Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Полифенолы дрока красильного и лапчатки белой и их использование в стандартизации сырья

і Ой

^ '' Київська медична академія іііслядипломної освіти

Міністерства охорони здоров’я України

ТОДОРОВА ВІОЛЕТА ІВАНІВНА

УДК 615.322-072:582.734+582.739]543.05

Поліфеноли дроку красильного і перстачу білого та їх використання у стандартизації

сировини

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

Автореферат дисертації па здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук

Київ - 1997

Дисертацією є рукопис

Робота виконала у Київській медичній академії післядипломпої освіти Міністерства охорони здоров’я України

професор Гриценко Олена Миколаївна Київська медична академія післядилломної освіти, завідуюча кафедрою фармацевтичної хімії та фармакошовії

професор Комісарешо Микола Федотович,

Державний науковий центр лікарських засобів Держкоммедбіопрому України, НАН України, завідуючий лабораторією природних комплексів і біотехнології

кандидат фармацевтичних наук Герасимчук Таїсія Володимирівна,

Державна лабораторія з аналізу якості лікарських засобів, старший науковим співробітшік

Науковий керівішк доктор фармацевтичіпк наук,

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичіпк наук,

Провідна установа Запорізький державний медичний університет

МОЗ Україщфармацевтичшгіі факультет, . кафедра фармакогнозії з курсом ботаїїіки

Захист відбудеться 23 грудня 1997р. о 14“ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 01.12.04 при Київській медичній академії післядипломпої освіти (254112, м.Київ, вул. Дорогожицька,9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київської медичної академії іпслядипломіюї освіти (254112, м.Київ, вулДорогожицька,9).

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Поліфенольні сполуки дуже поширені у природі і часто є основними діючими речовинами у тих видах рослинної сировини, що застосовуються як самостійні лікарські засоби. Фармакологічна активність цих чинників залежить від хімічної будови і реакційної здатності, в той же час більшість поліфенольних сполук легко піддаються оксидуванню, зв'язують вільні радикали та іони металів у комплексні сполуки і тому проявляють антиоксидантні та антирадикальні властивості. Отже, вживання фітозасобів, багатих на поліфенольні сполуки, сприяє стабілізації клітинних мембран, що дуже важливо для оздоровлення нації в умовах несприятливої екологічної ситуації в Україні і все більшого розповсюдження імунодефіцитних станів.

Відомо, що на фоні імунодефіциту перебігають і деякі ендокринні захворювання, зокрема гіпо- та гіпертиреози.

Актуальність теми. Наукова медицина не має у своєму арсеналі рослинних засобів для лікування гіпотиреозу та тиреотоксикозу, в той час як у народній медицині з цією метою використовують чимало лікарських рослин у вигляді настоїв чи відварів. Так, при зниженій функції щитовидної залози в народній медицині України застосовують траву дроку красильного, а при гіперфункції, що супроводжується вираженими ознаками тиреотоксикозу - перстач білий. Особливістю народної медицини є те, що її засоби спрямовані не тільки па лікування хворого, а й на зміцнення його організму, для чого часто використовують поєднання кількох фітозасобів у комплексному лікуванні. Тому дослідження, націлені па те, щоб ефективні засоби народної медицини стали надбанням медицини наукової, є актуальними і вельми своєчасними.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом науково-дослідних робіт Київської медичної академії післядипломпої освіти МОЗ України (№ держреєстрації 019611010591).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було науково-експериментальне обгрунтування показників якості сировини дроку красильного та перстачу білого, що відображають вміст та властивості поліфенолів як основних чинників тиреотропної дії.

Для досягнення мети необхідно було вирішити такі задачі:

- вивчити якісний склад біологічно активних сполук, зокрема флавоноїдів, травн дроку красильного українських популяцій;

- виділити фракцію флавоноїдів з трави модельного зразка для фітохімічних та фармакологічних досліджень;

- розділити флавоноїди на індивідуальні сполуки та встановити їх будову;

- визначити показники якості трави дроку красильного, що відображають вміст, властивості поліфенолів та їх стабільність в процесі зберігання;

- розробити методику спектрофотометричного визначення вмісту флавоноїдів у траві дроку красильного;

- визначити показники якості, що відображають стабільність поліфенолів перстачу білого, відповідальних за антитиреоїдну дію, у процесі сушіння та зберігання сировини.

Наукова новизна одержаних результатів. Досліджено якісний склад поліфенолів, виділено та розділено на індивідуальні сполуки фракцію флавоноїдів з трави дроку красильного українських популяцій. Доведено, що в інтегральних

характеристиках водного настою, спиртової настойки та флавоноїдної фракції, що виявили тироксипстимуліоіочу активність, найяскравіше відображення дістають хроматографічні та спектральні властивості ізофлавону геністеїну, основної діючої речовини дроку красильного. Вперше опрацьовано і запропоновано до включення в аналітичну нормативну документацію на траву дроку красильного методику спектрофотометричного визначення вмісту флавоноїдів у перерахунку на геністеїн, на відміну від описаної в літературі методики перерахунку на гіперозід. Запропоновано спосіб сушіння сировини перстачу білого, який забезпечує стабільність полімеризовапих катехінів, що є чинниками антитиреоїдної дії нового фітозасобу. Вперше пропонується для досліджених видів лікарської рослинної сировини новий показник якості та стабільності - здатність водних витяжок до самоорганізації та характер структуруванпя.

