Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Установление взаимозаменяемости воспроизведенных противоопухолевых лекарственных средств

ШАМАЛЬ ЛИЛИЯ ЛЕВОНОВНА

УСТАНОВЛЕНИЕ ВЗАИМОЗАМЕНЯЕМОСТИ ВОСПРОИЗВЕДЕННЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

„„„ 15 ФЕВ 7015

005559566

005559566

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Раменская Галина Владиславовна - доктор фармацевтических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Каленикова Елена Игоревна - доктор фармацевтических наук, доцент, заведующая кафедрой фармацевтической химии, фармакогнозии и организации фармацевтического дела, факультет фундаментальной медицины ФГБОУ ВО Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Ковалева Елена Леонардовна - доктор фармацевтических наук, заместитель директора Центра экспертизы и контроля готовых лекарственных средств ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Защита состоится: »<^^-^2015 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России по адресу: 117997, г.Москва, Нахимовский проспект д. 49 и на сайте ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова http ://www.mma.ru.

Автореферат разослан « "ffv>2015 г.

Учёный секретарь

Диссертационного совета Д 208.040.09 доктор фармацевтических наук,

профессор Демина Наталья Борисовна

ШАМАЛЬ ЛИЛИЯ ЛЕВОНОВНА

УСТАНОВЛЕНИЕ ВЗАИМОЗАМЕНЯЕМОСТИ ВОСПРОИЗВЕДЕННЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Раменская Галина Владиславовна - доктор фармацевтических наук, профессор Официальные оппоненты:

Каленикова Елена Игоревна - доктор фармацевтических наук, доцент, заведующая кафедрой фармацевтической химии, фармакогнозии и организации фармацевтического дела, факультет фундаментальной медицины ФГБОУ ВО Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Ковалева Елена Леонардовна - доктор фармацевтических наук, заместитель директора Центра экспертизы и контроля готовых лекарственных средств ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Защита состоится: « » 2015 г. в часов на заседании Диссертационного

совета Д 208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России по адресу: 117997, г.Москва, Нахимовский проспект д. 49 и на сайте ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова http://www.mma.ru.

Автореферат разослан« » 2015 г.

Учёный секретарь

Диссертационного совета Д 208.040.09 доктор фармацевтических наук,

профессор Демина Наталья Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования.

Одной из актуальных задач Здравоохранения РФ является обеспечение качественного и доступного медицинского обслуживания граждан. Для своевременного оказания необходимой медицинской помощи необходимо обеспечить условия высокого уровня производства и надлежащую оценку эффективности и безопасности лекарственных препаратов. Для оценки эффективности противоопухолевых лекарственных препаратов фармакокинетические исследования можно проводить только при участии и предварительном согласии пациентов, что может быть затруднено в связи с этическими проблемами. В некоторых зарубежных странах (США, Европейской Ассоциации Здравоохранения и т.д.) широко используется упрощенная процедура оценки эффективности и безопасности лекарственных препаратов, основанная на изучении их биофармацевтических свойств. Такие исследования позволяют в более короткие сроки оценить взаимозаменяемость воспроизведенных лекарственных препаратов в условиях in vitro. Согласно документу научного центра экспертизы средств медицинского применения (НЦЭСМП ФГБУ Методические указания, Москва 2013 г.), для оценки эквивалентности воспроизведенных лекарственных препаратов с различными дозировками, а также для оценки различных лекарственных форм с одинаковыми дозировками одного и того же препарата, допустимы исследования их биофармацевтических свойств. Изучение биофармацевтических свойств воспроизведенных лекарственных препаратов сводится к исследованиям:

• активных фармацевтических субстанций лекарственного средства, на основании его биофармацевтической растворимости, что позволяет оценить действующее вещество лекарственного средства;

• кинетики растворения лекарственного препарата, с помощью которой оценивается степень высвобождения действующего вещества (ДВ) из лекарственного препарата.

Таким образом, оценив как действующее вещество лекарственного средства, так и лекарственный препарат (ЛП) можно сделать заключение о возможной взаимозаме-

няемости воспроизведенных лекарственных средств еще на стадии разработки твердых дозированных лекарственных форм, с целью выявления отличий препаратов еще на лабораторном (фармацевтическом) этапе и не переходить, в случае отрицательного результата, к дорогостоящим исследованиям биоэквивалентности. Все изложенное выше позволяет заключить, что установление взаимозаменяемости воспроизведенных противоопухолевых лекарственных средств, в том числе в условиях in vitro является актуальной задачей.

