЧНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА В КОНТРОЛЕ КАЧЕСТВА, ПРОИЗВОДСТВЕ И БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ АМИНОСОДЕРЖАЩИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ

15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 2004

Работа выполнена на кафедре аналитической химии, сертификации и менеджмента качества Казанского государственного технологического университета

Научные консультанты:

Доктор химических наук, профессор Евгеньев Михаил Иванович Академик РАЕН, доктор медицинских наук Зыкова Ирина Евгеньевна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор Нестерова Ольга Владимировна Доктор химических наук, профессор Солдатенков Анатолий Тимофеевич Доктор фармацевтических наук, профессор Саломатин Евгений Михайлович

Ведущая организация:

Центр по химии лекарственных средств - Всероссийский научно-исследовательский химико-фармацевтический институт (г. Москва)

Защита состоится

2004 г. в

часов на

заседании диссертационного совета Д 212.203.13 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан.

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат фармацевтических наук, доцент

Лагуткина Т.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Соединения с аминными функциональными группами представляют собой важные классы лекарственных веществ (ЛВ) и находят широкое применение в медицинской практике как эффективные препараты с разнообразной фармакологической активностью. Многокомпо-нентность технологических смесей синтеза и лекарственных форм, токсичность многих из них при незначительном нарушении дозировки, а также генетическая детерминированность и индивидуальная вариабельность процессов их биотрансформации в организме человека требуют применения избирательных, чувствительных методов определения этих ксенобиотиков в лекарственных формах и биологических жидкостях организма человека.

В последнее десятилетие в анализе лекарственных веществ, наряду с развитием высокоэффективной жидкостной, тонкослойной хроматографии и других физико-химических методов, наблюдается тенденция к использованию таких аналитических систем, как проточно-инжекционный анализ (ПИА) и тест-методы. Этому способствовали такие их преимущества, как простота технического исполнения, высокая производительность, надежность и экономичность определений, возможность получения большого объема аналитической информации. Проточные методы анализа все чаще используются для оценки основных параметров, определяющих качество лекарств - их безопасности и эффективности применения.

Проблемой, ограничивающей применение проточных методов в биофармацевтическом анализе, является избирательность и чувствительность детектирования определяемых соединений. Это связано со сложным составом анализируемых матриц при низких содержаниях аналита, а также со спецификой значительной части ЛВ и их метаболитов, имеющих высокую полярность, слабовыраженные хромофорные, электрофорные или флуорофор-ные свойства. Кроме того, измерение аналитического сигнала в неравновесных условиях, когда физические и химические процессы в потоке не завершены, вызывает необходимость быстрого изменения аналитических свойств ЛВ за время движения определяемого соединения к детектору. Использование большей части реакций дериватизации аминосоединений из-за низкой специфичности взаимодействия и реакционной способности реагентов существенно ограничивает возможности проточного анализа ЛВ.

В то же время существует потребность в применении таких доступных аналитических систем, которые можно использовать в режиме проточного анализа для селективных и чувствительных определений аминосодержащих ЛВ в сложных по составу смесях без их разделения.

В этом плане важна разработка неинвазивных, простых в экспериментальном отношении и высокопроизводительных аналитических методов для исследований полиморфизма генетически детерминированных биохимических процессов, что чрезвычайно необходимо в осуществлении ранней до-симптоматической диагностики заболеваний,

>>ОС НАЦИОНАЛЬНАЯ

библиотека | СПекрбт' еп 1 оа тоо^мт^^ |

2004-4 25076

канцерогенеза и индивидуальной химической чувствительности организма человека.

Цель работы заключается в развитии научных основ и систематизации применения проточного анализа в фармацевтической химии для создания комплекса экспрессных, высокочувствительных, избирательных и производительных проточно--инжекционных, хроматографических и тест-методов для контроля качества лекарственных препаратов, фармацевтического производства и биофармацевтических исследований, а также оценки генетически детерминированных процессов биотрансформации аминосодержащих лекарственных веществ.

Для достижения этой цели были решены следующие задачи:

- обоснование путей повышения избирательности и чувствительности определения лекарственных веществ, содержащих аминные функциональные группы, в равновесных и неравновесных условиях;

- выявление факторов, обеспечивающих чувствительность и избирательность определений ЛВ в проточных системах: проточно-инжекционном анализе, высокоэффективной жидкостной и тонкослойной хроматографии, тест-методах, установление взаимосвязи между физико-химическими параметрами проточных систем и аналитическими свойствами ЛВ, изучение влияния компонентов анализируемой матрицы на регистрируемый в потоке сигнал;

- разработка тест-систем и автоматизированных средств для определения в потоке токсичных соединений в технологических смесях, воздушной среде и сточных водах фармацевтических производств, определение критериев выбора используемых при этом хромогенных реакций, условий проведения аналитических определений, изучение метрологических характеристик методик;

- создание методических основ количественных измерений спектральных характеристик селективных слоев в тест-методах для контроля безопасности технологических процессов и персонала химико-фармацевтических производств;

- разработка неинвазивных, избирательных и чувствительных аналитических методов фенотипической оценки генетически детерминированных процессов биотрансформации ЛВ по типу ацетилирования, обоснование их использования для оптимизации фармакотерапии, обеспечения безопасности и оценки риска при работе с экотоксикантами;

- практическое использование разработанных проточно-инжекцион-ных, хроматографических, спектрофотометрических методик для контроля качества и производства лекарственных препаратов, а также биофармацевтических исследований аминосодержащих ЛВ и выработка на этой основе рекомендаций по совершенствованию применения лекарственных средств.

Диссертационная работа выполнялась при поддержке Международного научно-технического центра (ISTC Projects # 498, 1517, 1891), Российского фонда фундаментальных исследований (проект 03-03-96013-р2003а), Акаде-

мии наук Республики Татарстан (проекты 19-01/2000 (Ф), 07-7.5-86/2001 (Ф), 09-9.7-13/2001 (Ф), 09-9.2-112/2003 (Ф)), ISSEP (1999,2000,2001 г.).

Научная новизна:

- на основании систематического исследования аналитических реакций ЛВ, содержащих аминные функциональные группы, выявлены факторы повышения избирательности и чувствительности определений аналитов в равновесных и неравновесных условиях;

- обоснованы выбор и условия использования проточных методов для избирательных и чувствительных определений аминосодержащих ЛВ различного спектра фармакологического действия в биологических жидкостях, технологических смесях и многокомпонентных лекарственных формах;

- обоснованы и установлены условия аналитических определений в проточно-инжекционном анализе ЛВ, выработаны критерии выбора аналитических реагентов при дериватизации биологически активных аминосоедине-ний различных классов и компонентов их промышленного синтеза;

- выявлен характер влияния состава потока, физико-химических характеристик растворителей и компонентов анализируемых сред на избирательность и чувствительность определений ЛВ в проточных системах на основе использования приема кинетического регулирования;

- показана возможность использования тест-методов и автоматических средств аналитического контроля для оценки безопасности и качества технологических процессов и персонала химико-фармацевтических производств, предложены методические приемы количественных измерений спектральных характеристик селективных слоев тест-средств;

- установлены рабочие условия проточно-инжекционных, хроматогра-фических, линейно-колористических, спектрофотометрических определений аминосодержащих ЛВ и исходных компонентов их синтеза, а также продуктов метаболических превращений в сложных по составу анализируемых матрицах;

- разработаны неинвазивные, избирательные и чувствительные методы оценки скорости генетически детерминированных процессов биотрансформации ЛВ по типу ацетилирования, обосновано их использование для оптимизации фармакотерапии, обеспечения безопасности и оценки риска при работе с экотоксикантами;

- изучена фармакокинетика и биотрансформация диуцифона и фосфа-бензида, получены данные по индукции ^ацетилтрансферазы.

Практическая значимость. Выявлены и обоснованы новые области применения проточных методов анализа в фармацевтической химии для контроля качества, технологических процессов и безопасности фармацевтических производств, биофармацевтических исследований аминосодержащих лекарственных препаратов.

Разработаны экспрессные и чувствительные методики избирательного проточно-инжекциониого, хроматографического, спектрофотометрического, тест-определения ряда аминосодержащих лекарственных веществ химиоте-

рапевтического, анальгезирующего, антиаритмического, иммуномодули-рующего и психотропного действия в реакционных смесях, лекарственных формах, биологических жидкостях человека.

В клинических и производственных условиях апробированы методики определения гидразидов кислот, сульфаниламидов, замещенных триптамина, производных п-аминобензойной и п-аминосалициловой кислот, диаминоди-фенилсульфона, ариламинов, гетероциклических аминов как в различных биологических жидкостях, полученных у пациентов в процессе терапевтического мониторинга, так и в готовых лекарственных формах и постадийном контроле производства.

Результаты исследования метаболических превращений диуцифона и фосфабензида в организме пациентов и их фармакокинетики использованы для оптимизации безопасного и эффективного клинического использования этих новых лекарственных средств.

Разработан комплекс неинвазивных методов определения типа генетически детерминированных процессов ацетилирования в организме человека при использовании гидразида изоникотиновой кислоты и сульфадимезина в качестве тест-препаратов. Методы рекомендованы и апробированы при оптимизации безопасной дозировки лекарственных веществ, оценки риска интоксикации, побочных явлений при фармакотерапии, а также установления показателей адаптации организма к интенсивной мышечной деятельности.

Результаты работы используются при проведении аналитического контроля (ОАО Татхимфармпрепараты", ФГУП ФНПЦ "ГК1ШП им. В.И. Ленина", Казанская академия ветеринарной медицины), в фармакокинетических исследованиях (Казанский государственный медицинский университет), биохимических исследованиях функционального состояния спортсменов, оценке степени их тренированности (Казанский государственный педагогический университет), для обеспечения экологической безопасности личного состава (Министерство обороны РФ) и внедрены в лечебную практику Республиканского клинического противотуберкулезного диспансера (Казань), Республиканской клинической больницы Татарстана, Казанской городской клинической больницы № 6, детской городской клинической больницы №9 им. Г.Н Сперанского (Москва).

Экспериментальные результаты и выводы на их основе использованы в учебном процессе Казанского государственного технологического университета в дисциплинах "Контроль качества лекарственных препаратов", "Экологический мониторинг" и Казанского государственного медицинского университета в последипломном образовании провизоров.

На защиту выносится: • Результаты исследования и подбор оптимальных условий проведения аналитических определений аминосодержащих лекарственных веществ в проточных системах (проточно-инжекционный анализ, тест-методы, высокоэффективная жидкостная и тонкослойная хроматография).

• Обоснование роли растворителя и компонентов анализируемой матрицы в формировании аналитического сигнала при определениях аминосодержа-щих лекарственных веществ в виде их производных в равновесных и неравновесных условиях.

• Результаты изучения влияния состава потока и его гидродинамических параметров, рН, свойств используемого реагента и определяемого вещества на выбор условий избирательного и чувствительного детектирования ЛВ и компонентов их синтеза в системе проточно-инжекционного анализа, высокоэффективной жидкостной и тонкослойной хроматографии.

• Методики проточно-инжекционного, хроматографического и спектрофо-тометрического определения гидразидов кислот, сульфаниламидов, производных n-аминобензойной и n-аминосалицшювой кислот, замещенных триптамина, диаминодифенилсульфона, n-аминофенола, офениленди-амина, гетероциклических аминов в промышленных и модельных смесях, лекарственных формах и биологических жидкостях.

• Способы определения фенотипа ацетилирования при изучении фармако-кинетики тест-препаратов сульфадимезина и изониазида в слюне и моче пациентов и результаты их применения в клинических условиях, а также в режиме профессиональной спортивной деятельности.

• Данные по индукции N-ацетилтрансферазы при клиническом использовании ряда лекарственных препаратов.

• Данные по фармакокинетике и метаболизму диуцифона и фосфабензида в организме человека.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Ш - V Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, 1996, 1997, 1998), I Съезде Российского научного общества фармакологов (Волгоград, 1995), Международной конференции "Neurochemistry and Pharmacology of Drug Addiction and Alcoholism" (С.-Петербург, 1996), Всероссийской конференции "Экоаналитика-96" (Краснодар, 1996), Всероссийской конференции "Мутагены и канцерогены окружающей среды. Проблемы антимутагене-за'1 (Казань, 1996), II конгрессе "Традиционная медицина. Теоретические и практические аспекты" (Чебоксары, 1996), Российском научно-практическом семинаре "Современное состояние теории и практического применения метода ТСХ" (Москва, 1996), Межвузовской конференции "Актуальные проблемы современной фармакотерапии" (Саратов, 1996), Международной конференции "Современные пути развития гомеопатии и проблемы создания рациональных лекарственных форм" (Пятигорск, 1996), II Международном конгрессе "European Association for Clinical Pharmacology and Therapeutics" (Берлин, 1997), XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (С.-Петербург, 1998), III Всероссийской конференции "Экоаналитика - 98" (Краснодар, 1998), V Международной конференции "Наукоемкие химические технологии" (Ярославль, 1998), II Всероссийском симпозиуме «Проточный химический анализ» (Москва, 1999), V Всероссийской конференции

"Электрохимические методы анализа" (Москва, 1999), Поволжской региональной конференции (Казань, 1999), Региональной конференции "Методы аналитического контроля материалов и объектов окружающей среды" (Пермь, 2001), Поволжской конференции по аналитической химии (Казань, 2001), Всероссийском симпозиуме 'Тест-методы химического анализа" (Москва, 2001), Научно-практической конференции "Окружающая среда и здоровье" (С.-Петербург, 2001), 28 Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001), V Всероссийской конференции "Экоаналитика-2003" (С.-Петербург, 2003), XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003), итоговых научных конференциях КГТУ (Казань, 1994 -2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 31 статья, 6 учебных пособий и методических указаний, 35 тезисов докладов и получен 1 патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; литературного обзора; четырех глав экспериментальной части, в которых описана аппаратура, объекты, техника эксперимента и изложены результаты с их обсуждением; выводов; заключения и списка цитируемой литературы. В приложении представлены акты использования разработанных аналитических методик.