Практичне значенння одержаних результатів. Результати досліджень стали основою для розробки проекту тимчасової фармакопейної статті “Трава дроку красильного”, що пропонується як засіб для лікування гіпотиреозу, та регламентації способу сушіння і терміну придатності сировини перстачу білого, якими доповнено проект Тимчасової фармакопейної статті (ТФС) “Трава та кореневище з бульбами перстачу білого", рекомендованої Фармакологічним комітетом МОЗ України на другу фазу клінічних досліджень як антитиреоїдиого засобу (Протокол № 8 від 31.10.96 р.). Трава фіалки пропонується для практичного використання у фітозборах загально-зміцшоючої та імуномодулюючої дії. Основні результати дисертації викладаються в ході навчального процесу зі студентами Медичного інституту УАНМ та слухачами циклів з питань фітотерапії Київської медичної академії післядипломної освіти (Акти впровадження від 10.10.97 р. та 27.10.97 р.) та застосування у медичній практиці (Акти апробації в санаторії “Сосновий Бір” м.Черкаси від 27.09.90 та в Республіканській клінічній лікарні м.Києва від 27.09.1990р.). .

Особистий внесок здобувача. У комплексному дослідженні трави дроку красильного як засобу для лікування гіпотиреозу, над яким працював творчий колектив співавторів публікацій, особисто здобувачем проведені всі дослідження по визначенню якісного складу та кількісного вмісту флавоноїдів у сировині, отримана спиртова настойка та здійснено фракціювання поліфенолів для передачі на фармакологічні дослідження, визначені показники якості сировини для включення у проект аналітичної нормативної документації.

У порядку доопрацювання нормативно-технічної (інструкції по збору та сушінню) та аналітичної документації на сировину перстачу білого особисто здобувачем проведені дослідження по стабільності поліфенолів у процесі її сушіння та зберігання.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися і обговорювалися на: XVI науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів Київського державного інституту удосконалення лікарів (КДІУЛ), (Київ, 1988 р.); V з’їзді фармацевтів БРСР (Мінськ, 1989); XVIII науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів (КДІУЛ, Київ, 1990 р.); науково-практичній конференції “Перспективи створення і виробництва лікарських засобів в Україні” (Одеса, 1993 р.); І Українській конференції “Народна і нетрадиційна медицина та шляхи її розвитку” (Полтава, 1993); І Конгресі Світової федерації українських фармацевтичних

з

товариств (Львів, 1994); І Міжнародному науковому конгресі “Традиційна медицина і харчування: теоретичні і практичні аспекти” (Москва, 1994).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті в наукових журналах та збірнику періодичного видання і 9 тез доповідей на наукових конференціях, з’їздах, конгресах.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 123 сторінках машинопису, складається з вступу, огляду літератури (перший розділ), розділу “Об’єкти та методи дослідження”, двох розділів експериментальної частини, кожен з яких закінчується висновками, узагальнення результатів, загальних висновків, списку літератури і додатків. Дисертація ілюстрована 12 рисунками, 11 таблицями, двома фото, п’ятьма додатками. Список літератури включає 263 джерела, з них 157 кирилицею та 106 латиницею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Розділ 1 - Сучасні дослідження поліфенолів як чинників тиреотропної та імуномодулюючої дії лікарських рослин містить огляд літератури, в якому основна увага приділена аналізу даних про розвиток захворювань щитовидної залози в залежності від імунного статусу організму чи навпаки. Узагальнені дані про використання фітозасобів, що містять поліфеноли, як імупомодуляторів, їх антиоксидантні та оптирадикальпі властивості. Виявлено, що тільки народна медицина використовує рослинні засоби специфічного та неспецифічного впливу на функцію щитовидної залози, з яких найбільш принадними для наукового дослідження виявилися дрік красильний та перстач білий.

Розділ 2 - Характеристика об’єктів та методи дослідження - містить перелік рослинної сировини вірогідних зразків поліфенолів, розчинників, реактивів та приладів, які були використані в дослідженні. Були застосовані фізичні, хімічні, фізико-хімічні, зокрема хроматографічні та спектральні методи досліджень. Для вивчення здатності систем до самоорганізації та характеру їх структурування застосовано мікроскопічний метод. Ці матеріали висвітлені у другому розділі дисертації. Методики, що стосуються конкретних об’єктів, наводяться у відповідних розділах експериментальних досліджень. Результати досліджень оброблялися статистично.

Розділ 3 - Природа, властивості та вміст флавоноїдів у траві дроку красильного.

Аналіз даних літератури свідчить, що з поліфенольних сполук у траві дроку красильного містяться фенолкарбонові кислоти, флавони та ізофлавон геністеїн у вільному та глікозидованому стані. Наявність ізофлавонів, яким притаманна гормоно-троіша активність, взагалі характерна для рослин родини Бобових, як і наявність алкалоїдів хінолізидинового типу. Тироксинстимулюючу активність препаратів дроку деякі дослідники пов’язують з наявністю в них флавону лютеоліну, хоч інші рослини, багаті на лютеолін, тиреотропної активності не виявляють. З огляду на важливість цього питання для розробки аналітичної нормативної документації на сировину, було проведено систематичне дослідження складу поліфенолів у траві дроку красильного, їх вкладу в тиреотропну активність засобу, в інтегральні хроматографічні та спектральні характеристики препаратів і лікарських форм.

Якісними хімічними реакціями і хроматографічними дослідженнями на папері у водному настої та у спиртовій витяжці виявлені флавоноїди і фенолкарбонові кислоти. Для більш детального вивчення природи флавоноїдів методом фільтраційної екстракції отримали спиртову настойку на 70% етанолі (1:5), частішу якої було передано па фармакологічні дослідження, іншу частину було піддано фракціюванню за допомогою розчинників різної полярності. Отримали ліпофільну (ЛФ) та гідрофільну (ГФ) фракції поліфенолів, частину яких теж передали на фармакологічні дослідження до Інституту ендокринології та обміну речовин АМН України, іншу - використали для розділення на індивідуальні сполуки.