Степень разработанности темы исследования. Несмотря на огромный арсенал изученных подходов к испытанию воспроизведенных противоопухолевых препаратов и разнообразие предложенных методик, степень разработанности темы исследования остается актуальной. Поиск усовершенствованных технологий при разработке лекарств усиливают необходимость совершенствовать и разнообразить методы их оценки.

Цель исследования - установить взаимозаменяемость воспроизведенных противоопухолевых лекарственных средств на основании их биофармацевтических свойств.

Задачи исследования:

1. Осуществить выбор объектов исследования на основании распоряжения Правительства РФ №1141 от 06.07.2010 о стратегически значимых лекарственных препаратах, производство которых должно быть запущено на территории РФ к 2015 г.

2. Разработать и валидировать методики определения биофармацевтической растворимости изучаемых лекарственных средств.

3. Провести анализ биофармацевтической растворимости действующих веществ (ДВ) исследуемых препаратов.

4. Подобрать оптимальные условия и провести валидацию методик теста сравнительной кинетики растворения (ТСКР) выбранных объектов исследования.

5. Провести тест сравнительной кинетики растворения исследуемых лекарственных препаратов.

6. Классифицировать исследуемые ЛП согласно биофармацевтической классификационной системе (БКС) на основании литературных данных о проницаемости и с

учетом полученных экспериментальных данных (растворимость, кинетика растворения).

7. Сделать заключение о возможности применения методов in vitro в оценке взаимозаменяемости изучаемых лекарственных средств.

Научная новизна. Впервые были разработаны методики оценки биофармацевтической растворимости действующих веществ и теста сравнительной кинетики растворения исследуемых препаратов - темозоломида, иматиниба, капецитабина. На основании данных о растворимости действующих веществ избранные ЛП были классифицированы по БКС. На основании проведенных исследований установлена взаимозаменяемость воспроизведенных испытуемых препаратов.

Теоретическая значимость работы. Представленные в диссертационной работе методики оценки взаимозаменяемости противоопухолевых препаратов в условиях in vitro могут быть применены на стадии разработки лекарственных препаратов.

Практическая значимость полученных результатов.

Разработанные методики определения растворимости действующих веществ воспроизведенных препаратов были использованы на этапе исследования ЛП в НИИ фармации. Испытания ТСКР были использованы производителями указанных ЛП на этапе разработки, выборе оптимального состава вспомогательных веществ, прогнозирования биоэквивалентности отечественных капсул Темозоломида (140 мг, 180 мг); капсул Иматиниба 100 мг и таблеток Капецитабина 500 мг.

Методология и методы исследования включают в себя испытания действующих веществ (ДВ) и оценку лекарственных препаратов, основанных на биофармацевтической растворимости ДВ и степени высвобождения ДВ из ЛП в различных средах рН (1,2; 4,5; 6,8), что отражает рН желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). В процессе исследования также использовали УФ-спектрофотометрию для оценки оптических плотностей ДВ испытуемых препаратов.

Публикации. На основании данных диссертационного исследования опубликовано восемь печатных работ, две статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, одна - в иностранном журнале и фрагменты диссертационной работы включены в

монографию «Руководство по инструментальным методам исследований при разработке и экспертизе качества лекарственных препаратов» (2014 г.).

Степень достоверности и апробация работы. Основные результаты доложены и обсуждены на "Первой Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков "Инновационные технологии в медицине XXI века" (6-7 декабря 2012 г.); на научно-практической итоговой студенческой конференции с международным участием "Татьянин день" (Москва, 2012); Конкурсе научных инновационных работ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (Москва, 2012), научном совете НИИ фармации (Москва, 2013).

Личный вклад автора. Лично автором проведен научно-обоснованный поиск объектов исследования из перечня стратегически значимых ЛС, утвержденных распоряжением Правительства РФ №1141 от 06.07.2010. Автором проведен поиск новых эффективных методов оценки взаимозаменяемости воспроизведенных противоопухолевых лекарственных средств (ЛС) in vitro, на основании анализа отечественной и зарубежной нормативной документации. Автором разработаны и валидирова-ны методики изучения биофармацевтической растворимости субстанций исследуемых препаратов и методики теста сравнительной кинетики растворения. Лично автором проведены экспериментальные исследования по установлению взаимозаменяемости противоопухолевых лекарственных средств (темозоломида, иматиниба и капецитабина), а также статистическая обработка и УФ-спектрофотометрия.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения соответствуют формуле специальности 14.04.02 - «фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Связь темы исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы НИИ фармации Первого МГМУ им. И.М.Сеченова "Развитие научных и научно-методических основ, базовых и инновационных подходов при разработке, внедрении и применении лекарственных средств". Номер государственной регистрации: 01201261653.