Диссертация изложена на 264 страницах, содержит 50 рисунков, 53 таблицы и библиографию 425 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Проточно-инжекционные (ПИ) определения проведены с использованием обращенного варианта одноканального проточно-инжекционного анализатора с плунжерным насосом Dl (Mickrotechna) и проточной кюветой объемом 6 мкл с длиной оптического пути 0,5 см. В качестве детектора применяли спектрофотометр Specol-210 (Karl Zeiss Yena). Регистра граммы записывали на самописце TZ-4100. В качестве инжектора использовали шестихо-довой кран (Mickrotechna) с калиброванной петлей объемом ПО мкл. Проточные коммуникации выполнены из тефлоновых трубок с внутренним диаметром 0,6 мм. Длина реакционной спирали составляла 2,5 м.

Хроматографические определения проводили с использованием системы HP-1100 с диодно-матричным детектором (Hewlett-Packard, Waldbronn, FRG). Тонкослойная хроматография выполнена на пластинках Силуфол УФ-254.

Спектрофотометрические измерения проведены на спектрофотометрах СФ-26 и Specol-210. Потенциометрические измерения выполнены на электронном рН-милливольтметре MV-87S (Германия).

Все соединения промышленного изготовления, а также используемые органические растворители при необходимости подвергали дополнительной очистке по известным методикам.

Лекарственные вещества: изониазид, апрессин, фосфабензид, ксиме-дон, анестезин, новокаин, новокаинамид, л-аминосалицилат натрия, стрептоцид, норсульфазол, сульфадимезин, сульфапиридазин, сульфодиметоксин, сульфацил-натрий, сульфален, сульгин, фталазол, букарбан, церукал, фуро-семид, дигидралазин, диафенилсульфон, солюсульфон, диуцифон, серотони-на адипинат, мексамин, мелатонин, новокаиновая, натриевая, калиевая, дибензилэтилендиаминовая соли бензилпенициллина, а также лекарственные формы вышеперечисленных соединений - фармакопейной чистоты.

Биологические жидкости (плазма крови, цельная кровь, эритроцитар-ная масса) предоставлены станцией переливания крови Республики Татарстан; образцы мочи и слюны, в некоторых случаях крови, получены у пациентов Казанской городской клинической больницы № 6 и медсанчасти Казанского филиала военного артиллерийского университета, а также спортсменов факультета физической культуры Казанского государственного педагогического университета.

2. ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ АМИНОСОДЕРЖАЩИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ

Эффективность использования реакций получения производных ЛВ в проточных системах предусматривает выполнение определенных требований по реакционной способности аналитических реагентов и спектральным свойствам образующихся производных. Для аминосодержащих ЛВ это возможно только в случае использования определенных классов электрофильных реагентов. В свою очередь, аналитические реакции, протекающие в растворах, должны испытывать влияние природы растворителя и компонентов реакционной смеси как на спектральные свойства образующихся производных, так и на скорость их образования. Важность состава используемых сред определяется также растворимостью анализируемых ЛВ, их производных и компонентов лекарственных форм.

Сравнительное сопоставление существующих аналитических подходов позволило выявить перспективу использования в ПИА реакций получения производных ЛВ с хлординитрозамещенными бенз-2,1,3-оксадиазола. При этом высокая эффективность использования 4-хлор-5,7-динитробензофу-разана (БФЗ), 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана (БФО), 4,6-динитро-5,7-дихлорбензофуроксана (ДХБФО) для получения производных ЛВ показана по отношению к другим классам реагентов, традиционно используемых для определения ЛВ в равновесных условиях (ароматические альдегиды, реакции диазотирования и азосочетания и др.).

В рамках решения задач использования проточных методов анализа в фармацевтической химии проведено установление состава производных ле-

карственных веществ, их метаболитов, компонентов и полупродуктов синтеза. Установлено, что исследованные соединения образуют азот-углерод связанные продукты аналитических реакций, что было подтверждено данными масс-, ИК-, электронной спектроскопии, электрохимических и хроматогра-фических исследований

Электроноакцепторные бензофуразановые или бензофуроксановые группы придают образующимся производным высокую КИ-кислотность, что удобно для повышения эффективности и экспрессности хроматографическо-го разделения, а также хорошие хромофорные свойства.

Максимумы поглощения соответствующих ариламинопроизводных находятся в интервале 470-520 нм. При этом положение и интенсивность полос поглощения определяются природой используемого реагента, электронными эффектами заместителей, растворителем или его смесями. Наибольшие значения молярных коэффициентов поглощения наблюдаются в полярных растворителях (спирты, диметилсульфоксид и их водные смеси), что позволяет использовать эти среды в качестве рабочих. Сопоставление молярных коэффициентов поглощения продуктов реакций указывает на практически количественное протекание реакций с аналитическими реагентами. Так, для анестезина в смеси диметилсульфоксид - вода (10:90, об. %) значения е для синтетически выделенного динитробензофуразанового производного ЛВ и продукта аналитической реакции в тех же условиях составляют 36000 и 34500 л'моль'см"1 (Х„,=480 нм) соответственно.

Для бензофуроксановых производных определяемых соединений характерен более длинноволновый сдвиг полос поглощения по сравнению с аналогичными бензофуразановыми производными (ДХп, =20-40 нм). При определениях первичных ариламинов с использованием в качестве реагента БФЗ происходит частичное наложение полос поглощения продуктов аналитических реакций на полосы поглощения гидролизованной формы реагента. В случае динитробензофуроксановых производных ариламинов такое наложение полос поглощения продуктов конкурирующих реакций незначительно. В связи с этим при ПИ определениях ЛВ в качестве реагента использован БФО. В то же время для этого реагента характерна и более высокая реакционная способность в реакциях с первичными аминами по сравнению с БФЗ.

Выбор аналитических длин волн для детектирования производных в системе ПИА проводили с учетом их спектроскопических характеристик (рис.1).

Рис. 1. Спектры поглощения 4,6-динитробензофуроксановых (3, 4, 8, 9) и 5,7-динигробензофураза-новых (1, 2, 5, 6, 7) производных лекарственных веществ: 1 - сульфацил-натрия (10 5 М) в воде, рН 6,68; 2 -стрептоцида (Ю 4 М) в диметилсуль-фоксиде, 3 - сульфацил-натрия (10"5 М) в воде, рН 6,68; 4 - букарбана (1,23-Ю"5 М) в смеси диметилсуль-фоксид: вода (1:99, об.%), рН 6,7; 5 -букарбана (1,4-10'5 М) в смеси метанол: вода (4: 96, об.%), рН 6,82; 6 -сульфодиметоксина (2-10"5 М) в смеси диметилсульфоксид: вода (3:97,

_ об.%), рН 6,7; 7 - сульфодиметоксина

Х,нм (2-1СГ5 М) в смеси метанол: вода (1, об.), рН 6,74; 8 - сульфалена (4-1СГ5 М) в воде, рН 6,74; 9 - норсульфазола (2 10"5 М) в смеси метанол: вода (10: 90,об.%), рН 6,74.

Важным фактором варьирования избирательности наиболее удобного и распространенного спектрофотометрического детектирования ЛВ в проточных системах является то, что положение полос поглощения производных в значительной степени определяется заместителями в ароматическом ядре определяемых веществ. Так, взаимодействие парацетамола, стрептоцида, фталазола, диуцифона с БФЗ и БФО приводит к образованию производных, для которых характерен гипсохромный сдвиг полос поглощения по сравнению с другими ЛВ, а для реакций БФО с натриевой, калиевой и ^^ дибензилэтилендиаминовой солями бензилпенициллина продуктов, имеющих поглощение при аналитических длинах волн 490-520 нм, зафиксировано не было. Это позволяет добиваться селективного детектирования одних соединений при их определении в смесях за счет вариации аналитических длин волн.

Другой возможностью повышения селективности определений служит различие в нуклеофильных свойствах определяемых соединений, которые в сочетании с зависимостью скоростей аналитических реакций от природы растворителя можно использовать для избирательных определений одних ЛВ в присутствии других соединений. Так, при использовании БФЗ в потоке наблюдается образование производных с натриевой, калиевой и ^^ дибензилэтилендиаминовой солями бензилпенициллина с незначительным

поглощением, которое, по-видимому, обусловлено образованием продуктов реакции реагента по вторичным аминогруппам бензилпенициллинового фрагмента ЛВ (рис. 2). Эти данные указывают на возможность использования эффекта кинетического регулирования аналитических реакций путем вариации свойств используемых реагентов, образования производных новокаиновой, натриевой, калиевой и ЭДМ-дибензилэтилендиаминовой солями бен-зилпенициллина для повышения избирательности аналитических определений новокаиновой соли в системе ПИА (табл. 1). Такой же подход при ПИ определениях ЛВ и компонентов их синтеза был использован для регулирования избирательности и чувствительности детектирования ЛВ в анализируемой матрице на фоне других аминосодержащих компонентов.

Рис. 2. Спектры поглощения 4,6-динитробензофуроксановых (3) и 5,7-динитробензофуразановых (/, 2,4) производных лекарственных веществ: 1 - натриевая соль бензил-пенициллина; 2 - М^дибензилэти-лендиаминовая соль бензилпени-циллина; 3 - новокаиновая соль бензилпенициллина; 4 - новокаино-вая соль бензилпенициллина. Растворитель: метанол-вода (30:70 % об.). Концентрация, моль/л: 1 -10"*, 2-5 10'5;3-10-5;4-КГ5

Возможность образования нескольких типов производных затрудняет их идентификацию и определение ЛВ в проточных системах. В связи с этим проведены исследования по выбору реагентов с учетом как их реакционной способности, так и подбору растворителей с учетом физико-химических свойств различных групп аминосодержащих лекарственных веществ.

Таблица 1 - Влияние компонентов анализируемого раствора на результаты проточ-но-инжекционного определения новокаиновой соли бензилпенициллина в виде 4,6-динитробензофуроксанового производного (п=4, Р=0,95)

Содержание компонента (мг/мл) Введено, мкг/мл Найдено, мкг/мл в,

Стандарт аминокислот (5,5) 1,10 5,12 1,15±0,06 4,80±0,38 0,06 0,05

Натриевая соль бензилпенициллина (0,05) 1,30 1,36±0,13 0,06

Калиевая соль бензилпенициллина (0,05) . 1,80 1,8±0,1 • 0,05

К,№Дибензилэхилендиаминовая соль бензилпенициллина (0,1) 2,80 2,87±0,23 0,05

Натрия хлорид 0,9 % 0,85 0,90±0,08 0,06

Возможность протекания нескольких аналитических реакций с ЛВ можно продемонстрировать на примере 4,6-динитро-5,7-дихлорбензофу-роксана, имеющего повышенную устойчивость к гидролитическим превращениям, но образующего несколько типов производных при взаимодействии с ЛВ ввиду двух электрофильных центров. Эти данные затрудняют получение воспроизводимых результатов в стационарных условиях спектрофото-метрии. Однако это не исключает возможности их получения в системе ПИА при соблюдении определенных условий проведения аналитических реакций за счет подбора состава среды, поскольку время движения реакционного сегмента к детектору строго определено.

В большинстве случаев было зафиксировано образование монозаме-щенных продуктов аналитических реакций постоянного состава. Монозаме-щенным реагентам (БФЗ, БФО) характерна более высокая реакционная способность, но это затрудняет проведение аналитических определений в водных или смешанных средах за счет протекания реакций гидролиза. Это влияние можно устранить обеспечением достаточно высокой эффективной концентрации реагентов в проточной системе. В ряде случаев было зафиксировано образование бис-продуктов замещения, как, например, в случае двух реакционных нуклеофильных центров у дигидралазина, диаминодифенилсуль-фона

Систематическое изучение условий проточно-инжекционных и хромато-графических определений выявило сложный характер влияния состава реакционной среды, рН, других химических и физических переменных .на величину аналитического сигнала.

Вследствие проявления КИ-кислотности динитробензоксадиазольными производными ЛВ повышение кислотности раствора приводит к уменьшению интенсивности длинноволновых полос поглощения и их положения (рис. 3). В проточной системе скорость образования динитробензофурокса-новых производных ЛВ и, соответственно, интенсивность аналитического сигнала также зависит от величины рН среды. Наибольшая чувствительность определений для всех ЛВ достигается в нейтральных средах, в которых наблюдается оптимальное с точки зрения регистрируемого сигнала влияние конкурентных реакций образования производных и гидролиза реагентов.