Розділення флавоноїдів па індивідуальні сполуки проводили па поліамідному сорбенті, в результаті чого отримали три флавоноїдні аглікони, позначені, як ФА-1, ФА-2 та ФА-3 і три флавоноїдні глікозиди, позначені як ФГ-1, ФГ-2 та ФГ-3.

Для ідентифікації виділених сполук використовували порівняльне дослідження їх хроматографічної поведінки та температури топлення.

Речовина ФА-1 за в системах бензол-етилацетат-оцтова кислота-формамід (БЕОФ), н-бутапол-оцтова кислота-вода (БОВ) та 15% оцтова кислота (ОК) співпадала з вірогідним зразком лютеоліну. Плями обох сполук набували однакового за інтенсивністю жовтого забарвлення під впливом пари аміак)’ як до, так і після проявлення метаїюльним розчином хлороксиду цирконію. Змішана проба лютеоліну та речовини ФА-1 па двовимірній хроматограмі в системах БОВ (1-й напрямок) та 15% оцтова кислота (ІІ-й напрямок) давала одну пляму. Речовина ФА-1 топиться при температурі 325-329°С (температура топлення лютеоліну 328-330°С). Отже можна стверджувати, що аглікон ФА-1, виділений з трави дроку красильного є лютеоліном.

Глікозидна фракція ФГ-1 за хроматографічною поведінкою (ІМ, забарвлення плям, змішана проба) в системах БОВ та 15% ОК співпадала з вірогідним зразком цинарозиду, що є 7-моноглюкозидом лютеоліну. Близькими були для них і температури топлення - 255-258”С та 255-257°С відповідно.

За забарвленням плями під впливом пари аміаку до та після проявлення хлороксидом цирконію до похідних лютеоліну було віднесено також речовину ФГ-3. Хроматографічна поведінка цієї сполуки (Иґ в системі БОВ 0,25-0,28, та в 15% ОК -

0,62-0,66) характеризує її як диглікозид, що було підтверджено результатами кислотного гідролізу.

Таким чином, в траві дроку міститься як мінімум три флавоноїди, що є лютеоліном або його глікозидами.

Агліконова фракція ФА-2 за ЯГ в системах БЕОФ, БОВ та 15% ОК співпадала з вірогідним зразком геністеїну. Плями обох сполук мали темно-буре забарвлення, яке мало змінювалось під впливом пари аміаку. Метанольшш розчин хлороксиду цирконію викликає жовте свічення, яке під впливом пари аміаку дещо тьмяніє. При двовимірному хроматографуваїші змішаної проби геністеїну та речовини ФА-2 розділення плям не спостерігалося. Температури топлення теж були близькими (295-296°С та 293-296°С відповідно). Отже можна допустити, що флавоноїдний аглікон ФА-2 є геністеїном.

Глікозидна фракція ФГ-2 за хроматографічною поведінкою нагадує мопозид, а за флюоресценцією в УФ світлі до (буре забарвлення) та після обробки хлороксидом цирконію (жовте забарвлення) нагадує похідне геністеїну. Оскільки ми не мали

вірогідного зразку описаного в літературі глікозиду геністеїну, було проведено кислотний гідроліз речовини за допомогою 10% розчину сірчаної кислоти (див. речовину ФГ-3). Хроматографічний аналіз отриманого аглікону та його температура топлення підтвердили належність речовини ФА-2 до похідних геністеїну. У водному залишку в системах БОВ та н-бутанол-піридіш-вода (БПВ) нами виявлено одну пляму, що за ІУ співпадала з вірогідним зразком глюкози. Отже є підстави стверджувати, що в досліджуваних нами зразках трави дроку містяться вільний аглікон геністеїн та його глікозид геністин.

Невелику кількість агліконової сполуки ФА-3 досліджували хроматографічно в трьох системах розчинників - БОВ, БЕОФ та 15% ОК. По Иї та за флюоресценцією з УФ світлі без обробки реактивами та після обробки хлороксидом цирконію і парою аміаку ця речовина співпадала з вірогідним зразком апігеніну. Плями речовин з подібним свіченням зустрічаються в різних зонах на хроматограмах настою та спиртової витяжки, що дає підстави припустити наявність в траві дроку глікозидів апігеніну, як про це згадується в літературі.

Таким чином, наші дослідження показали, що в траві дроку містяться різні поліфенольні сполуки, зокрема флавоноїди - похідні лютеоліну, геністеїну та апігеніну.

Нас цікавило, як іде розподіл цих флавоноїдів по фракціях, отриманих нами і переданих па фармакологічні дослідження. Для цього провели хроматографічний аналіз ліпофільної та гідрофільної фракцій в системах БОВ та 15% ОК.

Виявилось, що в обох фракціях містяться похідні трьох основних агліконів. В гідрофільнії! фракції лютеолін в цих умовах не виявляється, але в достатній кількості залишився геністеїн. В ліпофільній фракції, навпаки, не виявлено глікозиду геністеїну

- геністину, хоч мопознди всіх трьох агліконів в цю фракцію переходять.

У фармакологічних дослідженнях ліпофільну та гідрофільну фракції давали щурам з експериментальним гіпотиреозом окремо (перша і друга група тварин) та у суміші (третя група тварин). В результаті проведених досліджень було встановлено, що як ліпофільпа так і гідрофільна фракції та їх суміш нормалізують вміст тироксину в сироватці крові щурів при експериментальному гіпотиреозі. Флавоноїдні фракції нормалізують рівень тироксину в крові гіпотиреоїдних щурів, мабуть, за рахунок підвищення біосинтезу або секреції тироксину щитовидною залозою, або сприяють вивільненню Т4 та ТЗ із зв’язуючих їх протеїнів у крові.