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты разработанных методик определения биофармацевтической растворимости темозоломида, иматиниба и капецитабина.

- классификация темозоломида, иматиниба и капецитабина по БКС на основании растворимости их действующих веществ.

- условия и подходы методики ТСКР для препаратов темозоломида, иматиниба и капецитабина.

Внедрение результатов в практику. Методики определения растворимости субстанций и методики ТСКР определения темозоломида, иматиниба и капецитабина внедрены в работу отдела разработки лекарственных средств НИИ фармации Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 стр. машинописного текста и состоит из введения, глав: "Обзор литературы", "Экспериментальная часть", включающая обработку результатов исследования, выводов и списка литературы из 108 источников (61 из которых зарубежные). Работа иллюстрирована 25 рисунками и 42 таблицами, результаты эксперимента обработаны статистически, обобщены в таблицах, проиллюстрированы рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Объекты исследования.

В качестве объектов исследования были выбраны стратегически значимые противоопухолевые лекарственные средства из списка жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов (ЖНВЛП)

1. Лекарственные препараты темозоломида: исследуемый ЛП - Темозоломид (капсулы 140 мг, 180 мг, Россия); референтный ЛП - Темодал (капсулы 250 мг, Шеринг-Плау Лабо Н.В., Бельгия).

2. Лекарственные препараты иматиниба: исследуемый ЛП - Иматиниб (капсулы 100 мг, Россия); референтный ЛП - Гливек (капсулы 100 мг, Новартис Фарма АГ, Швейцария).

3. Лекарственные препараты капецитабина: исследуемый ЛП - Капецитабин (таблетки, покрытые оболочкой, 500 мг, Россия); референтный ЛП - Кселода (таблетки, покрытые оболочкой, 500 мг, производитель Ф. Хоффманн-Ля Рош Лтд. (Швейцария)).

В работе использованы темозоломид, иматиниб и капецитабин, а также стандартные образцы: темозоломид (Россия, содержание темозоломида 99,86%); имати-ниба мезилат (Россия, содержание иматиниба мезилата 98,97 %); капецитабин (Россия, содержание капецитабина 99,75%).

Оборудование и реактивы.

В работе использовалось следующее оборудование для проведения изучения биофармацевтической растворимости и проведения теста сравнительной кинетики растворения: UV-Vis спектрофотометр «Cintra 101» (Австралия); рН-метр FiveEasy™ FE20, Mettler Toledo (Швейцария); термошейкер для микропробирок Biosan TS-100C (Латвия); магнитная мешалка Intelli-Stirrer MSH-300Í, Biosan (Латвия); весы аналитические OHAUS Discovery DV214C (Швейцария); мерные колбы класса «А» вместимостью 10, 50, 100, 200 и 1000 мл; мерные цилиндры класса «В» вместимостью 500 и 1000 мл; аналитические пипетки класса «AS» вместимостью 1 мл; дозаторы переменного объема Ленпипет Лайт 100 - 1000 мкл; микропробирки типа Eppendorf вместимостью 2 мл.

В работе использовались следующие реактивы: вода для хроматографии (ГФ XII, ч.1,с.253), хлористоводородная кислота концентрированная (Сигма Тек, Россия, «х.ч.»), уксусная кислота ледяная (Рапгеас, Испания, «х.ч.»), натрия ацетат тригидрат (Рапгеас, Испания, «х.ч.»), калия фосфат однозамещенный (Рапгеас, Испания, «ч.д.а.»), натрия фосфат двузамещенный двенадцативодный (Рапгеас, Испания, «ч.д.а.»), ортофосфорная кислота 85 % (Рапгеас, Испания, «х.ч.»), натрия хлорид (Рапгеас, Испания, «ч.д.а.»), натрия гидроксид (Рапгеас, Испания, «х.ч.»), спирт 96 % (ГФ XII).

Нормативные документы

Экспериментальное изучение биофармацевтической растворимости субстанций проводили согласно разработанной методике. Поиск информации по

биофармацевтическим свойствам (растворимость, проницаемость) проводили в публикациях в рецензируемых научных журналах и монографиях, а также в базах данных по БКС.

Проведение теста сравнительной кинетики растворения осуществляли согласно Руководству по экспертизе лекарственных средств (ФГБУ НЦЭСМП, Москва, Том I, 2013 г.).