Типичная зависимость интенсивности сигнала при ПИ определении но-вокаинамида от рН потока приведена на рис. 4. Высокая реакционная спо-

собность аналитических реагентов обеспечивает возможность регистрации продуктов реакции даже в кислых средах, хотя при этом происходит значительное снижение интенсивности сигнала. Для определений использованы потоки, содержащие фосфатный буфер с рН=6,86 - 7,69.

Состав реакционной среды в потоке носителя, природа растворителя для инжектируемого в поток реагента влияют на полноту завершения реакции и интенсивность сигнала при ПИ определениях ЛВ.

Растворимость анализируемых ЛВ и их производных определяет необходимость выбора состава среды. Для производных изученных ЛВ характерна хорошая растворимость в водно-органических средах и биологических жидкостях. Из-за плохой растворимости анестезина, норсульфазола, сульгина, сульфадимезина, сульфалена, сульфапиридазина, сульфадиметоксина и солей бензилпенициллина в воде использованы неводные среды (спирты, ацетонитрил, в ряде случаев диметилсулъфоксид (ДМСО)). Дальнейшее разбавление таких растворов спиртами или их водными смесями при приготовлении рабочих растворов не вызывало седиментации определяемых ЛВ (так, содержание ДМСО в подвижной фазе не превышало 0,5, об. %).

Использование подвижных фаз на основе малополярных растворителей затрудняется проявлением ионных и, соответствешю, спектральных равновесий динитробензрксадиазольных производных определяемых веществ, растворимостью соединений и низкой скоростью аналитической реакции. Лучшие условия детектирования наблюдаются в полярных средах, но и в них ха-

рактерно сильное влияние растворителей на степень завершения реакции и регистрируемый сигнал. ПИ определения проводили в основном в водно-органических смесях, в которых спектральные характеристики производных менялись незначительно. В связи с этим справедливо допущение, что интенсивность фиксируемого сигнала в основном связана со степенью завершенности химической реакции при условии сохранения постоянства гидродинамических параметров в проточной системе.

Типичное влияние состава потока на аналитический сигнал для ПИ определений анестезина и новокаинамида представлено в табл. 2. Большая чувствительность достигается в спиртово-водных средах. С точки зрения гидродинамических характеристик используемых растворителей оптимальный состав соответствует этанольно-водной смеси. В этом потоке сохраняется и гомогенность среды. В других бинарных смесях, а также при проведении определений в неводных средах наблюдается понижение полноты завершения аналитической реакции. Аналогичное влияние состава потока на ПИ определения наблюдается для других ЛВ, содержащих первичные аминогруппы.

Таблица 2 - Влияние природы носителя на интенсивность сигнала при определении новокаинамида (4,5-10-6 моль/л) и анестезина (7-Ю6 моль/л) в виде' 4,6-динитробензофуроксановых производных. Концентрация реагента 1(Г2 моль/л, скорость потока 1,15 мл/мин, Х.=510 нм

Состав потока (объемные %) Определяемые вещества Интенсивность сигнала (.14 103). е.о.п.

Метанол (100) Анестезин 58

Метанол - вода (85 :15) Анестезин 84

Метанол - вода (70 : 30) Анестезин 93

Метанол - вода (50:50) Анестезин 96

Метанол - вода (30:70) Анестезин 98

Метанол - вода (15 : 85) Анестезин 82

Метанол (100) Новокаинамид 39

Метанол - вода (30:70) Нстокаинамид 44

Этанол (100) Новокаинамид 45

Этанол-вода (70:30) Новокаинамид 50

Этанол - вода (50 : 50) Новокаинамид 53

Этанол - вода (30:70) Новокаинамид 62

Этанол - вода (10: 90) Новокаинамид 51

Ацетонитрил (100) Новокаинамид 25

Ацетонитрил - вода (30 :70) Новокаинамид 43

ДМСО(ЮО) Новокаинамид 20

ДМСО : вода (30 : 70) Новокаинамид 36

Пропанол-2 (100) Новокаинамид 43

Пропанол-2 - вода (30 :70) Новокаинамид 63

Вода (100) Новокаинамид 32

Растворитель, используемый для приготовления растворов инжектируемого реагента, также влияет на полноту образования производных ЛВ. Более высокую устойчивость (до 24 ч) реагента обеспечивает ацетонитрил. Чувствительность определений зависит и от концентрации реагента, инжектируемого в поток. При концентрации реагента ниже 8 10° моль/л наблюдается понижение интенсивности сигнала. В то же время при концентрациях реагентов свыше 4 10-2 моль/л происходило нарушение гомогенности потока, что затрудняет проведение аналитических определений (рис. 5).

Гидродинамические параметры определяют время пребывания реакционной зоны в системе ПИА, влияя на полноту протекания химической реакции и размывание регистрируемых пиков. При малых скоростях потока наблюдается влияние диффузии, а при больших уменьшается степень завершения аналитической реакции. Для изученных соединений зависимость интенсивности сигнала от скорости потока имеет плато в интервале 0,6 - 2,6 мл/мин. Длина реактора свыше 250 см при его внутреннем диаметре 0,6 мм не оказывала влияния на интенсивность сигнала. Оптимальный объем инжектируемого раствора реагента составлял 110 мкл.

Аналитические характеристики для ПИ определений исследуемых лекарственных веществ при условиях, описанных выше, представлены в табл. 3. Результаты демонстрируют линейность градуировочных зависимостей в интервале определяемых концентраций. Значения пределов обнаружения, определенных в соответствии с 38-критерием и производительности определений также представлены в табл. 3.

Изучено влияние различных органических и неорганических веществ, являющихся потенциальными компонентами реакционных сред, содержащих ЛВ, на результаты их определений. Присутствие неорганических солей и вспомогательных веществ, входящих в состав лекарственных форм, определениям не мешает.

. I

Ь, мм

Рис. 5. Влияние концентрации инжектируемого реагента на сигнал при проточно-инжекционных определениях новокаина

А=0,02

(545-Ю-6 моль/л). По-

ток метанол - вода

(30:70, об. %), рН 7,12, скорость патока 1,2 мл/мин

о

2

3

4

010"? моль/л

Таблица 3 - Аналитические характеристики проточно-инжекционных определений лекарственных веществ

Определяемое вещество Состав потока (об. %) Уравнение регрессии (А.1,5 103, е.о.п; Сх, мкг/мл) Интервал определяемых концентраций, мкг/мл Коэффициент корреляции Про-изводи-тель-ность проб/ час Предел обнаружения, мкг/ мл

1 2 3 4 5 6 7

Анестезин Метанол-вода (30:70) А =83,840, -0,4 0,1 - 2,5 0,9998 25 0,04

Новокаин Метанол-фосфатны й буферный раствор с рН 6,68 (30:70) А =63,73СХ + 0,2 0,12 - 3,5 0,9998 24 0,05

Новокаин-амид Этанол-фосфатный буферный раствор с рН 6,68 (30:70) А =48,2СХ -0,8 0,16-5,0 0,9999 26 0,07

и-Амино-салицилат натрия Этанол-фосфатный буферный раствор с рН 6,68 (30:70) А=95,1СХ + 0,5 0,08 - 2,5 0,9999 28 0,03

Норсульфазол Этанол-фосфатный буферный раствор с рН 6,71 (50:50) А=22,11СХ + 1,33 0,39 -3,1 0,9984 17 0,24

Этазол Этанол-фосфатный буферный раствор с рН 7,4 (30:70) А =40,08СХ -0,8 0,31-5,0 0,9987 20 0,21

Сульфапири-дазин Этанол-фосфатный буферный раствор с рН 6,8 (30:70) А=32,45С, -0,61 0,28 - 2,8 0,9998 12 0,31

Сульфадимезин Метанол-вода (30:70) А =40,49СХ -1,49 0,28 -5,0 0,9996 14 0,18

Сульфадиме-токсин Метанол-фосфатный буферный раствор с рН6,8 (30:70) А=41,72СХ + 1,34 0,24 -3,2 0,9998 14 0,12

Сульфацил-натрий Водный буферный раствор с рН 7,4 А=50,14СХ -0,002 0,20-0,54 0,9983 18 0,13

Сульгин Метанол-фосфатный буфер с рН 6,76 (30:70) А =25,65СХ +1,00 0,21-2,14 0,9997 19 0,21

Сульфален Водный буфер с рН 6,71 А =42,43СХ -0,02 0,22 - 8,4 0,9989 15 0,19

Букарбан Метанол-фосфатный буфер с рН 6,8 (30:70) А =39,27С, -0,31 0,27-2,72 0,9985 16 0,14

1 2 3 4 5 6 7

Церукал Водный буферный раствор с рН 6,86 А =10,640, -0,36 1,018,25 0,9995 31 0,59

Фуросемид Ацетонитрил-водиый буферный раствор с рН 6,86 (15:85) А =8,58С„ + 1,34 1,6513,22 0,9999 13 0,33

Диаминоди-фенилсульфон Этанол-фосфатный буферный раствор с рН 6,0 (30:70) А =89,09С, -0,16 0,991,49 0,9992 18 0,37

Новокаиновая соль бензил-пенициллина Метанол - вода (30:70) ■ А=140,43С„ +1,02 0,04-0,98 0,9993 36 0,025

Сероггонин Ацетонитр ил-фосфатный буфер с рН 6,8 (20:80) А=230,99С„-135 0,0280,124 0,9999 32 0,02

Мексамин Ацетонитр ил-фосфатный буфер с р116,8 (20:80) А=45СХ-3,45 0,10-0,59 0,9998 28 0,056

Мелатонин Ацетонитр ил-фосфатный буфер с рН 6,8 (20:80) А=148,08Сх +1,93 0,0670,215 0,999 34 0,053

л-Амино-фенол (примесь в парацетамоле) Этанол- фосфатный буфер с рН 7,69 (75:25) А=139,7'СХ +1,2 0,04-0,98 0,9992 35 0,025

о-Фенилендиа-мин (примесь в дибазоле) Метанол - 6'10"3 М фосфатный буфер (30:70), рН смеси 7 А = 631,8 С-1,5 0,03-0,98 0,9987 30 0,01

Кроме того, избирательные определения Л В возможны и в присутствии различных органических компонентов, некоторые из них сопутствуют определяемым веществам в технологических смесях (алкиламины, аммиак, алкалоиды, фенолы, сахара, карбоновые кислоты, нитрофураны, пиримидины и

др.).

Возможность определения лекарственных веществ была проверена и в биологических жидкостях организма человека. ПИ определениям не мешают различные компоненты биологических жидкостей, содержащие аминные функциональные группы (аминокислоты, биогенные амины). Регистрируемые сигналы фона при введении в поток депротеинизированных гидролизата белков, сывороточного альбумина, плазмы крови и цельной крови незначительно отличаются от исходного значения. Мешающее влияние биогенных аминосодержащих компонентов мочи можно устранить пробоподготовкой биосубстратов. Это позволяет проводить ПИ определения ЛВ в указанных биологических матрицах (табл. 4.).

Таблица 4 - Результаты определения лекарственных веществ в биологических средах методом добавок (п=4, Р=0,95)

Биологическая Определяемые Введено, Найдено, 8,

жидкость вещества мкг/мл мкг/мл

Гидролизат белков ПАСК 0,55 0,60±0,06 0,06

Новокаинамид 1,30 1,40±0,13 0,06

Сывороточный Новокаинамид 0,85 0,90+0,09 0,06

альбумин ПАСК 1,80 1,80+0,14 0,05

Новокаинамид 5,12 4,80±0,38 0,05

Плазма крови ПАСК 16,5 16±1 0,05

Сульфален 0,90 0,87±0,07 0,05

Сульфадимезин 1,30 1,35 ±0,11 0,05

ПАСК 4,30 3,90+0,31 0,05

Новокаинамид 2,80 2,90±0,23 0,05

Кровь Новокаинамид 10,25 10±1 0,05

ПАСК 28,10 28± 2 0,04

Сульфадимезин 3,00 2,9±0,2 0,05

Сульфадиметоксии 2,50 2,6±0,2 0,05

Изониазид 2,04 2,14*0,10 0,03

Изониазид 3,10 3,28+0,31 0,06

Слюна Изониазид 4,25 4,12±0,33 0,05

Сульфадимезин 2,80 2,87*0,23 0,05

Сульфадимезин 4,25 4,15±0,20 0,03

Сульфадимезин 5,12 4,75*0,37 0,05

Сульфадимезин 6,10 6,0+0^ 0,05

Сульфадимезин 15,5 16+1 0,04

Сульфален 3,00 2,9*0,2 0,05

Моча Сульфален 5,80 5,5+0,4 0,04

Сульфадиметоксии 3,20 3,1*0,3 0,05

Изониазид 5,60 5,5*0,4 0,05

Изониазид 10,25 9,95*0,63 0,04

Проведенные исследования позволили сформулировать факторы регулирования избирательности и чувствительности спектрофотометрического детектирования лекарственных веществ за счет выбора реагента, подбора состава растворителя в потоках носителя и реагента, направленного изменения спектральных характеристик производных определяемых веществ и степени завершения аналитических реакций в неравновесных условиях.