Вивчалася також дія настою з дроку красильного на функціональні властивості тканини щитовидної залози в дослідах на первинній культурі тиреоцитів новонароджених поросят. Настій з дроку красильного стимулює утворення тироксину щитовидною залозою інтактних щурів, але не впливає на рівень тиреотропного гормону у крові, нормалізує вміст тироксину в сироватці крові щурів за експериментального гіпотиреозу.

Отже, флавоноїди дроку красильного можна вважати головними чинниками препаратів, що нормалізують функцію щитовидної залози за експериментального гіпотиреозу.

Щоб пересвідчитись, що фармакологічна активність трави зумовлена саме поліфенольними сполуками, досліджували наявність атколоїдів у використаних фракціях, водному настої та у спиртових настойках, виготовлених з трави, зібраної в період цвітіння та в період плодоношення. Виготовлені настойки позначені нами як НЦ та НП.

Дослідження проведені загальноалкалоїдшши осаджувальними реактивами (табл.1) та хроматографією па папері.

Таблиця 1

Результати досліджень препаратів дроку на наявність алкалоїдів

Назва препарату Назва осадового реактиву

Бушарда Вагнера Драгендорфа Люголя

Водний настій - - - -

нц -г + +

НП ++ + + ++ ++

ЛФ + + + + + - ++

ГФ +++ + + +++ -

Примітки: / + / - позитивна; / ++/ - виражена; / +++/ - інтенсивна;

/ - / - негативна; / + - / - сліди

Хроматограми розглядали в УФ-світлі, обприскували 0,2% розчином ніпгідрину, що є реактивом на амінокислоти та інші аміни, а також реактивом Драгендорфа на наявність алкалоїдів. Плями азотвміщуючих речовин забарвлювались розчином иінгідрину в синій, або фіолетовий колір. З реактивом Драгендорфа спостерігалося рожеве забарвлення у гідрофільній фракції (рис.1.).

и Проявлення хроматограм

розчином нінгідрину реактивом Драгендорфа

настій нц НП ЛФ ГФ настій нц НГІ ЛФ ГФ

0,9 о

0,8

0,7

0,6 І.)

0,5 О о о

0,4 О о о

0,3 0,2 0,1 ООО й Ь' 8 0000 0 о со

Рис. 1

Схема хроматограм препаратів та фракцій дроку красильного в системі БОВ (4:1:2)

Як свідчать результати досліджень, алкалоїди достовірно виявлені лише в гідрофільній фракції поліфенолів, що є цілком зрозумілим. Дійсно, якщо алкалоїди в траві містяться у вигляді солей, то вони, як правило, не переходять в органічний розчинник без попереднього підлужування середовища. Крім того, гідрофільна фракція с дуже концентрованою витяжкою, а саме 1:1, тобто в перерахунку на сировину і з урахуванням розведення для нанесення на хроматограми цей зразок є в 4 рази більш концентрований, ніж водний настій. Отже не можна стверджувати, що алкалоїди не переходять у воду при виготовленні фітопрепарату в вигляді настою, але кількість їх у ньому настільки мала, що лежить нижче порогу відкриття за допомогою якісних осаджувалышх реакцій та хроматографії па папері.

Слід зуважнти, що плоди дроку, в яких в основному накопичуються алкалоїди, складають незначну частину від маси трави, а саме менш ніж 2% навіть у тих зразках, що збиралися в період плодоношення. Тому гранично малий вміст алкалоїдів у водних настоях цілком зрозумілий.

Таким чином, у фармакологічно активних фракціях і препаратах дроку красильного основними компонентами є поліфенольні сполуки, зокрема флавоноїди, і саме вони відповідальні за тиреотропну активність дроку. Отже і оцінку якості та стандартизацію сировини було б доцільно проводити за їх вмістом.

З метою вивчення можливості визначення вмісту флавоноїдів у траві дроку нами досліджувалися спектральні характеристики виділених сполук, фракцій та препаратів.

Відомо, що в спектрах ізофлавопів є одна інтенсивна смуга вбирання, що розміщується близько 260 нм, іноді спостерігаються додаткові максимуми незначної інтенсивності. Флавони, на відміну від попередніх, мають дві головні смуги вбирання -перша з них знаходиться в межах 350-370 нм, де ізофлавоші, як правило, не вбирають, а друга - практично збігається зі смугою вбирання ізофлавопів (250-270 нм). Зокрема лютеолін характеризується такими показниками вбирання: Хтіп 236, Хшх 255, 265 плече Хтш 280 та А. 352 нм. Вірогідний зразок геністеїну в наших умовах (розчин в 70% етанолі, концентрація М*10‘1) має X 230 нм, один інтенсивний X 262 нм та додатковий Хішх 212 нм і плече в ділянці 320-355 нм. Виходячи з цього, ми пробували записати спектри вбирання водного настою з використанням води як розчину порівняння, а також 70% етанолу, що використовувався нами для розведення проб. Дослідження показали, що проби настою, розведені водою (1:100), малиХ 236 нм, досить інтенсивний Хігіх 258-260 нм, та пологий X 333 нм. Тобто в спектрі розведеного настою досить чітко проявляється присутність геністеїну, і дещо менше лютеоліну. Належність довгохвильового максимуму не зовсім зрозуміла, тому що на ділянці 325-335 нм найчастіше вбирають світло похідні оксикоричної кислоти - кофейна, хлорогенова та інші. В той же час, при розведенні водою спостерігається гіпсохромний зсув у лютеоліну за рахунок утворення сольватокомплексів з розчинником. Запис спектру водного настою без розведення (прилад “НкасЫ 356”, кювета з товщиною шару 30-150 мкм) дав такі спектральні характеристики: X, 205, 262 та 320 нм, і слабо виражене плече в ділянці 350-360 нм. Смуга в ділянці 320 нм асиметрична в бік 350 нм. Отже в спектрі нативного настою проявляють себе як ізофлавоші (геністеїн та гепістин), так і похідні лютеоліну,

хоч останні, очевидно, є досить заблокованими внаслідок взаємодії з розчинником та іншими компонентами настою.