Изучение биофармацевтической растворимости субстанции Определение равновесной растворимости проводят на приборе - термошейкере Biosan TS-100 (Латвия) в течение 24 ч. при 1000 об/мин.(темозоломид); 1400 об/мин (иматиниб и капецитабин) и 37 °С в трех средах: буферных растворах с pH 1,2; 4,5; 6,8.

1. Телюзоломид. Испытание проводят в трех повторностях для каждой из сред растворения. В микропробирку Eppendorf вместимостью 1,5 мл со средой растворения (объем среды растворения 0,25 мл) помещают по 0,025 г субстанции темозоло-мида, встряхивают в течение 24 часов. Спустя 24 ч. после встряхивания на термошейкере микропробирки помещают в центрифугу Thermo при 15200 об/мин на 15 минут.

2. Иматиниб. Испытание проводят в трех повторностях для каждой из сред растворения. В микропробирку Eppendorf вместимостью 1,5 мл со средой растворения (объем среды растворения 1 мл) помещают по 100 мг субстанции иматиниба ме-зилата. Спустя 24 ч после начала испытания пробы сразу центрифугируют. 100 мкл надосадочной жидкости помещают в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляют 4,9 мл соответствующей среды растворения с помощью дозаторов переменного объема, перемешивают на вортексе в течение 20 секунд (разведение 1). 100 мкл полученного раствора помещают в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляют 4,9 мл среды растворения, также перемешивают (разведение 2 — конечное для фосфатного буфера pH 6,8). 1 мл полученного раствора помещают в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляют 4,0 мл среды растворения, также перемешивают (разведение 3 - конечное для 0,1 М HCl и ацетатного буфера pH 4,5).

3. Капецитабин. Испытание проводят в трех повторностях для каждой из сред растворения. В микропробирку Eppendorf вместимостью 1,5 мл со средой растворения (объем среды растворения 1 мл) помещают по 100 мг субстанции капецитабина. Спустя 24 ч после начала испытания пробы незамедлительно центрифугируют. 100 мкл надосадочной жидкости помещают в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляют 4,9 мл соответствующей среды растворения с помощью дозаторов переменного объема, перемешивают на вортексе в течение 20 секунд (разведение 1). 100 мкл полученного раствора помещают в центрифужные пробирки вместимостью 10 мл и прибавляют 4,9 мл среды растворения, также перемешивают (разведение 2).

Количественное определение лекарственных веществ в полученных растворах проводят методом УФ-спектрофотометрии. Оптическую плотность проб измеряют при максимуме поглощения 330 нм (темозоломид); 265 нм (иматиниб) и 310 нм (капецитабин) в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя соответствующую среду растворения в качестве раствора сравнения. В среде растворения 0,1 M хлористоводородной кислоты максимум поглощения проб капецитабина составил 266 нм, что свидетельствует о разложении вещества до 5-фторурацила.

Значения биофармацевтической растворимости субстанций рассчитывают по DiXc„xVxP

формуле: а,хюо 'где

S - биофармацевтическая растворимость, мг/мл;

Д - оптическая плотность испытуемого раствора;

Dsl - оптическая плотность стандартного раствора;

V— разведение испытуемого раствора;

Р - содержание исследуемой субстанции в стандартном образце, %.

Статистическую обработку результатов эксперимента осуществляют с использованием пакета Microsoft Office Excel 2010 путем расчета среднего значения количества растворившейся субстанции и относительного стандартного отклонения (RSD, %).

Для каждой величины растворимости субстанции в соответствующем буферном растворе проводят расчет отношения дозы к растворимости, которое рассчитывают по формулам, рекомендованным ВОЗ и FDA:

Растворимость субстанций считается «высокой», если величина D/S имеет значения менее 250 мл.

Расчет дозового числа (D0 = 250 х S, мг/мл / Dmax, мг, где S, мг/мл - биофармацевтическая растворимость, Dmax, мг - максимальная дозировка, зарегистрированная в РФ к медицинскому применению) и отношения дозы к растворимости (D/S = Dmax, мг / S, мг/мл), которые проводят для временной точки 24 ч, приведены в таблицах.

Валидация методик. Разработанная методика количественного определения темозоломида подвергнута процедуре валидации. Специфичность методики подтверждена путем снятия спектров сред растворения и соответствующих стандартных растворов. При аналитических длинах волн оптическая плотность сред растворения не отличалется от нуля и не вносит свой вклад в оптическую плотность раствора. Результаты оценки линейности методики приведены в таблице 1.