Выявленные закономерности положены в основу методик ПИ определения сульфаниламидов, производных n-аминобензойной, n-аминосали-циловой кислот и диаминодифенилсульфона, солей бензилпенициллина, гетероциклических аминов и гидразидов кислот в смесях сложного состава и биологических субстратах. Было систематизировано применение комплекса

методик ПИ определения ЛВ в контроле качества лекарственных средств, которые апробированы при анализе различных многокомпонентных лекарственных форм (табл. 5).

Таблица 5 - Результаты определения лекарственных веществ в лекарственных формах (n=4, Р=0,95)

Состав лекарственной формы Определяемые вещества Найдено, г

по нормативной документации по разработанной методике

1 2 3 4

Новокаина гидрохлорид - 0,25 г, НС1 (0,1 н) - 0,3 мл; NaCl - 0,85 г, вода до 100 мл Новокаин 0,24+0,01 0,25*0,01

Раствора СаС12 (6,0 г) - 200,0 мл; NaBr -4,0 г; новокаина гидрохлорид 1,0 г Новокаин 0,98*0,03 1,01*0,03

Эфедрина гидрохлорид - 6,0 г; новокаина гидрохлорид (1%-ный) - 200 мл; димедрол - 2,0 г Новокаин 1,98*0,06 1,99*0,06

Атропина сульфат - 0,02 п эфедрина гидрохлорид - 0,05 г, новокаина гидрохлорид - 0,04 г; вода до 10,0 мл Новокаин 0,043*0,002 0,042*0,002

Димедрол - 0,025 г, эфедрин - 0,025 г, новокаина гидрохлорид - 0,2 г; NaCl -0,06 г Новокаин 0,18*0,01 0,19*0,01

«Свечи с новокаином», новокаин - 0,1 г Новокаин 0,11*0,01 0,10*0,01

Свечи «Анестезол»; анестезин - 0,1 г; дермаггол - 0,04 г; окись цинка - 0,02 г; ментол - 0,004 г; полиэтиленоксидная основа до 2,73 г Анестезин 0,095*0,03 0,096*0,02

Новокаин - 0.5 г, анестезин - 0,5 г; ментол - 1,25 г; спирт этиловый (70%-ный) -50,0 г Новокаин Анестезин 0,49*0,02 0,48*0,02 0,50*0,02 0,49*0,01

Натриевая соль бензилпенициллина 0,05 мг/мл; калиевая соль бензилпенициллина 0,05 мг/мл Новокаино-вая соль бензилпенициллина 1,8*0,1 мкг/мл 1,8±0,1 мкг/мл

Бициллин - 5 Новокаино-вая соль бензилпенициллина 0,89*0,01 0,90*0,01

Таблетки новокаинамида - 0,25 г Новокаина-мид 0,23*0,01 0,22*0,01

Раствор п-аминосаяицилата натрия для. инъекций (3%-ный) ПАСК 0,028*0,002 г/мл 0,029*0,003 г/мл

1 1 2 3 4

Стрептоцид - 0,75 г; норсульфазол - 0,75 г, тимол - 0,015 г; масло эвкалиптовое -0,015 п масло мяты перечной - 0,015 г; этанол 95 % - 1,8 г; сахароза -1,5 г; глицерин—2,1 г Норсульфазол 0,75±0,03 0,74*0,03

Таблетки норсульфазола - 0,25 г Норсульфазол 0,24±0,01 0,24±0,01

Норсульфазол-натрий - 0,5 г, глюкоза -0,5 г, вода-9 мл Норсульфазол 0,51±0,02 0,5±0,02

Сульфадиметоксин - 4 г; левомицепт -1,0 г; тримекаин - 3,0 г; полиэтиленоксид до 100 г Сульфадиметоксин 3,9±0,2 4,0±0,2

Таблетки сульфадиметоксина - 0,25 г Сульфадиметоксин 0,24±0,01 0,25 ±0,01

Фурацилин - 0,015 г; сульфацил-натрий -0,1 г, этанол 70 % - 20 мл Сульфацил-натрий 0,10±0,01 0,114:0,01

Аскорбат натрия - 0,15 г; сульфацил-натрий — 3 г, вода - 7 мл Сульфацил-натрий 2,9±0,1 2,9±0,1

Таблетки сульфалена- 0,2 г Сульфален 0,19±0,01 0,20±0,01

Раствор М-метилппокаминовой соли сульфалена для инъекций Сульфален 0,094±0,005 г/мл 0,092+0,005 г/мл

Таблетки сульгина - 0,5 г Сульгин 0,49±0,02 0,50±0,02

Таблетки сульфапиридазина - 0,5 г Сульфапи-ридазин 0,095±0,03 0,096±0,02

Таблетки этазола- 0,25 г Этазол 0,26±0,01 0,25±0,01

Таблетки букарбана - 0,5 г Букарбан 0,49±0,02 0,50±0,02

Таблетки сульфадимезина - 0,5 г Сульфадимезин 0,48*0,02 0,49±0,02

Сульфокамфокаин 1 Новокаин 50,4±0,8 мг/мл 50,3±0,9 мг/мл

3. ПРОТОЧНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА В БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ АМИНОСОДЕРЖАЩИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ

Проточные методы анализа перспективны для биофармацевтических исследований транспорта, всасывания, экскреции ЛВ и их метаболитов, связывания ксенобиотиков с биологическими субстратами организма человека, изучения кинетики процессов биотрансформации, а также выявления возможного полиморфизма генетически детерминированных метаболических превращений. Во многом это определено их высокой производительностью, возможностью регулирования соотношения информативности и экономично-

ста биофармацевтического анализа, адаптацией для его практических областей.

Избирательность детектирования гидразидов кислот и сульфаниламидов в биологических жидкостях нашла применение для фармакокинетиче-ских исследований генетически детерминированных процессов биотрансформации лекарственных веществ в организме человека. В этом случае особую актуальность при выборе аналитической технологии приобретают неин-вазивные процедуры, которые предусматривают использование методов про-боотбора без нарушения естественных барьеров организма. Для этих целей перспективно использование мочи и слюны обследуемых.

Сочетание проточно-инжекционных, хроматографических и спектро-фотометрических методов использовано для разработки комплекса неинва-зивных методов оценки кинетики генетически детерминированных процессов биотрансформации аминосодержащих ксенобиотиков в организме человека по типу ацетилирования. Экспериментальные данные показали, что определение степени ацетилирования изониазида и сульфадимезина в моче и слюне предложенными методами является технически простой и информативной операцией, позволяющей судить о фенотипе ацетилирования пациентов. Присутствие основных метаболитов лекарственных веществ в анализируемой матрице не мешает спектрофотометрическому детектированию ана-литов (см. табл. 4).

Установлены фармакокинетические параметры гидразида изоникоти-новой кислоты и сульфадимезина при их экскреции в слюне, моче и использовании спектрофотометрического детектирования их производных (табл. 6, 7). В качестве примера представлены фармакокинетические кривые экскреции сульфадимезина с мочой и уровень содержания изониазида в слюне (рис. 6 и 7). Полученные данные позволяют оценить генетически обусловленную активность К-ацетилтрансферазы отдельных пациентов. Удобным параметром для этого является количество выводимого тест-препарата в процентах от вводимой дозы (фракция дозы). Уровень содержания ЛВ в слюне коррелируют с результатами фенотипирования при исследовании мочи обследуемых. Значения фармакокинетических параметров имеют бимодальное распределение и различаются в группах обследуемых, что позволяет достоверно устанавливать фенотип ацетилирования. Разница в количестве выводимого препарата для пациентов одной и той же группы объясняется, по-видимому, вариациями функционального состояния желудочно-кишечного тракта и другими факторами среды.

Правильность результатов определения фенотипа ацетилирования также оценена сопоставлением с фотоколориметрической методикой определения изониазида в моче при использовании ванадата аммония как реагента.

Разработанные аналитические технологии прошли клиническую, войсковую и производственную апробации в сопоставлении с традиционными подходами. При этом показана эффективность их использования для оптимизации фармакотерапии. Особенно актуальна стандартизация этих процедур

для профессионального отбора при работе с малыми дозами экотоксикантов, выявление среди обследуемых групп повышенного риска, создания централизованного регистра их биохимических полиформизмов. Разработанный комплекс методов оценки скорости процесса ацетилирования может быть легко адаптирован к клиническим условиям. При этом предложенные методы оценки биохимического фенотипа существенно дополняют молекулярно-генетические и цитогенетические аналитические технологии, а в раде случаев служат им реальной альтернативой, поскольку проявление токсических и патологических эффектов является следствием фенотипических особенностей организма.

Таблица 6 - Фармакокинетические параметры экскреции сульфадимезина с мочой при пероральном приеме пациентами в дозе 0,5 г

Кинетические параметры Быстрые ацетиляторы (п=32) Медленные ацетиляторы (п=27)

Количество выводимого за 7 часов лекарственного вещества, % от дозы • 5,5 ± 0,6 10,1 ± 1,1

Константа скорости выведения, ч~' 0,28 ±0,03 0,15 ±0,02

Максимально выводимое за 7 часов количество препарата, мг 27,5 ± 3,0 50,5 ± 5,5

Таблица 7 - Фармакокинетические параметры экскреции изониазида с мочой при пероральном приеме пациентами в дозе 0,45 г

Кинетические параметры т Сверхбыстрые ацетиляторы (п=4) Быстрые ацетиляторы (п=20) Медленные ацетиляторы (п=17)

Количество выводимого за 6 часов лекарственного вещества, % от дозы 5,17*1,37 13,21*2,97 31,9543,31

Максимально выводимое за 6 часов количество препарата, мг 23,24±6,14 59,44± 13,37 145,6±16,7

Тангенс угла наклона фармакокинетических кривых а) 2,7±0,3 10,5±2,3 21,2±5,0

Фармакокинетические подходы к оценке биохимического фенотипа были использованы для создания научной основы рекомендаций экологической защиты. Целенаправленная модификация генетически детерминированных процессов метаболизма имеет большое значение для профессионального

отбора и профилактики поражения промышленного персонала химико-фармацевтических производств при работе с токсикантами, при осуществлении процессов уничтожения химического оружия и жидких ракетных топлив.

Рис. 6. Фармакокинетические кривые кумулятивной экскреции сульфадимезина с мочой после пероралыюго приема 0,5 г препарата: 1 - пациент с медленным типом ацетилирования; 2 -пациент с быстрым типом ацетилиро-вания.

Рис. 7. Уровень содержания изониази-да в слюне после перорального приема 0,45 г препарата: I - сверхбыстрый тип ацетилирования; 2 - быстрый тип ацетилирования; 3 — медленный тип ацетилирования

В связи с этим на основе изучения фармакокинетики аминосодержа-щих тест-препаратов методами ВЭЖХ, ПИА и спектрофотометрии исследовано влияние различных лекарственных веществ на скорость ацетилирования сульфадимезина и изониазида. Совместный прием больными с медленным фенотипом ацетилирования per os пантотената кальция (0,2 г однократно), иммуномодулятора ксимедона (по 0,5 г в течение 3 дней) вызывал увеличение активности N-ацетилтрансферазы. Это выражается в уменьшении содержания неацетилированного изониазида в моче пациентов, которое в случае пантотената кальция составило 43,5 %, а ксимедона - 30,8 %. Предварительный прием циметидина (в дозе 0,2 г в течение 5 дней) увеличивал на 16,6 % степень ацетилирования сульфадимезина обследуемых пациентов. Хотя ингибиторы микросомальных ферментов печени непосредственно не оказывают влияния на процессы ацетилирования сульфаниламидов, возможно увеличение содержания свободных сульфаниламидов в биологических жидкостях по механизму взаимного вытеснения этих соединений из связанных с белками форм лекарственных веществ. Полученные данные позволяют осуществлять подбор систем индукторов и ингибиторов N-ацетилтрансферазы.

Другой важной стороной практического использования разработанного метода определения фенотипа ацетилирования является изучение влияния мышечных тренировок на фармакокинетику сульфадимезина.

При обследовании спортсменов-профессионалов, получающих регулярные интенсивные мышечные нагрузки, установлена тримодальность распределения фармакокилетических параметров (рис. 8). Показатель ацетилирования в группе сверхбыстрых ацетиляторов составил 2,34 %, в группе быстрых - 6,24 % и медленных- 10,72 % (табл. 8). Эти данные свидетельствуют о том, что в процессе адаптации организма к систематическим мышечным нагрузкам формируется фенотип "сверхбыстрого" ацетилирования, что является одним из показателей адаптации организма к мышечным нагрузкам, а предлагаемый способ можно использовать для биохимической оценки степени тренированности спортсменов. Было показано, что одним из механизмов формирования фенотипа сверхбыстрого ацетилирования под воздействием систематических мышечных тренировок может являться индукция N ацетилтрансферазы эндогенно вырабатываемыми катехоламинами.