При розведенні водного настою 70% етанолом отримували спектр з інтенсивним Хшх 262 нм та більш пологим А.тах 348 нм. Отже в спиртовому середовищі спектральні характеристики похідних лютеоліну проявляються більш стабільно.

Для підтвердження ідентичності виділених нами агліконів ФА-1 та ФА-2 з лютеоліном та геністеїном записували їх УФ-спектри в 70% етанолі паралельно з спиртовою витяжкою у розведенні 1:200, використовуючи 70% етанол, як розчин порівняння (рис. 2).

Як видно з рисунка, спектральні характеристики ФА-1 та ФА-2, виділених з трави дроку, повністю співпадають з такими ж для вірогідних зразків лютеоліну та генітеїну. Спиртова витяжка відтворює X. 262 нм та пологий максимум в ділянці 341343 нм. Спостерігається також відхилення кривої спектру в ділянці 285-290 нм, де у лютеоліну спостерігається плече і невеличкий максимум (290 нм). Отже, найбільш виразно в інтегральному спектрі спиртової витяжки з дроку красильного проявляється

Рис. 2

УФ-спектри: 1 - аглікон ФА-1 (лютеолін); 2 - аглікон ФА-2 (геністеїн); З - спиртова витяжка з трави дроку красильного

присутність геністеїну. Цікаво було порівняти УФ-спектри спиртової витяжки з поліфенольними фракціями, що виявили тиреотрогшу активність. Запис спектрів тіпофільної фракції проводили після її розведення 70% етанолом, використовуючи як розчин порівняння 70% етанол. УФ-спектри гідрофільної фракції записували як при розведенні спиртом, так і при розведенні водою. В останньому випадку, як розчин порівняння використовували воду. Результати дослідження представлені в таблиці 2, куди включені також результати вивчення спектральних характеристик інших флавоноїдних сполук, виділених з трави дроку красильного.

Таким чином, результати хроматографічного та спектрального дослідження флавоноїдів дроку красильного переконливо свідчать, що саме вони чинять тиреотропну цію. Це спонукало нас розробити методику спектрофотометричного визначення вмісту флавоноїдів у траві дроку красильного у .перерахунку на геністеїн, чиї спектральні характеристики менше піддаються змінам внаслідок взаємодії з іншими сполуками препаратів та фракцій. Для розрахунків було використано питомий показник вбирання

Таблиця 2

Спектральні характеристики флавоноїдів, витяжок і фракцій, виділених з трави дроку красильного

Об’єкт дослідження Розчин порівняння А.„іах в УФ ділянці спектра, нм

ФА-1 Спирт 255, 265 пл., 290, 352

ФА-2 - “ - 212, 262, 320-355 ил.

ФА-3 - “ - 270, 336

ФГ-1 255, 265 пл., 350

ФГ-2 - “ - 210, 260, 320

ФГ-3 ч 255 пл., 265, 348

Водний настій натившш Вода 205, 262, 320, 350-360 пл.

Водний настій, розведений водою 205, 258, 333

Водний настій, розведений спиртом Спирт 210, 262, 248

Спиртова витяжка - “ - 212, 262, 285-290 пл., 342

ЛФ . “ _ 262, 350

ГФ - “ _ 205, 262, 248

ГФ Вода 205, 259, 333

геністеїну (1420), визначений нами експериментально для вірогідного хроматографічно чистого зразка.

Методика кількісного визначення флавоноїдів полягає в тому, що точну наважку сировини, вичерпно екстрагували 70% етанолом і кількісно переносили до мірної колби місткістю 100 мл. Після послідовних розведень готували пробу і вимірювали оптичну густину при 262 нм, використовуючи як розчин для порівняння 70% етанол. Розрахунок вмісту флавоноїдів у перерахунку на геністеїн здійснювали за формулою:

. В х V х ю х 20 х 100

. . х=-------------------------- %,

. 1420 х ш х (100-\У)

де Б - оптична густина досліджуваного розчину; 1420 - питомий показник вбирання геністеїну; V - об’єм спиртової витяжки; т - маса сировини в грамах; VI -розведення витяжки; \У - втрата в масі при висушуванні сировини у відсотках.

В таблиці 3 наведена метрологічна характеристика опрацьованої нами методики визначення флавоноїдів у траві дроку.

В процесі зберігання у сировині відбуваються різноманітні перетворення БАС, які можуть вплинути па фармакологічну активність лікарського засобу. Для Л РС терміни зберігання, як правило, не перевищують 5 років, а найчастіше це 2 і 3 роки. Систематичних досліджень стосовно стабільності основних показників якості сировини від дроку красильного українських популяцій до цього часу не проводилось.

Результати наших досліджень показали, що для спостереження за стабільністю

• Таблиця З

Метрологічна характеристика методики спектрофотометричного визначення флавоноїдів у траві дроку красильного

Оптична Знайдено флаиапоїдів, Метрологічні

густина % характеристики

0,620 4,42 х- 4,52

0,600 4,60 Б2- 0,027

0,627 4,54 5 - 0,165

0,613 4,47 5*= 0,06756

0,610 4,60 Дх“ 0,1655

0,590 4,48 8 - 3,6%

біологічно активних сполук трави дроку красильного крім кількісного вмісту флавоноїдів можна використати такі тести, як органоліптичні властивості пастою, співвідношення інтенсивності максимумів вбирання світла спиртовою витяжкою ( О 262 / Б 343 нм), хроматографічні характеристики цієї витяжки та мікроструктуру сліду висихання

краплини настою.