Таблица 1. Оценка линейности методики количественного определения темозоломида

Концентрация полученного стандартного раствора, мг/мл (введено) Концентрация полученного стандартного раствора, % от номинального (введено) Концентрация полученного стандартного раствора, мг/мл (найдено) Концентрация полученного стандартного раствора, % от номинального (найдено)

0,0151 140 0,0153 140,00

0,0127 120 0,0130 119,10

0,0113 100 0,0114 102,73

0,0089 80 0,0091 81,82

0,0064 60 0,0065 59,09

0,0043 40 0,0047 41,82

Коэффициент корреляции линейной зависимости (г2) составляет 0,9992. Остаточный член линейной зависимости незначительно отличается от нуля (1,808). Результаты оценки правильности и прег/изионности приведены в таблице 2.

Таблица 2. Оценка правильности и прецизионности методики количественного определения

темозоломида

введено (%) найдено (%) найдено (%), среднее значение %

40 41,42 40,72 0,69 1,70 1,80

40,46

40,30

100 102,41 101,77 0,57 0,56 1,77

101,44

101,46

140 140 140,29 0,27 0,19 0,21

140,36

140,51

Результаты определения правильности и прецизионности соответствуют нормам, поскольку для всех уровней концентраций величины относительного стандартного отклонения (Я8ГЗ, %) и относительной погрешности (е, %) не превышают 2 %. Результаты оценки промежуточной прецизионности приведены в таблице 3.

Таблица 3. 011енка прецизионности методики количественного определения темозоломида

Лаборатория 1 (Лаборатория технологии и анализа НИИ фармации), найдено (%) Лаборатория 2 (Лаборатория фармако-кннетики НИИ фармации, найдено (%)

Измерение 1 102,45 100,05

Измерение 1 101,43 100,24

Измерение 1 101,45 99,91

Измерение 1 101,53 100,23

Измерение 1 101,83 100,26

Измерение 1 101,28 100,33

среднее, % 101,55 100,18

во 0,44 0,16

1Ш), % 0,43 0,16

среднее|п1г„ % 100,89

0,84

КЯО,„1г. (п =12) 0,83

На оценки линейности, правильности и прецизионности методики установлен ее аналитический диапазон: 0,0047 - 0,0153 мг/мл.

Результаты оценки устойчивости (робастности) методики приведены в таблицах 4 (для среды рН 4,5) и 5 (для среды рН 6,8).

Результаты устойчивости (робастности) соответствуют принятым нормам, поскольку для всех уровней концентраций величины относительного стандартного отклонения (ЯБО, %) и относительной погрешности (с, %) не превышают 2 % при изменении рН 1,2; рН 4,5 и рН 6,8.

Таблица 4. Оценка устойчивости методики количественного определения темозоломида (рН 4,5)

введено (%) найдено (%) найдено (%), среднее значение в-а 1*8Г>, % е, %

40 40,82 40,76 0,16 0,40 1,89

40,57

40,88

100 100,45 101,19 0,64 0,63 1,19

101,54

101,58

140 140,84 140,81 0,09 0,06 0,58

140,71

140,88

Таблица 5. Оценка устойчивости методики количественного определения темозоломида (рН 6,8)

введено (%) найдено (%) найдено (%), среднее значение 8. Г). К81), % Е, %

40 39,31 39,22 0,10 0,24 -1,96

39,22

39,12

100 98,95 99,01 0,05 0,05 -0,99

99,02

99,05

140 138,56 138,71 0,15 0,10 -0,92

138,71

138,85

Таким образом, разработанная методика количественного определения темо-золомида валидирована по основным валидационным характеристикам, что позволяет ее применять для оценки биофармацевтической растворимости темозоломида.