Таблица 8 - Показатели фенотипа ацетилирования сульфадимезина у спортсменов и неспортсменов (фракция дозы, %)

Фенотип ацетилирования Спортсмены п Неспортсмены п

Сверхбыстрый 2,34±0,03 *♦ 15 — —

Быстрый 6,24±0,34 7 5,6±0,3 7

Медленный 10,72+0,96* 9 10,47±0,68* 5

Примечание: п - количество испытуемых; * - достоверность различий между показателями быстрого и медленного ацетилирования, - сверхбыстрого и быстрого ацетилирования (Р<0,001)

а б

Рис.8. Распределение испытуемых по фенотипу ацетилирования: I | - сверхбыстрый тип, Ц - быстрый тип,Щ - медленный тип

Следует отметить, что подобное тримодальное распределение испытуемых наблюдалось и в случае фенотипирования курсантов военных вузов, поскольку некоторые из них получали интенсивные мышечные нагрузки в режиме спортивной деятельности (см. рис. 7, табл. 7).

На основании этих результатов выработаны рекомендации для коррекции доз лекарственных веществ и учета интенсивной мышечной деятельности при выполнении профессиональных задач военнослужащими при работе с токсикантами.

Проточными методами анализа изучена фармакокинетика новых лекарственных средств фосфабензида и диуцифона.

При изучении метаболических превращений нового иммуномодулято-ра диуцифона в организме человека хроматографическими методами было показано, что одним из продуктов его биотраисформации является диамино-дифенилсульфон (ДДС), который обнаруживается в моче и желудочном содержимом пациентов после приема ими как самого диуцифона, так и ДДС. Количество метаболита при выделении с мочой достигает 11 % от первоначальной дозы диуцифона.

Изучение гидролитической устойчивости лекарственного вещества in vitro и in vivo показало, что при рН 2 в течение трех часов на 1,5 % происходит гидролиз диуцифона с образованием ДДС, при этом наличие органических компонентов и повышение кислотности среды увеличивает скорость превращения. Анализ проб желудочного содержимого пациентов (0,1 г диуцифона per os) также показал, что через 60, 120, 180 мин после приема содержание ДДС составило 0,46, 0,23 и 0Д0 мг/мл, соответственно. По этой причине оказывается невозможным применение для подобных определений традиционного реактива для получения производных аминосодержащих лекарственных веществ раствора n-диметиламинобензальдегида в 10 %-ной серной кислоте (реактив Эрлиха). Это связано с тем, что высокая кислотность растворов данного реагента может вызвать изменение равновесных концентраций диуцифона и его метаболита - ДДС. В то же время при получении производного определяемого вещества с БФЗ гидролитическое превращение диуцифона невозможно.

Фармакокинетические параметры экскреции ДДС с мочой приведены в табл. 9. Анализ этих результатов выявляет значительное различие параметров метаболических превращений ДДС и диуцифона. Во-первых, количество выводимого препарата при приеме ДДС значительно выше, чем это наблюдается в случае приема более высокой дозы диуцифона. Кроме того, время полувыведения ДДС после приема этого вещества оказывается на 2-3 ч меньше, чем при выведении ДДС как продукта метаболических превращений диуци-фона. Полученные результаты, по-видимому, объясняются низкой растворимостью диуцифона в желудке и указывают на то, что лимитирующей стадией выведения ЛВ из организма может оказаться абсорбция препарата в желудочно-кишечном тракте, сопровождающаяся его гидролитическими превращениями.

Таблица 9 - Кинетические параметры экскреции диаминодифенилсульфона с мочой за сутки при пероральном приеме диаминодифенилсульфона и диуцифона

Кинетические параметры Диаминодифе-нилсульфон (п=17) Диаминодифенилсульфон при приеме диуцифона (п=20)

Период полувыведения, ч 5,00 ±0,5 7,3 ± 0,7

Количество выводимого вещества, % от дозы 19,6 ± 0,9 10,5 ±0,7

Максимально выводимое за сутки количество препарата, мг 39,2 ± 1,8 314 ±2,1

Данные по фармакокинетике транквилизатора фосфабензида в крови и моче, полученные методами ВЭЖХ, ПИА и спектрофотометрии, обрабатывались в рамках одночастевой модели со всасыванием (табл. 10,11).

Полученные данные позволяют прогнозировать динамику концентрации фосфабензида в биологических жидкостях при различных схемах введения препарата. Методом равновесного диализа установлена степень связывания фосфабензида белками плазмы крови и эритроцитами человека, которая составила 30±3 и 78±4 % соответственно.

Таблица 10 - Фармакокинетические параметры экскреции фосфабензида с мочой при пероральном приеме пациентами в дозе 0,5 г

Кинетические параметры Ацетиляторы

Быстрые (п=12) Медленные (п=7)

Количество выводимого за сутки лекарственного вещества, % от дозы 17,14 ±14 26,8 ±3,1

Константа скорости выведения, ч"1 0,29 ±0,03 0,18 ±0,02

Максимально выводимое за сутки количество препарата, мг 85,7 ±74 134 ± 15

Таблица 11 - Фармакокинетические параметры фосфабензида в крови в рамках одночастевой модели со всасыванием (п=16, Р=0,95)

Фармакокинетические параметры Средние значения.

Со, мкг/мл 51*5

Кабс. Ч" 1,0±0,6

К,„, ч'1 0,36±0,03

Т|Л,ч 1,94±0,16

Т|/2А.Ч 0,83*0,43

А11С, мкгч/мл 142±14

СЬ, л/ч 343*0,34

1,72*043

С™,,, МКГ/МЛ 28*5

4. ПРОТОЧНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА В КОНТРОЛЕ

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ И БЕЗОПАСНОСТИ ПЕРСОНАЛА ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ

Эффективность современного производства лекарственных средств в значительной мере определяется состоянием аналитического контроля на всех его стадиях. Выход и качество целевых продуктов зависят не только от строгого соблюдения технологических регламентов, но и от применения надежных аналитических методик постадийного контроля технологических процессов, а также оценки качества сырья и готовой продукции. Решение этих задач невозможно без применения высокопроизводительных и информативных аналитических методов. Правильный их выбор при разработке технологии, постадийном контроле необходим и в целях обеспечения экономичности и рентабельности производства. Контроль воздуха рабочей зоны, сточных вод фармацевтических предприятий позволяет решать проблемы перекрестного загрязнения фармацевтической продукции и проводить обеспечение безопасности производственного персонала и окружающей среды.

Избирательные и чувствительные определения ароматических аминов и гидразинов проточными методами в технологических средах разного состава, готовой продукции и сточных водах химико-фармацевтических производств возможны при использовании предколоночной дериватизации определяемых веществ хлординитрозамещенными бенз-2,1,3-оксадиазола, приемов ее регулирования по основности аналита, а также за счет стерических затруднений образования производных.

Проточно-инжекционное и хроматографическое определения ароматических аминов и гидразинов возможно в присутствии целевых и побочных компонентов технологических смесей и компонентов лекарственных форм (см. табл. 11). Комплекс методик определения и-аминофенола, о-фениленди-амина, гидразина, несимметричного диметилгидразина (НДМГ) и других токсичных аминов использован для контроля состава реакционных смесей, технических продуктов и готовой продукции. Эти возможности можно проиллюстрировать на примере определения токсичного и-аминофенола в модельных смесях и готовых лекарственных формах (табл. 12, 13).

Эти результаты послужили основой для оценки безопасности многочисленных форм на основе парацетамола, поскольку исследование процессов, протекающих при хранении лекарственных форм с истекшим сроком годности, выявило тенденцию к увеличению содержания токсиканта. По полученным данным ПИА и ВЭЖХ содержание л-аминофенола удваивается каждые четыре года просрочки при хранении таблеток в обычных условиях.

Изучение жидкофазного и твердофазного экстракционного концентрирования следовых количеств токсичных веществ (гидразин и его замещенные, ариламины)в сточных водах показало большую эффективность использования дериватизации хлординитробензофуразаном по сравнению с реакциями конденсации ароматическими альдегидами.

Таблица 12 - Влияние мешающих компонентов на результаты проточно-инжекционного определения п-аминофенола и о-фенилендиамина (п=4, Р=О,95)

Компоненты матрицы Определяемые Введено, мкг/мл Найдено с± 6, мкг/мл 8,

(мг/л) вещества

Парацетамол (0,65) л-Аминофенол 1,30 1,36+0,13 0,06

Парацетамол (1,8) п-Аминофенол 1,80 1,8±0,1 0,05

Парацетамол (19,6) и-Аминофенол 2,80 2,87±0,23 0,05

Сахароза (5,5) п-Аминофенол 0,55 0,60*0,06 0,06

Ацетилсалициловая п-Аминофенол 0,85 0,90±0,08 0,06

кислота (8,5)

Аскорбиновая кислота (7,5) л-Аминофенол 1,00 1,10±0,1 0,06

Фенол (4,0) п-Аминофенол 1,00 1,02*0,02 0,05

Глюкоза (4,5) п-Аминофенол 1,02 1,06*0,06 0,06

Дибазол (122,2) о-Фенилендиамин 0,054 0,06+0,02 0,06

Фенол (3,5) о-Фенилендиамин 0,55 0,60*0,06 0,06

Уксусный ангидрид (50) о-Фенилендиамин 1,00 1,02+0,02 0,05

Папазол (10) о-Фенилендиамин 0,054 0,06*0,02 0,06

Папазол (130) о-Фенилендиамин 0,054 0,06*0,02 0,06

Таблица 13 - Результаты: проточно-инжекционного определения л-аминофенола в лекарственных формах (п=4, Р=О,95)

Лекарственные формы Найдено, %

Парацетамол (З,9±0,2)10"3

Панадол (2,6*0,1)10"3

Парамол 0,16±0,01 мкг/мл

Эффералган (1,30+0,08)10"'

Цитрамон П (2,1*0,1)10'3

Дафалган (1,10*0,06)103

Ди-антальвик (1,00*0,05)103

Для экстракции использованы изоамиловыш спирт и смесь растворителей метиленхлорид-изоамиловыш спирт. Выбор последней экстракционной системы проведен с учетом возможности концентрирования определяемых веществ за счет отгонки растворителя. Практически количественное извлечение производнык происходит при рН 4 - 5. Типичная хроматограмма экстракта пробы воды, содержащей выбросы гидразина, приведена на рис. 9. Как видно, использование БФЗ для получения производного приводит к упрощению хроматограммы. Полное время хроматографического разделения, включая промытку колонки, занимает 6 мин. Высокая интенсивность спек-

тров поглощения производного гидразина и его количественное извлечение при однократной экстракции позволяет проводить хроматографические определения гидразина при прямой инжекции до содержаний 0,1 мкг/л.

БАМ В, 810=5^и 9 |!.|=в00.80 (0ТОКИ31 В) САМ В. 5|(рвЗО 3 И.(«еОО во (ЗУ0И)523 [>)

-.-----■-1---------1-■ ' ----1---■-■.!■■■-■-г

0 12 3 4 П>|Ц

Рис. 9. А - хроматограмма воды после экстракции изоамиловым спиртом (объем пробы 200 мл, экстрагента 10 мл), В - спектр поглощения 5,7-динитробензофуразанового производного гидразина

Современное состояние знаний о токсических свойствах веществ диктует необходимость определения токсикантов при концентрациях на несколько порядков более низких, чем прежде, и, кроме того, оценки персональной экспозиции особенно в производственных условиях. Для определения экспозиции токсикантов, оценки дозы и эффекта их воздействия удобно использовать новые аналитические технологии, основанные на принципе химической дозиметрии.

В качестве объектов исследования при разработке тест-методов для контроля воздуха рабочей зоны химико-фармацевтических производств были выбраны наиболее высокотоксичные соединения (анилин и его замещенные, гидразин, несимметричный диметилгидразин, фенилгидразин, дифениламин, М,К-диметиланилин), часто используемые при синтезе лекарственных веществ различной фармакологической активности.

В процессе аспирации воздуха, содержащего определяемые первичные ароматические амины и фенилгидразин, на слое носителя с иммобилизованным реагентом образуется окрашенная в красный цвет контрастная зона индикации. Для вторичных и третичных ариламинов, гидразинов образуются слои, окрашенные в синий или сине-зеленый цвет. Интенсивность окраски и длина окрашенной зоны носителя пропорциональны концентрации определяемых веществ в воздухе.

Минимальная концентрация ароматических аминов, при которой возможно визуальное определение их содержания, соответствует 0,05-0,1 мг/м3

при объеме аспирируемого воздуха 10 л. Это позволяет разделить анализ ароматических аминов в воздушной среде на два этапа.

При относительно высоких содержаниях веществ в воздухе (0,1 мг/м3 и более) можно использовать определение с использованием линейно-колористической шкалы. Ошибка определений при этом не превышает 15 % (отн.) для интервала концентрации 0,1-10 мг/м3.

Для уменьшения ошибки визуального детектирования были разработаны методы цветометрического определения окрашенных зон в индикаторных трубках путем их сканирования и количественного выражения цветовых характеристик. Измерение общей функции сложения цветов при сканировании окрашенных зон индикаторных трубок позволило осуществлять инструментальное определение концентрации токсиканта в воздухе.

Низкие концентрации ароматических аминов и гидразинов (ниже значений ПДКВ) можно определять методом ВЭЖХ после десорбции производных определяемых соединений с применяемого сорбента. Подобраны оптимальные условия хемосорбционного концентрирования за счет регулирования скорости аспирации и длины слоя сорбента (табл. 14).