Методика оцінки структуроутворення і впорядкованості розчинів біологічно активних речовин за параметрами кристалізації твердої фази сліду висихання краплини розроблена О.М.Гриценко та М.В.Куриком, причому здатність систем до самоорганізації розглядається як спосіб визначення біологічної доступності лікарських препаратів.

Для вивчення цих властивостей в препаратах дроку красильного готували настій в співвідношенні 2,5:100 із сировини, зібраної в різних місцях зростання та різної тривалості зберігання.

Фазова структура настоїв із різних зразків трави характеризується досить високою гомогенністю з дрібними зернисто-кристалічними утвореннями, що можуть розглядатися як зароджепя рідких кристалів.

Місце зростання рослини справляє незначний вплив на характер структуроутворення, в той час як термін зберігання викликає руйнування гелевидної структури і сприяє дендритній кристалізації речовин, найчастіше, що вивільняються з матриці гелю. Цей показник можна успішно використати для контролю за якістю сировини (Таблиця 4)

Для стандартизації трави дроку красильного визначені також інші числові показники згідно з вимогами ДФХІ.

Таблиця 4

Мікроструктура настоїв з трави дроку красильного різної тривалості зберігання

Зразок, тривалість зберігання Опис Тип структурування (209]

1. (один рік) По краю - гелева структура з тріщинами. По центру - дрібночарунковий гель Система гомогенна, тип гелевидний, упорядкований

2ц і (п'ять років) Лея краплина - дрібночарунковий гель. Візерунок по краю - колбовидні чарунки з тріщинами, в яких зустрічається дрібна зернистість.

3, (п’ять років) Візерунок по краю, як у 2ц

4. (шість років) Візерунок по краю, як у 2ц.

5. (сім років) Луже насиченим центр. Явно виражена зернистість. Крап дрібно-зернистий, без чарунків та тріщин. . “ .

6. (десять років) Дрібночарунковий і зернистий край, але чарунки витягнуті. По полю - дендритна структура, розташована ближче до краю. Система гомогенна, тип міцелярний, упорядкований

Розділ 4 - Поліфеноли перстачу білого та фітозасобів імуномодулюючого супроводу.

Серед захворювань щитовидної залози досить поширеним є гіпертиреоз, що супроводжується симптомами інтоксикації і виникає на фоні імуподефіцнтних станів. З рослинних засобів, що використовуються народною медициною в таких випадках найбільш принадливим для наукових досліджень виявився перстач білий.

Фармакологічні дослідження тиреотронної активності препаратів перстачу білого у повному обсязі були проведені в Інституті ендокринології та обміну речовин АМН України.

Дослідженнями різних авторів встановлено, що перстач білий містить дубильні речовини пірокатехінової групи, а також мономерні та олігомерні катехіни, галотанін, флавоноїди, фенолкарбонові кислоти, іридоїди, амінокислоти та полісахариди, що локалізуються в підземних органах, та макро- і мікроелементи.

Для збереження основних діючих речовин у сировині розроблено технологію її обробки під час збирання та режим сушіння.

Сировину збирали в період бутонізації і висушували різними способами. Один зразок сировини сушили в сухому приміщенні, що добре провітрювалося, а другий - в сушарці з регульованим режимом температури, задаючи температуру повітря 50-70°С.

Кондиційну сировину за першим способом сушіння отримували через 7-10 діб, за другим - через 2-3 доби. Отже, використання другого способу сушіння значно скорочує час, що витрачається на операцію сушіння сировини, і має на меті інактивацію ферментів, діяльність яких може вести до оксидаційних перетворень катехінів та до гідролітичного розщеплення полімерних продуктів. Ці перетворення йдуть повільно протягом кількох діб і на якості сировини спочатку мало відбиваються. Проте при подальшому відволоженій, яке не виключається при зберіганні або транспортуванні сировини, ферменти відновлюють свої каталітичні властивості і це може призвести до змін у її хімічному складі.

Для перевірки цього припущення були проведені такі досліди. Обидва зразки сировини поміщали у відкриті бюкси і ставили у герметично закриту насичену вологою камеру (ексикатор), на дні якої знаходилась вода. Сировину витримували в камері протягом двох діб, після чого подрібнювали і використовували для приготування відварів шляхом кип’ятіння 1,0 г сировини з 50 мл води протягом 5 хвилин. Відвари охолоджували, проціджували і досліджували методом двовимірного хроматографуванпя на папері в системах БОВ (1-й напрямок) та 15% ОК (ІІ-й напрямок). Висушені хроматограми проявляли ваніліновим реактивом. Після обприскування та прогрівання хроматограми при 100°С протягом 2-3 хвилин плями катехінів та проантоцианідшпв забарвлювалися в рожевий чи оранжевий колір. При зберіганні хроматограм плями швидко знебарвлюються.

Встановлено, що після відволоження сировини, висушеної при температурі нижчій за 50°С, у відвар переходить більше речовин мономерних та олігомерних катехінів, і на хроматограмах додатково з’являються плями 2-3 речовин. Сушіння при температурі витій за 70°С призводить до підгоряння сировини за рахунок вмісту вуглеводів. Отже, в проекті Тимчасової фармакопейної статті ми робимо наголос на способі сушіння сировини.