Тест сравнительной кинетики растворения. Тип аппарата для теста сравнительной кинетики растворения - «вращающаяся корзинка» при 100 об/мин для капсул темозоломида и таблеток капецитабина и «лопастная мешалка» при 50 об/мин для капсул иматиниба. Во «вращающуюся корзинку» из 6 сосудов, объемом 900 мл, при 100 об/мин, предварительно термостатированных при 37 ± 0,5°С, помещают по одной капсуле каждого из препаратов Темозоломида. Последовательный отбор проб проводят через 10, 15, 20, 30 мин по 5 мл, причем такой же объем соответствующего буферного раствора добавляют в среду растворения для сохранения объема. Полученным пробам дают охладиться при комнатной температуре в течение 20-30 мин, затем фильтруют через мембранный фильтр «CHROMAFIL®». Для получения статистически достоверных результатов исследование проводят 6 раз для каждого препарата. Параллельно и аналогичным образом проводят исследование референтного ЛП - Темодала. Аналогичным образом проводят тест сравнительной кинетики растворения для тестового препарата Капецитабина и референтного препарата Кселоды с единственной разницей в точках отбора проб. У Капецитабина дополнительно отбирают пробы после 5 мин от начала испытания; точки отбора проб составляют: 5, 10, 15, 20, 30 минут, соответственно. Для иматиниба используют «лопастную мешалку» (скорость вращения 50 об/мин) из 6 сосудов с объемом среды 1000 мл. Количественное определение проводят методом УФ-спектрофотометрии. Оптическую плотность проб измеряют на спектрофотометре Cintra 101, GBC, при длине волны 330 нм (темозоломид), 265 нм (иматиниб), 310 нм (капецитабин) в кювете с толщиной слоя 10 мм. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора стандарта с заданной концентрацией в соответствующем буфере. В качестве раствора сравнения используют тот же буферный раствор, который использовался в качестве среды растворения.

Обработка результатов исследования. Эквивалентность кинетики растворе-

ния лекарственного средства оценивают, исходя из фактора сходимости (/у, который рассчитывают по уравнению:

1-0.5

х 100

/2 = 50Х1ОВ1(

1 1=п ? 1+(-) I ()2 и /=1

где

Я, - количество лекарственного средства, перешедшее в раствор из препарата сравнения в /-той временной точке (в среднем, в процентах); Т, - количество лекарственного средства, перешедшее в раствор из испытуемого препарата в /-той временной точке (в среднем, в процентах).

Величина стандартного отклонения для каждого среднего значения, за исключением первой временной точки, не должна быть больше 10%.

Кинетика растворения лекарственного средства считается эквивалентной, если значение лежит в пределах от 50 до 100. В том случае, когда более 85% лекарственного средства переходит в раствор в течение 15 мин, кинетика растворения считается эквивалентной без математической оценки.

По результатам статистической обработки, величины стандартных отклонений ни в одном из случаев не превышают 10%. Во всех случаях в течение 15 минут в раствор переходит более 85% лекарственного вещества, поэтому кинетика растворения исследуемых препаратов считается эквивалентной без математической оценки.

Результаты и их обсуждение

На основании экспериментальных данных биофармацевтическая растворимость для каждой субстанции в физиологическом диапазоне рН (1,0 — 6,8) оценена нами как «высокая» (табл.6). Принимая во внимание «высокую» проницаемость субстанций темозоломида, иматиниба и капецитабина, их следует отнести к I Классу БКС. Данные теста сравнительной кинетики растворения представлены в таблицах 7 - 10.

Во всех случаях (в трех средах рН 1,2; 4,5; 6,8) в течение 15 минут в раствор

переходит более 85% лекарственного вещества, поэтому кинетика растворения исследуемых препаратов считается эквивалентной без математической оценки.

Величина стандартного отклонения для каждого среднего значения, за исключением первой временной точки, не должна быть больше 10%, что подтверждено статистической обработкой полученных результатов, значения которых приведены в таблице 11.

Таблица 6. Биофармацевтическая растворимость субстанций в трех средах

Название субстанции/ стандартного образца Среда растворения Растворимость, мг/мл (среднее значение) Дозовое число 0„>1 (среднее значение) D/S, мл (среднее значение) D/S < 250 растворимость «высокая/ низкая»

Темозоломид РН 1,2 6,54 6,54 38,25 «высокая»

рН 4,5 6,44 6,44 38,89

рН 6,8 6,62 6,56 38,15

Иматиниба мезилат рН 1,2 88,97 222,43 1,12 «высокая»

рН 4,5 145,21 363,02 0,69

рН 6,8 16,35 40,86 6,12

Капецитабин рН 1,2 - - -

рН 4,5 27,4591 13,73 18,21 «высокая»