Таблица 14 - Влияние скорости аспирации воздуха на степень извлечения анилина, 4-хлоранилина и 2,5-дихлоранилина (0,5 мг/м3) хемосорбционными трубками с иммобилизованным на силикагеле 4-хлор-5,7-динитробензофуразаном (аспирация 10 мин)

Скорость аспирации, л/мин Степень извлечения, %

Анилин 4-Хлоранилин 2,5-Дихлоранилин

0,2 98 ±3 91 ±2 77*3

0,4 99 ±2 90±2 76*3

0,6 97 ±2 91 ±2 76 ±2

0,8 97 ±2 90 ±2 74 ± 2

1,0 96 ±3 88 ±3 74±г

1.2 93 ±3 86 ± 3 73 ±2

2,0 60 ±4 52 + 3 45 ±4

Изучены условия разделения и детектирования ряда ароматических, алифатических аминов и аммиака в виде их 5,7-динитробензофуразановых производных. На рис. 10 представлена типичная хроматограмма производных определяемых веществ в смеси с производными потенциальных загрязняющих компонентов воздушной среды. В связи с тем, что разделение осуществляли на обращенно-фазовом режиме хроматографии, следовало ожидать такого порядка элюирования, когда более гидрофобные хлорзамещен-ные производные анилина должны иметь более высокие значения времен удерживания. Однако элюирование компонентов анализируемой смеси не со-

тасуется с изменением их гидрофобных свойств, скорее согласуясь с изменением их КИ-кислотности, которая возрастает при переходе от производных аммиака и алкиламинов к производным ароматических аминов. Предел обнаружения аналитов с учетом 10-кратного концентрирования определяемых веществ после их десорбции составляет 0,7 мкг/м3.

Рис. 10. Хроматограмма (а) смеси 5,7-динитробензофуразановых производных аминосоединений: 1 - 2,5-дихлоранилин, 2 - 4-хлоранилин, 3 - анилин, 4 - аммиак, 5 - метиламин, (б) - спектр поглощения 5,7-динитробензофуразановых 4-хлоранилина; (в) - спектр поглощения производного аммиака. Элюэнт- смесь аце-тонитрила и воды (58:42, об.%)

В варианте химической дозиметрии для детектирования в воздушном потоке ариламинов и замещенных гидразина в непрерывном режиме использован автоматический газосигнализатор ГСП-11. Замена реагентов, оптимизация времени рабочего цикла и скорости аспирации позволяет проводить определение токсикантов в воздухе химико-фармацевтических производств на уровне чувствительности ферментативной реакции, изначально используемой в данной конверсионной базе.

Для тест-определения в сточных водах фармацевтических производств ариламинов и гидразинов предложены системы с визуальным и спектрофо-тометрическим детектированием сигнала на основе иммобилизованных в нитроцеллюлозные пленки реагентов (рис. 11). Предел обнаружения при спектрофотометр'ическом детектировании токсикантов достигает 0,01 мг/л.

Тест-определения возможны в присутствии алкиламинов, аммиака, фенолов, карбоновых кислот и неорганических солей.

А

а 6

480 520 560 Ш 643 Ш

Рис. 11. Спектры поглощения нитроцеллюлозных пленок с иммобилизованными 7-хлор-4,6-динитробензофуроксаном (1) и 4-хлор-5,7-динитробензофура-заном (2-5) после контакта с водными растворами: 1 - анилина (0,15 мг/л); 2 - фе-нилгидразина (0,27 мг/л); 3 — 1,1-диметилщдразина (1,1 мг/мл); 4 - NN диметиланилина (1,75 мг/л); 5 - N,N-диэтиланилина (0,82 мг/л). Время контакта 10 мин. Спектры сняты относительно пленок сравнения

1. Сформулированы научно-методические основы применения проточных методов анализа для контроля качества, производства и биофармацевтических исследований аминосодержащих лекарственных веществ.

2. Впервые показана возможность проточно-инжекционных определений со спектрофотометрическим детектированием аминосодержащих лекарственных веществ химиотерапевтической, анальгезирующей, антиаритмической, нейромедиаторной, иммуномодулирующей и психотропной активностью в биологических жидкостях и лекарственных формах. Установлены факторы регулирования избирательности и чувствительности определений лекарственных веществ выбором реагента, подбором состава растворителя в потоках носителя и реагента и направленным изменением спектральных характеристик производных определяемых веществ.

3. Разработан комплекс избирательных и чувствительных методик про-точно-инжекционного определения гидразидов кислот, сульфаниламидов, производных л-аминобензойной, л-аминосалициловой кислот и диаминоди-фенилсульфона, солей бензилпенициллина, гетероциклических аминов в смесях сложного состава и биологических жидкостях с производительностью до 36 проб/ч, интервалом определяемых содержаний 0,04-13,2 мкг/мл, пределом обнаружения до 0,02 мкг/мл. Методики проточно-инжекционного опре-

ВЫВОДЫ

деления лекарственных веществ апробированы при контроле качества многокомпонентных лекарственных форм и в биофармацевтическом анализе.

4. Предложены и прошли клиническую апробацию неинвазивные методы фенотипической оценки генетически детерминированных процессов биотрансформации аминосодержащих ксенобиотиков в организме человека по типу ацетилирования. Установлены фармакокинетические параметры экскреции гидразида изоникотиновой кислоты и сульфадимезина в слюне и моче при использовании спектрофотометрического детектирования их производных, позволяющие достоверно определять фенотип обследуемых. Показана перспективность использования комплекса разработанных методов для оптимизации фармакотерапии, обеспечения безопасности и оценки риска при работе с экотоксикантами.

5. На основе изучения фармакокинетики аминосодержащих тест-препаратов методами ВЭЖХ, ПИА и спектрофотометрии получены данные по индукции N-ацетилтрансферазы во время интенсивной мышечной деятельности и при клиническом применении ксимедона, пантотената кальция и пиридоксина. Тримодальность распределения фенотипа ацетилирования у спортсменов установлена впервые. Показана возможность осуществления коррекции доз лекарственных препаратов для эффективного и безопасного их применения с учетом фенотипических особенностей пациентов.

6. На основании исследования фармакокинетики фосфабензида и диу-цифона показано, что процессы биотрансформации лекарственных веществ обуславливают генетически детерминированные реакции их ацетилирования. Установлено, что метаболитом диуцифона на стадии его абсорбции при приеме per os является диаминодифенилсульфон, определены основные фар-макокинетические параметры метаболита и гидролитическая устойчивость лекарственного вещества in vitro и in vivo. Установлена степень связывания фосфабензида плазмой крови и эритроцитами человека.

7. Предложен комплекс проточных методов (ВЭЖХ, ПИА) для поста-дийного контроля токсичных компонетов производств аминосодержащих лекарственных веществ. Избирательность и чувствительность определения ароматических аминов и гидразинов в технологических средах, готовой продукции и сточных водах химико-фармацевтических производств обеспечивается при использовании приемов кинетического регулирования аналитических реакций. Разработаны методики определения и-аминофенола, о-фенилендиамина, гидразина, 1,1-диметилгидразина и других токсичных аминов в реакционных смесях, технических продуктах и готовой продукции. Методики использованы для исследования процессов, протекающих при хранении готовых лекарственных форм на основе парацетамола и установления их безопасности.

8. Установлены условия хемосорбционного концентрирования арила-минов и гидразинов из воздушной среды химико-фармацевтических производств трубками с иммобилизованными реагентами и последующего ВЭЖХ определения. Предложены методики сорбционно- и экстракционно-

хроматографического определения ароматических аминов и замещенных гидразина в воздушной среде и сточных водах с пределом обнаружения ана-литов 0,7 мкг/м3 и 0,05 мкг/л.

9. Для оценки безопасности технологических процессов и персонала химико-фармацевтических производств показана возможность использования автоматических сигнализаторов для проточного аналитического контроля, тест-методов в виде индикаторных трубок и тест-полосок. Оптимизированы условия и схемы аналитических определений, предложены методические приемы количественных измерений спектральных характеристик селективных слоев тест-средств.

Основное содержание диссертационной работы изложено в следующих публикациях:

1. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Шакирова Л.Ш. Проточно-инжекционный анализ лекарственных веществ (обзор) // Журн. аналит. химии. - 2001. - Т.56. №4. - С.355-366.

2. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Евгеньева И.И., Куртбелялова Х.И. Спек-трофотометрическое и хроматографическое определение лекарственных веществ в биологических субстратах // Журн. аналит. химии. - 1998. - Т. 53. № 1.-С.101-107.

3. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Евгеньева И.И., Горюнова СМ., Николаева Н.Г., Левинсон Ф.С. Тест-методы для визуального, спектрофотометриче-ского и хроматографического определения аминосоединений в воздушных и водных средах // Журн. аналит. химии. -1998. - Т. 53. № 2. - С.175-186.

4. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Евгеньева И.И., Угричич-Требинский В.В. Избирательное проточно-инжекционное определение гидразина // Журн. аналит. химии. -1998. - Т.53. №3. - С.272-277.

5. Evgen'ev M.I., Garmonov S.Yu., Evgen'eva I.I., Goryunova S.M., Pogorel"tsev V.I. and Levinson F.S. Reversed-phase liquid chromatographic determination of drugs in human urine as a test of the genetically predetermined type of-biotrans-formation by acetylation // Talanta. - 1998. - V.47. - P.891-898.

6. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Евгеньева И.И., Горюнова СМ., Газизуллина Л.Ш. Избирательные проточно-инжекционные определения 1,1-диметилгидразина в смесях // Журн. аналит. химии. - 1998. - Т.53. № 6. -С.650-654.

7. Валимухаметова Д.А., Погорельцев В.И., Гармонов С.Ю., Бикмуллин М.Ф., Резник B.C. Клинико-фармакологические свойства диуцифоыа (обзор) // Казанский медицинский журн. - 1998. - Т. 79. № 4. - С. 288-293.

8. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Шакирова Л.Ш., Брысаев А.С. Спектрофо-тометрическое определение производных n-аминобензойной и n-аминосалициловой кислот в лекарственных формах и биологических жидкостях. // Хим. - фарм. журн. - 1999. Т.ЗЗ. №5. - С.50-54.

9. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Мухамадиева P.M., Сопин В.Ф. Влияние среды на спектры поглощения 4,4>-гидразобис-5,7-динитробензофуразана // Изв. вузов. Химия и хим. технология. - 1999. - Т.42. Вып.1. - С.51-56.

10. Евгеньев М.И., Гармонов С. Ю., Погорельцев В.И., Шакурова Э.Ф. Спек-трофотометрическое и хроматографическое определение диаминодифенил-сульфона и его производных в биологических средах // Журн. аналит. химии.

- 1999. - Т.54. № 6. - С. 618-624.

11. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Шакирова Л.Ш. Избирательные проточ-но-инжекционные определения производных 4-аминобензойной и 4-аминосалициловой кислот в смесях // Журн. аналит. химии. - 2000. - Т.55. №7. - С. 775-784.

12. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Шакирова Л.Ш, Левинсон Ф.С. Спектро-фотометрическое и хроматографическое определение сульфаниламидов в биологических жидкостях и лекарственных формах // Журн. аналит. химии. -2000. - Т.55. №8. -С.888-895.

13. Евгеиьев М.И., Гармонов С.Ю., Шакирова Л.Ш., Брысаев А.С. Спектро-фотометрическое и хроматографическое определение n-аминофенола в парацетамоле. // Хим. - фарм. журн. - 2000. - Т.34. №5. - С. 52-54.

14. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Шакирова Л.Ш. Проточно-инжекционное определение n-аминофенола в смесях со спектрофотометрическим детектированием // Заводская лаборатория - 2000. - Т.68. №10. - С. 19-24.

15. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Шакирова Л.Ш., Погорельцев В.И. Метод определения фенотипа ацетилирования при использовании сульфадимезина как фармакогенетического маркера // Хим. - фарм. журн. - 2000. - Т.34. №11.

- С. 5-8.

16. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Евгеньева И.И., Исмаилова Р.Н., Побе-димский Д.Г. Экстракционно-хроматографическое определение 1,1-диметилгидразина в водах с диодно-матричным детектированием // Заводская лаборатория -2000. - Т.66. №7. - С. 14-16.

17. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Евгеньева И.И., Левинсон Ф.С. Аналитические возможности реакций хлординитрозамещенных бенз-2,1,3-оксадиазола и их N-оксидов с аминосоединениями // Вестник Казан, гос. тех-нол. ун-та - 2000. № 1-2. - С.52-57.

18. Абзалов РА., Нигматуллина Р.Р., Хайруллина Г.Н., Гармонов С.Ю., Шакирова Л.Ш, Евгеньев М.И. Влияние мышечных тренировок на скорость аце-тилирования сульфадимезина // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. -

2000. - Т.130. № 12. - С. 620-622.

19. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Шакирова Л.Ш. Проточно-инжекционное определение новокаиновой соли бензилпенициллина в препаратах пенициллина со спектрофотометрическим детектированием // Журн. аналит. химии. -

2001. - Т. 56. №6. - С.642-646.

20. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Шакирова Л.Ш. Проточно-инжекциоиное со спектрофотометрическим детектированием определение сульфаниламидов в лекарствах и биологических жидкостях // Журн. аналит. химии. - 2002. - Т. 57. №1.- С. 73-79.

21. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Евгеньева И.И. Тест-пленки для определения ароматических аминов и гидразинов в водных средах // Журн. аналит. химии. - 2002. - Т. 57. № 2. - С. 187-191.

22. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Багнюк В.П., Кочергин А.В. Автоматический контроль гептила в воздушной среде // Оборонная техника. - 2002. - №3. - С.74-75.

23. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Шакирова Л.Ш., Брысаев А.С. Проточно-инжекционные определения токсичных ароматических аминов в лекарственных препаратах // Журн. аналит. химии. - 2002. - Т. 58. №12. - С.1290-1295.

24. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Шакирова Л.Ш., Дегтерев Е.В. Проточно-инжекциошюе определение лекарственных веществ, содержащих первичные аминные функциональные группы // Хим.-фарм. журн. - 2002. - Т.36. №10. -С.34-39.

25. Гармонов СЮ. Безопасность лекарств: эколого-химические аспекты // Вестник Татарстанского отделения Российской экологической академии. -2002.-№3-4.-С. 138-145.

26. Евгеньев М.И., Евгеньева И.И., Гармонов С.Ю., Исмаилова Р.Н. Сорбци-онно-хроматографическое определение анилина, 4-хлоранилина, 2,5-дихлоранилина в воздухе // Журн. аналит. химии. - 2003. - Т. 59. № 6. - С. 604-610.

27. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Белов П.Е., Цехмистер В.И., Дружинин А.А. Тест-метод определения токсичных веществ раздражающего действия в воздушной среде // Журн. аналит. химии. - 2003. - Т. 59. № 5. - С. 542-545.

28. Патент РФ № 2194990. - Способ определения 4,6-динитро-5,7-дихлорбензофуроксана в биологически активной смеси / С.Ю. Гармонов, Л.М. Юсупова, А.С Якупова, И.Ф. Фаляхов, В.Ф. Сопин Заявлено 3.05.01; Опубл. 20.12.02, бюл. № 35. - 10 с.

29. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Баппок В.П., Максудова СЕ., Кочергин А.В. Диагностика фенотипа ацетилирования при обеспечении безопасности производственного персонала // Медицина труда и промышленная экология. -2002.-№11.-С.35-38.

30. Гармонов С.Ю., Юсупова Л.М., Якупова А.С, Фаляхов И.Ф., Сопин В.Ф. Спектрофотометрическое и хроматографическое определение 4,6-динитро-5,7-дихлорбензофуроксана в биологически активной смеси // Хим.-фарм. журн. - 2003. - T.37. №4. - С. 104-105.

31. Евгеньев М.И., Гармонов СЮ., Гисмятов Р.Г, Шитова Н.С, Зыкова И.Е. Неинвазивные методы определения фенотипа ацетилирования // Вопросы медицинской, биологической и фармацевтической химии. - 2003. - №3. -С.34-39.

32. Евгеньев М.И., Евгеньева И.И., Гармонов СЮ. Проточно-инжекционный анализ. Ферментативный анализ. Казань: Изд-во КГТУ, 1996. - 31 с.

33. Валимухаметова ДА., Погорельцев В.И., Хамитов Р.Ф., Сергеев В.А., Гармонов С.Ю., Резник B.C. Клиническое применение ксимедона. Казань: КГМУ, 1997.-18 с.

34. Погорельцев В.И., Гармонов С.Ю., Румянцев Д.М., Валимухаметова Д.А. Введение в клиническую фармакогенетику. Казань: КГМУ, 1997. - 34 с.

35. Погорельцев В.И., Гармонов С.Ю., Валимухаметова Д.А. Взаимодействие лекарственных средств. Казань: Изд-во Министерства информации и печати РТ, 1998.-122 с.

36. Погорельцев В.И., Гармонов С. Ю., Евгеньев М.И. Клиническая диагностика фенотипа биотрансформации по типу ацетилирования. Казань: Изд-во КГМУ, 1999.-22 с.

37. Гармонов С.Ю., Евгеньев М.И., Евгеньева И.И., Фаляхов И.Ф. Контроль качества лекарственных препаратов. Казань: Изд-во КГТУ, 2002. - 44 с.

Гармонов Сергей Юрьевич (Россия)

Проточные методы анализа в контроле качества, производстве и биофармацевтнческих исследованиях аминосодержащих лекарственных веществ

Сформулированы научно-методические основы применения проточных методов анализа для контроля качества, производства и биофармацевтических исследований аминосодержащих лекарственных веществ. Установлены факторы повышения избирательности и чувствительности определений аналитов в виде динитро-бенз-2,1,3-оксадиазольных производных методом проточно-инжекционного анализа со спектрофотометрическим детектированием (К 490-510 нм). Выявлен характер влияния состава потока, физико-химических характеристик анализируемых сред на избирательность и чувствительность определений лекарственных веществ при использовании приема кинетического регулирования. Предел обнаружения достигает 0,01 мкг/мл. Аналитические определения проведены в лекарственных формах и биологических жидкостях. Разработаны неинвазивные, избирательные и чувствительные методы оценки кинетики ацетилирования лекарственных веществ, обосновано их использование для оптимизации фармакотерапии, обеспечения безопасности при работе с экотоксикантами. Проточными методами анализа изучена фарма-кокинетика и биотрансформация диуцифона и фосфабензида, а также влияние физических нагрузок на фармакокинетику сульфадимезина.

Sergey Yu. Garmonov (Russia)

Flow methods of the analysis in quality control, manufactory and biopharmaceutical researches aminocontaining drugs

The scientific - methodical fundamentals of application of flow methods of the analysis for quality control, effecting and biopharmaceutical researches aminocontaining of drugs are formulated. The factors of increase of selectivity and sensitivity of determinations analytes by the way dinitrobenz-2,l,3-oxadiazole derivative by a method of the flow - injected analysis with spectrophotometric detecting (X. 490-510 nm) are established. The nature of influencing of a mobile phase, physico-chemical and hydrodynamic parameters of solvents and components of analytes on selectivity and sensitivity of drugs determination in flowing systems is detected on the basis of usage of kinetic regulation. The detection limit were 0,01 |ig/ml. Procedures for determining of medical substances in Pharmaceuticals and biological fluids were developed. The sensitive and sensitive flow methods of determination acetylarion phenotype, their usage for optimization of a phar-macotherapy, safety control and estimation of risk is justified by activity with toxicants. The flowing methods of the analysis study a pharmakokinetics and biotransformation of diuciphon and phosphabenzide, influencing of exercise stresses on a pharmakokinetics of sulfadimezin.

Заказ № м±_ _Тираж 100 экз.

Офсетная лаборатория КГТУ 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, 68. Казань 2003

il 24 J

РНБ Русский фонд

2004-4 25076

Актуальность проблемы. Соединения с аминными функциональными группами представляют собой важные классы лекарственных веществ (ЛВ) и находят широкое применение в медицинской практике как эффективные препараты с разнообразной фармакологической активностью. Многокомпонентность технологических смесей синтеза и лекарственных форм, токсичность многих из них при незначительном нарушении дозировки, а также генетическая детерминированность и индивидуальная вариабельность процессов их биотрансформации в организме человека требуют применения избирательных, чувствительных методов определения этих ксенобиотиков в лекарственных формах и биологических жидкостях организма человека.

В последнее десятилетие в анализе лекарственных веществ, наряду с развитием высокоэффективной жидкостной, тонкослойной хроматографии и других физико-химических методов, наблюдается тенденция к использованию таких аналитических систем, как проточно-инжекционный анализ (ПИА) и тест-методы. Этому способствовали такие их преимущества, как простота технического исполнения, высокая производительность, надежность и экономичность определений, возможность получения большого объема аналитической информации. Проточные методы анализа все чаще используются для оценки основных параметров, определяющих качество лекарств -их безопасности и эффективности применения.

Проблемой, ограничивающей применение проточных методов в биофармацевтическом анализе, является избирательность и чувствительность детектирования определяемых соединений. Это связано со сложным составом анализируемых матриц при низких содержаниях аналита, а также со спецификой значительной части ЛВ и их метаболитов, имеющих высокую полярность, слабовыраженные хромофорные, элек-трофорные или флуорофорные свойства. Кроме того, измерение аналитического сигнала в неравновесных условиях, когда физические и химические процессы в потоке не завершены, вызывает необходимость быстрого изменения аналитических свойств ЛВ за время движения определяемого соединения к детектору. Использование большей части реакций дериватизации аминосоединений из-за низкой специфичности взаимодействия и реакционной способности реагентов существенно ограничивает возможности проточного анализа ЛВ.

В то же время существует потребность в применении таких доступных аналитических систем, которые можно использовать в режиме проточного анализа для cell лективных и чувствительных определений аминосодержащих ЛВ в сложных по составу смесях без их разделения.

В этом плане важна разработка неинвазивных, простых в экспериментальном отношении и высокопроизводительных аналитических методов для исследований полиморфизма генетически детерминированных биохимических процессов, что чрезвычайно необходимо в осуществлении ранней досимптоматической диагностики заболеваний, оценке риска интоксикации, канцерогенеза и индивидуальной химической чувствительности организма человека.

Цель работы заключается в развитии научных основ и систематизации применения проточного анализа в фармацевтической химии для создания комплекса экспрессных, высокочувствительных, избирательных и производительных проточно-инжекционных, хроматографических и тест-методов для контроля качества лекарственных препаратов, фармацевтического производства и биофармацевтических исследований, а также оценки генетически детерминированных процессов биотрансформации аминосодержащих лекарственных веществ.

Для достижения этой цели были решены следующие задачи:

- обоснование путей повышения избирательности и чувствительности опреде-* ления лекарственных веществ, содержащих аминные функциональные группы, в равновесных и неравновесных условиях;

- выявление факторов, обеспечивающих чувствительность и избирательность определений ЛВ в проточных системах: проточно-инжекционном анализе, высокоэффективной жидкостной и тонкослойной хроматографии, тест-методах, установление взаимосвязи между физико-химическими параметрами проточных систем и аналитическими свойствами ЛВ, изучение влияния компонентов анализируемой матрицы на регистрируемый в потоке сигнал;

- разработка тест-систем и автоматизированных средств для определения в потоке токсичных соединений в технологических смесях, воздушной среде и сточных водах фармацевтических производств, определение критериев выбора используемых при этом хромогенных реакций, условий проведения аналитических определений, изучение метрологических характеристик методик;

- создание методических основ количественных измерений спектральных характеристик селективных слоев в тест-методах для контроля безопасности технологических процессов и персонала химико-фармацевтических производств;

- разработка неинвазивных, избирательных и чувствительных аналитических методов фенотипической оценки генетически детерминированных процессов биотрансформации J1B по типу ацетилирования, обоснование их использования для оптимизации фармакотерапии, обеспечения безопасности и оценки риска при работе с экотоксикантами;

- практическое использование разработанных проточно-инжекцион-ных, хро-матографических, спектрофотометрических методик для контроля качества и производства лекарственных препаратов, а также биофармацевтических исследований ами-носодержащих J1B и выработка на этой основе рекомендаций по совершенствованию применения лекарственных средств.

Диссертационная работа выполнялась при поддержке Международного научно-технического центра (ISTC Projects # 498, 1517, 1891), Российского фонда фундаментальных исследований (проект 03-03-96013-р2003а), Академии наук Республики Татарстан (проекты 19-01/2000 (Ф), 07-7.5-86/2001 (Ф), 09-9.7-13/2001 (Ф), 09-9.2112/2003 (Ф)), ISSHP (1999, 2000, 2001 г.).

Научная новизна:

- на основании систематического исследования аналитических реакций ЛВ, содержащих аминные функциональные группы, выявлены факторы повышения избирательности и чувствительности определений аналитов в равновесных и неравновесных условиях;

- обоснованы выбор и условия использования проточных методов для избирательных и чувствительных определений аминосодержащих ЛВ различного спектра фармакологического действия в биологических жидкостях, технологических смесях и многокомпонентных лекарственных формах;

- обоснованы и установлены условия аналитических определений в проточно-инжекционном анализе ЛВ, выработаны критерии выбора аналитических реагентов при дериватизации биологически активных аминосоединений различных классов и компонентов их промышленного синтеза;

- выявлен характер влияния состава потока, физико-химических характеристик растворителей и компонентов анализируемых сред на избирательность и чувствительность определений ЛВ в проточных системах на основе использования приема кинетического регулирования;

- показана возможность использования тест-методов и автоматических средств аналитического контроля для оценки безопасности и качества технологических процессов и персонала химико-фармацевтических производств, предложены методические приемы количественных измерений спектральных характеристик селективных слоев тест-средств;

- установлены рабочие условия проточно-инжекционных, хроматографических, линейно-колористических, спектрофотометрических определений аминосодержащих ЛВ и исходных компонентов их синтеза, а также продуктов метаболических превращений в сложных по составу анализируемых матрицах;

- разработаны неинвазивные, избирательные и чувствительные методы оценки скорости генетически детерминированных процессов биотрансформации ЛВ по типу ацетилирования, обосновано их использование для оптимизации фармакотерапии, обеспечения безопасности и оценки риска при работе с экотоксикантами;

- изучена фармакокинетика и биотрансформация диуцифона и фосфабензида, получены данные по индукции N-ацетилтрансферазы.