Процеси взаємодії БЛС перстачу білого відображаються у здатності водних іідварів та розчинів фракції поліфенолів до самоорганізації з утворенням впорядкованих :труктур ламелярлого типу.

Здатність до ламелярного структуроутворення втрачається при довготривалому іберігапні фракцій і може правити за показник стабільності основних діючих речовин ; сировині в процесі зберігання.

Як уже зазначалося, гіпертиреози виникають на фоні імунодефіцитних станів, цо викликаються різними, найчастіше антропогенними чинниками. В цих умовах >рганізм стає малочутливим до дії будь-яких лікарських засобів через утруднену {гармакорецепцію. Для її поліпшення застосовують різноманітні способи детоксикації організму, наприклад, ентеросорбцію та засоби імуномодулюючої дії, серед яких найбільш ірнродшши і дійовими є рослинні імуномодулятори.

Тяжкий етап хворих, що страждають на гіпертиреоз, вимагає комплексного іікуванпя. Тому фітотерапія гіпертиреозу теж повинна бути багатопланова і спрямована іа підтримку та корекцію діяльності серця і нервової системи, нормалізацію травного іроцесу та ііі. Зокрема в разі низької чутливості до перстачу білого при вираженому тіреотоксикозі рекомендується вживати його разом з травою фіалки триколірної.

Оскільки до закінчення доклінічного вивчення перстачу білого використати їого як засіб фітотерапії ми не могли, дослідженню піддавали траву фіалки, відому як :фектившій антиалергійний засіб, особливо в педіатрії.

Лікарська рослинна сировина “Трава фіалки” містить значну кількість флавоноїдів імуномодулюючої дії, зокрема кверцетину та його рамноглікозиду рутину, ш можуть втрачатися при виготовленні і зберіганні лікарської форми “Настій”.

Запропоновано поєднувати траву фіалки у зборах з листом подорожника, що іризводить до стабілізації флавоноїдів, залучених у процеси структуроутворення разом з пектинами подорожника.

Клінічно досліджена ефективність збору з трави фіалки та листа подорожника ш імуномодулюючого засобу при лікуванні дітей, хворих на хронічний бронхіт з істматичпіш компонентов. У поєднанні з іншими видами сировини трава фіалки успішно іастосовується для лікування дітей, які часто і тривало хворіють.

Отже, траву фіалки можна рекомендувати до вживання у комплексну |)ітотерапіга гіпертиреозу для імупокорекції.

ВИСНОВКИ

1. Поліфенольні сполуки є основними чинниками тнреотрошюї дії у таких іасобах народної медицини, як дрік красильний та перстач білий.

2. Найважливіші поліфеноли дроку красильного представлені флавоновими га ізофлавоновими сполуками, зокрема лютеоліном та геністеїном, що є ізомерними іродуктами біосинтезу, але відрізняються хроматографічними і спектральними сарактеристиками.

3. В інтегральні УФ-спектри водного настою та спиртових витяжок з трави фоку красильного основний внесок дає присутність геністеїну, на підставі чого юзроблена методика спектрофотометричного визначення вмісту флавоноїдів у іерерахупку на геністеїн, як основну сполуку, відповідальну за тиреотропну активність.

4. Кількісний вміст флавоноїдів (від 3,5 до 4,5%) разом з іншими числовими показниками може слугувати за критерій якості трави дроку красильного як засобу для лікування гіпотиреозу.

5. Конденсовані дубильні речовини проаитоцианідинового типу у перстачі білому як основні чинники антитиреоїдної дії більш стабільні у сировині, висушеній при температурі 50-70Т, зберігати яку треба у цільному виді.

6. Фазова структура водних витяжок може слугувати додатковим показником тотожності досліджених видів сировини та стабільності БАС у процесі її зберігання.

7. На основі результатів проведених досліджень доповнені та складені проекти ТФС на два фітозасоби “Трава та кореневище з бульбами перстачу білого “ для лікування тиреотоксикозу і “Трава дроку красильного” - для лікування гіпотиреозу.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1.Гриценко Е.Н., Тодорова В.И..,Дужеико В.А. Фитотерапия больных с заболеваниями органов дыхания в условиях детского санатория II Фармакология и токсикология.-1991 .-Лг?26.-С.46-39.

2.Гриценко О.М.,Кобзар А.Я.,Тодорова В.І, Венгер П.І., Красильникова В.І., Курик М.В. Можливості фітотерапевтичного оздоровлення та лікування дітей в установах санаторного тину//Фармац.журп.-1992.-№3-С.38-41.

3.Грицеико О.М., Тодорова В.І., Захарія А.В., Корпачов В.В., Курик М.В. До питання стандартизації та контролю якості сировини і фітопрепаратів імуномодулюючої та тиреотропної дії II Фармац. журн.-1993.-№6.-С.50-52.

4.Поканевич В.В.,Костинська Н.Є.,Тодорова В.І.Народна медицина в Україні -вчора, сьогодні, завтра//Ліки.-1994.-№1-3.-С.49-52.

5.Тодорова В.И. Сравнительная характеристика биологически активных веществ травы фиалки трёхцветной и фиалки полевой, заготовленной в разных местах произрастания// Материалы XYI научно-практической конференции молодых учёных и специалистов КГИУВ.-Киев.-1988.-С.7-8.

6.Гриценко Е.Н., Максютипа Н.П.,Тодорова В.И. Хроматографическая оценка взаимодействия биологически активных соединений в лекарственных растениях//Тез. докл.У съезда фармацевтов БССР.- Минск.-1989.-ч.1.-С.180-182.

7.Тодорова В.И., Гриценко Е.Н. Использование листа подорожника и травы фиалки трёхцветной и полевой в фитотерапии пульмонологических больных II Материалы XYII научно-практической конференции молодых учёных и специалистов КГИУВ.-1990.-С.78-79.