рН 6,8 25,4686 12,73 19,63

Таблица 7. Значения степени высвобождения темозоломида через 15 и 30 минут

Время, мин Препарат Значения рН Скорость растворения

1,2 4,5 6,8

15 Т 93,88 93,09 93,53 Быстро растворим

R 96,02 95,90 98,33 Быстро растворим

30 Т 103,47 102,48 102,16

R 98,74 100,25 99,11

Таблица 8. Значения степени высвобождения гшатиниба через 15 и 30 минут

Время, мин Препарат Значения pH Скорость растворения

1,2 4,5 6,8

15 Т 91,39 99,46 92,23 Быстро растворим

R 90,59 95,99 97,44 Быстро растворим

30 Т 93,22 101,04 98,06

R 99,42 104,39 108,03

Таблица 9. Значения степени высвобождения капецитабина через 15 и 30 минут

Время, мин Препарат Значения pH Скорость растворения

1,2 4,5 6,8

15 Т - 93,83 94,25 Быстро растворим

R - 85,74 84,81 Быстро растворим

30 Т - 103,60 102,95

R - 105,55 105,94

Таблица 10. Значения степени высвобождения темозоломида (Т), гшатиниба (И) и KaneifumaöuHa (К) в трех средах.

Время, мин Препарат Значения pH 1,2 Значения pH 4,5 Значения pH 6,8

15 Test 93,88 91,39 - 93,09 99,46 93,83 93,53 92,23 94,25

Ref 96,02 90,59 - 95,90 95,99 85,74 98,33 97,44 84,81

30 Test 103,4 93,22 - 102,48 101,0 103,6 102,1 98,06 102,9

Ref 98,74 99,42 - 100,25 104,3 105,5 99,11 108,0 105,9

Наименование ЛП T И К Т И К Т И К

Ст. высвобождения Быстрорастворимые ЛФ

Таблица 11. Величина стандартного отклонения для каждого среднего значения

RSD, % Темозоломид Временные точки

10 15 20 30

рН 1,2 Т 5,75 6,11 5,31 2,18

R 5,21 6,43 3,25 2,98

рН 4,5 Т 5,76 6,61 5,35 2,38

R 5,41 6,41 3,35 2,99

рН 6,8 Т 5,95 6,21 5,51 2,10

R 5,35 6,45 3,27 3,01

Иматиниб

рН 1,2 Т 5,26 1,39 1,70 2,09

R 46,49 11,79 4,89 4,37

рН 4,5 Т 11,10 4,13 3,78 2,65

R 25,03 4,90 5,83 6,65

рН 6,8 Т 16,55 4,60 2,26 3,03

R 39,41 7,88 4,53 5,28

Капецитабин

рН 1,2 Т - - - -

R - - - -

рН 4,5 Т 4,93 5,37 1,82 1,62

R 4,11 3,30 2,37 5,14

рН 6,8 Т 4,08 4,85 4,71 2,07

R 4,50 3,47 3,34 7,74

Рисунок 1. Усредненные профили высвобождения действующего вещества из капсул Темозоломида 140 мг и Темодала 250 мг.

Рисунок 2. Усредненные профили высвобождения действующего вещества из капсул Темозоломида 180 мг и Темодапа 250

мг.

Рисунок 3. Усредненные профили высвобождения иматиниба из препаратов Иматиниб и Гливек (0,1 Мраствор HCl)

о

5

10 15 20

время (мин)

25 30

Рисунок 4. Усредненные профили высвобождения иматиниба из капсул Иматиниб, и Гливек (ацетатный буферный раствор рН 4,5)

время (мин)

Рисунок 5. Усредненные профили высвобождения иматиниба из капсул Иматиниб, и Гливек (фосфатный буферный раствор рН 6,8)

время (мин)

Рисунок 6. УФ-спектр поглощения стандартного раствора темозоломида в 0,1 Мрастворе хлористоводородной кислоты

Wayolangth (tun)

Ю.00 1.28

Рисунок 7. УФ-спектры поглощения препарата Гливек в 0,1 Мрастворе HCl.

V

ЗЗМОО л» 13»00 Ii«

Рисунок 8. Уф-спектр и значение оптической плотности Капецитабина 0,1 MHCI

<

0,80,60,4 0,20,0-

200

250

300

350

400

Взаимозаменяемость воспроизведенных противоопухолевых испытуемых лекарственных препаратов установлена на основании оценки их биофармацевтических свойств, или исследований in vitro, в трех средах с рН 1,2; 4,5; 6,8. Эквивалентность капсул Темозоломида и Темодала; капсул Иматиниба и Гливека, а также таблеток Капецитабина и Кселоды подтверждена полученными экспериментальными данны-

1. Изучив список лекарственных препаратов, производство которых должно быть обеспечено на территории РФ к 2015 году, были выбраны объекты исследования -противоопухолевые лекарственные средства - темозоломид, иматиниб и капецита-бин. Выбранные препараты входят в перечень ЖНВЛП и являются стратегически значимыми лекарственными препаратами.