Практическая значимость. Выявлены и обоснованы новые области применения проточных методов анализа в фармацевтической химии для контроля качества, технологических процессов и безопасности фармацевтических производств, биофармацевтических исследований аминосодержащих лекарственных препаратов.

Разработаны экспрессные и чувствительные методики избирательного проточ-но-инжекционного, хроматографического, спектрофотометрического, тест-определения ряда аминосодержащих лекарственных веществ химиотерапевтического, анальгезирующего, антиаритмического, иммуномодулирующего и психотропного действия в реакционных смесях, лекарственных формах, биологических жидкостях человека.

В клинических и производственных условиях апробированы методики определения гидразидов кислот, сульфаниламидов, замещенных триптамина, производных и-аминобензойной и w-аминосалициловой кислот, диаминодифенилсульфона, ариламинов, гетероциклических аминов как в различных биологических жидкостях, полученных у пациентов в процессе терапевтического мониторинга, так и в готовых лекарственных формах и постадийном контроле производства.

Результаты исследования метаболических превращений диуцифона и фосфа-бензида в организме пациентов и их фармакокинетики использованы для оптимизации безопасного и эффективного клинического использования этих новых лекарственных средств.

Разработан комплекс неинвазивных методов определения типа генетически детерминированных процессов ацетилирования в организме человека при использовании гидразида изоникотиновой кислоты и сульфадимезина в качестве тест-препаратов. Методы рекомендованы и апробированы при оптимизации безопасной дозировки лекарственных веществ, оценки риска интоксикации, побочных явлений при фармакотерапии, а также установления показателей адаптации организма к интенсивной мышечной деятельности.

Результаты работы используются при проведении аналитического контроля (ОАО "Татхимфармпрепараты", ФГУП ФНПЦ ТКНПП им. В.И. Ленина", Казанская академия ветеринарной медицины), в фармакокинетических исследованиях (Казанский государственный медицинский университет), биохимических исследованиях функционального состояния спортсменов, оценке степени их тренированности (Казанский государственный педагогический университет), для обеспечения экологической безопасности личного состава (Министерство обороны РФ) и внедрены в лечебную практику Республиканского клинического противотуберкулезного диспансера (Казань), Республиканской клинической больницы Татарстана, Казанской городской клинической больницы № 6, детской городской клинической больницы №9 им. Г.Н Сперанского (Москва).

Экспериментальные результаты и выводы на их основе использованы в учебном процессе Казанского государственного технологического университета в дисциплинах "Контроль качества лекарственных препаратов", "Экологический мониторинг" и Казанского государственного медицинского университета в последипломном образовании провизоров.

На защиту выносится:

• Результаты исследования и подбор оптимальных условий проведения аналитических определений аминосодержащих лекарственных веществ в проточных системах (проточно-инжекционный анализ, тест-методы, высокоэффективная жидкостная и тонкослойная хроматография).

• Обоснование роли растворителя и компонентов анализируемой матрицы в формировании аналитического сигнала при определениях аминосодержащих лекарственных веществ в виде их производных в равновесных и неравновесных условиях.

• Результаты изучения влияния состава потока и его гидродинамических параметров, рН, свойств используемого реагента и определяемого вещества на выбор условий избирательного и чувствительного детектирования ЛВ и компонентов их синтеза в системе проточно-инжекционного анализа, высокоэффективной жидкостной и тонкослойной хроматографии.

• Методики проточно-инжекционного, хроматографического и спектрофотометри-ческого определения гидразидов кислот, сульфаниламидов, производных п-аминобензойной и w-аминосалициловой кислот, замещенных триптамина, диами-нодифенилсульфона, и-аминофенола, о-фениленди-амина, гетероциклических аминов в промышленных и модельных смесях, лекарственных формах и биологических жидкостях.

• Способы определения фенотипа ацетилирования при изучении фармакокинетики тест-препаратов сульфадимезина и изониазида в слюне и моче пациентов и результаты их применения в клинических условиях, а также в режиме профессиональной спортивной деятельности.

• Данные по индукции N-ацетилтрансферазы при клиническом использовании ряда лекарственных препаратов.

• Данные по фармакокинетике и метаболизму диуцифона и фосфабензида в организме человека.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на III - V Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, 1996, 1997, 1998), I

Съезде Российского научного общества фармакологов (Волгоград, 1995), Международной конференции "Ncurochcmistry and Pharmacology of Drug Addiction and

Alcoholism" (С.-Петербург, 1996), Всероссийской конференции "Экоаналитика-96"

Краснодар, 1996), Всероссийской конференции "Мутагены и канцерогены окружающей среды. Проблемы антимутагенеза" (Казань, 1996), II конгрессе "Традиционная медицина. Теоретические и практические аспекты" (Чебоксары, 1996), Российском научно-практическом семинаре "Современное состояние теории и практического применения метода ТСХ" (Москва, 1996), Межвузовской конференции "Актуальные проблемы современной фармакотерапии" (Саратов, 1996), Международной конференции "Современные пути развития гомеопатии и проблемы создания рациональных лекарственных форм" (Пятигорск, 1996), II Международном конгрессе "European Association for Clinical Pharmacology and Therapeutics" (Берлин, 1997), XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (С.-Петербург, 1998), III Всероссийской конференции "Экоаналитика - 98" (Краснодар, 1998), V Международной конференции "Наукоемкие химические технологии" (Ярославль, 1998), II Всероссийском симпозиуме «Проточный химический анализ» (Москва, 1999), V Всероссийской конференции "Электрохимические методы анализа" (Москва, 1999), Поволжской региональной конференции (Казань, 1999), Региональной конференции "Методы аналитического контроля материалов и объектов окружающей среды" (Пермь, 2001), Поволжской конференции по аналитической химии (Казань, 2001), Всероссийском симпозиуме "Тест-методы химического анализа" (Москва, 2001), Научно-практической конференции "Окружающая среда и здоровье" (С.-Петербург, 2001), 28 Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001), V Всероссийской конференции "Экоаналитика-2003" (С.-Петербург, 2003), XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003), итоговых научных конференциях КГТУ (Казань, 1994 - 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 31 статья, 6 учебных пособий и методических указаний, 35 тезисов докладов и получен 1 патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; литературного обзора; четырех глав экспериментальной части, в которых описана аппаратура, объекты, техника эксперимента и изложены результаты с их обсуждением; выводов; заключения и списка использованной литературы. В приложении представлены акты использования разработанных аналитических методик.

ВЫВОДЫ

1. Сформулированы научно-методические основы применения проточных методов анализа для контроля качества, производства и биофармацевтических исследований аминосодержащих лекарственных веществ.

2. Впервые показана возможность проточно-инжекционных определений со спектрофотометрическим детектированием аминосодержащих лекарственных веществ химиотерапевтической, анальгезирующей, антиаритмической, нейромедиатор-ной, иммуномодулирующей и психотропной активностью в биологических жидкостях и лекарственных формах. Установлены факторы регулирования избирательности и чувствительности определений лекарственных веществ выбором реагента, подбором состава растворителя в потоках носителя и реагента и направленным изменением спектральных характеристик производных определяемых веществ.

3. Разработан комплекс избирательных и чувствительных методик проточно-инжекционного определения гидразидов кислот, сульфаниламидов, производных п-аминобензойной, и-аминосалициловой кислот и диаминодифенилсульфона, солей бензилпенициллина, гетероциклических аминов в смесях сложного состава и биологических жидкостях с производительностью до 36 проб/ч, интервалом определяемых содержаний 0,04-13,2 мкг/мл, пределом обнаружения до 0,02 мкг/мл. Методики про-точно-инжекционного определения лекарственных веществ апробированы при контроле качества многокомпонентных лекарственных форм и в биофармацевтическом анализе.

4. Предложены и прошли клиническую апробацию неинвазивные методы фенотипической оценки генетически детерминированных процессов биотрансформации аминосодержащих ксенобиотиков в организме человека по типу ацетилирования. Установлены фармакокинетические параметры экскреции гидразида изоникотиновой кислоты и сульфадимезина в слюне и моче при использовании спектрофотометрического детектирования их производных, позволяющие достоверно определять фенотип обследуемых. Показана перспективность использования комплекса разработанных методов для оптимизации фармакотерапии, обеспечения безопасности и оценки риска при работе с экотоксикантами.

5. На основе изучения фармакокинетики аминосодержащих тест-препаратов методами ВЭЖХ, ПИА и спектрофотометрии получены данные по индукции N-ацетилтрансферазы во время интенсивной мышечной деятельности и при клиническом применении ксимедона, пантотената кальция и пиридоксина. Тримодальность распределения фенотипа ацетилирования у спортсменов установлена впервые. Показана возможность осуществления коррекции доз лекарственных препаратов для эффективного и безопасного их применения с учетом фенотипических особенностей пациентов.

6. На основании исследования фармакокинетики фосфабензида и диуцифона показано, что процессы биотрансформации лекарственных веществ обуславливают генетически детерминированные реакции их ацетилирования. Установлено, что метаболитом диуцифона на стадии его абсорбции при приеме per os является диаминоди-фенилсульфон, определены основные фармакокинетические параметры метаболита и гидролитическая устойчивость лекарственного вещества in vitro и in vivo. Установлена степень связывания фосфабензида плазмой крови и эритроцитами человека.

7. Предложен комплекс проточных методов (ВЭЖХ, ПИА) для постадийного контроля токсичных компонетов производств аминосодержащих лекарственных веществ. Избирательность и чувствительность определения ароматических аминов и гидразинов в технологических средах, готовой продукции и сточных водах химико-фармацевтических производств обеспечивается при использовании приемов кинетического регулирования аналитических реакций. Разработаны методики определения w-аминофенола, о-фенилендиамина, гидразина, 1,1-диметилгидразина и других токсичных аминов в реакционных смесях, технических продуктах и готовой продукции. Методики использованы для исследования процессов, протекающих при хранении готовых лекарственных форм на основе парацетамола и установления их безопасности.

8. Установлены условия хемосорбционного концентрирования ариламинов и гидразинов из воздушной среды химико-фармацевтических производств трубками с иммобилизованными реагентами и последующего ВЭЖХ определения. Предложены методики сорбционно- и экстракционно-хроматографического определения ароматических аминов и замещенных гидразина в воздушной среде и сточных водах с пределом обнаружения аналитов 0,7 мкг/м3 и 0,05 мкг/л.

9. Для оценки безопасности технологических процессов и персонала химико-фармацевтических производств показана возможность использования автоматических сигнализаторов для проточного аналитического контроля, тест-методов в виде индикаторных трубок и тест-полосок. Оптимизированы условия и схемы аналитических определений, предложены методические приемы количественных измерений спектральных характеристик селективных слоев тест-средств.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приведенные результаты, таким образом, показывают высокую эффективность использования проточных методов анализа в контроле качества, производстве и биофармацевтических исследованиях аминосодержащих лекарственных веществ. Важную роль играют с точки зрения чувствительности и селективности определений лекарственных веществ реакции получения их производных как в равновесных, так и проточных условиях. Они расширяют возможности использования проточных методов анализа в фармацевтической химии за счет усиления хромофорных и других свойств аналита в проточно-инжекционном анализе, высокоэффективной жидкостной и тонкослойной хроматографии, тест-методах и проточных автоматизированных средствах газового анализа для повышения производительности аналитических определений при проведении биофармацевтического анализа, контроле химико-фармацевтического производства и обеспечения безопасности персонала.

Вариации методов ПИА, ВЭЖХ и ТСХ позволяют регулировать соотношение информативности и экономичночти при анализе аминосоединений в матрице сложного состава на уровне их следовых количеств.

Проточные методы анализа эффективны для контроля качества различных фармацевтических продуктов (субстанций, лекарственных форм), определения токсичных компонентов реакционных смесей в процессе синтеза лекарственных веществ, позволяют проводить исследование процессов, протекающих при хранении готовых лекарственных форм и установления их безопасности.

Роль проточных методов важна с точки зрения исследования взаимодействия лекарственных веществ и организма человека. Особо следует отметить применимость высокопроизводительных проточных методов для определения тест-маркеров генетически детерминированных процессов биотрансформации аминосодержащих ксенобиотиков в организме человека, особенно при использовании спектрофотометриче-ского варианта детектирования. Разработанный комплекс неинвазивных, доступных для клинической и производственной практики методов оценки фенотипа ацетилирования может быть легко адаптирован к клиническим условиям и может быть использован для ранней досимптоматической диагностики заболеваний, оценки риска канцерогенеза и интоксикации, индивидуальной химической чувствительности. При этом предложенные методы оценки биохимического фенотипа существенно дополняют молекулярно-генетические и цитогенетические аналитические технологии, а в ряде случаев служат им реальной альтернативой, поскольку проявление токсических и патологических эффектов является следствием фенотипических особенностей организма.

Полученные результаты указывают на перспективность дальнейшего развития работы в рамках автоматизации анализа биологических жидкостей при проведении терапевтического и токсикологического мониторинга проточными методами в сочетании с использованием диализных систем ш vivo; сложных промышленных смесей синтеза лекарственных веществ, разработки при этом многоканальных систем ПИА с интегрированными системами детектирования и экстракционного концентрирования; создания проточных систем для определения биодоступности и распадаемости в системе ПИА различных лекарственных форм; развитии идеологии последовательного инжекционного анализа в фармацевтической химии.