8.Корпачёв В.В.,Пастер И.П., Шостак И.Н., Тодорова В.И., Захария А.В. Влияние отвара лапчатки белой / Potentilla albaI на функциональное состояние культивированной тиреоидной ткани//Тез. докл. научно-практической конференции “Перспективы создания и производства лекарственных средств в Украине".-Харьков.-

1993.-С.249-250.

Э.Гриценко Е.Н., Тодорова В.И. Полифенолы в структурировании и фармакологической активности лекарственных средств иммуномодулирующего и тиреотропного действия //Тез. докл. науч.-практ. конференции “Перспективі создания и производства лекарственніх средств в Украшіе”.-Харьков-1993.-С.19-20.

Ю.Корпачёв ІЗ.Б..Гриценко Е.Н.,Лнтвипенко В.И., Литвиненко Е.А., Попова Т.П., Тодорова В.И. Исследование химического состава и токсичности надземной части дрока красильного //Тез.докл. науч. конференции" Перспективы создания и производства лекарственных средств в У крайне”.-Харь коп.-1993.-С.43-45.

11.Тодорова В.И. Индивидуальный подбор растительных средств для эздоровлепия детей II Тез. докл. 1 Украинской конференции “Народная и нетрадиционная медицина и пути её развития”.- Полтава.-1993.-С. 167-168.

12. Тодорова В., Гриценко О., Корпачов В., Савченко Н. Вивчення взаємодії Зіологічно активних сполук в рослинних засобах імуномодулюючої і тиреотроппої дії/ 'Тези 1 конгресу Світової федерації Українських фармацевтичних товариств.-Львів.-

1994.-С.262-263.'

13.Тодорова В.И. Фитосредства иммуномодулирующего и тиреотропного действия II Мат. 1 Международного научного конгреса “Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты”.-Москва.-1994.-С.209.

Тодорова В.І. Поліфеноли дроку красильного і перстачу білого та їх використання у стандартизації сировини.-Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук «і спеціальністю 15.00.02-фармацевтнчпа хімія та фармакогнозія,-Київська медична лкадемія иіслядипломпої освіти МОЗ України, Київ, 1997.

Дисертацію присвячено дослідженню природи та властивостей поліфенольних сполук дроку красильного та перстачу білого як показників якості сировини, що використовується в народній медицині для лікування захворювань щитовидної залози. Показано, що стандартизацію трави дроку красильного доцільно проводити за вмістом флавоноїдів у перерахунку па геністеїн, що є основною діючою речовиною цього фітозасобу. Для стабілізації проантоцианідшйв перстачу білого, відповідальних за гпреотроппу дію, розроблено спосіб первинної обробки та сушіння сировини. Запропоновано повий показник якості та стабільності систем - здатність водних витяжок їо самоорганізації та характер структурувания.

Результати дослідженя стали основою для розробки аналітичної нормативної документації па два види лікарської рослинної сировини, викладаються в ході навчального процесу студентами і слухачами у системі додипломної та післядипломпої медичної освіти.

Ключові слова: аналіз, стандартизація, дрік красильний, перстач білий, флавоноїди, проаптоцианідини, самоорганізація систем.

Тодорова В.И. Полифеполы дрока красильного и лапчатки белой и их использование в стандартизации сырья. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата фармацевтических паук по специальности 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогиозия.-Киевская медицинская академия последипломного образования М3 Украины, Киев, 1997.

Диссертация посвящена исследованию природы и свойств полифенольиых соединений дрока красильного и лапчатки белой как показателей качества сырья, используемого в народной медицине для лечения заболеваний щитовидной железы. Показано, что стандартизацию травы дрока красильного целесообразно проводить по содержанию флавоноидов в пересчёте на генистеин, который является основным действующим веществом этого фитосредства. Для стабилизации проантоцианидиноз лапчатки белой, ответственных за тиреотропное действие, разработан способ первичной обработки и сушки сырья. Предложен новый показатель качества и стабильности систем

- способности водных извлечений к самоорганизации и характер структурирования.

Результаты исследования стали основой для разработки аналитической нормативной документации на два вида лекарственного растительного сырья, преподаются в ходе учебного процесса студентам и слушателям в системе додипломного и последипломного медицинского образования.

Ключевые слова: анализ, стандартизация, дрок красильный, лапчатка белая, флавоноиды, проантоцианидипы, самоорганизация систем.

Todorova V.I.

Polyphenols of Dyer's weed and White cinquefoil and their utilization in the standardization of raw materials.-Manuscript.

Thesis for a Master’s degree in pharmaceutical sciences in speciality 15.00.02-pharmaceutical chemistry and pharmacognosis.- Kiev Medical Academy of advanced training Ministry of Heals, Riev,1997.

The thesis deals with the research in the sphere of the nature and properties of polyphenolic combinations of dyer’s weed and white cinquefcil as the indices of the raw materials quality, utilized in falk medicine to cure the thyroid gland diseases. It is shown the advisability of the standardization of dyer's weed according to the content of flavonoids, measuring it as ror genistein, which is the main acting substance of this phyto means. In order to stabilize the proantocyanides of white cinquefcil responsible for thyreotropic-action it is developed a way of initial processing and drying of the raw material. A new index of quality and stability of systems is proposed, that is the ability of water extractions to selforganization and the character of structuring.

The results of the research have laid the basis for the development of analytical normative documents for the types of medicinal vegetable raw material and are taught to the students of pre-diploma and advanced training medical system.

Key word’s: analysis, standardization, Dyer’s weed, white cinquefcil, flavonoids, proantocyanides,self-organization of systems.