2. Разработаны и валидированы методики определения биофармацевтической растворимости темозоломида, иматиниба и капецитабина. Для всех уровней концентраций величины относительного стандартного отклонения и относительной погрешности не превышают 2%.

3. Определена биофармацевтическая растворимость темозоломида, иматиниба и капецитабина. Полученная растворимость признана нами высокой.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ.

4. Подобраны оптимальные условия и проведен тест сравнительной кинетики растворения выбранных объектов исследования в трех средах (рН 1,2; 4,5; 6,8) и проведена валидация методик количественного определения. Предложенные методики характеризуются оптимальными значениями параметров валидации для аналитических методик.

5. Проведен тест сравнительной кинетики растворения испытуемых ЛП. Результаты теста показали, что за 15 минут более 85% действующих веществ высвобождается в среду растворения из ЛП при рН 1,2; 4,5; 6,8.

6. На основании полученных данных биофармацевтической растворимости сделано заключение о принадлежности ЛП темозоломида, иматиниба и капецитабина к 1 -му классу БКС.

7. Установлена взаимозаменяемость противоопухолевых препаратов на основании сопоставления результатов исследований in vitro воспроизведенных препаратов и препаратов сравнения. Препараты Темозоломид, Иматиниб и Капецитабин, отечественного производителя взаимозаменяемы с препаратами Темодал, Гливек и Кселода соответственно на основании результатов вышеперечисленных исследований. Таким образом, показана возможность применения методов in vitro в оценке взаимозаменяемости противоопухолевых ЛП.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Шамаль Л. Л. Методика определения темозоломида по процедуре "биовейвер" // //"Инновационные технологии в медицине XXI века": Тез. докл. - М. 2012 г. - С. 219

2. Шамаль Л.Л. Определение иматиниба в плазме крови пациентов методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором // "Инновационные технологии в медицине XXI века": Тез. докл. - М„ 2012 г. - С. 206.

3. Разработка и валидация методики определения противоопухолевого препарата -капецитабина и его метаболита - 5-фторурацила в плазме крови / Шохин И.Е., Савченко А.Ю., Медведев Ю.В., Шамаль Л.Л. // Разработка и регистрация лекарственных средств. - М, 2012. -№ 1(1).-С. 46-52.

4. Тест сравнительной кинетики растворения стратегически значимого противоопухолевого лекарственного средства - темозоломида / Шамаль JI.JI., Шохин И.Е., Ярушок Т.А., Савченко А.Ю. // Разработка и регистрация лекарственных средств. -М., 2013. - № 1(3).-С. 54-59.

5. Определение иматиниба в плазме крови пациентов методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором / Шохин И.Е., Раменская Г.В., Шамаль JI.JI. [и др.] // Сорбционные и хроматографические процессы. - Воронеж, 2013. - № 13 (2). -С. 220 - 228.

6. Книттер Х.-Ю., Ярушок Т.А., Шамаль JI.JI. [и др.]. Инструментальные методы испытания твердых лекарственных форм по показателям «Растворение», «Распадае-мость», «Механические свойства». Глава 13 в монографии: «Руководство по инструментальным методам исследований при разработке и экспертизе качества лекарственных препаратов». - С. 314-367 / Под ред. Быковского С.Н., проф., д.х.н. Василенко И.А., к.м.н. Харченко М.И. [и др.]. // М. Изд-во Перо, 2014, С. 656.

7. Шамаль JI.JI., Раменская Г.В. Сравнительный тест кинетики растворения противоопухолевых лекарственных средств: темозоломида, иматиниба и капецитабина in vitro II Вестник ЮКГФА, 2014 - том II - №3 (68).

8. Изучение равновесной биофармацевтической растворимости субстанций лекарственных средств, применяемых при лечении онкологических заболеваний / Шамаль JI.JI., Ярушок Т.А., Шохин И.Е., Раменская Г.В. // Ремедиум - Москва, 2014. - №11 - С. 73.

Список сокращений.

НЦЭСМП - научный центр экспертизы средств медицинского применения; ДВ - действующее вещество;

ТСКР - тест сравнительной кинетики растворения; БКС - биофармацевтическая классификационная система; ЛП - лекарственный препарат; JIC - лекарственное средство; Test - тестовый препарат; Ref - препарат сравнения;

Подписано в печать 11.02.2015 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 1966-2-15 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39

Подписано в печать 11.02.2015 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 1966-2-15 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39